用于癌症免疫疗法的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体
阅读：154发布：2020-05-16
专利汇可以提供用于癌症免疫疗法的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及嵌合 抗原 受体(CAR)，其是能够将免疫细胞特异性和对所选膜抗原的 反应性 重定向的重组嵌合 蛋白质 ，并且更具体地，其中细胞外配体结合是衍生自EGFRvIII单克隆 抗体 的scFV，赋予针对EGFRvIII阳性细胞的特异性免疫。具有此类CAR的TCR KO工程改造免疫细胞特别适用于 治疗 肺 癌、肛 门 癌和多形性胶质母细胞瘤。，下面是用于癌症免疫疗法的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体专利的具体信息内容。
1.具有选自图2所示的V1至V6的多肽结构之一的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体(EGFRvIII CAR)，所述结构包含：
-细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗EGFRvIII抗体的VH和VL和任选地接头、特别是式(G4S)n的接头，其中n为1-3，优选n＝3(SEQ ID NO.10的接头)，
-铰链，
-跨膜结构域，以及
-胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域。
2.根据权利要求1的EGFRvIII特异性CAR，其包含：
细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗EGFRvIII抗体的VH和VL以及式(G4S)3(SEQ ID NO.10的)接头，
-铰链，
-来自CD8α的跨膜结构域，以及
-胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域。
3.根据权利要求1或2的EGFRvIII特异性CAR，其不包含来自人CD28的结构域，特别是不包含来自人CD28的共刺激结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述VH和VL与选自SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.14的多肽序列具有至少80％的同一性，任选地人源化。
5.根据权利要求1至4中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述来自4-1BB的共刺激结构域与SEQ ID NO.8具有至少80％的同一性，任选地人源化。
6.根据权利要求1至5中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD3ζ信号传导结构域与SEQ ID NO.9具有至少80％的同一性，任选地人源化。
7.根据权利要求1至6中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD8α跨膜结构域与SEQ ID NO.6具有至少80％的同一性，任选地人源化。
8.根据权利要求1至7中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其还包含不特异性针对EGFRvIII的另一细胞外配体结合结构域。
9.根据权利要求1至8中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其还包含信号肽。
10.根据权利要求9的EGFRvIII特异性CAR，其中所述信号肽与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少80％的序列同一性，任选地人源化。
11.根据权利要求1至10中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V1包含FcγRIIIα铰链和CD8α跨膜结构域。
12.根据权利要求11的EGFRvIII特异性CAR，其中所述FcγRIIIα铰链与SEQ ID NO.3具有至少80％的同一性，任选地人源化。
13.根据权利要求1至10中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V3包含CD8α铰链和CD8α跨膜结构域。
14.根据权利要求13的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD8α铰链与SEQ ID NO.4具有至少80％的同一性，任选地人源化。
15.根据权利要求1至10中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V5包含IgG1铰链和CD8α跨膜结构域。
16.根据权利要求15的EGFRvIII特异性CAR，其中所述IgG1铰链与SEQ ID NO.5具有至少80％的同一性，任选地人源化。
17.根据权利要求1-10或11-12中任一项的结构V1的EGFRvIII特异性CAR，其包含与SEQ ID NO.15或与SEQ ID NO.17具有至少80％同一性的多肽序列。
18.根据权利要求1-10或13-14中任一项的结构V3的EGFRvIII特异性CAR，其与选自SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的序列具有至少80％的同一性。
19.根据权利要求1-10或15-16中任一项的结构V5的EGFRvIII特异性CAR，其与选自SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.27的序列具有至少80％的同一性。
20.根据权利要求1-10或13-14或18中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其具有来自CD8α的信号肽、铰链和TM结构域。
21.编码根据权利要求1至20中任一项的EGFRvIII特异性CAR的多核苷酸。
22.表达载体，其包含权利要求21的多核苷酸。
23.根据权利要求22的表达载体，其中所述载体是慢病毒载体，优选慢病毒载体pCLD27600。
24.工程改造免疫细胞，其在细胞表面膜处表达根据权利要求1至20中任一项的EGFRvIII特异性CAR。
25.根据权利要求24的工程改造免疫细胞，其衍生自选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞的免疫细胞，优选衍生自细胞毒性T淋巴细胞。
26.根据权利要求24的工程改造免疫细胞，其衍生自NK细胞。
27.根据权利要求24至26中任一项的工程改造细胞，其中TCR的表达被抑制。
28.根据权利要求24至27中任一项的工程改造细胞，其中至少一种MHC蛋白，优选β2m或HLA的表达被抑制。
29.根据权利要求24至28中任一项的工程改造细胞，其中所述细胞对至少一种免疫抑制或化疗药物具有耐受性。
30.根据权利要求24至29中任一项的工程改造细胞，其用于疗法以预防或治疗患者的病况。
31.根据权利要求30的用于疗法的工程改造细胞，其用于治疗特征在于表达EGFRvIII的癌细胞的恶化前或恶性癌症病况。
32.根据权利要求30至31中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其用于治疗特征在于表达EGFRvIII的癌细胞过多的病况。
33.根据权利要求30至32中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其用于疗法，其中所述病况是选自肺癌、肛门癌残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤(GBM)的癌症，优选残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤或GBM。
34.损伤癌细胞的方法，包括使所述癌细胞与有效引起所述癌细胞损伤的量的根据权利要求24-29中任一项的工程改造细胞接触。
35.工程改造免疫细胞的方法，包括：
(c)提供免疫细胞，
(d)在所述细胞的表面表达至少一种根据权利要求1至20中任一项的EGFRvIII特异性CAR。
36.权利要求35的工程改造免疫细胞的方法，包括：
(d)提供免疫细胞，
(e)将至少一种根据权利要求21的编码所述EGFRvIII特异性CAR的多核苷酸引入所述细胞，
(f)将所述多核苷酸表达到所述细胞中。
37.根据权利要求35-36中任一项的工程改造免疫细胞的方法，包括：
(d)提供免疫细胞，
(e)将至少一种编码所述EGFRvIII特异性CAR的多核苷酸引入所述细胞，
(f)引入至少一种不特异性针对EGFRvIII的其它CAR。
38.治疗有需要的受试者的方法，包括：
(c)提供根据权利要求24至29中任一项的工程改造细胞，所述工程改造细胞在表面表达EGFRvIII特异性CAR；
(d)将所述工程改造细胞给予所述患者。
39.根据权利要求38的方法，其中所述工程改造细胞使用由供体提供的免疫细胞制备。
40.根据权利要求39的方法，其中所述供体是患者，优选地所述患者将使用根据权利要求35至37中任一项工程改造的其自身的免疫细胞进行治疗。
用于癌症免疫疗法的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体
发明领域
[0001] 本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够将免疫细胞特异性和对EGFRvIII的反应性重定向的重组嵌合蛋白质，所述EGFRvIII是在人肿瘤包括胶质母细胞瘤、胶质瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌上发现的细胞表面糖蛋白。当在T细胞或NK细胞中表达时，根据本发明的CAR特别适用于治疗带有EGFRvIII抗原的恶性细胞。所得的工程改造免疫细胞对恶性细胞显示高水平的特异性，赋予免疫疗法的安全性和效率。
[0002] 发明背景
[0003] 过继免疫疗法(其涉及转移离体产生的自体抗原特异性T细胞)是很有前途的治疗病毒感染和癌症的策略。用于过继免疫疗法的T细胞可以通过扩增抗原特异性T细胞或通过遗传工程改造T细胞的重定向而产生(Park,Rosenberg等人，2011)。病毒抗原特异性T细胞的转移是已被广泛接受的用于治疗移植物相关病毒感染和罕见病毒相关恶性肿瘤的程序。类似地，肿瘤特异性T细胞的分离和转移已经显示在治疗黑素瘤中是成功的。
[0004] 通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移已成功产生了T细胞中的新特异性(Jena,Dotti等人，2010)。CAR是由与单个融合分子中的一个或多个信号传导结构域相关的靶向部分组成的合成受体。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，其包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已被成功使用。第一代CAR的信号传导结构域衍生自CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。第一代CAR已经显示成功重定向T细胞的细胞毒性。然而，它们不能在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。已经加入来自共刺激分子的信号结构域以及跨膜和铰链结构域以形成第二代和第三代的CAR，导致人类中一些成功的治疗试验，其中T细胞可以被重定向针对表达CD19的恶性细胞(June等人，2011)。然而，关于CD19ScFv使用的信号传导结构域、跨膜和共刺激结构域的特定组合是相当抗原特异性的，并且不能被扩展到任意抗原标志物。
[0005] 恶性胶质瘤是最常见和致命的脑肿瘤。然而，患有胶质母细胞瘤(最具攻击性的胶质瘤)的患者的生存率，尽管对于个体是可变的，但在最近5年由于改善了护理标准，已经从诊断后平均10个月提高至平均14个月。放射疗法几十年来对这些损伤的治疗至关重要，并且放射疗法能够将束聚焦并使其适应脑肿瘤的不规则轮廓并且使用强度调制或图像引导技术使附近关键结构的剂量最小化的能力已经得到极大改善。替莫唑胺(具有简单口服给药和有利的毒性特征的烷基化剂)与放射疗法联合使用和在放射疗法后使用。较新的外科技术(如荧光引导切除术和神经内镜方法)在恶性胶质瘤的管理中已经变得重要(Van Meir等人，2010)。
[0006] 尽管有这些进展，仍然非常需要用于胶质母细胞瘤的非侵入性疗法。特别地，需要“现成的CAR T细胞”用于治疗EGFRvIII介导的病理，特别是用于治疗肺癌、肛门癌、残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤(GBM)，优选残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤或GBM。这里，本发明人已经开发了一种有效的嵌合抗原受体，其靶向作为抗原的表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)，该抗原是在胶质母细胞瘤中(但不在正常脑组织中)独特表达的糖蛋白，在Uniprot数据库中称为P00533(由具有NCBI参考号NM-00522的基因编码)。本发明开创了通过免疫疗法、特别是使用表达CAR的T细胞治疗人类肿瘤例如胶质母细胞瘤的方法，具有显著的临床优势。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供了解决本文所述问题的以下目的：
[0009] 1.具有选自图2所示的V1至V6的多肽结构之一的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体(EGFRvIII CAR)，所述结构包含：
[0010] -细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗EGFRvIII抗体的VH和VL和任选地接头、特别是式(G4S)n的接头，其中n为1-3，优选n＝3(SEQ ID NO.10的接头)，
[0011] -铰链，
[0012] -跨膜结构域，以及
[0013] -胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域。
[0014] 2.本发明提供了根据1的EGFRvIII特异性CAR，其包含：
[0015] 细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗EGFRvIII抗体的VH和VL以及式(G4S)3(SEQ ID NO.10的)接头，
[0016] -铰链，
[0017] -来自CD8α的跨膜结构域，以及
[0018] -胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域。
[0019] 3.本发明提供了根据1或2的EGFRvIII特异性CAR，其不包含来自人CD28的结构域，特别是不包含来自人CD28的共刺激结构域。
[0020] 4.本发明提供了根据1至3中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述VH和VL与选自SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.14的多肽序列具有至少80％的同一性，任选地人源化。
[0021] 5.本发明提供了根据1至4中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述来自4-1BB的共刺激结构域与SEQ ID NO.8具有至少80％的同一性，任选地人源化。
[0022] 6.本发明提供了根据1至5中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD3ζ信号传导结构域与SEQ ID NO.9具有至少80％的同一性，任选地人源化。
[0023] 7.本发明提供了根据1至6中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD8α跨膜结构域与SEQ ID NO.6具有至少80％的同一性，任选地人源化。
[0024] 8.本发明提供了根据1至7中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其还包含不特异针对EGFRvIII的另一细胞外配体结合结构域。
[0025] 9.本发明提供了根据1至8中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其还包含信号肽。
[0026] 10.本发明提供了根据9的EGFRvIII特异性CAR，其中所述信号肽与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少80％的序列同一性，任选地人源化。
[0027] 11.本发明提供了根据1至10中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V1包含FcγRIIIα铰链和CD8α跨膜结构域。
[0028] 12.本发明提供了根据11的EGFRvIII特异性CAR，其中所述FcγRIIIα铰链与SEQ ID NO.3具有至少80％的同一性，任选地人源化。
[0029] 13.本发明提供了根据1至10中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V3包含CD8α铰链和CD8α跨膜结构域。
[0030] 14.本发明提供了根据13的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD8α铰链与SEQ ID NO.4具有至少80％的同一性，任选地人源化。
[0031] 15.本发明提供了根据1至10中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V5包含IgG1铰链和CD8α跨膜结构域。
[0032] 16.本发明提供了根据15的EGFRvIII特异性CAR，其中所述IgG1铰链与SEQ ID NO.5具有至少80％的同一性，任选地人源化。
[0033] 17.本发明提供了根据1-10或11-12中任一项的结构V1的EGFRvIII特异性CAR，其包含与SEQ ID NO.15或与SEQ ID NO.17具有至少80％同一性的多肽序列。
[0034] 18.本发明有利地提供了根据1-10或13-14中任一项的结构V3的EGFRvIII特异性CAR，其与选自SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的序列具有至少80％的同一性。
[0035] 19.本发明提供了根据1-10或15-16中任一项的结构V5的EGFRvIII特异性CAR，其与选自SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.27的序列具有至少80％的同一性。
[0036] 20.本发明提供了根据1-10或13-14或18中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其具有来自CD8α的信号肽、铰链和TM结构域。
[0037] 在一个实施方案中，如以上1至20所述的本发明的所述EGFRvIII CAR允许表达所述EGFRvIII CAR的T细胞、优选如下表达所述EGRFvIII CAR的工程改造T细胞结合EGFRvIII，优选结合表达EGFRvIII的细胞，更优选结合表达EGFRvIII的癌细胞。
[0038] 在另一个实施方案中，如以上1至20所述的本发明的所述EGFRvIII CAR允许表达所述EGFRvIII CAR的T细胞、优选如下表达所述EGRFvIII CAR的工程改造T细胞结合EGFRvIII，优选结合表达EGFRvIII的细胞，更优选结合表达EGFRvIII的癌细胞，并破坏所述表达EGFRvIII的细胞，更优选破坏表达EGFRvIII的癌细胞。
[0039] 21.本发明提供了编码根据1至20中任一项的EGFRvIII特异性CAR的多核苷酸。
[0040] 本发明提供了根据1至20中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中多肽序列不含有来自人CD28的序列。
[0041] 在具体的实施方案中，本发明的1至20的EGFRVIII CAR不包括具有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列。
[0042] 在具体的实施方案中，本发明的1至20的EGFRVIII CAR的胞内和/或跨膜结构域不包括人CD28衍生的序列，特别是没有具有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列。
[0043] 22.本发明提供了表达载体，其包含21的多核苷酸。
[0044] 23.本发明提供了根据22的表达载体，其中所述载体是慢病毒载体，优选慢病毒载体pCLD27600。
[0045] 在具体实施方案中，所述表达载体允许如上文1至20的本发明的EGFRvIII CAR的稳定表达。
[0046] 24.本发明提供了工程改造免疫细胞，其在细胞表面膜处表达根据1至20中任一项的EGFRvIII特异性CAR。
[0047] 25.本发明提供了根据24的工程改造免疫细胞，其衍生自选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞的免疫细胞，优选衍生自细胞毒性T淋巴细胞。
[0048] 本发明提供了根据24的工程改造免疫细胞，其衍生自细胞毒性T淋巴细胞。
[0049] 26.本发明提供了根据24的工程改造免疫细胞，其衍生自NK细胞。
[0050] 27.本发明提供了根据24至26中任一项的工程改造细胞，其中TCR的表达被抑制。
[0051] 28.本发明提供了根据24至27中任一项的工程改造细胞，其中至少一种MHC蛋白，优选β2m或HLA的表达被抑制。
[0052] 29.本发明提供了根据24至28中任一项的工程改造细胞，其中所述细胞对至少一种免疫抑制或化疗药物具有耐受性。
[0053] 30.本发明提供了根据24至29中任一项的工程改造细胞，其用于疗法以预防或治疗患者的病况。
[0054] 31.本发明提供了用于根据30的用于疗法的工程改造细胞，其用于治疗特征在于表达EGFRvIII的癌细胞的恶化前或恶性癌症病况。
[0055] 32.本发明提供了用于根据30至31中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其用于治疗特征在于表达EGFRvIII的癌细胞过多的病况。
[0056] 33.本发明提供了用于根据30至32中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其用于疗法，其中所述病况是选自肺癌、肛门癌、残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤(GBM)的癌症，优选残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤或GBM。
[0057] 本发明提供了用于根据30至32中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其用于疗法，其中所述病况是GBM。
[0058] 本发明提供了用于根据30至32中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其用于疗法，其中所述病况是复发性EGFRvIII+胶质瘤。
[0059] 本文还公开了本发明从24至32的工程改造细胞，其中本发明的所述EGFRvIII CAR与EGFRvIII，优选与表达EGFRvIII的细胞，更优选与表达EGFRvIII的癌细胞结合。
[0060] 优选地，根据实施方案24至32中任一项公开的本发明的工程改造细胞结合表达EGFRvIII的癌细胞，并影响表达EGFRvIII的癌细胞的存活，更优选根据本文下述实施方案所公开的本发明的工程改造细胞改善患有胶质瘤、特别是GBM的患者的存活。
[0061] 34.本发明提供了损伤癌细胞的方法，包括使所述癌细胞与有效引起所述癌细胞损伤的量的根据24-29中任一项的工程改造细胞接触。
[0062] 35.本发明提供了工程改造免疫细胞的方法，包括：
[0063] (a)提供免疫细胞，
[0064] (b)在所述细胞的表面表达至少一种根据1至20中任一项的EGFRvIII特异性CAR。
[0065] 36.本发明提供了35的工程改造免疫细胞的方法，包括：
[0066] (a)提供免疫细胞，
[0067] (b)将至少一种根据21的编码所述EGFRvIII特异性CAR的多核苷酸引入所述细胞，[0068] (c)将所述多核苷酸表达到所述细胞中。
[0069] 37.本发明提供了根据35-36中任一项的工程改造免疫细胞的方法，包括：
[0070] (a)提供免疫细胞，
[0071] (b)将至少一种编码所述EGFRvIII特异性CAR的多核苷酸引入所述细胞，
[0072] (c)引入至少一种不特异性针对EGFRvIII的其它CAR。
[0073] 38.本发明提供了治疗有需要的受试者的方法，包括：
[0074] (a)提供根据24至29中任一项的工程改造细胞，所述工程改造细胞在表面表达EGFRvIII特异性CAR；
[0075] (b)将所述工程改造细胞给予所述患者。
[0076] 39.本发明提供了根据38的方法，其中所述工程改造细胞使用由供体提供的免疫细胞制备。
[0077] 40.本发明提供了根据39的方法，其中所述供体是患者，优选地所述患者将使用根据35至37中任一项工程改造的其自身的免疫细胞进行治疗。
[0078] 本发明还提供了：
[0079] 1.包含特异性针对EGFRVIII的抗体的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，(EGFRVIII CAR)包含特异性针对EGFRVIII的抗体的抗原结合结构域、前导序列、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。
[0080] 根据1的EGFRVIII CAR，其中所述抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO：11或13的轻链可变区。
[0081] 根据1或2的EGFRVIII CAR，其中所述抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO：12或14的重链可变区。
[0082] 4.根据1-3中任一项的EGFRVIII CAR，其中所述抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO：10的接头肽。
[0083] 5.根据1-4中任一项的EGFRVIII CAR，其中所述抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO：1或2的前导序列。
[0084] 6.根据1-5中任一项的EGFRVIII CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：1的前导序列。
[0085] 7.根据1-6中任一项的EGFRVIII CAR，其还包含细胞外铰链结构域。
[0086] 8.根据1-7中任一项的EGFRVIII CAR，其中所述前导序列、细胞外铰链结构域和跨膜结构域包含来自CD8α链的序列(SEQ ID NO：6)。
[0087] 9.根据1-8中任一项的EGFRVIII CAR，其中所述细胞内T细胞信号传导结构域包含：4-1BB SEQ ID NO：8和CD3ζ(SEQ ID NO：9)，优选不包含CD28序列。
[0088] 10.一种核酸，其包含编码根据1-9中任一项的EGFRVIII CAR的核苷酸序列。
[0089] 11.一种重组表达载体，其包含10的核酸。
[0090] 12.一种分离的原代细胞，其包含11的重组表达载体。
[0091] 13.一种TCR-KO分离的原代细胞，其包含11的重组表达载体
[0092] 14.一种TCR-KO分离的原代细胞，其包含1至9的EGFRVIII CAR
[0093] 15.一种原代细胞群，其包含至少一个12、13或14的分离的原代细胞。
[0094] 16.包含1-9的EGFRVIII CAR、10的核酸、11的重组表达载体、12、13或14的分离的原代细胞、15的原代细胞群以及药学上可接受的载体的药物组合物。
[0095] 17.1-9的EGFRVIII CAR、10的核酸、11的重组表达载体、12、13或14的分离的原代细胞、15的分离的原代细胞群或16的药物组合物，其用于在宿主中治疗或预防癌症，优选患有胶质瘤、更优选胶质母细胞瘤的宿主。
[0096] 1.本发明最终提供了具有选自图2所示的V1至V4的多肽结构之一的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体(CAR)，所述结构包含细胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域以及包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域的胞质结构域，所述细胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗EGFRvIII抗体的VH和VL。
[0097] 2.根据1的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V1包含FcγRIIIα铰链和CD8α跨膜结构域。
[0098] 3.根据1的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V2包含FcγRIIIα铰链和4-1BB跨膜结构域。
[0099] 4.根据1的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V3包含CD8α铰链和CD8α跨膜结构域。
[0100] 5.根据1的EGFRvIII特异性CAR，其中所述结构V4包含CD8α铰链和4-1BB跨膜结构域。
[0101] 6.根据1至5中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述VH和VL与选自SEQ ID NO.11-14的多肽序列具有至少80％的同一性。
[0102] 7.根据1至6中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中来自4-1BB的共刺激结构域与SEQ ID NO.8具有至少80％的同一性。
[0103] 8.根据1至6中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD3ζ信号传导结构域与SEQ ID NO.9具有至少80％的同一性。
[0104] 9.根据1或2中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述FcγRIIIα铰链与SEQ ID NO.3具有至少80％的同一性。
[0105] 10.根据3或4中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD8α铰链与SEQ ID NO.4具有至少80％的同一性。
[0106] 11.根据5中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述IgG1铰链与SEQ ID NO：5具有至少80％的同一性。
[0107] 12.根据2或4中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述CD8α跨膜结构域与SEQ ID NO.6具有至少80％的同一性。
[0108] 13.根据1、3或5中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其中所述4-1BB跨膜结构域与SEQ ID NO.7具有至少80％的同一性。
[0109] 14.根据1至13中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其还包含不特异性针对EGFRvIII的另一细胞外配体结合结构域。
[0110] 15.根据2的结构V1的EGFRvIII特异性CAR，其包含与SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.17具有至少80％同一性的多肽序列。
[0111] 16.根据3的结构V2的EGFRvIII特异性CAR，其包含与SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.18具有至少80％同一性的多肽序列。
[0112] 17.根据1至16中任一项的EGFRvIII特异性CAR，其还包含信号肽。
[0113] 18.根据17的EGFRvIII特异性CAR，其中所述信号肽与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少80％的序列同一性。
[0114] 19.编码根据1至18中任一项的嵌合抗原受体的多核苷酸。
[0115] 20.一种表达载体，其包含6或7的核酸。
[0116] 21.一种工程改造的免疫细胞，其在细胞表面膜处表达根据1至18中任一项的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体。
[0117] 22.根据21的工程改造的免疫细胞，其衍生自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。
[0118] 23.根据21的工程改造的免疫细胞，其中它衍生自NK细胞。
[0119] 24.根据21至23中任一项的工程改造细胞，其用于疗法。
[0120] 25.根据21至23中任一项的工程改造细胞，其用于人类疗法。
[0121] 26.根据21至25中任一项的工程改造细胞，其用于疗法，其中所述病况是特征在于表达EGFRvIII的癌细胞的恶化前或恶性癌症病况。
[0122] 27.根据21至26中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其中所述病况是特征在于表达EGFRvIII的细胞过多的病况。
[0123] 28.根据21至27中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其中所述病况是癌症病况。
[0124] 29.根据21至28中任一项的用于疗法的工程改造细胞，其中所述癌症病况是肺癌、肛门癌或多形性胶质母细胞瘤。
[0125] 30.根据21至29中任一项的工程改造细胞，其中在所述免疫细胞中TCR的表达被抑制。
[0126] 31.根据21至30中任一项的工程改造细胞，其中在所述免疫细胞中至少一种MHC蛋白，优选β2m或HLA的表达被抑制。
[0127] 32.根据21至31中任一项的工程改造细胞，其中所述细胞被突变以赋予对至少一种免疫抑制或化疗药物的耐受性。
[0128] 33.损伤癌细胞的方法，包括使所述细胞与有效引起所述癌细胞损伤的量的根据21-32中任一项的工程改造细胞接触。
[0129] 34.工程改造免疫细胞的方法，包括：
[0130] (a)提供免疫细胞，
[0131] (b)在所述细胞的表面表达至少一种根据1至19中任一项的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体。
[0132] 35.34的工程改造免疫细胞的方法，包括：
[0133] (a)提供免疫细胞，
[0134] (b)向所述细胞中引入至少一种编码所述EGFRvIII特异性嵌合抗原受体的多核苷酸，
[0135] (c)将所述多核苷酸表达到所述细胞中。
[0136] 36.34的工程改造免疫细胞的方法，包括：
[0137] (a)提供免疫细胞，
[0138] (b)向所述细胞中引入至少一种编码所述EGFRvIII特异性嵌合抗原受体的多核苷酸，
[0139] (c)引入至少一种不特异性针对EGFRvIII的其它嵌合抗原受体。
[0140] 37.治疗有需要的受试者的方法，包括：
[0141] (a)提供在表面表达根据1至19中任一项的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体的免疫细胞；
[0142] (b)将所述免疫细胞给予所述患者。
[0143] 38.根据37所述的方法，其中所述免疫细胞由供体提供。
[0144] 39.根据37所述的方法，其中所述免疫细胞由患者自身提供。
[0145] 本发明人已经产生了具有不同结构并且包含衍生自不同EGFRvIII特异性抗体的不同scFV的EGFRvIII特异性CAR。本发明的优选CAR多肽包含选自SEQ ID NO.15-19的氨基酸序列。
[0146] 本发明更优选的CAR是具有V3或V5架构(表A和B)，甚至更优选V3架构(表A)的EGFRvIII特异性CAR，甚至更优选本发明的CAR是具有选自SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列的EGFRvIII特异性CAR，任选地人源化。
[0147] 本发明的甚至更优选的CAR是选自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO：27的人源化CAR，其中至少1个、至少2个、至少3个、至少5个、至少8个、至少10个氨基酸被改变以减少HAMA反应，同时保持与非人源化EGFRvIII CAR相似或更好的对人EGFRvIII的选择性和亲和力。
[0148] 术语“相似”是指具有0.05至0.5(n＝2)的标准偏差的非人源化CAR的亲和力。术语“改善的”是指非人源化EGFRvIII CAR的亲和力增加至少1.2倍。
[0149] 根据本发明，人源化也指与wt EGFRvIII CAR或原始EGFRvIII CAR序列具有至少80％同一性的EGFRvIII CAR。
[0150] 在体外非特异性激活(例如用抗CD3/CD28包被的珠和重组IL2)后，使用病毒转导用表达这些CAR的多核苷酸转化来自供体的T细胞。在某些情况下，T细胞被进一步工程改造以产生非同种异体反应性T细胞，更特别是通过破坏TCR(αβ-T细胞受体)的成分以防止移植物抗宿主反应。
[0151] 所得的工程改造T细胞显示出在体外对EGFRvIII阳性细胞的各种程度的反应性，表明本发明的CAR有助于T细胞的抗原依赖性激活以及增殖，使得它们可用于免疫疗法。
[0152] 所得的工程改造T细胞显示在体内对EGFRvIII阳性细胞的反应性，表明本发明的CAR有助于体内T细胞的抗原依赖性激活以及增殖，使得它们可用于免疫疗法。
[0154] 本发明的工程改造的免疫细胞特别可用于治疗应用，例如用于治疗多发性骨髓瘤。
[0155] 本发明的工程改造的免疫细胞特别可用于治疗应用，例如用于治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)(也称为胶质母细胞瘤、星形细胞瘤IV级和IV级星形细胞瘤)。优选地，癌症的特征在于表达EGFRvIII的细胞。
[0156] 此外，本文公开了本发明的具有EGFRvIII CAR构建体的工程改造免疫细胞，优选具有V3架构的EGFRvIII CAR，其中铰链结构域是来自CD8α的铰链结构域。
[0157] 本发明的工程改造免疫细胞可以具有组合来自CD8与也来自CD8α信号肽的铰链和/或跨膜区的EGFRvIII CAR构建体。
[0159] 图1：根据本发明的工程改造免疫细胞的示意图。该图中呈现的工程改造免疫细胞是用编码CAR的逆转录病毒多肽转导的T细胞。该T细胞被进一步工程改造以允许更好和更安全地植入患者，这在本发明的框架内是可选的。X基因可以是例如表达TCR的成分(TCRα或TCRβ)的基因，Y可以是涉及T细胞对免疫抑制药物如CD52(关于Campath)或HPRT(关于6-硫鸟嘌呤)的敏感性。
[0160] 图2：不同CAR架构(V1至V4)和V5至V6的示意图。
[0161] 图3：EGFRvIII CAR构建体的示意图。
[0162] 图4：用于产生CAR mRNA的主链。
[0163] 图5：用于产生CAR慢病毒载体的主链。
[0164] 图6：通过FACS分析的原代T细胞中的EGFRvIII CAR表达
[0165] 图7：通过蛋白质印迹表征过表达EGFRVI或EGFRVIII蛋白的U87胶质瘤细胞。
[0166] 图8：与靶细胞共培养后通过FACS分析评估的EGFRvIII CAR T脱颗粒能力。
[0167] 图9：本发明的EGFRvIII CART细胞的细胞毒性测定。
[0168] 表1：本发明的不同EGFRvIII CAR组分的序列
[0169]
[0170] 表2：不同特异性CAR组分的序列
[0171]
[0172] 表3：V-1的CAR结构
[0173]
[0174] 表4：V-2的CAR结构
[0175]
[0176] 表5：V-3的CAR结构
[0177]
[0178] 表6：V-5的CAR结构
[0179]
[0180] 本发明的CAR任选包含在VH和VL之间或在VL和VH之间的接头，优选其中n＝1-3、有利地n＝3的序列(G4S)n的接头
[0181] 发明详述
[0182] 除非本文具体定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与基因疗法、生物化学、遗传学和分子生物学领域的技术人员通常理解的相同的含义。
[0183] 与本文所述的方法和材料类似或等同的所有方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，其中合适的方法和材料在本文中描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，除非另有说明，否则材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意在限制。
[0184] 除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这样的技术在文献中被充分解释。参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,(Sambrook等人,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Mullis等人，美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins编辑，1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；
Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；Methods In ENZYMOLOGY系列(J.Abelson和M.Simon,主编,Academic Press,Inc.,New York),特别是Vol.154和155(Wu等人编辑)以及Vol.185,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,编辑)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；
Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker,编辑,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编辑,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；Methods In ENZYMOLOGY系列(J.Abelson和M.Simon,主编,Academic Press,Inc.,New York),特别是Vol.154和155(Wu等人编辑)以及Vol.185,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,编辑)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；
Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker,编辑,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编辑,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
[0185] 表A：EGFRvIII CAR V-3的一般结构
[0186]
[0187] *任选包含在VH和VL之间或在VL和VH之间的接头，优选序列(G4S)3的接头
[0188] 表B：EGFRvIIICAR V-5的一般结构
[0189]
[0190] *任选包含在VH和VL之间或在VL和VH之间的接头，优选序列(G4S)3的接头
[0191] EGFRvIII特异性嵌合抗原受体
[0192] 本发明涉及包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域的抗EGFRvIII嵌合抗原受体(CAR或EGFRvIII CAR或抗EGFRvIII CAR)的新设计。
[0193] 一般来说，术语“包含”包括“在于”，在优选实施方案中，“包含”是指“在于”，[0194] 在本发明的每个实施方案中，术语“包含”可以意味着在于。
[0195] 本文使用的术语“细胞外配体结合结构域”定义为能够结合配体的寡核苷酸或多肽。优选地，该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择细胞外配体结合结构域以识别作为与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。在优选的实施方案中，所述胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗EGFRvIII抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变片段。所述VL和VH优选选自表2中所示的称为139和MR1的抗体。它们优选通过包含例如序列SEQ ID NO.10的柔性接头连接在一起。换句话说，所述CAR优选包含细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含与选自SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14的氨基酸序列显示至少90％、95％、97％或99％的同一性的多肽序列。
[0196] 根据本发明的CAR的信号转导结构域或细胞内信号传导结构域负责细胞外配体结合结构域与靶标结合后的细胞内信号传导，其导致免疫细胞的激活和免疫应答。换句话说，信号转导结构域负责其中表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的激活。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助T细胞活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“信号转导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子信号功能信号并指导细胞进行专门的功能。
[0197] 用于CAR中的信号转导结构域的优选实例可以是T细胞受体和协同受体(其协同作用以在抗原受体啮合后起始信号转导)的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能能力的合成序列。信号转导结构域包含两种不同类型的胞质信号序列，起始抗原依赖性初级激活的那些胞质信号序列，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些胞质信号序列。初级胞质信号序列可以包含已知为ITAM的基于免疫受体酪氨酸的激活基序的信号传导基序。ITAM是在作为syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的多种受体的胞质内尾部中发现的明确定义的信号传导基序。本发明中使用的ITAM的实例可包括来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些非限制性实例。在优选的实施方案中，CAR的信号转导结构域可以包含与选自(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
[0198] 在更优选的实施方案中，本发明的EGFRvIII CAR的胞质内结构域不包括来自人CD28的任何序列或不包含衍生自人CD28的序列
[0199] 在甚至更优选的实施方案中，EGFRvIII CAR的信号传导结构域包含与SEQ ID NO：9具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选95％、97％、99％或100％序列同一性的CD3ζ信号传导结构域并且不包括来自CD28信号传导结构域的任何序列。在具体实施方案中，本发明的CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子。共刺激分子是有效免疫应答所需的除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。“共刺激配体”是指抗原呈递细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了通过例如结合具有负载肽的MHC分子的TCR/CD3复合物的介导T细胞应答(包括但不限于增殖激活、分化等)的初级信号之外的信号。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、
4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还特别包括特异性结合存在于T细胞上的共刺激分子的抗体，例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。
4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还特别包括特异性结合存在于T细胞上的共刺激分子的抗体，例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。
[0200] “共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合的T细胞上的同源结合伴侣，从而介导细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
[0201] 在优选的实施方案中，本发明的CAR的信号转导结构域包含选自4-1BB(GenBank：AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)的片段的共刺激信号分子的一部分。特别地，本发明的CAR的信号转导结构域包含与选自SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少70％、优选至少
80％、更优选至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。
80％、更优选至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。
[0202] 在优选的实施方案中，本发明的EGFRvIII CAR的信号转导结构域包含来自4 1BB的共刺激信号分子，并且不包括来自人CD28的任何共刺激信号分子。
[0203] 根据本发明的CAR在细胞的表面膜上表达。因此，这样的CAR进一步包含跨膜结构域。合适的跨膜结构域的区别特征包括在细胞(在本发明中优选免疫细胞，特别是淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞)表面表达的能力，以及一起相互作用以指导免疫细胞对预定靶细胞的细胞反应的能力。跨膜结构域可以衍生自天然来源或衍生自合成来源。跨膜结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白质。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚单位例如α、β、γ或δ，构成CD3复合物的多肽，IL2受体p55(α链)，p75(β链)或γ链，Fc受体的亚单位链，特别是Fcγ受体III或CD蛋白。或者，跨膜结构域可以是合成的，并且可以主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在优选的实施方案中，所述跨膜结构域衍生自人CD8α链(例如NP_001139345.1)
[0204] 在优选的实施方案中，本发明的EGFRvIII CAR的TM结构域衍生自CD8α链(例如NP_001139345.1)
[0205] 跨膜结构域还可以包含所述细胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。本文使用的术语“铰链区”通常是指起作用以将跨膜结构域连接到细胞外配体结合结构域的任何寡肽或多肽。特别地，铰链区用于为细胞外配体结合结构域提供更大的柔性和可接近性。铰链区可以包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。铰链区可以衍生自天然存在的分子的全部或部分，例如来自CD8、CD4或CD28的细胞外区的全部或部分，或衍生自抗体恒定区的全部或部分。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方案中，所述铰链结构域包含人CD8α链、FcγRIIIα受体或IgG1的部分，在本说明书中分别称为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，或与这些多肽显示优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％序列同一性的铰链多肽。
[0206] 在优选的实施方案中，本发明的EGFRvIII CAR包含来自SEQ ID NO.4的CD8α的铰链、来自CD8α的TM结构域和来自CD8α的肽信号。
[0207] 在更优选的实施方案中，本发明的EGFRvIII CAR包含与SEQ ID NO.4显示优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的CD8α铰链、来自CD8α的TM结构域和来自CD8α的肽信号。
[0208] 根据本发明的car通常还包含更特别地选自CD8α和4-1BB的跨膜结构域(TM)，其显示与SEQ ID NO.6或7的多肽的同一性。
[0209] 优选地，根据本发明的EGFRvIII CAR包含与SEQ ID NO.6的多肽显示至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的TM。
[0210] 本文还公开了本发明的EGFRvIII CAR构建体，其中铰链区是来自CD8α的铰链区。例如，本发明的CAR构建体可以将衍生自CD8α的铰链区与衍生自CD8α的信号肽和/或也衍生自CD8α的跨膜区组合。
[0211] 在优选的实施方案中，本发明的EGFRvIII CAR构建体可以将来自CD8α的铰链区与来自CD8α的信号肽和也衍生自CD8α的跨膜区组合。
[0212] 在甚至更优选的实施方案中，本发明的CAR构建体可以将来自CD8α的铰链区与来自CD8α的信号肽和也衍生自CD8α的跨膜区组合，并不包括来自CD28信号传导结构域的任何序列。
[0213] 靶抗原的下调或突变通常在癌细胞中观察到，产生抗原-丢失逃逸变体。因此，为了抵消肿瘤逃逸并使免疫细胞对靶标更具特异性，根据本发明的EGFRvIII特异性CAR可以包含另一细胞外配体结合结构域，以同时结合靶标中的不同元件，从而增强免疫细胞的激活和功能。在一个实施方案中，细胞外配体结合结构域可以串联放置在相同的跨膜多肽上，并且任选地可以通过接头分开。
[0214] 在另一个实施方案中，所述不同的细胞外配体结合结构域可以置于构成CAR的不同跨膜多肽上。
[0215] 在另一个实施方案中，本发明涉及每一个包含不同细胞外配体结合结构域的CAR群体。具体地，本发明涉及工程改造免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞并在所述细胞的表面表达CAR群体，每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。在另一个具体实施方案中，本发明涉及工程改造免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞并将编码包含CAR群体的多肽的多核苷酸引入所述细胞中，每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。CAR群体意指至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个CAR，每一个CAR包含不同的细胞外配体结合结构域。根据本发明的不同的细胞外配体结合结构域可以优选同时结合靶中不同的元件，从而增强免疫细胞的激活和功能。本发明还涉及分离的免疫细胞，其包含CAR群体，每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。
[0216] 本发明提供了EGFRVIII特异性嵌合抗原受体(EGFRVIII CAR)，其包含：
[0217] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结合结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结合结构域是单链可变片段(scFv)。
[0218] -铰链，
[0219] -跨膜结构域，
[0220] -来自人4-1BB的共刺激信号分子，以及
[0221] 包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0222] 在一个实施方案中，本发明的EGFRVIII CAR没有来自人CD28的序列。
[0223] 在优选的实施方案中，本发明的EGFRVIII CAR不包括CD28衍生的序列，特别是没有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列。
[0224] 在更优选的实施方案中，本发明的EGFRVIII CAR的胞质内和/或跨膜结构域不包括人CD28衍生的序列，特别是没有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列。
[0225] 本发明的EGFRVIII CAR包含：
[0226] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结合结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结合结构域是单链可变片段(scFv)
[0227] -铰链，
[0228] -跨膜结构域，
[0229] -来自人4-1BB的共刺激信号分子，
[0230] -包含人CD3ζ信号传导结构域且无人CD28信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0231] 在优选的实施方案中，本发明的EGFRVIII CAR不含有来自CD28的任何序列，并且包含来自CD8α的信号肽(或前导序列)、TM结构域和铰链。
[0232] 在一个实施方案中，本发明的EGFRVIII CAR包含来自人CD8α(SEQ ID NO.1)的前导序列或与SEQ ID NO.1具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％的同一性，优选与SEQ ID NO.1具有100％的同一性。
[0233] 在另一个实施方案中，本发明的EGFRVIII CAR包含SEQ ID NO.2的前导序列或与SEQ ID NO.2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％的同一性，优选与SEQ ID NO.2具有100％的同一性。
[0234] 在一个实施方案中，本发明提供了EGFRVIII特异性嵌合抗原受体(EGFRVIII CAR)，其包含：
[0235] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结构域是单链可变片段(scFv)
[0236] -来自人CD8α链的铰链(来自CD8α)
[0237] -来自人CD8α的跨膜结构域
[0238] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0239] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0240] 本发明提供了EGFRVIII特异性嵌合抗原受体(EGFRVIII CAR)，其包含：
[0241] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结构域是单链可变片段(scFv)。
[0242] -来自人IgG1的铰链
[0243] -来自人CD8α的跨膜结构域
[0244] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0245] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0246] 本发明包括具有SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的信号肽的本发明的EGFRVIII CAR。
[0247] 在本发明中，scfv是特异性针对EGFRVIII的免疫球蛋白的重链(VH结构域)和轻链(VL结构域)的可变区的融合蛋白(或VL结构域与VH结构域的融合蛋白)，优选与4至25个氨基酸的短接头肽、更优选SEQ ID NO.10连接。
[0248] 本发明的scfv衍生自特异性针对EGFRVIII的抗体，其包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域，所述VH和/或VL结构域一起有助于结合EGFRVIII。
[0249] 在一个实施方案中，本发明的所述scfv还包含前导序列(或信号肽)，优选所述前导序列与VH结构域连接。
[0250] 其中所述前导序列与VL结构域连接的实施方案是本发明的一部分。
[0251] 优选地，所述前导序列具有SEQ ID NO.1或2的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
[0252] 在一个实施方案中，VH结构域与铰链连接，在另一个实施方案中，VL结构域与所述铰链连接。
[0253] 本发明提供了与具有不同长度的优选来自CD8α、IgG1或FCRIII(参见图2)的铰链、更优选来自CD8α的铰链、甚至更优选具有SEQ ID NO.4的铰链连接的抗EGFRVII scfv。
[0254] 优选地，本发明提供了一种EGFRVIII CAR，其包含：
[0255] -信号肽，优选来自CD8α的信号肽，更优选SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的来自CD8α的信号肽。
[0256] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，
[0257] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0258] -来自CD8α的跨膜结构域(TM)
[0259] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0260] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0261] 更优选地，本发明提供了一种EGFRVIII CAR，其包含：
[0262] -来自人CD8α的信号肽，
[0263] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，
[0264] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0265] -来自CD8α的跨膜结构域(TM)
[0266] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0267] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0268] 甚至更优选地，本发明提供了EGFRVIII CAR，其包含：
[0269] -来自人CD8α的信号肽，
[0270] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，并且所述VH和VL结构域是人源化的
[0271] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0272] -来自人CD8α的跨膜结构域(TM)
[0273] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0274] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0275] 甚至更优选地，本发明的EGFRVIII CAR包含：
[0276] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0277] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，
[0278] -CD8α铰链
[0279] -CD8αTM
[0280] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0281] -细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0282] 甚至更优选地，本发明的EGFRVIII CAR包含：
[0283] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0284] -包含VL、接头和VH的抗EGFRVIII的scfv，
[0285] -CD8α铰链
[0286] -CD8αTM
[0287] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0288] -细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0289] 甚至更优选地，本发明的EGFRVIII CAR包含：
[0290] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0291] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，
[0292] -CD8α铰链
[0293] -CD8αTM
[0294] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0295] -细胞内CD3ζ信号传导结构域
[0296] 在一个实施方案中，所述接头是式(G4S)n的接头，其中n是1至3；优选n＝3且所述序列是(G4S)3，更优选SEQ ID NO.10的接头。
[0297] 本发明的一种EGFRVIII CAR在于：
[0298] -人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0299] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0300] -人CD8α铰链
[0301] -人CD8αTM
[0302] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0303] -细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0304] 在一个实施方案中，本发明提供了：
[0305] EGFRVIII CAR，其包含：
[0306] -SEQ ID NO.1的人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)。
[0307] -包含SEQ ID NO.11的VH、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO 12的VL或SEQ ID NO.13的VH、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO 14的VL的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0308] -SEQ ID NO.4的人CD8α铰链，
[0309] -SEQ ID NO.6的人CD8αTM
[0310] -SEQ ID NO.8的来自4-1BB的共刺激信号分子
[0311] -SEQ ID NO.9的细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0312] 在一个实施方案中，本发明提供了：
[0313] EGFRVIII CAR，其包含：
[0314] -SEQ ID NO.1的人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)。
[0315] 包含SEQ ID NO.12的VL、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO 11的VH或SEQ ID NO 14的VL、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO.13的VH的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0316] -SEQ ID NO.4的人CD8α铰链，
[0317] -SEQ ID NO.6的人CD8αTM
[0318] -SEQ ID NO.8的来自4-1BB的共刺激信号分子
[0319] -SEQ ID NO.9的细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0320] 在一个实施方案中，本发明提供了EGFRVIII特异性嵌合抗原受体(EGFRVIII CAR)，其包含：
[0321] -具有与SEQ ID NO.1或2的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的信号肽；优选地，信号肽具有与SEQ ID NO 1的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0322] -通过接头与VL结构域分开的VH结构域，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII；所述接头与SEQ ID NO 10的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0323] 所述VH结构域与SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性
[0324] 所述VL结构域与SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 14的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0325] -衍生自人CD8α链的铰链，其具有与SEQ ID NO.4的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0326] -衍生自CD8α的跨膜结构域，其具有与SEQ ID NO.6的多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％同一性的氨基酸序列；
[0327] -衍生自人4-1BB(或4-1BB细胞内结构域)的共刺激信号分子，其具有与选自SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0328] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其具有与选自SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0329] 在优选的实施方案中，本发明的EGFRVIII特异性嵌合抗原受体(EGFRVIII CAR)不包含来自CD28或来自人CD28、特别是来自人CD28内部信号传导结构域的任何序列。在更优选的实施方案中，本发明的EGFRVIII特异性嵌合抗原受体(EGFRVIII CAR)不包含来自人CD28、特别是来自人CD28内部信号传导结构域的任何序列，并且还含有来自CD8α的信号肽，优选融合至特异性针对EGFRVIII的scfv的VH结构域。
[0330] 在一个实施方案中，本发明提供SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR。
[0331] 在一个实施方案中，本发明提供SEQ ID NO.25的EGFRVIII CAR。
[0332] 在一个实施方案中，本发明提供SEQ ID NO.26的EGFRVIII CAR。
[0333] 在一个实施方案中，本发明提供SEQ ID NO.27的EGFRVIII CAR。
[0334] 在优选的实施方案中，本发明提供SEQ ID NO.°24或SEQ ID NO.25的EGFRVIII CAR，更优选SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR。
[0335] 在一个实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0336] 在一个实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°25的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0337] 在一个实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°26的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0338] 在一个实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°27的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0339] 在一个方面，本发明的EGFRVIII CAR的抗EGFRvIII结合结构域是人源化抗EGFRvIII结合结构域。
[0340] 本发明的任何抗EGFRvIII CAR可以是具有氨基酸修饰的人源化抗EGFRvIII结合结构域，所述氨基酸修饰不显著影响或改变CAR的结合特征和/或不显著影响含有修饰的氨基酸序列的CAR T细胞的活性并减少或消除人抗小鼠抗体(HAMA)反应。
[0341] “人源化”意指不显著影响或改变CAR的结合特征和/或不显著影响含有修饰的氨基酸序列的CAR T细胞的活性并减少或消除人抗小鼠抗体(HAMA)反应。
[0342] “人源化”意指可以显著改善CAR的结合特征(亲和力亲合力)和/或不显著影响含有修饰的氨基酸序列的CAR T细胞的活性并减少或消除人抗小鼠抗体(HAMA)反应。
[0343] 这样的保守修饰包括在所述CAR和/或所述CAR分子的任何其它部分中所述抗体片段中的氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变、PCR介导的诱变)或通过使用优化的种系序列，将修饰引入抗体、引入抗体片段或本发明的CAR分子的任何其他部分。
[0344] 术语“保守序列修饰”或“氨基酸改变”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变、PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的CAR。
因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的CAR。
[0345] 在优选的实施方案中，本发明提供了与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有保守序列修饰(或氨基酸序列改变)的EGFRVIII CAR。
[0346] 在优选的实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有2个氨基酸改变的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0347] 在优选的实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有3个氨基酸改变的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0348] 在优选的实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有4个氨基酸改变的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0349] 在优选的实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有5个氨基酸改变的氨基酸序列的EGFRVIII CAR。
[0350] 在更优选的实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有5个氨基酸改变的氨基酸序列的EGFRVIII CAR，并且SEQ ID N°24中的所有CDR是保守的。
[0351] 在更优选的实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有1-15个氨基酸改变的氨基酸序列的EGFRVIII CAR，并且SEQ ID N°24中的所有CDR是保守的。
[0352] 在一个优选的实施方案中，本发明的EGFRVIII CAR序列通过改变至少1个氨基酸(与SEQ ID NO 24相比，2-15个氨基酸)以减少HAMA(人抗小鼠反应)而被修饰，而不改变所述CAR与其靶标(EGFRVIII)的结合能力。在一个实施方案中，所述结合可以得到改善。
[0353] 在优选的实施方案中，本发明提供了具有与SEQ ID N°24的多肽的氨基酸序列相比具有至少1个氨基酸改变的氨基酸序列的EGFRVIII CAR，所述至少1个氨基酸改变没有影响或改善所述EGFRVIII CAR在原代T细胞中的结合和/或活性。
[0354] 本发明还提供与本发明的EGFRVIII CAR有关的相关核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体和药物组合物。
[0355] 本文还公开了本发明的EGFRVIII CAR构建体，其中当铰链组合CD8α的TM结构域和信号肽时，与不结合这些结构元件和技术特征的先前CAR构建体相比，赋予所述EGFRVIII CAR对表达EGFRVIII的细胞更好的亲和力和选择性(如图9所示)。优选地，本发明的对表达EGFRVIII的细胞具有更好的亲和力和选择性的EGFRVIII CAR构建体组合了V3架构的技术特征，更优选地，本发明的对表达EGFRVIII的细胞具有更好的亲和力和选择性的EGFRVIII CAR构建体具有与SEQ ID NO.24具有至少80％同一性的序列并且是人源化的。
[0356] 本文还公开了本发明的EGFRVIII CAR构建体，其中与未组合这些结构元件和技术特征的在先CAR构建体相比，所述结构赋予所述EGFRVIII CAR对表达EGFRVIII的细胞更好的亲和力和选择性(如图9所示)。
[0357] 优选地，本发明的对表达EGFRVIII的细胞具有更好的亲和力和选择性的EGFRVIII CAR构建体组合V3架构的技术特征，更优选地，本发明的对表达EGFRVIII的细胞具有更好的亲和力和选择性的EGFRVIII CAR构建体具有与SEQ ID NO.24具有至少80％同一性的序列并且是人源化的。
[0358] 多核苷酸、载体：
[0359] 本发明还涉及编码根据本发明的上述CAR的多核苷酸、载体。
[0361] 在具体实施方案中，不同的核酸序列可以包括在一个多核苷酸或载体中，其包含编码核糖体跳跃序列的核酸序列，例如编码2A肽的序列。在小RNA病毒的口蹄疫病毒亚群中鉴定的2A肽导致从一个密码子到下一个密码子的核糖体“跳跃”，而在由密码子编码的两个氨基酸之间不形成肽键(参见(Donnelly和Elliott 2001；Atkins，Wills等人，2007；Doronina，Wu等人，2008))。“密码子”是指通过核糖体翻译成一个氨基酸残基的mRNA(或DNA分子的有义链)上的三个核苷酸。因此，当多肽被框内的2A寡肽序列分开时，可以从mRNA内的单一连续开放阅读框合成两种多肽。这样的核糖体跳跃机制在本领域中是众所周知的，并且已知由几种载体用于表达由单一信使RNA编码的几种蛋白质。
[0362] 允许本发明的EGFRVIII CAR在细胞中表达的载体是本发明的另一个目的。在优选的实施方案中，所述载体允许本发明的EGFRVIII CAR的瞬时表达。在更优选的实施方案中，所述载体通过将所述序列插入细胞的基因组而允许本发明的EGFRVIII CAR的组成型和稳定表达。可以控制本发明的EGFRVIII CAR的表达和/或表达本发明的EGFRVIII CAR的细胞的存活。
[0363] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码本发明的EGFRVIII CAR的序列的载体。
[0364] 在优选的实施方案中，本发明提供了包含选自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的编码本发明的EGFRVIII CAR的序列的载体。
[0365] 在更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码本发明的CAR的序列的pCLS 9632载体(如图4所示)。
[0366] 在更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码选自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的序列的pCLS 9632载体(如图4所示)。
[0367] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.25的CAR 的序列的pCLS 9632载体(如图4所示)。
[0368] 在更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.27的CAR的序列的pCLS 9632载体(如图4所示)。
[0369] 在更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.26的CAR的序列的pCLS 9632载体(如图4所示)。
[0370] 在甚至更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.24的CAR的序列的pCLS 9632载体(如图4所示)。
[0371] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的CAR的pCLS 26700载体(如图5所示)。
[0372] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码选自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的CAR的CAR序列的pCLS 26700载体(如图5所示)，所述CAR任选地人源化。
[0373] 在另一个更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.24的CAR的序列的pCLS 26700载体(如图5所示)。在另一个更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.25的CAR的序列的pCLS 26700载体(如图5所示)。
[0374] 在另一个更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.26的CAR的序列的pCLS 26700载体(如图5所示)。
[0375] 在另一个更优选的实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO.27的CAR的序列的pCLS 26700载体(如图5所示)。
[0376] 为了将跨膜多肽导入宿主细胞的分泌途径，在多核苷酸序列或载体序列中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列(prepro sequence)或前序列(pre sequence))。分泌信号序列可操作地连接于跨膜核酸序列，即两个序列以正确的阅读框连接并定位以将新合成的多肽导入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码目标多肽的核酸序列的5'端，尽管某些分泌信号序列可以位于目标核酸序列中的别处(参见例如Welch等人，美国专利号5,037,743；Holland等人，美国专利号5,143,830)。在优选的实施方案中，信号肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1和2。
[0377] 在一个更优选的实施方案中，本发明的CAR的信号肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[0378] 本领域技术人员将认识到，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能存在相当大的序列变异。优选地，本发明的核酸序列对于在哺乳动物细胞中表达是密码子优化的，优选用于在人细胞中表达。密码子优化是指在给定物种的高度表达的基因中通常罕见的密码子与在在此类物种的高度表达的基因中通常频繁出现的密码子的交换，此类编码氨基酸的密码子作为被交换的密码子。
[0379] 工程改造免疫细胞的方法：
[0380] 本发明包括制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法，包括向所述免疫细胞离体导入编码如前所述的EGFRvIII CAR之一的多核苷酸或载体。
[0381] 本发明还包括原代免疫细胞，其包含具有编码本发明EGFRvIII CAR之一的多核苷酸或慢病毒载体的免疫细胞，优选用于免疫疗法，更优选癌症的更多治疗。
[0382] 本发明的原代免疫细胞包含本发明的对表达EGFRVIII的癌细胞具有更好的亲和力和选择性的EGFRVIII CAR构建体。
[0383] 在优选的实施方案中，鉴于在免疫细胞中稳定表达，所述多核苷酸包括在慢病毒载体中(优选如图5所示)。
[0384] 根据另外的实施方案，所述方法还包括对所述细胞进行遗传修饰的步骤，以使其更适合于同种异体移植。
[0385] 根据第一方面，免疫细胞可以例如通过灭活至少一种表达T细胞受体(TCR)的一种或多种成分的基因而制成同种异体的，如WO 2013/176915中所述，其可以与失活编码或调节HLA或β2m蛋白表达的基因组合。因此，移植物抗宿主综合征和移植排斥的风险显著降低。
[0386] 根据另一方面，可以进一步遗传工程改造免疫细胞以改善其对用作治疗EGFRvIII阳性恶性细胞的标准护理的免疫抑制药物或化疗治疗的耐受性。例如，作为Campath(阿仑单抗(alemtuzumab))和糖皮质激素治疗的药物靶标的CD52和糖皮质激素受体(GR)可以被灭活以使细胞对这些治疗有耐受性，并且给予它们相对于未被赋予特异性EGFRvIII CAR的患者自身T细胞的竞争优势。CD3基因的表达也可以被抑制或降低以赋予对另一种免疫抑制药物替利珠单抗(Teplizumab)的耐受性。根据本发明，HPRT的表达也可以被抑制或降低以赋予对6-硫鸟嘌呤(一种通常用于化疗、特别是用于治疗急性淋巴母细胞白血病的细胞生长抑制剂)的耐受性。
[0387] 根据本发明的另一方面，可以通过灭活编码用作“免疫检查点”的蛋白质的基因来进一步操作免疫细胞以使它们更具活性或限制耗尽，所述“免疫检查点”充当T细胞激活的调节剂，例如PDCD1或CTLA-4。可以降低或抑制其表达的基因的实例示于表9中。
[0388] 表9：编码免疫检查点蛋白质的基因列表。
[0389]
[0390]
[0391] 在优选的实施方案中，所述进一步工程改造免疫细胞的方法包括向所述T细胞中导入编码特异性稀有切割的内切核酸酶的多核苷酸、特别是mRNA，以通过DNA切割选择性失活如上所述的基因。在更优选的实施方案中，所述稀有切割的内切核酸酶是TALE-核酸酶或Cas9内切核酸酶。迄今为止已经证明TAL-核酸酶比其他类型的稀有切割的内切核酸酶具有更高的特异性和切割效率，使得它们是用于以大规模产生具有恒定转换的工程改造免疫细胞的内切核酸酶的选择。
[0392] 递送方法
[0393] 上述不同的方法涉及将CAR导入细胞。作为非限制性实例，所述CAR可作为由一个质粒载体编码的转基因导入。所述质粒载体还可以含有选择标志物，其提供用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞。
[0394] 由于将编码所述多肽的多核苷酸导入细胞中，可以在细胞中原位合成多肽。或者，所述多肽可在细胞外产生，然后导入其中。将多核苷酸构建体导入细胞的方法是本领域已知的，并且包括作为非限制性实例的稳定转化方法(其中多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中)、瞬时转化方法(其中多核苷酸构建体不整合到细胞的基因组中)和病毒介导的方法。所述多核苷酸可以通过例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等导入细胞。例如，瞬时转化方法包括例如显微注射、电穿孔或粒子轰击。考虑到在细胞中表达，所述多核苷酸可以包括在载体中，更具体地包括质粒或病毒。
[0395] 工程改造免疫细胞
[0396] 具有本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫细胞(或工程改造免疫细胞)是本发明的另一个目的。优选地，所述细胞是原代T细胞，更优选具有针对表达EGFRVIII的细胞的CTL活性的原代T细胞，导致表达EGFRVIII的细胞的破坏。
[0397] 优选地，所述原代T细胞具有SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR。
[0398] 优选地，所述原代T细胞具有SEQ ID NO.25的EGFRVIII CAR。
[0399] 优选地，所述原代T细胞具有SEQ ID NO.26的EGFRVIII CAR。
[0400] 优选地，所述原代T细胞具有SEQ ID NO.27的EGFRVIII CAR，更优选地，优选地，所述原代T细胞具有SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR，任选地人源化。
[0401] 本发明提供了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代T细胞，其对表达EGFRVIII的细胞、优选对表达EGFRVIII的癌细胞表现出CTL和/或脱颗粒活性，优选所述原始T细胞对表达EGFRVIII的细胞、优选对表达EGFRVIII的癌细胞表现出CTL和/或脱颗粒活性，具有SEQ ID NO.27的EGFRVIII CAR，更优选地，所述原代T细胞具有SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR，任选地人源化。
[0402] 本发明还提供了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代T细胞，其用于裂解表达EGFRVIII的细胞、特别是表达EGFRVIII的肿瘤细胞。
[0403] 本文还公开了表达本发明的EGFRVIII CAR且对EGFRVIII表达细胞、优选对表达EGFRVIII的癌细胞表现出CTL和/或脱颗粒活性的原代T细胞。
[0404] 本文还公开了表达本发明的EGFRVIII CAR且对EGFRVIII表达细胞、优选对表达EGFRVIII的癌细胞表现出CTL和/或脱颗粒活性的原代T细胞。
[0405] 还提供了以下额外和具体的主题：
[0406] 表达EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞，其包含：
[0407] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结合结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结合结构域是单链可变片段(scFv)。
[0408] -铰链，
[0409] -跨膜结构域，
[0410] -来自人4-1BB的共刺激信号分子，以及
[0411] 包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0412] 在一个实施方案中，在本发明的原代免疫T细胞中表达的EGFRVIII CAR没有来自人CD28的序列。
[0413] 在优选的实施方案中，本发明的原代免疫T细胞表达EGFRVIII CAR，其不包含CD28衍生的序列，特别是不具有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列。
[0414] 在更优选的实施方案中，在本发明的原代免疫T细胞中的本发明的EGFRVIII CAR的胞质内和/或跨膜结构域不包括人CD28衍生的序列，特别是不具有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列。
[0415] 本发明的原代免疫T细胞表达EGFRVIII CAR，其包含：
[0416] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结合结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结合结构域是单链可变片段(scFv)
[0417] -铰链，
[0418] -跨膜结构域，
[0419] -来自人4-1BB的共刺激信号分子，
[0420] -在于人CD3ζ信号传导结构域且无人CD28信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0421] 在优选的实施方案中，本发明的原代免疫T细胞表达EGFRVIII CAR，其：不包含来自CD28的序列，并且包含来自CD8α的信号肽(前导序列)、TM结构域和的铰链。
[0422] 在一个实施方案中，本发明的原代免疫T细胞表达包含来自人CD8α的前导序列(SEQ ID NO.1)或与SEQ ID NO.1具有至少95％同一性的前导序列、优选SEQ ID NO.1的前导序列的EGFRVIII CAR。
[0423] 在另一个实施方案中，本发明的原代免疫T细胞表达包含SEQ ID NO.2的前导序列或与SEQ ID NO.2具有至少95％同一性的前导序列的EGFRVIII CAR。
[0424] 在一个实施方案中，本发明的原代免疫T细胞表达EGFRVIII CAR，其包含：
[0425] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结构域是单链可变片段(scFv)
[0426] -来自人CD8α链的铰链(来自CD8α)
[0427] -来自人CD8α的跨膜结构域
[0428] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0429] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0430] 在一个实施方案中，本发明的原代免疫T细胞表达EGFRVIII CAR，其包含：
[0431] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结构域是单链可变片段(scFv)。
[0432] -来自人IgG1的铰链
[0433] -来自人CD8α的跨膜结构域
[0434] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0435] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0436] 本发明包括表达包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的信号肽的EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞。
[0437] 本发明提供了表达包含抗EGFRVII的scFv的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述scfv连接到铰链，优选来自CD8α、IgG1或FCRIII的铰链(参见图2)，更优选来自CD8α的铰链，甚至更优选具有SEQ ID NO.4的铰链。
[0438] 优选地，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0439] -信号肽，优选来自CD8α的信号肽，更优选SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的来自CD8α的信号肽。
[0440] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，
[0441] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0442] -来自CD8α的跨膜结构域(TM)
[0443] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0444] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0445] 更优选地，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0446]
[0447] -来自人CD8α的信号肽，
[0448] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，
[0449] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0450] -来自CD8α的跨膜结构域(TM)
[0451] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0452] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0453] 甚至更优选地，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0454] -来自人CD8α的信号肽，
[0455] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，并且所述VH和VL结构域是人源化的
[0456] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0457] -来自人CD8α的跨膜结构域(TM)
[0458] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0459] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
[0460] 表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0461] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0462] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，
[0463] -CD8α铰链
[0464] -CD8αTM
[0465] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0466] -细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0467] 表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0468] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0469] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，
[0470] -CD8α铰链
[0471] -CD8αTM
[0472] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0473] -细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0474] 表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR在于：
[0475] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0476] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，
[0477] -CD8α铰链
[0478] -CD8αTM
[0479] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0480] -细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0481] 在一个实施方案中，所述接头是式(G4S)n的接头，其中n是1至3；优选n＝3且所述序列是(G4S)3，更优选SEQ ID NO.10的接头。
[0482] 表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0483] -人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0484] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0485] -人CD8α铰链
[0486] -人CD8αTM
[0487] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0488] -细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0489] 在一个实施方案中，本发明提供了：
[0490] 表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0491] -SEQ ID NO.1的人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0492] -包含SEQ ID NO.11的VH、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO 12的VL或SEQ ID NO.13的VH、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO 14的VL的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0493] -SEQ ID NO.4的人CD8α铰链，
[0494] -SEQ ID NO.6的人CD8αTM
[0495] -SEQ ID NO.8的来自4-1BB的共刺激信号分子
[0496] -SEQ ID NO.9的细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0497] 在一个实施方案中，本发明提供了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0498] -SEQ ID NO.1的人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0499] 包含SEQ ID NO 12的VL、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO.11的VH或SEQ ID NO 14的VL、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO.13的VH的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0500] -SEQ ID NO.4的人CD8α铰链，
[0501] -SEQ ID NO.6的人CD8αTM
[0502] -SEQ ID NO.8的来自4-1BB的共刺激信号分子
[0503] -SEQ ID NO.9的细胞内CD3ζ信号传导结构域。
[0504] 在一个实施方案中，本发明提供了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0505] -具有与SEQ ID NO.1或2的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的信号肽；优选地，信号肽具有与SEQ ID NO 1的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0506] -通过接头与VL结构域分开的VH结构域，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII；所述接头与SEQ ID NO 10的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0507] 所述VH结构域与SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性
[0508] 所述VL结构域与SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 14的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0509] -衍生自人CD8α链的铰链，其具有与SEQ ID NO.4的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0510] -衍生自CD8α的跨膜结构域，其具有与SEQ ID NO.6的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0511] -衍生自人4-1BB(或4-1BB细胞内结构域)的共刺激信号分子，其具有与选自SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％，95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0512] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其具有与选自SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％，95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0513] 在优选的实施方案中，在本发明的原代免疫T细胞中表达的本发明的EGFRVIII CAR不包含来自CD28或来自人CD28、特别是来自人CD28内部信号传导结构域的任何序列。在一个更优选的实施方案中，在本发明的原代免疫T细胞中表达的本发明的EGFRVIII CAR不包含来自人CD28、特别是来自人CD28内部信号传导结构域的任何序列，并且还含有来自CD8α的信号肽，优选融合至特异性针对EGFRVIII的scfv的VH结构域。
[0514] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞。
[0515] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.25的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞。
[0516] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.26的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞。
[0517] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.27的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞。
[0518] 在优选的实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25的、优选SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞。
[0519] 在更优选的实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25的、优选SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其表现出对表达EGFRVIII的细胞，优选对表达EGFRVIII的癌细胞的CTL和/或脱颗粒活性，
[0520] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°24的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0521] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°25的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0522] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°26的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0523] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°27的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0524] 本发明还涉及易于通过所述方法获得工程改造细胞的分离的细胞或细胞系。具体地，所述分离的细胞包含至少一种如上所述的本发明的CAR。在另一个实施方案中，所述分离的细胞包含CAR群体，每一个包含不同的细胞外配体结合结构域。具体地，所述分离的细胞包含编码CAR的外源多核苷酸序列。本发明的遗传修饰的免疫细胞独立于抗原结合机制而被激活和增殖。
[0525] 在本发明的范围内还包括分离的免疫细胞，优选根据前述方法中任一种获得的T细胞。所述免疫细胞是指功能上参与先天性和/或适应性免疫应答的起始和/或执行的造血起源细胞。根据本发明的所述免疫细胞可以衍生自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞、更具体是非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性人细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞还可以是树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞淋巴细胞或辅助T淋巴细胞的T细胞。在另一个实施方案中，所述细胞可以衍生自CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞。在本发明的细胞的扩增和遗传修饰之前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知和可以获得的任何数量的T细胞系。在另一个实施方案中，所述细胞可以衍生自健康供体、衍生自被诊断患有癌症的患者或衍生自被诊断患有感染的患者。在另一个实施方案中，所述细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群体的一部分。在本发明的范围内，还包括根据前述方法从转化的T细胞获得的细胞系。对免疫抑制治疗有耐受性且易于通过前述方法获得的修饰的细胞包括在本发明的范围内。
[0526] 作为优选实施方案，本发明提供了具有上述EGFRvIII CAR的T细胞或T细胞群体，其不表达功能性TCR，并且对EGFRvIII阳性细胞具有反应性，用于将其同种异体移植到患者中。
[0527] T细胞的激活和扩增
[0528] 无论在T细胞的遗传修饰之前或之后，即使本发明的遗传修饰的免疫细胞独立于抗原结合机制而被激活和增殖，本发明的免疫细胞，特别是T细胞可以通常使用例如在美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,
514、6,867,041和美国专利申请公开号20060121005被进一步激活和扩增。T细胞可以在体外或体内被扩增。
514、6,867,041和美国专利申请公开号20060121005被进一步激活和扩增。T细胞可以在体外或体内被扩增。
[0529] 通常，通过与刺激T细胞表面上的CD3TCR复合物和共刺激分子的试剂接触以产生T细胞的激活信号来扩增本发明的T细胞。例如，诸如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或有丝分裂凝集素如植物凝集素(PHA)的化学品可用于产生T细胞的激活信号。
[0530] 作为非限制性实例，可以例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触体外刺激T细胞群体。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适合于T细胞培养的条件包括可含有增殖和存活所必需的因子的合适培养基(例如，最小必需培养基(Minimal Essential Media)或RPMI培养基1640或X-vivo 5，(Lonza))，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp和TNF-或本领域技术人员已知的用于细胞的生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂，例如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素的RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer，无血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足够用于T细胞生长和扩增的一定量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注入受试者的细胞培养物中。靶细胞保持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。
[0531] 在另一个具体实施方案中，所述细胞可以通过与组织或细胞共培养而扩增。所述细胞还可以在体内扩增，例如在将所述细胞施用于受试者后在受试者的血液中。
[0532] 治疗应用
[0533] 本发明提供了包含表达本发明的EGFRVIII CAR的原代T细胞和药学上可接受的媒介物的组合物，这是本发明的另一个目的。
[0534] 本文还公开了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代T细胞，其作为药物，特别是用于免疫疗法。
[0535] 本文还公开了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代T细胞，其用于治疗癌症或减轻炎症。
[0536] 在另一个实施方案中，通过不同方法获得的分离的细胞或衍生自如前所述的所述分离的细胞的细胞系可以用作药物。在另一个实施方案中，所述药物可用于治疗癌症，特别是用于在有需要的患者中治疗B细胞淋巴瘤和白血病。在另一个实施方案中，根据本发明的所述分离的细胞或衍生自所述分离的细胞的细胞系可以用于制备用于治疗有需要的患者的癌症的药物。
[0537] 术语“癌症”是指特征在于一种或几种类型的细胞的快速和不受控制的生长的疾病。癌症的实例在本文中描述，包括但不限于胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌。优选地，用本发明的EGFRvIII CAR预防或治疗的癌症是胶质瘤、优选胶质母细胞瘤，更优选多发性胶质母细胞瘤。
[0538] 本文使用的术语“与EGFRvIII表达相关的疾病”包括但不限于与EGFRvIII的表达相关的疾病或与表达EGFRvIII的细胞的活性相关的病况，包括各种癌症的肿瘤细胞，例如，胶质母细胞瘤(包括胶质母细胞瘤干细胞)；乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌；头颈部鳞状细胞癌；髓母细胞瘤、结肠直肠癌、前列腺癌和膀胱癌。裂解是本发明的EGFRvIII CAR T细胞对抗表达EGFRvIII的细胞，减少或消除肿瘤，促进宿主的免疫细胞向肿瘤部位的浸润，以及增强/延长抗肿瘤反应的机制之一。
[0539] 在另一方面，本发明依赖于用于治疗有需要的患者的方法，所述方法包括以下步骤中的至少一个：
[0540] (a)提供可通过前述方法中的任一种获得的免疫细胞；
[0541] (b)对所述患者施用所述转化的免疫细胞，
[0542] 在一个实施方案中，本发明的所述T细胞可以经历稳定的体内T细胞扩增，并且可以持续延长的时间量。
[0543] 所述治疗可以是改善、治愈或预防。它可以是自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法治疗的一部分。自体是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群体源自所述患者或源自人白细胞抗原(HLA)相容性供体。同种异体是指用于治疗患者的细胞或细胞群体不是源自所述患者，而是源自供体。
[0544] 在前面的部分中描述了可以与所公开的方法一起使用的细胞。所述治疗可用于治疗诊断的患者，其中以表达EGFRvIII的细胞、特别是通过过量表达EGFRvIII的细胞为特征的恶化前或恶性癌症病况。这样的病况发现于癌症中，例如肺癌、肛门癌和多形性胶质母细胞瘤。
[0545] 用本发明的CAR治疗的癌症的类型包括但不限于肺癌、肛门癌和多形性胶质母细胞瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
[0546] 本发明提供了用于治疗与EGFRvIII相关的疾病和病症的组合物和方法。与EGFRvIII相关的疾病或病症的实例是胶质瘤。
[0547] 胶质瘤是指在神经胶质细胞(例如，围绕并支持神经细胞的细胞并包括少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞)开始的中枢神经系统癌症。根据其详细的病理组织类型，胶质瘤分类为超过七种类型，例如胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤(anaplastic astrocytoma)。
[0548] 当确定原发性脑肿瘤的恶性程度时，使用疾病阶段(肿瘤大小、远端转移的存在)和组织恶性。根据“脑肿瘤治疗指南”((2002)Kanehara&Co.，Ltd.)将组织恶性分为四个水平，即G至G4，它们分别对应于WH 01至WH04。数字越大，恶性程度越高。例如，胶质母细胞瘤的恶性是G4(WH04)，而间变性星形细胞瘤的恶性是G3(WH03)，并且G3和G4都被分类为恶性。
[0549] 因此，根据具体实施方案，本发明的方法靶向恶性胶质瘤。在其他方面，本发明靶向多形性胶质母细胞瘤(GBM)或多发性胶质母细胞瘤。
[0550] 在进一步的实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗其它胶质瘤，包括但不限于间变性星形细胞瘤、巨细胞胶质母细胞瘤、胶质肉瘤(gliosarcoma)、间变性少突胶质细胞瘤、间变性室管膜瘤、脉络丛癌、间变性神经节胶质瘤、成神经管细胞瘤(pineoblastoma)、髓上皮瘤、室管膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和非典型的畸胎类瘤/横纹肌样瘤。
[0551] 胶质母细胞瘤是成人中最常见的原发性脑肿瘤。每年超过一半的诊断为恶性原发性脑瘤的患者患有多形性胶质母细胞瘤。多形性胶质母细胞瘤是一种间变性、高度细胞肿瘤(highly cellular tumor)，具有高增殖指数、微血管增生和局灶性坏死。
[0552] 这些损伤的高度增殖性质可能源自多种促有丝分裂作用。GBM的标志之一是内皮增殖。在GBM中发现了许多血管生成生长因子及其受体。
[0553] 多形性胶质母细胞瘤预后仍然令人沮丧。大多数患者的存活时间少于2年。
[0554] 原发性多形性胶质母细胞瘤从神经胶质细胞从头发展，通常具有少于6个月的临床史，在老年患者中更常见并且呈现小细胞组织学。继发性多形性胶质母细胞瘤从已存在的低级星形细胞瘤开始数月或数年，主要影响年轻人并呈现巨细胞组织学。
[0555] 恶性胶质瘤也称为高级胶质瘤。它们可以影响大脑和脊髓。在一些方面，本发明的组合物和方法可用于治疗携带脑恶性胶质瘤的受试者，例如选自间变性星形细胞瘤(AA)、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、间变性少突胶质细胞瘤(AO)和间变性少突星形细胞瘤(AOA)。
[0556] 本发明的组合物和方法可用于治疗已被表征为具有表达EGFRvIII的细胞或组织或怀疑具有表达EGFRvIII的细胞或组织的受试者。例如，受益于根据本发明的治疗的受试者包括患有胶质瘤的受试者或怀疑患有胶质瘤的受试者，例如，通过存在头痛、恶心和呕吐、癫痫、视力丧失、疼痛、虚弱、四肢麻木，和/或由于颅内压增加的颅神经疾病中的一种或多种所证实的。在具体实施方案中，被治疗的胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤。根据该实施方案，多形性胶质母细胞瘤可以在脑或脊髓中。
[0557] 在本发明中，免疫细胞指原代免疫细胞、分离的原代免疫细胞、分离的原代免疫T细胞、分离的原代免疫NK细胞、分离的原代免疫TCR-KO T细胞，优选对化疗有耐受性的分离的原代免疫TCR-KO T细胞，例如对选自嘌呤核苷酸类似物、铂(顺铂或卡铂)、抗拓扑异构酶I(伊立替康)、抗拓扑异构酶II(依托泊苷)、氨甲蝶呤(叶酸类似物)的药物有耐受性。
[0558] 优选地，本发明提供了表达本发明的有效EGFRVIII CAR的原代T细胞，其用于治疗胶质母细胞瘤，更具体是多发性胶质母细胞瘤。更优选地，本发明提供了表达SEQ ID NO.24的本发明的有效EGFRVIII CAR的原代T细胞，任选地人源化，其用于治疗胶质母细胞瘤，更具体地，多形性胶质母细胞瘤。
[0559] 在一个实施方案中，患者是患有残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤、残留或复发性EGFRvIII+胶质母细胞瘤的患者。
[0560] 在另一个实施方案中，本发明提供了表达本发明的有效EGFRVIII CAR的原代T细胞，其用于治疗胶质母细胞瘤，更具体是多发性胶质母细胞瘤。更优选地，本发明提供了表达SEQ ID NO.24的本发明的有效EGFRVIII CAR的原代T细胞，任选地人源化，用于治疗患有间变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、胶质肉瘤或神经上皮瘤的患者。
[0561] 本文还公开了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代T细胞，其表现出对表达EGFRVIII的细胞，优选对表达EGFRVIII的癌细胞的CTL和/或脱颗粒活性，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0562] 本文提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0563] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结合结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结合结构域是单链可变片段(scFv)。
[0564] -铰链，
[0565] -跨膜结构域，
[0566] -来自人4-1BB的共刺激信号分子，
[0567] 包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0568] 在优选的实施方案中，本发明的原代免疫T细胞表达EGFRVIII CAR，其包含：不包含CD28衍生的序列，特别是不具有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列，并且提供用于治疗癌症，优选残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0569] 在更优选的实施方案中，在本发明的原代免疫T细胞中本发明的EGFRVIII CAR的胞质内和/或跨膜结构域不包括人CD28衍生的序列，特别是不具有与人CD28具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸同一性的序列，并且提供用于治疗癌症，优选残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选多形性胶质母细胞瘤(GBM)，
[0570] 提供表达EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0571] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结合结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结合结构域是单链可变片段(scFv)
[0572] -铰链，
[0573] -跨膜结构域，
[0574] -来自人4-1BB的共刺激信号分子，
[0575] -包含人CD3ζ信号传导结构域和无人CD28信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0576] 在优选的实施方案中，提供表达EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞，所述CAR：不包含来自CD28的序列，和包含来自CD8α的信号肽(前导序列)、TM结构域和铰链，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0577] 在一个实施方案中，提供表达EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞，所述CAR包含来自人CD8α的前导序列或与SEQ ID NO.1具有至少95％同一性的前导序列，优选SEQ ID NO.1的前导序列，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0578] 在另一个实施方案中，提供表达EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞，所述CAR包含SEQ ID NO.2的前导序列或与SEQ ID NO.2具有至少95％同一性的前导序列，优选SEQ ID NO.2的前导序列，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0579] 在一个实施方案中，提供表达EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0580] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结构域是单链可变片段(scFv)
[0581] -来自人CD8α链的铰链(来自CD8α)
[0582] -来自人CD8α的跨膜结构域
[0583] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0584] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0585] 提供表达EGFRVIII CAR的本发明的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0586] -特异性针对EGFRVIII的结合结构域，优选特异性针对人EGFRVIII的结构域，更优选所述特异性针对人EGFRVIII的结构域是单链可变片段(scFv)。
[0587] -来自人IgG1的铰链
[0588] -来自人CD8α的跨膜结构域
[0589] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0590] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0591] 本发明包括表达包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的信号肽的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0592] 本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含连接到铰链、优选来自CD8α、IgG1或FCRIII的铰链(参见图2)、更优选来自CD8α的铰链、甚至更优选具有SEQ ID NO.4的铰链的抗EGFRVII的scfv，用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0593] 本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含连接到铰链、优选来自CD8α的铰链、来自CD8α的TM和来自CD8α的信号肽的抗EGFRVII的scfv，甚至更优选具有SEQ ID NO.4的铰链、来自CD8α的TM和来自CD8α的信号肽，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0594] 优选地，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0595] -信号肽，优选来自CD8α的信号肽，更优选SEQ ID NO.1的来自CD8α的信号肽。
[0596] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，
[0597] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0598] -来自CD8α的跨膜结构域(TM)
[0599] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0600] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤。
[0601] 更优选地，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0602] -来自人CD8α的信号肽，
[0603] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，
[0604] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0605] -来自CD8α的跨膜结构域(TM)
[0606] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0607] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0608] 甚至更优选地，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0609] -来自人CD8α的信号肽，
[0610] -包含通过接头与VL结构域分开的VH结构域的(scFv)，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII，并且所述VH和VL结构域是人源化的
[0611] -来自人CD8α链的铰链或来自人IgG1的铰链
[0612] -来自人CD8α的跨膜结构域(TM)
[0613] -来自人4-1BB的共刺激信号分子
[0614] -包含人CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0615] 提供表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0616] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0617] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，
[0618] -CD8α铰链
[0619] -CD8αTM
[0620] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0621] -细胞内CD3ζ信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0622] 提供表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0623] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0624] -包含VL、接头和VH的抗EGFRVIII的scfv，
[0625] -CD8α铰链
[0626] -CD8αTM
[0627] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0628] -细胞内CD3ζ信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0629] 提供表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞
[0630] 在于：
[0631] -前导序列(例如CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0632] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，
[0633] -CD8α铰链
[0634] -CD8αTM
[0635] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0636] -细胞内CD3ζ信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0637] 在一个实施方案中，所述接头是式(G4S)n的接头，其中n是1至3；优选n＝3且所述序列是(G4S)3，更优选SEQ ID NO.10的接头。
[0638] 提供表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0639] -人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0640] -包含VH、接头和VL的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0641] -人CD8α铰链
[0642] -人CD8αTM
[0643] -来自4-1BB的共刺激信号分子
[0644] -细胞内CD3ζ信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0645] 在一个实施方案中，本发明提供了：
[0646] 表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0647] -SEQ ID NO.1的人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0648] -包含SEQ ID NO.11的VH、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO 12的VL或SEQ ID NO.13的VH、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO 14的VL的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的，
[0649] -SEQ ID NO.4的人CD8α铰链，
[0650] -SEQ ID NO.6的人CD8αTM
[0651] -SEQ ID NO.8的来自4-1BB的共刺激信号分子
[0652] -SEQ ID NO.9的细胞内CD3ζ信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0653] 在一个实施方案中，本发明提供了
[0654] 表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞包括：
[0655] -SEQ ID NO.1的人CD8α前导序列(CD8α前导序列或CD8α信号肽)
[0656] 包含SEQ ID NO 12的VL、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO.11的VH，SEQ ID NO 14的VL、SEQ ID N°10的接头和SEQ ID NO.13的VH的抗EGFRVIII的scfv，有利地scfv是人源化的。
[0657] -SEQ ID NO.4的人CD8α铰链，
[0658] -SEQ ID NO.6的人CD8αTM
[0659] -SEQ ID NO.8的来自4-1BB的共刺激信号分子
[0660] -SEQ ID NO.9的细胞内CD3ζ信号传导结构域，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0661] 在一个实施方案中，本发明提供了表达本发明的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR包含：
[0662] -具有与SEQ ID NO.1或2的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的信号肽；优选地，信号肽具有与SEQ ID NO 1的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0663] -通过接头与VL结构域分开的VH结构域，所述VH和VL有助于结合EGFRVIII；所述接头与SEQ ID NO 10的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0664] 所述VH结构域与SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性
[0665] 所述VL结构域与SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 14的多肽具有至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0666] -衍生自人CD8α链的铰链，其具有与SEQ ID NO.4的多肽具有至少80％、更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0667] -衍生自CD8α的跨膜结构域，其具有与SEQ ID NO.6的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
[0668] -衍生自人4-1BB(或4-1BB细胞内结构域)的共刺激信号分子，其具有与由SEQ ID NO：8组成的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％，95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
[0669] -包含CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其具有与选自SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％，95％、97％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0670] 在优选的实施方案中，在原代免疫T细胞中表达的用于治疗癌症、优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤、更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)的本发明EGFRVIII CAR不包含来自CD28或来自人CD28、特别是来自人CD28内部信号传导结构域的任何序列。
[0671] 在更优选的实施方案中，在本发明的原代免疫T细胞中表达的用于治疗癌症、优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤、更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)的本发明的EGFRVIII CAR不包含来自人CD28、特别是来自人CD28内部信号传导结构域的任何序列，并且还含有来自CD8α的信号肽，优选融合至特异性针对EGFRVIII的scfv的VH结构域。
[0672] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0673] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.25的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0674] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.26的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0675] 在一个实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.27的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0676] 在优选的实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)，更优选表达SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0677] 在一个更优选的实施方案中，本发明提供了表达SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)，更优选表现出对表达EGFRVIII的细胞，优选对表达EGFRVIII的癌细胞的CTL和/或脱颗粒活性的表达SEQ ID NO.24的EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0678] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°24的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0679] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°25的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0680] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°26的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0681] 在一个实施方案中，本发明提供了表达EGFRVIII CAR的原代免疫T细胞，所述CAR具有与SEQ ID N°27的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其用于治疗癌症，优选治疗残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤，更优选治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
[0682] 用根据本发明的工程改造免疫细胞的治疗可以与一种或多种选自抗体疗法、化疗、细胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放疗的针对癌症的疗法组合。
[0683] 根据本发明的优选实施方案，所述治疗可以施用于经历免疫抑制治疗的患者。实际上，本发明优选依赖于细胞或细胞群体，由于编码免疫抑制剂的受体的基因的失活，所述细胞或细胞群体对至少一种此类免疫抑制剂具有耐受性。在这方面，免疫抑制治疗应当有助于在患者体内选择和扩增根据本发明的T细胞。
[0684] 根据本发明的细胞或细胞群的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以通过皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的细胞组合物优选通过静脉内注射施用。
[0685] 细胞或细胞群体的施用可以由104-109个细胞/kg体重、优选105-106个细胞/kg体重的施用组成，包括那些范围内的细胞数的所有整数值。细胞或细胞群体可以一个或多个剂量施用。在另一个实施方案中，所述有效量的细胞作为单一剂量施用。在另一个实施方案中，所述有效量的细胞在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用的时机在管理医生的判断范围内，并且取决于患者的临床状况。细胞或细胞群体可以从任何来源获得，例如血库或供体。虽然个体需要变化，但是具体疾病或病况的给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定在本领域技术范围内。有效量是指提供治疗或预防有益效果的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，同时治疗的种类(如果有的话)，治疗频率和所需效果的性质。
[0686] 在另一个实施方案中，所述有效量的细胞或包含那些细胞的组合物肠胃外施用。所述施用可以是静脉内施用。所述施用可以通过在肿瘤内注射直接进行。
[0687] 在本发明的某些实施方案中，细胞与任何数量的相关治疗方式结合施用给患者(例如，在之前、同时或之后)，所述治疗方式包括但不限于用如抗病毒疗法、西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)药剂的治疗或用于MS患者的那他珠单抗治疗或用于银屑病患者的efaliztimab治疗或用于PML患者的其他治疗。在进一步的实施方案中，本发明的T细胞可以与化疗、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和照射组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的p70S6激酶((Henderson,Naya等人，1991；Liu,Albers等人，1992；Bierer,Hollander等人，1993)。
[0688] 在另一个实施方案中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、使用化疗剂例如氟达拉滨、外部束放疗(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞消融疗法的结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法之后施用，例如与CD20例如Rituxan反应的药剂。例如，在一个实施方案中，受试者可以接受高剂量化疗，接着进行外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
[0689] 其他定义
[0690] -多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码表示，其中例如，Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，D表示Asp或天冬氨酸残基。
[0691] -氨基酸置换是指用另一个氨基酸残基替换一个氨基酸残基，例如在肽序列中用谷氨酰胺残基替换精氨酸残基是氨基酸置换。
[0692] -核苷酸表示如下：单字母密码用于表示核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，n代表g、a、t或c。
[0693] -如本文所用，“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、以及通过连接、切割、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合的单体组成。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺和叠氮基替换一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子相似的结构替代，例如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或其它众所周知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。核酸可以是单链或双链的。
[0694] -嵌合抗原受体(CAR)是指将针对靶细胞上存在的成分的结合结构域，例如对所需抗原(例如肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体激活的细胞内结构域组合的分子，以产生展现出特异性抗靶细胞免疫活性的嵌合蛋白。通常，CAR由与T细胞抗原受体复合物ζ链的细胞内信号传导结构域融合的细胞外单链抗体(scFvFc)(scFvFc:ζ)组成，并且当在T细胞中表达时具有基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识别的能力。本发明中使用的CAR的一个实例是针对EGFRvIII抗原的CAR，并且可以包含作为非限制性实例的氨基酸序列：SEQ ID NO：15至18，优选SEQ ID NO.24至27，更优选SEQ ID NO.24；更优选人源化SEQ ID NO.24至27，更优选人源化SEQ ID NO.24。
[0695] 表达本发明的CAR的原代T细胞是指组合至少一个针对EGFRvIII的结合结构域(例如针对所需肿瘤抗原(EGFRvIII)的基于抗体的特异性)与T细胞受体-激活细胞内结构域以产生表现出特异性抗靶细胞免疫活性(CTL活性)的嵌合蛋白。
[0696] 通常，表达本发明的EGFRvIII CAR的T细胞基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识别，并诱导靶细胞的破坏。-术语“内切核酸酶”是指能够催化DNA或RNA分子、优选DNA分子内的核酸之间的键的水解(切割)的任何野生型或变体酶。不论其序列，内切核酸酶不切割DNA或RNA分子，而是在特异性的多核苷酸序列(进一步称为“靶序列”或“靶位点”)处识别和切割DNA或RNA分子。当通常具有长度大于12个碱基对(bp)、更优选14-55bp的多核苷酸识别位点时，内切核酸酶可以被分类为稀有切割的内切核酸酶。稀有切割的内切核酸酶通过在确定的基因座处诱导DNA双链断裂(DSB)而显著增加HR(Perrin,Buckle等人，1993；Rouet,Smih等人，1994；Choulika,Perrin等人，1995；Pingoud和Silva 2007)。稀有切割的内切核酸酶可以例如是归巢内切核酸酶(Paques和Duchateau 2007)、由工程改造的锌指结构域与限制酶例如FokI的催化结构域融合产生的嵌合锌指核酸酶(ZFN)(Porteus和Carroll 2005)、来自CRISPR系统的Cas9内切核酸酶(Gasiunas,Barrangou等人，2012；Jinek,Chylinski等人，2012；Cong,Ran等人，2013；Mali,Yang等人，2013)或化学内切核酸酶(Eisenschmidt,Lanio等人，2005；Arimondo,Thomas等人，2006)。在化学内切核酸酶中，化学或肽切割子缀合至核酸的聚合物或识别特异性靶序列的另一DNA，从而将切割活性靶向特异性序列。化学内切核酸酶还包括合成核酸酶如邻二氮菲的缀合物、切割DNA的分子和已知结合特异性DNA序列的形成三链体的寡核苷酸(TFO)(Kalish和Glazer 2005)。这样的化学内切核酸酶包括在根据本发明的术语“内切核酸酶”中。
[0697] -“TALE-核酸酶”(TALEN)意指由通常衍生自转录激活因子样效应物(TALE)的核酸结合结构域和一个切割核酸靶序列的核酸酶催化结构域组成的融合蛋白。催化结构域优选是核酸酶结构域，并且更优选具有内切核酸酶活性的结构域，如例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在具体的实施方案中，TALE结构域可以融合到兆核酸酶，如例如I-CreI和I-OnuI或其功能变体。在更优选的实施方案中，所述核酸酶是单体TALE-核酸酶。单体TALE-核酸酶是不需要二聚化而用于特异性识别和切割的TALE-核酸酶，例如WO2012138927中描述的工程改造TAL重复与I-TevI的催化结构域的融合体。转录激活因子样效应物(TALE)是来自细菌种类黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，其包含多个重复序列，每个重复包含位置12和13的二残基(RVD)，所述二残基特异性针对核酸靶向序列的每个核苷酸碱基。具有相似模块化碱基每碱基(base-per-base)核酸结合性质的结合结构域(MBBBD)也可以衍生自申请人最近在不同细菌种类中发现的新的模块化蛋白质。新的模块蛋白质具有显示比TAL重复更多的序列变异性的优点。优选地，与识别不同核苷酸相关的RVD是用于识别C的HD，用于识别T的NG，用于识别A的NI，用于识别G或A的NN，用于识别A、C、G或T的NS，用于识别T的HG，用于识别T的IG，用于识别G的NK，用于识别C的HA，用于识别C的ND，用于识别C的HI，用于识别G的HN，用于识别G的NA，用于识别G或A的SN，用于识别T的YG，用于识别A的TL，用于识别A或G的VT和用于识别A的SW。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可以突变成其他氨基酸残基，以便调节它们对核苷酸A、T、C和G的特异性，并且特别是增强这种特异性。TALE-核酸酶已经被描述并被用于刺激基因靶向和基因修饰(Boch，Scholze等人，2009；Moscou和Bogdanove 2009；Christian，Cermak等人，2010；Li，Huang等人，2011)。定制的TAL-核酸酶可以商品名TALENTM商购获得(Cellectis，8rue de la Croix Jarry，75013Paris，France)。
[0698] 根据本发明的稀有切割的内切核酸酶还可以是Cas9内切核酸酶。最近，已经基于来自II型原核CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)适应性免疫系统(参见综述(Sorek，Lawrence等人，2013))的RNA引导的Cas9核酸酶开发了新的基因组工程改造工具(Gasiunas，Barrangou等人，2012；Jinek，Chylinski等人，2012；Cong，Ran等人，2013；Mali，Yang等人，2013)。CRISPR相关(Cas)系统首先在细菌中发现，并作为对外来DNA(病毒或质粒)的防御起作用。CRISPR介导的基因组工程改造首先通过选择经常侧接短序列基序(称为原间隔区相邻基序(proto-spacer adjacent motif，PAM))的靶序列来进行。在靶序列选择后，工程改造与该靶序列互补的特异性crRNA。在CRISPR II型系统中需要反式激活crRNA(tracrRNA)与crRNA配对并与所提供的Cas9蛋白结合。Cas9充当促进tracRNA与cRNA的碱基配对的分子锚(Deltcheva，Chylinski等人，2011)。在这种三元复合物中，二元tracrRNA:
crRNA结构作为指导RNA，将内切核酸酶Cas9引导至同源靶序列。Cas9-tracrRNA:crRNA复合物的靶识别通过扫描靶序列的靶序列和crRNA之间的同源性来启动。除了靶序列-crRNA互补性，DNA靶向需要邻近原间隔区的短基序(原间隔区相邻基序-PAM)的存在。在二元RNA和靶序列之间配对后，Cas9随后在PAM基序的上游3个碱基处引入平端双链断裂(Garneau，Dupuis等人，2010)。
crRNA结构作为指导RNA，将内切核酸酶Cas9引导至同源靶序列。Cas9-tracrRNA:crRNA复合物的靶识别通过扫描靶序列的靶序列和crRNA之间的同源性来启动。除了靶序列-crRNA互补性，DNA靶向需要邻近原间隔区的短基序(原间隔区相邻基序-PAM)的存在。在二元RNA和靶序列之间配对后，Cas9随后在PAM基序的上游3个碱基处引入平端双链断裂(Garneau，Dupuis等人，2010)。
[0699] 稀有切割的内切核酸酶可以是归巢内切核酸酶，也称为兆核酸酶的名称。这样的归巢内切核酸酶是本领域众所周知的(Stoddard 2005)。归巢内切核酸酶识别DNA靶序列并产生单链或双链断裂。归巢内切核酸酶是高度特异性的，识别长度为12至45个碱基对(bp)、通常长度为14至40bp的DNA靶位点。根据本发明的归巢内切核酸酶可以例如对应于LAGLIDADG内切核酸酶、HNH内切核酸酶或GIY-YIG内切核酸酶。根据本发明的优选归巢内切核酸酶可以是I-CreI变体。
[0700] -“递送载体”意指可以在本发明中用于与细胞接触(即“接触”)或在细胞或亚细胞区室内部递送(即“引入”)本发明所需的试剂/化学品和分子(蛋白质或核酸)的任何递送载体。它包括但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载体、聚合物载体、脂质复合物、多聚复合物(polyplex)、树枝状聚合物、微泡(超声造影剂)、纳米粒子、乳液或其它合适的转移载体。这些递送载体允许分子、化学品、大分子(基因、蛋白质)或其它载体如由Diatos开发的质粒、肽的递送。在这些情况下，递送载体是分子载体。“递送载体”也意指用于进行转染的递送方法。
[0701] -术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。本发明中的“载体”包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达它们所连接的核酸(表达载体)的载体。大量合适的载体是本领域技术人员已知的并且可商购获得，实例在图4和图5中。
[0702] 病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒例如正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒例如小RNA病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields,等人编辑,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
[0703] -“慢病毒载体”意指基于HIV的慢病毒载体，其由于其相对大的包装能力、降低的免疫原性以及它们以高效率稳定转导大范围的不同细胞类型的能力而非常有希望用于基因递送。慢病毒载体通常在将三种(包装、包膜和转移)或更多种质粒瞬时转染到生产细胞中之后产生。像HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体的相互作用进入靶细胞。在进入时，病毒RNA经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录的产物是双链线性病毒DNA，其是感染细胞的DNA中病毒整合的底物。“整合型慢病毒载体(或LV)”是指能够整合靶细胞的基因组的作为非限制性实例的此类载体。相反，“非整合性慢病毒载体(或NILV)”是指不通过病毒整合酶的作用整合靶细胞的基因组的有效基因递送载体。
[0704] -递送载体可以与任何细胞透化技术例如声波穿孔或电穿孔或这些技术的衍生技术相关联或组合。
[0705] -细胞是指用于体外培养的任何真核生物细胞、原代细胞和衍生自这些生物体的细胞系。
[0706] -“原代细胞”意指直接从活组织(即活检材料)取得并建立用于体外生长的细胞，其已经经历非常少的群体倍增，因此与连续的致瘤性或人工永生化的细胞系相比更代表它们所衍生自的组织的主要功能成分和特征。
[0707] 作为非限制性实例，细胞系可选自CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞，U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；Jurkat细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞。
[0708] 所有这些细胞系可以通过本发明的方法修饰以提供细胞系模型以产生、表达、定量、检测、研究目的基因或蛋白质；作为非限制性实例的这些模型也可用于在研究和生产以及各种领域例如化学、生物燃料、治疗和农学中筛选目标生物活性分子。
[0709] -“突变”是指置换、缺失、插入至多一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、二十个、二十五个、三十个、四十个、五十个或更多个核苷酸/氨基酸(cDNA、基因)或多肽序列。突变可影响基因或其调节序列的编码序列。它还可以影响基因组序列的结构或编码的mRNA的结构/稳定性。
[0710] -“变体”意指重复变体、变体、DNA结合变体、TALE-核酸酶变体、通过突变或替换亲代分子的氨基酸序列中的至少一个残基而获得的多肽变体。
[0711] -“功能变体”意指蛋白质或蛋白质结构域的催化活性突变体；这样的突变体可以具有与其亲本蛋白质或蛋白质结构域相同的活性或另外的性质，或更高或更低的活性。
[0712] -“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较每个序列中为了比较的目的可以比对的位置来确定同一性。当被比较序列中的位置被相同碱基占据时，则分子在该位置是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列共有的位置处的相同或匹配核苷酸的数目的函数。可以使用各种比对算法和/或程序来计算两个序列之间的同一性，包括可用作GCG序列分析包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分的FASTA或BLAST，并且可以使用例如，默认设置。例如，考虑与本文所述的特异性多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并优选表现出基本上相同功能的多肽，以及编码此类多肽的多核苷酸。除非另有说明，相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比基于BLASTP阳性得分，序列同一性百分比基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”显示高评分序列对中相同的总残基的数量和分数；和BLASTP“阳性”显示比对分数具有正值并且彼此相似的残基的数量和分数。本公开考虑和涵盖具有与本文公开的氨基酸序列具有这些程度的同一性或相似性或任何中间程度的相似性的氨基酸序列。使用遗传密码推导相似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过常规方法获得，特别是通过使用遗传密码逆翻译其氨基酸序列。
[0713] -“信号转导结构域”或“共刺激配体”是指特异性结合T细胞上的同源共刺激分子的抗原呈递细胞上的分子，从而提供除了通过例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合提供初级信号之外的信号，介导T细胞应答，包括但不限于增殖激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还特别包括特异性结合存在于T细胞上的共刺激分子的抗体，所述共刺激分子例如但不限于CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体。
[0714] “共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
[0715] 本文所用的“共刺激信号”是指与初级信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
[0716] 本文使用的术语“细胞外配体结合结构域”定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择细胞外配体结合结构域以识别作为与具体的疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，可以充当配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
[0717] 本文使用的术语“受试者”或“患者”包括动物界的所有成员，包括非人灵长类动物和人。在一个实施方案中，患者是具有胶质瘤、优选残留或复发性EGFRvIII+胶质瘤的人。患者可以受益于根据本发明的治疗。
[0719] 在本文中陈述数值限度或范围时，包括端点。此外，数值限度或范围内的所有值和子范围如同明确写出那样被具体包括。
[0720] 呈现以上描述是为了使本领域技术人员能够制造和使用本发明，并且在上下文中提供具体的应用及其要求。对优选实施方案的各种修改对于本领域技术人员将是显而易见的，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本文定义的一般原理可以应用于其他实施方案和应用。因此，本发明不旨在限于所示的实施方案，而是符合与本文公开的原理和特征一致的最宽范围。
[0721] 一般方法
[0722] EGFRvIII CAR
[0723] 根据先前在文献US2010/0105136和US2010/0105136 A1中描述的方法使用不同的scfv制备EGFRvIII CAR，所述文献通过引用整体并入本文。
[0724] CAR的筛选和选择
[0725] -原代T细胞培养物
[0726] 使用Ficoll梯度密度介质从由EFS(Etablissement du Sang，Paris，France)提供的血沉棕黄层样品纯化T细胞。回收PBMC层，使用市售的T细胞富集试剂盒纯化TM
T细胞。在补充有20ng/mL人IL-2、5％人和Dynabeads人T激活剂CD3/CD28的X-Vivo -15培养基(Lonza)中以1:1的珠:细胞比(Life Technologies)激活纯化的T细胞。
T细胞。在补充有20ng/mL人IL-2、5％人和Dynabeads人T激活剂CD3/CD28的X-Vivo -15培养基(Lonza)中以1:1的珠:细胞比(Life Technologies)激活纯化的T细胞。
[0727] -CAR mRNA转染
[0728] 在T细胞纯化和激活后在第4天或第11天完成编码不同CAR构建体的CAR mRNA的转TM染。将细胞立即在X-Vivo -15培养基中稀释，并在37℃下与5％CO2孵育。在电穿孔后2小时以20ng/mL加入IL-2。
[0729] -用允许CAR表达的重组慢病毒载体的T细胞转导
[0730] 用表达CAR的重组慢病毒载体转导T细胞在T细胞纯化/激活后三天进行。可以使用由Vectalys SA(Toulouse，France)通过在HEK-293细胞中转染基因组和辅助质粒生产的慢病毒载体。以5的感染复数进行转导。使用与鼠IgG1Fc片段(由LakePharma生产)融合在一起的人EGFRVIII蛋白的细胞外结构域上构成的重组蛋白质，在T细胞表面进行CAR检测。使用靶向蛋白质的小鼠Fc部分的PE-缀合的二抗(Jackson Immunoresearch)检测该蛋白质与CAR分子的结合，并通过流式细胞术进行分析。
[0731] 原代T细胞中特异性基因的失活
[0732] 可在CAR引入T细胞之前或之后进行原代T细胞中特异性基因的失活。
[0733] 至少一个基因失活，一个、两个或三个基因可以在一个步骤中失活；在优选的实施方案中，两个基因失活，优选TCRα基因和赋予对选自嘌呤核苷酸类似物、铂(顺铂或卡铂)、抗拓扑异构酶I(伊立替康)、抗拓扑异构酶II(依托泊苷)、氨甲蝶呤(叶酸类似物)的药物具有耐受性的基因。
[0734] 通常，设计并产生异源二聚体核酸酶，特别是靶向由靶基因内的间隔区分开的两个长序列(称为半靶)的TALE-核酸酶。
[0735] 每个TALE-核酸酶构建体可以克隆在合适的哺乳动物表达载体中。编码切割靶向基因组序列的TALE-核酸酶的mRNA可以从携带启动子下游的编码序列的质粒合成。使用用抗CD3/CD28包被的珠预激活的纯化的T细胞，并用编码两种半TALE-核酸酶的2种mRNA中的每一种转染。细胞可以用可溶性抗CD28重新激活以在不同时间测量细胞增殖，检测激活标志物CD25以评估细胞的激活状态。
[0736] -脱颗粒测定(CD107a移动)
[0737] 将T细胞与表达各种水平的靶蛋白(EGFRVIII)的等量细胞一起在96孔板中孵育。共培养物在37℃、5％CO2下保持6小时。通过在共培养开始时加入荧光抗CD107a抗体以及抗CD49d、抗CD28和1x莫能菌素溶液作为对照，在细胞刺激期间进行CD107a染色。在6小时孵育期后，用可固定活力的染料和缀合荧光色素的抗CD8对细胞染色，并通过流式细胞术进行分析。脱颗粒活性测定为CD8+/CD107a+细胞的％，并通过测定CD8+细胞中CD107a染色的平均荧光强度信号(MFI)。在mRNA转染后24小时进行脱颗粒测定。
[0738] -IFNγ释放测定
[0739] 在mRNA转染后24小时，将表达T细胞的CAR与表达各种水平的靶蛋白的细胞系一起在37℃下孵育24小时。回收上清液，通过ELISA测定在细胞培养物上清液中进行IFNγ检测。
[0740] -细胞毒性测定
[0741] T细胞与10,000个靶细胞(表达各种水平的靶蛋白)或(阴性对照)细胞一起在相同的孔中孵育。在与CAR+ T细胞共培养之前，用荧光细胞内染料(CFSE或细胞痕量紫(Cell Trace Violet))标记靶细胞和对照细胞。将共培养物在37℃下孵育4小时。在该孵育期后，用可固定活力的染料标记细胞并通过流式细胞术分析。测定每个细胞群体(靶细胞或阴性对照细胞)的活力，并计算特异性细胞裂解的％。在mRNA转染后48小时进行细胞毒性测定。
[0742] -抗肿瘤小鼠模型
[0743] 将免疫缺陷小鼠植入肿瘤细胞(胶质母细胞瘤)或将表达靶蛋白萤光素酶的细胞的植入侧腹。随后，将细胞植入小鼠脑中。向更进一步代的小鼠系列移植继续维持体内异种移植细胞系。任选地，小鼠在注射CAR+ T细胞之前/或一起接受抗癌治疗。然后用不同剂量的待测试的CAR+ T细胞或未用CAR慢病毒载体转导的T细胞静脉内注射小鼠(在肿瘤细胞系注射后2或7天)。在T细胞注射(第0天)当天，在T细胞注射后的第7、14、21、28和40天测定生物发光信号，以便跟踪不同动物的肿瘤进展。
[0744] Chen,Jian等人，任何其他模型的胶质瘤，例如Malignant Glioma:Lessons from Genomics,Mouse Models,and Stem Cells.Cell:Volume 149,Issue 1,36-47中描述的那些适用于本研究。
[0745] 临床研究
[0746] 主要目标
[0747] 评价在患有脑癌、胶质母细胞瘤或胶质肉瘤、特别是胶质母细胞瘤、更特别是多发性胶质母细胞瘤的患者中施用表达抗EGFRvIII CAR(抗EGFRvIII CAR工程改造的T淋巴细胞)的TCR KO原代T细胞的安全性和效率。
[0748] 测定接受抗EGFRvIII CAR工程改造的T淋巴细胞和任选的阿地白介素的患者在非清髓性但淋巴细胞耗尽制备方案后的六个月无进展存活。
[0749] 次要目标
[0750] ·测定抗EGFRvIII CAR工程改造T淋巴细胞的体内存活。
[0751] ·评价治疗后放射影像学改变
[0752] 资格：
[0753] ·通过IHC或RT-PCR测定的组织学证明的表达EGFRvIII的胶质母细胞瘤或胶质肉瘤
[0754] ·使用或不使用化疗的放疗的标准治疗前失败
[0755] ·Karnofsky得分大于或等于60％
[0756] 心肺、肺和实验室参数在可接受的限度内。
[0757] 设计：
[0758] ·研究使用I/II期设计进行。
[0759] ·患者接受非清髓性但淋巴细胞耗尽制备方案，其由环磷酰胺和氟达拉滨，然后静脉内输注离体肿瘤反应性、抗EGFRvIII CAR工程改造的T淋巴细胞组成，任选加上静脉内阿地白介素。
[0760] ·一旦确定MTD，研究进行到II期部分。
[0761] ·在试验的第2期部分，患者应计到两组：
[0762] ○在治疗开始时需要使用类固醇的复发性恶性胶质瘤患者
[0763] ○在治疗开始时不需要类固醇的复发性恶性胶质瘤患者
[0764] 研究类型：干预
[0765] 研究阶段：1期-2期
[0766] 研究设计
[0767] 分配：非随机
[0768] 终点分类：安全/功效研究
[0769] 干预模型：单组分配
[0770] 掩蔽：开放标签
[0771] 主要目的：治疗
[0772] 条件
[0773] 胶质瘤
[0774] 胶质母细胞瘤、多发性胶质母细胞瘤
[0775] 脑癌
[0776] 干预
[0777] ·生物学：抗EGFRvIII CAR工程改造T淋巴细胞
[0778] 在第0天(最后一剂氟达拉滨的1-4天后)，在20-30分钟内将细胞静脉内(i.v.)输注到患者监护室(Patient Care Unit)上。
[0779] ·药物：没有媒介
[0780] ·药物：阿地白介素
[0781] 在细胞输注的24小时内开始，大约每8小时(+/-1小时)15分钟内阿地白介素(基于总体重)72,000IU/kg IV，并持续至多5天，最大15个剂量。
[0782] ·药物：氟达拉滨
[0783] 氟达拉滨25mg/m 2/天IVPB，每天30分钟，持续5天。
[0784] ·药物：环磷酰胺
[0785] 环磷酰胺60mg/kg/天×2天IV以1小时250ml D5W。
[0786] 研究臂
[0787] 实验：单臂-
[0788] 患者接受非清髓性但淋巴细胞耗尽制备方案，其由环磷酰胺和氟达拉滨，随后静脉内输注抗EGFRvIII CAR工程改造的T淋巴细胞组成。
[0789] 干预：
[0790] ·生物学：抗EGFRvIII CAR工程改造T淋巴细胞
[0791] ·药物：无
[0792] ·药物：如上所述的阿地白介素
[0793] ·药物：如上所述的氟达拉滨
[0794] ·药物：如上所述的环磷酰胺
[0795] 已经概括地描述了本发明，可以通过参考某些具体实施例获得进一步的理解，除非另有说明，这些实施例在本文中仅为了说明的目的而提供，并且不旨在是限制性的。实施例
[0796] 实施例1：表达EGFRvIII-CAR的TCRα灭活的细胞的增殖。
[0797] 设计并产生靶向T细胞受体α恒定链区(TRAC)基因内的由15-bp间隔子分开的两个17-bp长序列(称为半靶)的异二聚体TALE-核酸酶。每个半靶由表10中列出的半TALE-核酸酶的重复识别。
[0798] 表10：靶向TCRα基因的TAL核酸酶
[0799]
[0800] 使用限制酶消化在T7启动子控制下的哺乳动物表达载体中亚克隆每个TALE-核酸酶构建体。从携带T7启动子下游的编码序列的质粒合成编码TALE-核酸酶切割的TRAC基因组序列的mRNA。
[0801] 用编码两种半TRAC_T01TALE-核酸酶的2种mRNA中的每一种转染用抗CD3/CD28包被的珠预先激活72小时的纯化的T细胞。转染后48小时，来自相同供体的不同组的T细胞分别用编码先前所述的EGFRvIII CAR(SEQ ID NO：15-18)之一的慢病毒载体转导。转导后2天，使用抗CD3磁珠纯化CD3NEG细胞，并且转导后5天，用可溶性抗CD28(5μg/ml)重新激活细胞。
[0802] 通过每周计数细胞2次，在重新激活后追踪细胞增殖长达30天。与未转导的细胞相比，观察到表达EGFRvIII CAR的TCRα灭活的细胞的增殖增加，特别是当用抗CD28重新激活时。
[0803] 为了研究表达EGFRvIII CAR的人T细胞是否显示激活状态，在转导后7天通过FACS分析激活标志物CD25的表达。用编码EGFRvIII CAR的慢病毒载体转导的纯化细胞在其表面测定CD25表达，以便与非转导细胞相比评估它们的激活。预期在CD28重新激活或无重新激活条件下CD25表达都增加。
[0804] 本发明提供了用于治疗胶质母细胞瘤的靶向表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的工程改造EGFRvIII CAR TCR KO T细胞。
[0805] 本发明提供了用于治疗多发性胶质母细胞瘤的靶向表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的工程改造EGFRvIII CAR TCR KO T细胞。
[0806] 实施例2：EGFRvIII CAR-T
[0807] 开发靶向表皮生长因子受体变异体III(EGFRvIII)的工程改造CAR T细胞，用于治疗胶质母细胞瘤。
[0808] EGFRvIII是最常见的EGFR突变体并且由外显子2-7的符合读框(in-frame)的缺失组成。这种缺失导致截短的细胞外配体结合结构域，并且使得蛋白质以配体非依赖性方式组成型激活。EGFRvIII表达已经显示增强致瘤性，促进细胞运动性，并赋予对放射和化疗的耐受性。已报道EGFRvIII表达在24-67％的胶质母细胞瘤中，但不在任何正常组织中，使其成为用CAR T细胞的免疫疗法的有吸引力的靶标(图1)。
[0809] 1.EGFRvIII CAR：
[0810] 1.1.构建体
[0811] 设计了四种EGFRvIII CAR(图2和图3)并使用如先前在文献US2010/0105136和US2010/0105136 A1中所述的不同scfv制备，文献通过引用整体并入本文。使用由Rosenberg在专利PCT/US2012/029861中描述的衍生自139抗体的139scfv或由Carter在专利US2010/0105136A1中描述的衍生自MR1抗体的MR1scfv。已经设计并制备了具有41BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域、CD8α跨膜结构域和2种不同铰链：CD8α铰链(V3架构)或IgG1铰链(V5架构)(SEQ ID N°24至SEQ ID N°27)的2种不同CAR架构(图2和图3)。
[0812] 我们还生产了Rosenberg描述的CAR来验证其活性(图3)。
[0813] 将构建体插入到pCLS9632(图4)中，用于瞬时表达和筛选设计的CAR。通过使用AscI和HindIII限制性位点将CAR构建体导入该主链。
[0814] 将同样的构建体插入到pCL26700psew EF1a BFP载体(pCL26700载体)(图5)的XmaI和SpeI限制性位点之间，用于在原代T细胞中进一步转导。
[0815] EGFRvIII CAR是139-V3CAR(SEQ ID NO.24)和139-V5(SEQ ID NO.25)CAR、MR1-V3(SEQ ID NO.26)和MR1-V5CAR(SEQ ID NO.27)。
[0816] 因此，本发明提供了包含编码本发明的EGFRvIII CAR的序列的pCL26700psew EF1a BFP载体，例如包含编码SEQ ID NO.24的序列的pCL26700psew EF1a BFP载体，包含编码SEQ ID NO.25的序列的pCL26700psew EF1a BFP载体，包含编码SEQ ID NO.26的序列的pCL26700psew EF1a BFP载体，包含编码SEQ ID NO.27的序列的pCL26700psew EF1a BFP载体，优选包含编码SEQ ID NO.24的序列的pCL26700psew EF1a BFP载体，
[0817] 1.2.CAR表达(图6)
[0818] 在通过抗CD3CD28包被的珠和IL-2激活后5天，将CAR mRNA转染到原代TCR KO T或T细胞中。通过流式细胞术评估CAR表达。检测139-V3CAR和139-V5CAR。通过使用这种方法而不管所使用的架构(V3或V5)，其他CAR表达低(MR1)或不可检测(由Rosenberg设计的CAR)(图6)。
[0819] 2.EGFRvIII细胞系的产生(图7)
[0820] 为了测试抗EGFRvIII CAR的功能性，产生U87的过表达EGFRvIII细胞系。
[0821] 2.1.在U87细胞中EGFR和EGFRvIII的过表达。
[0822] 2.1.1.细胞系开发
[0823] 产生过表达EGFR(EGFRVI)或EGFRvIII的U87细胞，并通过FACS和蛋白质印迹表征(图7)。图7：显示过表达EGFRVI(170Kda)或EGFRVIII(155Kda/140Kda)蛋白的U87胶质瘤细胞。
[0824] 通过FACS分析获得的结果显示，56.6％的细胞表达可检测水平的EGRFVI，并且57.3％的细胞表达可检测水平的EGRFVIII。
[0825] 这些表达EGFRVI的细胞和表达EGFRVIII的细胞最终被分选和分离。
[0826] 2.1.2.新细胞系作为EGFRvIII CAR T细胞的靶细胞的验证
[0827] 2.1.2.1.脱颗粒测定
[0828] 为了验证细胞系和CAR构建体，已经用表达EGFRvIII CAR的T细胞对这些新的靶细胞进行脱颗粒测定(图3)。通过流式细胞术评价CART脱颗粒。读数是与靶细胞孵育5小时后T胞质膜的CD107a表达。令人惊讶的是，即使在它们的表达低的时候，CAR 139-V3、CAR139-V5、MR1-V3和MR1-V5仍然能够脱颗粒。相比之下，结果显示，Rosenberg CAR在这些实验条件下不显示活性。
[0829] 图8显示了在与靶细胞共培养后通过FACS分析评估的EGFRvIII CART脱颗粒能力。Rosenberg CAR是不可检测的并且没有脱颗粒，因此不进一步研究。
[0830] 2.1.2.2.细胞毒性测定
[0831] 已经用表达4种EGFRVIII CAR的T细胞对这些新的靶细胞进行了细胞毒性测定。本发明的EGFRvIII CAR，结果显示EGFRvIII细胞(U87-EGFRvIII)的特异性裂解(图9)，但是在EGFRvI(U87-EGFR)细胞和U87wt细胞上都没有。图9显示EGFRvIII CART细胞的细胞毒性测定。
[0832] 获得的数据显示，本发明的EGFRvIII CAR T细胞，尤其是V3结构的EGFRvIII CAR T细胞可以体外和体内显著减少定殖在脊髓和脑中胶质瘤细胞。
[0833] CAR多肽序列的实例：
[0834] 加方框的序列对应于优选的VH和VL序列。VH和VL可以被交换以提高CAR效率。
[0835] 139-v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.15)
[0836]
[0837] 139-v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.16)
[0838]
[0839] MR1-v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.17)
[0840]
[0841]
[0842] MR1-v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.18)
[0843]
[0844] 序列
[0845] SEQ-ID N°28:Rosenberg CAR
[0846]MVLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[0847] SEQ-ID N°24:139-v3
[0848]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[0849] SEQ-ID N°25:139-v5
[0850]MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[0851] SEQ-ID N°26:MR1-v3
[0852]MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[0853] SEQ-ID N°27:MR1-v5
[0854]MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
[0855] 参考文献
[0856] Arimondo,P.B.,C.J.Thomas,et al.(2006)."Exploring the cellular activity of camptothecin-triple-helix-forming oligonucleotide conjugates."Mol Cell Biol 26(1):324-33.
[0857] Atkins,J.F.,N.M.Wills,et al.(2007)."A case for"StopGo":reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination(Stop)after addition of glycine and then allowing continued translation(Go)."Rna 13(6):803-10.
[0858] Badhiwala J,Decker WK,Berens ME,Bhardwaj RD.Clinical trials in cellular immunotherapy for brain/CNS tumors.Expert Rev Neurother.2013 Apr；13(4):405-24.doi:10.1586/ern.13.23.Review.
[0859] Bierer,B.E.,G.Hollander,et al.(1993)."Cyclosporin A and FK506:molecular mechanisms of immunosuppression and probes for transplantation biology."Curr Opin Immunol 5(5):763-73.
[0860] Bloom HJ.Combined modality therapy for intracranial tumors.Cancer.1975 Jan；35(1):111-20.Review.
[0861] Boch,J.,H.Scholze,et al.(2009)."Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors."Science 326(5959):1509-12.
[0862] Choulika,A.,A.Perrin,et al.(1995)."Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system of
Saccharomyces cerevisiae."Mol Cell Biol 15(4):1968-73.
Saccharomyces cerevisiae."Mol Cell Biol 15(4):1968-73.
[0863] Christian,M.,T.Cermak,et al.(2010)."Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases."Genetics 186(2):757-61.
[0864] Cong,L.,F.A.Ran,et al.(2013)."Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems."Science 339(6121):819-23.
[0865] Cros,E.et al.(2004)."Problems related to resistance to cytarabine in acute myeloid leukemia".Leukemia&Lymphoma.45(6):1123-1132.
[0866] Deltcheva,E.,K.Chylinski,et al.(2011)."CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III."Nature 471(7340):602-7.[0867] Donnelly,M.and G.Elliott(2001)."Nuclear localization and shuttling of herpes simplex virus tegument protein VP13/14."J Virol 75(6):2566-74.
[0868] Doronina,V.A.,C.Wu,et al.(2008)."Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon."Mol Cell Biol 28(13):4227-39.
[0869] Eisenschmidt,K.,T.Lanio,et al.(2005)."Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage."Nucleic Acids Res
33(22):7039-47.
33(22):7039-47.
[0870] FRANKEL SA,GERMAN WJ.Glioblastoma multiforme；review of 219 cases with regard to natural history,pathology,diagnostic methods,and treatment.J Neurosurg.1958 Sep；15(5):489-503.
[0871] Gardin,C.et al.(2007)."Postremission treatment of elderly patients with acute myeloid leukemia in first complete remission after intensive induction chemotherapy:results of the multicenter randomized Acute Leukemia French Association(ALFA)9803 trial".Blood.109(12):5129-5135.
[0872] Garneau,J.E.,M.E.Dupuis,et al.(2010)."The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA."Nature 468(7320):67-71.
[0873] Gasiunas,G.,R.Barrangou,et al.(2012)."Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria."Proc Natl Acad Sci U S A 109(39):E2579-86.
[0874] Henderson,D.J.,I.Naya,et al.(1991)."Comparison of the effects of FK-506,cyclosporin A and rapamycin on IL-2 production."Immunology 73(3):316-21.[0875] Jena,B.,G.Dotti,et al.(2010)."Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor."Blood 116(7):1035-44.[0876] Jinek,M.,K.Chylinski,et al.(2012)."A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity."Science 337(6096):816-21.
[0877] June,C.H.et al.(2011)."T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia".Sci.Transl.Med.3(95):ra73.
[0878] Kalish,J.M.and P.M.Glazer(2005)."Targeted genome modification via triple helix formation."Ann N Y Acad Sci 1058:151-61.
[0879] Li,T.,S.Huang,et al.(2011)."TAL nucleases(TALNs):hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain."Nucleic Acids Res 39(1):359-72.
[0880] Liu,J.,M.W.Albers,et al.(1992)."Inhibition of T cell signaling by immunophilin-ligand complexes correlates with loss of calcineurin phosphatase activity."Biochemistry 31(16):3896-901.
[0881] Lonial S,Mitsiades C.S.,Richardson P.G.,(2011)"Treatment options for relapsed and refractory multiple myeloma".Clin Cancer Res.17:1264-77.
[0882] Mali,P.,L.Yang,et al.(2013)."RNA-guided human genome engineering via Cas9."Science 339(6121):823-6.
[0883] Morgan RA,Johnson LA,Davis JL,Zheng Z,Woolard KD,Reap EA,Feldman SA,Chinnasamy N,Kuan CT,Song H,Zhang W,Fine HA,Rosenberg SA.Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.Hum Gene Ther.2012 Oct；23(10):1043-53.doi:10.1089/hum.2012.041.Epub 2012 Sep 24.Moscou,M.J.and A.J.Bogdanove(2009)."A simple cipher governs DNA recognition by TAL
effectors."Science 326(5959):1501.
effectors."Science 326(5959):1501.
[0884] Paques,F.and P.Duchateau(2007)."Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination:perspectives for gene therapy."Curr Gene Ther 7(1):49-66.
[0885] Park,T.S.,S.A.Rosenberg,et al.(2011)."Treating cancer with genetically engineered T cells."Trends Biotechnol 29(11):550-7.
[0886] Peipp,M.,D.Saul,et al.(2004)."Efficient eukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CD antigens for FACS applications."J Immunol Methods 285(2):265-80.
[0887] Perrin,A.,M.Buckle,et al.(1993)."Asymmetrical recognition and activity of the I-SceI endonuclease on its site and on intron-exon
junctions."Embo J 12(7):2939-47.
junctions."Embo J 12(7):2939-47.
[0888] Pingoud,A.and G.H.Silva(2007)."Precision genome surgery."Nat Biotechnol 25(7):743-4.
[0889] Porteus,M.H.and D.Carroll(2005)."Gene targeting using zinc finger nucleases."Nat Biotechnol 23(8):967-73.
[0890] Rouet,P.,F.Smih,et al.(1994)."Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease."Mol Cell Biol 14(12):8096-106.
[0891] Sorek,R.,C.M.Lawrence,et al.(2013)."CRISPR-mediated Adaptive Immune Systems in Bacteria and Archaea."Annu Rev Biochem.
[0892] Stoddard,B.L.(2005)."Homing endonuclease structure and function."Q Rev Biophys 38(1):49-95.
[0893] Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,Weller M,Fisher B,Taphoorn MJ,Belanger K,Brandes AA,Marosi C,Bogdahn U,Curschmann J,Janzer RC,Ludwin SK,Gorlia T,Allgeier A,Lacombe D,Cairncross JG,Eisenhauer E,Mirimanoff RO；
European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radiotherapy Groups；National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for
glioblastoma.N Engl J Med.2005 Mar 10；352(10):987-96.
European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radiotherapy Groups；National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for
glioblastoma.N Engl J Med.2005 Mar 10；352(10):987-96.
[0894] Van De Donk,N.W.C.J.,Kamps S.,Mutis,T.,Lokhorst,H.M.(2012)"Monoclonal antibody-based therapy as a new treatment strategy in multiple myeloma".Leukemia.26:199–213.
[0895] Van Meir,E.G.,Hadjipanayis,C.G.,Norden,A.D.,Shu,H.K.,Wen,P.,and Olson,J.J.(2010)“The Avenue to a Cure for Malignant Glioma”CA Cancer J Clin.60(3):166–193.
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于治疗癌症的组合免疫疗法 | 2020-05-12 | 684 |
| 在癌症免疫疗法中有用的生物标记 | 2020-05-12 | 97 |
| 用于治疗癌症的针对抑制细胞的近红外光免疫疗法(NIR-PIT) | 2020-05-17 | 614 |
| 用于治疗癌症的组合免疫疗法 | 2020-05-11 | 1027 |
| 癌症免疫疗法的组合物和方法 | 2020-05-13 | 595 |
| 用共刺激分子的联合癌症免疫疗法 | 2020-05-14 | 436 |
| 评估癌症免疫疗法的适合性的方法 | 2020-05-12 | 313 |
| 靶定癌症的IL-12免疫疗法 | 2020-05-12 | 273 |
| 使用病毒颗粒的癌症免疫疗法 | 2020-05-11 | 981 |
| 靶定癌症的IL-12免疫疗法 | 2020-05-14 | 314 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
癌症免疫疗法热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈