大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法
阅读：729发布：2020-05-13
专利汇可以提供大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种大鼠心肌缺血/ 再灌注 模型的制备方法，制备过程包括下述依次的步骤：Ⅰ.麻醉 麻醉药物是2％～3％异氟烷，将大鼠放在诱导箱中采用异氟烷进行吸入麻醉后，从诱导箱取出，在面罩下继续吸入异氟烷以维持麻醉；Ⅱ.剪开胸部 皮肤 挤出心脏 将胸部消毒，剪开胸部皮肤，撑开皮下肌肉进入胸腔，将心脏直接从肋间挤出；Ⅲ.结扎冠脉左前降支 采用活结结扎冠脉左前降支起始端，结扎完毕，把心脏送回胸腔，结扎线一端置于胸腔外，缝合关闭胸腔；Ⅳ.松结扎线 缺血结束后，直接把露在胸腔外的结扎线松开，冠脉恢复血供。本发明操作简单、耗时短、大鼠存活率较高。，下面是大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法，缺血/再灌注大鼠模型的制备过程包括下述依次的将大鼠麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏、结扎冠脉左前降支与松结扎线，其步骤特征为：
Ⅰ.麻醉
麻醉药物是2％～3％异氟烷，将大鼠放在诱导箱中采用异氟烷进行吸入麻醉后，从诱导箱取出，在面罩下继续吸入异氟烷以维持麻醉；大鼠麻醉仪器是美国Matrx公司小动物麻醉机；
Ⅱ.剪开胸部皮肤挤出心脏
将胸部消毒，剪开胸部皮肤，撑开皮下肌肉进入胸腔，将心脏直接从肋间挤出；
Ⅲ.结扎冠脉左前降支
采用活结结扎冠脉左前降支起始端，结扎完毕，冠脉缺血，把心脏送回胸腔，并将结扎线一端置于胸腔外，进行“U”字褥式缝合关闭胸腔；
Ⅳ.松结扎线
缺血结束后，直接把露在胸腔外的结扎线松开，冠脉恢复血供。
2.根据权利要求1所述的大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法，其特征是：所述的大鼠为一组作为心肌缺血/再灌注组，该组的例数最少为6只。
3.根据权利要求1所述的大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法，其特征是：还另有一组为伪手术组；伪手术组的每只大鼠都按下述依次的步骤进行：麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏、冠脉左前降支。
大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 众所周知，对于急性心肌梗塞，目前公认的最为有效的治疗方法是冠状动脉再灌注，然而冠状动脉再灌注存在再灌注损伤问题，因此，再灌注损伤的研究及防治已成为人们研究的热点问题。在动物体内阻断冠状动脉左前降支造成急性心肌缺血，并在预定时间内恢复血供予以再灌注是模拟人类缺血性心脏病恢复血供治疗必需的实验方法。大鼠以其冠状动脉侧支循环少、心肌坏死出现早、重复性及稳定性好、费用低廉等优点而成为制作心肌缺血/再灌注损伤模型的首选实验动物。
[0003] 目前，在大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备过程中，结扎冠状动脉左前降支的方法包括①心脏原位结扎法，其优点是心脏处于正常解剖位置，对心脏生理功能影响较小，但是此法通常暴露的视野小，心脏不易固定，结扎冠状动脉时很难把握进针位置及深度，易出血；且需剪断肋骨，耗时长，操作困难；同时操作过程需要进行气管插管，使用动物呼吸机呼吸、给氧；动物麻醉通常使用乌拉坦进行全麻，因此麻醉时间较长，术后苏醒慢；此外，在去除气管插管后，容易因气管内分泌物增加而造成动物窒息死亡，手术存活率不高于90％。②胸腔外结扎法，其优点是操作中可视性强，无需剪断肋骨，结扎冠状动脉在胸腔外进行，失血少、损伤小，且耗时短。目前采用此法制备缺血/再灌注模型时常用的麻醉药包括戊巴比妥钠、水合氯醛和乙醚。但是，戊巴比妥钠的呼吸抑制作用比较明显，术后易引起大鼠呼吸衰竭甚至死亡；水合氯醛本身具有致心律失常的作用；乙醚麻醉常使呼吸道分泌物增多，易引起呼吸道阻塞。
[0004] 在使用心脏原位结扎法或胸腔外结扎法造模时，传统的结扎冠状动脉的具体操作方法包括推管法和压管法。推管法是将结扎线穿过硬质塑料管，使用止血钳或纹式钳提线推管压迫冠脉造成缺血，缺血结束时松止血钳解除管对冠脉压迫恢复血液灌流。该方法存在以下缺点，首先是心脏跳动使管的位置发生改变，不能保证实验过程中维持恒定的缺血效果；其次管切面接触心脏表面，心肌遭受的机械损伤严重；另外，使用止血钳或纹式钳维持管对冠脉的压迫，不仅损伤加重，而且心脏受到外力牵拉，不能很好地模拟临床实际情况，尤其是需要动态监测动物心功能时，测量数据可能会偏离真实情况。压管法是将管放置在心表面，将线系在管上阻断冠脉形成缺血，缺血结束时抽出管恢复血液灌流，但由于管不易固定和缺血效果不好目前使用较少。
发明内容
[0005] 本发明目的在于克服现有大鼠心肌缺血/再灌注模型制备方法的上述不足，提供一种操作简单、耗时短、大鼠存活率较高的大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法。
[0006] 本大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法，缺血/再灌注大鼠模型的制备过程包括下述依次的将大鼠麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏、结扎冠脉左前降支与松结扎线，其步骤特征为：
[0007] 1.麻醉
[0008] 麻醉药物是2％～3％异氟烷，将大鼠放在诱导箱中采用异氟烷进行吸入麻醉后，从诱导箱取出，在面罩下继续吸入异氟烷以维持麻醉；大鼠麻醉仪器是美国Matrx公司小动物麻醉机。
[0009] 2.剪开胸部皮肤挤出心脏
[0010] 将胸部消毒，剪开胸部皮肤，撑开皮下肌肉进入胸腔，将心脏直接从肋间挤出。
[0011] 3.结扎冠脉左前降支
[0012] 采用活结结扎冠脉左前降支起始端，结扎完毕，冠脉缺血，把心脏送回胸腔，并将结扎线一端置于胸腔外，进行“U”字褥式缝合关闭胸腔。
[0013] 4.松结扎线
[0014] 缺血结束后，直接把露在胸腔外的结扎线松开，冠脉恢复血供。这样避免了二次开胸。
[0015] 本发明所述的麻醉药物2％～3％异氟烷，是异氟烷与以氧气为主的吸入气体体积百分比。
[0016] 上述的大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法，其特征是：所述的大鼠为一组，作为心肌缺血/再灌注组，该组的例数最少为6只。
[0017] 本发明与现有技术相比，具有如下优点：
[0018] 1.采用异氟烷吸入麻醉，使大鼠麻醉平稳，药物副作用小，安全性高，可控性强，复苏快；
[0019] 2.采用活结结扎冠状动脉，使用这种在心脏表面打活结形成缺血的方法避免了推管法对心肌的机械损伤，而且由于不需要止血钳等来固定管可以防止外力牵拉，保证心脏在自然状态下搏动，动态监测心功能时，数据稳定可靠，同时可以避免二次开胸；
[0022] 图2是冠状动脉结扎后心电图Ⅱ导联典型图。
具体实施方式
[0023] 下面结合实施例详细说明本发明的具体实施方式，但本发明的具体实施方式不局限于下述的实施例。
[0024] 实施例一
[0025] 本实施例共60只雄性Wistar大鼠，分为缺血/再灌注组与伪手术组两个组，每组为30只。
[0026] 缺血/再灌注组
[0027] 本实施例以30只出生8-10周，体重180-220g的雄性Wistar大鼠，缺血30min，再灌注3h为例，说明本大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法。每只大鼠都按下述依次的步骤进行麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏、结扎冠脉左前降支与松结扎线，其步骤特征为：
[0028] 1.麻醉
[0029] 将大鼠置于Matrx小动物麻醉机诱导箱中，用2％～3％异氟烷诱导麻醉后，将大鼠从诱导箱中取出，在随后的手术过程中，继续用麻醉面罩给予异氟烷吸入维持麻醉。连接心电图，并且利用BL-420生物信号记录分析系统记录术前标准Ⅱ导联心电图。
[0030] 2.剪开胸部皮肤挤出心脏
[0031] 用酒精棉球擦拭手术区皮肤，剪开皮肤，用穿有4号线的缝皮针在切口两端环形穿线不结扎。分离皮下组织、胸大肌及胸小肌，于左侧第三肋间，用16号血管钳沿第三肋间钝性分离肋间肌，同时撑开3、4肋骨进入胸腔，用左手拇指及四指将心脏挤出胸腔。
[0032] 3.结扎冠脉左前降支
[0033] 在左心耳下方2mm处用眼科针4-0丝线穿线，进针为1～1.5mm，宽为2～3mm，结扎冠状动脉左前降支，此处用的是活结结扎，成功结扎冠状动脉后(1min内可见心电图Ⅱ导联ST段抬高与高耸的T波融合，呈弓背向上单向曲线，说明结扎成功)迅速将心脏送回胸腔，并将结扎线一端置于胸腔外，轻挤胸腔排出胸腔气体，同时提拉已穿好的缝皮4号线并结扎，即进行“U”字褥式缝合关闭胸腔。
[0034] 4.松结扎线
[0035] 结扎30min缺血结束后，轻拉置于胸腔外的结扎线一端，将活结松开，冠脉恢复血供，心肌顺利进行血液再灌注。可以根据实验的需要规定再灌注时间，本实施例的灌注时间是3h。
[0036] 伪手术组
[0037] 下面以30只出生8-10周，体重180-220g的雄性Wistar大鼠为例，说明本模型伪手术组大鼠的制备方法。每只大鼠都按下述依次的步骤进行麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏与冠脉左前降支只穿线不结扎，其步骤特征为：
[0038] 1麻醉
[0039] 将大鼠置于Matrx小动物麻醉机诱导箱中，用2％～3％异氟烷诱导麻醉后，将大鼠从诱导箱中取出，在随后的手术过程中，继续用麻醉面罩给予异氟烷吸入维持麻醉。连接心电图，并且利用BL-420生物信号记录分析系统记录术前标准Ⅱ导联心电图。
[0040] 2.剪开胸部皮肤挤出心脏
[0041] 用酒精棉球擦拭手术区皮肤，剪开皮肤，用穿有4号线的缝皮针在切口两端环形穿线不结扎。分离皮下组织、胸大肌及胸小肌，于左侧第三肋间，用16号血管钳沿第三肋间钝性分离肋间肌，同时撑开3、4肋骨进入胸腔，用左手拇指及四指将心脏挤出胸腔。
[0042] 3.冠脉左前降支只穿线不结扎
[0043] 在左心耳下方2mm处用眼科针4-0丝线穿线，进针为1～1.5mm，宽为2～3mm，将心脏送回胸腔，并将结扎线一端置于胸腔外，轻挤胸腔排出胸腔气体，同时提拉已穿好的缝皮4号线并结扎，即进行“U”字褥式缝合关闭胸腔。
[0044] 模型测试结果
[0045] 1.心电图ST段变化情况
[0046] 对于伪手术组大鼠，手术前后心电图ST段无明显改变，见图1；缺血/再灌注组大鼠，手术前后心电图ST段变化明显，见图2，冠状动脉结扎后1min内可见心电图Ⅱ导联ST段抬高与高耸的T波融合，呈弓背向上单向曲线，说明结扎成功。再灌注3h末，心电图ST段明显下降，且T波回落。
[0047] 2.心肌梗死面积变化情况
[0048] 再灌注3h后，结扎两组大鼠的冠脉，向每只大鼠心腔内快速注入2％Evan’s Blue，自根部剪下心脏，剪去心房、右心室，冰生理盐水漂洗，垂直于左心室长轴将其切成1～2mm厚的环形薄片，37℃水浴中1％TTC(氯化三苯四氮唑)染色15min。正常心肌为蓝色，梗死区为白色，缺血心肌未梗死区为红色。梗死区面积大小以
[0049] 表示。
[0050] 伪手术组与缺血/再灌注组(缺血30min，再灌注3h)大鼠，心肌梗死面积比较见表1：
[0051] 表1伪手术组与缺血/再灌注组大鼠心肌梗死面积比较(x±s，n＝30/组)[0052]**
[0053] 与伪手术组相比，P＜0.01
[0054] 由表1可以看出，心肌缺血/再灌注组心肌梗死面积明显高于伪手术组。
[0055] 3.心肌酶变化情况
[0056] 再灌注3h后，打开大鼠腹腔，进行腹主动脉采血，标本静置30min后离心获得血清，分别检测血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB，CK-MB)的水平，二者均是反映心肌坏死的指标。伪手术组与缺血/再灌注组(缺血30min，再灌注3h)大鼠血清心肌酶比较见表2：
[0057] 表2伪手术组与缺血/再灌注组大鼠血清心肌酶比较(x±s，n＝30/组)[0058]**
[0059] 与伪手术组相比，P＜0.01
[0060] 由表2可以看出，心肌缺血/再灌注组心肌酶明显高于伪手术组，表明缺血/再灌注组大鼠心肌出现明显的坏死。
[0061] 实施例二
[0062] 本实施例共60只雄性Wistar大鼠分为两组，每组30只。
[0063] 缺血/再灌注组
[0064] 本实施例采用30只出生8-10周，体重180-220g的雄性Wistar大鼠缺血30min，再灌注24h为例，说明本大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备方法。每只大鼠都按下述依次的步骤进行麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏、结扎冠脉左前降支与松结扎线，其步骤特征为：
[0065] 1.麻醉
[0066] 将大鼠置于Matrx小动物麻醉机诱导箱中，用2％～3％异氟烷诱导麻醉后，将大鼠从诱导箱中取出，在随后的手术过程中，继续用麻醉面罩给予异氟烷吸入维持麻醉。连接心电图，并且利用BL-420生物信号记录分析系统记录术前标准Ⅱ导联心电图。
[0067] 2.剪开胸部皮肤挤出心脏
[0068] 用酒精棉球擦拭手术区皮肤，剪开皮肤，用穿有4号线的缝皮针在切口两端环形穿线不结扎。分离皮下组织、胸大肌及胸小肌，于左侧第三肋间，用16号血管钳沿第三肋间钝性分离肋间肌，同时撑开3、4肋骨进入胸腔，用左手拇指及四指将心脏挤出胸腔。
[0069] 3.结扎冠脉左前降支
[0070] 在左心耳下方2mm处用眼科针4-0丝线穿线，进针为1～1.5mm，宽为2～3mm，结扎冠状动脉左前降支，此处用的是活结结扎，成功结扎冠状动脉后(1min内可见心电图Ⅱ导联ST段抬高与高耸的T波融合，呈弓背向上单向曲线，说明结扎成功)迅速将心脏送回胸腔，并将结扎线一端置于胸腔外，轻挤胸腔排出胸腔气体，同时提拉已穿好的缝皮4号线并结扎，即进行“U”字褥式缝合关闭胸腔。
[0071] 4.松结扎线
[0072] 结扎30min缺血结束后，轻拉置于胸腔外的结扎线一端，将活结松开，冠脉恢复血供，心肌顺利进行血液再灌注。可以根据实验的需要规定再灌注时间，本实施例的灌注时间是24h。
[0073] 伪手术组
[0074] 下面以30只出生8-10周，体重180-220g的雄性Wistar大鼠为例，说明本模型伪手术组大鼠的制备方法。每只大鼠都按下述依次的步骤进行麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏与冠脉左前降支只穿线不结扎，其步骤特征为：
[0075] 1.麻醉
[0076] 将大鼠置于Matrx小动物麻醉机诱导箱中，用2％～3％异氟烷诱导麻醉后，将大鼠从诱导箱中取出，在随后的手术过程中，继续用麻醉面罩给予异氟烷吸入维持麻醉。连接心电图，并且利用BL-420生物信号记录分析系统记录术前标准Ⅱ导联心电图。
[0077] 2.剪开胸部皮肤挤出心脏
[0078] 用酒精棉球擦拭手术区皮肤，剪开皮肤，用穿有4号线的缝皮针在切口两端环形穿线不结扎。分离皮下组织、胸大肌及胸小肌，于左侧第三肋间，用16号血管钳沿第三肋间钝性分离肋间肌，同时撑开3、4肋骨进入胸腔，用左手拇指及四指将心脏挤出胸腔。
[0079] 3.冠脉左前降支只穿线不结扎
[0080] 在左心耳下方2mm处用眼科针4-0丝线穿线，进针为1～1.5mm，宽为2～3mm，将心脏送回胸腔，并将结扎线一端置于胸腔外，轻挤胸腔排出胸腔气体，同时提拉已穿好的缝皮4号线并结扎，即进行“U”字褥式缝合关闭胸腔。
[0081] 模型测试结果
[0082] 一、心电图ST段变化情况
[0083] 对于伪手术组大鼠，手术前后心电图ST段无明显改变，见图1；缺血/再灌注组大鼠，手术前后心电图ST段变化明显，见图2，冠状动脉结扎后1min内可见心电图Ⅱ导联ST段抬高与高耸的T波融合，呈弓背向上单向曲线，说明结扎成功。再灌注24h末，心电图ST段明显下降，且T波回落。
[0084] 二、心肌梗死面积变化情况
[0085] 再灌注24h后，开胸结扎两组大鼠的冠脉，向每只大鼠心腔内快速注入2％Evan’s Blue，自根部剪下心脏，剪去心房、右心室，冰生理盐水漂洗，垂直于左心室长轴将其切成1～2mm厚的环形薄片，37℃水浴中1％TTC(氯化三苯四氮唑)染色15min。正常心肌为蓝色，梗死区为白色，缺血心肌未梗死区为红色。梗死区面积大小以
[0086] 表示。
[0087] 伪手术组与缺血/再灌注组(缺血30min，再灌注24h)大鼠心肌梗死面积比较见表3：
[0088] 表3伪手术组与缺血/再灌注组大鼠心肌梗死面积比较(x±s，n＝30/组)[0089]
[0090] **与伪手术组相比，P＜0.01
[0091] 由表3可以看出，心肌缺血/再灌注组心肌梗死面积明显高于伪手术组。
[0092] 三、心肌酶变化情况
[0093] 再灌注24h后，打开大鼠腹腔，进行腹主动脉采血，标本静置30min后离心获得血清，分别检测血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB，CK-MB)的水平，二者均是反映心肌坏死的指标。伪手术组与缺血/再灌注组(缺血30min，再灌注24h)大鼠血清心肌酶比较见表4：
[0094] 表4伪手术组与缺血/再灌注组大鼠血清心肌酶比较(x±s，n＝30/组)[0095]
[0096] **与伪手术组相比，P＜0.01
[0097] 由表4可以看出，心肌缺血/再灌注组心肌酶明显高于伪手术组，表明缺血/再灌注组大鼠心肌出现明显的坏死。
[0098] 上述两个实施例的大鼠分为缺血/再灌注组与伪手术组两个组，每组大鼠例数可少于或多于30只，但每组不少于6只。
[0099] 上述两个实施例中的伪手术组，是要证明模型是否制备成功，将缺血/再灌注组与伪手术组相比较才用的，相比较才能说明是否制备成功。
[0100] 伪手术组的每只大鼠都按下述依次的步骤进行：麻醉、剪开胸部皮肤挤出心脏、冠脉左前降支只穿线不结扎。
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