用于防止心脏缺血-再灌注损伤的多肽
阅读：688发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于防止心脏缺血-再灌注损伤的多肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且如下式的肽或者所述GLP-1肽的某些类似物：R1-NH-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK-CONR2R3，其中，R＝H或含1-10个 碳 原子 的有机化合物，且R2R3＝各自独立地为H或具1-4个碳原子的烷基；可用于 治疗 和 预防 心脏缺血- 再灌注 损伤。，下面是用于防止心脏缺血-再灌注损伤的多肽专利的具体信息内容。
1.一种如下式的肽
1 2 3
R-NH-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK-CONRR
2 3
其中，R为H或含1-10个碳原子的有机化合物，且R、R 独立地为H或具1-4个碳原子的烷基；
用于治疗或预防心脏缺血-再灌注损伤。
1
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，R 代表酰基。
1 2
3.如权利要求1或2所述的肽，其中R 为甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基和/或R、
3 2 3
R 独立地为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基，特别地，R ＝R 且为氢、甲基或乙基。
4.如权利要求1-3中至少一项所述的肽，其特征在于，
R-GLP-1-(7-34)-酰胺8位的A被选自下组的中性氨基酸取代：S、 G、C、 Sar、β-丙氨酸和Aib；和/或
R-GLP-1-(7-34)-酰胺10位的G被中性氨基酸取代；和/或
R-GLP-1-(7-34)-酰胺15位的D被酸性氨基酸取代。
5.如权利要求4所述的肽，其特征在于，A被S、 G、C、 Sar、β-丙氨酸和Aib取代。
6.如权利要求1-5中至少一项所述的肽，其与适合的药学上可接受载体组合。
7.如权利要求1-6中至少一项所述的肽，其特征在于，所述的肽配制成永久性或脉动性释放剂。
8.如权利要求1-6中至少一项所述的肽，其特征在于，所述的肽配制成用于皮下、静脉内、动脉内、经口、肌内或经肺给药。
用于防止心脏缺血-再灌注损伤的多肽
[0001] 本发明涉及一种用于防治心脏缺血-再灌注损伤(heart ischemia-reperfusion injury)的多肽。
[0003] 缺血-再灌注损伤(IRI)是一种在足够长的中断之后的血流恢复时影响心肌的综合症，例如冠状动脉血栓形成或心脏手术[1,2]中所遇到的情况。该综合症的主要组成包括：心肌细胞死亡、心肌顿抑、心律失常和无复流[1]。在最近30年中，为阐明IRI的病理生理学性质，积累了大量的实验研究素材，其中主要关注心肌细胞死亡及限制其的方案。一类这样的方案是药物后调理(pharmacological postconditioning)，其中在血流恢复的同时施以心脏保护剂。这种时间选择使得后调理与临床前瞻性相关，其中在冠状动脉血栓形成和ST段抬高型心肌梗死之后的不可逆心肌损伤的限制仍是主要目标[3]。
[0004] Bose,A.K.等[4]在Cardiovasc Drugs Ther(2007)21:253-256中公开了单用GLP-1未能降低心肌梗塞，而当与GLP-1分解抑制剂缬氨酸吡咯烷(VP)联用时心肌梗塞的发生显著降低。
[0006] 本发明的一个目的是提供一种心脏缺血-再灌注损伤疗法，该方法通过给予可作为单组分进行施用的GLP-1类似物并避免给予该药物与第二化合物。
[0007] 本发明基于这样的意外发现：本发明的肽具有心血管保护作用而无需同时给予其它化合物，具体地，它们具有保护心脏抵御缺血-再灌注损伤的作用。使用N末端封闭、C末端截断的N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺进行后调理限制了大鼠离体心脏中的缺血-再灌注损伤。心舒期高挛缩减弱和梗塞面积减小体现了N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺的该有益效果。
[0009] 图2：缺血-再灌注对左室舒张压(LVD)、左室发展压(LVDEV)和心率血压乘积(RPP)的作用如图2A-C所示。在A图中，*表明与“无肽”条件相比，P<0.05。
[0010] 图3：N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺对梗塞面积的作用。各柱代表平均梗死面积(IS)(N＝7-14)，计算为心肌缺血面积(Area at Risk，AAR)(％IS/AAR)的百分率，而各短棒指示SEM。各治疗组的命名如图2所示。*是指与“无肽”条件相比，P<0.05。
[0011] 根据本发明，式
[0012] R1-NH-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK-CONR2R3所示肽可用于治疗和预防心脏缺血-再灌注损伤，
[0014] 可用于治疗和预防心脏缺血-再灌注损伤。
[0015] 在该肽的序列中，氨基酸用单字符表示，但明确标明N末端(R1-NH-)和C末端2 3
(-CONRR)。
(-CONRR)。
[0016] 在本发明所用的肽中，R1代表酰基。
[0017] 特别地，R1为甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基，和/或，特别地，R2、R3独立地为2 3
氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基，特别是，R ＝R，为氢、甲基或乙基。
例如，肽的C末端可以是酰胺、二甲基酰胺、二乙基酰胺，但也可以是混合酰胺，如单甲基酰胺、单乙基酰胺、甲基乙基酰胺等等。本领域技术人员不难理解这些组合。
氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基，特别是，R ＝R，为氢、甲基或乙基。
例如，肽的C末端可以是酰胺、二甲基酰胺、二乙基酰胺，但也可以是混合酰胺，如单甲基酰胺、单乙基酰胺、甲基乙基酰胺等等。本领域技术人员不难理解这些组合。
[0018] 该肽可经修饰，其中R-GLP-1-(7-34)-酰胺8位的A被选自下组的中性氨基酸取代：S、 G、C、 Sar、β-丙氨酸和Aib；和/或
[0019] R-GLP-1-(7-34)-酰胺10位的G被中性氨基酸取代；和/或
[0020] R-GLP-1-(7-34)-酰胺15位的D被酸性氨基酸取代。
[0021] 特别地，在该肽中，A可以被S、 G、C、 Sar、β-丙氨酸和Aib取代。
[0022] 该肽可以与适合的药学上可接受的载体组合配制。这样的载体为本领域普通技术人员所熟知，并可容易地获自药物制剂的教科书。
[0024] 作为本发明的肽的一个代表，N-Ac-GLP-1-(7-34)-酰胺，一种天然激素GLP-1的合成类似物，其已经显示在大鼠离体心脏中减弱这种心脏缺血-再灌注损伤，而无需与抑制GLP-1分解的物质，例如VP一同给药。
[0025] N-Ac-GLP-1-(7-34)-酰胺效应之应用模式的通用类型称作药物后调理。这类生物效应的细胞和分子细节仍不为人充分理解。在想不束缚于作用模式的如何假设或原理，但N-Ac-GLP-1-(7-34)-酰胺作用的一个可能机制可涉及心肌细胞上GLP-1受体的激活，其进而激活若干细胞内的信号传导机制，增加其存活能力。
[0027] 方法
[0028] 将全心缺血(35min)-再灌注(120min)施于离体的、逆行灌注的大鼠心脏。在再灌注发生时，肽存在15min。在整个灌注期间测量心脏功能参数(每分钟心跳、左心室发展压和舒张压、心率血压乘积)。用氯化2,3,5-三苯基四氮唑(2,3,5-tripehyltetrazolium chloride)染色和测面积法进行测定收集的心脏梗死面积。
[0029] 结果。
[0030] N-Ac-GLP-1(7-34)-酰胺将梗死面积自28.4％(SEM2.8,N＝14)降低至11.4％(SEM3.2,N＝8；P<0.05)。N-Ac-GLP-1(7-34)-酰胺显著减弱了缺血后舒张挛缩。当进行施加而没有前期缺血时，N-Ac-GLP-1(7-34)-酰胺对左心室发展压(LVDEV)或心率血压乘积(RPP)未有显著效果，亦未影响任一心脏功能参数。共同给予GLP-1受体拮抗剂艾塞那肽(exendin，9-39)消除了N-Ac-GLP-1(7-34)-酰胺的效果。
[0031] 材料和方法
[0032] 化学品
[0033] N-Ac-GLP-1(7-34)-酰胺由Polypeptide Laboratories公司(美国圣地亚哥)合成。艾塞那肽(9-39)购自Bachem公司(瑞士)。
[0034] 动物和实验步骤
[0035] 使用了雄性Sprague Dawley大鼠(330-370g，购自丹麦Taconic公司)。这些动物研究符合《实验动物护理和使用指南》(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)(全国卫生出版学院，National Institutes of Health Publication，No.85-23,1996修订)以及管理动物实验的丹麦法规(1987)，并且，在得到了丹麦司法部动物实验监管局(Animal Experiments Inspectorate,Ministry of Justice,Denmark)批准后，进行上述动物研究。
[0036] 为进行麻醉，皮下给予咪达唑仑(2.5mg/kg)、氟阿尼酮(2.5mg/kg)和芬太尼柠檬酸盐(0.08mg/kg)的混合物。肝素(1000即每kg)通过股静脉进行给药。动物经气管切开术，通以35％O2/65％N2的混合物，并且胸腔被打开。将切除的心脏立即放入冰冻冷却的Krebs Henseleit缓冲液中。该心脏被迅速固定至Langendorff灌流系统(购自英国ADInstruments)并用改良的Krebs-Henseleit溶液(NaCl118.5mM、KCl4.7mM、NaHCO325.0mM、MgSO41.2mM、CaCl21.4mM、葡萄糖11.1mM)进行灌注，用5％CO2/95％O2的混合气体于37℃平衡至pH7.4。移除左心耳(left auricle)并将一个7码的7气球(ADInstruments)通过左心房插入左心室并调节舒张压至4-10mmHg。灌注压设为70mmHg并通过伺服控制系统(ML175STH泵控制器，ADInstruments)维持于该平均值，根据流动阻力持续调节该蠕动泵转动。使心脏稳定20min，然后在接下来的10min中对左心室功能参数基线值进行记录：压力(收缩期，LVS；舒张期，LVD；发展，LVDEV＝LVS-LVD)，每分钟心跳次数(BPM)和心率血压乘积(RPP)。购自ADInstruments的Power Lab8/30系统和Chart5Pro软件用于这些记录。
[0037] 淘汰标准
[0038] 如稳定期间的最后10分钟均值无法满足以下标准，则将心脏淘汰：BPM:210–-1 -1350min 、LVDEV:80–150mm Hg、RPP:>22,000(mmHg×min )。如果再灌注过程中发生心室颤动持续5分钟以上，则亦淘汰心脏。
[0039] 治疗组
[0040] 图1概括了含氧量正常(A)和缺血-再灌注(B)实验的时间进程。实验组为：含氧量正常对照，未添加肽；含氧量正常，N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺0.3nM；缺血-再灌注(IR)对照，未添加肽；IR，N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺0.3nM；IR,N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺0.3nM+艾塞那肽(9-39)3nM；IR，艾塞那肽(9-39)3nM。图1.显示了示意含氧量正常灌注(A)和缺血-再灌注(B)的灌注时期的方案图。“Stab”是指30min稳定期。当存在时，自灌注(A)或再灌注(B)的最后120min起，添加肽，持续15min。总灌注时间总是185min，由以下组成：30min稳定，接着为155min的含氧量正常灌注(图1A)或35min全心缺血-120min再灌注(图1B)。
[0041] 测定梗死面积
[0042] 再灌注后，如前所述，心脏进行氯化2,3,5-三苯基四氮唑染色和测定平面梗死面积[5]。由对实验条件未知的调查员进行定量测定。梗死面积(IS)表示为有风险的缺血总面积百分比(AAR)(％IS/AAR)。
[0043] 统计分析
[0044] 所有数值以均值呈现，SEM在括号中给出。单向ANOVA与Dunnett事后检验用于比对处理结果和对照条件。P<0.05视为显著。
[0045] 结果
[0046] 功能参数
[0047] 基线参数值为(在所有实验中均为N＝14)：BPM291(7)min-1，LVDEV105.2(5.4)-1mmHg，LVD8.3(0.7)mmHg，RPP30302(1434)mmHg min 。在含氧量正常灌注结束时，这些值为-1
(N＝ 5)：BPM215(14)min ，LVDEV75.2(8.6)mmHg，LVD19.2(5.2)mmHg 和 RPP16060(1740)-1
mmHg min 。在含氧量正常实验中这些参数的时间曲线未因灌注的35min和50min之间(即，与缺血-再灌注实验中施加肽所对应的期间)N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺的存在而受影响。
(N＝ 5)：BPM215(14)min ，LVDEV75.2(8.6)mmHg，LVD19.2(5.2)mmHg 和 RPP16060(1740)-1
mmHg min 。在含氧量正常实验中这些参数的时间曲线未因灌注的35min和50min之间(即，与缺血-再灌注实验中施加肽所对应的期间)N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺的存在而受影响。
[0048] 缺血-再灌注对LVD、LVDEV和RPP的影响示于图2A-2C。缺血-再灌注实验中左心室舒张压(LVD)(A)、左心室发展压(LVDEV)(B)和心率血压乘积(RPP)(C)的时间进程。点代表7-14次实验的均值，短棒表示SEM。标出了缺血和再灌注时期的起始、施加肽的时期(在灌注开始起15min)以及计算曲线下面积(AUC)的时期。以下的治疗组用标识(在A-C中为相同标识)示出意：对照缺血-无肽存在；N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺0.3nM；N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺0.3nM+Exe(9-39)(艾塞那肽(9-39))3nM；Exe(9-39)3nM。“基线值”标记的诸点代表在稳定期间最后10min各组的均值。*是指与“不含肽”条件相比，P<0.05。
[0049] 在血流中断后LVD急剧上升，在朝向缺血期间末期有所下降，并在再灌注开始时再一次急剧上升(图2A)。在再灌注开始后约5-10min达到峰值，约60min后降至近平台(near-plateau)。曲线下面积(AUC)用作再灌注的最后60min间功能参数值的时间积分测量值。在用N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺作后调理之后，与对照缺血相比，这些LVD的AUC值显著降低；在有GLP-1受体拮抗剂艾塞那肽存在下使用N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺进行后调理(9-39)，或在单用艾塞那肽(9-39)时，它们并未受影响(图2A)。
[0050] 用N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺进行后调理并未显著降低LVDEV或RPP的AUC值(分别为图2B和2C)。向着LVDEV增加的趋势可能曾是明显的。
[0051] 梗死面积
[0052] 不作后调理(对照缺血-再灌注)时，梗死面积为24.8％(2.8％，N＝14)(图3)。该图亦显示了用N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺0.3nM作后调理对梗死面积(％IS/AAR)的影响。治疗组入图2那样命名。*指与“无肽”条件相比，P<0.05。用N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺0.3nM进行后调理将梗死面积降低至11.4％(3.2％，N＝8，P<0.05)。艾塞那肽(9-39)显示消除了GLP-1的梗塞限制作用。在有艾塞那肽(9-39)存在下，用N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺进行后调理得到梗死面积为21.4％(2.4,N＝8)，并与对照缺血的情况或仅艾塞那肽(9-39)单独存在下的数值(21.7％；3.6,N＝9)无差异。
[0053] 本发明公开了N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺所示例的本发明肽的心脏保护效果。N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺是N末端乙酰化、C末端截断的GLP-1类似物。
[0054] 测试了N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺作为后调理剂的心脏保护性作用。在全心缺血后立即施加N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺，15min，其中再灌注持续120min。以该种方式，N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺在心肌性能水平以及梗塞面积方面皆具有有益的效果。LVD是受影响最为强烈的参数，在使用N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺进行后调理后显示出显著的降低(图2A)。缺血后的LVD升高，或高挛缩(hypercontracture)是导致再灌注时心肌细胞死亡的主要机制之一，这是因机械应力导致肌纤维膜破裂所致[6]。N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺的LVD-降低效果被艾塞那肽(9-39)(GLP-1受体拮抗剂)的存在而封闭。因此，N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺对缺血后挛缩的改善性活性是由已知在心肌中存在的GLP-1受体所介导[7]。
[0055] 舒张高挛缩可能反映了恢复的肌细胞中ATP合成的恢复不足和/或Ca2+循环异常[8]。N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺后调理并未以统计学上显著的方式来影响LVDEV或RPP(图2B)。然而，用N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺进行后调理之后，朝向LVDEV改善的趋势看来存在，并且因艾塞那肽的存在而消除(9-39)(图2B)。
[0056] 未发现N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺在含氧量正常条件下灌注期间对心肌性能有影响。
[0057] N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺后调理导致梗死面积显著下降(图3)，相对减小值约54％。与前文讨论的对LVD的作用一致，N-Ac-GLP-1(7-34)酰胺的这种梗塞面积限制作用在有GLP-1受体拮抗剂艾塞那肽(9-39)存在下被消除。
[0058] 参考文献
[0059] [1]Yellon DM,Hausenloy DJ(2007)心肌再灌注损伤(Myocardial reperfusion injury).N.Engl.J Med.357:1121-1135
[0060] [2]Turer AT,Hill JA(2010)心肌缺血再灌注损伤的发病机理以及治疗的理论基 础 (Pathogenesis of myocardial ischemia-reperfusion injury and rationale for therapy).Am J Cardiol106:360-368
[0061] [3]Ovize M,Baxter GF,Di Lisa F等(2010)再灌注损伤的后处理和保护：我们处在什么位置？来自欧洲心脏病学会心脏细胞生物学工作组的意见书(Postconditioning and protection from reperfusion injury:where do we stand ？ Position paper from the working group of cellular biology of the heart of the European Society of Cardiology).Cardiovasc Res87:406-423
[0062] [4]Bose A.K.,Mocanu MM,Carr RD,Yellon DM(2007)心肌缺血再灌注损伤在体外大鼠心脏中为完整的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)所减弱，且可涉及p70S6K途径(Myocardial ischaemia-reperfusion injury is attenuated by intact glucagon like peptide-1(GLP-1)in the in vitro rat heart and may involve the p70s6K pathway).Cardiovasc Drugs Ther21:253-256
[0063] [5]Ossum A,van Deurs U, T,Jensen JS,Treiman M.(2009)GLP-1和GLP-1(9-36)在分离的大鼠心脏中的后处理效应的心脏保护性和肌肉收缩性成分(The cardioprotective and inotropic components of the postconditioning effects of GLP-1and GLP-1(9-36)a in an isolated rat heart).Pharmacol Res60:411-417[0064] [6]Inserte J,Barrabes JA,Hernando V,Garcia-Dorado D(2009)再灌注损伤的孤靶点(Orphan targets for reperfusion injury).Cardiovasc.Res.83:169-178[0065] [7]Ban K,Noyan-Ashraf MH,Hoefer J,Bolz SS,Drucker DJ,Husain M(2008) 胰高血糖素样肽1的心脏保护性和血管舒张性活性为胰高血糖素样肽1受体依赖性和非依赖性途径所介导(Cardioprotective and vasodilatory actions of Glucagon-like Peptide1are mediated through both Glucagon-Like Peptide1receptor-dependent and-independent pathways)。发行117:2340-2350
[0066] [8]Ladilov Y,Efe O,Schafer C 等 (2003) 再 充 氧 诱 导 性 僵 型 挛 缩(Reoxygenation-induced rigor-type contracture).J Mol Cell Cardiol.35:1481-1490
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种脑缺血再灌注损伤动物模型的制作方法 | 2020-05-13 | 242 |
| SiRNA在器官储存/再灌注溶液中的应用 | 2020-05-12 | 420 |
| GW3965用于制备防治肾缺血再灌注损伤药物的应用 | 2020-05-12 | 300 |
| 治疗缺血再灌注损伤的化合物 | 2020-05-11 | 813 |
| 治疗和预防远端缺血-再灌注损伤 | 2020-05-11 | 573 |
| 一种用于防治脑缺血再灌注损伤的药物组合物 | 2020-05-13 | 319 |
| 一种抗缺血与再灌注损伤药物 | 2020-05-11 | 705 |
| 可再灌注塑料瓶的洗涤方法 | 2020-05-12 | 579 |
| 一种腹腔镜外科手术用气体灌注和再循环系统 | 2020-05-13 | 127 |
| C1抑制剂在预防缺血-再灌注损伤中的应用 | 2020-05-13 | 503 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈