人源化抗‑αvβ5抗体及其用途
阅读：296发布：2021-09-16
专利汇可以提供人源化抗‑αvβ5抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了结合αvβ5的人源化 抗体 和抗体 片段 。还公开了使用所公开的抗体和抗体片段 治疗 或 预防 αvβ5介导的 疾病 的方法。，下面是人源化抗‑αvβ5抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种特异性结合αvβ5的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的重链可变区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含与SEQ ID NO：8至12中的任一个所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含与SEQ ID NO：8至12中的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的轻链可变区。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含与SEQ ID NO：8至12中的任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含与SEQ ID NO：8至12中的任一个所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变区。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含与SEQ ID NO：8至12中的任一个所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的轻链可变区。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
8所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
9所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区；或
与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链可变区。
12.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
8所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
9所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的轻链可变区；或
与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的轻链可变区。
13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
8所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
9所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区；或
与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变区。
14.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
9所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变区；或
与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变区。
15.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
8所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
9所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的轻链可变区；
与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的轻链可变区；或
与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO：
10所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的轻链可变区。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR 1、2和3，其中所述重链CDR 1包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述重链CDR 2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，并且所述重链CDR 3包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR 1、2和3，其中所述重链CDR 1包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述重链CDR 2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，并且重链CDR 3包含SEQ ID NO：
15所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR 1、2和3，其中所述轻链CDR 1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述轻链CDR 2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并且所述轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR 1、2和3，其中所述轻链CDR 1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述轻链CDR 2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链CDR 1、2和3，其中重链CDR 1包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述重链CDR 2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，并且所述重链CDR 3包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；和
轻链CDR 1、2和3，其中所述轻链CDR 1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述轻链CDR 2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并且所述轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下氨基酸的至少一个：
(a)在所述可变重链中：位置4处的缬氨酸、位置5处的谷氨酰胺、位置6处的谷氨酰胺、位置16处的谷氨酸、位置23处的赖氨酸、位置38处的赖氨酸、位置66处的赖氨酸、位置67处的丙氨酸、位置69处的亮氨酸、位置71处的丙氨酸、位置72处的缬氨酸、位置73处的苏氨酸、位置75处的脯氨酸或丝氨酸和/或位置78处的丙氨酸；和
(b)在所述可变轻链中：位置1处的天冬酰胺、位置11处的亮氨酸、位置12处的苏氨酸、位置13处的缬氨酸、位置21处的甲硫氨酸、位置22处的丝氨酸、位置43处的丝氨酸、位置60处的天冬氨酸、位置63处的苏氨酸、位置78处的缬氨酸、位置100处的丙氨酸和/或位置104处的亮氨酸(根据Kabat编号)。
22.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链CDR 1、2和3，其中所述重链CDR 1包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述重链CDR 2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，并且所述重链CDR 3包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；和
轻链CDR 1、2和3，其中所述轻链CDR 1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述轻链CDR 2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并且所述轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区；或
包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的重链可变区。
24.根据权利要求23所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的轻链可变区。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有选自由以下组成的组的同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域。
27.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，并且其中所述抗体包含S228P和N297Q突变(根据Kabat编号)。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、双抗体、scFv和sc(Fv)2。
29.一种抗体，其包含以下所示的氨基酸序列
(i)SEQ ID NO：69和70；
(ii)SEQ ID NO：69和82；
(iii)SEQ ID NO：80和82；或
(iv)SEQ ID NO：81和70。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中将所述抗体缀合至选自由以下组成的组的物质：毒素、放射性核素、荧光标记物、聚乙二醇和细胞毒性剂。
31.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
32.一种治疗有此需要的人受试者的急性肾损伤的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
33.一种治疗有此需要的人受试者的急性肺损伤的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
34.一种治疗有此需要的人受试者的中风的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
35.一种治疗有此需要的人受试者的眼新生血管化疾病的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
36.一种治疗有此需要的人受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
37.一种治疗有此需要的人受试者的心肌梗死的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
38.一种治疗有此需要的人受试者的肺水肿的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
39.一种治疗有此需要的人受试者的肺纤维化的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述肺纤维化是常见间质性肺炎。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化。
42.一种治疗有此需要的人受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
43.一种抑制有此需要的人受试者中的血管生成的方法，所述方法包括向所述人受试者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
44.一种分离的核酸，所述核酸包含与选自由SEQ ID NO：95-102、34和53-55组成的组的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
45.根据权利要求44所述的分离的核酸，所述核酸包含选自由SEQ ID NO：95-102、34和
53-55组成的组的核苷酸序列。
46.一种分离的核酸，所述核酸包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO：1-7、8-12、69、70、80、81和82组成的组的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
47.根据权利要求46所述的分离的核酸，所述核酸包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自由SEQ ID NO：1-7、8-12、69、70、80、81和82组成的组的氨基酸序列。
48.一种分离的蛋白质，所述蛋白质由权利要求44至47中任一项的核酸编码。
49.一种重组载体，所述载体包含权利要求44至47中任一项的核酸。
50.一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求49的重组载体。
51.一种制备人源化抗体的方法，所述方法包括在适于表达人源化抗体的条件下培养包含重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含：
SEQ ID NO：99和53所示的核酸序列；
SEQ ID NO：99和102所示的核酸序列；
SEQ ID NO：97和102所示的核酸序列；
SEQ ID NO：100和53所示的核酸序列；或
SEQ ID NO：99和34所示的核酸序列；
其中表达人源化抗体链并产生人源化抗体。
52.根据权利要求51所述的方法，所述方法还包括分离所述人源化抗体。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
人源化抗-αvβ5抗体及其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0003] 领域
[0005] 背景
[0006] 整联蛋白是细胞表面糖蛋白受体，其结合细胞外基质蛋白并介导细胞与细胞间和细胞与细胞外基质间相互作用以及细胞与病原体间相互作用。这些受体由非共价缔合的阿尔法(α)和贝塔(β)链组成，所述α和β链组合以产生具有不同细胞和粘附特异性的多种异二聚体蛋白。这些蛋白质可以与细胞表面配体、跨膜蛋白、可溶性蛋白酶、病原体和生长因子相互作用。
[0007] αvβ5整联蛋白是唯一含有β5亚基的整联蛋白。αv和β5都已被测序和表征(分别见Hynes，1992(同上)和美国专利第5,527,679号)。αvβ5识别RGD肽序列并结合玻连蛋白(Hynes,Cell,69:11-25(1992)。另外，αvβ5可通过需要完整的细胞骨架和细胞收缩的机制激活TGF-β。TGFβ1通常以由3种蛋白质组成的复合物形式分泌，所述蛋白质包括TGFβ1、潜伏相关肽β1(LAP-β1)和潜态TGFβ(LTGFβ)结合蛋白1(LTBP-1)的生物活性肽。TGFβ1与LAP-β1形成称为小潜态复合物(SLC)的非共价复合物，并且在此构型下，TGFβ1不能结合于其受体。αvβ5通过识别RGD基序结合小潜态复合物(SLC)的潜伏相关肽β1(LAP-β1)并导致TGF-β的激活。此外，αvβ5特异性调节由血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管通透性的增加。然而，血管通透性的αvβ5调节并不单限于VEGF诱导的作用；αvβ5的阻断防止由几种不同的水肿发生(edemagenic)激动剂(包括TGF-β和凝血酶)诱导的单层通透性。
[0009] 概述
[0011] 在一个方面，本申请公开了特异性结合αvβ5和/或β5的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1至7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链可变区。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1至7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的重链可变区。
[0012] 在某些实施方案中，特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段还包含与SEQ ID NO：8至12中的任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的轻链可变区。
[0013] 在一些实施方案中，特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区，并且包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区。
[0014] 在其它实施方案中，特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区，并且包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区。
[0015] 在其它实施方案中，特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区，并且包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区。
[0016] 在某些实施方案中，特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区，并且包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区。
[0017] 在其它实施方案中，特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变区，并且包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变区。
[0018] 在一些实施方案中，上述抗体可包含重链互补决定区(CDR)1、2和3，其中重链CDR 1包含SEQ ID NO：13、58、60或62所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：13、58、60或62所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，重链CDR 2包含SEQ ID NO：14、59、61或63所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：14、59、61或63所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且重链CDR3包含SEQ ID NO：15或64所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：15或64所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0019] 在一个实施方案中，上述抗体包含重链CDR 1、2和3，其中重链CDR 1包含SEQ ID NO：13、58、60或62所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，重链CDR 2包含SEQ ID NO：14、59、61或63所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且重链CDR 3包含SEQ ID NO：
15或64所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
15或64所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0020] 在另一个实施方案中，上述抗体包含重链CDR 1、2和3，其中重链CDR 1包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，重链CDR 2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且重链CDR 3包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0021] 在一些实施方案中，上述抗体可包含轻链CDR 1、2和3，其中轻链CDR 1包含SEQ ID NO：16或65所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：16或65所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，轻链CDR2包含SEQ ID NO：17或66所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：17或66所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列或在
2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0022] 在一个实施方案中，上述抗体包含轻链CDR 1、2和3，其中轻链CDR1包含SEQ ID NO：16或65所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，轻链CDR2包含SEQ ID NO：17或66所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且轻链CDR3包含SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0023] 在另一个实施方案中，上述抗体包含轻链CDR 1、2和3，其中轻链CDR1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，轻链CDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0024] 在一些实施方案中，上述抗体可包含重链互补决定区(CDR)1、2和3，其中重链CDR1包含SEQ ID NO：13、58、60或62所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：13、58、60或62所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，重链CDR2包含SEQ ID NO：14、59、61或63所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：14、59、61或63所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且重链CDR 3包含SEQ ID NO：15或64所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：15或64所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成；并且还包含轻链CDR 1、2和3，其中轻链CDR1包含SEQ ID NO：16或65所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：16或65所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，轻链CDR2包含SEQ ID NO：17或
66所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：17或66所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
66所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：17或66所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列或在2个或更少的氨基酸位置处具有取代的SEQ ID NO：18或67所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0025] 在一个实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含重链CDR 1、2和3，其中重链CDR 1包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，重链CDR 2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且重链CDR 3包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成；和轻链CDR 1、2和3，其中轻链CDR 1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，轻链CDR 2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成，并且轻链CDR 3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0026] 在一些情况下，上文公开的抗体或抗原结合片段包含以下氨基酸中的1至26个(即，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或26个)氨基酸：(a)在可变重链中：位置4处的缬氨酸、位置5处的谷氨酰胺、位置6处的谷氨酰胺、位置16处的谷氨酸、位置23处的赖氨酸、位置38处的赖氨酸、位置66处的赖氨酸、位置67处的丙氨酸、位置69处的亮氨酸、位置
71处的丙氨酸、位置72处的缬氨酸、位置73处的苏氨酸、位置75处的脯氨酸或丝氨酸和/或位置78处的丙氨酸；和(b)在可变轻链中：位置1处的天冬酰胺、位置11处的亮氨酸、位置12处的苏氨酸、位置13处的缬氨酸、位置21处的甲硫氨酸、位置22处的丝氨酸、位置43处的丝氨酸、位置60处的天冬氨酸、位置63处的苏氨酸、位置78处的缬氨酸、位置100处的丙氨酸和/或位置104处的亮氨酸(根据Kabat编号)。
71处的丙氨酸、位置72处的缬氨酸、位置73处的苏氨酸、位置75处的脯氨酸或丝氨酸和/或位置78处的丙氨酸；和(b)在可变轻链中：位置1处的天冬酰胺、位置11处的亮氨酸、位置12处的苏氨酸、位置13处的缬氨酸、位置21处的甲硫氨酸、位置22处的丝氨酸、位置43处的丝氨酸、位置60处的天冬氨酸、位置63处的苏氨酸、位置78处的缬氨酸、位置100处的丙氨酸和/或位置104处的亮氨酸(根据Kabat编号)。
[0027] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的重链可变区。
[0028] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
[0029] 上述抗体可具有选自由以下组成的组的同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方案中，抗体具有IgG1同种型。在其它实施方案中，抗体具有IgG4同种型。在一些情况下，抗体包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域。在某些情况下，抗体还包含S228P和/或N297Q突变(根据Kabat编号)。
[0030] 在一些实施方案中，上述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、双抗体、scFv和sc(Fv)2。
[0031] 在某些实施方案中，抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链包含SEQ ID NO：69和70、SEQ ID NO：69和82、SEQ ID NO：80和82或SEQ ID NO：81和70所示的氨基酸序列/由所述氨基酸序列组成。
[0033] 在一些实施方案中，本公开提供了包含上述抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0034] 在一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的急性肾损伤的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0035] 在另一方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的急性肺损伤的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0038] 在一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的肺水肿的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0039] 在另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的急性呼吸窘迫综合征的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0040] 在另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的哮喘的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0041] 在另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的败血症的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0042] 在另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的癌症(例如，胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌和子宫内膜癌)，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0043] 在一个方面，本公开提供了抑制有此需要的人受试者的血管生成的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0044] 在另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的心肌梗死的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0045] 在另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的血脂异常的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0046] 在另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的人受试者的肥胖症的方法，其包括向人受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。
[0047] 在不同的方面，本公开提供了分离的核酸，其包含与选自由SEQ ID NO：95至102、34和53至55组成的组的核苷酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少
89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开涵盖由这些核酸编码的蛋白质。在其它实施方案中，本申请包括包含这些核酸的载体。在某些实施方案中，将所述载体转染或转化至宿主细胞(例如，CHO DG44i或CHO K1 GS)中。
89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开涵盖由这些核酸编码的蛋白质。在其它实施方案中，本申请包括包含这些核酸的载体。在某些实施方案中，将所述载体转染或转化至宿主细胞(例如，CHO DG44i或CHO K1 GS)中。
[0048] 在不同的方面，本公开提供了分离的核酸，其包含与选自由SEQ ID NO：1-7、8-12、69、70、80、81和82组成的组的核苷酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开涵盖由这些核酸编码的蛋白质。在其它实施方案中，本申请包括包含这些核酸的载体。在某些实施方案中，将所述载体转染或转化至宿主细胞(例如CHO DG44i或CHO K1 GS)中。
97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开涵盖由这些核酸编码的蛋白质。在其它实施方案中，本申请包括包含这些核酸的载体。在某些实施方案中，将所述载体转染或转化至宿主细胞(例如CHO DG44i或CHO K1 GS)中。
[0049] 在另一个方面，本公开提供了制备人源化抗体的方法。所述方法包括培养包含含有上述核酸的重组载体的宿主细胞。例如，所述核酸序列包括SEQ ID NO：99和53所示的那些核酸序列；SEQ ID NO：99和102所示的那些核酸序列；SEQ ID NO：97和102所示的那些核酸序列；SEQ ID NO：100和53所示的那些核酸序列；和SEQ ID NO：99和34所示的那些核酸序列。在适于表达抗体(例如，人源化抗体)的条件下进行培养。表达抗体链并产生抗体。在某些实施方案中，所述方法包括分离抗体。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞(例如CHO DG44i或CHO K1 GS)。
[0050] 在另一个方面，本公开提供了特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段，其适合用于治疗人受试者和用于大规模生产和储存。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段相较于鼠αvβ5抗体(例如，ALULA、小鼠嵌合ALULA)和/或其它人源化抗-αvβ5抗体，显示出改善的结合和抑制性质。可以如实施例6中所示测试此类改善的结合和抑制性质。另外，在一些实施方案中，抗-αvβ5抗体显示减少的片段化并且在低pH下维持比许多其它人源化抗-αvβ5抗体更高水平的单体完整性。此外，在一些实施方案中，所述抗-αvβ5抗体显示与其它人源化抗-αvβ5抗体相当的构象稳定性。同样地，在一些实施方案中，相较于其它人源化抗-αvβ5抗体，抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段在加速影响因素条件诸如升高的温度、冻融和/或搅动下显示出更大的抗聚集性。在一个实施方案中，该方面的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的VH。在一个实施方案中，该方面的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的VL。
[0051] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了示例性方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，以包括定义在内的本申请为准。材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
[0054] 图1是显示人源化抗-αvβ5抗体的降低效应子功能不影响其在大鼠缺血-再灌注模型中测定的功效的图。
[0055] 图2是7个人源化ALULA VH区的可变重链(VH)氨基酸序列与ALULA(即鼠抗-αvβ5抗体)的VH区的比对。与人源化VH0 CDR移植物相比，人源化形式VH1至VH6中的突变以粗体小写字体显示。在ALULA VH区与人源化ALULA VH CDR移植物之间相异的氨基酸以灰色突出显示。CDR区(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)加有下划线。
[0056] 图3是5个人源化ALULA VL区的可变轻链(VL)氨基酸序列与ALULA的VL区的比对。与人源化VL0 CDR移植物相比，人源化形式VL1至VL4中的突变以粗体小写字体显示。在ALULA VL区与人源化ALULA VL CDR移植物之间相异的氨基酸以灰色突出显示。CDR区
(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)加有下划线。
(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)加有下划线。
[0057] 图4是使用本文所述的人源化ALULA抗体进行的，评估它们在利用ALULA的竞争ELISA中与可溶性纯化的人αvβ5蛋白的结合的实验的图示。
[0058] 图5是为测定人源化抗-αvβ5抗体H4/L2(由SEQ ID NO：69和70组成)在大鼠单侧缺血钳模型中预防肾缺血的效力而进行的实验的结果的图示。
[0060] 图6B是在40℃/75％RH条件下2周后，如通过SEC测定的指定抗体构建体的低分子量(LMW)蛋白质片段的图形描述。
[0061] 图6C是在40℃/75％RH条件下2周后，如通过GXII LabChip测定的指定抗体构建体的单体百分比的图形描述。
[0062] 图7A是显示在40℃/75％RH条件下并在升高的浓度下2周后，通过SEC测定的指定抗体构建体的聚集体的增加(高分子量种类％)的条形图。
[0063] 图7B是描绘在多个冻融循环后在升高的浓度下，通过SEC测定的指定抗体构建体的聚集体的增加(HMW％)的条形图。
[0064] 图7C是显示在升高的浓度下多次室温搅拌后，通过SEC测定的指定抗体构建体的聚集体的增加(HMW％)的条形图。
[0065] 详述
[0066] 本公开表征了特异性结合αvβ5整联蛋白和/或该整联蛋白的β5亚基的抗体和抗原结合片段。所述αvβ5整联蛋白识别多种配体中的RGD肽序列。例如，本文所述的抗体及其抗原结合片段阻断αvβ5与其配体诸如玻连蛋白之间的相互作用。另外，本文所述的抗体及其抗原结合片段还可阻断αvβ5与其一种或多种其它配体(诸如纤连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白c、腱生蛋白、血纤蛋白原、层粘连蛋白、基质金属蛋白酶-2、骨调节蛋白、凝血酶原、血小板反应蛋白，Von Willebrand因子(vWF)和腺病毒五邻体基质)之间的相互作用。本文所述的抗体或其抗原结合片段还可抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；抑制TGF-β的活化；结合大鼠、小鼠、食蟹猴和人αvβ5；以0.01至2nM(例如，0.02、0.04、0.06、0.08、1.0、1.2、1.4、1.6或1.8nM)的KD结合于在细胞表面(例如，BaF3)上表达的αvβ5；以约5pM至约500pM(例如，
25pM至500pM、25pM至150pM、50pM至100pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、
65pM、70pM、75pM、80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、125pM或150pM)的表观亲和力结合重组αvβ
5；在ELISA测定中使用纯化的蛋白质抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50值为约1nM至约
5nM(例如，1nM、1.5nM、2.0nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、
3.0nM、3.2nM、3.5nM、3.8nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM)；和/或在细胞粘附测定中抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50为0.1至2nM(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、
1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8nM)。本文所述的抗体和抗原结合片段阻断αvβ5，从而抑制血管通透性(响应炎症和损伤)；抑制内皮迁移；以及抑制TGF-β活化和纤维化。这些抗体和抗原结合片段可用于治疗多种病症诸如急性肾损伤、急性肺损伤、中风(脑出血)、急性呼吸窘迫综合征、肺水肿、肺纤维化(例如，特发性肺纤维化IPF)、常见间质性肺炎(UIP))、败血症、心肌梗死、癌症(例如，胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌和子宫内膜癌)和眼新生血管化疾病。另外，本公开的抗体或抗原结合片段可用于治疗或预防病原性(例如，病毒性)感染，其中所述病原性感染至少部分地通过病原体的含RGD的蛋白与αvβ5之间的相互作用进行。
25pM至500pM、25pM至150pM、50pM至100pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、
65pM、70pM、75pM、80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、125pM或150pM)的表观亲和力结合重组αvβ
5；在ELISA测定中使用纯化的蛋白质抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50值为约1nM至约
5nM(例如，1nM、1.5nM、2.0nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、
3.0nM、3.2nM、3.5nM、3.8nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM)；和/或在细胞粘附测定中抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50为0.1至2nM(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、
1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8nM)。本文所述的抗体和抗原结合片段阻断αvβ5，从而抑制血管通透性(响应炎症和损伤)；抑制内皮迁移；以及抑制TGF-β活化和纤维化。这些抗体和抗原结合片段可用于治疗多种病症诸如急性肾损伤、急性肺损伤、中风(脑出血)、急性呼吸窘迫综合征、肺水肿、肺纤维化(例如，特发性肺纤维化IPF)、常见间质性肺炎(UIP))、败血症、心肌梗死、癌症(例如，胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌和子宫内膜癌)和眼新生血管化疾病。另外，本公开的抗体或抗原结合片段可用于治疗或预防病原性(例如，病毒性)感染，其中所述病原性感染至少部分地通过病原体的含RGD的蛋白与αvβ5之间的相互作用进行。
[0067] αv：
[0068] 人αv蛋白(Uniprot登录号P06756-1)的氨基酸序列示于下面：
[0069]
[0070] 人β5蛋白( 登录号NP_002204.2)的氨基酸序列示于下面：
[0071]MPRAPAPLYACLLGLCALLPRLAGLNICTSGSATSCEECLLIHPKCAWCSKEDFGSPRSITSRCDLRANLVKNGCGGEIESPASSFHVLRSLPLSSKGSGSAGWDVIQMTPQEIAVNLRPGDKTTFQLQVRQVEDYPVDLYYLMDLSLSMKDDLDNIRSLGTKLAEEMRKLTSNFRLGFGSFVDKDISPFSYTAPRYQTNPCIGYKLFPNCVPSFGFRHLLPLTDRVDSFNEEVRKQRVSRNRDAPEGGFDAVLQAAVCKEKIGwRKDALHLLVFTTDDVPHIALDGKLGGLVQPHDGQCHLNEANEYTASNQMDYPSLALLGEKLAENNINLIFAVTKNHYMLYKNFTALIPGTTVEILDGDSKNIIQLIINAYNSIRSKVELSVWDQPEDLNLFFTATCQDGVSYPGQRKCEGLKIGDTASFEVSLEARSCPSRHTEHVFALRPVGFRDSLEVGVTYNCTCGCSVGLEPNSARCNGSGTYVCGLCECSPGYLGTRCECQDGENQSVYQNLCREAEGKPLCSGRGDCSCNQCSCFESEFGKIYGPFCECDNFSCARNKGVLCSGHGECHCGECKCHAGYIGDNCNCSTDISTCRGRDGQICSERGHCLCGQCQCTEPGAFGEMCEKCPTCPDACSTKRDCVECLLLHSGKPDNQTCHSLCRDEVITWVDTIVKDDQEAVLCFYKTAKDCVMMFTYVELPSGKSNLTVLREPECGNTPNAMTILLAVVGSILLVGLALLAIWKLLVTIHDRREFAKFQSERSRARYEMASNPLYRKPISTHTVDFTFNKFNKSYNGTVD(SEQ ID NO：51)
[0072] 鼠β5蛋白( 登录号NP_001139356.1)的氨基酸序列示于下面：
[0073]MPRVPATLYACLLGLCALVPRLAGLNICTSGSATSCEECLLIHPKCAWCSKEYFGNPRSITSRCDLKANLIRNGCEGEIESPASSTHVLRNLPLSSKGSSATGSDVIQMTPQEIAVSLRPGEQTTFQLQVRQVEDYPVDLYYLMDLSLSMKDDLENIRSLGTKLAEEMRKLTSNFRLGFGSFVDKDISPFSYTAPRYQTNPCIGYKLFPNCVPSFGFRHLLPLTDRVDSFNEEVRKQRVSRNRDAPEGGFDAVLQAAVCKEKIGWRKDALHLLVFTTDDVPHIALDGKLGGLVQPHDGQCHLNEANEYTASNQMDYPSLALLGEKLAENNINLIFAVTKNHYMLYKNFTALIPGTTVEILHGDSKNIIQLIINAYSSIRAKVELSVWDQPEDLNLFFTATCQDGISYPGQRKCEGLKIGDTASFEVSVEARSCPGRQAAQSFTLRPVGFRDSLQVEVAYNCTCGCSTGLEPNSARCSGNGTYTCGLCECDPGYLGTRCECQEGENQSGYQNLCREAEGKPLCSGRGECSCNQCSCFESEFGRIYGPFCECDSFSCARNKGVLCSGHGECHCGECKCHAGYIGDNCNCSTDVSTCRAKDGQICSDRGRCVCGQCQCTEPGAFGETCEKCPTCPDACSSKRDCVECLLLHQGKPDNQTCHHQCKDEVITWVDTIVKDDQEAVLCFYKTAKDCVMMFSYTELPNGRSNLTVLREPECGSAPNAMTILLAVVGSILLIGMALLAIWKLLVTIHDRREFAKFQSERSRARYEMASNPLYRKPISTHTVDFAFNKFNKSYNGSVD(sEQ ID NO：52)
[0074] 抗-αvβ5抗体
[0075] 本公开包括特异性结合αvβ5和/或β5亚基的抗体和抗原结合片段。本文公开的抗体基于由2004年2月13日以登录号PTA-5817保藏于ATCC的杂交瘤产生的ALULA鼠抗体的互补决定区(CDR)。下面提供了鼠抗-αvβ5抗体(ALULA)的成熟VH和VL序列(基于Kabat定义的CDR加有下划线)。
[0076] ALULA VH：
[0077]
[0078] ALULA VL：
[0079]
[0080] 实施例2公开了分别具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7所示的氨基酸序列的7个示例性人源化重链可变区VH0、VH1、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6，和分别具有SEQ ID NO：8、9、10、11和12中所示的氨基酸序列的5个示例性人源化轻链可变区VL0、VL1、VL2、VL3和VL4。每个VH链可以与任何VL链配对：即VH0可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对；VH1可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对；VH2可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对；VH3可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对；VH4可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对；VH5可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对；
以及VH6可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对。因此，实施例2中公开的重链可变区和轻链可变区可形成35种不同的VH-VL对。所有这些抗体都被认为是本公开的一部分。这些抗体可以包含κ轻链恒定区。在一个实施方案中，轻链恒定区具有以下氨基酸序列：
以及VH6可以与VL0、VL1、VL2、VL3或VL4配对。因此，实施例2中公开的重链可变区和轻链可变区可形成35种不同的VH-VL对。所有这些抗体都被认为是本公开的一部分。这些抗体可以包含κ轻链恒定区。在一个实施方案中，轻链恒定区具有以下氨基酸序列：
[0081]RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：56)
[0082] 这些抗体还可包含重链恒定区。在一个实施方案中，重链恒定区具有以下序列：
[0083]ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：57)
[0084] 下面提供实施例2中描述的示例性人源化抗-αvβ5抗体的7个重链可变区和5个轻链可变区的重和轻链CDR 1、2和3以及框架区(FR)1、2、3、4的氨基酸序列。CDR基于Kabat编号系统。
[0085]
[0086]
[0087]
[0088] 本申请还公开了ALULA的“替代CDR，”其可用于替代本公开的抗体中的Kabat CDR。“替代”CDR是指根据除Kabat外的定义(例如，来自AbYsis的Chothia，增强的Chothia/AbM CDR或接触定义)来定义的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。这些替代CDR可以例如通过使用Abysis数据库(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_
annotation.cgi)来获得。将ALULA的重链可变区和轻链可变区的示例性“交替”CDR 1、2和3的氨基酸序列与下表中根据Kabat定义的CDR进行比较。
annotation.cgi)来获得。将ALULA的重链可变区和轻链可变区的示例性“交替”CDR 1、2和3的氨基酸序列与下表中根据Kabat定义的CDR进行比较。
[0089]
[0090] 在一些情况下，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含VH或重链，所述VH或重链包含分别含有SEQ ID NO：13，14和15所示的氨基酸序列/分别由所述氨基酸序列组成的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。在其它情况下，抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含VH或重链，所述VH或重链包含分别含有SEQ ID NO：58、59和15所示的氨基酸序列/分别由所述氨基酸序列组成的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。在其它情况下，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含VH或重链，所述VH或重链包含分别含有SEQ ID NO：60、61和15所示的氨基酸序列/分别由所述氨基酸序列组成的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。在某些实施方案中，所有上述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含VL或轻链，所述VL或轻链包含分别含有SEQ ID NO：16、17和18所示的氨基酸序列/分别由所述氨基酸序列组成的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。上述抗-αvβ5抗体可具有包含SEQ ID NO：56所示序列/由所述序列组成的轻链恒定区和/或包含SEQ ID NO：57所示序列/由所述序列组成的重链恒定区。
[0091] 在一些情况下，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含VH或重链，所述VH或重链包含分别含有SEQ ID NO：62、63和64所示的氨基酸序列/分别由所述氨基酸序列组成的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。在某些实施方案中，这些抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含VL或轻链，所述VL或轻链包含分别含有SEQ ID NO：65、66和67所示的氨基酸序列/分别由所述氨基酸序列组成的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。上述抗-αvβ5抗体可具有包含SEQ ID NO：56所示序列/由所述序列组成的轻链恒定区和/或包含SEQ ID NO：57所示序列/由所述序列组成的重链恒定区。
[0092] 本文所述的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段可包括重链框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，其中H-FR1具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：19、23、25、28、30和32；H-FR2具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：20和26；H-FR3具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：21、24、27、29、31和33；以及H-FR4具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。在某些情况下，本文所述的抗-αvβ5抗体可包括轻链框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，其中L-FR1具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：
36、40、43和46；L-FR2具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：37和44；L-FR3具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：38、41、45和47；以及L-FR4具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39、42和48。在具体实施方案中，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含(i)重链框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，其中H-FR1具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列；H-FR2具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；H-FR3具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；以及H-FR4具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；和(ii)轻链框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，其中L-FR1具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；L-FR2具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；L-FR3具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列；以及L-FR4具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
36、40、43和46；L-FR2具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：37和44；L-FR3具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：38、41、45和47；以及L-FR4具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39、42和48。在具体实施方案中，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段包含(i)重链框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，其中H-FR1具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列；H-FR2具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；H-FR3具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；以及H-FR4具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；和(ii)轻链框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，其中L-FR1具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；L-FR2具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；L-FR3具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列；以及L-FR4具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
[0093] 本公开还包括特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有这样的重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任一个所示的氨基酸序列具有至少75％、至少78％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有拥有有两个或更少的取代的ALULA的VH CDR1，拥有两个或更少的取代的ALULA的VHCDR2和拥有两个或更少的取代的ALULA的VH CDR3。在其它实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有ALULA的VHCDR1，拥有三个或更少的取代的ALULA的VHCDR2，以及ALULA的VHCDR3。在其它实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有ALULA的VHCDR1、具有一个取代的ALULA的VHCDR2和ALULA的VHCDR3。在具体实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有ALULA的VHCDR1、ALULA的VHCDR2和ALULA的VHCDR3。上述抗体或其抗原结合片段可以抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β的活化。上述CDR可以是Kabat CDR或替代CDR。
[0094] 在一些实施方案中，这些抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段还包括这样的轻链可变区，所述轻链可变区与SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的任一个具有至少75％、至少78％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有拥有两个或更少的取代的ALULA的VLCDR1，拥有两个或更少的个取代的ALULA的VLCDR2和拥有两个或更少的取代的ALULA的VLCDR3。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有ALULA的VLCDR1、拥有两个或更少的取代的ALULA的VLCDR2和ALULA的VLCDR3。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有ALULA的VLCDR1、ALULA的VLCDR2和ALULA的VLCDR3。在其它实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有ALULA的VHCDR1、拥有三个或更少的取代的ALULA的VHCDR2和ALULA的VHCDR3；以及ALULA的VLCDR1、拥有两个或更少的取代的ALULA的VLCDR2和ALULA的VLCDR3。在具体情况下，这些抗体或其抗原结合片段包括ALULA的所有重链和轻链CDR。上述CDR可以是Kabat CDR或替代CDR。上述抗体或其抗原结合片段可抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；可抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；可抑制TGF-β的活化；可结合大鼠、小鼠、食蟹猴和人αvβ5；可以以0.01至2nM(例如，0.02、0.04、0.06、0.08、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8nM)的KD结合于(例如，BaF3的)细胞表面上重组表达的αvβ5；以约5pM至约500pM(例如，25pM至500pM、25pM至
150pM、50pM至100pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、
80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、125pM或150pM)的表观亲和力结合重组αvβ5；在ELISA测定中使用纯化的蛋白质抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50值为约1nM至约5nM(例如，1nM、
1.5nM、2.0nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.2nM、
3.5nM、3.8nM、4.0nM、4.5nM或5.0nM)；和/或可以在细胞粘附测定中抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50为0.1至2nM(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7或1.8nM)。
150pM、50pM至100pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、
80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、125pM或150pM)的表观亲和力结合重组αvβ5；在ELISA测定中使用纯化的蛋白质抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50值为约1nM至约5nM(例如，1nM、
1.5nM、2.0nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.2nM、
3.5nM、3.8nM、4.0nM、4.5nM或5.0nM)；和/或可以在细胞粘附测定中抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50为0.1至2nM(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7或1.8nM)。
[0095] 本公开还包括特异性结合αvβ5和/或β5的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有在包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6或7所示的氨基酸序列的重链可变区的1个、2个、3个或所有4个框架区中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，3个、2个或更少，2个或1个)氨基酸取代，和/或在1个、2个或所有3个CDR(或替代CDR)中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，2个或更少，或1个)氨基酸取代。本申请还包括这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含在包含SEQ ID NO：8、9、10、11或12所示的氨基酸序列的轻链可变区的1个、2个、3个或所有4个框架区中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，3个、2个或更少，2个或1个)氨基酸取代，和/或在1个、2个或所有3个CDR(或替代CDR)中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，2个或更少，或1个)氨基酸取代。在某些实施方案中，本公开的人源化抗体包括特异性结合αvβ5和/或β5的抗体，其具有在包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6或7所示的氨基酸序列的重链可变区的1个、2个、3个或所有4个框架区中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，3个、2个或更少，2个或1个)氨基酸取代，和/或在1个、2个或3个CDR(或替代CDR)中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，2个或更少，2个，或1个)氨基酸取代；
和在包含SEQ ID NO：8、9、10、11或12所示的氨基酸序列的轻链可变区的1个、2个、3个或所有4个框架区中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，3个、2个或更少，2个或1个)氨基酸取代，和/或在1个、2个或所有3个CDR(或替代CDR)中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，2个或更少，或1个)氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。上述抗体或其抗原结合片段可以抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；可抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；可抑制TGF-β的活化；可结合大鼠、小鼠、食蟹猴和人αvβ5；可以以
0.01至2nM(例如，0.02、0.04、0.06、0.08、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8nM)的KD结合于(例如，BaF3的)细胞表面上重组表达的αvβ5；可以以约5pM至约500pM(例如，25pM至500pM、25pM至
150pM、50pM至100pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、
80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、125pM或150pM)的表观亲和力结合重组αvβ5；在ELISA测定中使用纯化的蛋白质抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50值为约1nM至约5nM(例如，1nM、
1.5nM、2.0nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.2nM、
3.5nM、3.8nM、4.0nM、4.5nM或5.0nM)；和/或可以在细胞粘附测定中抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50为0.1至2nM(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7或1.8nM)。
和在包含SEQ ID NO：8、9、10、11或12所示的氨基酸序列的轻链可变区的1个、2个、3个或所有4个框架区中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，3个、2个或更少，2个或1个)氨基酸取代，和/或在1个、2个或所有3个CDR(或替代CDR)中的4个或更少的(例如，4个、3个或更少，2个或更少，或1个)氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。上述抗体或其抗原结合片段可以抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；可抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；可抑制TGF-β的活化；可结合大鼠、小鼠、食蟹猴和人αvβ5；可以以
0.01至2nM(例如，0.02、0.04、0.06、0.08、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8nM)的KD结合于(例如，BaF3的)细胞表面上重组表达的αvβ5；可以以约5pM至约500pM(例如，25pM至500pM、25pM至
150pM、50pM至100pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、
80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、125pM或150pM)的表观亲和力结合重组αvβ5；在ELISA测定中使用纯化的蛋白质抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50值为约1nM至约5nM(例如，1nM、
1.5nM、2.0nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.2nM、
3.5nM、3.8nM、4.0nM、4.5nM或5.0nM)；和/或可以在细胞粘附测定中抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，其中IC50为0.1至2nM(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7或1.8nM)。
[0096] 在某些实施方案中，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段分别包含SEQ ID NO：5和10所示的VH和VL氨基酸序列，或分别包含SEQ ID NO：6和10所示的VH和VL氨基酸序列，或分别包含SEQ ID NO：5和8所示的VH和VL氨基酸序列，或分别包含SEQ ID NO：5和9所示的VH和VL氨基酸序列，或分别包含SEQ ID NO：3和10所示的VH和VL氨基酸序列。
[0097] 在一些实施方案中，可将所述VH和/或VL区连接至恒定区(例如，野生型人Fc区或包括一个或多个改变的Fc区)。在一些实施方案中，所述抗体具有衍生自人κ序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，所述抗体具有衍生自人λ序列的轻链恒定区。在具体实施方案中，所述轻链恒定区包含人亚组κ1序列。在某些实施方案中，所述抗体具有选自由以下组成的组的同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。所述重链恒定区可以是野生型人Fc区，或包括一个或多个氨基酸取代的人Fc区。所述抗体可具有稳定免疫球蛋白的两条重链之间的二硫键的突变，诸如本领域公开的IgG4的铰链区中的突变(例如，Angal等，Mol.Immunol.,30:105-08(1993))。也参见例如，U.S.2005-0037000。所述重链恒定区还可具有修饰抗体性质(例如，减少Fc受体结合、抗体糖基化、脱酰胺、与补体的结合或甲硫氨酸氧化中的一项或多项)的取代。在一些情况下，所述抗体可具有突变，诸如美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中所述的那些突变。在一些实施方案中，修饰所述抗体以降低或消除效应子功能。在一些实施方案中，所述重链恒定区具有一个或多个以下突变：S228P、N297Q和T299A(根据Kabat的编号)。所述重链恒定区可以是嵌合的，例如，Fc区可以包含IgG4同种型的IgG抗体的CH1和CH2结构域，和IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域(参见，例如，美国专利申请第2012/0100140A1号，其通过引用整体并入本文)。在具体实施方案中，本文所述的人源化抗-αvβ5抗体具有包含IgG4同种型的IgG抗体的CH1和CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域的嵌合恒定区，并且还含有S228P和N297Q突变(根据Kabat编号)。
[0098] 本公开的人源化抗-αvβ5抗体的非限制性实例包括包含SEQ ID NO：69所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：70所示的轻链氨基酸序列的抗体；包含SEQ ID NO：69所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：82所示的轻链氨基酸序列的抗体；包含SEQ ID NO：80所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：82所示的轻链氨基酸序列的抗体；以及包含SEQ ID NO：81所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：70所示的轻链氨基酸序列的抗体。
[0099] 可将本文所述的抗体或其抗原结合片段连接至另一种试剂(例如，荧光部分、放射性分子、药物、微RNA、细胞毒性剂)。细胞毒性剂可以是例如放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、细胞抑制剂、前药、免疫活性配体、细胞因子、烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素或激素拮抗剂。示例性细胞毒性剂包括90Y、131I、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、美登素(DM1)、DM4、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE38)和蓖麻毒蛋白的A链。在具体实施方案中，细胞毒性剂是美登木素生物碱。
[0100] 可基于与先前已知的αvβ5抗体相比改善的效力、对β5的更高的亲和力或亲合力和/或降低的免疫原性来选择抗体以进行使用。测定抗体的效力、亲和力或亲合力和免疫原性的方法在普通技术人员的技能范围内。
[0101] 获得抗-αvβ5抗体的方法
[0102] 可以例如通过制备和表达编码所述氨基酸序列的合成基因来制备抗体，诸如上述的那些抗体。产生任何抗-αvβ5抗体的变体(例如，包含氨基酸取代)的方法是本领域公知的。这些方法包括但不限于通过编码抗体或其任何部分(例如，框架区、CDR(替代CDR)、恒定区)的制备的DNA分子的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变进行的制备。定点诱变是本领域公知的(参见，例如，Carter等，Nucl.Acids Res.,13:4431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488(1987))。PCR诱变也适用于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi，于PCR Protocols，第177-183页(Academic Press,1990)中；和Vallette等，Nucl.Acids Res.17:723-733(1989)。制备序列变体的另一种方法盒式诱变基于由Wells等，Gene,34:315-323(1985)所述的技术。
[0103] 亲和力成熟
[0104] 在一个实施方案中，通过例如诱变修饰本文所述的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段，以提供经修饰的抗体的库。然后评价经修饰的抗体以鉴定一种或多种具有改变的功能性质(例如，改善的结合、改善的稳定性、降低的抗原性或体内稳定性)的抗体。在一个实现中，使用展示文库技术来选择或筛选经修饰的抗体的库。然后例如，通过使用更高严格性或更具竞争性的结合和洗涤条件从第二文库中鉴定更高亲和力的抗体。也可以使用其它筛选技术。
[0105] 在一些实施方式中，将诱变靶向已知在或可能在结合界面的区域。如果，例如鉴定的结合蛋白是抗体，则可使诱变针对本文所述的重或轻链的CDR区(或替代CDR区)。此外，可使诱变针对CDR附近或邻近的框架区，例如，特别是CDR(或替代CDR)接合处的10个、5个或3个氨基酸内的框架区。在抗体的情况下，诱变也可被限制于一个或几个CDR(或替代CDR)，例如，以便逐步改进。
[0106] 在一个实施方案中，诱变被用来使抗体与一种或多种种系序列更相似。一个示例性种系化方法可包括：鉴定与分离的抗体的序列相似(例如，在特定数据库中最相似)的一个或多个种系序列。然后可在分离的抗体中增量地、组合地或以这两种方式产生突变(在氨基酸水平)。例如，产生包括编码一些或所有可能的种系突变的序列的核酸文库。然后评价突变的抗体，例如鉴定相对于分离的抗体具有一个或多个另外的种系残基并且仍然有用(例如，具有功能活性)的抗体。在一个实施方案中，尽可能多地将种系残基引入分离的抗体。
[0107] 在一个实施方案中，诱变被用来取代一个或多个种系残基或将其插入CDR(或交替CDR)区。例如，种系CDR(或替代CDR)残基可来自与被修饰的可变区相似(例如，最相似)的种系序列。诱变后，可评价抗体的活性(例如，结合或其它功能活性)，以确定种系残基是否被耐受。可在框架区中进行类似的诱变。
[0108] 可以以不同的方式选择种系序列。例如，如果种系序列满足选择性或相似性的预定标准(例如相对于供体非人抗体至少一定的百分比同一性，例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99或99.5％同一性)，则可以选择其。
可使用至少2个、3个、5个或10个种系序列进行选择。在CDR1和CDR2的情况下，鉴定类似的种系序列可包括选择一个此类序列。在CDR3的情况下，鉴定类似的种系序列可包括选择一个此类序列，但可包括使用分别对氨基末端部分和羧基末端部分有贡献的两个种系序列。在其它实施方案中，使用多于一个或两个种系序列，例如以形成共有序列。
可使用至少2个、3个、5个或10个种系序列进行选择。在CDR1和CDR2的情况下，鉴定类似的种系序列可包括选择一个此类序列。在CDR3的情况下，鉴定类似的种系序列可包括选择一个此类序列，但可包括使用分别对氨基末端部分和羧基末端部分有贡献的两个种系序列。在其它实施方案中，使用多于一个或两个种系序列，例如以形成共有序列。
[0109] 如下进行两个序列之间“序列同一性”的计算。为了最佳比较目的，对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入缺口，以及为了比较的目的，可以忽略非同源序列)。使用GCG软件包中的GAP程序，利用Blossum 62评分矩阵和为12的缺口罚分、为4的缺口延伸罚分和为5的移码缺口罚分，将最佳比对测定为最佳分数。随后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。两个序列之间的百分比同一性是由序列共有的相同位置的数目的函数。
[0110] 在其它实施方案中，可修饰抗体以具有改变的糖基化模式(即，从原始或天然糖基化模式改变)。如在本上下文中使用的，“改变的”意指使一个或多个糖类部分被删除，和/或使一个或多个糖基化位点添加至原始抗体。向目前公开的抗体添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列以包含糖基化位点共有序列来实现；此类技术在本领域中是公知的。在抗体上增加糖类部分的数目的另一种方法是通过将糖苷化学地或酶促地偶联至抗体的氨基酸残基。这些方法描述于例如WO 87/05330以及Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.,22:259-306。除去存在于抗体处的任何糖类部分可如本领域中所述，通过化学或酶促实现(Hakimuddin等(1987)Arch.Biochem.Biophys.,259:52；Edge等
(1981)Anal.Biochem.,118:131；和Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.,138:350)。关于通过提供补救受体结合表位来增加体内半衰期的修饰，参见，例如，美国专利第5,869,046号。
(1981)Anal.Biochem.,118:131；和Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.,138:350)。关于通过提供补救受体结合表位来增加体内半衰期的修饰，参见，例如，美国专利第5,869,046号。
[0111] 在一个实施方案中，抗体具有与SEQ ID NO：13-18的那些CDR序列不同的CDR序列(例如，Chothia或Kabat CDR)。与本文所述的人源化ALULA抗体的那些CDR序列不同的CDR序列包括氨基酸变化，诸如1个、2个或3个氨基酸的取代(如果CDR的长度为5-7个氨基酸)，或CDR序列中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的取代(如果CDR的长度为10个氨基酸或更大)。被取代的氨基酸可具有相似的电荷、疏水性或立体化学特征。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守取代。在其它实施方案中，氨基酸取代是非保守取代。此类取代在本领域技术人员的普通技能范围内。可以筛选含有取代的CDR的抗体或其抗体片段以鉴定具有本文所述的一个或多个特征(例如，特异性结合αvβ5，抑制αvβ5与玻连蛋白的结合)的抗体。
[0112] 与CDR中不同，可在不会不利地影响抗体的结合特性的情况下进行结构框架区(FR)的更实质性的改变。FR的改变包括但不限于人源化非人来源的框架或工程化对抗原接触或对稳定结合部位重要的某些框架残基，例如改变恒定区的类别或亚类，改变可能改变效应子功能诸如Fc受体结合的特定氨基酸残基(Lund等，J.Immun.,147:2657-62(1991)；
Morgan等，Immunology,86:319-24(1995))，或改变恒定区所源自的物种。在一些情况下，所述抗体或抗原结合片段包含以下氨基酸中的1个至26个，(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个或26个)氨基酸：(a)在可变重链中：位置4处的缬氨酸、位置5处的谷氨酰胺、位置6处的谷氨酰胺、位置16处的谷氨酸、位置23处的赖氨酸、位置38处的赖氨酸、位置
66处的赖氨酸、位置67处的丙氨酸、位置69处的亮氨酸、位置71处的丙氨酸、位置72处的缬氨酸、位置73处的苏氨酸、位置75处的脯氨酸或丝氨酸和/或位置78处的丙氨酸；和(b)在可变轻链中：位置1处的天冬酰胺、位置11处的亮氨酸、位置12处的苏氨酸、位置13处的缬氨酸、位置21处的甲硫氨酸、位置22处的丝氨酸、位置43处的丝氨酸、位置60处的天冬氨酸、位置63处的苏氨酸、位置78处的缬氨酸、位置100处的丙氨酸和/或位置104位的亮氨酸(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，包含ALULA的CDR的抗体或其抗原结合片段在可变重链的位置16具有谷氨酸。在另一个实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含ALULA的CDR，并且在可变重链的位置16处具有谷氨酸，在位置4处具有缬氨酸，在位置6处具有谷氨酰胺，在位置23处具有赖氨酸，在位置66处具有赖氨酸，在位置71处具有丙氨酸，在位置73处具有苏氨酸，在位置75处具有脯氨酸和在位置78处具有丙氨酸；以及在可变轻链的位置1处具有天冬酰胺，在位置11处具有亮氨酸，在位置21处具有甲硫氨酸，在位置22处具有丝氨酸，在位置43处具有丝氨酸，在位置60处具有天冬氨酸和在位置63处具有苏氨酸。
Morgan等，Immunology,86:319-24(1995))，或改变恒定区所源自的物种。在一些情况下，所述抗体或抗原结合片段包含以下氨基酸中的1个至26个，(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个或26个)氨基酸：(a)在可变重链中：位置4处的缬氨酸、位置5处的谷氨酰胺、位置6处的谷氨酰胺、位置16处的谷氨酸、位置23处的赖氨酸、位置38处的赖氨酸、位置
66处的赖氨酸、位置67处的丙氨酸、位置69处的亮氨酸、位置71处的丙氨酸、位置72处的缬氨酸、位置73处的苏氨酸、位置75处的脯氨酸或丝氨酸和/或位置78处的丙氨酸；和(b)在可变轻链中：位置1处的天冬酰胺、位置11处的亮氨酸、位置12处的苏氨酸、位置13处的缬氨酸、位置21处的甲硫氨酸、位置22处的丝氨酸、位置43处的丝氨酸、位置60处的天冬氨酸、位置63处的苏氨酸、位置78处的缬氨酸、位置100处的丙氨酸和/或位置104位的亮氨酸(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，包含ALULA的CDR的抗体或其抗原结合片段在可变重链的位置16具有谷氨酸。在另一个实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含ALULA的CDR，并且在可变重链的位置16处具有谷氨酸，在位置4处具有缬氨酸，在位置6处具有谷氨酰胺，在位置23处具有赖氨酸，在位置66处具有赖氨酸，在位置71处具有丙氨酸，在位置73处具有苏氨酸，在位置75处具有脯氨酸和在位置78处具有丙氨酸；以及在可变轻链的位置1处具有天冬酰胺，在位置11处具有亮氨酸，在位置21处具有甲硫氨酸，在位置22处具有丝氨酸，在位置43处具有丝氨酸，在位置60处具有天冬氨酸和在位置63处具有苏氨酸。
[0113] 所述抗-αvβ5抗体可呈全长抗体的形式，或呈抗-αvβ5抗体的低分子量形式(例如，生物活性抗体片段或微型抗体)的形式，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb、scFv和sc(Fv)2。本公开内容包括的其它抗-αvβ5抗体包括含有单个可变链诸如VH或VL的单结构域抗体(sdAb)或其生物活性片段。参见，例如Moller等，J.Biol.Chem.,285(49):38348-38361(2010)；Harmsen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(1):13-22(2007)；U.S.2005/
0079574和Davies等(1996)Protein Eng.,9(6):531-7。与完整抗体一样，sdAb能够选择性结合特异性抗原。由于分子量仅为12-15kDa，sdAb比常见抗体小得多，甚至小于Fab片段和单链可变片段。
0079574和Davies等(1996)Protein Eng.,9(6):531-7。与完整抗体一样，sdAb能够选择性结合特异性抗原。由于分子量仅为12-15kDa，sdAb比常见抗体小得多，甚至小于Fab片段和单链可变片段。
[0114] 本文提供了包含抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段和其一种或多种酸性变体的混合物的组合物，例如，其中酸性变体的量小于约80％、70％、60％、60％、50％、40％、30％、30％、20％、10％、5％或1％。还提供了包含抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个脱酰胺位点，其中组合物的pH为约5.0至约6.5，以使得例如至少约90％的抗-αvβ5抗体不脱酰胺(即，使小于约10％的抗体脱酰胺)。在某些实施方案中，使小于约5％、3％、2％或1％的抗体脱酰胺。pH可以为5.0至6.0，诸如5.5或6.0。在某些实施方案中，组合物的pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
[0115] “酸性变体”是比目标多肽更具酸性(例如如通过阳离子交换色谱测定的)的目标多肽的变体。酸性变体的实例是脱酰胺化变体。
[0117] 如本文中关于包含抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段的组合物所用的，术语“混合物”意指期望的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段和其一种或多种酸性变体的存在。所述酸性变体可以主要包含脱酰胺化抗-αvβ5抗体，以及少量的其它酸性变体。
[0118] 在某些实施方案中，被突变以消除脱酰胺作用的抗体的结合亲和力(KD)、结合速率(KD on)和/或解离速率(KD off)与野生型抗体的结合亲和力相似，例如，具有小于约5倍、2倍、1倍(100％)、50％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％的差异。
[0119] 在某些实施方案中，当向人患者施用时，抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段或其低分子量抗体特异性结合β5，抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，抑制αvβ5与TGF-β的LAP的结合，抑制TGF-β的活化，抑制TGF-β信号传导和/或减轻症状的严重度，所述患者具有以下疾病的一种或多种：急性肾损伤、急性肺损伤、中风(脑出血)、急性呼吸窘迫综合征、肺水肿、肺纤维化(例如，特发性肺纤维化(IPF)、常见间质性肺炎(UIP))、败血症、心肌梗死、癌症(例如，胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌和子宫内膜癌)和眼新生血管化疾病。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段抑制或减少血管生成，从而预防或延缓癌症的发展。在一个实施方案中，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段或其低分子量抗体抑制特发性肺纤维化模型中的疾病发展(Degryse等，Am J Med Sci.,341(6):444-9(2011))。在另一个实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段抑制损伤诱导的血管通透性模型(例如，VEGF，呼吸机诱导的，IL-1β，缺血-再灌注，LPS，穿孔盲肠结扎)中的血管通透性。
[0120] 抗体片段
[0121] αvβ5结合抗体的抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Facb和Fv)可通过完整αvβ5抗体的蛋白水解消化来制备。例如，可通过用酶诸如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶处理完整抗体来获得抗体片段。完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生F(ab)2或Fab片段；完整抗体的胃蛋白酶消化产生F(ab')2或Fab'；以及完整抗体的纤溶酶消化产生Facb片段。
[0122] 或者，可重组产生抗体片段。例如，可以构建编码目标抗体片段的核酸，将其引入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达。参见，例如，Co,M.S.等，J.Immunol.,152:2968-2976(1994)；Better,M.和Horwitz,A.H.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；
Pluckthun,A.和Skerra,A.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology,121:652-663(1989)；Rousseaux,J.等，Methods in Enzymology,(1989)121:663-669(1989)；和Bird,R.E.等，TIBTECH,9:132-137(1991))。抗体片段可以在大肠杆菌(E.coli)中表达并从大肠杆菌分泌，因此允许容易地产生大量的这些片段。可从抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段并将其化学偶联以形成F(ab)2片段(Carter等，Bio/Technology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。具有增加的体内半衰期的包含补救受体结合表位残基的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利第5,869,046号中。
Pluckthun,A.和Skerra,A.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology,121:652-663(1989)；Rousseaux,J.等，Methods in Enzymology,(1989)121:663-669(1989)；和Bird,R.E.等，TIBTECH,9:132-137(1991))。抗体片段可以在大肠杆菌(E.coli)中表达并从大肠杆菌分泌，因此允许容易地产生大量的这些片段。可从抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段并将其化学偶联以形成F(ab)2片段(Carter等，Bio/Technology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。具有增加的体内半衰期的包含补救受体结合表位残基的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利第5,869,046号中。
[0123] 微型抗体
[0124] 抗-αvβ5抗体的微型抗体包括双抗体、单链(scFv)和单链(Fv)2(sc(Fv)2)。
[0125] “双抗体”是通过基因融合构建的二价微型抗体(参见，例如Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6444-6448(1993)；EP404,097；WO 93/11161)。双抗体是由两条多肽链组成的二聚体。双抗体的每条多肽链的VL和VH结构域由接头结合。构成接头的氨基酸残基的数目可以在2个至12个残基之间(例如，3-10个残基或5个或约5个残基)。双抗体中多肽的接头通常太短而不允许VL和VH彼此结合。因此，在同一多肽链中编码的VL和VH不能形成单链可变区片段，而是形成具有不同单链可变区片段的二聚体。因此，双抗体具有两个抗原结合部位。
[0126] scFv是通过用接头连接VH和VL获得的单链多肽抗体(参见例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)；和Pluckthun,“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”第113卷，Ed Resenburg和Moore,Springer Verlag,New York，第
269-315页，(1994))。连接的VH和VL的顺序没有特别限制，它们可以以任何顺序排列。排列的实例包括：[VH]接头[VL]；或[VL]接头[VH]。scFv中的H链V区和L链V区可来源于本文所述的任何抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。
269-315页，(1994))。连接的VH和VL的顺序没有特别限制，它们可以以任何顺序排列。排列的实例包括：[VH]接头[VL]；或[VL]接头[VH]。scFv中的H链V区和L链V区可来源于本文所述的任何抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。
[0127] sc(Fv)2是其中两个VH和两个VL通过接头连接以形成单链的微型抗体(Hudson等，J.Immunol.Methods,(1999)231:177-189(1999))。sc(Fv)2可以例如通过用接头连接scFv来制备。本发明的sc(Fv)2包括优选地其中两个VH和两个VL以从单链多肽的N末端开始的VH、VL、VH和VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列的抗体；然而，两个VH和两个VL的顺序不限于上述排列，并且它们可以以任何顺序排列。排列的实例列于下面：
[0128] [VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
[0129] [VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
[0130] [VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
[0131] [VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
[0132] [VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]
[0133] 通常，当连接四个抗体可变区时，需要三个接头；所使用的接头可以相同或不同。对连接微型抗体的VH和VL区的接头没有特别限制。在一些实施方案中，接头是肽接头。可使用包含约3至25个(例如，5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、
17个、18)残基的任何任意单链肽作为接头。此类肽接头的实例包括：Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:68)；Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:73)；
Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:74)；Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:75)；Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:76)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:77)；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:78)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:79)；
(Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:74)n，其中n为1或更大的整数；和(Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:75)n，其中n为1或更大的整数。
17个、18)残基的任何任意单链肽作为接头。此类肽接头的实例包括：Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:68)；Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:73)；
Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:74)；Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:75)；Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:76)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:77)；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:78)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:79)；
(Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:74)n，其中n为1或更大的整数；和(Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:75)n，其中n为1或更大的整数。
[0134] 在某些实施方案中，接头是合成化合物接头(化学交联剂)。市售的交联剂的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。
[0135] 微型抗体中VH或VL的氨基酸序列可包括修饰诸如取代、缺失、添加和/或插入。例如，修饰可存在于抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段的一个或多个CDR(或替代CDR)中。在某些实施方案中，修饰涉及抗-αvβ5微型抗体的VH和/或VL结构域的一个或多个CDR(或替代CDR)和/或框架区中的1个、2个或3个氨基酸取代。进行这样的取代以改善抗-αvβ5微型抗体的结合、功能活性和/或降低其免疫原性。在某些实施方案中，取代是保守氨基酸取代。在其它实施方案中，可以删除或添加抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段的CDR(或替代CDR)的1个、2个或3个氨基酸，只要当将VH与VL缔合时存在αvβ5结合和/或功能活性即可。经修饰的微型抗体可抑制αvβ5与玻连蛋白的结合；抑制αvβ5与TGF-β的LAP的结合；和/或抑制TGF-β信号。
[0136] 双特异性抗体
[0137] 双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合αvβ5蛋白的两个不同表位。其它此类抗体可将αvβ5结合部位与另一种蛋白质(例如，αvβ6、αvβ8、肿瘤特异性抗原(例如，甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-1、MAGE-3、BAGE-1、GAGE-1、GnTV、KM-HN-1、KK-LC-1、LAGE-1、NA88-A、NY-ESO-1、SAGE、Sp17、SSX-2、TAG-1、TRAG-3、TRP2、XAGE-1b、HPV 16、HPV E6、HPV E7、TAG-72、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、EGF受体、HER 2受体、Lewis Y)、T-细胞抗原(例如，CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、TCR))的结合部位组合。双特异性抗体可被制备为全长抗体或其低分子量形式(例如，F(ab')2双特异性抗体、sc(Fv)2双特异性抗体、双抗体双特异性抗体)。
[0138] 全长双特异性抗体的常规产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature,305:537-539(1983))。在不同的方法中，可将具有所需结合特异性的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入单独的表达载体中，并共转染至合适的宿主细胞中。这提供了调节3种多肽片段的比例的更大灵活性。然而，当以相等比例表达至少两种多肽链导致高产量时，可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入单一表达载体中。
[0139] 根据美国专利第5,731,168号中描述的另一种方法，可工程化一对抗体分子之间的界面，以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选界面包含CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了用于相对于其它不期望的终产物(例如同二聚体)增加异二聚体的产率的机制。
[0140] 双特异性抗体包括交联或“异缀合”抗体。例如，可将异缀合中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，将另一抗体与生物素偶联。异缀合抗体可使用任何方便的交联方法制备。
[0141] “双抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过接头连接至VL的VH，所述接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合部位。
[0142] 多价抗体
[0143] 多价抗体可被表达抗体所结合的抗原的细胞比二价抗体更快地内化(和/或分解代谢)。本文所述的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合部位的多价抗体(例如，四价抗体)，其可通过重组表达编码抗体多肽链的核酸来容易地产生。多价抗体可以包含二聚化结构域和3个或更多个抗原结合部位。示例性二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。多价抗体可包含(或由其组成)3个至约8个(例如，4个)抗原结合部位。多价抗体任选地包含至少1条多肽链(例如，至少2条多肽链)，其中多肽链包含2个或更多个可变结构域。例如，所述多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的多肽链，X1和X2表示氨基酸或肽间隔子，且n为0或1。
[0144] 缀合抗体
[0145] 本文公开的抗体可以是与各种分子结合的缀合抗体，所述分子包括大分子物质，诸如聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、用PEG修饰的聚乙烯亚胺(PEI)(PEI-PEG)、聚谷氨酸(PGA)(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物)、透明质酸、荧光物质、发光物质、半抗原、酶、金属螯合物和药物。
[0146] 在一个实施方案中，为了改善抗-αvβ5抗体(及其抗原结合片段)的细胞毒性作用并因此改善其治疗效果，将抗体与高毒性物质(包括放射性同位素和细胞毒性剂)缀合。这些缀合物可将毒性负载选择性地递送至靶位点(即，表达被抗体识别的抗原的细胞)，同时避开不被抗体识别的细胞。为了使毒性最小化，通常基于具有短血清半衰期的分子(例如，使用抗体片段、鼠序列和/或IgG3或IgG4同种型)工程化缀合物。示例性放射性同位素包括90 125 131 123 111 105 153 67 67 166 177 186 188
：Y、 I、 I、 I、 I、 Rh、 Sm、Cu、Ga、 Ho、 Lu、 Re和 Re。可以使用的细胞毒性剂包括用于癌症治疗的细胞毒性药物。如本文中所用，“细胞毒性剂”意指对细胞的生长和增殖有害并且可起到减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的作用的任何试剂。示例性细胞毒性剂包括但不限于放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂(例如，烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂)、前药、免疫活性配体和生物响应调节剂诸如细胞因子。用于延缓或减缓免疫反应性细胞或恶性细胞生长的任何细胞毒素在本发明的范围内。示例性细胞抑制剂包括烷化物质诸如氮芥、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，以及亚硝基脲化合物，诸如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。在一个实施方案中，缀合至本文所述的抗体或抗原结合片段的细胞毒性剂是美登木素生物碱。美登木素生物碱在本领域中已知包括美登素、美登醇、美登木素生物碱的C-3酯以及其它美登醇类似物和衍生物(参见，例如美国专利第5,
208,020号和第6,441,163号)。美登醇的C-3酯可以是天然存在的或合成得到的。此外，天然存在的和合成的C-3美登醇酯可被分类为具有简单羧酸的C-3酯，或者与N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯，后者比前者更具细胞毒性。合成的美登木素生物碱类似物也是本领域已知的，并且描述于例如Kupchan等，J.Med.Chem.,21,31-37(1978)中。用于产生美登醇及其类似物和衍生物的方法描述于例如美国专利第4,151,042号中。在某些实施方案中，美登醇包含含有反应性化学基团(例如，美登醇的C-3酯及其类似物，其中连接部分含有二硫键，并且连接部分包含N-琥珀酰亚胺基或N-磺基琥珀酰亚胺酯)的连接部分。在某些实施方案中，与本文所述的抗体或抗原结合缀合的美登木素生物碱是N2'-脱乙酰基-N2'-(-3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
在某些其它实施方案中，细胞毒性剂包括例如蒽环类家族药物、长春花碱药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族药物、二炔类和鬼臼毒素。这些家族的特别有用的成员包括例如亚德里亚霉素、洋红霉素、柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸(methopterin)、光神霉素、链黑霉素、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物诸如依托泊苷或磷酸依托泊苷磷、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。在其它实施方案中、细胞毒性剂包括紫杉醇、紫杉烷、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。还可将激素和激素拮抗剂诸如皮质类固醇(例如泼尼松)、孕激素(例如羟孕酮或甲羟孕酮(medroprogesterone))、雌激素(例如二乙基己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄激素(例如睾酮)和芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特)与本文所述的抗体或其抗原结合片段缀合。在某些实施方案中，细胞毒性剂包括抗肿瘤抗生素的烯二炔家族的成员或衍生物，包括加利车霉素、埃斯培拉霉素或动力霉素(dynemicins)。这些毒素是极其强效的并且通过切割核DNA，从而导致细胞死亡而起作用。与可以在体内裂解以产生许多无活性但具有免疫原性的多肽片段的蛋白质毒素不同，毒素诸如加利车霉素、埃斯培拉霉素和其它烯二炔类是基本上非免疫原性的小分子。
通过先前已用于标记单克隆抗体和其它分子的技术将这些非肽毒素化学连接成二聚体或四聚体。这些连接技术包括通过仅存在于构建体的Fc部分上的N-连接的糖残基的位点特异性连接。此类定点连接方法具有减少键联对构建体的结合性质的可能影响的有利方面。在另外的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还可与生物毒素诸如蓖麻毒素亚基A、相思豆毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、cyanginosins、石房蛤毒素、志贺毒素、破伤风、河豚毒素、单端孢菌烯、致震颤真菌毒素(verrucologen)或毒性酶。此类生物毒素可使用允许抗体-毒素构建体直接表达的遗传工程技术来制备。本领域技术人员可使用常规技术容易地形成此类构建体。缀合细胞毒性剂的方法是本领域公知的(参见，例如US 8,021,661)。
：Y、 I、 I、 I、 I、 Rh、 Sm、Cu、Ga、 Ho、 Lu、 Re和 Re。可以使用的细胞毒性剂包括用于癌症治疗的细胞毒性药物。如本文中所用，“细胞毒性剂”意指对细胞的生长和增殖有害并且可起到减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的作用的任何试剂。示例性细胞毒性剂包括但不限于放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂(例如，烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂)、前药、免疫活性配体和生物响应调节剂诸如细胞因子。用于延缓或减缓免疫反应性细胞或恶性细胞生长的任何细胞毒素在本发明的范围内。示例性细胞抑制剂包括烷化物质诸如氮芥、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，以及亚硝基脲化合物，诸如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。在一个实施方案中，缀合至本文所述的抗体或抗原结合片段的细胞毒性剂是美登木素生物碱。美登木素生物碱在本领域中已知包括美登素、美登醇、美登木素生物碱的C-3酯以及其它美登醇类似物和衍生物(参见，例如美国专利第5,
208,020号和第6,441,163号)。美登醇的C-3酯可以是天然存在的或合成得到的。此外，天然存在的和合成的C-3美登醇酯可被分类为具有简单羧酸的C-3酯，或者与N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯，后者比前者更具细胞毒性。合成的美登木素生物碱类似物也是本领域已知的，并且描述于例如Kupchan等，J.Med.Chem.,21,31-37(1978)中。用于产生美登醇及其类似物和衍生物的方法描述于例如美国专利第4,151,042号中。在某些实施方案中，美登醇包含含有反应性化学基团(例如，美登醇的C-3酯及其类似物，其中连接部分含有二硫键，并且连接部分包含N-琥珀酰亚胺基或N-磺基琥珀酰亚胺酯)的连接部分。在某些实施方案中，与本文所述的抗体或抗原结合缀合的美登木素生物碱是N2'-脱乙酰基-N2'-(-3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
在某些其它实施方案中，细胞毒性剂包括例如蒽环类家族药物、长春花碱药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族药物、二炔类和鬼臼毒素。这些家族的特别有用的成员包括例如亚德里亚霉素、洋红霉素、柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸(methopterin)、光神霉素、链黑霉素、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物诸如依托泊苷或磷酸依托泊苷磷、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。在其它实施方案中、细胞毒性剂包括紫杉醇、紫杉烷、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。还可将激素和激素拮抗剂诸如皮质类固醇(例如泼尼松)、孕激素(例如羟孕酮或甲羟孕酮(medroprogesterone))、雌激素(例如二乙基己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄激素(例如睾酮)和芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特)与本文所述的抗体或其抗原结合片段缀合。在某些实施方案中，细胞毒性剂包括抗肿瘤抗生素的烯二炔家族的成员或衍生物，包括加利车霉素、埃斯培拉霉素或动力霉素(dynemicins)。这些毒素是极其强效的并且通过切割核DNA，从而导致细胞死亡而起作用。与可以在体内裂解以产生许多无活性但具有免疫原性的多肽片段的蛋白质毒素不同，毒素诸如加利车霉素、埃斯培拉霉素和其它烯二炔类是基本上非免疫原性的小分子。
通过先前已用于标记单克隆抗体和其它分子的技术将这些非肽毒素化学连接成二聚体或四聚体。这些连接技术包括通过仅存在于构建体的Fc部分上的N-连接的糖残基的位点特异性连接。此类定点连接方法具有减少键联对构建体的结合性质的可能影响的有利方面。在另外的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还可与生物毒素诸如蓖麻毒素亚基A、相思豆毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、cyanginosins、石房蛤毒素、志贺毒素、破伤风、河豚毒素、单端孢菌烯、致震颤真菌毒素(verrucologen)或毒性酶。此类生物毒素可使用允许抗体-毒素构建体直接表达的遗传工程技术来制备。本领域技术人员可使用常规技术容易地形成此类构建体。缀合细胞毒性剂的方法是本领域公知的(参见，例如US 8,021,661)。
[0147] 在某些实施方案中，利用使其在循环中，例如在血液、血清或其它组织中的稳定化和/或保留改善例如至少1.5、2、5、10或50倍的部分修饰抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。例如，可将抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段与聚合物(例如，基本上非抗原性聚合物，诸如聚环氧烷或聚环氧乙烷)缔合(例如，缀合)。合适的聚合物将基本上按重量变化。可使用具有在约200至约35,000道尔顿(或约1,000至约15,000和2,000至约12,500)的范围内的数均分子量的聚合物。例如，可将所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段缀合至水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。此类聚合物的实例包括聚环氧烷同聚物诸如聚乙二醇(PEG)(参见，例如Cha pMan等，Nature Biotechnology,17:780-783(1999))，或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，只要所述嵌段共聚物的水溶性得以保持。另外的有用的聚合物包括聚氧化烯诸如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯与聚氧丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支化或未支化的多糖。治疗性抗体的功效可通过增加其血清持续性(从而允许更高的循环水平，更低频率的施用和减少的剂量)来改善。IgG的半衰期取决于其对新生儿受体FcRn的pH依赖性结合。在内皮细胞表面上表达的FcRn以pH依赖性方式结合IgG并保护其免于降解。在pH 6.0而不是pH 7.4下选择性结合FcRn的一些抗体在多种动物模型中表现出较高的半衰期。在某些实施方案中，本公开的抗体在CH2与CH3结构域之间的界面处具有一个或多个突变，诸如T250Q/M428L和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(根据EU索引编号)，所述突变增加了对FcRn的结合亲和力和IgG1在体内的半衰期。在其它实施方案中，本文的抗体具有经修饰的Fc区，其相对于野生型人Fc区包含至少一个修饰，其中所述修饰选自由以下组成的组：434S、252Y/428L、252Y/434S和428L/434S，并且根据EU索引编号。
[0148] 还可将所述抗体或其抗原结合片段缀合至siRNA、miRNA或抗-miR以将siRNA、miRNA或抗-miR递送至表达αvβ5的细胞(参见，例如Song等，Nat.Biotechnol.,23(6):709-
17(2005)；Schneider等，Molecular Therapy Nucleic Acids,1:e46(2012))。siRNA、miRNA或抗-miR可靶向TGF-β或TGF-β信号传导通路的组分。在一些实施方案中，siRNA、miRNA或抗-miR可靶向参与所治疗的疾病(例如，肺纤维化、急性肺损伤、癌症)的基因。例如，为了治疗肺纤维化，可使用αvβ5抗体或其抗原结合片段将以下的一种或多种抗-miR或微RNA(microRNA)靶向表达αvβ5的细胞，所述抗体或其抗原结合片段缀合至：针对微RNA的抗-miR诸如：miR-142-3p、miR-155、miR-192、miR-199a/b、miR-208、miR-21、miR-215、miR-216、miR-217、miR-23a、miR-27a、miR-27b、miR-32、miR-338、miR-34a、miR-377、miR-382；或缀合至微RNA诸如：let-7d、miR-107、miR-132、miR-133、miR-141、miR-15b、miR-16、miR-150、miR-18a、miR-19a/b、miR-194、miR-200a/b、miR-204、miR-211、miR-26a/b、miR-29a/b/c、miR-30c、miR-335、miR-449a/b和miR-590。为了治疗急性肺损伤，可使用αvβ5抗体或其抗原结合片段将以下miR的一种或多种靶向表达αvβ5的细胞，所述抗体或其抗原结合片段缀合至所述miR：miR-127、miR-16和/或miR-199a。在具体实施方案中，缀合有抗miR-21的人源化αvβ5抗体或其抗原结合片段可用于治疗癌症(例如，肝细胞癌)；并且缀合有抗-miR-10b的人源化αvβ5抗体或其抗原结合片段可用于治疗癌症诸如胶质母细胞瘤。
17(2005)；Schneider等，Molecular Therapy Nucleic Acids,1:e46(2012))。siRNA、miRNA或抗-miR可靶向TGF-β或TGF-β信号传导通路的组分。在一些实施方案中，siRNA、miRNA或抗-miR可靶向参与所治疗的疾病(例如，肺纤维化、急性肺损伤、癌症)的基因。例如，为了治疗肺纤维化，可使用αvβ5抗体或其抗原结合片段将以下的一种或多种抗-miR或微RNA(microRNA)靶向表达αvβ5的细胞，所述抗体或其抗原结合片段缀合至：针对微RNA的抗-miR诸如：miR-142-3p、miR-155、miR-192、miR-199a/b、miR-208、miR-21、miR-215、miR-216、miR-217、miR-23a、miR-27a、miR-27b、miR-32、miR-338、miR-34a、miR-377、miR-382；或缀合至微RNA诸如：let-7d、miR-107、miR-132、miR-133、miR-141、miR-15b、miR-16、miR-150、miR-18a、miR-19a/b、miR-194、miR-200a/b、miR-204、miR-211、miR-26a/b、miR-29a/b/c、miR-30c、miR-335、miR-449a/b和miR-590。为了治疗急性肺损伤，可使用αvβ5抗体或其抗原结合片段将以下miR的一种或多种靶向表达αvβ5的细胞，所述抗体或其抗原结合片段缀合至所述miR：miR-127、miR-16和/或miR-199a。在具体实施方案中，缀合有抗miR-21的人源化αvβ5抗体或其抗原结合片段可用于治疗癌症(例如，肝细胞癌)；并且缀合有抗-miR-10b的人源化αvβ5抗体或其抗原结合片段可用于治疗癌症诸如胶质母细胞瘤。
[0149] 上述缀合抗体可以通过对本文所述的抗体或其较低分子量形式进行化学修饰来制备。用于修饰抗体的方法是本领域公知的(例如，US 5057313和US 5156840)。
[0150] 产生抗体的方法
[0151] 可在细菌或真核细胞中产生本公开的αvβ5抗体或其抗体结合片段。一些抗体，例如Fab，可以在细菌细胞例如大肠杆菌细胞中产生。还可在真核细胞诸如转化的细胞系(例如，CHO、293E、COS、3T3)中产生抗体。另外，可在酵母细胞如毕赤酵母属(Pichia)(参见，例如Powers等，J Immunol Methods.251:123-35(2001))、汉逊酵母属(Hanseula)或酵母属(Saccharomyces)中表达抗体(例如，scFv)。为了产生目标抗体，构建编码抗体的多核苷酸，将其引入表达载体，然后在合适的宿主细胞中表达。将标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并回收抗体。
[0152] 如果将在细菌细胞(例如，大肠杆菌)中表达抗体，则表达载体应具有允许在该细菌细胞中扩增载体的特征。另外，当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue作为宿主时，所述载体必须具有启动子，例如lacZ启动子(Ward等，341:544-546(1989))、araB启动子(Better等，Science,240:1041-1043(1988))或可允许在大肠杆菌中高效表达的T7启动子。此类载体的实例包括M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用该表达载体时，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)。表达载体可含有用于抗体分泌的信号序列。为了产生至大肠杆菌的周质内，可将pelB信号序列(Lei等，J.Bacteriol.,169:4379(1987))用作用于抗体分泌的信号序列。对于细菌表达，可使用氯化钙方法或电穿孔方法将表达载体引入细菌细胞。
[0153] 如果抗体在动物细胞诸如CHO、COS、293、293T和NIH3T3细胞中表达，则表达载体包含在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等，Nature,277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))或CMV启动子。除了编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列以外，重组表达载体还可携带另外的序列，诸如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。所述选择标记基因有利于选择其中已经导入了载体的宿主细胞(参见，例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。例如，通常，所述选择性标记基因赋予已导入了载体的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。具有选择标记的载体的实例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
[0154] 在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中产生抗体或其抗原结合片段。用于表达抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的dhfr–CHO细胞，其与例如，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621)中所述的DHFR选择标记一起使用)、人胚胎肾293细胞(例如，293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞细胞系例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞，以及来自转基因动物例如转基因哺乳动物的细胞。例如，所述细胞是乳房上皮细胞。
[0155] 在用于抗体表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗-αvβ5抗体的抗体重链和抗体轻链的重组表达载体，或两个单独的重组表达载体(每个分别编码抗-αvβ5抗体的抗体重链和抗体轻链)引入dhfr–CHO细胞。在一个实施方案中，CHO细胞是CHO DG44i。在另一个实施方案中，CHO细胞是CHO K1 GS。在重组表达载体内，将所述抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至增强子/启动子调节元件(例如，来源于SV40、CMV、腺病毒等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动基因的高水平转录。所述重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经用载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中回收抗体。
[0156] 抗体还可由转基因动物产生。例如，美国专利第5,849,992号描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建包含乳汁特异性启动子和编码目标抗体的核酸和用于分泌的信号序列的转基因。由此类转基因哺乳动物的雌性产生的乳汁包括在其中分泌的目标抗体。所述抗体可以从乳汁中纯化，或对于一些应用，可被直接使用。还提供了包含一种或多种本文所述的核酸的动物。
[0157] 可将本公开的抗体从宿主细胞的内部或外部(例如培养基)分离并纯化为基本上纯的和同质的抗体。通常用于抗体纯化的分离和纯化方法可用于抗体的分离和纯化，并且不限于任何特定的方法。抗体可通过适当选择和组合例如柱色谱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析和重结晶来分离和纯化。色谱包括例如亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤、反相色谱和吸附色谱(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。可使用液相色谱诸如HPLC和FPLC进行色谱。用于亲和色谱的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(GE Healthcare Biosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化的抗体。
[0158] 抗体的表征
[0159] 可通过任何标准方法，例如，以下方法中的一种或多种来测量本文所述抗体的αvβ5结合性质： 表面等离子体共振(SPR)、BIACORETM分析、酶联免疫吸附测定
(ELISA)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)和荧光共振能量转移(FRET)。
(ELISA)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)和荧光共振能量转移(FRET)。
[0160] 可使用 系统分析目标蛋白质(抗-αvβ5抗体)与靶(例如，β5)的结合相互作用。在该方法中，将由FortéBio公司制造的仪器的几种变体(例如， QKe和QK)之
一用于测定蛋白质相互作用、结合特异性和表位作图。 系统提供了简单的方法来
监测实时结合，通过测量沿着定制尖端传播，然后返回传感器的偏振光的变化。
一用于测定蛋白质相互作用、结合特异性和表位作图。 系统提供了简单的方法来
监测实时结合，通过测量沿着定制尖端传播，然后返回传感器的偏振光的变化。
[0161] 可使用表面等离子体共振(SPR)分析目标蛋白质(抗-αvβ5抗体)与靶(例如，β5)的结合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)实时检测生物特异性相互作用，而不标记任何相互作用物。BIA芯片的结合表面处的质量的变化(指示结合事件)导致表面附近的光的折射率的改变(表面等离子体共振(SPR)的光学现象)。折射率的变化生成可检测信号，将所述信号作为生物分子之间的实时反应的指示进行测量。使用SPR的方法描述于例如美国专利第5,641,640号；Raether(1988)Surface Plasmons Springer Verlag；Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338-2345；Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705和由BIAcore International AB(Uppsala，Sweden)提供的在线资源中。可将来自SPR的信息用于提供关于生物分子与靶标的结合的平衡解离常数(Kd)和动力学参数(包括Kon和Koff)的精确和定量测量。
[0162] 还可通过使用BIACORE色谱技术(Pharmacia BIAtechnology Handbook,"Epitope Mapping"，第6.3.2节，(1994年5月)；也参见Johne等(1993)J.Immunol.Methods,160:191-198)评估不同抗体彼此竞争与人αvβ5或β5的结合的能力，来直接定位表位。
[0163] 当应用酶免疫测定时，将含有抗体的样品，例如抗体产生性细胞的培养物上清液或纯化的抗体添加至抗原涂覆的平板中。加入用酶诸如碱性磷酸酶标记的二抗，孵育平板，在洗涤后，加入酶底物诸如对硝基苯磷酸酯，并测量吸光度以评价抗原结合活性。
[0164] 用于评价抗体的另外的一般指导，例如免疫印迹和免疫沉淀测定，可见于由Harlow和Lane编码的Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor press
(1988))中。
(1988))中。
[0165] 具有改进的效应子功能的抗-αvβ5抗体
[0166] 抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统细胞的相互作用触发多种响应，在本文称为效应子功能。免疫介导的效应子功能包括两个主要机制：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。其两者均由免疫球蛋白的恒定区介导。因此，抗体Fc结构域是通过免疫效应子机制限定相互作用的部分。
[0167] IgG抗体通过结合细胞表面Fcγ受体家族的成员和补体系统的Clq激活免疫系统的效应子通路。通过簇集的抗体连接效应蛋白触发多种响应，包括炎性细胞因子的释放，抗原产生的调节，内吞作用和细胞杀伤。在一些临床应用中，这些反应对于单克隆抗体的功效是至关重要的。在其它情况下，它们引起不想要的副作用，诸如炎症和带有抗原的细胞的消除。因此，本发明还涉及具有改变的例如增强或减弱的效应子功能的αvβ5结合蛋白，包括抗体。
[0168] 本发明的抗-αvβ5抗体的效应子功能可使用许多已知测定法中的一种来测定。所述抗-αvβ5抗体的效应子功能可相对于第二抗-αvβ5抗体增得以强或减弱。在一些实施方案中，所述第二抗-αvβ5抗体可以是特异性结合αvβ5的任何抗体。在某些实施方案中，所述第二抗-αvβ5抗体可以是特异性结合αvβ5的任何人源化抗体。在其它实施方案中，所述第二αvβ5特异性抗体可以是本发明的任何抗体，诸如实施例2和8中描述的抗体。在其中目标抗-αvβ5抗体已经被修饰来减弱效应子功能的其它实施方案中，所述第二抗-αvβ5抗体可以是抗体的未修饰或亲本形式。
[0169] 效应子功能包括ADCC，其中抗体结合细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)细胞或导致细胞死亡的巨噬细胞上的Fc受体，和CDC，其是通过补体级联的激活诱导的细胞死亡(综述于Daeron,Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997)；Ward和Ghetie,Therapeutic Immunol.,2:77-94(1995)；以及Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991))。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可使用本领域已知的标准测定法进行评估(参见，例如WO 05/018572、WO 05/003175和US 6,242,195)。
[0170] 效应子功能可以通过使用缺少Fc结构域的抗体片段诸如Fab、Fab'2或单链Fv来避免。另一种方法是使用与FcγRI结合但与C1q以及FcγRII和RIII结合较差的IgG4亚型抗体。然而，IgG4抗体可形成聚集体，因为它们在低pH下与IgG1抗体相比具有差的稳定性。IgG4抗体的稳定性可以通过用以下氨基酸中的任一种取代位置409(根据由Kabat等，
Sequences of proteins of immunological interest，1991，第5版提出的EU索引)处的精氨酸来改善：赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。可选择地和/或另外地，可通过用IgG1抗体的CH3结构域取代IgG4抗体的CH3结构域，或通过用IgG1的CH2和CH3结构域取代IgG4的CH2和CH3结构域来改善IgG4抗体的稳定性。因此，IgG4同种型的本发明的抗-αvβ5抗体可包括位置409处的修饰和/或IgG1结构域对CH2和/或CH3结构域的替代，以增加抗体的稳定性，同时减弱效应子功能。IgG2亚型还具有减少的与Fc受体的结合，但保留对FcγRIIa的H131同种异型和C1q的显著结合。因此，可能需要Fc序列中的额外变化来消除与所有Fc受体和与C1q的结合。
Sequences of proteins of immunological interest，1991，第5版提出的EU索引)处的精氨酸来改善：赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。可选择地和/或另外地，可通过用IgG1抗体的CH3结构域取代IgG4抗体的CH3结构域，或通过用IgG1的CH2和CH3结构域取代IgG4的CH2和CH3结构域来改善IgG4抗体的稳定性。因此，IgG4同种型的本发明的抗-αvβ5抗体可包括位置409处的修饰和/或IgG1结构域对CH2和/或CH3结构域的替代，以增加抗体的稳定性，同时减弱效应子功能。IgG2亚型还具有减少的与Fc受体的结合，但保留对FcγRIIa的H131同种异型和C1q的显著结合。因此，可能需要Fc序列中的额外变化来消除与所有Fc受体和与C1q的结合。
[0171] 几种抗体效应子功能，包括ADCC，由结合抗体Fc区的Fc受体(FcR)介导。可通过改变抗体的Fc和/或恒定区的氨基酸序列和/或翻译后修饰来调节(即，增强或减小)抗体对特定FcR的亲和力，从而调节由抗体介导的效应子活性。
[0172] FcR通过它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE的Fc受体被称为FcεR，IgA的Fc受体被称为FcαR等。已鉴定了FcγR的三个亚类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRII和FcγRIII都有两种类型：FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIB(CD32b)；和FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。因为每个FcγR亚类由两个或三个基因编码，并且选择性RNA剪接导致多种转录物，所以存在FcγR同种型的宽泛多样性。例如，FcγRII(CD32)包括同种型IIa、IIb1、IIb2IIb3和IIc。
[0173] 针对FcγR的人和鼠抗体上的结合部位先前已被定位至由残基G233-S239(如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991),Woof等，
Molec.Immunol.23:319-330(1986)；Duncan等，Nature 332:563(1988)；Canfield和
Morrison,J.Exp.Med.173:1483-1491(1991)；Chappel等，Proc.Natl.Acad.Sci USA88:
9036-9040(1991)中的EU索引编号)组成的所谓的“下铰链区”。在残基G233-S239当中，P238和S239是被列为可能参与结合的那些残基。参与与FcγR的结合的其它残基是：G316-K338(Woof等，Mol.Immunol.,23:319-330(1986))、K274-R301(Sarmay等，Molec.Immunol.21:
43-51(1984))、Y407-R416(Gergely等，Biochem.Soc.Trans.12:739-743(1984)和Shields等，J Biol Chem 276:6591-6604(2001)，Lazar GA等，Proc Natl Acad Sci 103:4005-
4010(2006))、N297、T299、E318、L234-S239、N265-E269、N297-T299和A327-I332。通过检查Ig-FcR复合物的晶体结构，参与FcR结合的氨基酸残基的这些和其它区段或区域对于本领域技术人员是显而易见的(参见，例如Sondermann等，2000Nature 406(6793):267-73和Sondermann等2002Biochem Soc Trans.30(4):481-6)。因此，本发明的抗-αvβ5抗体包括一个或多个上述残基的修饰来根据需要增强或减弱效应子功能。
Molec.Immunol.23:319-330(1986)；Duncan等，Nature 332:563(1988)；Canfield和
Morrison,J.Exp.Med.173:1483-1491(1991)；Chappel等，Proc.Natl.Acad.Sci USA88:
9036-9040(1991)中的EU索引编号)组成的所谓的“下铰链区”。在残基G233-S239当中，P238和S239是被列为可能参与结合的那些残基。参与与FcγR的结合的其它残基是：G316-K338(Woof等，Mol.Immunol.,23:319-330(1986))、K274-R301(Sarmay等，Molec.Immunol.21:
43-51(1984))、Y407-R416(Gergely等，Biochem.Soc.Trans.12:739-743(1984)和Shields等，J Biol Chem 276:6591-6604(2001)，Lazar GA等，Proc Natl Acad Sci 103:4005-
4010(2006))、N297、T299、E318、L234-S239、N265-E269、N297-T299和A327-I332。通过检查Ig-FcR复合物的晶体结构，参与FcR结合的氨基酸残基的这些和其它区段或区域对于本领域技术人员是显而易见的(参见，例如Sondermann等，2000Nature 406(6793):267-73和Sondermann等2002Biochem Soc Trans.30(4):481-6)。因此，本发明的抗-αvβ5抗体包括一个或多个上述残基的修饰来根据需要增强或减弱效应子功能。
[0174] 用于改变单克隆抗体效应子功能的另一种方法包括突变参与效应物结合相互作用的单克隆抗体表面上的氨基酸(Lund,J.等(1991)J.Immunol.147(8):2657-62；Shields,R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276(9):6591-604)。
[0175] 增强抗体的效应子功能的方法是本领域公知的(参见，例如Kelley等，Methods Mol.Biol.,901:277-93(2012)；Natsume等，Drug Des Devel Ther.,3:7-16(2009)；US 8,188,231、US 7,960,512)。在一个实施方案中，所述αvβ5抗体在选自由以下位置组成的组的位置处具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个氨基酸取代：位置221、222、223、224、
225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、
247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、
276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、
299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、
330、331、332、333、334、335、336和337，其中Fc区中的残基的编号是Kabat中EU索引的编号。
在某些实施方案中，所述αvβ5抗体具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个氨基酸取代，其选自：D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、P228E、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、L234H、L234I、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、L234Y、L235A、L235D、L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、L235Q、L235R、L235S、L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、G236M、G236N、G236P、G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、G237R、G237S、G237T、G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、P238N、P238Q、P238R、P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239E、S239F、S239G、S239H、S239I、S239K、S239L、S239M、S239N、S239P、S239Q、S239R、S239T、S239V、S239W、S239Y、V240A、V240I、V240M、V240T、F241D、F241E、F241L、F241R、F241S、F241W、F241Y、F243E、F243H、F243L、F243Q、F243R、F243W、F243Y、P244H、P245A、K246D、K246E、K246H、K246Y、P247G、P247V、D249H、D249Q、D249Y、R255E、R255Y、E258H、E258S、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262A、V262E、V262F、V262I、V262T、V263A、V263I、V263M、V263T、V264A、V264D、V264E、V264F、V264G、V264H、V264I、V264K、V264L、V264M、V264N、V264P、V264Q、V264R、V264S、V264T、V264W、V264Y、D265F、D265G、D265H、D265I、D265K、D265L、D265M、D265N、D265P、D265Q、D265R、D265S、D265T、D265V、D265W、D265Y、V266A、V266I、V266M、V266T、S267D、S267E、S267F、S267H、S267I、S267K、S267L、S267M、S267N、S267P、S267Q、S267R、S267T、S267V、S267W、S267Y、H268D、H268E、H268F、H268G、H268I、H268K、H268L、H268M、H268P、H268Q、H268R、H268T、H268V、H268W、E269F、E269G、E269H、E269I、E269K、E269L、E269M、E269N、E269P、E269R、E269S、E269T、E269V、E269W、E269Y、D270F、D270G、D270H、D270I、D270L、D270M、D270P、D270Q、D270R、D270S、D270T、D270W、D270Y、P271A、P271D、P271E、P271F、P271G、P271H、P271I、P271K、P271L、P271M、P271N、P271Q、P271R、P271S、P271T、P271V、P271W、P271Y、E272D、E272F、E272G、E272H、E272I、E272K、E272L、E272M、E272P、E272R、E272S、E272T、E272V、E272W、E272Y、V273I、K274D、K274E、K274F、K274G、K274H、K274I、K274L、K274M、K274N、K274P、K274R、K274T、K274V、K274W、K274Y、F275L、F275W、N276D、N276E、N276F、N276G、N276H、N276I、N276L、N276M、N276P、N276R、N276S、N276T、N276V、N276W、N276Y、Y278D、Y278E、Y278G、Y278H、Y278I、Y278K、Y278L、Y278M、Y278N、Y278P、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278T、Y278V、Y278W、D280G、D280K、D280L、D280P、D280W、G281D、G281E、G281K、G281N、G281P、G281Q、G281Y、V282E、V282G、V282K、V282P、V282Y、E283G、E283H、E283K、E283L、E283P、E283R、E283Y、V284D、V284E、V284L、V284N、V284Q、V284T、V284Y、H285D、H285E、H285K、H285Q、H285W、H285Y、N286E、N286G、N286P、N286Y、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290H、K290L、K290N、K290W、P291D、P291E、P291G、P291H、P291I、P291Q、P291T、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293F、E293G、E293H、E293I、E293L、E293M、E293N、E293P、E293R、E293S、E293T、E293V、E293W、E293Y、E294F、E294G、E294H、E294I、E294K、E294L、E294M、E294P、E294R、E294S、E294T、E294V、E294W、E294Y、Q295D、Q295E、Q295F、Q295G、Q295H、Q295I、Q295M、Q295N、Q295P、Q295R、Q295S、Q295T、Q295V、Q295W、Q295Y、Y296A、Y296D、Y296E、Y296G、Y296H、Y296I、Y296K、Y296L、Y296M、Y296N、Y296Q、Y296R、Y296S、Y296T、Y296V、N297D、N297E、N297F、N297G、N297H、N297I、N297K、N297L、N297M、N297P、N297Q、N297R、N297S、N297T、N297V、N297W、N297Y、S298D、S298E、S298F、S298H、S298I、S298K、S298M、S298N、S298Q、S298R、S298T、S298W、S298Y、T299A、T299D、T299E、T299F、T299G、T299H、T299I、T299K、T299L、T299M、T299N、T299P、T299Q、T299R、T299S、T299V、T299W、T299Y、Y300A、Y300D、Y300E、Y300G、Y300H、Y300K、Y300M、Y300N、Y300P、Y300Q、Y300R、Y300S、Y300T、Y300V、Y300W、R301D、R301E、R301H、R301Y、V302I、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304H、S304L、S304N、S304T、V305E、V305T、V305Y、W313F、K317E、K317Q、E318H、E318L、E318Q、E318R、E318Y、K320D、K320F、K320G、K320H、K320I、K320L、K320N、K320P、K320S、K320T、K320V、K320W、K320Y、K322D、K322F、K322G、K322H、K322I、K322P、K322S、K322T、K322V、K322W、K322Y、V323I、S324D、S324F、S324G、S324H、S324I、S324L、S324M、S324P、S324R、S324T、S324V、S324W、S324Y、N325A、N325D、N325E、N325F、N325G、N325H、N325I、N325K、N325L、N325M、N325P、N325Q、N325R、N325S、N325T、N325V、N325W、N325Y、K326I、K326L、K326P、K326T、A327D、A327E、A327F、A327H、A327I、A327K、A327L、A327M、A327N、A327P、A327R、A327S、A327T、A327V、A327W、A327Y、L328A、L328D、L328E、L328F、L328G、L328H、L328I、L328K、L328M、L328N、L328P、L328Q、L328R、L328S、L328T、L328V、L328W、L328Y、P329D、P329E、P329F、P329G、P329H、P329I、P329K、P329L、P329M、P329N、P329Q、P329R、P329S、P329T、P329V、P329W、P329Y、A330E、A330F、A330G、A330H、A330I、A330L、A330M、A330N、A330P、A330R、A330S、A330T、A330V、A330W、A330Y、P331D、P331F、P331H、P331I、P331L、P331M、P331Q、P331R、P331T、P331V、P331W、P331Y、I332A、I332D、I332E、I332F、I332H、I332K、I332L、I332M、I332N、I332P、I332Q、I332R、I332S、I332T、I332V、I332W、I332Y、E333F、E333H、E333I、E333L、E333M、E333P、E333T、E333Y、K334F、K334I、K334L、K334P、K334T、T335D、T335F、T335G、T335H、T335I、T335L、T335M、T335N、T335P、T335R、T335S、T335V、T335W、T335Y、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337H和S337N，其中Fc区中的残基的编号是Kabat中EU索引的编号。在具体实施方案中，所述αvβ5抗体包含以下突变中的1个、2个或3个：S239D、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、S239D/I332E/G236A、S298A、A330L I332E、E333A和K334A。
225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、
247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、
276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、
299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、
330、331、332、333、334、335、336和337，其中Fc区中的残基的编号是Kabat中EU索引的编号。
在某些实施方案中，所述αvβ5抗体具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个氨基酸取代，其选自：D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、P228E、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、L234H、L234I、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、L234Y、L235A、L235D、L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、L235Q、L235R、L235S、L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、G236M、G236N、G236P、G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、G237R、G237S、G237T、G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、P238N、P238Q、P238R、P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239E、S239F、S239G、S239H、S239I、S239K、S239L、S239M、S239N、S239P、S239Q、S239R、S239T、S239V、S239W、S239Y、V240A、V240I、V240M、V240T、F241D、F241E、F241L、F241R、F241S、F241W、F241Y、F243E、F243H、F243L、F243Q、F243R、F243W、F243Y、P244H、P245A、K246D、K246E、K246H、K246Y、P247G、P247V、D249H、D249Q、D249Y、R255E、R255Y、E258H、E258S、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262A、V262E、V262F、V262I、V262T、V263A、V263I、V263M、V263T、V264A、V264D、V264E、V264F、V264G、V264H、V264I、V264K、V264L、V264M、V264N、V264P、V264Q、V264R、V264S、V264T、V264W、V264Y、D265F、D265G、D265H、D265I、D265K、D265L、D265M、D265N、D265P、D265Q、D265R、D265S、D265T、D265V、D265W、D265Y、V266A、V266I、V266M、V266T、S267D、S267E、S267F、S267H、S267I、S267K、S267L、S267M、S267N、S267P、S267Q、S267R、S267T、S267V、S267W、S267Y、H268D、H268E、H268F、H268G、H268I、H268K、H268L、H268M、H268P、H268Q、H268R、H268T、H268V、H268W、E269F、E269G、E269H、E269I、E269K、E269L、E269M、E269N、E269P、E269R、E269S、E269T、E269V、E269W、E269Y、D270F、D270G、D270H、D270I、D270L、D270M、D270P、D270Q、D270R、D270S、D270T、D270W、D270Y、P271A、P271D、P271E、P271F、P271G、P271H、P271I、P271K、P271L、P271M、P271N、P271Q、P271R、P271S、P271T、P271V、P271W、P271Y、E272D、E272F、E272G、E272H、E272I、E272K、E272L、E272M、E272P、E272R、E272S、E272T、E272V、E272W、E272Y、V273I、K274D、K274E、K274F、K274G、K274H、K274I、K274L、K274M、K274N、K274P、K274R、K274T、K274V、K274W、K274Y、F275L、F275W、N276D、N276E、N276F、N276G、N276H、N276I、N276L、N276M、N276P、N276R、N276S、N276T、N276V、N276W、N276Y、Y278D、Y278E、Y278G、Y278H、Y278I、Y278K、Y278L、Y278M、Y278N、Y278P、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278T、Y278V、Y278W、D280G、D280K、D280L、D280P、D280W、G281D、G281E、G281K、G281N、G281P、G281Q、G281Y、V282E、V282G、V282K、V282P、V282Y、E283G、E283H、E283K、E283L、E283P、E283R、E283Y、V284D、V284E、V284L、V284N、V284Q、V284T、V284Y、H285D、H285E、H285K、H285Q、H285W、H285Y、N286E、N286G、N286P、N286Y、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290H、K290L、K290N、K290W、P291D、P291E、P291G、P291H、P291I、P291Q、P291T、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293F、E293G、E293H、E293I、E293L、E293M、E293N、E293P、E293R、E293S、E293T、E293V、E293W、E293Y、E294F、E294G、E294H、E294I、E294K、E294L、E294M、E294P、E294R、E294S、E294T、E294V、E294W、E294Y、Q295D、Q295E、Q295F、Q295G、Q295H、Q295I、Q295M、Q295N、Q295P、Q295R、Q295S、Q295T、Q295V、Q295W、Q295Y、Y296A、Y296D、Y296E、Y296G、Y296H、Y296I、Y296K、Y296L、Y296M、Y296N、Y296Q、Y296R、Y296S、Y296T、Y296V、N297D、N297E、N297F、N297G、N297H、N297I、N297K、N297L、N297M、N297P、N297Q、N297R、N297S、N297T、N297V、N297W、N297Y、S298D、S298E、S298F、S298H、S298I、S298K、S298M、S298N、S298Q、S298R、S298T、S298W、S298Y、T299A、T299D、T299E、T299F、T299G、T299H、T299I、T299K、T299L、T299M、T299N、T299P、T299Q、T299R、T299S、T299V、T299W、T299Y、Y300A、Y300D、Y300E、Y300G、Y300H、Y300K、Y300M、Y300N、Y300P、Y300Q、Y300R、Y300S、Y300T、Y300V、Y300W、R301D、R301E、R301H、R301Y、V302I、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304H、S304L、S304N、S304T、V305E、V305T、V305Y、W313F、K317E、K317Q、E318H、E318L、E318Q、E318R、E318Y、K320D、K320F、K320G、K320H、K320I、K320L、K320N、K320P、K320S、K320T、K320V、K320W、K320Y、K322D、K322F、K322G、K322H、K322I、K322P、K322S、K322T、K322V、K322W、K322Y、V323I、S324D、S324F、S324G、S324H、S324I、S324L、S324M、S324P、S324R、S324T、S324V、S324W、S324Y、N325A、N325D、N325E、N325F、N325G、N325H、N325I、N325K、N325L、N325M、N325P、N325Q、N325R、N325S、N325T、N325V、N325W、N325Y、K326I、K326L、K326P、K326T、A327D、A327E、A327F、A327H、A327I、A327K、A327L、A327M、A327N、A327P、A327R、A327S、A327T、A327V、A327W、A327Y、L328A、L328D、L328E、L328F、L328G、L328H、L328I、L328K、L328M、L328N、L328P、L328Q、L328R、L328S、L328T、L328V、L328W、L328Y、P329D、P329E、P329F、P329G、P329H、P329I、P329K、P329L、P329M、P329N、P329Q、P329R、P329S、P329T、P329V、P329W、P329Y、A330E、A330F、A330G、A330H、A330I、A330L、A330M、A330N、A330P、A330R、A330S、A330T、A330V、A330W、A330Y、P331D、P331F、P331H、P331I、P331L、P331M、P331Q、P331R、P331T、P331V、P331W、P331Y、I332A、I332D、I332E、I332F、I332H、I332K、I332L、I332M、I332N、I332P、I332Q、I332R、I332S、I332T、I332V、I332W、I332Y、E333F、E333H、E333I、E333L、E333M、E333P、E333T、E333Y、K334F、K334I、K334L、K334P、K334T、T335D、T335F、T335G、T335H、T335I、T335L、T335M、T335N、T335P、T335R、T335S、T335V、T335W、T335Y、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337H和S337N，其中Fc区中的残基的编号是Kabat中EU索引的编号。在具体实施方案中，所述αvβ5抗体包含以下突变中的1个、2个或3个：S239D、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、S239D/I332E/G236A、S298A、A330L I332E、E333A和K334A。
[0176] 寡糖-特别是IgG1的CH2结构域中天冬酰胺-297处的N-连接的寡糖的存在对于与FcγR以及C1q的结合是重要的。减少抗体的岩藻糖含量改善了效应子功能(参见，例如US 8,163,551)。在某些实施方案中，所述αvβ5抗体具有减弱的增强效应子功能的岩藻糖基化和氨基酸取代(例如，以下突变中的1个、2个或3个：S298A、E333A和K334A)。效应子功能还可通过在浓度为约60-200ng/mL(例如，60ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、150ng/ml)的α-甘露糖苷酶I抑制剂(例如，基夫碱)存在的情况下制备和表达本文所述的抗-αvβ5抗体来实现。在α-甘露糖苷酶I抑制剂存在下表达的抗体主要包含寡甘露糖型聚糖，并且通常表现出增强的ADCC活性和对FcγRIIIA的亲和力，但减少的C1q结合。
[0177] 具有增强的效应子功能的本公开的抗-αvβ5抗体包括具有相对于亲本或非变异抗-αvβ5抗体增加的对一种或多种Fc受体(FcR)的结合亲和力的抗体。因此，具有增强的FcR结合亲和力的抗-αvβ5抗体包括这样的抗-αvβ5抗体，所述抗体表现出相较于亲本或非变异抗-αvβ5抗体的对一种或多种Fc受体的结合亲和力的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高倍的增强。在一些实施方案中，具有增强的效应子功能的抗-αvβ5抗体以相对于亲本或非变体抗体高约10倍的亲和力结合FcR。在其它实施方案中，具有增强的效应子功能的抗-αvβ5抗体以相对于亲本或非变体抗体高约15倍的亲和力或高约20倍的亲和力结合FcR。FcR受体可以是FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII及其同种型以及FcεR、FcμR、FcδR和/或FcαR中的一种或多种。在具体实施方案中，具有增强的效应子功能的抗-αvβ5抗体表现出对FcγRIIa的结合亲和力的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高倍的增加。
[0178] 在一些情况下，需要消除人源化ALULA中的效应子功能/补体激活，因为(1)ALULA的假定的作用机制是抑制配体与αvβ5的结合；(2)αvβ5在大多数细胞类型上广泛表达；和(3)补体活化在相关临床适应症中有详细记载，并且可在疾病中具有致病作用。因此，本发明还涉及具有减弱的效应子功能的αvβ5-结合抗体。为了减弱效应子功能，可使用不同亚型序列区段的组合(例如，IgG2与IgG4的组合)，以提供比任一单独的亚型更大的对Fcγ受体的结合的减少(Armour等，Eur.J.Immunol.,29:2613-1624(1999)；Mol.Immunol.,40:585-593(2003))。对于一些或所有Fc受体亚型(以及因此对于效应子功能)具有改变的和/或减小的亲和力的大量Fc变体是本领域已知的。参见，例如，US 2007/0224188、US 2007/
0148171、US 2007/0048300、US 2007/0041966、US 2007/0009523、US 2007/0036799、US
2006/0275283、US 2006/0235208、US 2006/0193856、US 2006/0160996、US 2006/0134105、US 2006/0024298、US 2005/0244403、US 2005/0233382、US 2005/0215768、US 2005/
0118174、US 2005/0054832、US 2004/0228856、US 2004/132101、US 2003/158389，也参见US 7,183,387、6,737,056、6,538,124、6,528,624、6,194,551、5,624,821、5,648,260。
0148171、US 2007/0048300、US 2007/0041966、US 2007/0009523、US 2007/0036799、US
2006/0275283、US 2006/0235208、US 2006/0193856、US 2006/0160996、US 2006/0134105、US 2006/0024298、US 2005/0244403、US 2005/0233382、US 2005/0215768、US 2005/
0118174、US 2005/0054832、US 2004/0228856、US 2004/132101、US 2003/158389，也参见US 7,183,387、6,737,056、6,538,124、6,528,624、6,194,551、5,624,821、5,648,260。
[0179] 具有减弱的效应子功能的本发明的抗-αvβ5抗体包括相对于亲本或非变异抗-αvβ5抗体对一种或多种Fc受体(FcR)具有减小的结合亲和力的抗体。因此，具有减小的FcR结合亲和力的抗-αvβ5抗体包括相较于亲本或非变异抗-αvβ5抗体表现出对一种或多种Fc受体的结合亲和力的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或25倍或更高倍的减小的抗-αvβ5抗体。在一些实施方案中，具有减弱的效应子功能的抗-αvβ5抗体以相对于亲本或非变异抗体小至约1/10的亲和力结合FcR。在其它实施方案中，具有减弱的效应子功能的抗-αvβ
5抗体以相对于亲本或非变异抗体小至约1/15的亲和力或小至约1/20的亲和力结合FcR。
FcR受体可以是FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII及其同种型以及FcεR、FcμR、FcδR和/或FcαR中的一种或多种。在具体实施方案中，具有减弱的效应子功能的抗-αvβ5抗体表现出对FcγRIIa的结合亲和力的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高倍的减小。
5抗体以相对于亲本或非变异抗体小至约1/15的亲和力或小至约1/20的亲和力结合FcR。
FcR受体可以是FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII及其同种型以及FcεR、FcμR、FcδR和/或FcαR中的一种或多种。在具体实施方案中，具有减弱的效应子功能的抗-αvβ5抗体表现出对FcγRIIa的结合亲和力的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高倍的减小。
[0180] 在CDC中，抗体-抗原复合物结合补体，导致补体级联的激活和膜攻击复合物的产生。经典补体通路的激活通过补体系统的第一组分(C1q)与结合至其同源抗原的抗体(合适亚类的)的结合启动；因此，补体级联的激化部分地由免疫球蛋白对C1q蛋白的结合亲和力调节。为了激活补体级联，C1q必需结合至IgG1、IgG2或IgG3的至少两个分子，但只结合至附接于抗原性靶标的IgM分子的一个分子(Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2:77-94(1995)第80页)。为了评估补体激活，可进行CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods,202:163(1996)所述。
[0181] IgG分子的各种残基参与与C1q的结合，所述残基包括CH2结构域上的Glu318、Lys320和Lys322残基、位于紧邻相同β链的转角上的氨基酸残基331、位于下铰链区中的Lys235和Gly237残基和位于CH2结构域的N末端区中的残基231至238(参见，例如Xu等，J.Immunol.150:152A(摘要)(1993)、WO94/29351；Tao等，J.Exp.Med.,178:661-667(1993)；
Brekke等，Eur.J.lmmunol.,24:2542-47(1994)；Burton等，Nature,288:338-344(1980)；
Duncan和Winter,Nature 332:738-40(1988)；Idusogie等，J Immunol 164:4178-4184(2000；U.S.5,648,260和U.S.5,624,821)。
Brekke等，Eur.J.lmmunol.,24:2542-47(1994)；Burton等，Nature,288:338-344(1980)；
Duncan和Winter,Nature 332:738-40(1988)；Idusogie等，J Immunol 164:4178-4184(2000；U.S.5,648,260和U.S.5,624,821)。
[0182] 具有改善的C1q结合的抗-αvβ5抗体可在人IgG Fc区的氨基酸位置326、327、333和334的1个、2个、3个或4个位置处包含氨基酸取代，其中IgG Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。在一个实施方案中，所述抗-αvβ5抗体包括以下氨基酸取代：K326W/E333S，已知其增加IgG1抗体与C1q的结合(Steurer W.等，J Immunol.,155(3):1165-74(1995))。
[0183] 具有减少的C1q结合的抗-αvβ5抗体可在人IgG Fc区的氨基酸位置270、322、329和331的1个、2个、3个或4个位置处包含氨基酸取代，其中IgG Fc区中残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。作为IgG1中的一个实例，人IgG1的CH2结构域的COOH末端区域中的两个突变-K322A和P329A不激活CDC通路，并且经显示导致C1q结合减少超过100倍(US 6,242,
195)。
195)。
[0184] 因此，在某些实施方案中，相对于第二抗-αvβ5抗体，本发明的抗-αvβ5抗体表现出减少或增加的与补体蛋白的结合。在某些实施方案中，相对于第二抗-αvβ5抗体，本发明的抗-αvβ5抗体表现出对C1q的结合的约1.5倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多或约15倍或更多的增加或减少。
[0185] 因此，在本发明的某些实施方案中，可以修饰、取代或去除这些残基中的一个或多个，或可以插入一个或多个氨基酸残基，以增强或减弱本文提供的抗-αvβ5抗体的CDC活性。
[0186] 在某些其它实施方案中，本发明提供了抗-αvβ5抗体，其表现出与一种或多种FcR受体的减少的结合，但保持其结合补体的能力(例如，与天然、非变异或亲本抗-αvβ5抗体相似或在一些实施方案中，程度低于其)。因此，本发明的抗-αvβ5抗体可以结合并激活补体，同时表现出与FcR(诸如，例如FcγRIIa(例如，在血小板上表达的FcγRIIa))的减少的结合。此类具有减少的与FcγRIIa(例如，诸如在血小板上表达的FcγRIIa)的结合或无与所述FcγRIIa的结合，但能够结合C1q并且至少一定程度地激活补体级联的抗体，将降低血栓栓塞事件的风险，同时保持可能期望的效应子功能。在替代实施方案中，本发明的抗-αvβ5抗体表现出与一种或多种FcR的减少的结合，但保持其结合一种或多种其它FcR的能力。参见，例如US 2007-0009523、2006-0194290、2005-0233382、2004-0228856和2004-0191244，它们描述了生成具有减少的与FcRI、FcRII和/或FcRIII结合的抗体的各种氨基酸修饰，以及导致与一种FcR的增加的结合但与另一种FcR的减少的结合的氨基酸取代。
[0187] 因此，涉及抗-αvβ5抗体恒定区的效应子功能可通过改变恒定区，特别是Fc区的性质来进行调节。在某些实施方案中，将具有减弱的效应子功能的抗-αvβ5抗体与第二抗体进行比较，所述第二抗体具有效应子功能的，并且可以是包含介导效应子功能的天然恒定区或Fc区的非变异、天然或亲本抗体。
[0188] 天然恒定区包含与天然存在的恒定链区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。优选地，用于评估相对效应子功能的对照分子包含与测试或变异抗体相同的类型/亚型Fc区。变体或改变的Fc或恒定区包含这样的氨基酸序列，其由于至少一个氨基酸修饰(诸如，例如，翻译后修饰、氨基酸取代、插入或缺失)而不同于天然序列重链区的氨基酸序列。因此，变异恒定区可含有导致改变的翻译后修饰，包括例如改变的糖基化模式的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。变体恒定区可以具有减弱的效应子功能。
[0189] 具有改变的(即增强的或减弱的)效应子功能的抗体可通过工程化或产生具有变异恒定区、Fc区或重链区的抗体来生成。重组DNA技术和/或细胞培养和表达条件可用于产生具有改变的功能和/或活性的抗体。例如，重组DNA技术可用于工程化影响抗体功能(包括效应子功能)的区域(诸如，例如Fc或恒定区)中的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。或者，翻译后修饰的变化，诸如，例如糖基化模式可通过操作宿主细胞和细胞培养物以及籍以产生抗体的表达条件来实现。
[0190] 本发明的某些实施方案涉及包含来自SEQ ID NO：1-7中任一个的一个或多个(1、2或3个)重链CDR序列(Kabat或替代CDR)或由其组成的抗-αvβ5抗体。在一个实施方案中，所述抗-αvβ5抗体重链CDR序列包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15中的氨基酸序列或由其组成。这些抗体还可以包含来自SEQ ID NO：8-12中任一个的一个或多个(1、2或3个)轻链CDR序列(Kabat或替代CDR)或由其组成。例如，所述抗-αvβ5抗体轻链CDR序列可包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18中的氨基酸序列或由其组成。本文所述的抗体还可包含相较于天然或亲本Fc区赋予增强或减弱的效应子功能的Fc区。在某些实施方案中，这些抗体的Fc区是包含IgG4的CH1和CH2结构域和IgG1的CH3结构域的嵌合体。这些抗-αvβ5抗体(i)抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；和/或(ii)抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或(iii)抑制TGF-β的活化；和/或(iv)以高亲和力结合人αvβ5。
[0191] 在其它实施方案中，本公开提供了抗-αvβ5抗体，其包含含有SEQ ID NO：10的VL序列和含有SEQ ID NO：5的VH序列，所述抗体还包含相较于天然或亲本Fc区赋予增强或减弱的效应子功能的Fc区或变异Fc区。在具体实施方案中，本公开提供了抗-αvβ5抗体，其包含含有SEQ ID NO：70的轻链序列和含有SEQ ID NO：69的重链序列。
[0192] 生成包含氨基酸取代的任何上述抗-αvβ5抗体变体的方法是本领域公知的。这些方法包括但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变编码所述抗体或至少所述抗体的恒定区的制备的DNA分子进行的制备。定点诱变是本领域公知的(参见，例如，Carter等，Nucleic Acids Res.,13:4431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488(1987))。PCR诱变也适用于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi，于PCR Protocols，第177-183页(Academic Press,1990)；和Vallette等，Nuc.Acids Res.17:723-733(1989)中。制备序列变体的另一种方法盒式诱变基于由Wells等，Gene,34:315-323(1985)所述的技术。可通过US2012/0100140(通过引用并入本文)中描述的方法来稳定具有增强或减弱的效应子功能的本文所述的抗体。
[0193] 具有改变的糖基化的抗-αvβ5抗体
[0194] 聚糖去除产生应该大大减少对跨物种的Fc受体家族的所有成员的结合的结构变化。在糖基化抗体，包括抗-αvβ5抗体中，附接至Fc二聚体的CH2结构域中的保守的N-连接位点的聚糖(寡糖)被封闭在CH2结构域之间，糖残基与相对的CH2结构域上的特定氨基酸残基接触。不同的糖基化模式与抗体的不同生物学性质相关(Jefferis和Lund，1997,Chem.Immunol.,65:111-128；Wright和Morrison,1997,Trends Biotechnol.,15:26-32)。
某些特定的糖形赋予潜在有利的生物学性质。聚糖的损失改变结构域之间的间隔并且增加它们相对于彼此的迁移，并且预期对Fc受体家族的所有成员的结合具有抑制作用。例如，使用各种糖基化抗体的体外研究已经证明，CH2聚糖的去除改变Fc结构，使得与Fc受体和补体蛋白C1Q结合的抗体大大减少。减弱效应子功能的另一种已知方法是抑制Fc的CH2结构域中位置297(EU编号)处的N连接的聚糖的产生或去除该聚糖(Nose等，1983PNAS 80:6632；
Leatherbarrow等，1985 Mol.Immunol.22:407；Tao等，1989 J.Immunol.143:2595；Lund等，
1990 Mol.Immunol.27:1145；Dorai等，1991 Hybridoma 10:211；Hand等，1992 Cancer Immunol.Immunother.35:165；Leader等，1991 Immunology 72:481；Pound等，1993 Mol.Immunol.30:233；Boyd等，1995 Mol.Immunol.32:1311)。还已知不同的糖形可深深地影响治疗剂的性质，包括药代动力学、药效动力学、受体相互作用和组织特异性靶向
(Graddis等，2002,Curr Pharm Biotechnol.3:285-297)。特别地，对于抗体，除了抗体的效应子功能(例如，与补体复合物C1的结合，该结合诱导CDC，和与FcγR受体的结合，该结合负责调节ADCC通路)以外，寡糖结构还可影响与蛋白酶抗性相关的性质、由FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、吞噬作用和抗体反馈(Nose和Wigzell，1983；Leatherbarrow和Dwek,
1983；Leatherbarrow等，1985；Walker等，1989；Carter等，1992,PNAS,89:4285-4289)。
某些特定的糖形赋予潜在有利的生物学性质。聚糖的损失改变结构域之间的间隔并且增加它们相对于彼此的迁移，并且预期对Fc受体家族的所有成员的结合具有抑制作用。例如，使用各种糖基化抗体的体外研究已经证明，CH2聚糖的去除改变Fc结构，使得与Fc受体和补体蛋白C1Q结合的抗体大大减少。减弱效应子功能的另一种已知方法是抑制Fc的CH2结构域中位置297(EU编号)处的N连接的聚糖的产生或去除该聚糖(Nose等，1983PNAS 80:6632；
Leatherbarrow等，1985 Mol.Immunol.22:407；Tao等，1989 J.Immunol.143:2595；Lund等，
1990 Mol.Immunol.27:1145；Dorai等，1991 Hybridoma 10:211；Hand等，1992 Cancer Immunol.Immunother.35:165；Leader等，1991 Immunology 72:481；Pound等，1993 Mol.Immunol.30:233；Boyd等，1995 Mol.Immunol.32:1311)。还已知不同的糖形可深深地影响治疗剂的性质，包括药代动力学、药效动力学、受体相互作用和组织特异性靶向
(Graddis等，2002,Curr Pharm Biotechnol.3:285-297)。特别地，对于抗体，除了抗体的效应子功能(例如，与补体复合物C1的结合，该结合诱导CDC，和与FcγR受体的结合，该结合负责调节ADCC通路)以外，寡糖结构还可影响与蛋白酶抗性相关的性质、由FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、吞噬作用和抗体反馈(Nose和Wigzell，1983；Leatherbarrow和Dwek,
1983；Leatherbarrow等，1985；Walker等，1989；Carter等，1992,PNAS,89:4285-4289)。
[0195] 因此，调节抗体的效应子功能的另一种手段包括改变抗体恒定区的糖基化。改变的糖基化包括例如糖基化残基数目的减少或增加、糖基化残基的模式或位置的改变以及糖结构的改变。在人IgG上发现的寡糖影响它们的效应子功能程度(Raju,T.S.BioProcess International2003年4月.44-53)；人IgG寡糖的微不均一性可影响生物学功能诸如CDC和ADCC、与各种Fc受体的结合和与C1q蛋白的结合(Wright A.&Morrison SL.TIBTECH 1997,15 26-32；Shields等J Biol Chem.2001 276(9):6591-604；Shields等J Biol Chem.2002；
277(30):26733-40；Shinkawa等J Biol Chem.2003 278(5):3466-73；Umana等Nat
Biotechnol.1999年2月；17(2):176-80)。例如，IgG结合C1q并激活补体级联的能力可取决于位于两个CH2结构域之间的糖类部分(其通常锚定在Asn297)的存在、不存在或修饰(Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2:77-94(1995)。
277(30):26733-40；Shinkawa等J Biol Chem.2003 278(5):3466-73；Umana等Nat
Biotechnol.1999年2月；17(2):176-80)。例如，IgG结合C1q并激活补体级联的能力可取决于位于两个CH2结构域之间的糖类部分(其通常锚定在Asn297)的存在、不存在或修饰(Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2:77-94(1995)。
[0196] 可通过标准技术鉴定含Fc多肽例如抗体诸如IgG抗体中的糖基化位点。糖基化位点的鉴定可以是实验的或基于序列分析或建模数据。已经描述了共有基序，即被各种糖基转移酶识别的氨基酸序列。例如，N连接的糖基化基序的共有基序通常是NXT或NXS，其中X可以是除脯氨酸之外的任意氨基酸。还描述了用于定位潜在的糖基化基序的几种算法。因此，为了鉴定抗体或含Fc片段内的潜在糖基化位点，例如通过使用公众可获得的数据库诸如由生物学序列分析中心提供的网站来检查抗体的序列(参见用于预测N-连接的糖基化位点的NetNGlyc服务和用于预测O-连接的糖基化位点的NetOGlyc服务)。
[0197] 体内研究证实了无糖基化抗体的效应子功能的减弱。例如，无糖基抗-CD8抗体不能在小鼠中清除携带CD8的细胞(Isaacs,1992J.Immunol.148:3062)，且无糖基抗-CD3抗体在小鼠或人中不诱导细胞因子释放综合征(Boyd,1995，同上；Friend,1999 Transplantation 68:1632)。
[0198] 重要的是，尽管去除CH2结构域中的聚糖似乎对效应子功能具有显著影响，但抗体的其它功能和物理性质保持不变。具体地，已经表明，除去聚糖对血清半衰期和与抗原的结合几乎没有或没有影响(Nose,1983，同上；Tao,1989，同上；Dorai,1991，同上；Hand,1992，同上；Hobbs,1992 Mol.Immunol.29:949)。
[0199] 虽然存在非糖基化方法的体内验证，但有关于无糖基化mAb的残余效应子功能的报道(参见，例如Pound,J.D.等(1993)Mol.Immunol.30(3):233-41；Dorai,H.等(1991)Hybridoma 10(2):211-7)。Armor等显示与FcγRIIa和FcγRIIb蛋白的残余结合(Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-1624；Mol.Immunol.40(2003)585-593)。因此，效应子功能，特别是补体激活的进一步减弱对于在一些情况下保证活性的完全消除可能是重要的。
由于这个原因，IgG2和IgG4以及G1/G4杂交体的无糖基形式可用于本发明的方法和具有减弱的效应子功能的本发明的抗体组合物。
由于这个原因，IgG2和IgG4以及G1/G4杂交体的无糖基形式可用于本发明的方法和具有减弱的效应子功能的本发明的抗体组合物。
[0200] 本发明的抗-αvβ5抗体可被修饰或改变来引起减弱的效应子功能(相较于第二αvβ5特异性抗体)，同时任选地保留Fc部分的其它有价值的属性。
[0201] 因此，在某些实施方案中，本发明涉及具有减弱的效应子功能的无糖基抗-αvβ5抗体，其特征在于在抗体Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点处的修饰。Fc二聚体的CH2结构域中保守的N-连接位点的修饰可导致无糖基抗-αvβ5抗体。此类修饰的实例包括Fc二聚体的CH2结构域中的保守N-连接位点的突变，附接至CH2结构域中N-连接位点的聚糖的去除和糖基化的防止。例如，可通过将重链CH2结构域中的经典N-连接的Asn位点改变为Gln残基来产生无糖基抗-αvβ5抗体(参见，例如WO 05/03175和US 2006-0193856)。
[0202] 在本发明的一个实施方案中，所述修饰包括在重链糖基化位点处的突变以防止在该位点的糖基化。因此，在本发明的一个实施方案中，无糖基抗-αvβ5抗体通过重链糖基化位点的突变，即N298Q(N297Q，使用Kabat编号)的突变来制备，并在合适的宿主细胞中表达。例如，该突变可通过遵循制造商对来自Amersham-Pharmacia (Piscataway，NJ，
USA)的独特位点诱变试剂盒的推荐方案来实现。
USA)的独特位点诱变试剂盒的推荐方案来实现。
[0203] 可在宿主细胞(例如NSO或CHO细胞)中稳定表达所述突变的抗体，然后纯化其。作为一个实例，可使用蛋白A和凝胶过滤色谱进行纯化。对本领域技术人员显而易见的是，也可使用另外的表达和纯化方法。
[0204] 在本发明的另一个实施方案中，所述无糖基抗-αvβ5抗体具有减弱的效应子功能，其中在所述抗体或抗体衍生物的Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点处的修饰包括CH2结构域聚糖的去除，即去糖基化。这些无糖基抗-αvβ5抗体可通过常规方法生成，然后酶促去糖基化。用于抗体的酶促去糖基化的方法是本领域技术人员公知的(Williams,1973；Winkelhake&Nicolson,1976 J.Biol Chem.251:1074-80.)。
[0205] 在本发明的另一个实施方案中，去糖基化可通过在包含糖基化抑制剂诸如衣霉素的培养基中生长产生抗体的宿主细胞来实现(Nose&Wigzell,1983)。也就是说，修饰是减少或防止所述抗体的Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点处的糖基化。
[0206] 在本发明的其它实施方案中，重组X多肽(或含有此类多肽的细胞或细胞膜)可用作抗原来生成抗-αvβ5抗体或抗体衍生物，然后可将其去糖基化。
[0207] 在替代实施方案中，具有减少的糖基化的无糖基抗-αvβ5抗体或抗-αvβ5抗体可通过Taylor等(WO 05/18572和US 2007-0048300)中所述的方法产生。例如，在一个实施方案中，可通过改变第一氨基酸残基(例如，通过取代、插入、缺失或通过化学修饰)产生抗-αvβ5无糖基化抗体，其中所述改变的第一氨基酸残基通过空间位阻或电荷或两者抑制第二残基的糖基化。在某些实施方案中，所述第一氨基酸残基通过氨基酸取代来修饰。在另外的实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Asn、Gln、Trp、Pro、Ser、Thr、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Lys、Arg和His。在其它实施方案中，氨基酸取代是非常规氨基酸残基。所述第二氨基酸残基可以在糖基化基序(例如，包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基序)附近或其内。在一个示例性实施方案中，根据Kabat编号，所述第一氨基酸残基是氨基酸299，并且所述第二氨基酸残基是氨基酸297。例如，根据Kabat编号，所述第一氨基酸取代可以是T299A、T299N、T299G、T299Y、T299C、T299H、T299E、T299D、T299K、T299R、T299G、T299I、T299L、T299M、T299F、T299P、T299W和T299V。在具体实施方案中，所述氨基酸取代是T299C。
[0208] 效应子功能还可通过修饰本发明的抗体以使得所述抗体含有阻断部分来减弱。示例性阻断部分包括具有足够的空间体积和/或电荷的部分，以使得例如通过阻断糖苷酶糖基化多肽的能力来减少糖基化发生。所述阻断部分可另外或可选择地减弱效应子功能，例如通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力。在一些实施方案中，本发明涉及αvβ5结合蛋白，例如抗-αvβ5抗体，其包含变异Fc区，所述变异Fc区包含第一氨基酸残基和N-糖基化位点，用侧链化学修饰所述第一氨基酸残基以实现相较于未修饰的第一氨基酸残基增加的空间体积或增加的静电电荷，从而降低N-糖基化位点处的糖基化水平或以其它方式改变该糖基化。在这些实施方案的某些实施方案中，相较于对照、非变异Fc区，变异Fc区赋予减弱的效应子功能。在另外的实施方案中，具有增加的空间体积的侧链是选自由以下组成的组的氨基酸残基的侧链：Phe、Trp、His、Glu、Gln、Arg、Lys、Met和Tyr。在另外的实施方案中，所述具有增加的静电电荷的侧链化学是选自由以下组成的组的氨基酸残基的侧链：Asp、Glu、Lys、Arg和His。
[0209] 因此，在一个实施方案中，可通过用带电荷的侧链化学诸如D、E、K或R取代T299来调节糖基化和Fc结合。所得抗体将具有减少的糖基化以及由于不利的静电相互作用而具有减小的对Fc受体的Fc结合亲和力受体。
[0210] 在另一个实施方案中，相较于其无糖基化抗体对应物(参见，例如WO 05/18572)，既无糖基化又能形成半胱氨酸加合物的T299C变异抗体可表现出较弱的效应子功能(例如，FcγRI结合)。因此，接近糖基化基序的第一氨基酸的改变可在第二氨基酸残基处抑制抗体的糖基化；当所述第一个氨基酸是半胱氨酸残基时，所述抗体可表现出甚至进一步减弱的效应子功能。另外，相较于另外亚型中无糖基化的作用，IgG4亚型的抗体的糖基化的抑制可对FcγRI结合具有更深远的影响。
[0211] 在另外的实施方案中，本发明涉及具有改变的糖基化的抗-αvβ5抗体，其表现出与一种或多种FcR受体的减弱的结合，并且任选地还表现出与一种或多种Fc受体和/或补体的增加的或正常的结合-例如，具有改变的糖基化的抗体，其至少维持与天然的对照抗-αvβ5抗体相同或相似的对一种或多种Fc受体和/或补体的结合亲和力)。例如，主要具有Man5GlcNAc2N-聚糖作为聚糖结构的抗-αvβ5抗体(例如，其中Man5GlcNAc2N-聚糖结构以比Ig组合物的次主要聚糖结构多至少约5摩尔％的水平存在)相较于其中Man5GlcNAc2N-聚糖结构不占优势的抗-αvβ5抗体群，可表现出改变的效应子功能。主要具有该聚糖结构的抗体表现出与FcγRIIa和FcγRIIb的减少的结合，与FcγRIIIa和FcγRIIIb的增加的结合，以及与C1复合物的C1q亚基的增加的结合(参见US 2006-0257399)。当其是主要的聚糖结构时，该聚糖结构赋予增强的ADCC、增强的CDC、增加的血清半衰期、增加的B细胞的抗体产生和减弱的巨噬细胞的吞噬作用。
[0212] 通常，糖蛋白上的糖基化结构将根据表达宿主和培养条件而变化(Raju,TS.BioProcess International 2003年4月.44-53)。此类差异可导致效应子功能和药代动力学的变化(Israel等Immunology,1996；89(4):573-578；Newkirk等P.Clin.Exp.,1996；
106(2):259-64)。例如，半乳糖基化可随细胞培养条件而变化，这可使一些免疫球蛋白组合物根据其特异性半乳糖模式而具有免疫原性(Patel等人，1992.Biochem J.285:839-845)。
由非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的寡糖结构倾向于与人糖蛋白的寡糖结构更密切相关。
另外，可工程化或选择蛋白质表达宿主系统以表达主要的Ig糖形，或者可天然产生具有主要的聚糖结构的糖蛋白。产生具有主要糖形的糖蛋白的工程化蛋白表达宿主系统的实例包括基因敲除/突变(Shields等，2002,JBC,277:26733-26740)；(Umana等，1999,Nature Biotech.,17:176-180)中的遗传工程或两者的组合。或者，某些细胞天然表达主要的糖形-例如鸡、人和牛(Raju等，2000,Glycobiology,10:477-486)。因此，可由本领域技术人员通过选择许多表达宿主系统中的至少一种来获得具有改变的糖基化(例如，主要是一种特定的聚糖结构)的抗-αvβ5抗体或抗体组合物的表达。可用于产生本发明的抗-αvβ5抗体的蛋白质表达宿主系统包括动物、植物、昆虫、细菌细胞等。例如，US 2007-0065909、2007-
0020725和2005-0170464描述了在细菌细胞中产生无糖基化免疫球蛋白分子。作为另一个实例，Wright和Morrison在缺乏糖基化的CHO细胞系中产生抗体(1994 J Exp Med 180:
1087-1096)，并且显示在该细胞系中产生的抗体不能进行补体介导的细胞溶解。本领域中发现的用于生产糖蛋白的表达宿主系统的其它实例包括：CHO细胞：Raju WO 99/22764和Presta WO 03/35835；杂交瘤细胞：Trebak等，1999,J.Immunol.Methods,230:59-70；昆虫细胞：Hsu等，1997,JBC,272:9062-970，和植物细胞：Gerngross等，WO 04/74499。如果给定的细胞或提取物已导致给定的基序的糖基化，则用于确定基序是否已被糖基化的本领域公认的技术是可获得的，例如使用凝胶电泳和/或质谱法。
106(2):259-64)。例如，半乳糖基化可随细胞培养条件而变化，这可使一些免疫球蛋白组合物根据其特异性半乳糖模式而具有免疫原性(Patel等人，1992.Biochem J.285:839-845)。
由非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的寡糖结构倾向于与人糖蛋白的寡糖结构更密切相关。
另外，可工程化或选择蛋白质表达宿主系统以表达主要的Ig糖形，或者可天然产生具有主要的聚糖结构的糖蛋白。产生具有主要糖形的糖蛋白的工程化蛋白表达宿主系统的实例包括基因敲除/突变(Shields等，2002,JBC,277:26733-26740)；(Umana等，1999,Nature Biotech.,17:176-180)中的遗传工程或两者的组合。或者，某些细胞天然表达主要的糖形-例如鸡、人和牛(Raju等，2000,Glycobiology,10:477-486)。因此，可由本领域技术人员通过选择许多表达宿主系统中的至少一种来获得具有改变的糖基化(例如，主要是一种特定的聚糖结构)的抗-αvβ5抗体或抗体组合物的表达。可用于产生本发明的抗-αvβ5抗体的蛋白质表达宿主系统包括动物、植物、昆虫、细菌细胞等。例如，US 2007-0065909、2007-
0020725和2005-0170464描述了在细菌细胞中产生无糖基化免疫球蛋白分子。作为另一个实例，Wright和Morrison在缺乏糖基化的CHO细胞系中产生抗体(1994 J Exp Med 180:
1087-1096)，并且显示在该细胞系中产生的抗体不能进行补体介导的细胞溶解。本领域中发现的用于生产糖蛋白的表达宿主系统的其它实例包括：CHO细胞：Raju WO 99/22764和Presta WO 03/35835；杂交瘤细胞：Trebak等，1999,J.Immunol.Methods,230:59-70；昆虫细胞：Hsu等，1997,JBC,272:9062-970，和植物细胞：Gerngross等，WO 04/74499。如果给定的细胞或提取物已导致给定的基序的糖基化，则用于确定基序是否已被糖基化的本领域公认的技术是可获得的，例如使用凝胶电泳和/或质谱法。
[0213] 用于改变抗体的糖基化位点的其它方法描述于例如US 6,350,861和US 5,714,350、WO 05/18572和WO 05/03175中；这些方法可用于产生具有改变的、减少的或无糖基化的本发明的抗-αvβ5抗体。
[0214] 具有减弱的效应子功能的无糖基抗-αvβ5抗体可以是包含修饰或可被缀合以包含功能部分的抗体。此类部分包括封闭部分(例如，PEG部分、半胱氨酸加合物等)、可检测部分(例如，荧光部分、放射性同位素部分、不透射线部分等，包括诊断部分)、治疗部分(例如，细胞毒性剂)抗炎剂、免疫调节剂、抗感染剂、抗癌剂、抗神经变性剂、放射性核素等)和/或结合部分或诱饵(例如，允许抗体被预靶向肿瘤，然后结合由互补结合部分或捕获物和可检测部分或治疗部分组成的第二分子，如上所述)。
[0215] 适应症
[0216] 本文所述的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段阻断αvβ5并抑制血管通透性(响应炎症和损伤)。另外，这些抗体或抗原结合片段可以抑制内皮迁移。此外，这些抗体或抗原结合片段可以抑制TGF-β活化和纤维化。这些抗体或其抗原结合片段可用于治疗、预防或减轻多种疾病或病症的症状或严重程度。此类疾病或病症包括急性肾损伤、急性肺损伤、中风(脑出血)、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、肺水肿、肺纤维化(例如，特发性肺纤维化(IPF)、常见间质性肺炎(UIP)、心肌梗塞、癌症(例如，胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌和子宫内膜癌)、血脂异常、肥胖症和眼新生血管化疾病。
[0217] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗或减轻急性肺损伤的症状或严重度。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗或减轻肺水肿(例如，与肺损伤相关的水肿)的症状或严重度。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗或减轻败血症的症状或严重度。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗肺纤维化(例如，IPF、UIP)。在其它实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于保护免受上皮和/或内皮细胞损伤。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于减少或防止肺泡上皮损伤。在其它实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗上皮癌(例如，头颈癌(包括口腔癌、喉癌、咽癌、食管癌)、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤癌(基底细胞癌)和卵巢癌)。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用作抗血管生成剂。在另外的实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于阻断αvβ5受体与含RGD的配体(例如，病毒或其它病原体表面上的蛋白质)的相互作用，从而减少或预防感染。
[0218] 可在本领域公知的各种动物模型中评估本发明的抗体的功效。用于急性肺损伤的动物模型包括：肺缺血/再灌注模型(Sakuma T.等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.,276:L137–L145,(1999)；WO 2005/094391)；非肺缺血/再灌注模型(Koike K.等，J Surg Res.,52:656–662(1992))；油酸模型(Schuster,Am J Respir Crit Care Med,
149:245–260(1994))；LPS模型(Wiener-Kronish等，J Clin Invest,88:864–875(1991)；酸性抽吸模型(Modelska K.等，Am J Respir Crit Care Med,160:1450–1456,(1999))；高氧症模型(Frank L.等，J Appl Physiol.,45:699–704(1978))；博来霉素模型(Moore等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.,294:L152–L160(2008))；盐水灌洗模型(Lachmann B.等，Acta Anaesthesiol Scand.,24:231–236,(1980))；盲肠结扎和穿刺模型(Villar J.等，Crit Care Med.,22:914–921(1994))和肺内细菌模型(Fox-Dewhurst R.等，Am J Respir Crit Care Med.,155:2030–2040(1997)。用于肺纤维化的小鼠模型包括博来霉素(Pittet等，J.Clin.Invest.,107(12):1537-1544(2001)；和Munger等，Cell,96:319-328(1999))和辐射-诱导肺纤维化(Franko等，Rad.Res.,140:347-355(1994))。用于败血症的动物模型是本领域已知的，并且包括毒血症模型(例如，LPS注射)、细菌感染模型、宿主-屏障破坏模型(Doi等，J.Clin.Invest.,119(10):2868-2878(2009)；WO 2011/011775)。最后，可评估本文所述的αvβ5抗体在标准体内肿瘤生长和转移模型中抑制肿瘤生长、进展和转移的能力。参见，例如Rockwell等，J.Natl.Cancer Inst.,49:735(1972)；Guy等，Mol.Cell Biol.,12:954(1992)；Wyckoff等，Cancer Res.,60:2504(2000)；和Oft等，Curr.Biol.,8:
1243(1998)。
149:245–260(1994))；LPS模型(Wiener-Kronish等，J Clin Invest,88:864–875(1991)；酸性抽吸模型(Modelska K.等，Am J Respir Crit Care Med,160:1450–1456,(1999))；高氧症模型(Frank L.等，J Appl Physiol.,45:699–704(1978))；博来霉素模型(Moore等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.,294:L152–L160(2008))；盐水灌洗模型(Lachmann B.等，Acta Anaesthesiol Scand.,24:231–236,(1980))；盲肠结扎和穿刺模型(Villar J.等，Crit Care Med.,22:914–921(1994))和肺内细菌模型(Fox-Dewhurst R.等，Am J Respir Crit Care Med.,155:2030–2040(1997)。用于肺纤维化的小鼠模型包括博来霉素(Pittet等，J.Clin.Invest.,107(12):1537-1544(2001)；和Munger等，Cell,96:319-328(1999))和辐射-诱导肺纤维化(Franko等，Rad.Res.,140:347-355(1994))。用于败血症的动物模型是本领域已知的，并且包括毒血症模型(例如，LPS注射)、细菌感染模型、宿主-屏障破坏模型(Doi等，J.Clin.Invest.,119(10):2868-2878(2009)；WO 2011/011775)。最后，可评估本文所述的αvβ5抗体在标准体内肿瘤生长和转移模型中抑制肿瘤生长、进展和转移的能力。参见，例如Rockwell等，J.Natl.Cancer Inst.,49:735(1972)；Guy等，Mol.Cell Biol.,12:954(1992)；Wyckoff等，Cancer Res.,60:2504(2000)；和Oft等，Curr.Biol.,8:
1243(1998)。
[0219] 治疗的功效可通过许多可用的诊断工具测量，所述工具包括身体检查、血液测试、肺功能测试、瘢痕形成或纤维化损伤的观察和评分、细胞外基质诸如胶原、平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白的沉积、超声、磁共振成像(MRI)和CT扫描。
[0220] 药物组合物
[0221] 可将本文所述的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段配制为用于向受试者施用例如以治疗本文所述的病症的药物组合物。通常，药物组合物包括药学上可接受的载体。如本文中所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述组合物可包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见，例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。
[0222] 药物制剂是良好建立的技术，并例如在以下文献中进一步描述：Gennaro(编辑)，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(编辑),Handbook of Pharmaceutical Excipients American
Pharmaceutical Association，第3版(2000)(ISBN:091733096X)。
Pharmaceutical Association，第3版(2000)(ISBN:091733096X)。
[0223] 药物组合物可呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式可取决于预期的施用模式和治疗应用。通常用于本文所述试剂的组合物呈可注射或可输注溶液的形式。
[0224] 在一个实施方案中，用赋形剂材料诸如柠檬酸钠、七水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tween-80和稳定剂配制本文所述的抗-αvβ5抗体。其可以例如在适当浓度的缓冲溶液中提供，并且可在2-8℃下储存。在一些其它实施方案中，所述组合物的pH为约5.5至7.5(例如，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5)。
[0225] 药物组合物还可包括当配制时减少αvβ5抗体或其抗原结合片段的聚集的试剂。聚集减少剂的实例包括选自由以下组成的组的一种或多种氨基酸：甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸。可将这些氨基酸以约0.5mM至约145mM(例如，0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM)的浓度添加至制剂中。所述药物组合物还可包含糖(例如，蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇)和/或张力调节剂(例如，氯化钠、甘露醇或山梨醇)和/或表面活性剂(例如，聚山梨酯-20或聚山梨酯-80)。
[0226] 此类组合物可通过肠胃外模式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)施用。在一个实施方案中，皮下施用抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物。在一个实施方案中，静脉内施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物。如本文中所用，短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指通常通过注射而不是肠内和局部施用的施用模式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、鼻内、口腔吸入、硬膜外和胸骨内注射和输注。
[0227] 可将所述组合物配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或适于在高浓度下稳定储存的其它有序结构。通过以下方式制备无菌可注射溶液：将本文所述试剂以要求的量连同上文列举的成分之一或其组合一起并入适宜的溶剂中，根据需要，随后过滤消毒。通常，通过将本文所述的试剂并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上面列举的那些的所需的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生本文所述试剂的粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当的流动性。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)来实现。
[0228] 在某些实施方案中，所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段可用保护化合物免于快速释放的载体(诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统)来制备。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备此类制剂的方法是获得专利权的或通常已知的。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
[0229] 在一个实施方案中，所述药物制剂包含用药学上可接受的载体配制的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的浓度为约0.5mg/mL至500mg/mL(例如，0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、
100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL、350mg/mL、
400mg/mL、450mg/mL、500mg/mL)。在一些实施方案中，将所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段配制在无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水中。所述药物制剂的pH可为5.5至7.5(例如，5.5、
5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.3、7.4、7.5)。
100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL、350mg/mL、
400mg/mL、450mg/mL、500mg/mL)。在一些实施方案中，将所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段配制在无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水中。所述药物制剂的pH可为5.5至7.5(例如，5.5、
5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.3、7.4、7.5)。
[0230] 施用
[0231] 可通过多种方法向受试者，例如有此需要的受试者，例如人受试者施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。对于许多应用，施用途径是以下途径之一：静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜内(IP)或肌内注射。还可能使用关节内递送。也可使用肠胃外施用的其它模式。此类模式的实例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、鼻内、口腔吸入、硬膜外和胸骨内注射。在一些情况下，施用可以是口服。
[0232] 抗体或其抗原结合片段的施用途径和/或模式也可以针对个体情况进行调整，例如通过监测受试者，例如使用色谱成像，例如以使肿瘤可视化。
[0233] 可以以固定剂量或以mg/kg剂量施用所述抗体或其抗原结合片段。还可选择剂量以减少或避免产生针对抗-αvβ5抗体的抗体。调整剂量方案以提供所需的响应，例如治疗响应或联合治疗作用。通常，可使用成剂量的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段(和任选的第二药剂)，以向受试者提供具有生物可用量的药剂。例如，可施用在0.1-100mg/kg、0.5-100mg/kg、1mg/kg-100mg/kg、0.5-20mg/kg、0.1-10mg/kg或1-10mg/kg的范围内的剂量。也可以使用其它剂量。在某些实施方案中，以1mg/kg至30mg/kg的剂量向需要用抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段治疗的受试者施用抗体。在一些实施方案中，以1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg或50mg/kg的剂量向需要用抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段治疗的受试者施用所述抗体。在某些实施方案中，以0.1mg/kg至30mg/kg的剂量向需要用缀合有毒素的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段治疗的受试者施用缀合有毒素的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，以0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、
0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg或50mg/kg的剂量向需要用缀合有毒素的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段治疗的受试者施用缀合有毒素的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，以1mg/kg至3mg/kg的剂量皮下施用所述抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，以4mg/kg至30mg/kg的剂量静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，以0.1mg/kg至30mg/kg的剂量静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段的毒素缀合形式。
0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg或50mg/kg的剂量向需要用缀合有毒素的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段治疗的受试者施用缀合有毒素的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，以1mg/kg至3mg/kg的剂量皮下施用所述抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，以4mg/kg至30mg/kg的剂量静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，以0.1mg/kg至30mg/kg的剂量静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段的毒素缀合形式。
[0234] 组合物可包含约1mg/mL至100mg/ml或约10mg/mL至100mg/ml或约50至250mg/mL或约100至150mg/ml或约100至250mg/ml的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，组合物中的抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段主要呈单体形式，例如至少约90％、92％、94％、96％、98％、98.5％或99％呈单体形式。某些抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物可包含少于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％或0.1％的聚集体，如例如在A280nm处通过UV检测的。某些抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物包含少于约5％、4％、3％、2％、1％、
0.5％、0.3％、0.2％或0.1％的片段，如例如在A280nm处通过UV检测的。
0.5％、0.3％、0.2％或0.1％的片段，如例如在A280nm处通过UV检测的。
[0235] 本文使用的剂量单位形式或“固定剂量”是指适合作为待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生所需的治疗效果的预定量的抗-αvβ5抗体，其与所需的药物载体结合，和任选与其它试剂结合。可给予单个剂量或多个剂量。可选地或另外地，可通过连续输注施用所述抗体。
[0236] 可例如在以足以包括至少2个剂量、3个剂量、5个剂量、10个剂量或更多剂量的一段时间(疗程)内周期性间隔施用抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段的剂量，例如每周1次或2次，或每周约1至4次，或优选每周1次，每两周1次(每两周一次)，每三周1次，每月1次，例如持续约1至12周，优选2至8周，更优选约3至7周，甚至更优选约4、5或6周。可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间的因素包括例如疾病或病症的严重度、制剂、递送途径、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的化合物治疗受试者可包括单次治疗，或优选可包括一系列治疗。
[0237] 如果受试者处于发展本文所述病症的风险中，则可在病症完全发作之前施用抗体，例如作为预防措施。此类预防性治疗的持续时间可以是单个剂量的抗体，或者治疗可以继续(例如，多个剂量)。例如，处于病症风险中的或具有该病症倾向的受试者可用抗体治疗数天、数周、数月或甚至数年，以防止疾病发生或爆发。
[0238] 药物组合物可包括“治疗有效量”的本文所述的试剂。此类有效量可以基于施用的试剂的作用或试剂的组合作用(当使用不止一种试剂时)来确定。试剂的治疗有效量还可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在个体中引起所需响应(例如至少一个病症参数的改善或病症的至少一种症状的改善)的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益作用超过组合物的任何毒性或有害作用的量。
[0239] 在某些实施方案中，以约1mg/mL至约500mg/mL(例如，1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、
95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL、325mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL)的浓度皮下施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，以50mg/mL的浓度皮下施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，以约1mg/mL至约500mg/mL的浓度静脉内施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，以50mg/mL的浓度静脉内施用所述抗-αvβ
5抗体或其抗原结合片段。
95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL、325mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL)的浓度皮下施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，以50mg/mL的浓度皮下施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，以约1mg/mL至约500mg/mL的浓度静脉内施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，以50mg/mL的浓度静脉内施用所述抗-αvβ
5抗体或其抗原结合片段。
[0240] 可向有此需要的患者(例如，患有肺纤维化的患者)组合施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合。所述第二治疗剂取决于所治疗的疾病或病症的类型。例如，所述第二治疗剂可以是以下物质的一种或多种的拮抗剂(例如，抗体、多肽拮抗剂和/或小分子拮抗剂)：其它整联蛋白受体(例如，α1β1、α4β1、αvβ8、αvβ6、αvβ1等)；细胞因子(例如，TGF-β、IL-4、IL-13、IL-17)；趋化因子(例如，CCL2、CXCL8、CXCL12)；生长因子(例如，结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1))和/或小的分泌信号蛋白(例如，Wnt蛋白，内皮素-1)。可以同时或依次施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂。在某些实施方案中，可以各自以亚治疗剂量或治疗剂量施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂。
[0241] 在某些实施方案中，当患者患有急性肺损伤、肺水肿或ARDS或处于发展所述疾病的风险中时，可将所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段与利尿剂、支气管扩张剂、麻醉剂、氧气和选择性止血带敷用组合施用。另外，可将本文公开的抗αvβ5整联蛋白抗体与靶向涉及急性肺损伤、ARDS或PE的代谢途径的第二治疗剂结合施用。例如，可将抗-αvβ5整联蛋白抗体或其抗原结合片段与以下试剂结合施用：TGFβ通路抑制剂、活化的蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、β-2激动剂、表面活性剂、特异性结合αvβ5整联蛋白或β5的其它抗体、αvβ5整联蛋白的第二拮抗剂、特异性结合αvβ6整联蛋白的抗体、αvβ6整联蛋白的拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、抗凝血酶剂、rho激酶抑制剂和抑制αvβ5整联蛋白表达的核酸(包括例如反义寡核苷酸、核酶、miRNA和siRNA)。合适的TGFβ通路抑制剂包括，例如，如在例如Ling等，J.Amer.Soc.Nephrol.,14:377-388(2003),McCormick等，J.Immunol.,163:5693-5699(1999)和Cordeiro,Curr.Opin.Mol.Ther.,5(2):199-203(2003)中所述的TGF-β抗体(包括特异性阻断TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3或其任意组合的那些抗体)；TGF-β受体II型抑制剂或TGF-β受体I型激酶抑制剂，如在例如DaC osta Bayfield,Mol.Pharmacol.,65(3):744-52(2004),Laping,Curr.Opin.Pharmacol.,3(2):204-8(2003),Laping,Mol.Pharmacol.,62(1):58-64(2002)中描述的；可溶性TGF-β受体II型，如在例如Pittet,J.Clin.Invest.,
107:1537-1544(2001)；Wang等，Exp Lung Res.,28(6):405-17(2002)和Wang,Thorax,54(9):805-12(1999)中描述的；可溶性潜伏相关肽，如在例如Zhang,J Invest.Dermatol.,
121(4):713-9(2003)中描述的；血小板反应蛋白I抑制剂，如在例如Crawford等，Cell,93:
1159-1170(1998),Riberiro等，J.Biol.Chem.,274:13586-13593(1999)和Schultz-Cherry等，J.Biol.Chem.,269:26775-26782(1994)中描述的。合适的β-2激动剂包括例如沙丁胺醇、比托特罗、福莫特罗、异丙肾上腺素、左旋沙丁胺醇、间羟异丙肾上腺素、吡布特罗、沙美特罗和特布他林。合适的表面活性剂包括例如Taeus ch等，Acta Pharmacol Sin 23增刊:
11-15(2002)中所述的棕榈胆磷(exosurf)、因法舒夫(infasurf)、KL-4、嘌吗坦、survanta、venticute和表面活性剂TA。合适的抗凝血酶剂包括例如水蛭素、二价水蛭素(Hi rulog)(Biogen)、阿加曲班、依非加群和美国专利第6,518,244中描述的化合物。合适的凝血酶受体拮抗剂描述于例如美国专利第6,544,982号、第6,515,023号、第6,403,612号、第6,399,
581号和第5,446,131号。合适的rho激酶抑制剂包括例如Y-27632，如在例如Tasaka等，Am J Respir Cell Mol Biol.,32(6):504-10(2005)中描述的；法舒地尔，如在例如Nishikimi et al,J Hypertens.,22(9):1787-96(2004)中描述的；1-(5-异喹啉磺酰基)-高哌嗪(HA-
1077)、(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉)磺酰基]高哌嗪(H-1 152P)，如在Sasaki等，Phar macol Ther.,93(2-3):225-32(2002)中描述的，以及另外的rho激酶抑制剂，如在例如美国专利第6,451,825号和第6,218,410号以及美国专利公开第20050014783号和第
20030134775号中描述的。另外，可将αvβ5整联蛋白的拮抗剂与如下试剂组合施用：表达ATP酶的腺病毒(如在美国专利申请第20020192186号中描述的)、β2肾上腺素能受体(如在美国专利申请第20020004042号中描述的)、VEGFβ拮抗剂(如在美国专利第6,284,751号中描述的)、脂质过氧化抑制剂(如在美国专利第5,231,114号中描述的)以及αvβ6、αvβ5和αvβ3整联蛋白的小分子抑制剂(如在例如美国专利申请第2000/40019206号、第2004/0019037号、第2004/0019035号、第2004/0018192号、第2004/0010023号、第2003/0181440号、第2003/
0171271号、第2003/0139398号、第2002/0037889号、第2002/0077321号、第2002/0072500号、美国专利第6,683,051号和Goodman等，J.Med Chem.45(5):1045-51(2002)中描述的)。
107:1537-1544(2001)；Wang等，Exp Lung Res.,28(6):405-17(2002)和Wang,Thorax,54(9):805-12(1999)中描述的；可溶性潜伏相关肽，如在例如Zhang,J Invest.Dermatol.,
121(4):713-9(2003)中描述的；血小板反应蛋白I抑制剂，如在例如Crawford等，Cell,93:
1159-1170(1998),Riberiro等，J.Biol.Chem.,274:13586-13593(1999)和Schultz-Cherry等，J.Biol.Chem.,269:26775-26782(1994)中描述的。合适的β-2激动剂包括例如沙丁胺醇、比托特罗、福莫特罗、异丙肾上腺素、左旋沙丁胺醇、间羟异丙肾上腺素、吡布特罗、沙美特罗和特布他林。合适的表面活性剂包括例如Taeus ch等，Acta Pharmacol Sin 23增刊:
11-15(2002)中所述的棕榈胆磷(exosurf)、因法舒夫(infasurf)、KL-4、嘌吗坦、survanta、venticute和表面活性剂TA。合适的抗凝血酶剂包括例如水蛭素、二价水蛭素(Hi rulog)(Biogen)、阿加曲班、依非加群和美国专利第6,518,244中描述的化合物。合适的凝血酶受体拮抗剂描述于例如美国专利第6,544,982号、第6,515,023号、第6,403,612号、第6,399,
581号和第5,446,131号。合适的rho激酶抑制剂包括例如Y-27632，如在例如Tasaka等，Am J Respir Cell Mol Biol.,32(6):504-10(2005)中描述的；法舒地尔，如在例如Nishikimi et al,J Hypertens.,22(9):1787-96(2004)中描述的；1-(5-异喹啉磺酰基)-高哌嗪(HA-
1077)、(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉)磺酰基]高哌嗪(H-1 152P)，如在Sasaki等，Phar macol Ther.,93(2-3):225-32(2002)中描述的，以及另外的rho激酶抑制剂，如在例如美国专利第6,451,825号和第6,218,410号以及美国专利公开第20050014783号和第
20030134775号中描述的。另外，可将αvβ5整联蛋白的拮抗剂与如下试剂组合施用：表达ATP酶的腺病毒(如在美国专利申请第20020192186号中描述的)、β2肾上腺素能受体(如在美国专利申请第20020004042号中描述的)、VEGFβ拮抗剂(如在美国专利第6,284,751号中描述的)、脂质过氧化抑制剂(如在美国专利第5,231,114号中描述的)以及αvβ6、αvβ5和αvβ3整联蛋白的小分子抑制剂(如在例如美国专利申请第2000/40019206号、第2004/0019037号、第2004/0019035号、第2004/0018192号、第2004/0010023号、第2003/0181440号、第2003/
0171271号、第2003/0139398号、第2002/0037889号、第2002/0077321号、第2002/0072500号、美国专利第6,683,051号和Goodman等，J.Med Chem.45(5):1045-51(2002)中描述的)。
[0242] 在某些实施方案中，当患者患有败血症或处于发展败血症的风险时，可将所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段与用于败血症的任何标准治疗组合施用，所述标准治疗包括例如抗生素、他汀类、活化的蛋白C、利尿剂、血管收缩剂或变力性药物。抗生素疗法是常用的，并且可由医学专业人员最佳地选择来特异性靶向特定感染。示例性抗生素包括例如青霉素、红霉素、环脂肽(达托霉素)、甘氨酰环素(替加环素)和噁唑烷酮(利奈唑胺)。他汀类(HMG-CoA还原酶抑制剂)包括例如辛伐他汀或阿托伐他汀。另外，可将抗-αvβ5整联蛋白抗体或其抗原结合片段与靶向参与败血症的代谢途径的试剂结合施用。例如，可将αvβ5整联蛋白的拮抗剂与以下试剂结合施用：TGFβ通路抑制剂、活化的蛋白C、GM-CSF、特异性结合αvβ5整联蛋白或β5的抗体、αvβ5整联蛋白的第二拮抗剂、特异性结合αvβ6整联蛋白的抗体、αvβ6整联蛋白的拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、抗凝血酶剂、rho激酶抑制剂和抑制αvβ5整联蛋白表达的核酸(包括例如反义寡核苷酸、核酶、siRNA、微RNA)。
[0243] 用于疗法的装置和试剂盒
[0244] 可将包含所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段的药物组合物与医疗装置一起施用。所述装置可被设计成具有诸如便携性、室温储存和易于使用的特征，以使得其可以在紧急情况下例如由未经训练的受试者或由现场应急人员从医疗设施和其它医疗设备取出使用。所述装置可包括例如用于储存包含抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段的药物制剂的一个或多个外壳，并且可被配置来递送一个或多个单位剂量的抗体。该装置可被进一步配置来将第二试剂(例如化学治疗剂)作为单一药物组合物(其还包含所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段)或作为两种单独的药物组合物施用。
[0245] 可用注射器施用所述药物组合物。还可用无针皮下注射装置诸如US 5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置施用所述药物组合物。公知的植入物和模块的实例包括：US 4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微量输注泵；US 4,486,194，其公开了用于将药物施用通过皮肤的治疗装置；US 4,447,233，其公开了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；US 4,
447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流动可植入输注设备；US 4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和US 4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。许多其它装置、植入物、递送系统和模块也是已知的。
447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流动可植入输注设备；US 4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和US 4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。许多其它装置、植入物、递送系统和模块也是已知的。
[0246] 可在试剂盒中提供抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述试剂盒包括(a)容器，其含有包含抗-αvβ5抗体的组合物，和任选的(b)信息材料。所述信息材料可以是与本文所述的方法和/或所述试剂用于治疗益处的用途相关的描述性、指导性、销售性或其它材料。
[0247] 在一个实施方案中，所述试剂盒还包括用于治疗本文所述病症的第二治疗剂(例如，一种或多种以下试剂的拮抗剂(例如，抗体，多肽拮抗剂(例如，抗体、多肽拮抗剂和/或小分子拮抗剂)：其它整联蛋白受体(例如，α1β1、α4β1、αvβ8、αvβ5、αvβ1等)；细胞因子(例如，TGF-β、IL-4、IL-13、IL-17)；趋化因子(例如，CCL2、CXCL8、CXCL12)；生长因子(例如，结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1))、小的分泌信号蛋白(例如，Wnt蛋白、内皮素-1)、类固醇、细胞毒性化合物、放射性同位素、前药激活酶、秋水仙素、氧气、抗氧化剂(例如，N-乙酰半胱氨酸)、金属螯合剂(例如，四硫代钼酸盐)、IFN-β、IFN-γ、α-抗胰蛋白酶)。例如，所述试剂盒包括装有包含抗-αvβ5抗体的组合物的第一容器和装有第二治疗剂的第二容器。
[0248] 所述试剂盒的信息材料不限于其形式。在一个实施方案中，所述信息材料可包括关于化合物的生产、化合物的分子量、浓度、到期日期、批次或生产地点信息等的信息。在一个实施方案中，所述信息材料涉及例如以合适的剂量、剂型或施用模式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用模式)施用所述抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段，以治疗已经患有本文所述的免疫病症或处于发生所述病症的风险中的受试者的方法。可以以多种格式提供信息，包括打印文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或例如在因特网上为实体材料提供链接或地址的信息。
[0249] 除了抗体以外，试剂盒中的组合物还可包括其它成分，诸如溶剂或缓冲液、稳定剂或防腐剂。所述抗体可以以优选基本上纯的和/或无菌的任何形式(例如，液体、干燥或冻干形式)提供。当所述试剂以液体溶液提供时，所述液体溶液优选为水溶液。在某些实施方案中，液体溶液中的抗体或其抗原结合片段的浓度为约25mg/mL至约250mg/mL(例如，40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、75mg/mL、85mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、200mg/mL)。当抗体或抗原结合片段作为冻干产品提供时，所述抗体或抗原结合片段为约75mg/小瓶至约200mg/小瓶(例如，100mg/小瓶、125mg/小瓶、150mg/小瓶)。冻干粉剂通常通过加入合适的溶剂来进行重构。可以任选地在试剂盒中提供溶剂，例如无菌水或缓冲液(例如，PBS)。在某些实施方案中，所述冻干产物为约100mg/小瓶，并以75mg/mL的浓度重构成液体溶液。
[0250] 所述试剂盒可包括用于所述组合物的一个或多个容器或含有所述试剂的组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于组合物和信息材料的单独的容器、分隔物或隔室。
例如，可在瓶、小瓶或注射器中包含所述组合物，并在塑料套或小包中包含信息材料。在其它实施方案中，可将试剂盒的单独元件包含在单个未分隔的容器中。例如，可将所述组合物包含在已附着有标签形式的信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多个(例如，一包)单独的容器，每个容器含有一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)的试剂。所述容器可包括组合单位剂量，例如，包括(例如，以所需比例)所述抗-αvβ
5抗体或其抗原结合片段和所述第二试剂的单位。例如，所述试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包、泡罩包装或医疗装置，例如，每个装置包含单个组合单位剂量。试剂盒的容器可以是气密性的、防水的(例如，对于水分或蒸发的变化是不可渗透的)和/或不透光的。
例如，可在瓶、小瓶或注射器中包含所述组合物，并在塑料套或小包中包含信息材料。在其它实施方案中，可将试剂盒的单独元件包含在单个未分隔的容器中。例如，可将所述组合物包含在已附着有标签形式的信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多个(例如，一包)单独的容器，每个容器含有一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)的试剂。所述容器可包括组合单位剂量，例如，包括(例如，以所需比例)所述抗-αvβ
5抗体或其抗原结合片段和所述第二试剂的单位。例如，所述试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包、泡罩包装或医疗装置，例如，每个装置包含单个组合单位剂量。试剂盒的容器可以是气密性的、防水的(例如，对于水分或蒸发的变化是不可渗透的)和/或不透光的。
[0251] 所述试剂盒任选地包括适于施用组合物的装置，例如注射器或其它合适的递送装置。所述装置可以预先装载有一种或两种试剂，或者可以是空的，但是适合于装载。
[0252] 诊断用途
[0253] 抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段可以用于体外或体内检测αvβ5的存在的诊断方法(例如，受试者的体内成像)。例如，可向受试者施用抗-αvβ5抗体以检测受试者内的αvβ5。例如，可以例如用MRI可检测标记物或放射性标记物标记抗体。可使用用于检测可检测标记物的工具来评价受试者。例如，可以扫描受试者以评价抗体在受试者内的定位。例如，可以例如通过NMR或其它断层摄影装置对受试者进行成像。
[0254] 用于诊断成像的标记物的实例包括放射性标记物诸如131I、111In、123I、99mTc、32P、33P、125I、3H、14C和188Rh、荧光标记物诸如荧光素和罗丹明、核磁共振活性标记物、可通过正电子发射断层摄影(“PET”)扫描仪检测的正电子发射同位素、化学发光剂诸如荧光素和酶标记物诸如过氧化物酶或磷酸酶。还可以使用短程辐射发射器，诸如可通过短距离检测器探测器检测的同位素。蛋白质配体可使用已知技术利此类试剂进行标记。例如，关于抗体的放射性标记的技术，参见Wensel和Meares(1983)Radioimmunoimaging and
Radioimmunotherapy,Elsevier,New York和Colcher等(1986)Meth.Enzymol.121:802-
816。
Radioimmunotherapy,Elsevier,New York和Colcher等(1986)Meth.Enzymol.121:802-
816。
[0255] 可使用已知技术，诸如使用例如γ照相机或发射断层摄影术的放射性核素扫描对受试者进行体内“成像”。参见，例如A.R.Bradwell等，“Developments in Antibody Imaging”,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin等，(编辑)，第65-85页(Academic Press 1985)。或者，可使用正电子发射轴向断层扫描仪诸如位于Brookhaven National Laboratory的指定的Pet VI，其中放射性标记物发射正电子(例如，11C、18F、15O和13N)。
[0256] 磁共振成像(MRI)使用NMR来使活体受试者的内部特征可视化，并且对于预后、诊断、治疗和手术是有用的。可在无放射性示踪剂化合物的情况下使用MRI以获得明显的益处。在EP0 502 814A中概述了一些MRI技术。通常，与在不同环境中的水质子的弛豫时间常数T1和T2相关的差异被用于生成图像。然而，这些差异可能不足以提供清晰的高分辨率图像。
[0257] 这些弛豫时间常数的差异可通过造影剂增加。此类造影剂的实例包括许多磁性剂、顺磁性剂(其主要改变T1)和铁磁性或超顺磁性剂(其主要改变T2反应)。螯合剂(例如，3+ 2+ 3+
EDTA、DTPA和NTA螯合剂)可用于附着(和降低毒性)一些顺磁性物质(例如，Fe 、Mn 、Gd )。
其它试剂可呈颗粒形式(例如，直径小于10μm至约10nm)。颗粒可具有铁磁性、反铁磁性或超顺磁性性质。颗粒可包括例如磁铁矿(Fe3O4)、γ-Fe2O3、铁氧体和过渡元素的其它磁性矿物化合物。磁性颗粒可包括具有和不具有非磁性材料的一个或多个磁性晶体。非磁性材料可包括合成或天然聚合物(诸如琼脂糖、葡聚糖、糊精、淀粉等)。
EDTA、DTPA和NTA螯合剂)可用于附着(和降低毒性)一些顺磁性物质(例如，Fe 、Mn 、Gd )。
其它试剂可呈颗粒形式(例如，直径小于10μm至约10nm)。颗粒可具有铁磁性、反铁磁性或超顺磁性性质。颗粒可包括例如磁铁矿(Fe3O4)、γ-Fe2O3、铁氧体和过渡元素的其它磁性矿物化合物。磁性颗粒可包括具有和不具有非磁性材料的一个或多个磁性晶体。非磁性材料可包括合成或天然聚合物(诸如琼脂糖、葡聚糖、糊精、淀粉等)。
[0258] 还可用含有NMR-活性19F原子的指示基团或多个此类原子标记抗-αvβ5抗体或其抗原结合片段，因为(i)基本上所有的天然丰富的氟原子是19F同位素，因此，基本上所有含氟化合物是NMR-活性的；(ii)许多化学活性多氟化化合物诸如三氟乙酸酐可以以相对低的成本商购获得，以及(iii)已发现许多氟化化合物对在人中的使用是医学上可接受的，诸如用于作为血红蛋白替代物携带氧气的全氟化聚醚。在允许这样的孵育时间之后，使用装置诸如由Pykett(1982)Scientific American,246:78-88描述的那些装置之一进行全身MRI以对αvβ5分布进行定位和成像。
[0259] 在另一方面，本公开提供了用于在体外(例如，生物样品，诸如血清、血浆、组织、活检组织)检测αvβ5在样品中的存在的方法。该方法可用于诊断病症，例如急性肺损伤、肺纤维化或癌症(例如，胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌或子宫内膜癌)。所述方法包括：(i)将样品或对照样品与抗-αvβ5抗体接触；和(ii)例如通过检测抗-αvβ5抗体与αvβ5之间的复合物的形成，或通过检测所述抗体或αvβ5的存在来评价样品的αvβ5的存在。例如，可将所述抗体固定在例如支持物上，并检测抗原在支持物上的保留，和/或反之亦然。使用的抗体可以例如用荧光团标记。可包括对照样品。阳性对照可以是已知具有所评估的疾病或病症的样品，阴性对照可以是来自没有所评估的疾病或病症的受试者的样品。相对于对照样品，样品中复合物的形成的统计学显著的变化可以指示样品中存在αvβ5。通常，抗-αvβ5抗体可用于包括荧光偏振、显微镜、ELISA、离心、色谱和细胞分选(例如，荧光激活细胞分选)的应用中。在某些实施方案中，所述抗-αvβ5抗体是人源化ALULA抗体或其抗原结合片段。组织样品可以是例如来自患有癌症例如胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、食管癌、皮肤癌或子宫内膜癌的人患者的皮肤活检组织。
实施例
实施例
[0260] 实施例1：效应子功能对ALULA的体内功效的作用
[0261] 为了评估Fc效应子功能(通过结合至Fc-γ受体和/或补体C1q介导的)在ALULA的体内功效中起作用，使用具有不同鼠Fc结构域的构建体进行大鼠缺血-再灌注模型。生成包含与mIgG2a(最高效应子功能)或mIgG1(N297Q)Agly(最低效应子功能)恒定结构域融合的人源化ALULA可变结构域重链序列(在本文中被称为“设计-参照H1”)的两种嵌合变体。这些重链与包含与鼠κ恒定结构域融合的人源化可变结构域轻链序列(在本文中被称为“设计-参照L1”)的嵌合轻链配对。配对在一起的设计-参照H1和设计参照L1被称为参照人源化αvβ5设计。在大鼠缺血-再灌注模型中，与原始ALULA IgG2b构建体和鼠IgG2b同种型对照平行测试上述两种嵌合mAb。如图1所示，所有三种ALULA抗体相对于同种型对照显著降低血清肌酐水平，并且在三种不同形式的ALULA中没有观察到显著差异。这些数据表明减弱效应子功能不影响αvβ5靶向抗体疗法的功效。
[0262] 实施例2：人源化ALULA设计
[0263] 将成熟鼠ALULA抗体的CDR(重链区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3以及轻链区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)移植至基于人种系humIGHV3-15和humIGKV1-12的人受体框架，以分别产生CDR-移植链VH0和VL0。通过与CDR-移植的链相比在CDR移植物(下文中论述的)的人受体框架中组合几个突变，产生了6个另外的重链区(VH1至6)和4个另外的轻链区(VL1至4)。在人受体框架中产生的大多数突变是对成熟鼠框架的氨基酸的回复突变，以帮助维持
ALULA成熟鼠CDR的结构。
ALULA成熟鼠CDR的结构。
[0264] 设计VH1至VH5和VL1至VL3基于CDR移植物，即，移植至人受体框架上的所有成熟ALULA CDR。然而，设计VH6和VL4含有ALULA的CDR1和CDR3，同时使CDR2维持来自人受体框架。ALULA的第二CDR不从亲本鼠种系成熟为成熟鼠，这表明所述第二CDR区可能不与抗原接触，因此所述第二CDR可能不是必需的，并且用人受体序列替换了该CDR以减少暴露的鼠序列的免疫原性风险。
[0265] 人受体框架中的突变：
[0266] 1.重链
[0267] 1.1VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6中的突变
[0268] 下面论述在上文所列的VH区中产生的三个突变。
[0269] 首先，产生框架突变R71A以为成熟鼠CDR残基Y32和/或P52a腾出空间。其在一侧被溶剂化并且处于该位置的A在人中是常见的(A151/544、R 227/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)，因此该突变应当不具有免疫原性风险。
[0270] 第二突变D73T是CDR-H2的Haidar位置。在一侧被溶剂化后，该氨基酸接触CDR-H1和CDR-H2。该位置处的T在人中是常见的(T 164/544、N 164/544、K 114/544、D 39/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)，因此该突变具有非常低的免疫原性风险。
[0271] 第三突变L4V是从鼠种系中的L高突变成成熟鼠中的V。该位置处的V在小鼠中(V 13/943对比L 927/943)和在人中(V 9/544对L529/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)是不常见的，但该侧链被埋藏，因此该突变的免疫原性风险低。L4V突变可影响CDR-H3结构，并改善与高变T94(其在受体中也是T)的拟合。
[0272] 1.2 VH2、VH3、VH4、VH5中的突变
[0273] 下面论述在上文所列的VH区中产生的三个突变。
[0274] 首先，R66K是CDR-H2的Haidar位置。K在一侧被溶剂化，但具有许多盐桥以构成框架残基，推测可将其的CDR-H2的末端保持在适当位置。在CDR移植后，R66可类似地相互作用，但可能改变CDR结构。在该位置处的K在人中是常见的(K 176/544、R 347/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)。
[0275] 第二突变L78A是支持CDR-H2的Haidar位置。该位置被埋藏，并且接触CDR-H2。在成熟鼠相对比受体中相异的邻居是CDR-H2中的P52a和71，其已被突变为R71A。L78A突变与R71A一起应该不会带来额外的风险，这将有助于R71A实现其成熟的鼠构象。该位置处的A对于人是常见的(A 214/544对比L 163/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)，并且其被埋藏，因此对于该突变没有免疫原性风险。
[0276] 第三突变R38K半嵌在框架中。在CDR移植时产生的CDR-H2中的F63与此处的R的组合可能是拥挤的，从而影响CDR结构。R38K可以帮助保留成熟的CDR构象。此处的K在人中是相当常见的(K153/544、R 385/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)。此处的K可能仍然照常形成盐桥。
[0277] 1.3 VH4、VH5中的突变
[0278] 在上文所列的VH区中产生的突变是K75P。该位置被溶剂化并位于CDR-H2的转角附近。该位置从A高突变成P。在人中(P 0/544对比K 225/544、S 142/544、T 56/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)(以及在小鼠中)的该位置处未观察到P，因此该突变具有免疫原性的风险。其高突变的事实意味着其对于抗原结合可能是重要的，尽管基于其位置，其不可能接触抗原。其环也包含高突变的N76，其更可能接触抗原。该位置的至脯氨酸的高突变意味着其可改变其环的主链构象，尽管成熟鼠同源模型给予其对于非脯氨酸也良好地作用的phi/psi角。
[0279] 1.4 VH2、VH3中的突变
[0280] 在上文所列的VH区中产生的突变是K75S。在该突变中，为了小得多的免疫原性风险，将大的带电荷的K去除，但用普遍的S而非P替代，这在人中未见过。
[0281] 1.5 VH3、VH4、VH5中的突变
[0282] 在上文所列的VH区中产生的突变是A23K，其被溶剂化并位于来自CDR-H1的转角和含有高突变的P75和高突变的N76的环的附近。A23K可以支持N76，并且此处的带正电荷的鼠K也可以改善溶解度。K和A在人中是常见的(K 198/544、A 154/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)。从设计VH2中省略该突变，以使得设计VH2具有简单方法来替代K75但避免K75P和D72V的免疫原性风险。
[0283] 1.6 VH3、VH5中的突变
[0284] 下面论述在上文所列的VH区中产生的两个突变。
[0285] 首先，D72V被溶剂化并位于来自CDR的转角周围。然而，这是在具有高突变P75N76的框架环中，其因此可以接触抗原。该位置可与氨基酸75相互作用；位置72和75在紧匝的两侧，因此它们不能是相同电荷或转向可能不稳定。在成熟鼠中，72和75是V和P；在受体中，它们是D和K。因此，如果有K75P突变，则D72V也应该被突变。该位置处的V在人中是不常见的(V 8/544、D 514/544、E17/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)，因此对于该突变存在一定的免疫原性风险。
[0286] 第二突变I69L被埋藏并支持CDR-H2。I69L突变可以帮助保留鼠CDR结构，尽管附近的其它残基在成熟鼠对比受体中没有不同。此处的L也是常见的(I 122/544、L 342/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)，并且被埋藏，因此对于该突变没有免疫原性风险。
[0287] 1.7 VH2、VH4中的突变
[0288] 在上文所列的VH区中产生的突变是G16E。该突变在几种其它抗体中改善了scFv结构域的稳定性。该位置是暴露于溶剂，在远离CDR的弯曲附近。该位置处的E在人中较不常见(E 44/544对比G 175/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)。从VH1中省略该突变，以使得VH1仅具有高优先级变化；并且从设计VH3和VH5中省略该突变以使VH3和VH5保持为最鼠类样的设计。
[0289] 1.8 VH2、VH4、VH5中的突变
[0290] 上文所列的VH区中的突变是E6Q，其大部分被埋藏并远离CDR。该突变已改善了几种其它抗体的scFv稳定性。在该情况下，其是回复至成熟鼠Q的突变。该位置处的Q在人中是常见的，虽然在我们的受体框架的亚组Heavy 3中并非如此常见。从设计VH1中省略该突变，以使得VH1仅具有高优先级变化；并从设计H3中省略该突变以测试该特异性突变的作用。
[0291] 1.9 VH5中的突变
[0292] 下面论述在VH5中产生的两个突变。
[0293] 第一突变F67A是CDR-H2的Haidar位置并被埋藏。大的F可能与移植的CDR上的F63发生碰撞，因此需要F67A突变以保留成熟的CDR构象。另一方面，尽管CDR移植模型看起来非常适合，但受体框架的F比A大得多，以便刺入埋藏在框架与CDR-H2之间的该区域。该突变的免疫原性风险低，因为其位于CDR-H2的远端，其没有来自鼠种系的成熟。该位置处的F或A在人类中是常见的(F 232/544、A 151/544)，并且所述位置被埋藏，因此没有免疫原性风险。在此处留下F将意味着F63和F67都是F，这在人种系中是不常见的，仅出现在两个亚组7序列中。
[0294] 第二突变V5Q被溶剂化，并且不应影响亲和力。V5Q突变可能改善溶解度。该位置处的V或Q在人中是常见的(V 212/544对比Q182/544是这些氨基酸在544个人重链序列的数据库中的频率)。
[0295] 2.轻链
[0296] 2.1 VL1、VL2、VL3、VL4中的突变
[0297] 下面论述在上文所列的VL区中产生的三个突变。
[0298] 第一突变V11L在其β链与导向CDR-L1的另一条链(含有V19)之间的一侧被溶剂化。因为该残基在空间上接近残基104，所以存在成熟鼠序列的稍大的L11和L104(对受体中的V和V)可影响CDR-L1结构的机会。该位置中的受体框架V在人中是不常见的(V 4/496对比L
410/496、M 63/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此，回复至鼠L的突变相比于增加免疫原性更可能减少免疫原性。
410/496、M 63/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此，回复至鼠L的突变相比于增加免疫原性更可能减少免疫原性。
[0299] 第二突变I21M被埋藏并位于在3个位置后开始CDR-L1的链上。因此，其可影响CDR-L1结构。该位置处的M或I几乎可以接触L104和L11。该位置处的M在人中是常见的(M 91/496对比I 306/496、L75/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，并且该位置被埋藏，因此没有免疫原性风险。
[0300] 第三突变V104L被埋藏，并且远离CDR。该位置紧靠V11，并且存在在该区域包装可影响CDR的机会。该位置处的L在人中最常见(L 374/496对比V 121/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)。
[0301] 2.2 VL1、VL2、VL3中的突变
[0302] 在上文所列的VL区中产生的突变是S60D，其被溶剂化。该位置可能接触抗原并与CDR-L2中的54相互作用。在成熟鼠中，54和该60是R和D；在受体中，它们是L和S。该位置处的D在人中也是常见的(D 202/496、S 188/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)。
[0303] 2.3 VL2、VL3中的突变
[0304] 下面论述在上文所列的VL区中产生的三个突变。
[0305] 第一个突变T22S暴露于溶剂，并位于CDR-L1之前2个位置。所有其邻居在成熟鼠中具有与受体相同的序列。受体的T22与S7的主链氧氢-键合，成熟鼠序列的相应S也应该能够这样氢-键合，尽管其在模型中不这样氢-键合。存在这可影响CDR-L1结构或抗原结合的小的机会。该益处的S在人中是常见的(S 257/496对比T 199/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此该突变没有免疫原性风险。
[0306] 第二突变A43S在一侧被溶剂化并且远离CDR。该位置在VH G104处接触VH链。该接触附近的VH区在成熟鼠和受体中具有相同的序列，因此该差异不应影响配对；但其离CDR-H3不远，因此该接触可影响CDR-H3结构的机会很小。该位置处的S在人中是常见的(S 268/496对A 135/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)。
[0307] 第三突变S63T暴露于溶剂，并位于CDR-L2旁边，虽然其不接触其。存在这可接触抗原的机会。该位置处的T在人中也是常见的(T90/496对比S 389/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)。
[0308] 2.4 VL3中的突变
[0309] 下面论述在上文所列的VL区中产生的四个突变。
[0310] 第一突变S12T被溶剂化并且通过距离和链距离远离CDR和抗原。该框架位置处的T是来自鼠种系中的A的高突变，但其似乎最可能是无意义的高突变。该位置处的T在人中(和对于小鼠)是不常见的(T 8/496对比S 297/496、A 90/496、P 88/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此对于该突变存在一定的免疫原性风险。
[0311] 第二突变Q100A向外伸入溶剂，并且不在CDR附近，但离CDR-L3的下游链不远。在结构模型中，此处的Q与S9或位置5和6的主链相互作用。该位置可影响CDR-L3，但机会很小，因为该位置处的人Q大多延伸至溶剂中。该位置处的A在人中是相当常见的(A 64/496对比G 223/496、Q 143/496、S 58/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)。
[0312] 第三突变A13V在一侧被溶剂化，并且正好位于位置13-18处的β转角之前，其链中的一条链导向远端CDR-L1。存在成熟鼠V对于CDR-L1结构是重要的机会。该位置处的V在人中是常见的(V255/496、A 191/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此该突变具有非常小的免疫原性风险。
[0313] 第四突变L78V被埋藏，远离CDR。该位置处的V在人中是常见的(V 236/496对比L 219/496是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此该突变具有非常低的免疫原性风险。
[0314] 2.5 VL2中的突变
[0315] 在VL2区域中产生的突变D1N是CDR-L1的Haidar位置并被溶剂化。其可接触抗原并且还可接触CDR-L3中的S93 S94和CDR-H2中的Q56。当其在CDR移植后使长度改变了-1时，该位置可以影响CDR-L3。来自成熟鼠的该位置处的N对于小鼠是不常见的(N 7/928对比D 598/928、E 135/928、Q 112/928)，因为其对于人也是不常见的(6/496对比379/496D，61/
496E是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此该突变具有小到中等的相对免疫原性风险。从设计VL3中省略该突变以测试D1N突变的作用。
496E是这些氨基酸在496个人κ链序列的数据库中的频率)，因此该突变具有小到中等的相对免疫原性风险。从设计VL3中省略该突变以测试D1N突变的作用。
[0316] ALULA VH和VL区的序列，以及七个人源化ALULA可变重链区和五个人源化ALULA可变轻链区示于下面。CDR 1、2和3在每个氨基酸序列中加有下划线。
[0317] 可变重链序列：
[0318] ALULA VH可变重链氨基酸序列
[0319]EVQVQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTSYNQKFKGKAKLTAVTSPNTAYMELSSLTNEDSAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：71)
[0320] hALULA VH0可变重链氨基酸序列
[0321]EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNSDTSYNQKFKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)
[0322] hALULA VH0可变重链核酸序列
[0323]
[0324] hALULA VH1可变重链氨基酸序列
[0325]EVQVVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNSDTSYNQKFKGRFTISADTSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)
[0326] hALULA VH1可变重链核酸序列
[0327]
[0328] hALULA VH2可变重链氨基酸序列
[0329]EVQVVQSGGGLVKPGESLRLSCAASGYTFTSYWMHWVKQAPGKGLEWVGAIYPGNSDTSYNQKFKGKFTISADTSSNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)
[0330] hALULA VH2可变重链核酸序列
[0331]
[0332] hALULA VH3可变重链氨基酸序列
[0333]EVQVVESGGGLVKPGGSLRLSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGKGLEWVGAIYPGNSDTSYNQKFKGKFTLSAVTSSNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)
[0334] hALULA VH3可变重链核酸序列
[0335]
[0336] hALULA VH4可变重链氨基酸序列
[0337]EVQVVQSGGGLVKPGESLRLSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGKGLEWVGAIYPGNSDTSYNQKFKGKFTISADTSPNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)
[0338] hALULA VH4可变重链核酸序列
[0339]
[0340] hALULA VH5可变重链氨基酸序列
[0341]EVQVQQSGGGLVKPGGSLRLSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGKGLEWVGAIYPGNSDTSYNQKFKGKATlSAVTSPNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)
[0342] hALULA VH5可变重链核酸序列
[0343]
[0344] hALULA VH6可变重链氨基酸序列
[0345]EVQVVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISADTSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTYGYDWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)
[0346] hALULA VH6可变重链核酸序列
[0347]
[0348] 可变轻链序列：
[0349] ALULA VL可变轻链氨基酸序列
[0350]NIMMTQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：72)
[0351] hALULA VL0可变轻链氨基酸序列
[0352]DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYLSSLTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：8)
[0353] hALULA VL0可变轻链核酸序列
[0354]
[0355] hALULA VL1可变轻链氨基酸序列
[0356]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：9)
[0357] hALULA VL1可变轻链核酸序列
[0358]
[0359] hALULA VL2可变轻链氨基酸序列
[0360]NIQMTQSPSSLSASVGDRVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：10)
[0361] hALULA VL2可变轻链核酸序列
[0362]
[0363] hALULA VL3可变轻链氨基酸序列
[0364]DIQMTQSPSSLTVSVGDRVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCHQYLSSLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO：11)
[0365] hALULA VL3可变轻链核酸序列
[0366]
[0367] hALULA VL4可变轻链氨基酸序列
[0368]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：12)
[0369] hALULA VL4可变轻链核酸序列
[0370]
[0371] ALULA VH和VL的氨基酸序列与7个人源化ALULA可变重链区和5个人源化ALULA可变轻链区的比对分别示于图2和3中。
[0372] 实施例3：材料和方法
[0373] 人可溶性αvβ5蛋白的产生：将人αv和β5整联蛋白亚基的细胞外结构域克隆入哺乳动物表达载体中，并稳定地转染在CHO细胞中。使用标准方法表达蛋白质，并在固定的αv整联蛋白特异性单克隆抗体上使用亲和色谱来从条件培养基纯化所述蛋白。
[0374] 固相αvβ5结合测定法(ELISA)：使用用链霉抗生物素蛋白预涂覆的96孔微量滴定板(Thermo Scientific反应-结合链霉抗生物素蛋白涂覆的高结合能力板)。将含有1％BSA的TBS中的生物素化的可溶性αvβ5蛋白(2μg/mL)加入孔中，并将板在25℃下孵育1小时。用洗涤缓冲液(0.05％的PBS中的Tween-20)洗涤板，加入含有1％BSA、1mM CaCl2和1mM MgCl2的TBS中的纯化的人源化ALULA抗体(50μl/孔)。将板在25℃下孵育1小时，洗涤，然后用50μl/孔的缀合有过氧化物的山羊抗-人二抗孵育1小时。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)检测结合的抗体。结合通过在450nm处测量的吸光度表示。
[0375] 竞争性ELISA：在4℃下，用50μl/孔的5μg/mL可溶性人αvβ5蛋白涂覆96-孔微量滴定板，进行过夜。在自动洗板机中用洗涤缓冲液(0.05％的PBS中的Tween-20)洗涤板4次。加入300μl/孔的1％的PBS中的BSA，在25℃下孵育1小时以阻断非特异性结合。如上洗涤板，加入与含有1％BSA的PBS中的1nM鼠ALULA混合的人源化抗体的稀释液(50μl/孔)。将板在25℃下孵育1小时，洗涤，然后用100μl/孔的缀合有过氧化物的山羊抗-小鼠抗体孵育40分钟。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)检测结合的抗体。结合通过在450nm处测量的吸光度表示。
[0376] 玻连蛋白抑制性ELISA：在4℃下用在PBS中稀释的5μg/ml纯化的人血浆玻连蛋白(50μl/孔)涂覆96孔微量滴定板，进行过夜。除涂覆溶液后，将板用300μl/孔的1％BSA/TBS在25℃封闭1小时。用洗涤缓冲液(0.05％的含有1mM CaCl2和1mM MgCl2的TBS中的Tween-20)洗涤平板，添加与含有1％BSA，1mM CaCl2和1mM MgCl2的TBS中的1nM可溶性αvβ5蛋白混合的人源化抗体的稀释液(50μl/孔)并在25℃孵育1小时。在自动化板洗涤器中用洗涤缓冲液洗涤板4次，并在25℃下在含有1％BSA、1mM CaCl2和1mM MgCl2的TBS中依次用50μl/孔的抗-β5单克隆抗体15F11(0.5ug/mL)孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤板4次后，加入100μl/孔的含有1％BSA、1mM CaCl2和1mM MgCl2的TBS中的缀合有过氧化物酶的山羊抗-小鼠抗体的
1:5000稀释物，并在25℃下孵育1小时。结合的蛋白质使用TMB底物来检测，并通过在450nm处测量的吸光度表示。
1:5000稀释物，并在25℃下孵育1小时。结合的蛋白质使用TMB底物来检测，并通过在450nm处测量的吸光度表示。
[0377] 玻连蛋白粘附测定：在4℃下，用50μl/孔的稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10μg/ml纯化的人玻连蛋白涂覆96孔微量滴定板，进行过夜。将板用PBS(100μl/孔)洗涤两次，并在25℃下用1％的PBS中的BSA(100μl/孔)封闭1小时。将板用100μl/孔的测定缓冲液(TBS完全加上1mM CaCl2和1mM MgCl2)洗涤两次。接下来，向板的各孔中加入25μl杂交瘤上清液(或纯化的抗体)和25μlαvβ5-BaF3细胞(5×106个细胞/ml，用2μM钙荧光素AM标记的)。将板在37℃下孵育1.5小时，随后用测定缓冲液(100μl/孔)洗涤4-6次。记录从捕获在板上的细胞发射的荧光。通过将洗涤前的荧光信号(即，加入的总细胞)与洗涤后的荧光信号(即结合的细胞)进行比较来测定百分比结合。
[0378] FACS结合测定：将细胞在PBS中洗涤一次，随后重悬于FACS缓冲液(1X PBS、1％BSA、1mM CaCl2和1mM MgCl 2)中。然后将1×106个细胞在含有测试抗体的FACS缓冲液中在冰上孵育1小时，总体积为50μl。孵育后，将细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤两次，重悬于50μl含有3μg/ml山羊抗-小鼠IgG AlexaFluor488(Jackson ImmunoResearch)的FACS缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。然后将细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤两次，并在1％PFA中固定过夜。通过40μm滤板(Millipore)过滤除去细胞聚集体，并使用FACS Calibur(BD Biosciences)通过流式细胞术监测标记的第二抗体的结合。
[0379] 单侧缺血钳模型：重量为250-320g的雄性Sprague-Dawley大鼠购自Harlan Laboratories，在手术前使其适应5天，随意获取食物和水。用异氟烷/O2混合物麻醉动物，
5％用于诱导，1-2％用于维持麻醉。使用3cm中线切口打开腹部。分离每个肾脏，使用无菌棉签将肾动脉和静脉周围的脂肪和结缔组织切除。取出右肾，将肾动脉和静脉缝合。通过在肾蒂上使用非创伤夹钳夹住肾动脉和静脉40分钟来启动左肾的缺血。在缺血期结束时，取出夹钳并观察肾以确保血流的快速重建。研究在手术后72小时结束，并且通过过量戊巴比妥，随后进行颈脱位法将大鼠安乐死。在夹紧之前6小时通过皮下注射以300μL体积施用测试试剂(对照抗体1E6-mIgG1同种型对照)或H4/L2抗-αvβ5抗体)。在研究开始时抽取0.15mL静脉血样品用于基线肌酐测量，以及在术后48小时抽取0.15mL静脉血样品用于病理性血清肌酐水平评价。在Beckman肌酸酐分析仪2上测量肌酸酐浓度。用已知对照标准化机器，并使用苦味酸反应运行样品。
5％用于诱导，1-2％用于维持麻醉。使用3cm中线切口打开腹部。分离每个肾脏，使用无菌棉签将肾动脉和静脉周围的脂肪和结缔组织切除。取出右肾，将肾动脉和静脉缝合。通过在肾蒂上使用非创伤夹钳夹住肾动脉和静脉40分钟来启动左肾的缺血。在缺血期结束时，取出夹钳并观察肾以确保血流的快速重建。研究在手术后72小时结束，并且通过过量戊巴比妥，随后进行颈脱位法将大鼠安乐死。在夹紧之前6小时通过皮下注射以300μL体积施用测试试剂(对照抗体1E6-mIgG1同种型对照)或H4/L2抗-αvβ5抗体)。在研究开始时抽取0.15mL静脉血样品用于基线肌酐测量，以及在术后48小时抽取0.15mL静脉血样品用于病理性血清肌酐水平评价。在Beckman肌酸酐分析仪2上测量肌酸酐浓度。用已知对照标准化机器，并使用苦味酸反应运行样品。
[0380] 实施例4：人源化ALULA构建体的筛选
[0381] 使用在CHO细胞中瞬时表达的蛋白质(对应于可变结构域重链和可变轻链设计，其中VH结构域融合至无糖基化人IgG1结构域(含有Thr299Ala突变，根据Kabat编号惯例编号的)并且VL结构域融合至κ轻链)进行人源化构建体的筛选。
[0382] 使用未纯化的蛋白质在条件细胞培养基中筛选重链形式VH0、VH1、VH2、VH3、VH4或VH5与轻链VL0、VL1、VL2或VL3的所有组合。使用固相结合测定(ELISA)和通过FACS测定每个构建体与缀合有生物素的人αvβ5蛋白的结合，并且使用玻连蛋白细胞粘附测定法(表1)测定每个构建体阻断配体结合的能力。
[0383] 表1.使用未纯化的Agly-IgG1构建体的结合和抑制数据的概述
[0384]
[0385]
[0386] *ND，由于低表达水平而未测定
[0387] 纯化并进一步测试一个亚组的重-轻链对。
[0388] 通过利用鼠ALULA的竞争性ELISA测定每种构建体与可溶性纯化的人αvβ5蛋白的结合(图4)。在该测定中测定的IC50值示于下表2中。含有H0的构建体显著降低了阻断ALULA结合的能力，这表明与ALULA框架相比，H0链中的氨基酸变化减小了H0抗体的结合亲和力。其余构建体表现相似，形式H4/L2在该测定中显示最低的IC50值。
[0389] 平行地，在两个粘附测定中测试人源化ALULA抗体。一个测定测量每种抗体抑制可溶性αvβ5与纯化的人血浆玻连蛋白的结合的能力。在另一个测定中，用人αv和β5亚基稳定转染鼠BaF3细胞系，并且使用荧光终点确定这些细胞对玻连蛋白的粘附。两个粘附测定的结果与结合测定平行，因为含H0的构建体是明显不太有效的抑制剂，而H4/L2是其中最有效的(参见表2)。
[0390] 表2.使用纯化的Agly-IgG1蛋白的结合和抑制数据的概述
[0391]
[0392]
[0393] 实施例5：人源化ALULA的人恒定区的选择
[0394] 为了使人源化ALULA构建体的免疫效应子功能最小化，选择已经显示以低亲和力结合Fcγ受体和补体C1q的工程化IgG Fc结构域(参见，美国专利公开第2012/0100140A1号)。重链(称为“IgG4.P(S228P)/IgG1(N297Q)”)包含人IgG4的CH1和CH2结构域以及人IgG1的CH3结构域。铰链区中的氨基酸变化(使用Kabat编号惯例的S228P)稳定重链的链间二硫键以使抗体重排最小化，并且N297Q突变消除N-糖基化位点。轻链含有人κCL结构域。
[0395] 实施例6：ALULA构建体的筛选
[0396] 基于上文实施例4中描述的结果，选择4种人源化ALULA构建体：VH2/VL2、VH4/VL0、VH4/VL2和VH5/VL2用于进一步测试。这些VH/VL构建体表达为与杂交的无糖基化IgG4.P(S228P)/IgG1(N297Q)结构域和人κ轻链结构域的融合蛋白，并从稳定转染的CHO细胞的条件培养基中纯化所述构建体。使用利用鼠ALULA的竞争性ELISA并使用人αvβ5转染的BaF3细胞通过FACS评估每种人源化ALULA构建体的结合。还通过ELISA或细胞粘附测定法，使用用人或食蟹猴αvβ5稳定转染的BaF3细胞评估每种人源化ALULA构建体的对玻连蛋白的结合/粘附的阻断。将人源化ALULA构建体与包含与人IgG1重链和人κ轻链结构域融合的鼠重链和轻链可变结构域的ALULA的嵌合形式进行比较。所述4种人源化ALULA构建体在测定中表现相似，其中H4/L2通常具有与另外的构建体相似或比其略高的亲和力/阻断效力(参见，表3)。
[0397] 表3.利用纯化的Agly-IgG4P/IgG1蛋白的结合和抑制数据的概述
[0398]
[0399] 在IgG4.P(S228P)/IgG1(N297Q)主链上产生3种另外的组合(VH4/VL4、VH6/VL2和VH6/VL4)，以测定设计VH6和VL4中使用的对CDRH2的改变的作用。这3种构建体中的每一种阻断鼠ALULA并抑制αvβ5-玻连蛋白结合，IC50值≥100nM，表明掺入设计VH6和VL4的对CDRH2的改变显著削弱抗体与αvβ5的结合(数据未显示)。
[0401] 通过用木瓜蛋白酶消化从相应的IgG1(N297Q)形式生成实施例6的4种构建体的Fab片段。通过ELISA测定每种Fab阻断2nM可溶性αvβ5与固定的人血浆玻连蛋白结合的能力。如表4所示，VH4/VL2Fab片段以可与嵌合鼠抗体相当的IC50阻断配体结合，而其它形式具有略高的IC50值。
[0402] 表4.使用Fab片段进行的αvβ5与玻连蛋白的结合的抑制
[0403]
[0404] 实施例8：示例性人源化抗-αvβ5抗体
[0405] 下面提供了4种示例性人源化抗-αvβ5抗体。这些抗体包括基于VH结构域VH4、VH5和VH2以及VL结构域VL0和VL2的设计。
[0406] 这些示例性抗体的重链包含VH4、VH2或VH5可变重链(参见图2)以及含有人IgG4P的CH1和CH2结构域和人IgG1的CH3结构域的恒定区。重链还包含铰链区中的突变(S228P，Kabat编号)以减少半抗体的形成和CH2结构域中的突变(N297Q，Kabat编号)以消除N-糖基化位点。在每个序列中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3加有下划线；IgG4P恒定结构域CH1和CH2结构域以粗体显示；所述IgG1恒定结构域和CH3结构域以斜体表示；并且IgG4P铰链中的S228P突变和CH2结构域中的N297Q突变均以粗体加下划线字体表示。
[0407] 基于VH4的重链：
[0408]
[0409] 基于VH2的重链：
[0410]
[0411] 基于VH5的重链：
[0412]
[0413] 示例性轻链包含VL0或VL2可变轻链(参见图3)和含有人IgG4P的κ轻链恒定区(在下文中以斜体显示)的恒定区。基于Kabat的CDR加有下划线。
[0414] 基于VL0的轻链：
[0415]
[0416] 基于VL2的轻链：
[0417]
[0418] 实施例9：抗-αvβ5抗体的示例性核酸序列
[0419] 以下是编码基于上述人源化ALULA VH0-VH6设计的重链的示例性核酸序列。这些示例性抗体的重链具有包含人IgG4P的CH1和CH2结构域和人IgG1的CH3结构域的恒定区。重链还包含铰链区中的突变(S228P，Kabat编号)以减少半抗体的形成和CH2结构域中的突变(N297Q，Kabat编号)以消除N-糖基化位点。
[0420] 基于VH0的重链的核酸序列：
[0421]
[0422]
[0423] 基于VH1的重链的核酸序列：
[0424]
[0425] 基于VH2的重链的核酸序列：
[0426]
[0427] 基于VH3的重链的核酸序列：
[0428]
[0429] 基于VH4的重链的核酸序列：
[0430]
[0431] 基于VH5的重链的核酸序列：
[0432]
[0433] 基于VH6的重链的核酸序列：
[0434]
[0435] 以下是基于上述人源化ALULA VL0-VL4设计的编码轻链的示例性核酸序列。这些轻链具有包含人IgG4的κ轻链恒定区的恒定区。
[0436] 基于VL0的重链的核酸序列：
[0437]
[0438]
[0439] 基于VL1的重链的核酸序列：
[0440]
[0441] 基于VL2的重链的核酸序列：
[0442]
[0443] 基于VL3的重链的核酸序列：
[0444]
[0445] 基于VL4的重链的核酸序列：
[0446]
[0447] 实施例10：利用MAb/Fab的FACS结合
[0448] 进行该实验以证实ALULA-H4/L2-IgG4.P(S228P)/IgG1(N297Q)对在鼠BaF3细胞上稳定表达的细胞表面表达的αvβ5的亲和力。使用较低数量的细胞生成结合曲线以确保抗体不是简单地滴定细胞上的受体。使用10,000个细胞/实验，对于mAb，KD值被测定为0.08±0.02nM，对于单价Fab，KD值被测定为0.42±0.03nM。
[0449] 实施例11：人源化ALULA构建体的稳定性
[0450] 使用差示扫描量热法(DSC)测定均含有无糖基化IgG4.P(S228P)/IgG1(N297Q)结构域的纯化的人源化ALULA抗体VH2/VL2、VH4/VL0、VH4/VL2和VH5/VL2的热稳定性(参见表5)。将这些与在相同Fc结构域上表达的参照人源化αvβ5设计(设计-参照H1和设计-参照L1；
参见实施例1)的相应值进行比较。
参见实施例1)的相应值进行比较。
[0451] 对于每种抗体，观察到3个不同的转换，对应于恒定结构域的CH2和CH3区的解折叠(分别在57-59℃和84-85℃)和包含可变结构域和CH1恒定结构域的Fab区的解折叠(在69-73℃)。形式VH4/VL2、VH4/VL0和VH2/VL2的Fab区域各自具有比VH5/VL2或参照人源化αvβ5设计抗体略高的解链温度(Tm)，表明较高的热稳定性。值得注意的是，VH4和VH2重链都在位置16处包含谷氨酸残基，而VH5在该位置具有甘氨酸，并且参照人源化αvβ5设计具有丙氨酸。通过木瓜蛋白酶裂解每个mAb的Agly-IgG1(T299A)形式生成了单价Fab片段，并测量分离的Fab的热稳定性。VH2/VL2、VH4/VL0和VH4/VL2Fab具有在75.4-76.3之间的Tm值，而VH5/VL2Fab的Tm为72.1，与在完整mAb内的该区域中观察到的热稳定性的差异一致。
[0452] 表5.使用DSC测定的抗体的热稳定性
[0453]
[0454] 实施例12：H4/L2的FACS直接结合测定
[0455] 使用流式细胞术在与人αv和人β5整联蛋白亚基稳定共转染的BaF3细胞上测定H4/L2抗体(SEQ ID NO：69和70)与细胞表面上表达的αvβ5的结合。BaF3细胞是不确定来源的鼠IL-3依赖性造血细胞系。这些细胞内源性表达小鼠α-V(以及α-4、α-5和β-1整联蛋白)，但不表达β-5或β-6整联蛋白。
[0456] 在冰上将H4/L2抗体添加至FACS缓冲液(PBS、1％BSA、1mM CaCl2、1mM MgCl2)中的细胞，进行30分钟。洗涤后，利用抗-人-Alexa 488二抗检测结合的抗体。在FACS Calibur上收集在1％多聚甲醛中固定的细胞，使用FlowJo软件分析平均荧光强度。
[0457] H4/L2抗体特异性结合αvβ5-BaF3细胞，没有可检测的与亲本BaF3细胞的结合。H4/L2抗体的结合是剂量依赖性的，EC50为3nM。
[0458] 实施例13：H4/L2抗体的表观结合亲和力
[0459] 使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定H4/L2抗体(SEQ ID NO：69和70)对固定的人αvβ5(hsαvβ5)的表观结合亲和力。将纯化的hsαvβ5蛋白以2μg/mL直接涂覆在96孔ELISA板上，并使用缀合有辣根过氧化物酶的驴抗-人IgG多克隆抗体检测H4/L2抗体结合。在该形式中，H4/L2抗体对αvβ5的EC50为约65pM。
[0460] 实施例14：可制造性评估
[0461] 在对于可开发性和可制造性是关键的情况下评估H4/L2抗体连同3种其它抗体(H4/L0、H5/L2和H2/L2)的稳定性。作为生物治疗剂的制造过程的一部分，通常将化合物在低pH下经历长时间孵育，以灭活任何潜在的污染病毒。单克隆抗体的标准纯化方法还可掺入低pH条件。因此，低pH下的稳定性可以是重要的属性。在数周的过程中横跨宽范围的pH的筛选表明这些构建体中的每一种在低pH下通过多次测量具有降低的稳定性(图6A)。然而，H4/L2表现出比除了另外的构建体中的一个外的所有构建体更少的片段化(图6B)。虽然其和其它构建体在该pH范围内表现出增加的聚集，但相对于所有其它构建体，其维持了更高水平的单体完整性(图6C)。
[0462] 在多个研究中在宽pH范围内，在多个缓冲系统中并且在包含常见赋形剂的情况下通过差示扫描量热法(DSC)评估构象稳定性。除了H5/L2(其在该测量中一直不如所有其它构建体稳定)之外，H4/L2在构象稳定性方面与其余构建体相匹配。
[0463] 就可制造性和预期的保质期而言，蛋白质对常见影响因素(例如，升高的温度、搅拌或冻融)的稳定性是非常需要的。在加速影响因素条件下的稳定性常常用作尝试预测在最佳条件下储存的蛋白质的实时长期稳定性的工具。在通常于5℃下储存的生物制品的情况下，加速条件通常由25℃/60％RH(相对湿度)和40℃/75％RH组成。在高浓度下，在加速条件(40℃/75％RH)下，所有构建体均显示增加的聚集行为。然而，在大多数制剂和pH中，H4/L2在加速温度下最抗聚集(图7A)。还观察到响应于搅动(图7B)和冻融(图7C)两者的该效果。对于蛋白质可制造性和预期的保质期两者而言，对于影响因素诸如高温、搅拌和冻融的稳定性是非常期望的。
[0464] 实施例15：抗-αvβ5抗体在肾脏缺血模型中的功效
[0465] 大鼠单侧缺血钳模型用于研究人源化抗-αvβ5抗体在预防肾缺血中的功效。在夹紧肾动脉之前6小时，用1mg/kg、10mg/kg或50mg/kg的H4/L2抗体(由SEQ ID NO：69和70组成)或对照抗体(1E6)的单次施用处理5至6只大鼠。在基线时和夹紧后48小时收集血液以评估血清肌酐水平。单剂量的抗-αvβ5抗体能够显著减弱缺血诱导的手术后血清肌酐的上升(图5；*P<0.05对比对照抗体；误差棒＝SD)。
[0466] 其它实施方案
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