评估癌症免疫疗法的适合性的方法
阅读：313发布：2020-05-12
专利汇可以提供评估癌症免疫疗法的适合性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及鉴定适合于用免疫检查点干预 治疗 的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括在从所述患者分离的样品中分析表达的移码插入/缺失突变负荷。，下面是评估癌症免疫疗法的适合性的方法专利的具体信息内容。
1.用于鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括在从所述受试者分离的样品中分析表达的移码插入/缺失突变的负荷。
2.用于鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的样品中表达的移码插入/缺失突变的负荷，其中与参照样品相比更高的表达的移码插入/缺失突变负荷指示对免疫疗法的响应。
3.用于预测或测定具有癌症的受试者是否会响应用免疫疗法治疗的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的样品中表达的移码插入/缺失突变的负荷，其中较高的表达的移码插入/缺失突变负荷指示对所述治疗的响应。
4.用于预测或测定癌症类型是否会响应用免疫疗法治疗的方法，所述方法包括测定来自所述癌症的样品中表达的移码插入/缺失突变的负荷，其中较高的表达的移码插入/缺失突变负荷指示对所述治疗的响应。
5.治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)通过根据权利要求1或2的方法鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者；
并且
(ii)用免疫疗法治疗所述受试者。
6.用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，其包括用免疫疗法治疗具有癌症的受试者，其中所述受试者已经测定为具有与参照样品相比更高的表达的移码插入/缺失突变负荷。
7.用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述方法包括用免疫疗法治疗具有癌症的受试者，所述受试者已经通过根据权利要求1或2的方法鉴定为适合于用免疫疗法治疗。
8.用于在治疗或预防受试者中的癌症的方法中使用的免疫疗法，所述方法包括：
(i)通过根据权利要求1或2中任一项的方法鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者；并且
(ii)用免疫疗法治疗所述受试者。
9.用于在治疗或预防受试者中的癌症中使用的免疫疗法，其中所述受试者已经测定为具有与参照样品相比更高的表达的移码插入/缺失突变负荷。
10.用于在治疗或预防受试者中的癌症中使用的免疫疗法，所述受试者已经通过根据权利要求1或2的方法鉴定为适合于用免疫疗法治疗。
11.根据前述权利要求中任一项的方法或使用的免疫疗法，其中所述表达的移码插入/缺失突变是肿瘤抑制基因表达的移码插入/缺失突变。
12.根据前述权利要求中任一项的方法或使用的免疫疗法，其中所述表达的移码插入/缺失突变编码克隆新抗原。
13.根据前述权利要求中任一项的方法或使用的免疫疗法，其中通过外显子组测序、RNA-seq、全基因组测序和/或靶向基因小组测序来鉴定所述插入/缺失突变。
14.根据前述权利要求中任一项的方法或使用的免疫疗法，其中所述样品是来自所述受试者的肿瘤、血液或组织样品。
15.根据前述权利要求中任一项的方法或使用的免疫疗法，其中所述免疫疗法是免疫检查点干预或细胞疗法。
16.根据权利要求15的方法或使用的免疫检查点干预，其中所述免疫检查点干预与CTLA4、PD-1、PD-L1、Lag-3、Tim-3、TIGIT或BTLA相互作用。
17.根据权利要求16或权利要求17的方法或使用的免疫检查点干预，其中所述免疫检查点干预是派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗或伊匹单抗。
18.根据权利要求15的方法或使用的免疫疗法，其中所述细胞疗法是T细胞疗法。
19.根据前述权利要求中任一项的方法或使用的免疫疗法，其中所述癌症选自：膀胱癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞和间皮瘤)、脑癌(神经胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、黑素瘤、梅克尔细胞癌、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、胰腺癌、肝胆肿瘤、生殖细胞癌、前列腺癌、头颈癌、甲状腺癌和肉瘤。
20.根据权利要求19的方法或使用的免疫疗法，其中所述癌症选自：黑素瘤、梅克尔细胞癌、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱尿路上皮癌(BLAC)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)和MSI高癌症。
21.根据权利要求19的方法或使用的免疫疗法，其中所述癌症是黑素瘤。
22.根据权利要求19的方法或使用的免疫疗法，其中所述癌症是肾癌(肾细胞)。
23.根据前述权利要求中任一项的方法或使用的免疫疗法，其中所述受试者是哺乳动物，优选人、猫、狗、马、驴、绵羊、山羊、猪、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。
24.根据权利要求22的方法或使用的免疫疗法，其中所述受试者是人。
评估癌症免疫疗法的适合性的方法
发明领域
[0001] 本发明涉及鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的具有癌症的受试者的方法。本发明进一步涉及用于预测具有癌症的受试者是否会响应用免疫检查点干预的治疗的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 肿瘤突变负荷(TMB)与多种肿瘤类型中对免疫疗法的响应和治疗方式有关，所述治疗方式包括检查点抑制剂(CPI)和基于细胞的疗法。但是，尽管TMB是临床相关的生物标志物，但仍有明显的机会来改进与对免疫疗法的响应相关的分子特征。
[0004] 特别地，关于TMB作为免疫疗法生物标志物的主要假设涉及以下事实：体细胞变异能够产生肿瘤特异性新抗原(neoantigen)。但是，绝大多数突变似乎没有免疫原性效果。例如，尽管在典型的肿瘤样品中预测了数百种高亲和力的新抗原，但是肽筛选常规每个肿瘤仅检测到针对几种新抗原的T细胞反应性。
[0005] 因此，本领域中需要鉴定会响应免疫疗法的备选且改进的方式，以及备选的免疫疗法生物标志物。本发明解决了此需要。
[0006] 本发明已经发现了移码插入/缺失(fs-插入/缺失)代表不常见(泛癌中值＝每个肿瘤4)但高度免疫原性的体细胞变异子集。fs-插入/缺失可以产生增加的具有较大突变体结合特异性的肿瘤特异性新抗原的丰度。但是，fs-插入/缺失导致过早终止密码子(PTC)，并且易于经由无义介导的衰变(non-sense mediated decay,NMD)过程在信使RNA水平上降解。NMD通常发挥监视途径的功能，以保护真核细胞免受截短蛋白的毒性积累。本发明人已经发现fs-插入/缺失的子集逃脱NMD降解，其在翻译时基本上有助于指导抗肿瘤免疫，因此代表了对免疫疗法的响应的生物标志物。
[0007] 发明概述
[0008] 根据第一方面，本发明提供了用于鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括在从所述受试者分离的样品中分析表达的移码插入/缺失突变的负荷。
[0009] 如本文所指，“插入/缺失突变”指生物体的核苷酸序列(例如DNA或RNA)中碱基的插入和/或缺失。通常，插入/缺失突变发生在生物体的DNA，优选基因组DNA中。合适地，插入/缺失突变发生在受试者的肿瘤细胞的基因组DNA中。合适地，插入/缺失可以是插入突变。合适地，插入/缺失可以是缺失突变。
[0010] 合适地，插入/缺失可以是1至100个碱基，例如1至90、1至50、1至23或1至10个碱基。
[0011] 根据本发明的另一方面，提供了鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的样品中表达的移码插入/缺失突变的负荷，其中与参照样品相比更高的表达的移码插入/缺失突变负荷指示对免疫疗法的响应。
[0012] 在另一方面，本发明提供了用于预测或测定具有癌症的受试者的预后或预测具有癌症的受试者的存活的方法，该方法包括测定来自所述受试者的样品中表达的移码插入/缺失突变的负荷，其中较高的表达的移码插入/缺失突变负荷指示改善的预后或改善的存活。
[0013] 本发明进一步提供了用于预测或测定癌症类型是否会响应用免疫疗法的治疗的方法，该方法包括测定来自所述癌症的样品中表达的移码插入/缺失突变的负荷，其中较高的表达移码插入/缺失突变负荷指示对所述治疗的响应。
[0014] 在另一方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0015] (i)根据本发明的方法鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者；并且[0016] (ii)用免疫疗法治疗所述受试者。
[0017] 在另一方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，其包括对受试者施用免疫疗法的步骤，该受试者已经使用本发明的方法鉴定为适合于用免疫疗法的治疗。
[0018] 本发明进一步提供了用于治疗或预防受试者中的癌症的方法中使用的免疫疗法，该方法包括：
[0019] (i)使用根据本发明的方法鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者；并且
[0020] (ii)用免疫疗法治疗所述受试者。
[0021] 本发明进一步提供了用于治疗或预防受试者中的癌症中使用的免疫疗法，该受试者已经使用本发明的方法鉴定为适合于用免疫疗法的治疗。
[0022] 因此，本发明满足了本领域对治疗和预防癌症的新的、备选的和/或更有效的方式的需要。
[0024] 图1：(a)肾癌具有最高的泛癌插入/缺失比例。绘制了来自TCGA的19种实体瘤类型间插入/缺失的突变的比例(即，插入/缺失数目/(插入/缺失数目+SNV数目)。最后两个箱形图是另外的独立的肾细胞癌复制数据集。与所有其他非肾TCGA样品相比，基于KIRC分组计算统计学关联。(b)肾癌具有最高的泛癌插入/缺失计数。绘制了来自TCGA的19种实体瘤间插入/缺失突变的绝对计数。最后两个箱形图是另外的独立肾细胞癌复制数据集，基于KIRC分组，与所有其他非肾TCGA样品相比计算统计学关联。
[0025] 图2：TCGA泛癌分组中所有患者间的具有移码插入/缺失新抗原的复现基因。在X轴上绘制了含有移码插入/缺失新抗原的独特样品的数目，并且在Y轴上绘制了独特的新抗原的数目(即每个突变可以产生多种新抗原)。标记了在>30个样品中突变或具有>80个新抗原的基因。
[0026] 图3：按癌症类型的肿瘤特异性新抗原计数。第一个图绘制了snv衍生的新抗原的计数，第二个图是移码插入/缺失衍生的新抗原的计数，第三个图是仅突变体新抗原结合剂(mutant only neoantigen binder)的计数，第四个图是从SNV/插入/缺失衍生的新抗原的比例，第五个图是仅突变体等位基因结合的新抗原的比例，最后是饼状图，呈现具有多于或少于5个仅突变体新抗原结合剂的样品的比例。前3个图按中值排序，从最低(左)到最高(右)。4和5图与3图相同排序。
[0027] 图4：(a)通过Hugo等人、Snyder等人和Van Allen等人的黑素瘤分组间对检查点抑制剂疗法的响应来分开非同义SNV突变负荷(第一)、框内插入/缺失负荷(第二)和移码插入/缺失负荷(第三)。(b)基于非同义SNV突变负荷(顶部)、框内插入/缺失负荷(中间)和移码插入/缺失负荷(底部)的检查点抑制剂患者响应率。对于每种测量将患者分为高(上四分位数)和低(底部3个四分位数)组。针对Hugo等人、Snyder等人和Van Allen等人黑素瘤分组呈现了分析。
[0028] 图5：基于i)移码插入/缺失新抗原计数(fs-插入/缺失-新抗原)，ii)框内插入/缺失突变计数(if-插入/缺失-突变)和iii)非同义SNV新抗原计数(ns-snv-新抗原)，在ccRCC患者中比较免疫基因签名(signatures)。左：对于i)、ii)和iii)，在高组和低组之间显示了中值签名表达的百分比变化(FPKM-上四分位数标准化)。发现几种途径仅在高fs-插入/缺失-新抗原组中上调。右：高fs-插入/缺失-新抗原组内的相关性分析证明CD8+T细胞签名与MHC I类抗原呈递基因和细胞溶解活性两者密切相关。
[0029] 图6：通过Snyder等人黑素瘤分组中对检查点抑制剂疗法的响应分开非同义SNV突变负荷(第一)、框内插入/缺失负荷(第二)、移码插入/缺失负荷(第三)和克隆移码插入/缺失负荷(第四)。
[0030] 图7：图A显示了研究设计和方法论办法的改善。图的左手侧显示了fs-插入/缺失触发的过早终止密码子，其落入基因的中间外显子中，与有效的无义介导的衰变(NMD)相关的位置。图的右手侧显示了fs-插入/缺失触发的过早终止密码子，该密码子落入基因的最后一个外显子中，与绕过NMD相关的位置。图B显示了对于落入第一个、中间、倒数第二个或最后一个外显子位置，表达的fs-插入/缺失和非表达的fs-插入/缺失之间的比值比(OR)。使用Fisher精确检验计算比值比和相关的p值。任意使用着色来区分组。误差棒表示OR估计值的95％置信区间。图C显示了按外显子组位置的表达的fs-插入/缺失的变体等位基因频率。使用Kruskal-Wallis检验来检验组之间分布的差异。图D显示非表达的fs-插入/缺失突变相对于表达的fs-插入/缺失突变的蛋白表达水平。使用双侧Mann Whitney U检验评估组之间的差异。
[0031] 图8：图A显示了三个黑素瘤检查点抑制剂(CPI)治疗的分组，根据对疗法的“无临床益处”或“临床益处”分为几组。每个分组显示了三个度量：(上排)TMB非同义SNV计数，(中排)移码插入/缺失计数和(下排)NMD逃脱突变计数。第一列是Van Allen等人抗CTLA4分组，中间列是Snyder等人抗CTLA4分组，最后一栏是Hugo等人抗PD1分组。最右边的是三个分组间每个度量的元分析(meta-analysis)p值，显示了与来自CPI治疗的临床益处的关联。使用双侧Mann Whitney U检验评估组之间的差异。使用组合来自独立检验的P值的Fisher方法对分组间的结果进行元分析。图B显示了对于具有＝>1个NMD逃脱突变和0个NMD逃脱突变的患者，具有来自CPI疗法的临床益处的患者％。图C显示了过继细胞疗法治疗分组中比较的相同的三个度量。
[0032] 图9：显示了在个性化疫苗和CPI研究中通过实验测试T细胞反应性的fs-插入/缺失的外显子位置，发现它们是a)T细胞反应性(左手栏)或b)T细胞非反应性(右手栏)。当fs-插入/缺失突变落入与NMD逃脱相关的外显子位置(第一个、倒数第二个或最后一个)的情况下，转录物颜色为深蓝色；在fs-插入/缺失落入与NMD胜任(competence)相关的外显子位置(中间)中的情况下，转录物颜色为浅蓝色。在灰色线条中，显示了对于T细胞反应性和T细胞非反应性组，落入NMD逃脱外显子位置中的fs-插入/缺失的总体比例。使用Fisher精确检验计算P值。
[0033] 图10：图A显示了fs-插入/缺失的选择分析，如针对功能上等同的SNV终止获得突变(stop-gain mutation)为基准。显示了落入每个外显子位置组中的fs-插入/缺失(与SNV终止获得相比)的比值比。使用Fisher精确检验计算比值比和相关的p值。任意使用着颜来区分组。误差棒表示OR估计值的95％置信区间。图B显示了TCGA SKCM(左)和MSI(右)分组的总体存活Kaplan-Meir图。使用Cox比例风险模型进行总体存活分析。
[0034] 图11：数据显示了三个黑素瘤检查点抑制剂(CPI)治疗的分组，根据对疗法的“无临床益处”(浅蓝色)或“临床益处”(深蓝色)分成组，对表达的nsSNV突变计数(使用等位基因特异性RNAseq)测试关联。在第一栏中是Van Allen等人抗CTLA4分组，中间栏是Snyder等人抗CTLA4分组，并且最后一栏是Hugo等抗PD1分组。
[0035] 发明详述
[0036] 本发明基于如下的令人惊讶的发现预测，即癌症的表达的移码插入/缺失突变的负荷特别与受试者对免疫疗法例如免疫检查点干预或细胞疗法的响应有关。特别地，本发明基于令人惊讶的发现，即与其他类型的突变，例如单核苷酸变异相比，癌症的插入/缺失突变负荷——特别是表达的移码插入/缺失突变负荷——特别与受试者对免疫检查点干预或细胞疗法的响应有关。
[0037] 不希望受理论的束缚，本发明人认为可以提供对免疫疗法的此种改善的响应性，因为与其他类型的突变(例如SNV)相比，插入/缺失突变，特别是表达的移码插入/缺失突变，导致MHC I类分子呈递高度独特且差异性的“非自身”肽。此外，与SNV突变相比，插入/缺失突变——特别是移码突变——产生增加的每个突变的新抗原数目。这些高度独特的非自身肽提供了突变体特异性MHC结合，它们由即使在胸腺选择和删除后存在于受试者中的具有高亲和力TCR的T细胞识别。因此，对受试者施用检查点干预释放这些高亲和力T细胞，以靶向针对肿瘤的有效T细胞介导的免疫应答。
[0038] 如本文所使用，“插入/缺失突变负荷”可以指“插入/缺失突变数”和/或“插入/缺失突变比例”。
[0039] “突变”是指与来自同一个体的健康细胞相比，肿瘤细胞中核苷酸序列(例如DNA或RNA)的差异。核苷酸序列的差异可以导致不由来自同一个体的健康细胞(例如非癌细胞)表达的蛋白质表达和/或由肿瘤细胞表达的I类MHC分子呈递“非自身”肽。
[0040] 可以通过外显子组测序、RNA-seq、全基因组测序和/或靶向基因小组测序和/或单一基因的常规Sanger测序来鉴定插入/缺失突变。合适的方法是本领域已知的。
[0041] Boa等人(Cancer Informatics.2014；13(Suppl 2):67-82.)和Ares等人(Cold Spring Harb Protoc.2014Nov 3；2014(11):1139-48)分别提供了外显子组测序和RNA-seq的描述。靶向基因小组测序的描述可以参见例如Kammermeier等人(J Med Genet.2014Nov；51(11):748-55)和Yap KL等人(Clin Cancer Res.2014.20:6605)。也参见Meyerson等人,Nat.Rev.Genetics,2010 and Mardis,Annu Rev Anal Chem,2013。靶向基因测序小组也是商品化的(例如，如由Biocompare((http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/
161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/)汇总)。
161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/)汇总)。
[0042] 合适的测序方法包括但不限于高通量测序技术，例如下一代测序(Illumina,Roche Sequencer,Life Technologies SOLIDTM)、单分子实时测序(Pacific Biosciences)、真单分子测序(True Single Molecule Sequencing)(Helicos)、或不使用发光技术而是使用其他物理方法检测测序反应或测序产物的测序方法，例如Ion Torrent(Life Technologies)。
[0043] 可以使用本领域已知的方法进行序列比对，以鉴定与来自非肿瘤样品的DNA和/或RNA相比来自肿瘤样品的DNA和/或RNA中的插入/缺失。例如，可以使用如本实施例中以及由Koboldt DC,Zhang Q,Larson DE,Shen D,McLellan MD,Lin L,et al.VarScan 2:somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing.Genome research.2012；22(3):568-76描述的方法进行与参照样品相比的核苷酸差异。
[0044] 可以使用本实施例中描述的方法进行与参照样品相比的核苷酸差异。合适地，参照样品可以是种系DNA和/或RNA序列。
[0045] 在一个优选的实施方案中，插入/缺失突变是移码插入/缺失突变。此类移码插入/缺失突变产生新的可读框，其通常与受试者中相应健康细胞中的非突变DNA/RNA编码的多肽高度不同。
[0046] 移码突变通常在可读框中引入过早终止密码子(PTC)，并且所得的mRNA被靶向进行无义介导的衰变(NMD)。本发明人已经测定，由移码插入/缺失突变产生的不同的可读框能够逃脱NMD并经历生产性翻译以产生多肽序列。不希望受到理论的束缚，通常不被靶向以进行NMD，并且因此会产生可以由肿瘤细胞中MHC I类分子呈递的肽的插入/缺失移码突变可以特别指示对检查点干预的响应性，因为它们提供了T细胞介导的免疫响应的有效靶物。
[0047] 合适地，本方法可以包括鉴定被靶向或不被靶向以进行NMD的插入/缺失移码突变。
[0048] 如本文所用，术语“表达的插入/缺失”意图等同于逃脱NMD(并因此得到表达)的插入/缺失。因此，“表达的移码插入/缺失”等同于已经逃脱NMD的移码插入/缺失。
[0049] 本文定义了高插入/缺失突变负荷。
[0050] 样品
[0051] 从肿瘤分离活组织检查和样品是本领域的常规实践，并且可以根据任何合适的方法进行，并且此类方法对于本领域技术人员而言是已知的。
[0052] 样品可以是肿瘤样品、血液样品或组织样品。
[0053] 在某些实施方案中，所述样品是肿瘤相关的体液或组织。
[0055] 合适地，样品可以是循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外来体。可以使用本领域已知的方法从获自受试者的血液样品中分离循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外来体。
[0056] 可以根据本领域已知的任何方法获得肿瘤样品和非癌性组织样品。例如，可以从已经经历切除的癌症患者获得肿瘤和非癌样品，或者它们可以通过使用皮下针提取，通过显微解剖或通过激光捕获来获得。可以例如从尸体供体或健康供体获得对照(非癌性)样品。
[0057] 可以根据例如Nature.2017Apr 26；545(7655):446-451或Nat Med.2017Jan；23(1):114-119从血液样品分离ctDNA和循环肿瘤细胞。
[0058] 可以使用本领域已知的方法从样品中分离适合于下游测序的DNA和/或RNA。例如，可以使用基于酚的提取来进行DNA和/或RNA分离。基于酚的试剂含有变性剂和RNA酶抑制剂的组合以破坏细胞和组织，并随后从污染物分离DNA或RNA。例如，可以使用提取程序诸如使用DNAzolTM、TRIZOLTM或TRI REAGENTTM的提取程序。可以使用固相提取方法(例如旋转柱)，例如PureLinkTMGenomic DNA微型试剂盒或QIAGEN RNeasyTM方法进一步分离DNA和/或RNA。可使用本领域已知的方法(RT-PCR)将分离的RNA转化为cDNA以用于下游测序。
[0059] 适合于治疗的受试者
[0060] 在一方面，本发明提供了用于鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括在从所述受试者分离的样品中分析表达的移码插入/缺失突变的负荷。
[0061] 如本文所用，术语“适合于治疗”可以指更可能响应用免疫疗法的治疗的受试者，或者作为用免疫疗法的治疗的候选者的受试者。与使用本发明测定为不合适的受试者相比，适合于治疗的受试者可以更可能响应所述治疗。根据本发明测定为适合于治疗的受试者可以展现响应于用免疫疗法的治疗的持久的临床益处(DCB)，其可以定义为持续至少6个月的部分响应或稳定的疾病。
[0062] 可以将从受试者获得的癌细胞中鉴定或预测的表达的移码插入/缺失突变的数目与一个或多个预定阈值进行比较。使用此类阈值，可以将受试者分为指示对治疗的响应程度的类别。
[0063] 可以相对于癌症患者的参照分组测定阈值。该分组可以包括至少10、25、50、75、100、150、200、250、500或更多的癌症患者。该分组可以是任何癌症分组。或者，患者可以都具有所讨论受试者的相关或特定癌症类型。
[0064] 本发明进一步提供了用于鉴定适合于用免疫疗法的治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的样品中表达的移码插入/缺失突变的负荷，其中与参照样品相比更高的表达的移码插入/缺失突变负荷指示对免疫疗法的响应。
[0065] 如本文所定义，表达的移码插入/缺失突变负荷可以指表达的移码插入/缺失突变的数目和/或插入/缺失突变相对于突变总数的比例。
[0066] 合适地，表达的移码插入/缺失突变负荷可以指表达的移码插入/缺失突变的数目。表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”数目可以意味着数目大于癌症患者的参照分组中预测的表达的移码插入/缺失突变的中值，例如预测为在参照分组的上四分位数中的表达的移码插入/缺失突变的最小数目。
[0067] 在另一个实施方案中，表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”数目可以定义为至少5、6、7、8、9、10、12、15或20个表达的移码插入/缺失突变。
[0068] 合适地，表达的移码插入/缺失突变负荷的“高”或“更高”数目可以定义为表达的移码插入/缺失突变占总突变计数的比例(表达的移码插入/缺失比例)。合适地，可以通过计算表达的移码插入/缺失突变的数目作为突变总数的分数来提供表达的移码插入/缺失比例。
[0069] 合适地，突变的总数可以定义为表达的移码插入/缺失突变的数目+SNV突变的数目。因此，在某些实施方案中，可以通过计算表达的移码插入/缺失突变的数目作为表达的移码插入/缺失突变+SNV突变的总数的分数(即表达的移码插入/缺失突变的数目/表达的移码插入/缺失突变+SNV突变的数目)来提供表达的移码插入/缺失的比例。
[0070] 合适地，表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”比例大于在癌症患者的参照分组中测定或预测的表达的移码插入/缺失突变的中值比例，例如测定或预测在参照分组的上四分位数中的表达的移码插入/缺失突变的最小比例。
[0071] 在另一个实施方案中，表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”比例可以定义为突变总数的至少约0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.12、0.15、0.20、0.25或0.30。
[0072] 本领域技术人员将理解，提及表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”数目可以是上下文特定的，并且可以相应地进行适当的分析。
[0073] 如上文，可以在具有任何癌症或具有相关/特定癌症的受试者分组的情况内测定表达的移码插入/缺失突变负荷。因此，可以通过将以上讨论的方法应用于参照分组来测定表达的移码插入/缺失突变负荷。因此，表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”数目可以对应于大于在癌症患者的参照分组中预测的表达的移码插入/缺失突变的中值数目，例如预测在参照分组的上四分位数中的表达的移码插入/缺失突变的最小数目。表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”比例可以对应于大于在癌症患者的参照分组中预测的表达的移码插入/缺失突变的中值比例，例如预测为在参照分组的上四分位数中表达的移码插入/缺失突变的最小比例。
[0074] 合适地，本方法可以包括测定表达的移码插入/缺失突变的数目和表达的移码插入/缺失突变的比例。可以通过本领域已知的方法，例如如本实施例所述的方法分析表达的移码插入/缺失突变的数目和/或比例。
[0075] 免疫疗法
[0076] “免疫疗法”描述了利用受试者自身的免疫系统对抗癌症的治疗方法。它通过帮助免疫系统识别和攻击癌细胞而起作用。
[0077] 在如本文所述的本发明的一方面，免疫疗法是免疫检查点干预。
[0078] 免疫检查点指硬连接到免疫系统中的多种抑制途径，所述途径对于维持自我耐受以及调控外周组织中生理免疫响应的持续时间和幅度至关重要，以使附带的组织损害最小化。然而，尽管免疫检查点对于调控健康组织中的免疫响应至关重要，但是在癌性组织的情况下，免疫检查点可以帮助肿瘤逃避宿主免疫响应，其在其它情况下将有助于消灭肿瘤。
[0079] 因此，肿瘤可以增选某些免疫检查点途径作为免疫抵抗的主要机制，尤其针对对肿瘤抗原特异性的T细胞。但是，由于许多免疫检查点是由配体-受体相互作用起始的，它们可以容易被抗体阻断或被重组形式的配体或受体调控。此类干预构成了针对癌症的新型治疗攻击的基础。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)抗体是获得美国食品药品管理局(FDA)批准的此类免疫治疗剂的第一种，随后还采用了一些其他疗法。
[0080] 尽管免疫检查点抑制剂证明是持续抗击癌症的有用工具，但并非所有患者响应此类治疗。本发明促进会响应免疫检查点干预的患者的改善的鉴定。
[0081] 如所描述的根据本发明的方法可以进一步包括以下步骤：对已经鉴定为适合于用免疫检查点干预的治疗的受试者施用免疫检查点干预。
[0082] 因此，本发明还提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法：
[0083] (a)其中所述方法包括：
[0084] (i)通过本发明的方法鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的具有癌症的受试者；
[0085] (ii)用免疫检查点干预治疗所述受试者；
[0086] (b)其中所述受试者已经测定为具有与参照样品相比更高的表达的移码插入/缺失突变负荷；或
[0087] (c)通过根据本发明的方法已鉴定出哪个受试者适合于用免疫检查点干预治疗。
[0088] 如本文所定义，“治疗”是指相对于治疗前的症状，减轻、缓解或消除正在治疗的疾病、病症或感染的一种或多种症状。
[0089] “预防”(或防范)是指延迟或预防疾病、病症或感染的症状发作。预防可以是绝对的(使得不发生疾病)或者可以仅在某些个体中或在有限的时间量内有效。
[0090] 如本文所用，“免疫检查点干预”可以指与信号传导相互作用或信号传导级联(在细胞外或细胞内水平)相互作用或调控信号传导相互作用或信号传导级联(在细胞外或细胞内水平)以提高/增强免疫细胞活性(特别是T细胞活性)的任何疗法。例如，免疫检查点干预可以预防、减少或最小化对免疫细胞活性(特别是T细胞活性)的抑制。免疫检查点干预可通过增加共刺激信号传导来增加免疫细胞活性(特别是T细胞活性)。
[0091] 合适地，“免疫检查点干预”可以是与免疫检查点抑制剂分子相互作用或调控免疫检查点抑制剂分子的疗法。在此类实施方案中，免疫检查点干预在本文中也可以称为“检查点阻断疗法”、“检查点调控剂”或“检查点抑制剂”。
[0092] 免疫检查点抑制剂分子是本领域已知的，并且例如包括CTLA-4、PD-1、PD-L1、Lag-3、Tim-3、TIGIT和BTLA。“抑制剂”是指通过防止例如这些途径对T细胞活性的抑制的任何手段。这可以通过阻断受体配体相互作用的抗体或分子、细胞内信号传导途径抑制剂以及阻止T细胞表面上的免疫检查点分子表达的化合物来实现。
[0093] 检查点抑制剂包括但不限于例如CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、Lag-3抑制剂、Tim-3抑制剂、TIGIT抑制剂和BTLA抑制剂。可以增加免疫细胞活性的干预的实例包括但不限于通过免疫调节受体传递阳性信号的共刺激抗体，包括但不限于ICOS、CD137、CD27 OX-40和GITR。
[0094] 预防、减少或最小化对免疫细胞活性的抑制的合适的免疫检查点干预的实例包括派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、杜鲁他单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、替西木单抗(tremelimumab)和伊匹单抗(ipilimumab)。
[0095] 在如本文所述的本发明的一方面，免疫疗法是细胞疗法，例如过继细胞疗法。在一方面，细胞疗法是T细胞疗法。
[0096] 过继细胞疗法是将细胞转移到患者中以转移细胞的免疫功能和其他特征。细胞最通常是免疫来源的，例如T细胞，并且可以是自体的或同种异体的。若是同种异体的，则它们通常是HLA匹配的。通常，在癌症免疫疗法中，从患者中提取T细胞，任选地进行基因修饰，并在体外培养，然后返回同一患者。自体细胞而不是同种异体细胞的转移使移植物抗宿主疾病问题最小化。进行过继细胞疗法的方法是本领域已知的。
[0097] 用ACT转移的T细胞可以是CART。经嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CART)在选择性靶向特定细胞类型以及利用免疫系统监视能力和以强烈特异性对肿瘤细胞的有力的自我扩充细胞毒性机制中具有巨大潜力。此技术提供了以单克隆抗体可变区片段的特异性靶向新生性细胞，并通过效应T细胞功能的细胞毒性影响细胞死亡的方法。例如，抗原受体可以是scFv或任何其他单克隆抗体域。在一些实施方案中，抗原受体也可以是与靶细胞结合的任何配体，例如与细胞膜蛋白天然缔合的蛋白质的结合域。
[0098] 如所描述的根据本发明的方法可以进一步包括对已经鉴定为适合于用免疫疗法治疗的受试者施用细胞疗法的步骤。
[0099] 因此，本发明还提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法：
[0100] (a)其中所述方法包括：
[0101] (i)通过根据本发明的方法鉴定适合于用免疫疗法治疗的具有癌症的受试者；
[0102] (ii)用细胞疗法治疗所述受试者；
[0103] (b)其中所述受试者已经测定为具有与参照样品相比更高的表达的移码插入/缺失突变负荷；或
[0104] (c)通过根据本发明的方法已经鉴定哪个受试者适合于用免疫疗法治疗。
[0105] 在如本文所述的本发明的一方面，受试者具有侵入前疾病，或者是已经切除其原发性疾病的受试者，他们可以需要辅助疗法或受益于辅助疗法。
[0106] 使用本发明的方法的治疗还可以涵盖靶向循环肿瘤细胞和/或源自肿瘤的转移。
[0107] 根据本发明的用于治疗癌症的方法和用途可以与另外的癌症疗法组合进行。特别地，根据本发明的免疫检查点干预可以与共刺激抗体、化学疗法和/或放射疗法、靶向疗法或单克隆抗体疗法组合施用。
[0108] 预测免疫疗法治疗结果的方法
[0109] 在另一方面，本发明提供了用于预测或测定具有癌症的受试者是否会响应用免疫疗法的治疗的方法，该方法包括测定已经从所述受试者中分离的样品中表达的移码插入/缺失突变负荷。
[0110] 鉴于本实施例中呈现的令人惊讶的发现，本领域技术人员将在本发明的背景下认识到具有高或更高的表达的移码插入/缺失突变负荷的受试者，例如在受试者分组中或在使用许多不同受试者或分组鉴定的范围内相对于具有较低的表达的移码插入/缺失突变负荷的受试者可以具有改善的存活。
[0111] 可以使用本文提供的方法测定表达的移码插入/缺失突变负荷的参照值。
[0112] 表达的移码插入/缺失突变负荷可以是如本文定义的表达的移码插入/缺失突变数或表达的移码插入/缺失突变比例。
[0113] 所述方法可以涉及测定在癌症受试者分组中预测的表达的移码插入/缺失突变负荷，并且：
[0114] (i)测定在该分组中预测的表达的移码插入/缺失突变的中值数目和/或比例；其中该中值数目是参照值；或
[0115] (ii)测定预测在该分组的上四分位数中的表达的移码插入/缺失突变的最小数目和/或比例，其中该最小数目和/或比例是参照值。
[0116] 此类“中值”或“在上四分位数中的最小数目”可以在任何癌症分组本身中测定，或者备选在相关/特定癌症类型中测定。
[0117] 合适地，表达的移码插入/缺失突变的“高”或“更高”数目可定义为至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个插入/缺失突变。
[0118] 合适地，表达的移码插入/缺失突变的“高”或“较高”比例可以定义为总突变的至少约0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.12、0.15、0.20、0.25或0.30。
[0119] 本领域的技术人员将理解，提及“高”或“更高”的表达的移码插入/缺失突变负荷可以是上下文特定的，并且可以相应地进行适当的分析。
[0120] 因此，本发明还提供了用于预测或测定具有癌症的受试者是否会响应用免疫疗法治疗的方法，其包括测定来自受试者的一个或多个癌细胞中的表达的移码插入/缺失突变负荷，其中例如相对于如上讨论的分组，更高的表达的移码插入/缺失突变负荷指示对治疗的响应或改善的存活。在一个优选的实施方案中，癌症是肾癌(肾细胞)或黑素瘤。
[0121] 肿瘤抑制物
[0122] 在一方面，表达的移码插入/缺失突变可以在肿瘤抑制基因中。
[0123] 肿瘤抑制基因可以定义为保护细胞免于形成肿瘤/癌细胞的基因。因此，通常与其他遗传变化结合，引起由肿瘤抑制基因编码的蛋白质的功能丧失或降低的突变可促成细胞进展为癌症。肿瘤抑制基因可以分组为几类，包括看守基因(caretaker gene)、看门人基因(gatekeeper gene)和园丁基因(landscaper gene)。
[0124] 由肿瘤抑制基因编码的蛋白质通常对细胞周期的调节具有阻抑或抑制作用和/或促进细胞凋亡。
[0125] 肿瘤抑制基因的实例包括但不限于视网膜母细胞瘤(RB)、TP53、ARID1A、PTEN、MLL2/MLL3、APC、VHL、CD95、ST5、YPEL3、ST7、ST14和编码SWI/SNF染色质重塑复合物成分的基因。
[0126] 因此，本方法可以包括测定肿瘤抑制基因中的表达的移码插入/缺失突变负荷。
[0127] 新抗原
[0128] 合适地，插入/缺失突变产生新抗原。如本文所述的根据本发明的插入/缺失突变可以产生表达的移码新抗原。
[0129] 新抗原是肿瘤特异性抗原，其是癌细胞内突变的结果。因此，新抗原不由健康者(即非肿瘤细胞)表达。如本文所述，新抗原可以被加工以产生独特的肽，当在MHC分子的背景下呈递时，其可以被T细胞识别。
[0130] 合适地，表达的移码插入/缺失突变产生克隆新抗原。
[0131] 因此，“克隆”新抗原是在整个肿瘤中有效表达并基本上在每个肿瘤细胞内编码的新抗原。“分支”或“亚克隆”新抗原是在肿瘤中的细胞或区域子集或一定比例的细胞或区域中表达的新抗原。
[0132] “在整个肿瘤中存在”、“在整个肿瘤中有效表达”和“基本上在每个肿瘤细胞内编码”可以意味着克隆新抗原在分析样品的肿瘤的所有区域中表达。
[0133] 应当理解，测定“基本上在每个肿瘤细胞内编码的”突变是指统计计算，因此要服从统计分析和阈值。
[0134] 同样，测定克隆新抗原“在整个肿瘤中有效表达”是指统计计算，因此需要服从统计分析和阈值。
[0135] 在基本上每个肿瘤细胞或基本上所有肿瘤细胞中有效表达意指突变存在于样品中分析的所有肿瘤细胞中，如使用适当的统计方法所测定的。
[0136] 举例来说，描述含有突变的癌细胞比例的癌细胞分数(CCF)可用于测定突变是克隆的还是亚克隆的。例如，可以通过将变体等位基因频率与拷贝数和纯度估值相结合来测定癌细胞分数，如Landau等人(Cell.2013Feb14；152(4):714-26)所述。
[0137] 合适地，可以针对在所分析的每个肿瘤区域内鉴定的所有突变计算CCF值。若仅使用一个区域(即仅单一样品)，则将仅获得一组CCF值。这将提供关于在该肿瘤区域内的所有肿瘤细胞中存在哪些突变的信息，从而将指示突变是躯干的还是分支的。将肿瘤区域中的所有亚克隆突变(即CCF<1)测定为分支，而将具有CCF＝1的克隆突变测定为躯干的。
[0138] 如所述，测定克隆突变服从统计分析和阈值。因此，若测定突变具有CCF95％置信区间>＝0.75，例如0.80、0.85、0.90、0.95、1.00或>1.00，则可以将突变鉴定为躯干的。相反，若在分析的任何样品中测定突变具有CCF 95％置信区间<＝0.75，例如0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01，则可以将突变鉴定为分支的。
[0139] 应当理解，通过鉴定从肿瘤分离的超过一个样品的克隆突变来提高鉴定躯干突变的方法的准确性。
[0140] 因此，本方法可以包括测定克隆新抗原的表达的移码插入/缺失突变负荷。
[0141] 在某些实施方案中，本方法可以包括测定表达的移码插入/缺失突变负荷，其从肿瘤抑制基因产生克隆新抗原。
[0142] 受试者
[0144] 癌症
[0145] 合适地，癌症可以是卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞和间皮瘤)、脑癌(神经胶质瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤)、黑素瘤，梅克尔细胞癌、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、胰腺癌、肝胆肿瘤、生殖细胞癌、前列腺癌、头颈癌、甲状腺癌和肉瘤。
[0146] 在一实施方案中，癌症可在DNA修复途径中具有突变。
[0147] 在一实施方案中，癌症是黑素瘤。在一实施方案中，癌症是肾癌(肾细胞癌)。
[0149] 在一个实施方案中，癌症可以是MSI-高癌症。
[0150] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第20版,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的通用词典。
[0151] 本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
[0153] 在本文中，使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。
[0154] 如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
[0155] 术语的其他定义可以在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开内容不限于所描述的特定实施方案，因为它们当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而无意于为限制的，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求书限制。
[0156] 在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确规定，也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)。在本公开内容内涵盖规定范围中的任何规定值或中间值和该规定范围中的任何其它规定值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或在该范围中排除，并且本公开内容内也涵盖较小范围中包括任一、无一或两个限度的每个范围，服从规定范围中的任何具体排除限度。在规定范围包括一个或两个限制的情况下，本公开内容中也包括排除那些包括的限制中的一个或两个的范围。
[0157] 必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。
[0158] 如本文所用，术语“包含”和“由…构成”与“包括”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、非叙述的成员、要素或方法步骤。术语“包括”和“由…构成”也包括术语“由……组成”。
[0160] 仅通过举例的方式，现在将参照以下实施例描述本发明。实施例
[0161] 实施例1
[0162] 测定以泛癌为基础的插入/缺失突变模式，以及它们与检查点阻断后的抗肿瘤免疫响应和结果的关联。
[0163] 结果
[0164] 使用来自癌症基因组图谱(TCGA)的5777个样品，在19种实体瘤类型间以泛癌为基础比较插入/缺失频率。插入/缺失的贡献以每个样品的总突变计数的比例(插入/缺失比例)和每个样品的插入/缺失的绝对数目(插入/缺失计数)分析，并且全分组分别观察到0.05和4的中值。在所有肿瘤类型间，发现ccRCC具有最高的编码插入/缺失的比例0.12(P＝
2.2x10-16，图2)，与泛癌平均值相比增加2.4倍。此结果在两项进一步的独立研究中得到重复，观察到的插入/缺失比例中值分别为0.10和0.12(1,2)(图1)。乳头状肾细胞癌(pRCC)和嫌色性肾细胞癌(chrRCC)具有第二/第三高的插入/缺失比例，这指示可能的组织特异性突变过程，其有助于肾癌中插入/缺失的获得。在所有肿瘤类型间，pRCC、chrRCC和ccRCC具有最高的绝对插入/缺失计数，中位插入/缺失数分别为10、8和7。ccRCC以一种或多种肿瘤抑制基因中的功能丧失(LoF)突变为特征：VHL、PBRM1、SETD2、BAP1和KDM5C(11)，它们可通过nsSNV或插入/缺失突变来失活。为了排除这些标志性突变使结果失真的可能性，重新计算了ccRCC插入/缺失比例，排除了VHL、PBRM1、SETD2、BAP1和KDM5C；修正的插入/缺失比例保持于0.12。利用先前发表的来自10个ccRCC病例的多区域全外显子组测序数据(2)，评估了插入/缺失突变的克隆性质，揭示了48％的移码插入/缺失在本质上是克隆性的(存在于所有肿瘤区域)。
2.2x10-16，图2)，与泛癌平均值相比增加2.4倍。此结果在两项进一步的独立研究中得到重复，观察到的插入/缺失比例中值分别为0.10和0.12(1,2)(图1)。乳头状肾细胞癌(pRCC)和嫌色性肾细胞癌(chrRCC)具有第二/第三高的插入/缺失比例，这指示可能的组织特异性突变过程，其有助于肾癌中插入/缺失的获得。在所有肿瘤类型间，pRCC、chrRCC和ccRCC具有最高的绝对插入/缺失计数，中位插入/缺失数分别为10、8和7。ccRCC以一种或多种肿瘤抑制基因中的功能丧失(LoF)突变为特征：VHL、PBRM1、SETD2、BAP1和KDM5C(11)，它们可通过nsSNV或插入/缺失突变来失活。为了排除这些标志性突变使结果失真的可能性，重新计算了ccRCC插入/缺失比例，排除了VHL、PBRM1、SETD2、BAP1和KDM5C；修正的插入/缺失比例保持于0.12。利用先前发表的来自10个ccRCC病例的多区域全外显子组测序数据(2)，评估了插入/缺失突变的克隆性质，揭示了48％的移码插入/缺失在本质上是克隆性的(存在于所有肿瘤区域)。
[0165] 为了使移码新抗原有助于抗肿瘤免疫，突变体肽必须得以表达。移码导致过早终止密码子(PTC)，并且所得的mRNA被靶向进行无义介导的衰变(NMD)。已发表的种系样品分析显示PTC经常导致变体等位基因的表达丧失，但是某些突变体转录物根据基因内移码的确切位置而逃脱NMD(16)。来自超过10,000个癌症样品的突变和表达数据的综合分析显示了NMD以可变功效触发，并且即使在有效时也可由于诸如短的mRNA半衰期等因素而不改变表达水平(17)。使用TCGA ccRCC数据，比较了在给定基因中含有突变的样品中的基因表达水平与未突变样品中的基因表达水平。对插入/缺失和SNV突变均进行了此分析，后者作为基准比较器包括在内。NMD对插入/缺失突变基因表达水平的总体影响估算为14％，明显低于完全运行NMD下的预期水平，这指向逃脱NMD的PTC的存在。
[0166] 通过分析泛癌TCGA分组中MHC I类相关的肿瘤特异性新抗原结合预测来测定nsSNV和插入/缺失突变的潜在免疫原性。在所有样品间，对335,594个nsSNV突变进行HLA特异性新抗原预测，总共产生214,882个高亲和力结合剂(定义为具有预测的IC50<50nM的表位)，等于每个nsSNV突变为0.64个新抗原(snv-新抗原)的比率。以类似的方式对19,849个移码插入/缺失突变进行了预测，从而产生了39,768个高亲和力结合剂，具有每个移码突变为2.00个新抗原(移码-新抗原)的比率。因此，在每个突变的基础上，移码插入/缺失可产生多约三倍的高亲和力新抗原结合剂(表1)，这与最近对结肠直肠癌分组的分析中的预测一致(18)。当预测野生型和突变体肽两者结合时，中枢免疫耐受机制可以删除具有反应性T细胞受体的细胞。因此，重复泛癌分析，将新抗原限制于突变体特异性结合剂(即，在预测野生型肽不结合的情况下)，并证明移码插入/缺失对仅突变体等位基因的结合剂富集了9倍(表1)。
[0167] 表1：每种变异类别的新抗原
[0168]
[0169] *强结合剂(<50nM亲和力)
[0170] **野生型等位基因非结合(>500nM亲和力)
[0171] 特别令人感兴趣的是经常通过移码突变而改变并且具有高的MHC结合倾向的基因。在泛癌分析中，它们富含经典的肿瘤抑制基因，包括TP53、ARID1A、PTEN、MLL2/MLL3、APC和VHL(图2)。在>500个样品(分组的约10％)中突变了具有最高的移码突变数目的前15个基因，预测>2,400个高亲和力新抗原。肿瘤抑制基因一直是先前难处理的突变靶标，但它们可以作为有力的新抗原而可靶向。此外，凭借创建者事件，肿瘤抑制基因中的许多改变是克隆性的，存在于所有癌细胞中，使它们成为免疫系统的引人注目的靶标。
[0172] 通过评估新抗原富集与治疗益处之间的关系考虑插入/缺失突变的临床影响。迄今为止，CPI已获批准用于治疗六种实体瘤类型：黑素瘤(抗PD1/CTLA-4)、梅克尔细胞癌(抗PD1)、ccRCC(抗PD1)、NSCLC(抗PD1)、BLAC(抗PD-L1)和HNSC(抗PD1)。与移码在新抗原产生中的潜在作用一致，尽管总的SNV/插入/缺失突变负荷(即ccRCC)的显著差异，但发现获得CPI批准的肿瘤类型都含有高于平均数目的移码新抗原(图3)。总体而言，移码新抗原的数目在CPI批准的肿瘤类型中相对于在迄今尚未CPI批准的类型中高得相当多(P＝2.2x10-16)。使用最近在黑素瘤(n＝38名患者)中进行的抗PD-1研究的外显子组测序结果评估了移码新抗原对CPI疗效的影响(3)。定义了三类突变：(i)非同义SNV，(ii)框内(3n)插入/缺失和(iii)移码(非3n)插入/缺失，并分别测试了与对治疗的响应的关联。虽然(i)和(ii)类突变显示无明显趋势(P＝0.26，P＝0.22))，(iii)类移码插入/缺失突变与抗PD-1响应显著相关，P＝0.02(图4a)。与较低的三个四分位数的43％相比，具有最高的(iii)类移码插入/缺失负荷的上四分位数的患者具有88％对PD-1疗法的响应率(RR)(图4b)。为了证实此种关联的可重复性，从另外两个具有基因组图谱分析的黑素瘤分组中获得CPI响应数据：Snyder等人(n＝62，抗CTLA-4处理)(4)和Van Allen等人(n＝100，抗CTLA-4处理)(5)。在每个分组中进行相同的分析，并且在两个另外的数据集中，移码插入/缺失负荷与CPI响应显著相关，分别为P＝0.0074和P＝0.024(图4a)。三个分组间的总体元分析证实，移码插入/缺失计数与-4 -3CPI响应显著相关(P＝3.8x10 )，并且与nsSNV计数相比具有更强的关联(P＝3.5x10 )。另外，在(iii)移码插入/缺失组中观察到改善的总存活(补充图3)。最后，为了评估在另一种肿瘤类型中移码插入/缺失负荷和CPI响应之间的关系，从Rizvi等人(6)中获得31例用抗PD1疗法治疗的非小细胞肺癌患者的小分组。尽管不显著，但在CPI响应者中观察到了较高的移码插入/删除负载的趋势(P＝0.2)。
[0173] 最后，虽然无法获得ccRCC中的基因组数据与CPI响应关联，但使用RNAseq基因表达数据分析了移码-新抗原负荷与肿瘤内免疫响应之间的关系。根据移码新抗原的负荷(高定义为>10个移码/例)与snv-新抗原负荷(高定义为>17个nsSNV/例，将此阈值设置为确保匹配的患者样品大小)将患者分为几组。高移码新抗原负荷与经典与免疫激活有关的免疫签名的上调有关，包括：MHC I类抗原呈递，CD8+T细胞激活和细胞溶解活性增加，这是在高snv-新抗原组中观测不到的模式(图5)。此外，高移码新抗原组内的相关性分析证明，CD8+T细胞签名与MHC I类抗原呈递基因和细胞溶解活性均密切相关(分别为ρ＝0.78和ρ＝0.83)(图5)。
[0174] 方法
[0175] 研究设计和患者
[0176] 在19种不同的实体瘤类型间，对于5777名经历全外显子组测序的可用患者，从癌症基因组图谱(TCGA)中获得泛癌体细胞突变数据：膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺侵入性癌(BRCA)、宫颈癌和宫颈癌(CESC)、结肠直肠腺癌(COADREAD)、脑胶质瘤(GMBLGG)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾嫌色性(KICH)、肾的肾透明细胞癌(KIRC)、肾的肾乳头状细胞癌(KIRP)、肝的肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺腺癌(PAAD)、前列腺癌(PRAD)、皮肤的皮肤黑素瘤(SKCM)、胃腺癌(STAD)、甲状腺癌(THCA)和子宫癌肉瘤(UCS)。患者水平突变注释文件从Broad Institute TCGA GDAC Firehose存储库(https://gdac.broadinstitute.org/)中提取，该文件先前已由TCGA分析工作组专家策划，以确保严格的质量控制。在另外两个ccRCC患者分组中进行重复分析：i)Sato等人(1)报告的106个ccRCC的全外显子组测序研究；ii)Gerlinger等人(2)报告的10个ccRCC的全外显子组测序研究。对于每个研究获得了最终的后质量控制(QC)患者水平突变注释文件。
[0177] 为了测试非同义SNV/插入/缺失负荷与患者对检查点抑制剂(CPI)疗法的响应之间的关联，再利用四个患者分组。根据Hugo等人(3)报道，第一个数据集由38位用PD-1疗法治疗的黑素瘤患者组成。获得了最终的后QC突变注释文件和临床结果数据，并且在排除从患者来源的细胞系中提取DNA的情况和CPI疗法后获得组织样品的患者之后，保留32名患者进行分析。鉴于CPI疗法本身可能通过对免疫原性肿瘤克隆的可能消除来改变突变频率，因此此后一种排除是特别重要的。如Snyder等人(4)报道，第二个CPI分组由62位用抗CTLA-4疗法治疗的黑素瘤患者构成。从新鲜的速冻肿瘤组织中在CPI处理前获得所有患者样品，因此所有62例病例均保留用于分析。如Van Allen等人(5)报道，第三个CPI分组包括100名用抗CTLA-4疗法治疗的黑素瘤患者，再次使用上述相同标准，所有患者均符合纳入条件。如Rizvi等人(6)报道，最后的CPI分组包括31例用抗PD1疗法治疗的非小细胞肺癌患者，所有患者再次均符合纳入条件。对于Snyder等人、Van Allen等人和Rizvi等分组，包括插入/缺失突变的最终突变注释文件不可用，因此获得了原始BAM文件，并使用标准化的生物信息学管道(如下所述)进行了变异调用。
[0178] 全外显子组测序变异调用
[0179] 获得代表来自Snyder等人、Van Allen等人和Rizvi等分组的种系和肿瘤区域两者的BAM文件，并使用picard工具(1.107)SamToFastq转换为FASTQ格式。使用bwa mem(bwa-0.7.7)(8)，将FastQ格式的原始配对末端读段(100bp)与从GATK束2.8(7)获得的完整hg19基因组装配(包括未知重叠群)进行比对。使用Picard工具v1.107来清理，排序和合并来自同一患者区域的文件，并除去一式两份的读段(http://broadinstitute.github.io/picard)。使用Picard工具(1.107)、GATK(2.8.1)和FastQC(0.10.1)(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)来生成质量控制度量。使用SAMtools mpileup(0.1.19)(9)在肿瘤和种系样品中定位非参照位置。忽略具有phred得分小于20的碱基或具有定位质量小于20的读物。禁用BAQ计算，并将定位质量降低的系数设置为50。
VarScan2体细胞(v2.3.6)(58)利用来自SAMtools mpileup的输出来鉴定肿瘤和匹配种系样品之间的体细胞变异。除了将种系样品的最小覆盖设置为10并将最小变异频率更改为
0.01外，使用默认参数。使用VarScan2 processSomatic提取体细胞变异。使用Varscan2相关的fpfilter.pl脚本对得到的单核苷酸变异(SNV)调用物过滤假阳性，首先使用默认设置，然后再使用min-var-frac＝0.02再次重复，首先通过bam-readcount(0.5.1)(https://github.com/genome/bam-readcount)运行数据。仅由VarScan2 processSomatic归类为“高置信度”的插入/缺失调用物得到保留以进行进一步分析，somatic_p_value得分<5x10-4。还使用MuTect(1.1.4)(10)利用GATK包2.8中包含的注释文件检测SNV。完成后，根据过滤器参数“PASS”过滤由MuTect调用的变异。
VarScan2体细胞(v2.3.6)(58)利用来自SAMtools mpileup的输出来鉴定肿瘤和匹配种系样品之间的体细胞变异。除了将种系样品的最小覆盖设置为10并将最小变异频率更改为
0.01外，使用默认参数。使用VarScan2 processSomatic提取体细胞变异。使用Varscan2相关的fpfilter.pl脚本对得到的单核苷酸变异(SNV)调用物过滤假阳性，首先使用默认设置，然后再使用min-var-frac＝0.02再次重复，首先通过bam-readcount(0.5.1)(https://github.com/genome/bam-readcount)运行数据。仅由VarScan2 processSomatic归类为“高置信度”的插入/缺失调用物得到保留以进行进一步分析，somatic_p_value得分<5x10-4。还使用MuTect(1.1.4)(10)利用GATK包2.8中包含的注释文件检测SNV。完成后，根据过滤器参数“PASS”过滤由MuTect调用的变异。
[0180] 泛癌插入/缺失分析
[0181] 在泛癌分组中，考虑所有变异类型，计算每例病例的SNV和插入/缺失(插入/缺失)突变计数。在所有5,777个样品间，观察到总共1,227,075个SNV和54,207个插入/缺失。不考虑二核苷酸和三核苷酸取代。度量“插入/缺失负荷”简单定义为每个病例的绝对插入/缺失计数，并且“插入/缺失比例”定义为：插入/缺失数目/(插入/缺失数目+SNV数目)。在两个ccRCC复制分组中重复相同的分析。
[0182] 无义介导的衰变分析
[0183] 使用从TCGA GDAC Firehose存储库https://gdac.broadinstitute.org/获得的RNAseq表达数据(如以TPM测量)估算无义介导的衰变(NMD)效率。通过比较具有突变的样品中的mRNA表达水平与不存在突变的所有其它肿瘤样品间相同转录物的中值mRNA表达水平对所有插入/缺失和SNV突变估算NMD程度。具体而言，将每个带有突变的转录物的mRNA表达水平除以未突变样品中该转录物的中值mRNA表达水平，得出NMD指数。观察到的总体NMD指数值为0.93(插入/缺失)和1.00(SNV)，指示插入/缺失突变转录物中表达的总体0.07下降。据报道，KIRC分组中的肿瘤纯度为0.54(11)，并假设在剩余的0.46正常细胞含量中表达水平恒定，那会在携带插入/缺失突变的癌细胞中产生经调节的0.136表达下降。假设肿瘤突变在二倍体基因组区域中是克隆的，具有杂合子基因型，并且突变癌细胞中的野生型等位基因表达保持恒定，则在完全有效的NMD模型下预期0.5的纯度调整的降低。因此，该数据提示NMD在KIRC分组中以降低的效率运行，但是我们承认上述假设会产生一定的影响。采用与先前出版物一致的方法(12)，以NMD效率的全局近似值呈现这些数据。
[0184] 肿瘤特异性新抗原分析
[0185] 对于来自TCGA分组的患者分组(n＝4,592)，肿瘤特异性新抗原结合亲和力预测数据也可用并且从Rooney等人(60)获得。简而言之，使用POLYSOLVER(POLYmorphic基因座reSOLVER)测定每个样品的4位HLA类型以及I类HLA基因的突变。使用Mutect(14)和Strelka工具测定体细胞突变。基于在整个分组中检测到的体细胞SNV和插入/缺失突变，计算所有可能的9聚体和10聚体突变体肽。使用NetMHCpan(v2.4)预测与相应的POLYSOLVER推断的HLA等位基因相关的突变体和相应的野生型肽的结合亲和力。强亲和力结合剂定义为IC50<50nM。野生型等位基因非结合定义为IC50>500nM。我们(从泛癌新抗原分析中)排除了与高水平病毒基因组整合相关的癌症，包括宫颈癌(HPV整合率>80％)、肝细胞癌(HepB整合率>
50％)，但没有HNCC(HPV整合率<15％)。没有可用于默克尔细胞癌的TCGA数据集。
50％)，但没有HNCC(HPV整合率<15％)。没有可用于默克尔细胞癌的TCGA数据集。
[0186] 免疫签名RNAseq分析
[0187] 免疫基因签名数据获自Rooney等人(15)，具有根据补充表1定义的基因集。根据每个样品的RNAseq转录物每千碱基百万(TPM)表达水平，将免疫签名评分计算为该集内基因的几何平均值。对ccRCC TCGA(KIRC)患者进行分析，其中可获得RNAseq和新抗原数据两者(n＝392)。移码插入/缺失强亲和力新抗原的高负荷定义为每例>10(n＝32)，并且在每个免疫签名中，在高插入/缺失新抗原组和所有其他患者之间比较表达百分比差异。排除所有组中具有最低表达(<0.5TPM)的免疫签名。对于高负荷的snv衍生的强亲和力新抗原，重复相同的分析，选择阈值>17个snv新抗原，以与突变类型间的高负荷组进行大小匹配(相等的患者数，在所有高负荷组中n＝32)。表达的百分比差异以热图格式绘制。在高移码插入/缺失新抗原组(n＝32个ccRCC患者)内进行相关性分析。
[0188] 检查点抑制剂(CPI)响应分析
[0189] 在四个CPI治疗的患者分组中，对(i)非同义SNV、(ii)所有编码插入/缺失和(iii)移码插入/缺失变异计数测试与患者对疗法的响应的关联。对于每个测量(i)、(ii)和(iii)，将高和低组定义为顶部四分位数(高)和底部三个四分位数(低)。在所有四个数据集中使用相同的标准，并比较了高组和低组中响应疗法的患者比例(响应率)。每个研究中如下定义患者响应的测量：
[0190] Snyder等人(4)
[0191] ·长期临床益处(LB)：(i)无疾病的放射摄影证据或(ii)疾病稳定的证据或(iii)疾病数目减少；超过6个月。
[0192] ·缺乏长期临床益处(NB)：(i)治疗开始后每次CT扫描时的肿瘤生长(无益处)或(ii)持续6个月或更短的临床益处(最小益处)。
[0193] Hugo等人(3)：
[0194] ·响应肿瘤：完全响应(CR)、部分响应(PR)和稳定疾病(SD)。
[0195] ·非响应肿瘤：疾病进展(PD)
[0196] VanAllen等人(5)：
[0197] ·临床益处：CR/PR/SD
[0198] ·无临床益处：OS＜1年的PD或SD
[0199] Rizvi等人(6)：
[0200] ·持久的临床益处(DCB)：PR或SD持续超过6个月
[0201] ·无持久益处(NDB)：自治疗开始起PD<6个月
[0202] 统计分析
[0203] 使用双侧Mann Whitney检验比较了ccRCC和所有其他非肾癌之间的插入/缺失负荷和比例测量。在CPI响应分析中，使用双侧Mann Whitney测试将非同义SNV、外显子插入/缺失和移码插入/缺失计数各与患者响应结果进行比较。使用组合来自独立检验的P值的Fisher方法，对四个CPI数据集间的结果进行了元分析。使用spearman秩相关系数进行免疫签名相关性分析。使用R3.0.2(http://www.r-project.org/)进行统计分析。P值为0.05(双侧)认为是统计学显著的。
[0204] 克隆性
[0205] 另外评估克隆性的影响，并且发现克隆移码插入/缺失具有超出所有移码插入/插入(克隆和亚克隆)的进一步的预测优势。就此而言，参见图6。
[0206] 参考文献
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[0226] 实施例2
[0227] 在实施例1中测定fs-插入/缺失与对检查点抑制剂疗法的改善的响应有关。然后研究了无义介导的衰变的效果。
[0228] 材料和方法
[0229] 研究分组
[0230] 在均用免疫疗法治疗的以下分组中进行匹配的DNA/RNA测序分析：
[0231] ·Van Allen等人(8)，晚期黑素瘤检查点抑制剂(CPI)(抗CTLA-4)治疗的分组。利用具有RNA测序和全外显子组(DNA)测序数据两者的病例(n＝33)。
[0232] ·Snyder等人(7)，晚期黑素瘤CPI(抗CTLA-4)治疗的分组。利用具有RNA测序和全外显子组(DNA)测序数据两者的病例(n＝21)。
[0233] ·Hugo等人(4)，晚期黑素瘤CPI(抗PD-1)治疗的分组。利用具有RNA测序和全外显子组(DNA)测序数据两者的病例(n＝24)。
[0234] ·Lauss等人(10)，晚期黑素瘤过继细胞疗法治疗的分组。利用具有RNA测序和全外显子组(DNA)测序数据两者的病例(n＝22)。
[0235] ·Snyder等人(18)，转移性尿路上皮癌CPI(抗PD-L1)治疗的分组。利用具有RNA测序和全外显子组(DNA)测序数据两者的病例(n＝23)。
[0236] 在以下分组(未用免疫疗法特异性治疗)中进行了匹配的DNA/RNA测序分析：
[0237] ·从癌症基因组图谱(TCGA)项目获得的皮肤的皮肤黑素瘤(SKCM)肿瘤。利用具有配对末端RNA测序数据和来自TCGA GDAC Firehose(2016_01_28版本)的精选(curated)的变异调用物的病例(n＝368)。
[0238] ·来自TCGA项目所有组织学亚型间的微卫星不稳定(MSI)肿瘤。根据Cortes-Ciriano等人(19)的分类鉴定MSI病例ID。利用具有配对末端RNA测序数据和来自TCGA GDAC Firehose(2016_01_28版本)的精选的变异调用物的病例(n＝96)。
[0239] 在以下免疫疗法治疗的分组中进行了NMD逃脱特征的预测(仅基于DNA外显子突变位置，而非匹配的DNA/RNA测序分析)：
[0240] ·Ott等人(22)，晚期黑素瘤个性化疫苗治疗分组(n＝6例)。
[0241] ·Rahma等人(23)，转移性肾细胞癌个性化疫苗治疗分组(n＝6例)。
[0243] 全外显子组测序(DNA)变异调用
[0244] 对于Van Allen等人(8)、Snyder等人(7)和Snyder等人(18)分组，我们从原始作者获得了种系/肿瘤BAM文件，并使用Picard工具(版本1.107)SamToFastq将这些恢复为FASTQ格式。使用bwa mem(bwa-0.7.7)，将FastQ格式的原始配对末端读段与从GATK软件包(2.8版)获得的完整hg19基因组装配(包括未知重叠群)进行比对。我们使用Picard工具清理，排序和除去一式两份的读取。使用GATK(2.8版)进行局部插入/缺失再比对。我们使用Picard工具、GATK(2.8版)和FastQC(0.10.1版)来生成质量控制度量。使用SAMtools mpileup(0.1.19版)来定位肿瘤和种系样品中的非参考位置。忽略具有Phred得分小于20的碱基或具有定位质量小于20的读段。VarScan2体细胞(版本2.3.6)使用来自SAMtools mpileup的输出来鉴定肿瘤和匹配的种系样品之间的体细胞变异。除了种系样品的最小覆盖设置为10并且最小变异频率更改为0.01外，使用默认参数。使用VarScan2 processSomatic提取体细胞变异。使用Varscan2中关联的fpfilter.pl脚本对单核苷酸变异(SNV)调用物过滤假阳性，最初使用默认设置，然后使用min-var-frac＝0.02再重复，首先通过bam-readcount(0.5.1版)运行数据。还使用MuTect(版本1.1.4)检测SNV，并根据滤器参数PASS过滤结果。在最终的QC过滤中，若变体等位基因频率(VAF)大于2％，并且具有体细胞p值<＝0.01的VarScan2和MuTect两者调用突变，则认为该SNV为真阳性。或者，若仅在VarScan2中调用，再次具有体细胞p值<＝0.01，则需要5％的频率。对于小规模插入/删除(INDEL)，仅保留由VarScan2 processSomatic分类为高置信度的调用物以进行进一步分析，somatic_p_value-4
得分小于5×10 。使用Annovar(版本2016Feb01)进行变异注释。作为由Annovar注释的第一(默认)的相关转录物的第一个、倒数第二个或最后一个外显子中的变异认为是与NMD逃逸相关的外显子位置的突变。中间外显子突变认为是所有不在第一个、倒数第二个或最后一个外显子位置中的突变。对于Hugo等人(4)分组，我们获得了如前所述(4)生成的最终后质量控制突变注释文件。简而言之，使用MuTect、VarScan2和GATK Unified Genotyper检测到SNV，而使用VarScan2、IndelLocator和GATK-UGF检测插入/缺失。由三个SNV/插入/缺失调用器中的至少两个调用的突变保留为高可信度调用物。对于Lauss等人(10)分组，如先前所述(10)调用SNV和INDEL。简而言之，使用MuTect和VarScan2变异的交集检测SNV，而仅使用VarScan2检测插入/缺失。对于VarScan2，保留大于10％的VAF的高置信度调用物。
得分小于5×10 。使用Annovar(版本2016Feb01)进行变异注释。作为由Annovar注释的第一(默认)的相关转录物的第一个、倒数第二个或最后一个外显子中的变异认为是与NMD逃逸相关的外显子位置的突变。中间外显子突变认为是所有不在第一个、倒数第二个或最后一个外显子位置中的突变。对于Hugo等人(4)分组，我们获得了如前所述(4)生成的最终后质量控制突变注释文件。简而言之，使用MuTect、VarScan2和GATK Unified Genotyper检测到SNV，而使用VarScan2、IndelLocator和GATK-UGF检测插入/缺失。由三个SNV/插入/缺失调用器中的至少两个调用的突变保留为高可信度调用物。对于Lauss等人(10)分组，如先前所述(10)调用SNV和INDEL。简而言之，使用MuTect和VarScan2变异的交集检测SNV，而仅使用VarScan2检测插入/缺失。对于VarScan2，保留大于10％的VAF的高置信度调用物。
[0245] 全转录物组测序(RNA)变异调用
[0246] 对于所有研究，以BAM格式获得RNAseq数据，并使用bam2fastq(v1.1.0)恢复为FASTQ格式。使用mapsplice(v2.2.0)从原始的配对末端FASTQ文件中调用插入/删除突变，序列读段与hg19基因组装配比对(使用bowtie预先建立的索引)。设置最低QC阈值以保留具有＝>5个备选读段且变体等位基因频率＝>0.05的变异。将在RNA和DNA测序测定法两者中调用的插入和缺失相交，并称为表达的插入/缺失，其中包括+/-10bp的填充间隔，以允许次要比对错配。直接从hg19再比对的BAM文件中调用RNA测序数据中的SNV，使用Rsamtools提取SNV在DNA测序分析中已调用的每个基因组位置的每个等位基因的读段计数。类似地，利用最小QC阈值＝>5个备选读段和变体等位基因频率＝>0.05，并将通过这些阈值的变异称为表达的SNV。
[0247] 蛋白质表达分析
[0248] 我们在来自癌症蛋白质组图集(http://tcpaportal.org/tcpa/index.html)的n＝453TCGA黑素瘤/MSI肿瘤(其与也经由DNA/RNA测序分析的TCGA分组重叠)检索223种蛋白质的4级(L4)标准化蛋白质表达数据。我们将数据过滤到样品/蛋白质组合，其还含有fs-插入/缺失突变(n＝136)，如通过DNA测序调用。然后，基于表达或不表达的fs-插入/缺失(如通过RNAseq测量，使用上文详细方法)将数据集分为两组。使用双侧Mann Whitney检验比较两组。
[0249] 结果分析
[0250] 在所有免疫疗法治疗的分组中，患者临床益处/无临床益处的测量均与原始作者的标准/定义保持一致。对于TCGA结果分析，基于从TCGA GDAC Firehose存储库获得的临床注释数据，利用了总存活(OS)数据。
[0251] 选择分析
[0252] 为了测试选择的证据，在SKCM TCGA分组中(n＝368例)将fs-插入/缺失突变与终止获得SNG突变比较。终止获取SNV突变用作基准比较器，这由于它们的可能同等的功能影响(即功能丧失)，通过NMD途径的等同的治疗(即最后一个外显子终止获取SNV仍将逃脱NMD并引起截短的蛋白质积累)，但是缺乏免疫原性潜力(即不产生突变的肽)。在所有SKCM病例中，考虑n＝1,594个fs-插入/缺失和n＝9,833个终止获得SNV。对于外显子位置，注释每组中的所有改变(即，如上定义的第一个、中间、倒数第二个或最后一个外显子)。然后，将第一个、中间、倒数第二个或最后一个外显子位置中具有fs-插入/缺失的几率相对于终止获取SNV的等同几率进行基准比较。
[0253] 统计方法
[0254] 对计数数据使用Fisher精确检验计算比值比，每个外显子位置组与所有其他外显子位置组进行比较。使用Kruskal-Wallis检验来测试三个或更多独立组之间的分布差异。使用双侧Mann Whitney U检验评估两个群体组之间的分布差异。使用组合来自独立检验的P值的Fisher方法对整个分组的结果进行元分析。联合使用逻辑回归联合评估多个变量，以与二元结果进行独立关联。使用Cox比例风险模型在SKCM TCGA分组中进行总体存活分析，将阶段、性别和年龄作为协变量。使用Cox比例风险模型在MSI TCGA分组中进行总体存活分析，将主要疾病部位作为协变量。使用R3.4.4(http://www.r-project.org/)进行统计分析。我们认为0.05的P值(双侧)在统计上是显著的。
[0255] 结果
[0256] 检测NMD逃脱突变
[0257] 使用成对的DNA和RNA测序检测表达的移码插入/缺失(fs-插入/缺失)，通过等位基因特异性生物信息学流水线处理数据(图7A)。在所有经处理的TCGA样品中(n＝453，参见分组详细信息的方法)，每个肿瘤检测4个fs-插入/缺失的中值(范围0-470)，其中中值为每个肿瘤1(范围为0-94)。因此，表达的fs-插入/缺失突变以相对较低的频率和丰度存在。实际上，进行图谱分析的样品的49.6％具有检测的0个表达的fs-插入/缺失突变。注释了表达的fs-插入/缺失(n＝1,840)的外显子位置，并与非表达的fs-插入/缺失(即，DNA中，而非RNA中存在的突变体等位基因)(n＝8,691)比较。表达的fs-插入/缺失富含倒数第二个突变(相对于非表达的fs-插入/缺失的比值比＝1.80，95％置信区间[1.53-2.11]，p＝3.2x10-12)和最后一个外显子位置(OR＝1.80[1.60-2.04]，p<2.2x10-16)，而在中间外显子位置中消减(OR＝0.56[0.51-0.62],p<2.2x10-16)(图7B)。这些外显子位置与如先前建立(14)的已知NMD逃脱模式一致。出乎意料地，第一个外显子位置突变是消减的(OR＝0.71[0.55-0.91，p＝0.006])，但是该组中观察到的突变的绝对数目是小的(仅n＝80个表达的fs-插入/缺失)，并且它们中的一定比例(n＝21)从基因开始起>200nt。接下来，我们考虑了表达的fs-插入/缺失的RNA变体等位基因频率(VAF)估值，并且发现它们在最后一个(中值＝0.33)、倒数第二个(0.28)、然后第一个(0.26)外显子位置是最高的，中间的外显子改变具有最低值(0.19)(图7C，p<2.2x10-16)。最后，我们从癌症蛋白质组图谱(17)中获得了与DNA/RNAseq处理的分组重叠的453个肿瘤间的223种蛋白质的蛋白质表达数据。将具有fs-插入/缺失基因突变和匹配的蛋白质表达数据两者的样品相交，我们比较了表达的(n＝40)相对于非表达的fs-插入/缺失(n＝96)的蛋白质水平。发现表达的fs-插入/缺失的蛋白质丰度明显更高(p＝0.018，图7D)。这些结果共同指示表达的fs-插入/缺失(至少部分)逃脱了NMD并被翻译成蛋白质水平。本文将表达的fs-插入/缺失称为NMD逃脱，并且将非表达的fs-插入/缺失称为NMD-胜任的。
[0258] NMD逃脱突变负荷与免疫检查点抑制的临床益处相关
[0259] 为了评估NMD逃脱突变对抗肿瘤免疫响应的影响，我们评估了具有匹配的DNA和RNA测序数据的三个独立的黑素瘤分组中NMD逃脱突变计数与CPI临床益处之间的关联：Van Allen等人(n＝33，抗CTLA-4处理)，Snyder等人(n＝21，抗CTLA-4处理)和Hugo等人(n＝24，抗PD-1治疗)。对于每个样品，基于以下分类对突变负荷进行定量：i)TMB：所有非同义SNV(nsSNV)，ii)fs-插入/缺失，和iii)NMD-逃脱fs-插入/缺失。测试每种突变类别与临床益处的关联(图8a)。在三个具有WES和RNAseq两者的黑素瘤分组的合并的元分析中(总计n＝78)，观察到nsSNV的显著性趋势(所有分组间的元分析，Pmeta＝0.12)和fs-插入/缺失的边际显著性趋势(Pmeta＝0.048)，而NMD逃脱突变计数与临床益处具有最强的总体关联(Pmeta＝
0.0087)(图8a)。为了清楚起见，我们注意到本文使用的样品数目比以前报告的样品小，因为只有一小部分病例具有可用的匹配的DNA和RNA测序数据两者，并且nsSNV和fs-插入/缺失测量在整个数据集中是显著的。与无NMD逃脱突变的患者相比，具有一个或多个NMD逃脱突变的患者具有较高的对免疫检查点阻断的临床益处率：56％比12％(Van Allen等人)，
57％对14％(Snyder等人)，和71％和35％(Hugo等人)(图8b)。为了确保NMD逃脱组不简单反映总体新抗原表达的重要性，我们检查了使用等位基因特异性RNAseq分析检测到的表达的nsSNV，并且发现与临床益处的关联仍然不显著(Pmeta＝0.24，图11)。另外，我们评估了TMB和nmd逃脱测量度量之间的相关性证据，并且仅发现两个变量之间弱的相关性(r＝0.21，P＝0.06，n＝78)。并且，在多变量逻辑回归分析中，我们在联合模型中一起测试了这两个变量，以评估独立显著性(n＝78，研究ID也作为控制分组特异性因素的模型项包括在内)，并且发现NMD逃脱突变计数与CPI临床益处独立相关(P＝0.032)，而TMB没有达到独立显著性(P＝0.25)。最后，为了研究其他肿瘤类型中的潜在关联，在CPI治疗的转移性尿路上皮癌分组(n＝23例)中进行了NMD逃脱分析(18)。此研究中的以前分析发现，TMB，预测的新抗原负荷或表达的新抗原负荷均与CPI临床益处无关(18)。类似地，在这里，我们未发现NMD逃脱计数与临床益处之间关联的证据(P＝1.0)，这可能是由于小的样品大小，此分组中较低的突变负荷(TMB＝约0-5个错义SNV/兆碱基，与最近发表的较大分组中的约10.0(9)相比)，或在转移性尿路上皮癌中一般较低的总体响应率。为了完整起见，重复进行NMD逃脱CPI元分析，以包括上述膀胱数据以及三个黑素瘤分组，并且关联仍然是显著的(Pmeta＝0.028)。
0.0087)(图8a)。为了清楚起见，我们注意到本文使用的样品数目比以前报告的样品小，因为只有一小部分病例具有可用的匹配的DNA和RNA测序数据两者，并且nsSNV和fs-插入/缺失测量在整个数据集中是显著的。与无NMD逃脱突变的患者相比，具有一个或多个NMD逃脱突变的患者具有较高的对免疫检查点阻断的临床益处率：56％比12％(Van Allen等人)，
57％对14％(Snyder等人)，和71％和35％(Hugo等人)(图8b)。为了确保NMD逃脱组不简单反映总体新抗原表达的重要性，我们检查了使用等位基因特异性RNAseq分析检测到的表达的nsSNV，并且发现与临床益处的关联仍然不显著(Pmeta＝0.24，图11)。另外，我们评估了TMB和nmd逃脱测量度量之间的相关性证据，并且仅发现两个变量之间弱的相关性(r＝0.21，P＝0.06，n＝78)。并且，在多变量逻辑回归分析中，我们在联合模型中一起测试了这两个变量，以评估独立显著性(n＝78，研究ID也作为控制分组特异性因素的模型项包括在内)，并且发现NMD逃脱突变计数与CPI临床益处独立相关(P＝0.032)，而TMB没有达到独立显著性(P＝0.25)。最后，为了研究其他肿瘤类型中的潜在关联，在CPI治疗的转移性尿路上皮癌分组(n＝23例)中进行了NMD逃脱分析(18)。此研究中的以前分析发现，TMB，预测的新抗原负荷或表达的新抗原负荷均与CPI临床益处无关(18)。类似地，在这里，我们未发现NMD逃脱计数与临床益处之间关联的证据(P＝1.0)，这可能是由于小的样品大小，此分组中较低的突变负荷(TMB＝约0-5个错义SNV/兆碱基，与最近发表的较大分组中的约10.0(9)相比)，或在转移性尿路上皮癌中一般较低的总体响应率。为了完整起见，重复进行NMD逃脱CPI元分析，以包括上述膀胱数据以及三个黑素瘤分组，并且关联仍然是显著的(Pmeta＝0.028)。
[0260] 过继细胞疗法(ACT)的临床益处与NMD逃脱突变负荷相关
[0261] 为了进一步研究NMD逃脱突变在指导抗肿瘤免疫响应中的重要性，我们分析了采用过继细胞疗法治疗的黑素瘤患者(n＝22)的匹配的DNA和RNA测序数据(10)。TMB ns-SNVs(P＝0.027)，fs-插入/缺失(P＝0.025)和NMD逃脱计数(P＝0.021)均与来自疗法的临床益处相关(图8c)。与无NMD逃脱突变的患者的33％(6/18)相比，所有具有NMD逃脱计数≥1的患者经历临床益处(n＝4，100％)，这进一步突出显示了来自单个NMD逃脱突变的潜在强免疫原性作用。如先前报道(10)，与中等(中等三分位数)或低(底部三分位数)nsSNV计数的患者相比，具有高nsSNV负荷的患者(定义为患者的上三分位数)具有改善的无进展存活(P＝0.0008)。我们注意到，在具有NMD逃脱计数≥1的患者中，大多数(3/4)在中间(而非高)三分位数nsSNV组中，并且若仅使用TMB作为预测性生物标志物，则可能已经作为高可能性潜在响应者而错过。每个NMD逃脱突变的危险比(HR)为0.28(95％置信区间0.07–1.09)，与约845个nsSNV突变等同(HR＝0.28(0.08-0.92))(表S1)。
[0262] 表S1.多变量分析
[0263]
[0264] 表S1
[0265] 使用Cox比例风险模型显示了Lauss等人分组的多变量无进展存活分析，其中nsSNV和NMD逃脱突变计数均作为连续变量包含在模型中。第一个表显示了每个测量的每个单一突变的经调节的危险比，并且第二个表显示了需要多少个TMB(nsSNV)突变的相当危险比才等于与1个NMD逃脱突变相同的风险降低。
[0266] T细胞再激活新抗原在预测逃脱NMD的基因组位置中富集
[0267] 尽管具有翻译相关性和临床实用性，但生物标志物关联并不直接分离驱动抗肿瘤免疫响应的特定新抗原。因此，我们从两项抗肿瘤个性化疫苗研究和已通过对患者T细胞的功能测定法建立了针对特定新抗原的T细胞反应性的一项CPI研究中获得了数据。在这三项研究中，在功能上验证了六种fs-插入/缺失衍生的新抗原为引发T细胞反应性：DHX40 p.S754fs、RALGAPBp.I1404fs、BTBD7 p.Y324fs、SLC16A4 p.F475fs、DEPDC1 p.K418fs和VHL p.L116fs(图9)。因此，在构思证明水平上，先前已经建立了fs-插入/缺失引发抗肿瘤免疫应答的能力。在这些相同的研究中，还对12种fs-插入/缺失衍生的新抗原进行了功能筛选，但发现它们是T细胞非反应性的(图9)。对于所有这些分组，配对的DNA和RNA测序数据不可用于测定表达，因此使用外显子位置注释来估算NMD逃脱的可能性。与经筛选但发现无T细胞反应性的fs-插入/缺失肽的12个中的3个相比，在显示为T细胞反应性的fs-插入/缺失组内，6个中的5个在外显子位置中注释为降低的NMD效率(即第一个、倒数第二个和最后一个外显子)(图9)。虽然观察到例外(即，中间外显子位置突变引起T细胞应答，相反最后一个外显子位置突变无法产生T细胞反应性)，但观察到富集，其中T细胞反应性fs-插入/缺失更可能在NMD逃脱外显子位置中发生(OR＝12.5[0.9-780.7]，P＝0.043)(图9)。
[0268] NMD逃脱突变显示负选择的证据
[0269] 接下来，我们评估了针对NMD逃脱突变的选择性压力的证据，其可以反映产生天然抗肿瘤免疫原性的潜力。除了潜在的免疫原性选择性压力外，fs-插入/缺失先前还已经因其丧失蛋白质功能作用而报道处于功能选择之下(15)。为了解决这点，我们使用终止获得SNV突变作为基准比较器，因为这些变异具有同等的功能影响，但没有免疫原性潜力(即功能丧失但未产生新抗原)。此外，NMD规则同样适用于终止获得SNV和fs-插入/缺失，因为这两者触发过早的终止密码子。使用皮肤的皮肤黑素瘤(SKCM)TCGA分组，我们注释外显子位置的所有fs-插入/缺失(n＝1,594)和终止获得(n＝9,883)突变。与终止获得事件相比，发现倒数第二个和最后一个外显子改变在fs-插入/缺失中显著消减(分别为OR＝0.58[0.46-0.71],P＝1.5x10-5和OR＝0.65[0.55-0.75],P＝1.5x10-7)(图10A)。相比之下，fs-插入/缺失突变更可能发生在中间外显子位置中(OR＝1.51[1.33-1.68],P＝1.2x10-11)。无论哪种情况，第一个外显子突变均未富集，这可能是由于绝对数较小(仅n＝69个fs-插入/缺失是第一个外显子)。该数据提示负选择性免疫压力对可能逃脱NMD的外显子位置(例如倒数第二个和最后一个)中的fs-插入/缺失突变起作用，导致具有中间外显子fs-插入/缺失的癌细胞，它们更有可能幸免于免疫编辑。
[0270] NMD逃脱突变负荷与改善的总体存活相关
[0271] 最后，为了评估黑素瘤中NMD逃脱突变的天然抗肿瘤免疫原性的证据，我们检查了TCGA SKCM分组中368名患者的匹配DNA和RNA测序数据。与具有0个NMD逃脱突变的患者相比，具有至少一个NMD逃脱突变的患者具有显著改善的OS(HR＝0.69[0.50-0.96]，P＝0.03)(图10B)。此外，使用由Cortes-Ciriano等人(19)鉴定的来自MSI癌(其具有高丰度的fs-插入/缺失事件)的匹配DNA和RNA测序数据(n＝96)，在具有高NMD逃脱突变负荷(定义为>分组中值而非＝>1，由于高水平的插入/缺失事件)的患者中观察到改善的OS的相似但不显著的趋势)(HR＝0.67[0.31-1.45]，P＝0.313)。
[0272] 本文呈现的结果显示了表达的fs-插入/缺失在预测为逃脱NMD的基因组位置上高度富集，并且具有更高的蛋白质水平表达(相对于非表达的fs-插入/缺失)。表达的fs-插入/缺失(又称NMD逃脱突变)也与来自免疫疗法的临床益处显著相关。
[0273] 发现NMD逃脱突变计数与CPI和ACT两种方式的免疫疗法的临床益处显著相关，并且比nsSNV或fs-插入/缺失关联更强。与具有0个此类事件的患者(≥0.12-0.35)相比，具有≥1个NMD逃脱突变的患者的CPI临床益处率升高(所分析的分组间的范围＝0.56-0.71)。此外，从抗肿瘤疫苗和CPI研究中分析的实验证据证明了T细胞对人患者中直接表达的移码新表位的反应性。相对于实验筛选但T细胞非反应性fs-插入/缺失，T细胞反应性fs-插入/缺失新抗原在NMD逃脱外显子位置中富集(OR＝12.5[0.9-780.7]，P＝0.043。
[0274] 参考文献
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[0299] 以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员将是明显的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应过度限于这些特定的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说明显的所描述的用于实施本发明的方式的各种修改都在所附权利要求书的范围内。
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