抗蓝舌病病毒血清1型VP2蛋白的单克隆抗体BTV1-4B6及其识别的B细胞表位多肽与应用专利检索-多克隆血清疗法专利检索查询-专利查询网

抗蓝舌病病毒血清1型VP2蛋白的单克隆抗体BTV1-4B6及其识别的B细胞表位多肽与应用

阅读：304发布：2020-05-12

专利汇可以提供抗蓝舌病病毒血清1型VP2蛋白的单克隆抗体BTV1-4B6及其识别的B细胞表位多肽与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种抗蓝舌病病毒血清1型VP2蛋白的单克隆抗体 BTV1-4B6及其识别的B细胞表位多肽与应用，属于蓝舌病防治领域。本发明还涉及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。由本发明的杂交瘤细胞株分泌的抗BTV1-VP2蛋白的单克隆抗体，命名为BTV1-4B6。进一步的，本发明利用截短表达抗原短肽和肽扫描技术鉴定出该抗体所识别的BTV1-VP2蛋白B细胞表位多肽：115AQPLKVGL122，序列比对结果显示该表位多肽是BTV1所特有并保守的B细胞表位多肽。免疫荧光实验结果显示BTV1-4B6可与BTV1发生特异性反应，而与BTV2～24不发生反应。由此说明BTV1-4B6可用于BTV1特异性诊断的研究与应用。，下面是抗蓝舌病病毒血清1型VP2蛋白的单克隆抗体BTV1-4B6及其识别的B细胞表位多肽与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株分泌抗蓝舌病病毒血清1型(Bluetongue virus1,BTV1)VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV1-4B6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No.7002。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体。
3.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清1型感染药物中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清1型感染药物中的应用。

说明书全文

抗蓝舌病病毒血清1型VP2蛋白的单克隆抗体BTV1-4B6及

其识别的B细胞表位多肽与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体(Monoclonalantibody,Mab)，尤其涉及一株分泌抗蓝舌病病毒血清1型（Bluetongue virus1,BTV1）VP2蛋白Mab的杂交瘤细胞株及其所分泌的Mab；本发明还涉及一个B细胞表位多肽，尤其涉及上述Mab所识别的BTV1VP2蛋白B细胞表位多肽；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、Mab以及B细胞表位多肽在制备诊断或预防BTV1药物中的应用，属于蓝舌病（Bluetongue,BT）的防治领域。

背景技术

[0002] 蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的以库蠓等昆虫为传播媒介的一种急性非接触性传染病，以发热、白细胞减少、颊粘膜和胃肠道粘膜严重卡他性炎症为主要特征。主要感染绵羊，牛等家养及野生反刍类动物，反刍动物感染BTV后的死亡率5%～30%不等，易感绵羊可高达80%。该病最早于1876年发现于南非的绵羊，1940年前主要在非洲大陆流行，40年代后到70年代开始向中东地区蔓延，广泛分布于热带、亚热带、温带国家，动物生产力降低、死亡、贸易限制及疫病诊断和控制直接或间接地造成了巨大的经济损失，成为世界性危害的传染病。是世界动物卫生组织（OIE）规定的上报疫病（以前规定为A类传染病），我国将其规定为一类动物疫病。我国从1979年在云南师宗县首次发生本病以来，先后在湖北，安徽，四川，山西等地发生本病，此后，在广东、广西、新疆、甘肃、内蒙古、河北、江苏、天津、陕西、青海、辽宁、吉林等地也陆续发生本病，目前我国至少29个省市区的羊群中已经检测出BTV抗体，许多省市还在牛群中检测出BTV抗体。

[0003] BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），是一种双链RNA病毒，目前全世界已经发现26个血清型，我国已分离到BTV1、2、3、4、12、15、和16型毒株。BTV可用中和试验分型，各型间无交叉反应，各个国家和地区血清型的分布各不相同。

[0004] VP2蛋白由L2基因编码，在BTV各型间保守性最低。VP2能诱导产生中和抗体，其中VP2蛋白是BTV型特异性的主要决定因素而且具有血凝活性。将BTV的26个血清型标准株的L2基因序列对比发现，L2基因在BTV所有编码基因中变异性最大。对BTV的26个血清型病毒株的VP2基因序列分别进行测序分析，各型间VP2的基因序列差异从29%（BTV8和BTV18）到59%（BTV16和BTV22）不等。VP2的氨基酸序列变化范围为22.4%(BTV4和BTV20)到73%（BTV6和BTV22）。

[0005] 由于BTV血清型众多，而且不同的血清型之间无交叉免疫性，因此快速的BTV血清型检测方法的建立及针对相应血清型使用适当的疫苗是预防该病的关键。加之我国对该病的研究起步较晚，目前仅有关于BTV群特异性Mab制备的报道，缺乏建立血清型检测方法所需要的试剂。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一是提供一株可以稳定分泌抗BTV1-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

[0007] 本发明的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体（Monoclonal antibody,Mab），该单克隆抗体可与蓝舌病病毒血清1型（BTV1）发生特异性反应，而与蓝舌病病毒血清2～24型（BTV2～24）不发生反应；

[0008] 本发明的目的之三是鉴定一个BTV1-VP2蛋白的BTV1特异性B细胞表位多肽。

[0009] 本发明的目的之四是提供上述杂交瘤细胞株、Mab以及B细胞表位多肽在制备诊断BTV1病毒感染药物中的应用。

[0010] 本发明是通过以下技术方案来实现的：

[0011] 利用pMAL-c4x原核表达载体对BTV1-VP2基因进行原核表达，将所表达出的BTV1-VP2蛋白纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。并利用杆状病毒表达系统对BTV1-VP2基因进行真核表达，对所表达的包涵体形式的BTV1-VP2蛋白进行变性、纯化和复性后作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选。最终获得一株稳定分泌抗BTV1-VP2蛋白Mab的杂交瘤细胞株，命名为BTV1-4B6，其分类命名为分泌抗BTV1-4B6单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.7002，保藏日期为2012年12月11日。同时，将该杂交瘤细胞株所分泌的Mab命名为BTV1-4B6。

[0012] 本发明利用截短表达抗原短肽和肽扫描技术对BTV1-4B6所识别的BTV1-VP2蛋白115 122
的B细胞表位进行了鉴定，最终将该表位精确定位为：AQPLKVGL （SEQ ID NO.1所示。）。

[0013] 免疫荧光实验（IFA）检测结果表明BTV1-4B6可与BTV1发生特异性反应，而与BTV2～24不发生反应。

[0014] 因此，本发明提出了所述杂交瘤细胞株在制备诊断BTV1病毒感染药物中的应用。及

[0015] 所述的单克隆抗体在制诊断或预防BTV1病毒感染药物中的应用。以及[0016] 所述的BTV1-VP2蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断BTV1感染药物中的应用。

[0017] 合成BTV25-VP2蛋白、BTV26-VP2蛋白相应区段的短肽，进行间接ELISA反应，结115 122
果显示二者均与BTV1-4B6呈阴性反应。同时，序列比对结果显示 AQPLKVGL 为BTV1所特有并保守的B细胞表位多肽。

[0018] 综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV1-VP2蛋白的Mab，以及该Mab所识别的BTV1-VP2蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽。本发明为建立BTV1血清学诊断方法奠定了基础。附图说明

[0019] 图1为VP2基因的PCR的扩增；

[0020] M：DNA Marker；1：空白对照；2：反转录PCR扩增的L2基因；

[0021] 图2为重组质粒pMAL-c4X-VP2的酶切鉴定；

[0022] M：DNA Marker；1：pMAL-c4X空质粒；2：重组质粒pMAL-c4X-VP2；3：BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的空载体pMAL-c4X；4：BamHⅠ单酶切后的重组质粒pMAL-c4X-VP2；5：HindⅢ单酶切后的重组质粒pMAL-c4X-VP2；6：BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的重组载体pMAL-c4X-VP2；

[0023] 图3为纯化原核表达的重组VP2蛋白的SDS-PAGE分析；

[0024] M:蛋白Marker;1:纯化后的原核表达的重组VP2蛋白；2：纯化前的原核表达的重组VP2蛋白；

[0025] 图4为纯化真核表达的重组VP2蛋白的SDS-PAGE分析；

[0026] M:蛋白Marker;1:纯化前的真核表达的重组VP2蛋白；2：纯化后的真核表达的重组VP2蛋白；

[0027] 图5为BTV1-4B6的Western blot鉴定结果；

[0028] M:蛋白Marker;1：BHK-21细胞沉淀；2：接种BTV1后收获的BHK-21细胞沉淀；

[0029] 图6为BTV1-4B6与24个型的BTV的间接免疫荧光鉴定结果；

[0030] 图7为截短表达的96条短肽的SDS-PAGE分析；

[0031] M:蛋白Marker;V:空载体表达的MBP标签蛋白；1～96：鉴定表位用的截短表达的96段短肽；

[0032] 图8为合成的短肽（表1）与BTV1-4B6反应性的间接ELISA分析；

[0033] 图9为合成的短肽（表2）与BTV1-4B6反应性的间接ELISA分析；

[0034] 图10为表位多肽的保守性分析；

[0035] 图11为表位多肽的特异性分析。

具体实施方式

[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0037] 主要实验材料和来源

[0038] 1.蛋白、细胞、毒种

[0039] 原核表达并纯化（图3）的BTV1-VP2蛋白、真核表达并纯化（图4）的BTV1-VP2蛋白、SP2/0细胞、Sf9细胞和携带BTV1-VP2基因的重组杆状病毒BACV-VP2,BHK21细胞、1至24型BTV均由本实验室保存。

[0040] 2.主要试剂和药品

[0041] 胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，DMEM培养基购自GIBCOL公司；50%PEG、50×HAT、50×HT和8-氮鸟嘌呤（8-AG）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记山羊抗小鼠IgG均购自Sigma公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG为金桥生物技术有限公司进口分装产品；SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司；Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ和SalⅠ购自宝生物工程(大连)公司。

[0042] 3.实验动物

[0043] 6周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

[0044] 实施例1BTV1-VP2蛋白的原核表达及纯化

[0045] 1.引物设计

[0046] 根据Genbank中已登录的BTV1VP2基因序列(登录号：JN848760.1)，设计PCR扩增引物，序列如下：

[0047] BTV1-VP2-BamHⅠ-1-23F：5'CTGGATCCATGGATGAACTAGGCATCCCAGT3'

[0048] BTV1-VP2-Hind-2886-2865R：5'GCCAAGCTTTCATACGTTGAGAAGTTTTGTC3'[0049] 下划线部分为引入的BamH I、Hind III酶切位点，预计扩增产物长度为2886bp。

[0050] 2.BTV1病毒RNA的提取及反转录

[0051] 利用Trizol法从感染BTV1的BHK-21细胞中提取病毒基因组RNA作为模板，用BTV1-VP2-Hind-2886-2865R引物进行反转录合成病毒cDNA。

[0052] Trizol法提取RNA步骤：收获感染BTV1的BHK-21细胞1-5×107个，加入1mL Trizol混匀，室温静置5min，加入0.2mL氯仿，用力振摇15s，室温孵育2-3min，12000g，4℃离心15min，离心后液体分三层，小心取出上层无色液体，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温孵育10min，12000g，4℃离心10min，弃上清，沉淀加入1mL75％的乙醇（DEPC水配制的），轻振15s，7500g，4℃离心5min，小心弃尽上清，沉淀室温风干3-5min，加入20-30μL DEPC水溶解，-20℃保存。

[0053] 用提取的病毒总RNA进行反转录合成cDNA，体系如下：

[0054]

[0055] 反应过程中，先将模板RNA溶液和下游引物于95℃孵育10min，冰浴冷却5min，然后将其余试剂加入，混匀，室温放置10min，42℃孵育60min，冰中冷却2min。

[0056] 3.BTV1VP2基因扩增与纯化

[0057] 以反转录获得的cDNA为模板，利用所设计的BTV1-VP2-BamHⅠ-1-23F做为上游引物，BTV1-VP2-Hind-2886-2865R做为下游引物，扩增BTV1VP2基因。PCR反应体系（50μL）如下：

[0058]

[0059] 反应条件为95°C预变性5min；95°C变性30s，54°C 退火30s，72°C延伸3min，循环30个周期；72°C延伸10min。

[0060] 然后对PCR产物胶回收，将全部PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切取含有目的基因的胶块，之后按照上海华舜生物工程有限公司胶回收试剂盒说明书回收PCR扩增出的VP2基因，BTV1VP2基因RT-PCR结果如图1所示。

[0061] 4.BTV1-VP2蛋白原核表达重组载体的构建

[0062] 将胶回收得到的VP2基因进行双酶切，酶切体系如下：

[0063]

[0064] 同时，对原核表达载体pMAL-c4X进行双酶切，酶切体系如下：

[0065]

[0066] 将酶切反应体系混匀后，置37°C水浴锅中静置2h。将L2基因双酶切后的体系用上海华舜生物工程有限公司PCR产物纯化试剂盒进行纯化，操作步骤按试剂盒说明书进行。将原核表达载体pMAL-c4X双酶切后的体系进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行胶回收。

[0067] 将双酶切后的L2基因和原核表达载体pMAL-c4X进行连接，连接体系如下：

[0068]

[0069] 连接条件为在DNA连接仪中16°C连接过夜。

[0070] 5.转化与挑菌

[0071] 将4中得到的连接产物全部转入Ecoli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃水浴热刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250μL LB液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h，将100μL菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜。
从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到5mL LB(Amp+，100μg/mL)液体培养基中37℃振荡培养。

[0072] 6.重组质粒的酶切鉴定与测序

[0073] 1）利用AXYGEN公司的质粒小量抽提试剂盒，按照试剂盒说明书操作从5中培养的菌液中提取质粒，将所提取的质粒与pMAL-c4X载体质粒一起进行琼脂糖凝胶电泳，选出疑似重组质粒。

[0074] 2）对疑似重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下：

[0075]

[0076] 酶切条件为37℃水浴，作用2h。

[0077] 3）将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定阳性质粒。

[0078] 4）将经过初步断定含有阳性质粒的菌液送交上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pMAL-c4X-VP2。重组质粒pMAL-c4X-VP2的酶切鉴定结果如图2所示。

[0079] 7.BTV1VP2基因的原核表达与纯化

[0080] 按照5所述转化方法将重组质粒pMAL-c4X-VP2转化到原核表达用BL21(DE3)感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色孤立菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养过夜。表达诱导具体操作如下：取1mL重组菌菌液加入到100mL的LB培养基中37℃震荡培养至OD600nm约为0.5-1时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4-5h。重组表达BTV VP2蛋白SDS-PAGE分析结果如图3所示。

[0081] 将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过切胶方法进行纯化。将切下的胶块加入适量的PBS将其研磨成细的碎颗粒，该胶粒不必加佐剂即可用于动物免疫，可缓慢释放出目的蛋白。

[0082] 实施例2单克隆抗体的制备

[0083] 1.小鼠免疫

[0084] 以纯化后的原核表达的重组BTV1-VP2蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，一免将重组VP2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，二免和三免将重组NS1蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫剂量为50μg/只，免疫途径为腹腔免疫。

[0085] 分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清（4℃，10000rpm，10min），用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫。

[0086] 2.细胞融合

[0087] 融合前1天准备饲养细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4∶1到10∶1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。

[0088] 3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

[0089] 利用纯化后的真核表达BTV1-VP2蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，克隆3轮，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗BTV1-VP2蛋白Mab的杂交瘤细胞株，并将其分泌的Mab命名为BTV1-4B6；该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.7002，保藏日期为2012年12月11日。

[0090] 4.Mab的大量制备

[0091] 给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡油，0.5mL/只，1周后腹腔注6
射1×10 个杂交瘤细胞，7～10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于-20℃。

[0092] 实施例3Mab的鉴定

[0093] 1.Mab的亚类鉴定

[0094] SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例1所得到的Mab进行亚类鉴定。

[0095] 结果显示本发明Mab TV1-4B6的重链为IgG1，轻链为κ链。

[0096] 2.Western blot鉴定

[0097] 将离心收获BTV1病毒上清后的细胞沉淀和BHK-21细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳然后进行电转印，电转条件为17V 电压30min。转印后的硝酸纤维素膜放入含50g/L脱脂奶粉的PBST封闭液中4℃封闭过夜；将封闭好的硝酸纤维素膜放入阳性杂交瘤培养液上清中室温作用1h，用PBST（含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBST缓冲液）洗涤3次，再与经PBST5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG HRP标记抗体室温作用1h，PBST洗涤3次，DAB显色试剂盒显色，扫描记录（图5）。

[0098] 2.IFA试验

[0099] 为了印证本研究所制备的单克隆抗体BTV1-4B6与BTV1反应的特异性，本实验室在BHK21细胞上接种BTV1～24，以BTV1-4B6为一抗，以异硫氰酸荧光素（FITC）标记山羊抗小鼠IgG为二抗进行IFA试验（图6），结果显示单克隆抗体BTV1-4B6只与BTV1反应，而与BTV2～24不发生反应。

[0100] 试验结果证实，本发明所制备的BTV1-4B6能够与BTV1发生特异性反应，而与BTV2～24不反应，同时根据Western blot实验结果推测单克隆抗体BTV1-4B6所识别的BTV1-VP2蛋白B细胞表位应该是一个线性表位。

[0101] 实施例4B细胞表位多肽的鉴定

[0102] 1.B细胞表位的初步鉴定

[0103] 以BTV1-VP2基因序列为模板，利用Primer5.0 软件先设计96对引物，分别表达BTV1-VP2抗原短肽。然后进行BTV1-4B6B细胞表位的初步鉴定，具体方法如下：

[0104] （1）人工合成96对互补寡核苷酸链，每对核苷酸链表达的短肽具有16个氨基酸，相邻的短肽之间重叠6个氨基酸。上游寡核苷酸链的5’端引入EcoRⅠ酶切位点，在下游寡核苷酸链的5’端引入SalⅠ酶切位点。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司（Invitrogen公司）合成。

[0105] （2）将两对互补链直接54℃退火10min形成带有粘性末端的双链DNA，同时用EcoR I和SalⅠ对pMAL-c4x进行双酶切。

[0106] （3）将两条退火形成的双链DNA与酶切后的pMAL-c4x相连接

[0107] （4）连接产物转化BL21（DE3）感受态细胞，用两对互补链中的上游链和载体下游引物M13-47对重组质粒进行PCR鉴定，将重组质粒分别命名为pMAL-VP2-1～pMAL-VP2-96。

[0108] （5）挑取单个阳性菌落过夜培养，之后以1:100接种于10mL LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600约为0.5，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，37℃诱导表达9h，收集菌体用1mL PBS缓冲液重悬，超声波破碎菌体，并分别对其进行SDS-PAGE电泳分析，以确定短肽的表达情况（图7）。

[0109] 结果显示短肽成功表达，并且其与pMAL-c4x载体所携带的麦芽糖结合蛋白（MBP）形成融合蛋白，将该融合蛋白命名为MBP-1～MBP-96。

[0110] （6）确认短肽成功表达后，将短肽100ng/孔包被ELISA反应板进行间接ELISA检测。

[0111] 结果显示所表达的MBP-12短肽可以与BTV1-4B6发生特异性反应。进而将111 126
BTV1-4B6所识别的BTV-VP2蛋白B细胞表位初步定位于 DSMDAQPLKVGLDDQS 。

[0112] 3.B细胞表位的精确定位

[0113] 利用肽扫描技术合成如下短肽（表1），并对其进行间接ELISA检测，包被量为100ng/孔，进而精确定位B细胞表位。

[0114] 表1针对BTV-4B6所合成的短肽

[0115]

[0116] 结果显示VP2-16DS、VP2-14SQ、VP2-12MD和VP2-10DD均可以与单克隆抗体BTV1-4B6、VP2-8AL呈阳性反应，而VP2-8AL和VP2-7QL与BTV1-4B6呈阴性反应。说明VP2-8AL两端的A、L关键氨基酸，决定了表位短肽和单克隆抗体的结合效率（图8）。从而将BTV1-4B6所识别的表位精确到115AQPLKVGL122（SEQ ID NO.1所示。）。

[0117] 4.B细胞表位多肽的保守性和特异性分析

[0118] 利用National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库提供的氨基酸序列进行多序列比对，对所鉴定出的BTV1-VP2蛋白B细胞表位多肽进行保守性分析，同时将该表位多肽的氨基酸序列与其他各型BTV VP2蛋白相应区段进行比对，分析该表位多肽是否是BTV1特异性表位。由于本实验室未保存有BTV25、BTV26病毒，所以不能通过IFA鉴定BTV1-4B6是否可与BTV25、BTV26反应，故合成BTV25-VP2蛋白、BTV26-VP2蛋白相应区段的短肽（表2），按上面的方法进行间接ELISA反应，结果显示二者均与BTV1-4B6呈阴性反应（图9）。

[0119] 表2针对BTV-4B6所合成的短肽

[0120]

[0121] 序列比对结果和间接ELISA结果显示所鉴定出的BTV1-VP2蛋白B细胞表位多肽在BTV1各毒株中是保守的（图10），而且和其它各型BTV VP2蛋白相应区段的比较显示该表位多肽是BTV1所特有的（图11）。

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