防治肾脏缺血再灌注损伤的药物组合物
阅读：543发布：2020-05-13
专利汇可以提供防治肾脏缺血再灌注损伤的药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及埃他卡林或其可药用盐用于制备具有对肾脏缺血 再灌注 损伤的保护作用、以及防治肾脏缺血再灌注损伤、以及由此导致的急性肾功能衰竭的药物中的用途。本发明还涉及一种用于防治肾脏缺血再灌注损伤的药物组合物，其中包含埃他卡林或其可药用盐、以及至少一种药物载体或稀释剂。，下面是防治肾脏缺血再灌注损伤的药物组合物专利的具体信息内容。
1.N-(1-甲基乙基)-2，3-二甲基-2-丁胺(iptakalim，埃他卡林) 或其可药用盐用于制备具有对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用、以及 防治肾脏缺血再灌注损伤、以及由此导致的急性肾功能衰竭的药物中 的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述埃他卡林的可药用盐选 自硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐；或者是乙酸盐、草酸盐、柠檬盐、葡 萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸 盐、乳酸盐和马来酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物的剂型为片剂、 颗粒剂、口服液或胶囊，优选片剂和胶囊。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物口服给药的每 日给药剂量为0.5-100mg，更优选2-50mg，特别优选5-20mg，每天给 药1-4次，更优选1-2次，疗程为1-8周。
5.权利要求1所述的用途，其中所述药物用于防治肾脏缺血再灌 注损伤、以及由此导致的急性肾功能衰竭的药物组合物中的用途。
6.一种用于防治肾脏缺血再灌注损伤的药物组合物，它包含N-(1- 甲基乙基)-2，3-二甲基-2-丁胺(iptakalim，埃他卡林)或其可药用 盐，以及至少一种药物载体或稀释剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述埃他卡林的可药用盐选 自硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐；或者是乙酸盐、草酸盐、柠檬盐、葡 萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸 盐、乳酸盐和马来酸盐。
8.根据权利要求6或7的药物组合物，其中所述药物的剂型为片 剂、颗粒剂、口服液或胶囊，优选片剂和胶囊。
技术领域
本发明涉及埃他卡林或其可药用盐用于制备具有对肾脏缺血再灌 注损伤的保护作用、以及防治肾脏缺血再灌注损伤、以及由此导致的 急性肾功能衰竭的药物中的用途。本发明还涉及一种用于防治肾脏缺 血再灌注损伤的药物组合物，其中包含埃他卡林或其可药用盐、以及 至少一种药物载体或稀释剂。
背景技术
肾脏缺血-再灌注损伤(IRI)是导致急性肾功能衰竭的主要原因， 而且还有着较高的发病率和病死率。同时，缺血再灌注损伤在移植器 官发生急性排斥反应和器官功能丧失等方面有着重要意义，可以明显 增加其危险性，导致移植肾脏出现延迟功能衰竭。
缺血再灌注损伤的机制是复杂的、多因素的，近年来，研究表明， 缺血再灌注后最早发生的两件事是ATP减少和钾离子外流。由于钾离子 的调节与内向钾离子电流有关，因此ATP敏感性钾通道(KATP)在肾脏 缺血性损伤中具有重要作用。
临床上引起肾脏缺血再灌注损伤的原因主要有心血管疾病、脓毒 症、创伤、外科手术等。虽然近年来随着肾脏缺血再灌注损伤的实验 及临床研究的深入，急性肾衰的治疗取得了很大的进展，但是随着各 种脏器手术尤其肾脏移植手术的增加以及一些新的医疗技术的开展， 因缺血再灌注所导致的急性肾功能衰竭的发生率却呈逐年上升的趋 势。目前临床上用于治疗肾衰的药物主要有利尿剂、心钠肽、胰岛素 样生长因子-1等，但循证医学尚未证实利尿药治疗能改变急性肾衰竭 的临床病程或降低死亡率。此外，扩血管药物、钙拮抗剂、血管紧张 素转换酶、生长因子等也用于肾衰的治疗，但疗效均不确切。提示目 前临床上应用的治疗肾衰竭的药物，其保护肾脏的作用还远远不够。 因此研究对缺血再灌注性肾损伤有预防或治疗作用的药物具有重要的 临床意义。
埃他卡林是军事医学科学院毒物药物研究所发现并合成的一类新 型KATP开放剂，已于2005年获得中国发明专利(具有调节钾通道功能 的胺衍生物及其制备方法和应用，中国专利，专利号：ZL01101656.6)。
埃他卡林是一种新型抗高血压药物，但是在现有文献中，迄今尚未 见到埃他卡林用于防治肾脏缺血再灌注损伤、以及由此导致的急性肾 功能衰竭的用途。
附图说明
附图1描述了埃他卡林对缺血再灌注所致大鼠肾脏皮质损伤的保 护作用。
附图2描述了埃他卡林对缺血再灌注所致大鼠肾脏髓质损伤的保 护作用。
缺血再灌注损伤的机制是复杂的、多因素的，近年来，研究表明， 缺血再灌注后最早发生的两件事是ATP减少和钾离子外流。由于钾离子 的调节与内向钾离子电流有关，因此ATP敏感性钾通道(KATP)在肾脏 缺血性损伤中具有重要作用。
临床上引起肾脏缺血再灌注损伤的原因主要有心血管疾病、脓毒 症、创伤、外科手术等。虽然近年来随着肾脏缺血再灌注损伤的实验 及临床研究的深入，急性肾衰的治疗取得了很大的进展，但是随着各 种脏器手术尤其肾脏移植手术的增加以及一些新的医疗技术的开展， 因缺血再灌注所导致的急性肾功能衰竭的发生率却呈逐年上升的趋 势。目前临床上用于治疗肾衰的药物主要有利尿剂、心钠肽、胰岛素 样生长因子-1等，但循证医学尚未证实利尿药治疗能改变急性肾衰竭 的临床病程或降低死亡率。此外，扩血管药物、钙拮抗剂、血管紧张 素转换酶、生长因子等也用于肾衰的治疗，但疗效均不确切。提示目 前临床上应用的治疗肾衰竭的药物，其保护肾脏的作用还远远不够。 因此研究对缺血再灌注性肾损伤有预防或治疗作用的药物具有重要的 临床意义。
埃他卡林是军事医学科学院毒物药物研究所发现并合成的一类新 型KATP开放剂，已于2005年获得中国发明专利(具有调节钾通道功能 的胺衍生物及其制备方法和应用，中国专利，专利号：ZL01101656.6)。
埃他卡林是一种新型抗高血压药物，但是在现有文献中，迄今尚未 见到埃他卡林用于防治肾脏缺血再灌注损伤、以及由此导致的急性肾 功能衰竭的用途。
附图说明
附图1描述了埃他卡林对缺血再灌注所致大鼠肾脏皮质损伤的保 护作用。
附图2描述了埃他卡林对缺血再灌注所致大鼠肾脏髓质损伤的保 护作用。
发明内容
本发明涉及埃他卡林或其可药用盐用于制备具有对肾脏缺血再灌 注损伤的保护作用、以及防治肾脏缺血再灌注损伤、以及由此导致的 急性肾功能衰竭的药物中的用途。本发明还涉及一种用于防治肾脏缺 血再灌注损伤的药物组合物，其中包含埃他卡林或其可药用盐、以及 至少一种药物载体或稀释剂。
为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案。
N-(1-甲基乙基)-2，3-二甲基-2-丁胺(iptakalim，埃他卡林)
本发明所述埃他卡林的可药用盐选自盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢 溴酸盐；或者是乙酸盐、草酸盐、柠檬盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、 酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐和马来酸盐。
在按照本发明的技术方案，特别优选所述化合物是埃他卡林。
埃他卡林的制备和质量检测方法可以参照中国专利“具有调节钾 通道功能的胺衍生物及其制备方法和应用”(专利号：ZL01101656.6) 中所述方法进行。其剂型优选为口服剂型，例如片剂、颗粒剂、口服 液或胶囊，优选片剂和胶囊，口服给药的每日给药剂量优选0.5-100mg， 更优选2-50mg，特别优选5-20mg，优选每天1-4次，更优选1-2次， 疗程为1-8周。
药理学研究表明，以缺血再灌注肾脏损伤大鼠为模型，从整体水平 观察埃他卡林对缺血再灌注肾脏损害的实验预防治疗学效果，发现埃 他卡林可有效的降低血清尿素氮、肌酐水平，减轻肾脏病理性改变， 同时降低缺血再灌注肾脏损伤后大鼠血浆ET-1水平，以及组织ET-1 mRNA表达水平，降低细胞的凋亡，促进细胞增生，但对细胞增殖指数 无明显影响。这些结果提示埃他卡林对缺血再灌注肾脏损伤具有保护 作用，此作用可能与其抑制血液及肾组织局部ET系统，减少细胞凋亡， 促进细胞增生，加速细胞修复有关。
本发明的发明人发现埃他卡林及其可药用盐是一类具有肾脏缺血 再灌注损伤保护作用的新型KATP开放剂，可用于由肾脏缺血再灌注损 伤导致的急性肾功能衰竭的防治。
可以按照任意常用方式给予埃他卡林，例如以肠道给药方式或非肠 道给药方式。
以下将结合实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的 范围。
实施例1
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血清尿素氮和肌酐水平的影 响
清洁级雄性Wistar大鼠36只由军事医学科学院实验动物中心提 供，体重220～280g。饲养条件：每笼6只群居饲养，12小时光照/ 黑暗，室温(24±1)℃，相对湿度45～60％，自由摄食进水。实验动 物随机分为6组：假手术组(sham group)：手术前3d用生理盐水灌胃， 每天2次，每次3ml/kg，第4天早上再灌胃一次，1小时后手术分离 肾动静脉，穿线但不夹闭左肾动静脉，24小时后剖腹由右心房取静脉 血及肾组织检查；缺血再灌注组(I/R group)：手术夹闭左肾动静脉， 45min后去除无创动脉夹缝合切口，24小时后取血及组织检查，其他 同假手术组；埃他卡林预防组(Ipt pretreated groups)分别以埃他 卡林0.5，1.0，1.5，2.0mg/kg代替生理盐水灌胃，其余同缺血再灌 注组。埃他卡林由北京恩华医药研究院有限公司合成，含量大于99.8％， 称取相应量的埃他卡林，溶于生理盐水中，动物灌胃容积为3ml/kg。 大鼠(两周前已经切除右肾)用3％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉后左侧腹 部切口，分离左侧肾动静脉用无创动脉夹夹闭45min后再放开恢复血 流24小时，造成急性缺血/再灌注肾损伤大鼠模型。3％戊巴比妥钠注 射液腹腔麻醉后，开胸腹联合切口，直视下由下腔静脉抽取2ml血液， 静置30min后，常温7500g离心，取血清用7150型全自动生化分析仪 测定。
如表1所示，缺血再灌注损伤能够明显降低肾功能，与假手术组 比较，血清尿素氮和肌酐水平分别升高500％和800％以上，差别有显 著统计学意义(P<0.01)。应用埃他卡林预防后，能够明显改善肾功 能，降低血清尿素氮和肌酐水平，且成剂量依赖性降低，其中埃他卡 林2.0mg/kg组与缺血再灌注组比较，血清尿素氮和肌酐水平分别降 低52.5％和70.8％，差别有显著统计学意义(P<0.01)。
本实验的结论：埃他卡林可显著改善缺血再灌注所致的肾脏功能 损伤。
表1.埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血浆尿素氮和肌酐含量的 影响
x±s，n＝6.BUN：尿素氮；Cr：肌酐。与假手术组比较，**P<0.01； 与缺血再灌注组比较，#P<0.05，##<0.01。
实施例2
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织病理改变的影响
埃他卡林来源及动物分组和给药方式与实施例1相同。
将大鼠处死，取出肾脏，以10％福尔马林溶液固定。将固定好的 肾脏，经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，光 镜下观察肾脏组织形态学改变，进行改良Miller评分每张切片任选 12个高倍镜视野，评分标准如表2。
如附图1和附图2所示，光镜下可见假手术组肾小管排列整齐， 间质无充血、水肿及炎症细胞浸润；而缺血再灌注组肾组织损伤明显 加重，肾皮质区近曲小管上皮细胞水肿变性，刷状缘坏死、脱落明显， 甚至有上皮细胞坏死脱落，肾小管内细胞和蛋白管型较多，肾髓质及 皮髓交界处肾小管排列稀疏、紊乱，肾小管扩张明显，内有粉染的浆 液或细胞管型以及蛋白管型，间质充血、水肿。与缺血再灌注组比较 埃他卡林组能够明显减轻缺血再灌注损伤，表现为减少肾小管上皮细 胞的坏死、细胞核和刷状缘的脱落，减轻细胞间质水肿，减轻肾髓质 及皮髓交界处淤血、充血、细胞及蛋白管型，对肾小球无明显影响。 组织病理评分示埃他卡林1.5，2.0mg/kg组(分别为1.83±0.75、1.17 ±0.75，)与缺血再灌注组(2.57±0.53)比较差别有统计学意义 (P<0.05)。
本实验的结论：埃他卡林可显著改善缺血再灌注所致的肾脏组织 病理损伤。
表2.肾组织病理损伤分级标准
实施例3
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血浆ET-1水平的影响
埃他卡林来源及动物分组和给药方式与实施例1相同。
采用放免分析方法，应用免疫分离剂分离。以I125标记制备的特 异性ET-1多克隆抗体，依据抗原抗体反应原理及竞争性拮抗原理，根 据样品管中cpm值直接从标准曲线中读取相应的ET-1含量。按试剂说 明将血浆样品与缓冲液混合，4℃温育24小时，加入I125标记ET-1混 匀4℃温育24小时，再加入免疫分离剂后室温放置20min，4℃ 7500g 离心20min，吸弃上清液，在γ计数器上测定cpm数，ET-1单位pgml-1。
如表3所示，大鼠肾脏缺血再灌注后血浆ET-1水平明显升高，由 假手术组的86.5±7.4pg·ml-1升高到缺血再灌注组的111.8±10.4 pg·ml-1，说明ET-1在肾脏缺血再灌注损伤中起了重要的作用。埃他 卡林1.5，2.0mg/kg能够明显降低血清ET-1水平，与缺血再灌注组 比较，差别有显著统计学意义(P<0.01)，与假手术组比较差别有统 计学意义(P<0.01)，说明内皮素水平尚未降低到正常值。
本实验的结论：埃他卡林可显著降低缺血再灌注时的血浆内皮素 -1水平。
表3.埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血浆内皮素-1含量的 影响
x±s，n＝6.ET-1：内皮素-1。与假手术组比较，**P<0.01；与缺血再 灌注组比较，#P<0.05，##<0.01。
实施例4
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾组织ET-1mRNA表达的影 响
埃他卡林来源及动物分组和给药方式与实施例1相同。
引物序列为：ET-1：有义链5’GCT CCT GCT CCT CCT TGA TG 3’； 反义链5’CTC GCT CTA TGT AAG TCA TGG.3’；GAPDH：有义链5’ TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA3’，反义链5’AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT3’；采用半定量RT-PCR法：(1)总RNA的提取：按照Gibco公 司Trizol总RNA提取试剂操作说明进行，提取肾组织RNA样品的A260/ A280比值大于1.8，表明没有蛋白质污染。(2)反转录成cDNA：25μl反 应体系中包括2μg RNA，Oligo(dT)15 0.02μg/μl，50mM Tris-HCl (pH8.3)，75mM KCI，10mM DTT，0.5mM dNTP，RNAase抑制剂25 单位，反转录酶M-MLV 200单位；设置不加反转录酶的为阴性对照， 加入反转录酶M-MLV为启动反应。混匀，放入PCR仪，反应条件：42 ℃ 50min，最后70℃ 15min终止反应。(3)PCR反应：25μl PCR反应 体系中包括10mM Tris-HCI，10mM KCl，8mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2， 0.2mM dNTP，2μl cDNA，2.5单位Taq DNA聚合酶，上下游引物各 为1pM。PCR反应条件：94℃ 5min预变性，然后变性94℃ 30s，退 火60℃，30s，延伸72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。 (4)半定量分析PCR产物：取5μl RT-PCR产物进行以琼脂糖凝胶电泳 分析(2％)，用凝胶成像仪对目的条带进行扫描，用凝胶成像分析软件 进行分析(Labwork 4.0)，以内参照基因GAPDH表达量为基准，读取目 的条带的光密度值(OD)，计算目的条带与GAPDH基因OD值的比值间 接表示目的基因mRNA表达量。
如表4所示，缺血再灌注组肾组织ET-1 mRNA表达水平均较假手 术组大鼠明显增加，相同实验条件下，埃他卡林0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg均可明显下调高表达的ET-1 mRNA水平。
本实验的结论：埃他卡林可逆转缺血再灌注所致肾脏损伤时肾组 织中内皮素-1基因表达水平的病理性增高。
表4.埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织中内皮素-1 mRNA表达的影响
x±s，n＝5.ET-1：内皮素-1；GAPDH：内参照基因。与假手术组比较， *P<0.05；与缺血再灌注组比较，#P<0.05，##<0.01。
为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案。
N-(1-甲基乙基)-2，3-二甲基-2-丁胺(iptakalim，埃他卡林)
本发明所述埃他卡林的可药用盐选自盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢 溴酸盐；或者是乙酸盐、草酸盐、柠檬盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、 酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐和马来酸盐。
在按照本发明的技术方案，特别优选所述化合物是埃他卡林。
埃他卡林的制备和质量检测方法可以参照中国专利“具有调节钾 通道功能的胺衍生物及其制备方法和应用”(专利号：ZL01101656.6) 中所述方法进行。其剂型优选为口服剂型，例如片剂、颗粒剂、口服 液或胶囊，优选片剂和胶囊，口服给药的每日给药剂量优选0.5-100mg， 更优选2-50mg，特别优选5-20mg，优选每天1-4次，更优选1-2次， 疗程为1-8周。
药理学研究表明，以缺血再灌注肾脏损伤大鼠为模型，从整体水平 观察埃他卡林对缺血再灌注肾脏损害的实验预防治疗学效果，发现埃 他卡林可有效的降低血清尿素氮、肌酐水平，减轻肾脏病理性改变， 同时降低缺血再灌注肾脏损伤后大鼠血浆ET-1水平，以及组织ET-1 mRNA表达水平，降低细胞的凋亡，促进细胞增生，但对细胞增殖指数 无明显影响。这些结果提示埃他卡林对缺血再灌注肾脏损伤具有保护 作用，此作用可能与其抑制血液及肾组织局部ET系统，减少细胞凋亡， 促进细胞增生，加速细胞修复有关。
本发明的发明人发现埃他卡林及其可药用盐是一类具有肾脏缺血 再灌注损伤保护作用的新型KATP开放剂，可用于由肾脏缺血再灌注损 伤导致的急性肾功能衰竭的防治。
可以按照任意常用方式给予埃他卡林，例如以肠道给药方式或非肠 道给药方式。
以下将结合实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的 范围。
实施例1
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血清尿素氮和肌酐水平的影 响
清洁级雄性Wistar大鼠36只由军事医学科学院实验动物中心提 供，体重220～280g。饲养条件：每笼6只群居饲养，12小时光照/ 黑暗，室温(24±1)℃，相对湿度45～60％，自由摄食进水。实验动 物随机分为6组：假手术组(sham group)：手术前3d用生理盐水灌胃， 每天2次，每次3ml/kg，第4天早上再灌胃一次，1小时后手术分离 肾动静脉，穿线但不夹闭左肾动静脉，24小时后剖腹由右心房取静脉 血及肾组织检查；缺血再灌注组(I/R group)：手术夹闭左肾动静脉， 45min后去除无创动脉夹缝合切口，24小时后取血及组织检查，其他 同假手术组；埃他卡林预防组(Ipt pretreated groups)分别以埃他 卡林0.5，1.0，1.5，2.0mg/kg代替生理盐水灌胃，其余同缺血再灌 注组。埃他卡林由北京恩华医药研究院有限公司合成，含量大于99.8％， 称取相应量的埃他卡林，溶于生理盐水中，动物灌胃容积为3ml/kg。 大鼠(两周前已经切除右肾)用3％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉后左侧腹 部切口，分离左侧肾动静脉用无创动脉夹夹闭45min后再放开恢复血 流24小时，造成急性缺血/再灌注肾损伤大鼠模型。3％戊巴比妥钠注 射液腹腔麻醉后，开胸腹联合切口，直视下由下腔静脉抽取2ml血液， 静置30min后，常温7500g离心，取血清用7150型全自动生化分析仪 测定。
如表1所示，缺血再灌注损伤能够明显降低肾功能，与假手术组 比较，血清尿素氮和肌酐水平分别升高500％和800％以上，差别有显 著统计学意义(P<0.01)。应用埃他卡林预防后，能够明显改善肾功 能，降低血清尿素氮和肌酐水平，且成剂量依赖性降低，其中埃他卡 林2.0mg/kg组与缺血再灌注组比较，血清尿素氮和肌酐水平分别降 低52.5％和70.8％，差别有显著统计学意义(P<0.01)。
本实验的结论：埃他卡林可显著改善缺血再灌注所致的肾脏功能 损伤。
表1.埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血浆尿素氮和肌酐含量的 影响
x±s，n＝6.BUN：尿素氮；Cr：肌酐。与假手术组比较，**P<0.01； 与缺血再灌注组比较，#P<0.05，##<0.01。
实施例2
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织病理改变的影响
埃他卡林来源及动物分组和给药方式与实施例1相同。
将大鼠处死，取出肾脏，以10％福尔马林溶液固定。将固定好的 肾脏，经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，光 镜下观察肾脏组织形态学改变，进行改良Miller评分每张切片任选 12个高倍镜视野，评分标准如表2。
如附图1和附图2所示，光镜下可见假手术组肾小管排列整齐， 间质无充血、水肿及炎症细胞浸润；而缺血再灌注组肾组织损伤明显 加重，肾皮质区近曲小管上皮细胞水肿变性，刷状缘坏死、脱落明显， 甚至有上皮细胞坏死脱落，肾小管内细胞和蛋白管型较多，肾髓质及 皮髓交界处肾小管排列稀疏、紊乱，肾小管扩张明显，内有粉染的浆 液或细胞管型以及蛋白管型，间质充血、水肿。与缺血再灌注组比较 埃他卡林组能够明显减轻缺血再灌注损伤，表现为减少肾小管上皮细 胞的坏死、细胞核和刷状缘的脱落，减轻细胞间质水肿，减轻肾髓质 及皮髓交界处淤血、充血、细胞及蛋白管型，对肾小球无明显影响。 组织病理评分示埃他卡林1.5，2.0mg/kg组(分别为1.83±0.75、1.17 ±0.75，)与缺血再灌注组(2.57±0.53)比较差别有统计学意义 (P<0.05)。
本实验的结论：埃他卡林可显著改善缺血再灌注所致的肾脏组织 病理损伤。
表2.肾组织病理损伤分级标准
实施例3
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血浆ET-1水平的影响
埃他卡林来源及动物分组和给药方式与实施例1相同。
采用放免分析方法，应用免疫分离剂分离。以I125标记制备的特 异性ET-1多克隆抗体，依据抗原抗体反应原理及竞争性拮抗原理，根 据样品管中cpm值直接从标准曲线中读取相应的ET-1含量。按试剂说 明将血浆样品与缓冲液混合，4℃温育24小时，加入I125标记ET-1混 匀4℃温育24小时，再加入免疫分离剂后室温放置20min，4℃ 7500g 离心20min，吸弃上清液，在γ计数器上测定cpm数，ET-1单位pgml-1。
如表3所示，大鼠肾脏缺血再灌注后血浆ET-1水平明显升高，由 假手术组的86.5±7.4pg·ml-1升高到缺血再灌注组的111.8±10.4 pg·ml-1，说明ET-1在肾脏缺血再灌注损伤中起了重要的作用。埃他 卡林1.5，2.0mg/kg能够明显降低血清ET-1水平，与缺血再灌注组 比较，差别有显著统计学意义(P<0.01)，与假手术组比较差别有统 计学意义(P<0.01)，说明内皮素水平尚未降低到正常值。
本实验的结论：埃他卡林可显著降低缺血再灌注时的血浆内皮素 -1水平。
表3.埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血浆内皮素-1含量的 影响
x±s，n＝6.ET-1：内皮素-1。与假手术组比较，**P<0.01；与缺血再 灌注组比较，#P<0.05，##<0.01。
实施例4
埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾组织ET-1mRNA表达的影 响
埃他卡林来源及动物分组和给药方式与实施例1相同。
引物序列为：ET-1：有义链5’GCT CCT GCT CCT CCT TGA TG 3’； 反义链5’CTC GCT CTA TGT AAG TCA TGG.3’；GAPDH：有义链5’ TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA3’，反义链5’AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT3’；采用半定量RT-PCR法：(1)总RNA的提取：按照Gibco公 司Trizol总RNA提取试剂操作说明进行，提取肾组织RNA样品的A260/ A280比值大于1.8，表明没有蛋白质污染。(2)反转录成cDNA：25μl反 应体系中包括2μg RNA，Oligo(dT)15 0.02μg/μl，50mM Tris-HCl (pH8.3)，75mM KCI，10mM DTT，0.5mM dNTP，RNAase抑制剂25 单位，反转录酶M-MLV 200单位；设置不加反转录酶的为阴性对照， 加入反转录酶M-MLV为启动反应。混匀，放入PCR仪，反应条件：42 ℃ 50min，最后70℃ 15min终止反应。(3)PCR反应：25μl PCR反应 体系中包括10mM Tris-HCI，10mM KCl，8mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2， 0.2mM dNTP，2μl cDNA，2.5单位Taq DNA聚合酶，上下游引物各 为1pM。PCR反应条件：94℃ 5min预变性，然后变性94℃ 30s，退 火60℃，30s，延伸72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。 (4)半定量分析PCR产物：取5μl RT-PCR产物进行以琼脂糖凝胶电泳 分析(2％)，用凝胶成像仪对目的条带进行扫描，用凝胶成像分析软件 进行分析(Labwork 4.0)，以内参照基因GAPDH表达量为基准，读取目 的条带的光密度值(OD)，计算目的条带与GAPDH基因OD值的比值间 接表示目的基因mRNA表达量。
如表4所示，缺血再灌注组肾组织ET-1 mRNA表达水平均较假手 术组大鼠明显增加，相同实验条件下，埃他卡林0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg均可明显下调高表达的ET-1 mRNA水平。
本实验的结论：埃他卡林可逆转缺血再灌注所致肾脏损伤时肾组 织中内皮素-1基因表达水平的病理性增高。
表4.埃他卡林对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织中内皮素-1 mRNA表达的影响
x±s，n＝5.ET-1：内皮素-1；GAPDH：内参照基因。与假手术组比较， *P<0.05；与缺血再灌注组比较，#P<0.05，##<0.01。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种脑缺血再灌注损伤动物模型的制作方法 | 2020-05-13 | 242 |
| SiRNA在器官储存/再灌注溶液中的应用 | 2020-05-12 | 420 |
| GW3965用于制备防治肾缺血再灌注损伤药物的应用 | 2020-05-12 | 300 |
| 治疗缺血再灌注损伤的化合物 | 2020-05-11 | 813 |
| 治疗和预防远端缺血-再灌注损伤 | 2020-05-11 | 573 |
| 一种用于防治脑缺血再灌注损伤的药物组合物 | 2020-05-13 | 319 |
| 一种抗缺血与再灌注损伤药物 | 2020-05-11 | 705 |
| 可再灌注塑料瓶的洗涤方法 | 2020-05-12 | 579 |
| 一种腹腔镜外科手术用气体灌注和再循环系统 | 2020-05-13 | 127 |
| C1抑制剂在预防缺血-再灌注损伤中的应用 | 2020-05-13 | 503 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈