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用于癌症免疫治疗的转染T细胞和T细胞受体

阅读：1026发布：2020-07-15

专利汇可以提供用于癌症免疫治疗的转染T细胞和T细胞受体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本说明书涉及用于靶向癌细胞的结合肿瘤相关抗原 (TIA)的T细胞受体(TCR)，表达该受体的T细胞，该受体的制备方法，以及使用该受体治疗癌症的方法。特别是，本说明书涉及与含肽的HLA I类或II类分子结合的TCR及其变体，肽为例如IGF2BP3‑001，具有KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。本说明书进一步涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本说明书涉及癌症的免疫疗法。本说明书还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位，其可以例如作为刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞并转入患者的疫苗组合物的活性药物成分。与主要组织兼容性复合体 (MHC)分子结合的肽或与此类的肽也可以是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。，下面是用于癌症免疫治疗的转染T细胞和T细胞受体专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种TCR，其包含α链和β链，其中α链包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列为至少90％相同的TCRα可变结构域，β链包含与SEQ ID NO：10为至少90％相同的TCRβ可变结构域，其中TCR与IGF2BP3-001肽-MHC分子复合体特异性结合。
2.权利要求1所述的TCR，还包含TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域，其中TCRα恒定结构域与SEQ ID NO：2的TCRα恒定结构域为至少70％相同，TCRβ恒定结构域与SEQ ID NO：10的TCRβ恒定结构域为至少70％相同。
3.权利要求1或 2所述的TCR ，其中α恒定结构域包含α跨膜结构域
VIGFRILLLKVAGFNLLMTL(SEQ ID NO：18)，β恒定结构域包含β跨膜结构域
TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO：19)。
4.权利要求1至3中任一项所述的TCR，其中TCRa可变结构域由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，TCRβ可变结构域由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成。
5.权利要求1至4中任一项所述的TCR，其中TCRα恒定结构域由SEQ ID NO：2的TCRa恒定结构域组成，TCRβ恒定结构域由SEQ ID NO：10的TCRβ恒定结构域组成。
6.权利要求1至5中任一项所述的TCR，其包含由SEQ ID NO：2组成的α链和由SEQ ID NO：10组成的β链。
7.权利要求1至6中任一项所述的TCR，其中TCRα链包含至少一个选自SEQ ID NO：2的α链CDR1、CDR2和CDR3的α链互补决定区(CDR)，和/或TCR β链包含至少一个选自SEQ ID NO：
10的β链CDR1、CDR2和CDR3的β链互补决定区(CDR)。
8.权利要求1至7中任一项所述的TCR，其中TCRα链包含SEQ ID NO：2的全部三个CDR。
9.权利要求1至8中任一项所述的TCR，其中TCRβ链包含SEQ ID NO：10的全部三个CDR。
10.权利要求1至9中任一项所述的TCR，其中α链和β链融合形成单链TCR。
11.权利要求1至10中任一项所述的TCR，其中α链和/或β链包含可检测标记。
12.权利要求11所述的TCR，其中可检测标记选自放射性核素、荧光团和生物素。
13.权利要求1至12中任一项所述的TCR，其中α链和/或β链与治疗活性剂结合。
14.权利要求13所述的TCR，其中治疗活性剂选自放射性核素、化学治疗剂和毒素。
15.一种TCR，其包含γ链和δ链，其中γ链包含至少一个选自SEQ ID NO：2的α链CDR1、CDR2和CDR3的互补决定区(CDR)，和/或TCRδ链包含至少一个选自SEQ ID NO：10的β链CDR1、CDR2和CDR3的互补决定区(CDR)，其中所述TCR与IGF2BP3-001肽-MHC分子复合体特异性结合。
16.权利要求1至21中任一项所述的TCR，其中所述TCR与IGF2BP3-001肽-MHC分子复合体特异性结合，其中IGF2BP3-001肽由SEQ ID NO：1组成，且MHC分子是HLA I类或HLA II类分子。
17.一种核酸，其编码权利要求1至14中任一项所述的TCR的α链和/或β链、或权利要求
15所述的TCR的γ链和/或δ链。
18.一种表达载体，其包含与至少一个启动子序列可操作地连接的权利要求17所述的核酸。
19.一种宿主细胞，转化有权利要求18所述的表达载体。
20.权利要求19所述的宿主细胞，其为T细胞或T细胞祖细胞。
21.权利要求20所述的宿主细胞，其中T细胞或T细胞祖细胞获自癌症患者。
22.权利要求20所述的宿主细胞，其中T细胞或T细胞祖细胞获自健康供体。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1至16中任一项所述的TCR、权利要求17所述的核酸、权利要求18所述的表达载体、和/或权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体，以及任选地药学上可接受的赋形剂和/或稳定剂。
24.一种制备当由MHC分子提呈时与SEQ ID NO：1的肽特异性结合的TCR的方法，所述方法包括在适于促进TCR表达的条件下培养权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞。
25.一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用权利要求1至16中任一项所述的TCR、权利要求17所述的核酸、权利要求18所述的表达载体、权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞、和/或权利要求23所述的药物组合物。
26.权利要求25所述的方法，其中所述TCR在宿主细胞的表面上表达。
27.权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。
28.权利要求27所述的方法，其中T细胞或T细胞祖细胞是自体细胞。
29.权利要求27所述的方法，其中T细胞或T细胞祖细胞是同种异体细胞。
30.权利要求25所述的方法，其中TCR与治疗活性剂结合。
31.权利要求30所述的方法，其中治疗活性剂选自放射性核素、化学治疗剂和毒素。
32.权利要求25至31中任一项所述的方法，其中癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌和胆管癌、食管癌、或其组合。
33.权利要求25至32中任一项所述的方法，还包括对所述受试者施用至少一种化学治疗剂。
34.权利要求32至33中任一项所述的方法，还包括对所述受试者施用放射治疗。
35.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：
a)从所述受试者中分离细胞；
b)用编码权利要求1至16中任一项所述的TCR的载体转化细胞以产生转化细胞；
c)扩增该转化细胞以产生多个转化细胞；以及
d)对所述受试者施用该多个转化细胞。
36.权利要求35所述的方法，其中所述细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。
37.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：
a)从健康供体中分离细胞；
b)用编码权利要求1至16中任一项所述的TCR的载体转化细胞以产生转化细胞；
c)扩增该转化细胞以产生多个转化细胞；以及
d)对所述受试者施用该多个转化细胞。
38.权利要求37所述的方法，其中所述细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。
39.一种在生物样本中检测癌症的方法，包括：
a)使生物样本与权利要求1至16中任一项所述的TCR接触，以及
b)检测TCR与所述生物样本的结合。
40.权利要求39所述的方法，其中所述TCR包含可检测标记。
41.权利要求40所述的方法，其中可检测标记选自放射性核素、荧光团和生物素。
42.权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述检测在体外、体内或原位进行。
43.权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌和胆管癌、食管癌、或其组合。
44.权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞，其中所述T细胞为γ/δT细胞。
45.一种在靶细胞异常表达IGF2BP3的患者中杀灭靶细胞的方法，所述方法包含向患者施用有效量的表达权利要求1至16中任一项所述的TCR的T细胞、权利要求17所述的核酸、权利要求18所述的表达载体、权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞、和/或权利要求23所述的药物组合物。
46.权利要求1至16中任一项所述的TCR，其为可溶性TCR。
47.权利要求1至16中任一项所述的TCR，其中α链包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列为至少95％相同的TCRα可变结构域，β链包含与SEQ ID NO：10为至少95％相同的TCRβ可变结构域，其中所述TCR与IGF2BP3-001肽-MHC分子复合体特异性结合。
48.权利要求1至16中任一项所述的TCR，其相对于SEQ ID NO：2在α链中具有至少一个突变，和/或相对于SEQ ID NO：10在β链中具有至少一个突变，其中所述TCR对IGF2BP3-001肽-HLA分子复合体具有结合亲和力和/或结合半衰期，该结合亲和力和/或结合半衰期是未突变TCR对相同肽的结合亲和力和/或结合半衰期的至少两倍。
49.权利要求1至16中任一项所述的TCR，其相对于SEQ ID NO：2在α链中具有至少一个突变，和/或相对于SEQ ID NO：10在β链中具有至少一个突变，其中与未突变的TCR相比，所述TCR具有修饰的糖基化。
50.权利要求25至28以及45中任一项所述的方法，其中权利要求1至16中任一项所述的TCR、权利要求17所述的核酸、权利要求18所述的表达载体、权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞、或权利要求23所述的药物组合物至少施用两次，两次间隔至少24小时。
51.权利要求50所述的方法，其中在数天、数周或数月的期限内向受试者施用权利要求
1至16中任一项所述的TCR、权利要求17所述的核酸、权利要求18所述的表达载体、权利要求
19至22中任一项所述的宿主细胞、或权利要求23所述的药物组合物。
52.权利要求50或51所述的方法，其中通过局部输注施用权利要求1至16中任一项所述的TCR、权利要求17所述的核酸、权利要求18所述的表达载体、权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞、或权利要求23所述的药物组合物。
53.权利要求52所述的方法，其中局部输注通过输注泵和/或导管系统施用。
54.权利要求52或53所述的方法，其中所述局部输注注入实体瘤、供应实体瘤的血管、和/或实体瘤周围的区域。
55.权利要求25至38、45以及50至54中任一项所述的方法，其中权利要求1至16中任一项所述的TCR、权利要求17所述的核酸、权利要求18所述的表达载体、权利要求19至22中任一项所述的宿主细胞、或权利要求23所述的药物组合物以每次约104至约1010细胞的剂量施用。
56.一种TCR，其包含至少一个选自SEQ ID NO：2的α链CDR1、CDR2和CDR3的α链互补决定区(CDR)，和/或至少一个选自SEQ ID NO：10的β链CDR1、CDR2和CDR3的β链互补决定区(CDR)，其中所述TCR与IGF2BP3-001肽-MHC分子复合体特异性结合。

说明书全文

用于癌症免疫治疗的转染T细胞和T细胞受体

背景技术

[0001] 基于T细胞的免疫治疗靶向作用于主要组织兼容性复合体(MHC)分子提呈的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。这些肿瘤相关抗原(TAA)可以是源自所有蛋白类型的肽，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。

[0002] 细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的T细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺陷型核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞抗原(HLA)。

[0003] IGF2BP3是胰岛素样生长因子-II mRNA结合蛋白家族中的一员，涉及mRNA定位、周转及翻译控制。与对照组织相比，在许多癌症组织中存在IGF2BP3的高水平转录，这表明IGF2BP3蛋白可能在转化细胞的增殖中发挥着功能性作用。根据报告，许多癌症类型中表达IGF2BP3，包括透明细胞肾细胞癌(RCC)、恶性黑色素瘤、食管鳞状细胞癌、胰腺癌和尿路上皮肿瘤。因此，源自IGF2BP3的表位可用于将抗癌治疗剂靶向作用于表达IGF2BP3的癌症。

[0004] MHC分子有两类：MHC I类和MHC II类。肽和MHC I类的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征肿瘤相关抗原和相应T细胞受体在开发癌症免疫治疗(如：疫苗和细胞治疗)中非常重要。

[0005] 在MHC I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体(TCR)识别。因此，TAA是基于T 细胞疗法(包括但不限于肿瘤疫苗和细胞疗法)研发的起点。

[0006] 虽然在开发用于癌症治疗的分子靶向药物方面取得了进展，但是，本领域仍然需要开发专门靶向作用于癌细胞高度特异性分子的抗癌新药。本说明书通过提供特异性结合至IGF2BP3的表位，例如肽KIQEILTQV(IGF2BP3-001；SEQ ID NO：1)及其变体的新型TCR、核酸、载体和宿主细胞来满足需要；以及使用这些分子治疗癌症的方法。发明内容

[0007] 本说明书涉及包含α链和β链的T细胞受体(TCR)(“α/βTCR“)。在另一项实施方案中，本说明书涉及包含γ链和δ链的TCR(“γ/δTCR“)。

[0008] 本说明书还涉及TCR、单个TCR亚基(单独或组合)及其亚结构域、可溶性TCR(sTCR)，例如可溶性α/β二聚体TCR，其在恒定结构域残基之间至少有一个二硫键(二硫键在天然TCR中不存在)，和克隆TCR，这些TCR加工为自体或异体T细胞或T细胞祖细胞，还涉及制造这些TCR的方法以及载有所述TCR的其他细胞。

[0009] 本说明书进一步涉及一种特异性结合于IGF2BP3-001肽-HLA分子复合体的TCR，其中IGF2BP3-001肽包含或由KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)组成。在一项实施方案中，HLA分子为HLA-A*02。

[0010] 本说明书进一步涉及一种特异性结合于IGF2BP3-001肽-HLA分子复合体的TCR，其中所述IGF2BP3-001肽包含IGF2BP3-001的变体或由IGF2BP3-001的变体组成，该变体与SEQ ID NO：1为至少66％、优选至少77％、更优选至少88％同源(优选为至少77％或至少88％相同)，其中所述变体与HLA I类或II类分子结合和/或诱导与所述肽或其药用盐交叉反应的T细胞，其中所述肽不是基础的全长多肽。

[0011] 本说明书进一步涉及本说明书的一种肽，包含选自SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1至少66％、优选至少77％、更优选至少88％同源(优选为至少77％或至少88％相同)的变体的序列，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸。

[0012] 本说明书进一步涉及TCR，包含TCRα可变结构域，该TCRα可变结构域与表1所示的TCRα可变结构域具有至少75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性，优选为90％序列同一性；以及包含TCRβ可变结构域，该TCRβ可变结构域与表1所示的TCRβ可变结构域具有至少75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性，优选为90％序列同一性。

[0013] 在实施方案中，该TCRα可变结构域相对于表1所示TCRα结构域具有至少一个突变；和/或该TCRβ可变结构域相对于表1所示TCRβ结构域具有至少一个的突变。在一实施方案中，TCRα可变结构域和/或TCRβ可变结构域中包含至少一个突变的TCR对于IGF2BP3-001肽HLA分子复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少是包含未突变TCRα结构域和/或未突变TCRβ可变结构域的TCR的两倍。

[0014] 本说明书的TCRα链还可以包含与表1所示的TCRα恒定结构域具有至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的TCRα恒定结构域。本说明书的TCRβ链还可以包含与表1所示的TCRβ恒定结构域具有至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的TCRβ恒定结构域。

[0015] 本说明书的TCRα链还可以包含TCRα跨膜结构域和/或TCRα细胞内结构域。本说明书的TCRβ链还可以包含TCRβ跨膜结构域和/或TCRβ细胞内结构域。

[0016] 说明书进一步涉及包含表1中披露的一个或多个α链互补决定区(CDR)的TCRα链以及相对于表1所示CDR具有一个、两个、三个或四个取代基的变体。进一步的说明为包含选自表1所示的CDR1、CDR2和CDR3中至少一个CDR的TCRα链。进一步的说明为包含表1所示的α链CDR3的TCRα链。

[0017] 说明书进一步涉及包含表1中披露的一个或多个β链互补决定区(CDR)的TCRβ链以及相对于表1所示CDR具有一个、两个、三个或四个取代基的变体。进一步的说明为包含选自表1所示的TCRβ链CDR1、CDR2和CDR3中至少一个CDR的TCRβ链。进一步的说明为包含表1所示的β链CDR3的TCRβ链。

[0018] 说明书进一步涉及包含编码本说明书中TCR的核苷酸序列的分离或重组核酸。在一实施方案中，说明书中的核酸编码如表1所示的TCRα链和/或TCRβ链。

[0019] 说明书进一步涉及如本文所述的包含编码TCRα链、β链或两者的核酸的重组表达载体。

[0020] 说明书进一步涉及包含表达编码TCRα链、β链或两者的核酸的重组表达载体的分离宿主细胞。

[0021] 说明书进一步涉及包含根据本说明书的重组表达载体的分离宿主细胞，优选为其中细胞是人细胞，优选为外周血淋巴细胞(PBL)，更优选为CD4或CD8阳性T淋巴细胞。

[0022] 说明书进一步涉及包含该说明书的重组表达载体的分离PBL，其中所述PBL为CD8+T细胞或CD4+T细胞。

[0023] 该说明书进一步涉及包含本文所述的至少一个宿主细胞的细胞群。

[0024] 说明书进一步涉及本说明书的TCR和宿主细胞在治疗增殖性疾病中的用途，增殖性疾病为例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌(如，胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌。

[0025] 在一方面，宿主细胞是用编码说明书至少一种TCR的核酸转染的CD8+T细胞或CD4+T细胞，其中TCR包含表1中披露的至少一个氨基酸序列。另一方面，此类宿主细胞用于免疫治疗小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌(如，胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌。

[0026] 说明书进一步涉及杀死或减少癌细胞数量的方法，其包括使癌细胞与本文所述的TCR、核酸、载体或宿主细胞接触。还提供的是治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本文所述的TCR、核酸、载体或宿主细胞。

[0027] 本说明书进一步涉及一种本说明书中的TCR的核酸，以及一种能表达本说明书中核酸的表达载体。

[0028] 本说明书进一步涉及本说明中的一种TCR、本说明书中的一种核酸或本说明书中的一种表达载体在治疗疾病和药物中的用途，特别是在治疗癌症中的用途。

[0029] 本说明书进一步涉及含有本说明书中核酸或前述表达载体的宿主细胞。

[0030] 本说明书进一步涉及本说明书中的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。

[0031] 本说明书进一步涉及制备本说明书中肽的一种方法，所述方法包括培养本说明书中的宿主细胞，以及从所述宿主细胞或其培养基中分离肽。

[0032] 本说明书涉及一种本发明的方法，其中抗原通过与足量的抗原提成细胞接触而加载在表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子上，或者抗原通过将抗原/I类或II类MHC复合物单体四聚化而加载到I或II类MHC四聚体上。

[0033] 本说明书进一步涉及本说明书中的方法，其中抗原提呈细胞包括能表达或表达含SEQ ID NO：1所述肽或其变体的表达载体。

[0034] 本说明书进一步涉及以本说明书中的方法制造的激活的T细胞，其中所述T细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞表达含一种本说明书中氨基酸序列的多肽。

[0035] 本说明书进一步涉及一种杀灭患者癌症或抑制细胞的方法，其中患者癌细胞异常表达含本说明书中任何氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者按本说明书中的方法制造的有效量T细胞。

[0036] 本说明书进一步涉及本文所述的任何肽、本文所述的核酸、本文所述的表达载体、本文所述的细胞、本文所述的活化T淋巴细胞、本说明书中的T细胞受体、抗体或其他肽和/或肽-MHC结合分子作为一种药剂或在制造药剂中的用途。一方面，药剂优选为具有抗癌活性。

[0037] 优选情况为，所述药剂为细胞治疗药物、TCR或抗体。

[0038] 本说明书进一步涉及本说明书中的用途，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌(如，胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌，优选为小细胞肺癌细胞。

[0039] 本说明书进一步涉及一种基于本说明书中肽的生物标志物，在此称为“靶标“，其可用于诊断癌症，优选为非小细胞癌。所述标志物可以肽本身过度提呈或相应基因过度表达。标志物也可以用于预测治疗成功的可能性，优选为免疫疗法，最优选为靶向作用于该生物标志物识别的相同靶目标免疫疗法。例如，抗体或可溶性TCR可用于染色肿瘤切片以检测是否存在相关肽与MHC复合。或者，抗体或可溶性TCR具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。

[0040] 本说明书进一步涉及这些新靶标在确定可识别至少一种所述靶标的TCR，优选在确定激活T细胞的TCR中的用途。

[0041] 本说明书还涉及这些新靶标在癌症治疗中的用途。附图说明

[0042] 图1显示了健康组织和癌症中IGF2BP3-001肽提呈。

[0043] 图2-4显示了癌症和健康组织中IGF2BP3-001的表达。

[0044] 图5显示了用TCR R10P1A7的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+T细胞的MHC/IGF2BP3-001四聚体或MHC/NYESO1-001四聚体染色。用特异性结合于MHC/NYESO1-001复合体的
1G4TCR的RNA所转化的CD8+T细胞和模拟转化物作为对照。

[0045] 图6显示了在与载有IGF2BP3-001肽(SEQ ID NO：1)或同源但不相关的肽CLUA-001(SEQ ID NO：26)、CHCHD6-001(SEQ ID NO：27)、CDC42BPG-001(SEQ ID NO：28)、PARP14-002(SEQ ID NO：29)、SYNE2-001(SEQ ID NO：30)、IFT7-001(SEQ ID NO：31)、DHRS12-001(SEQ ID NO：32)、STX12-001(SEQ ID NO：33)、EEA-001(SEQ ID NO：34)、SENP7-001(SEQ ID NO：35)、或对照肽NYESO1-001(SEQ ID NO：36)的靶细胞共孵育后，用TCR R10P1A7(表1)的α和β链RNA电穿孔的CD8+T细胞中IFNγ的释放。用源自两个不同供体的CD8+T细胞获得IFNγ释放资料。RNA电穿孔的CD8+T细胞单独或与无载靶细胞共孵育作为对照。

[0046] 图7显示了与载有IGF2BP3-001(SEQ ID NO：1)或在SEQ ID NO：1第1-9位上有丙氨酸取代的各种IGF2BP3-001变体的靶细胞共孵育后，用TCR R10P1A7的α和β链RNA电穿孔的CD8+T细胞中IFNγ的释放。RNA电穿孔的CD8+T细胞单独或与载有对照肽NYESO1-001的靶细胞或无载靶细胞共孵育作为对照。用源自两个不同供体的CD8+T细胞获得IFNγ释放资料。

[0047] 图8.在分别与A-375黑素瘤细胞系、T98G胶质母细胞瘤细胞系和SK-BR-3乳腺癌细胞系共孵育后，用TCR R10P1A7的α和β链RNA(表1)电穿孔的CD8+T细胞中IFNγ的释放。RNA电穿孔的CD8+T细胞单独作为对照。

具体实施方式

[0048] 本说明书涉及包含α链和/或β链的T细胞受体(TCR)(“α/βTCR“)。还提供了由MHC分子提呈时可与TCR和抗体结合的IGF2BP3-001肽。本说明书还涉及核酸、载体和用于表达TCR的宿主细胞和本说明书的肽；以及使用它们的方法。

[0049] 定义

[0050] 除非另有说明，否则本文使用的所有术语定义如下。

[0051] 术语“T细胞受体“(缩写TCR)是指一种异二聚体分子，其包含一个α多肽链(α链)和一个β多肽链(β链)，其中所述异二聚体受体能够结合由HLA分子提呈的肽抗原。

[0052] 术语”T细胞反应”是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和启动。对于MHC I类限制性细胞毒性T细胞，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效应分子，优选为肽诱导的颗粒酶或穿孔素，或脱颗粒。

[0053] 本文所用”肽”这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为10、11、12或13个氨基酸长度或更长，如果为MHC-II类肽时(本说明书肽的较长变体)，至长可为14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长度或更长。

[0054] 因此，”肽”这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。优选的情况是，盐为肽的药用盐，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)盐。必须注意的是，本说明书中肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为该不是体内的盐。

[0055] 术语“肽“应也包括“寡肽“。本文使用的术语”寡肽”是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本说明书来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于15个氨基酸。

[0056] “多肽”这一术语是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。多肽的长度对于本说明书来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，多肽这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。

[0057] 一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有”免疫原性”(因此是本说明书中的一种”免疫原」”)。在本说明书的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，”免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本说明书的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽与MHC的复合体、和/或用于提高特异性抗体或TCR抗性的蛋白。

[0058] I类T细胞”表位”要求的是一种结合至MHC I类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链，β-2-微球蛋白和肽)，其可以通过T细胞负载匹配T细胞受体与具有适当亲和力的MHC/肽复合体结合来识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。

[0059] 编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本说明书蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。

[0060] 如本文所用的术语“肽的核苷酸编码“系指对肽进行核苷酸序列编码，其中该肽包括与将由用于产生TCR的树突细胞或另一细胞系统所表达该序列的生物系统兼容的人工(人造)启动和停止密码子。

[0061] 如本文所用的术语“TCR的核苷酸编码“系指对TCR进行一个或多个核苷酸序列编码，其中该TCR包括与将由用于产生TCR的T细胞或另一细胞系统所表达该序列的生物系统兼容的人工(人造)启动和停止密码子。

[0062] 本文提到的核酸序列既包括单链核酸也包括双链核酸。因此，除非本文另有所指，否则，例如对于DNA，具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工(双链DNA)以及该序列的互补序列。

[0063] 术语”编码区”系指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。

[0064] 编码区可来自非突变(”正常”)基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。

[0065] 术语”表达产物”系指多肽或蛋白质，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。

[0066] 术语”片断”当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。

[0067] 术语”DNA片段”系指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载体，进行识别、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此类片段以开放阅读框架(未被内部未翻译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。

[0068] 术语”引物”表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3′-OH末端。

[0069] 术语”启动子”表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。

[0070] 术语”分离”表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。另一方面，此类多核苷酸是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。

[0071] 本说明书中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以”纯化”的形式存在。术语”纯化”并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳同构型的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确涵盖所述多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或更高。

[0072] 根据本说明书公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以”浓缩的形式”存在。本文使用的术语”浓缩”是指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本说明书的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。术语”活性片段”系指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一种肽、多肽或核酸序列的片段，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起或在载体中给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，”活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。

[0073] 本文使用的”部分”(portion)、”节段”(segment)、”片段”(fragment)这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。

[0074] 根据本说明书，术语”等同度百分比”或”等同百分比”，如果指的是序列，则表示在待对比序列(”被对比序列”)与所述序列或权利要求的序列(”参考序列”)对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：

[0075] 等同度百分比＝100[1-(C/R)]

[0076] 其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中

[0077] (i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；

[0078] (ii)参考序列中每个空隙，以及

[0079] (iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异以及

[0080] (iv)必须在对准序列的第1位置开始对准；

[0081] 并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。

[0082] 如果”被对比序列”和”参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。

[0083] 在本说明书中，术语”同源性”系指两个氨基酸序列之间的同一度(参见上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的”同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是Vector NTI、GENETYX或由公共数据库提供的其他工具。

[0084] 本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Appay et al.，2006；Colombetti et al.，2006；Fong et al.，2001；Zaremba et al.，1997)。

[0085] 发明人用给定氨基酸序列的“变体“表示，一个或两个氨基酸残基等的侧链，例如，通过被另一个天然氨基酸残基的侧链或其他侧链取代而发生改变，这样，这种肽仍然能够以含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如没有提高)其能与HLA-A*02或-DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持(如没有提高)其与启动T淋巴细胞的TCR结合的能力。类似地，TCR可被修饰以便至少维持(如果不提升的话)其能与HLA-A或-DR等合适MHC分子/KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)复合体相互作用和结合，以及至少维持(如果不提升的话)启动T细胞的能力。

[0086] 随后，这些T细胞可与细胞和杀伤细胞发生交叉反应，这些细胞表达多肽，其中包含本说明书中定义的同源肽的天然氨基酸序列，如，KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)。正如科学文献和数据库(Rammensee et al.，1999；Godkin et al.，1997)中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性、电物理、疏水性和空间特性确定。一方面，本领域技术人员将有能力根据本说明书的教导通过保持已知的锚残基来修饰TCR的氨基酸序列，并且能够确定此类TCR变体是否保持与MHC I类或II类分子/KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)复合体结合的能力。描述的TCR变体重新结合MHC I类或II类分子/KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)复合体的能力。随后，表达该说明书TCR变体的T细胞可杀伤细胞，这些细胞表达含有同源肽(例如KIQEILTQV(SEQ ID NO：1))天然氨基酸序列的多肽。

[0087] 一方面，如果无另有说明，那么本文公开的肽或TCR可以通过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。优选情况是，这些取代位于所述肽氨基酸链的末端。对于TCR，优选情况是，这些取代位于TCRα链和TCRβ链的可变结构域。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定”保守取代”的基础。

[0088] 在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4-大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大芳香残基(Phe，Tyr，Trp)。

[0089] 较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种”激进”取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。

[0090] 一方面，此类取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可能被本说明书的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，非标准氨基酸(即，除了常见的天然蛋白原氨基酸)也可以用于取代之目的，以生产根据本说明书的免疫原和免疫原性多肽。

[0091] 如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的迭加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。

[0092] 本文所用的术语“鼠“或“人“在提及抗原识别构建体或TCR时，或本文所述的TCR的任何组分(例如，互补性决定区(CDR)、可变区、恒定区，α链和/或β链)是指分别源自小鼠或人未经排列的TCR基因座的TCR(或其组分)。

[0093] T细胞受体(TCR)

[0094] 在优选的实施方案中，该说明书涉及包含表1所示的TCRα链的TCR及其变体；以及表1所示的TCRβ链及其变体。在一方面，本文所述的TCR具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子/KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)复合体或II类/KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)复合体结合或特异性结合的能力。

[0095] 表1：根据本说明书的代表性TCR

[0096]

[0097]

[0098]

[0099] α/βTCR的α和β链以及γ/δTCR的γ和δ链通常被认为具有两个”结构域”，即可变和恒定结构域。可变结构域由可变区(V)和连接区(J)的组合。可变结构域还可能包括一个前导区(L)。β和δ链还可能包括一个多样区(D)。α和β恒定结构域还可能包括锚定α和β链至细胞膜的C末端跨膜(TM)结构域。

[0100] 因此，在本说明书中，术语“TCRα可变结构域“指无前导区(L)的TCRαV(TRAV)区和TCRαJ(TRAJ)区的组合；术语“TCRα恒定结构域“系指细胞外TRAC区域或C末端截短TRAC序列，以及任选的α跨膜结构域(VIGFRILLLKVAGFNLLMTL(SEQ ID NO：18))。

[0101] 同样地，术语“TCRβ可变结构域“系指无前导区(L)的TCRβV(TRBV)区和TCRβ D/J(TRBD/TRBJ)区的组合；术语“TCRβ恒定结构域“系指细胞外TRBC区域或C末端截短TRBC序列，以及任选的β跨膜结构域(TILYEILLGKATLYAVLVSALVL(SEQ ID NO：19))。

[0102] 相对于γ/δTCR，如本文所用的术语“TCRγ可变结构域“系指无前导区(L)的TCRγV(TRGV)区与TCRγJ(TRGJ)区的组合，术语TCRγ恒定结构域系指细胞外TRGC区域或C末端截短TRGC序列。同样地，术语“TCR δ可变结构域“系指无前导区(L)的TCR δV(TRDV)区与TCR δD/J(TRDD/TRDJ)区的组合，术语TCR δ恒定结构域系指细胞外TRDC区域或C末端截短TRDC序列。

[0103] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与表1中所述的TCR α链75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、95％、96％、
97％、98％或99％同一的TCRα链或由其组成。表1中所述的TCR α链包含前导(L)段、V链、三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)、接合区域(J)和恒定区域，如表1所定义。

[0104] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与表1中所述的TCR α可变结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、
95％、96％、97％、98％或99％同一的TCRα可变结构域或由其组成。

[0105] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与表1中所述的TCR α恒定结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为75％同一的TCRα恒定结构域或由其组成。

[0106] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRα可变结构域或由其组成，TCRα可变结构域包含至少一个选自表1中所示的α链CDR1、CDR2和CDR3的α链互补决定区(CDR)。在一项优选实施方案中，TCRα可变结构域包含表1所示的α链CDR3。在另一项优选实施方案中，TCRα可变结构域包含表1所示的α链CDR1、CDR2和CDR3。

[0107] 在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与表1的TCRα可变结构域具有至少90％序列同一性的TCRα可变结构域，或由其组成，并且包含表1中相同α可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3。

[0108] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与表1中所述的TCR β链75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、95％、96％、
97％、98％或99％同一性的TCRβ链或由其组成。表1中所述的TCRβ链包含前导(L)段、V链、三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)、接合区域(J)和恒定区域，如表1所定义。

[0109] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与表1中所述的TCRβ可变结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、
95％、96％、97％、98％或99％同一的TCRβ可变结构域或由其组成。

[0110] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与表1中所述的TCR β恒定结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为75％同一的TCRβ恒定结构域或由其组成。

[0111] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRβ可变结构域或由其组成，TCRβ可变结构域包含至少一个选自表1中所示的β链CDR1、CDR2和CDR3的β链互补决定区(CDR)。在一项优选实施方案中，TCRα可变结构域包含表1所示的β链CDR3。在另一项优选实施方案中，TCRβ可变结构域包含表1所示的β链CDR1、CDR2和CDR3。

[0112] 在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与表1的TCRβ可变结构域具有至少90％或95％序列同一性的TCRβ可变结构域，或由其组成，并且包含表1中相同TCR β可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3。

[0113] α链可变结构域可包含一个或多个αCDR结构域，其相对于表1所示的相应CDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。同样地，β链可变结构域可包含一个或多个βCDR结构域，其相对于表1所示的相应βCDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。

[0114] TCRα链和TCRβ链可以融合形成单链TCR。另一方面，TCRα和β链可以表达为可以组装成异二聚体的分离蛋白质。

[0115] 在一项实施方案中，表1的任何TCRα链与任何其他TCRβ链配对以产生特异性结合IGF2BP3-001肽HLA分子复合体的TCR。在另一项实施方案中，表1的任何TCRβ链与任何其他TCRα链配对以产生特异性结合于IGF2BP3-001肽HLA分子复合体的TCR。

[0116] TCR R10P1A7

[0117] 在一项实施方案中，本说明书的TCR分别包含分别对应于SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：10的TCR R10P1A7α链和/或β链或由其组成。

[0118] TCR R10P1A7的TCRα可变结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸22至130，或可选地由其组成；TCR R10P1A7的TCRα恒定结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸131至271，或可选地由其组成；TCR R10P1A7的TCRβ可变结构域包含SEQ ID NO：10的氨基酸26至139，或可选地由其组成；TCRβ恒定结构域包含SEQ ID NO：10的氨基酸140至318，或可选地由其组成。

[0119] 在一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含至少与SEQ ID NO：2的TCR α链75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、
95％、96％、97％、98％或99％同一的TCRα链。

[0120] 在另一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与SEQ ID NO：2的TCR α可变结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、0.95％、96％、97％、98％或99％同一的TCRα可变结构域。

[0121] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与SEQ ID NO：2的TCRα恒定结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为75％同一的TCRα恒定结构域。

[0122] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRα可变结构域，TCRα可变结构域包含至少一个选自SEQ ID NO：2的α链CDR1、CDR2和CDR3的α链互补决定区(CDR)。在一项优选实施方案中，TCRα可变结构域包含SEQ ID NO：2的α链CDR3。在另一项优选实施方案中，TCRα可变结构域包含SEQ ID NO：2的α链CDR1、CDR2和CDR3。

[0123] 在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQ ID NO：2的TCRα可变结构域具有至少90％序列同一性的TCRα可变结构域，并且包含SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3。

[0124] 在另一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含至少与SEQ ID NO：10的TCR β链75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、
95％、96％、97％、98％或99％同一的TCRβ链。

[0125] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与SEQ ID NO：10的TCR β可变结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为90％、
95％、96％、97％、98％或99％同一的TCRβ可变结构域。

[0126] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含至少与SEQ ID NO：10的TCR β恒定结构域75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同、优选为75％同一的TCRβ恒定结构域。

[0127] 在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRβ可变结构域，TCRβ可变结构域包含至少一个选自由SEQ ID NO：10的β链CDR1、CDR2和CDR3组成的组的β链互补决定区(CDR)。在一项优选实施方案中，TCRβ可变结构域包含SEQ ID NO：10的β链CDR3。在另一项优选实施方案中，TCRβ可变结构域包含SEQ ID NO：10的β链CDR1、CDR2和CDR3。

[0128] 在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQ ID NO：10的TCRβ可变结构域具有至少90％序列同一性的TCRβ可变结构域，并且包含SEQ ID NO：10的CDR1、CDR2和CDR3。

[0129] α链可变结构域可包含一个或多个αCDR结构域，其相对于SEQ ID NO：2的相应CDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。同样地，β链可变结构域可包含一个或多个βCDR结构域，其相对于SEQ ID NO：10的相应βCDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。

[0130] 在一项进一步优选的实施方案中，本说明书的TCR特异性结合IGF2BP3-001肽-HLA分子复合体，其中IGF2BP3-001肽选自KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)及其变体。在一项实施方案中，HLA分子是选自由HLA-A、HLA-B和HLA-C分子组成的组的I类MHC分子。在一项实施方案中，HLA分子是HLA-A*02。在另一项实施方案中，HLA分子是选自由HLA-DP和HLA-DR分子组成的组的II类MHC分子。

[0131] 本说明书的TCR优选结合至IGF2BP3-001肽HLA分子复合体，其具有约100μM或更小、约50μM或更小、约25μM或更小或约10μM或更小的结合亲和力(KD)。更为优选的情况是具有约1μM或更小、约100Nm或更小、约50nM或更小或约25nM或更小结合亲和力的高亲和力TCR。本发明的TCR优选结合亲和力范围的非限制性示例包括约1nM至约10nM；约10nM至约20nM；约20nM至约30nM；约30nM至约40nM；约40nM至约50nM；约50nM至约60nM；约60nM至约
70nM；约70nM至约80nM；约80nM至约90nM；以及约90nM至约100nM。

[0132] 与本说明书TCR相关，本文使用的“特异性结合“及其语法变体用于指对1001μM或更小的IGF2BP3-001肽-HLA分子复合体有结合亲和力(KD)的TCR。

[0133] 本说明书的α/β异二聚体TCR可能具有其恒定结构域之间的引入二硫键。这种类型的优选TCR包括那些具有一个TRAC恒定结构域序列和TRBC 1或TRBC2恒定结构域序列的TCR，除非TRAC的那苏氨酸48和TRBC1或TRBC2的丝氨酸57被半胱氨酸残基取代，所述半胱氨酸形成TRAC恒定结构域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定区序列之间的二硫键。

[0134] 不论具有或不具有上述的引入链间键，本说明书的α/β杂二聚体TCR可能具有一个TRAC恒定域序列和一个TRBC1或TRBC2恒定结构域序列，并且TRAC恒定结构域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定结构域序列可能通过TRAC外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2外显子2的Cys4之间的天然二硫键相连。

[0135] 本说明书的TCR可能包括选自由放射性核素、荧光团和生物素组成组中的可检测标记。本说明书的TCR可能结合至治疗活性剂，如放射性核素、化学治疗剂或毒素。

[0136] 在一项实施方案中，具有在α链中至少一个突变和/或具有在β链中至少一个突变的TCR与未突变的TCR相比，已经修改了糖基化。

[0137] 在一项实施方案中，在TCRα链和/或TCRβ链中包括至少一个突变的TCR对IGF2BP3-001肽HLA分子复合体有结合亲和力和/或结合半衰期，其是包含未突变TCRα链和/或未突变TCR β链的TCR的结合亲和力的至少两倍。肿瘤特异性TCR亲和力增强及其开发依赖于存在最佳TCR亲和力的窗口。这样窗口的存在是根据观察结果：HLA-A2限制性病原体特异性TCR与HLA-A2限制性肿瘤相关自身抗原特异性TCR相比，KD值通常大约低10倍(Aleksic et al.2012；Kunert et al.2013)。现已知，尽管肿瘤抗原可能具有免疫原性，但是因为肿瘤来自个体自身的细胞，因此仅突变蛋白质或翻译加工改变的蛋白将将被免疫系统视为外来物质。上调或过度表达(所谓的自体抗原)的抗原不一定诱导针对肿瘤的功能免疫应答：表达对这些抗原具有高度反应性的TCR的T细胞会在一种称为中枢耐受的程序中在胸腺内被不利选择(Xing etal.2012；Ruella et al.2014；Sharpe et al.2015)，也就是说只有对自身抗原具有低亲和力TCR的细胞才仍然存在。因此，本说明书的TCR或变体对IGF2BP3-001的亲和力可通过本领域熟知的方法来增强。

[0138] “药物组合物“是指适合在医疗机构用于人体的组合物。优选地，药物组合物为无菌状态，并根据GMP指南生产。

[0139] 本说明书的药物组合物还包括至少一种在一种药用载体中表达本说明书中TCR的宿主细胞。

[0140] 本说明书的药物组合物还可以包括药用辅料和/或稳定剂。

[0141] 此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和其他选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多赋形剂可在从A.Kibbe所著的Handbook of Pharmaceutical Excipients(Kibbe，2000)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病。示例性制剂可见EP21 12253，其通过引用整体并入本文。

[0142] 本说明书的另一方面提出了编码本说明书的肽、肽变体、TCR和TCR变体的核酸(例如，多核苷酸)。多聚核苷酸可能为，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合物，它们可为单链和/或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。本说明书的另一方面还提出了能够表达本说明书多肽的表达载体。

[0143] 对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可通过向载体补充可连接性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入补充性均聚物轨道，之后DNA片段被插入到载体DNA。然后，通过补充性均聚物尾巴的氢键结合，将载体和DNA片段结合，从而形成重组DNA分子。

[0144] 含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可通过多种管道购得，其中包括从国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，康涅狄格州，美国)购得。

[0145] 编码本说明书多肽的DNA理想修饰方法是使用Saiki等人(Saiki et al.，1988)所采用的聚合酶链反应方法。此方法可用于将DNA引入合适的载体(例如，通过设计合适的酶切位点)，也可用于本领域已知的其他有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘病毒载体或腺病毒载体为优选。

[0146] 一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，编码本说明书TCR-α和/或TCR-β链的核酸被克隆入表达载体，诸如γ逆转录病毒或慢病毒。重组病毒产生，然后测试功能，如抗原专一性和功能性亲合力。然后，最终产品的等分试样被用于转导靶T细胞群体(一般纯化自患者的PBMC)，在输入患者前展开。

[0147] 另一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，TCR RNA通过本领域中已知的技术(例如，体外转录系统)合成。然后，体外合成的TCRRNA通过电穿孔来重新表达肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链被引入获得自健康供体的原代CD8+T细胞。

[0148] 引入外周T细胞的TCR链可能与内源性TCR链竞争，与TCR表面表达所需的CD3复合体结合。由于高水平的TCR表面表达对通过表达肿瘤靶抗原的细胞触发赋予适当的灵敏度是必要的(Cooper et al.，2000；Labrecque et al.，2001)，因此增强TCR-α和TCR-β基因表达水平的策略是TCR基因治疗中的重要考虑因素。

[0149] 为了增加表达，编码本说明书TCR的核酸在操作上可连接到强启动子，例如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、巨细胞病毒(CMV)、鼠干细胞病毒(MSCV)U3、磷酸甘油酸激酶(PGK)、β-肌动蛋白、泛素蛋白和猿猴病毒40(SV40)/CD43复合启动子(Cooper et al.，2004；Jones et al.，2009)、延伸因子(EF)-1a(Tsuji et al.，2005)和脾脏病灶形成病毒(SFFV)启动子(Joseph et al.，2008)。在一优选实施方案中，启动子与被表达的核酸异源。

[0150] 除了强启动子外，本说明书的TCR表达盒可能含有附加的元素，可提高转基因表达，包括中枢多聚嘌呤区(CPPT)，其促进了慢病毒构建体的核易位(Follenzi et al.，2000)，和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元素(WPRE)，其通过提高RNA稳定性增加转基因表达水平(Zufferey et al.，1999)。

[0151] 本发明TCR的α和β链可由位于分开的载体核酸进行编码，或者可通过位于同一载体的多核苷酸编码。

[0152] 实现高水平的TCR表面表达需要引入TCR的TCR-α和TCR-β链高水平转录。为了实现它，本说明书的TCR-α和TCR-β链可在单一的载体中被克隆入双顺反子构建体，其已被证明能够克服这一障碍。使用TCR-α和TCR-β链在之间的病毒核糖体间进入位点(IRES)导致两链的协同表达，因为TCR-α和TCR-β链均由在翻译过程中分成两个蛋白质的单一转录物产生，从而确保了产生TCR-α和TCR-β链的相等摩尔比。(Schmitt et al.2009)。

[0153] 编码本说明书TCR的核酸可以是被优化以从宿主细胞增加表达的密码子。遗传密码冗余让一些氨基酸被一个以上的密码子编码，但某些密码子没有其他密码子“理想“，因为匹配tRNA以及其他因子的相对可用性(Gustafsson et al.，2004)。修改TCR-α和TCR-β基因序列使得每个氨基酸被用于哺乳动物基因表达的最佳密码子编码，以及消除mRNA不稳定性基序或隐蔽剪接位点，已显示可显著提高TCR-α和TCR-β基因表达(Scholten et al.，2006)。

[0154] 此外，引入的和内源性TCR链之间的错配可能会导致获得特异性，这些特异性对自身免疫构成显著风险。例如，混合TCR二聚体的形成可能会减少可用以形成正确配对TCR复合体的CD3分子数目，因此，可以显著降低表达所引入TCR的细胞的功能性亲合力(Kuball et al.，2007)。

[0155] 为了减少错配，本说明书引入的TCR链的C-末端结构域可以进行修改以促进链间亲和力，而降低引入链与内源TCR配对的能力。这些策略可能包括用鼠配对物取代人类TCR-α和TCR-βC端结构域(鼠化C端结构域)；通过引入第二半胱氨酸残基到引入TCR的TCR-α和TCR-β链产生C末端结构域的第二间二硫键(半胱氨酸修饰)；交换TCR-α和TCR-β链C端结构域的相互作用残基(“杵臼结构”)；直接熔合TCR-α和TCR-β链可变结构域至CD3ζ(CD3ζ融合)。(Schmitt et al.2009)。

[0156] 之后，DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能表达于合适的宿主，从而制成含本说明书肽或变体的多肽。因此，可根据已知技术使用编码本说明书肽或变体的DNA，用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从而表达和产生本说明书中的多肽。此类技术包括那些公开于，例如，美国专利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,
648的技术，其通过引用并入本文。

[0157] 编码含本说明书化合物多肽的DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能被加入到其他多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。

[0158] 一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列对转化细胞中的可选择性属性(如抗生素耐药性)进行编码。

[0159] 另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿主细胞。

[0160] 然后，本说明书中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。

[0161] 有许多已知的表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(如酵母菌)、丝状真菌(如曲霉菌)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库(Cell Biology Collection)中的CHO细胞。

[0162] 在一实施方案中，宿主细胞被改变结构以表达本说明书的TCR。在一优选实施方案中，宿主细胞为人T细胞或T细胞祖细胞。在一些实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞从癌症患者中获得。在另一些实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞从健康供体中获得。本说明书的宿主细胞相对于待治疗的患者可以为同种异体或自体的。在一实施方案中，宿主是被转化以表达α/βTCR的γ/δT细胞。

[0163] 典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴的SV40启动子以及抗性标志物(如新霉素)。一个实例为从Pharmacia公司(Piscataway，新泽西州，美国)获得的pSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla，加州92037，美国)获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒为酵母着丝粒质粒(Ycp)。基于CMV启动子的载体(如，来自于Sigma-Aldrich公司)提供了瞬时或稳定的表达、胞浆表达或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。

[0164] 强劲的人巨细胞病毒(CMV)启动子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平高达1mg/L。对于较弱的细胞株，蛋白质水平一般大约0.1mg/L。SV40复制原点的出现将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细菌细胞中的pMB1(pBR322的衍生物)复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的钙-内酰胺酶基因、hGHpolyA和f1的原点。含前胰蛋白酶原引导(PPT)序列的载体可使用抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其他与各种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。

[0165] 在另一项实施方案中，对本说明书的两个或更多的肽或肽变体进行编码，因此，以一个连续顺序(类似于“一串珠子”的构建体)表达。在达到目标，所述肽或肽变体可能通过连接符氨基酸的延伸处(例如LLLLLL)连接或融合一起，也可能他们之间没有任何附加的肽而被连接。这些构建体也可用于癌症治疗，可诱导涉及MHC I和MHC II类分子的免疫应答。

[0166] 本说明书还涉及一种宿主细胞，其以本说明书的多核苷酸载体构建转化而来。宿主细胞可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5(从Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda，马里兰州，美国)获得)和RR1(从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，马里兰州，美国)，ATCC编号31343获得)。优选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla，加州92037，美国)获得。优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3为ATCC中的CRL 1658细胞、猴肾源性COS-1细胞为ATCC中的CRL 1650细胞以及人胚胎肾细胞的293号细胞。优选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合适宿主细胞的概要，可从教科书(Paulina and Argelia Lorence《Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression，Reviews and Protocols》Part One，Second Edition，ISBN 978-1-58829-262-9)和本领域技术人员知道的其他文献中查到。

[0167] 含本说明书DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。关于原核宿主细胞的转化，请参见，例如，Cohen等人的文献(Cohen et al.，1972)和(Green and Sambrook，2012)。酵母细胞的转化在Sherman等人的文章(Sherman et al.，1986)中进行了描述。Beggs(Beggs，1978)中所述的方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染这些细胞的试剂等，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体配方，可从Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg，MD 20877，美国)获得。电穿孔也可用于转化和/或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。

[0168] 被成功转化的细胞(即含本说明书DNA结构的细胞)可用大家熟知的方法(如PCR)进行识别。另外，上清液存在的蛋白可使用抗体进行检测。

[0169] 应了解，本说明书中的某些宿主细胞用于制备本说明书中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其他宿主细胞可能对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞(如树突状细胞)可用于表达本说明书中的肽，使他们可以加加载相应的MHC分子中。因此，本说明书提出了含本说明书中核酸或表达载体的一种宿主细胞。

[0170] 在一项优选实施方案中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。2010年4月29日，美国食品和药物管理局(FDA)批准载有含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白可用于治疗无症状或症状轻微的转移性HRPC(Rini et al.，2006；Small et al.，2006)。

[0171] 另一方面，本说明书提出了一种配制一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。

[0172] 在另一项实施方案中，本说明书中的TCR、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹膜内(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的试验中成功使用(Walter et al.，2012)。

[0173] 用于主动免疫接种的多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。核酸可能为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。这种核酸的设计和引入方法为本领域所熟知。例如，Teufel等人的文献中有其概述(Teufel et al.，2005)。多核苷酸疫苗很容易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未完全了解。合适的载体和输送系统包括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如通过“基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR的表位。

[0174] 本说明书还涉及适体。适体(例如，参见WO 2014/191359及其中引用的文献)是短的单链核酸分子，其可以折迭为所定义的三维结构并识别特定的靶标结构。它们似乎是开发靶向治疗的合适替代方法。适体已显示可选择性与具有高亲和力和特异性的复合体靶标相结合。

[0175] 识别细胞表面分子的适体在过去十年内已经确定，并为开发诊断和治疗方法提供了手段。由于适体已显示几乎无毒性和免疫原性，因此，它们是生物医学应用中有前景的候选物质。事实上适体，例如前列腺特异性膜抗原识别适体，已被成功地用于靶向治疗并在体内模型的异种移植物中显示出功能。此外，认识到特定肿瘤细胞系的适体也已确定。

[0176] 可选择DNA适体来揭示各种癌细胞的广谱标识属性，特别是那些来自于实体瘤的细胞，而非致瘤和主要健康细胞不被识别。如果所识别的适体不仅识别肿瘤特异性子类型，而且与一系列肿瘤相互作用，这使适体适用于作为所谓的广谱诊断和治疗手段。

[0177] 此外，用流式细胞仪对细胞结合行为的研究显示，适体在纳摩尔范围内显示出很好的亲和力。

[0178] 适体用于诊断和治疗目的。一方面，至少一种或多种适体被肿瘤细胞吸取，因而可作为抗癌剂靶向递送的分子赋形剂，例如siRNA进入肿瘤细胞。

[0179] 可选择适体针对复合体的靶标，如细胞和组织以及包含、优选包括根据任何SEQ ID NO 14至SEQ ID NO 15的一个序列、根据本说明书的肽复合体或TCR与MHC分子，使用细胞SELEX(通过指数富集的配体系统进化)技术。

[0180] 在一项实施方案中，该说明书提供了如本文中所描述的产生TCR的方法，该方法包括在适于促进TCR表达的条件下培养能够表达TCR的宿主细胞。

[0181] 本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：用A2/IGF2BP3单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。

[0182] 本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。

[0183] 本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L9L单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。

[0184] 本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：获得含整个人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用IGF2BP3-001对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。

[0185] 本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：获得含整个人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。

[0186] 本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：获得含整个人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L9L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。

[0187] 本说明书还涉及根据说明书的方法，其中所述T细胞包含能够根据本说明书表达ATCR的表达载体。

[0188] 本发明还涉及一种在靶细胞异常表达IGF2BP3的患者中杀伤靶细胞的方法，所述方法包括向患者施用有效量的根据本说明书的TCR、可溶性TCR和/或T细胞。

[0189] 本说明书进一步涉及任何所述TCR、本说明书的一种核酸、本说明书的一种表达载体、本说明书的一种细胞、本说明书中的激活细胞毒性T淋巴细胞作为药剂或在制造药剂中的用途。本说明书进一步涉及一种根据本说明书的用途，其中药剂可有效抗癌。

[0190] 本说明书进一步涉及本说明书中的用途，其中所述癌细胞为小细胞肺癌或其他实体或血液肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊和胆管癌和食管癌。

[0191] 本说明书进一步涉及一种杀死癌细胞的方法，其包括使癌细胞与本说明书所述的宿主细胞接触。在一实施方案中，宿主细胞表达本说明书的TCR。在一项实施方案中，宿主细胞为T细胞或T细胞祖细胞。在一项优选实施方案中，癌细胞选自小细胞肺癌或其他实体或血液肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊和胆管癌和食管癌。在一些实施方案中，TCR与治疗活性剂结合。在某些实施方案中，治疗活性剂选自由放射性核素、化学治疗剂和毒素组成的组。

[0192] 本发明还涉及一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本发明的宿主细胞。在一实施方案中，宿主细胞表达本说明书的TCR。在一项实施方案中，宿主细胞为T细胞或T细胞祖细胞。在一实施方案中，宿主细胞是待治疗受试者的自体细胞。在另一项实施方案中，宿主细胞是待治疗受试者的同种异体细胞。在一项优选实施方案中，癌细胞选自小细胞肺癌或其他实体或血液肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊和胆管癌和食管癌。

[0193] 在一些实施方案中，TCR与治疗活性剂结合。本文所用的术语“治疗活性剂”系指用于治疗或预防疾病或不良医疗状况的化合物。在一项实施方案中，治疗活性剂用于治疗或预防癌症。在某些实施方案中，治疗活性剂选自由放射性核素、化学治疗剂和毒素组成的组。

[0194] 本说明书中的TCR、核酸和宿主细胞及其药物组合物可以通过本领域已知的途径施用于有需要的受试者，并且可以根据待治疗癌症的类型而变化。给药途径包括例如，局部给药(例如肿瘤内)和肠胃外给药(如皮下、腹膜内、肌内、静脉内、门静脉内和肝内)。在一项优选实施方案中，本说明书的TCR、核酸或宿主细胞或其药用组合物通过局部输注(例如使用输注泵和/或导管系统)施用于受试者的治疗部位，如实体肿瘤。在一项实施方案中，将本说明书的组合物输注入实体肿瘤，供应实体肿瘤的血管和/或实体肿瘤周围区域。

[0195] 在优选实施方案中，使用至少两次给药、每次相隔至少24小时的给药方案将本说明书的组合物施用于受试者。适用于本说明书组合物的给药方案包括例如每天一次、每两天一次和每三天一次。更优选的给药方案包括每周一次、每周两次、隔周一次、每月一次、每月两次。在特定的实施方案中，使用剂量递增方案，其中在数天、数周或数月内向受试者施用一系列的递增剂量。

[0196] 表达本发明TCR的宿主细胞的有效剂量包括例如，每剂至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109和至少1010个宿主细胞。在一项实施方案中，本说明书的宿主细胞以每剂量约104至约1010个细胞的剂量施用，优选为以每剂量约105至约109个细胞的剂量施用。在优选实施方案中，在至少两次或更多次给药周期的疗程中以给药方案施用剂量。

[0197] 本发明还涉及一种治疗癌症的方法，其包括与至少一种化学治疗剂和/或放射治疗组合施用本说明书的TCR、核酸或宿主细胞。

[0198] 还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：

[0199] a)从所述受试者中分离细胞；

[0200] b)用编码本说明书TCR的至少一个载体转化细胞以产生转化的细胞；

[0201] c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；和

[0202] d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。

[0203] 还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：

[0204] a)从健康供体中分离细胞；

[0205] b)用编码本说明书TCR的一个载体转化细胞以产生转化的细胞；

[0206] c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；和

[0207] d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。

[0208] 还提出了一种检测生物样本中癌症的方法，包括：

[0209] a)使生物样本与本说明书的TCR接触；

[0210] b)检测TCR与生物样本的结合情况。

[0211] 在一些实施方案中，检测癌症的方法在体外、体内或原位进行。

[0212] 本说明书进一步涉及一种基于本说明书的肽的特定标志物蛋白质和生物标志物，在此称为“靶标”，其可用于诊断和/或判断非小细胞肺癌的预后。本说明书还涉及这些新靶点在癌症治疗中的用途。

[0213] 本说明书的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合体的可溶性T细胞受体(sTCR)的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们的亲和力可以通过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用噬菌体展示(美国2010/0113300，(Liddy et al.，2012))。为了在噬菌体展示期间以及实际使用为药物时稳定T细胞受体之目的，可通过非天然二硫键、其他共价键(单链T细胞受体)或通过二聚化结构域连接α和β链(Boulter et al.，2003；Card et al.，2004；Willcox et al.，1999)。T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子(参见US 2013/0115191)或招募效应细胞的结构域，如抗CD3结构域等，以便对靶细胞执行特定的功能。另一方面，它表达于用于过继转移的T细胞中。参见例如WO 2004/033685A1、WO2004/074322A1和WO 2013/057586A1，其内容通过引用整体并入。

[0214] 此外，可用本说明书的肽和/或TCR或抗体或其他结合分子在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。

[0215] 该抗体或TCR也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体或TCR用放射性核素标记(如：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，从而可免疫闪烁扫描法使肿瘤局限化。在一实施方案中，其中的抗体或片段与两个或两个以上选自包括上述蛋白质组成的组的蛋白质靶目标细胞外域结合，并且亲和力值(Kd)低于1x10μM。

[0216] 诊断用抗体或TCR可通过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法包括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、计算机断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其他稀土、顺磁铁、氟-18和其他正电子发射放射性核素。此外，探针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行检测。这些抗体和/或TCR可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体和/或TCR探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体或TCR、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其他本行业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位蛋白的表达。

[0217] 实施例

[0218] 当与来自自体情况(即患者)的T细胞相比时，异体反应性环境可用于规避自身耐受性并产生具有更高亲合力的T细胞。这种情况的实例包括体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞(Sadovnikova et al.1998；Savage et al.2004；Wilde et al.2012)以及用人-MHC或人TCR对转基因小鼠进行免疫(Stanislawski et al.2001；Li et al.2010)。

[0219] 实施例1体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞(Savage et al.2004)

[0220] 获得知情同意后，使用来自HLA-A*02阳性和HLA-A*02阴性健康供体的PBMC。从MBLI中获得含有IGF2BP3-001的重组生物素化HLA-A2I类单体和A2荧光四聚体。将PBMC使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释的抗CD20SA室温下孵育1小时，洗涤，并使用生物素化的A2/IGF2BP3-001单体室温下温育30分钟，洗涤并在具有10％人AB血清的RPMI中用24孔板以3×106个细胞/孔进行铺板。第1天以10ng/mL加入白细胞介素7(IL-7；R&D Systems，Minneapolis，明尼苏达州，美国)，第4天以10U/mL加入IL-2(Chiron，黑尔菲尔德，英国)。在
5周的期间，每周用新鲜的PBMC对细胞进行再刺激，用1∶1的比例与应答细胞混合，并在24孔板中以3×106/孔进行铺板。

[0221] 为了获得高亲合力T细胞，将大约106个含有HLA-A2/IGF2BP3-001四聚体-藻红蛋白(PE)(获得自MBLI)的PBMC 37℃下孵育30分钟，随后用抗CD8-异硫氰酸荧光素(FITC)/别藻蓝蛋白(APC)在4℃下孵育20分钟，然后进行荧光启动细胞分选(FACS)-Calibur分析。用FACS-Vantage(Becton Dickinson，Cowley，牛津，英国)进行分选。分选的四聚体阳性细胞5 6
在24孔板中扩增，方法为每孔2x10个分选细胞、2x10 个经照射的A2阴性PBMC作为进料、
2x104CD3/CD28珠/mL(Dynal，奥斯陆，挪威)和IL-2(1000U/mL)。然后使用如此获得的高亲合力T细胞，采用本领域已知的技术鉴定和分离TCR，例如单细胞5′RACE(cDNA末端快速扩增)。然后使用本领域众所周知的方法分析非冗余TCR DNA进行氨基酸/DNA序列测定并克隆到表达载体中。

[0222] 实施例2TCR的克隆

[0223] 克隆TCR的方法是本领域已知的，例如，如美国专利8,519,100中所述，其全部内容通过引用并入本文用于所述方法。编码限制性位点NdeI(用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸 ) 的 α链可变区序列特异性寡核苷酸 A 1(ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc SEQ ID NO：22)，和编码限制性位点SalI的α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID NO：23)被用于扩增α链可变区。在β链的情况下，编码限制性位点NdeI(用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸 ) 的β链可变区序列特异性寡核苷酸 B 1(tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa SEQ ID NO：24)和编码限制性位点AgeI的β链恒定区序列特异性寡核苷酸B2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQ ID NO：25)被用于扩增β链可变区。

[0224] 将用NdeI和SalI切割的编码TCRα链的DNA序列连接到用NdeI和XhoI切割的pGMT7+Cα载体中。将用NdeI和AgeI切割的编码TCRβ链的DNA序列连接到用NdeI和AgeI切割的单独pGMT7+Cβ载体中。将结合的质粒转化为感受态大肠杆菌菌株XL1-blue细胞中，并在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂板上铺板。在37℃孵育过夜后，挑取单个菌落，并在含有100μg/ml氨苄青霉素的10ml LB中摇荡培养过夜。使用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，并使用自动DNA测序仪(Lark Technologies)对插入片段进行测序。

[0225] 从健康供体的T细胞中分离和扩增TCR R10P1A7，其编码肿瘤特异性TCR-α和TCR-β链。根据Walter等人描述的方法体外刺激来自健康供体的细胞。靶标特异性细胞使用靶标特异性多复位位子进行单细胞分选，以进行随后的TCR分离。例如根据Green和Sambrook所著的分子克隆实验室手册第四版所述的标准方法通过5′RACE分离TCR序列。TCR R10P1A7分离自HLA-A2阴性供体。对TCR R20P1H7、R7P1D5和R10P2G12的α和β可变区进行测序。

[0226] 发现R10P1A7TCRα可变结构域具有与SEQ ID NO：2的残基22-130相对应的氨基酸序列。发现R10P1A7TCRβ可变结构域具有与SEQ ID NO：10的残基26-139相对应的氨基酸序列。

[0227] 噬菌体展示技术可用于产生TCR变体库，以识别高亲和力突变。(Li etal，(2005)Nature Biotech 23(3)：349-354)一文中描述的TCR噬菌体展示技术和筛选方法可应用于选自表1所述TCR的参考TCR。

[0228] 例如，SEQ ID NO：2的α链序列的所有三个CDR区以及SEQ ID NO：10的β链序列的所有三个CDR区可以通过诱变进行靶向作用，并且每个CDR库单独进行筛选。

[0229] 因此，可鉴定亲和力和/或结合半衰期至少是参考TCR两倍的TCR(暗示至少是天然TCR的两倍)。

[0230] 使用包括在恒定区中引入半胱氨酸的方法重新折迭TCR异二聚体，以提供人造链间二硫键。使用这种方式制备了TCR，其由以下组成：(a)参考TCRβ链以及突变的α链；(b)参考TCRα链以及突变的β链；和(c)β和α链的各种组合，包括突变可变结构域。

[0231] 可以使用BIAcore方法分析高亲和力可溶性二硫键连接的TCR和TCR变体以及天然肽KIQEILTQV(SEQ ID NO：1)HLA-A复合体之间的相互作用。

[0232] 高亲合力TCR变体也可以通过酵母或T细胞展示技术从CDR突变体库中选择(Holler et al.2003；Chervin et al.2008)。因此，候选TCR变体为设计TCR CDR突变提供了指导，以获得高亲和力TCR变体(Robbins et al.2008；Zoete et al.2007)。

[0233] 实施例3自体T细胞工程技术

[0234] T细胞可进行工程化处理以表达高亲合力TCR(所谓的TCR疗法)或蛋白融合衍生的嵌合抗原受体(CAR)，增强了对MHC I/IGF2BP3-001复合体或MHCII/IGF2BP3-001复合体的抗原特异性。一方面，该方法克服了与中枢和外周耐受性相关的一些限制，并且生成在靶向作用于肿瘤更有效的T细胞，而不需要患者进行新的T细胞活化。

[0235] 一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，编码肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链的核酸(按实施例1-2中所述进行鉴定和分离)被克隆入表达载体，诸如γ逆转录病毒或慢病毒。重组病毒产生，然后测试功能，如抗原特异性和功能性亲合力。然后，最终产品的等分试样被用于转导靶T细胞群体(一般纯化自患者的PBMC)，在输入患者前扩增。

[0236] 另一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，TCR RNA通过本领域中已知的技术(例如，体外转录系统)合成。然后，体外合成的TCRRNA通过电穿孔来重新表达肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链被引入获得自健康供体的原代CD8+T细胞。

[0237] 为了测试外源性TCR在转化T细胞的细胞表面是否功能性地表达，使用四聚体染色技术检测MHC/IGF2BP3-001结合T细胞。如图5和表2所示，采用荧光标记的MHC/IGF2BP3-001四聚体染色观察到CD3阳性特异性T细胞群体在TCR表达性CD8+T细胞中的比例(6.78％)高于使用MHC/不相关肽(例如，NYESO1-001)四聚体(1.53％)或模拟对照(1.73％)的比例。作为对照，已知与MHC/NYESO1-001复合体特异性结合的对照TCR(1G4TCR)所转化的原代CD8+T细胞更容易被MHC/NYESO1-001四聚体检测到(17.69％)。这些结果表明TCR R10P1A7在T细胞表面表达，并可特异性结合于MHC/IGF2BP3-001复合体。TCR1G4的α和β链分别显示于SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中：

[0238] 1G4α链(SEQ ID NO：20)：

[0239] METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAI-YNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAAS-
Q P G DS A T Y L C A V R P T SG G S Y I P T F G R G T SL I V H P Y I Q N P D P A -VYQLRDSKSSDK SVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRS-
MDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKS-
FETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

[0240] 1G4β链(SEQ ID NO：21)：

[0241] MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMN-HEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLL-
SAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVA-
VFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPL-
KEQP ALNDSR YCLS SRLRV SATFWQ NPRNH FRCQV QFYGL SENDE -
WTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATIL-YEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG[0242] 为了确定TCR的特异性和亲和力，将转化的CD8+T细胞与载有IGF2BP3-001的靶细胞或载有同源但不相关的肽CLUA-001(SEQ ID NO：26)、CHCHD6-001(SEQ ID NO：27)、CDC42BPG-001(SEQ ID NO：28)、PARP14-002(SEQ ID NO：29)、SYNE2-001(SEQ ID NO：30)、IFT7-001(SEQ ID NO：31)、DHRS12-001(SEQ ID NO：32)、STX12-001(SEQ ID NO：33)、EEA-
001(SEQ ID NO：34)、SENP7-001(SEQ ID NO：35)或对照肽NYESO1-001(SEQ ID NO：36)的靶细胞共孵育，然后进行IFN-γ释放测定。无负载的靶细胞和CD8+T细胞单独作为对照。CD8+T细胞分泌IFN-γ提示具有细胞毒活性的T细胞活化。

[0243] 表2

[0244]

[0245] 如图6所示，在与载有IGF2BP3-001的靶细胞共培养后，用本次公开数据中RNA编码TCR R10P1A7进行电穿孔的原代CD8+T细胞释放的IFN-γ水平比对照肽靶细胞刺激的水平高得多。靶向肽滴定分析显示EC50范围为约1nM(表2)。这些结果表明，通过与MHC/IGF2BP3-001复合体的特异性相互作用，本发明的TCR R10P1A7可启动细胞毒性T细胞活性，例如IFN-γ释放。

[0246] 为了确定IGF2BP3-001/MHC复合体的TCR R10P1A7的结合基序，在IGF2BP3-001肽的9个氨基酸的每一个上均进行丙氨酸定位扫描分析。丙氨酸取代的IGF2BP3-001肽如表3所示。

[0247] 表3

[0248]

[0249] 简言之，用TCR R10P1A7转化的CD8+T细胞与载有IGF2BP3-001、IGF2BP3-001-A1至IGF2BP3-001-A9或对照肽NYESO1-001肽共同孵育，随后进行IFNγ释放测定，如上所述。

[0250] TCR R10P1A7丙氨酸定位扫描分析的结果所图7所示，并表4中进行总结。

[0251] 表4

[0252]TCR IGF2BP3-001的位置可促使TCR结合
R10P1A7 1，3-7

[0253] 针对具有相同基序的TCR R10P1A7进行的A*02结合肽全基因组筛选显示，无潜在交叉反应性肽。这些结果表明，本文所述的TCR表现出非常特定的识别模式，降低了非靶向作用的风险。

[0254] 为了确定本文所述的表达TCR的T细胞的功效，用R10P1A7的RNA电穿孔的原代CD8+T细胞与不同的人癌细胞系共同孵育，例如A-375(人黑素瘤细胞系)和T98G(人成胶质细胞瘤细胞系)(这两者为HLA-A2阳性和IGF2BP3-001(靶标)阳性)以及SK-BR-3(人乳腺癌细胞系，HLA-A2阴性和IGF2BP3-001阴性)，然后进行IFNγ释放测定。

[0255] 如图8所示，在HLA-A2呈阳性、IGF2BP3-001呈阳性的A-375和T98G细胞中都观察到了IFN-γ释放，但在SK-BR-3细胞中并非如此，其具有基础水平的IFN-γ释放，这与效应细胞具有可比性。这些结果表明，表达TCR R10P1A7的T细胞可以HLA-A2/IGF2BP3-001特异性的方式特异性地诱导靶向作用于癌细胞的细胞毒活性。

[0256] 本说明书提出了可用于治疗癌症/肿瘤(优选为过度提呈或只IGF2BP3-001的黑色素瘤和胶质母细胞瘤)的TCR。

[0257] 实施例5同种异体T细胞工程技术

[0258] γδT细胞是涉及抗病原体第一道防线的非常规T淋巴细胞效应子，可以通过启动受体等、TCR-γ和TCR-δ链以MHC无关的方式与肿瘤细胞相互作用并根除肿瘤细胞。这些γδT细胞显示出预活化的表型，其在启动后可快速产生细胞因子(IFN-γ、TNF-α)和发生强细胞毒性反应。这些T细胞对许多癌症具有抗肿瘤活性，并表明γδT细胞介导的免疫治疗是可行的并且可诱导客观的肿瘤反应。(Braza et al.2013)。

[0259] 使用固定化抗原、激动单克隆抗体(mAb)，肿瘤衍生的人造抗原呈递细胞(aAPC)或活化mAb和aAPC的组合的最新进展已成功地用寡克隆或多克隆TCR扩增γδT细胞谱。例如，固定化的主要组织兼容性复合体I类链相关A是表达TCRδ1同种型的γδT细胞的刺激物，且板结合活化抗体已经离体扩增了Vδ1和Vδ2细胞。在aAPC上共培养后，产生了临床上足够量neg neg的TCRδ1、TCRδ2和TCRδ1 TCRδ2 ，并且这些亚组在体外和体内显示出记忆表型和对肿瘤反应性的差异。(Deniger et al.2014)。

[0260] 另外，通过引入TCR-α和TCR-β链可以证明γδT细胞适于遗传修饰。(Hiasa et al.2009)。本说明书的另一方面涉及表达与IGF2BP3-001结合的TCR-α和TCR-β的γδT细胞的产生。为此，γδT细胞通过Deniger et al.2014所述的方法扩增，接着将表达与IGF2BP3-001结合(如实施例3所述)的TCR的重组病毒转导入扩增的γδT细胞。然后将病毒转导的γδT细胞输注入患者。

[0261] 实施例6慢病毒的构建体和表达分析

[0262] 简而言之，制备了两个测试构建体(“R10”)。然后将这些构建体用于产生具有良好滴定度和产出率的慢病毒支架。然后将慢病毒支架用于转导原代T细胞(2个供体)，随后通过流式细胞术检测基于四聚体结合的TCR的表面表达。

[0263] 表5A：慢病毒构建体及其对照-所测试的各供体(系列表格对应于构建体)

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重组李斯特菌疫苗菌株及其用于癌症免疫疗法的方法	2020-05-17	251
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