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使用病毒颗粒的癌症免疫疗法

阅读：981发布：2020-05-11

专利汇可以提供使用病毒颗粒的癌症免疫疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明描述了治疗有需要的受试对象的癌症的方法，其包括向所述的受试对象给予治疗有效量的病毒或类病毒颗粒，其中所述的病毒颗粒在所述的受试对象中为非复制性的并且是非感染性的。所述的方法代表一种原位接种，其中直接应用于肿瘤的免疫抑制剂改变了肿瘤微环境，使得免疫系统能够对肿瘤产生应答。，下面是使用病毒颗粒的癌症免疫疗法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种治疗有需要的受试对象的癌症的方法，其包括向所述的受试对象给予治疗有效量的病毒或类病毒颗粒，其中所述的病毒或类病毒颗粒在所述的受试对象中是非复制性的并且是非感染性的。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的病毒为植物病毒。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的病毒为植物小核糖核酸病毒。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的植物小核糖核酸病毒为豇豆花叶病毒属(Comovirus genus)的病毒。
5.权利要求3所述的方法，其中所述的植物小核糖核酸病毒为豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的病毒颗粒在接近于所述的受试对象的肿瘤处给予。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的病毒颗粒与药物可接受的载体一起给予。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的癌症为转移癌。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的癌症选自黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的癌症为肺癌。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的病毒颗粒通过吸入给予。
12.权利要求1所述的方法，其中所述的病毒颗粒为非感染性病毒颗粒。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的病毒颗粒加载由货物分子或者与货物分子结合。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的货物分子为抗癌剂。
15.权利要求1所述的方法，其进一步包括消融所述的癌症的步骤。
16.权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述的受试对象给予治疗有效量的抗癌剂。

说明书全文

使用病毒颗粒的癌症免疫疗法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2014年11月7日提交的美国临时专利申请系列No.62/076,543、2015年1月26日提交的美国临时专利申请系列No.62/107,617、2015年5月11日提交的美国临时专利申请系列No.62/159,389的优先权，所有这些申请文件的内容以引用方式并入本文。

[0003] 关于联邦政府资助的研究的陈述

[0004] 本发明是在由the National Institutes of Health授予的NIH Training Grant No.5T32AI007363-22、NIH Training Grant No.T32HL105338和Grant No.NIH 1U54CA151662下，以及在由the National Science Foundation授予的Grant No.CMMI
1333651下，在政府支持下完成的。

背景技术

[0005] 无论组织来源如何，转移癌均同样地具有较差的预测。传统的化疗和放射性疗法很大程度上对于晚期疾病是无效的。新兴的肿瘤免疫疗法领域提供了新的治疗选择。寻求诱导抗肿瘤免疫力的新型治疗(例如免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体细胞疗法和肿瘤相关的抗原癌症疫苗)显示出前景，但是针对癌症的免疫疗法的研发处于早期阶段，并且可能的情况是由于使用其他的癌症疗法，结合免疫疗法以达到最佳的效力。进行了有限探索的选择是将免疫刺激剂直接应用于疑似转移的位点或经鉴定的肿瘤。这种方法(原位接种)可以调控局部微环境，并且类似于诸如T细胞检查点阻断抗体之类的疗法，可以减轻免疫抑制，并增强针对肿瘤表达的抗原的抗肿瘤免疫力。

[0006] 关于这一点，对于纳米颗粒作为癌症疗法的研究主要集中于它们作为传递平台：使用肿瘤相关抗原和用于刺激抗肿瘤免疫力的免疫激动剂加载颗粒，或者使用现有的用于传递至肿瘤的常规化疗药品加载颗粒作为降低毒性的手段。Sheen et al.,Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol.,6(5):496-505(2014)。如果纳米颗粒调控了所获取的固有免疫群体的特征，则它们与固有免疫细胞的相互作用及被固有免疫细胞获取的趋势使得它们潜在地作为免疫刺激、免疫调节和免疫刺激剂。

[0007] 类病毒颗粒(VLP)是指衣壳蛋白质自发组装成特定病毒的三维衣壳结构。类似于活性病毒，这些颗粒的大小为20-500nm，但是它们缺乏病毒核酸。VLP已经有效地用作针对感染性乙型肝炎病毒副本(Halperin et al.,Vaccine,30(15):2556-63(2012))和人类乳头瘤病毒(Moreira et al.,Hum Vaccin.,7(7):768-75(2011))的抗病毒疫苗的抗原成分。通过预防导致癌症的病毒感染，使用VLP的疫苗目前有助于癌症发病率的减少。

[0008] 近来的研究已经证明VLP治疗效力已经扩展至特定的抗原阵列的范围之外，其中所述的特定的抗原阵列是VLP所携带的，并且该VLP可以具有可以刺激针对感染试剂(其未携带VLP所包含的任何抗原)的免疫应答的固有的免疫原性(Rynda-Apple et al.,Nanomed.,9(12):1857-68(2014))。VLP在感染性肺病的小鼠模型的呼吸道中已经显示诱导保护性免疫应答的能力。VLP治疗保护小鼠免于由抗引新青霉素的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus(MRSA))(Rynda-Apple et al.,Am J Pathol.,181(1):196-210(2012))和贝纳特氏立克次体(Coxiella burnetii)(Wiley et al.,PloS ONE.,4(9):e7142(2009))起的细菌肺炎。VLP还显示保护多种流感模型的小鼠。Patterson et al.,ACS Nano.,7(4):3036-44(2013)；Richert et al.,Eur J Immunol.,44(2):397-408(2014)。这些模型中的保护性免疫力与募集、激活和增加的抗原处理能力，可诱导的支气管相关的淋巴组织(iBALT)的形成以及CD4+T和B淋巴细胞和CD8+T细胞的刺激有关。重要的是应该注意这些研究报告了固有的和获得性免疫力的强力诱导，并且所用的VLP与感染性试剂并非抗原相关的，而是显示通过颗粒的固有免疫调控本性而发挥它们的治疗作用。任何VLP的免疫调控的机制基础是未知的，但是一些VLP可能比其他的VLP具有更多的能力。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明人研究了最初在肺感染性疾病模型中观察到的病毒、类病毒颗粒和它们的独特治疗特征是否可以用于新的应用：治疗癌症，例如肺癌。原发性肺癌是美国仅在乳腺癌之后的第二普遍的癌症。此外，大部分其他的主要癌症通常转移至肺，包括乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、肾癌、黑素瘤和前列腺癌。他们的研究集中于黑素瘤(由于在美国，它们的发病率增加)以及转移性疾病的较差的预后，目前其5年生存率低于10％。Flaherty et al.,N Engl J Med.,363(9):809-19(2010)。本发明人还研究了免疫介导的抗肿瘤效力是否转移至乳腺癌、卵巢癌和结肠癌模型中；原发性和转移位点是否被治疗。

[0011] 豇豆花叶病毒(CPMV)是自组装成离散的均一的30nm二十面体结构的蛋白质纳米颗粒。其由60个拷贝组成，每个拷贝都具有小的和大的衣壳蛋白质单元。Yildiz et al.,J Controlled Release.,172(2):568-78(2013)。CPMV是可以通过植物的分子农业而生产的植物病毒。具体而言，在本发明提供的实例中使用的颗粒为VLP系统的空CPMV(eCPMV)，其未携带任何核酸；因此其是非复制性的，并且由人类健康和农业的观点来看，它们可以被视为安全的。在植物中生产防止内毒素污染，内毒素可以为由E.coli衍生的其他VLP系统的副产物。所述的颗粒是规模可升级的，在一定的温度范围(4-60℃)内是稳定的，并且为溶剂:缓冲剂的混合物；而且可以修饰成在其中空的核心或者与其衣壳蛋白质共价连接的方式传递货物，例如药品或抗原。Aljabali et al.,Mol Pharm.,10(1):3-10(2013)。本发明人研究了eCPMV纳米颗粒为作为免疫治疗剂在转移性肺黑素瘤以及皮肤黑素瘤和其他癌症模型(乳腺癌、结肠癌、卵巢癌)中的效力，并且发现其在小鼠模型中作为原位接种试剂的引人关注的效力。

[0012] 本发明人的方法不依赖于eCPMV颗粒作为用于药品或抗原传递的媒介物，而是依赖于它们的固有免疫原性。这种免疫原性在颗粒被吸入时，或者通过肿瘤内给予而被给予至皮肤肿瘤时，或者当治疗播散性转移性卵巢癌时进行IP给予时，显示独特的效力。对于肺肿瘤的治疗而言，将颗粒以气管内注射至患有已经建立的肺肿瘤的小鼠中，并且这种免疫刺激治疗使得这些肿瘤被排斥，并且得到防止远端肿瘤生长的系统性免疫力。单独的eCPMV颗粒能够刺激系统性抗肿瘤免疫力。eCPMV能够使得肺微环境不适合肿瘤细胞传播或持续的生长。本发明人在攻击后的3天进行处理，其为良好建立以下情况的时间点：肿瘤细胞已经接种。这些细胞是否持续地并简单地失去扩增能力，或者它们是否被免疫系统主动地消除都是未知的。

[0013] 本发明人证明具有不明显的免疫刺激成分的空豇豆花叶病毒(eCPMV)类病毒颗粒(VLP)能够刺激有效的抗肿瘤免疫应答。其中eCPMV VLP被免疫系统识别的方式还尚未表征。在小鼠中的研究证明了在小鼠建立肺肿瘤后吸入eCPMV类病毒颗粒(VLP)时的这种能力。这是首次证明任何类型的VLP的这种免疫刺激能力具有抗肿瘤作用。

[0014] 附图简述

[0015] 通过参照以下附图可以更容易地理解本发明，其中：

[0016] 图1A和1B提供了示出eCPMV纳米颗粒是固有免疫原性的柱状图。(A)暴露于eCPMV的骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)在体外产生了生个水平的促炎性细胞因子。(B)巯基乙醇酸盐激发的原代巨噬细胞也分泌显著升高水平的相同的一组细胞因子。使用20μg eCPMV将2种类型的细胞培养24h(黑色柱)，并使用多通量luminex阵列来分析细胞因子的水平。

[0017] 图2A-2D提供了显示在携带B 16F10肺肿瘤的小鼠中eCPMV吸入诱导免疫细胞组成和细胞因子/趋化因子环境急剧改变的图。(A)在使用PBS(上方左侧)或eCPMV(上方右侧)处理的不携带肿瘤的小鼠的活CD45+细胞上、以及在使用PBS(下方左侧)或eCPMV(下方右侧)+处理的携带B 16F10肿瘤的小鼠的活CD45细胞上预门控的代表性FACS图。在B16F10IV注射后的第7天处理的B16F10小鼠。在气管内注射PBS或l00ug eCPMV后24h，收集肺。标记表示(i)休眠的嗜中性粒细胞，(ii)肺泡巨噬细胞，(iii)单核细胞MDSC，(iv)粒细胞MDSC，(v)肿瘤浸润性嗜中性粒细胞，以及(vi)激活的嗜中性粒细胞。在圆圈圈起的组的旁边的数字为+ +
CD45 细胞的％。箭头表示TIN(蓝色)和CDl lb激活的嗜中性粒细胞(红色)。在补充数据中利用门控方法。(B)由eCPMV吸入诱导的固有细胞亚群的改变定量为如面板(A)中所示的CD45+细胞(上方)和细胞总数量(下方)的百分率。(C)TIN、激活的嗜中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、和单核细胞MDSC的代表性柱图，其表明Alexa488-标记的II类CPMV和CD86激活标志物的摄入。(D)携带B 16F10肺肿瘤的小鼠的肺在如面板(A)中所示使用eCPMV进行处理时，展现出升高水平的促炎性细胞因子和化学引诱物。

[0018] 图3A-3D提供了示出eCPMV吸入会防止B 16F10类转移性肺肿瘤的形成的图和照片。(A)试验设计简图。(B)在肿瘤攻击后第21天时，由eCPMV-和PBS-处理的携带肿瘤的B16F10小鼠得到的肺的摄影照片。(C和D)通过(C)中的两个数量，或者通过(D)中用于黑色素细胞特异性Tyrpl mRNA表达的qRT-PCR测试来定量B16F10肺类转移性肿瘤病灶。

[0019] 图4A-4D提供了示出在B16F10肺模型中eCPMV治疗效力为免疫介导的图。(A)当小鼠缺乏11-12时，eCPMV吸入不能显著影响肿瘤的发展。(B)在缺乏Ifn-γ的情况下，治疗效力也被废除。(C)缺乏T,B和NK细胞的NOD/scid/II2-γ-/-小鼠也不能对eCPMV吸入疗法产生应答。(D)使用Ly6G mAb消耗嗜中性粒细胞会废除治疗效力。

[0020] 图5A-5D提供了示出eCPMV免疫疗法成功用于转移性乳腺癌、侧腹黑素瘤(flank melanoma)、结肠癌和卵巢癌模型中的图和照片。(A)使用4T1乳腺肿瘤攻击的并气管内注射PBS的小鼠快速地发展(IVIS图像)并且在第24天开始屈从于(Kaplan-Meier)转移性肺肿瘤，而在接受气管内注射eCPMV的小鼠中，肿瘤发展延迟并且存活显著延长。(B)直接注射eCPMV的携带皮内侧腹B16F10肿瘤的小鼠(箭头表明处理天数)显示相对于注射PBS的对照而言显著延长的肿瘤发展，并且在一半的eCPMV处理的小鼠中，肿瘤一起被消除。(C)携带皮内侧腹CT26结肠肿瘤的小鼠也对eCPMV的直接注射产生应答(箭头表明处理天数)，并且与注射PBS的对照相比，生长显著延迟。(D)eCPMV还证明成功地作为用于ID8-Defb29/Vegf-A卵巢癌攻击的小鼠的疗法，从而使得相对于注射PBS的对照而言，当IP注射时，显著改善生存情况。

[0021] 图6A和6B提供了显示eCPMV处理皮肤B 16F10诱导系统性抗肿瘤免疫力的时间表(A)和图(B)。

[0022] 发明详述

[0023] 除非另外定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的任一菩提技术人员通常理解的相同的含义。用于描述本发明的专有名词仅用于描述特定的实施方案，并且无意于限定本发明。本发明提及的所有公开、专利申请、专利和其他参照均以引用方式全文并入本文。

[0024] 定义

[0025] 除非内容中另外明确地指出，否则如本发明的说明书和所附的权利要求书所用，单数形式“a”、“an”和“the”还包括复数形式。此外，通过端值引述的数字范围包括归入该范围内的所有数字(例如1至5，包括1,1.5,2,2.75,3,3.80,4,5等)。

[0026] 如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，是指由氨基酸残基构成的化合物，其中所述的氨基酸残基通过肽键共价连接。蛋白质或肽必须包含至少2个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限定。多肽包含任意的肽或蛋白质，该肽或蛋白质包含彼此通过肽键连接的2个或多个氨基酸。如本文所用，所述的术语是指短链，它们在本领域中通常还称为例如肽，寡肽和寡聚体，并且所述的术语还指更长的链，其在本领域中通常还称为蛋白质，该蛋白质有多种类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合多肽等。所述的多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。蛋白质可以为受体或非受体。“Apa”为氨基戊酸。

[0027] “核酸”是指多核苷酸，并且包括多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸。

[0028] 如本文所用，“治疗”是指减轻疾病或紊乱的作用，或者延迟、停止或逆转疾病或紊乱的进展。所述的词语涵盖减轻疾病或紊乱的症状的严重性，和/或疾病或紊乱的症状的频率。

[0029] 如本文所用，“受试对象”可以为人类或非人类动物。非人类动物包括例如家畜和宠物(例如绵羊、牛、猪、犬、猫和鼠科哺乳动物)以及爬行动物、鸟和鱼。优选的是，受试对象为人类。

[0030] 用语“有效量”或“治疗有效量”是指在本发明的实践中使用的组合物的非毒性但足够的量，其有效地用于提供受试对象的有效成像或治疗，该量取决于所用的化合物。其结果可以降低和/或减轻疾病或紊乱的迹象、症状或原因，或者生物学系统的任何其他所需的改变。在任何个体情况下的合适的治疗量可以由本领域的任一技术人员使用常规的试验来确定。

[0031] “预防性”治疗或“防治性”治疗是指为了降低发展与疾病或紊乱有关的病理学的风险而给予受试对象的治疗，其中所述的受试对象未展现出疾病或紊乱的迹象，或者仅展现出疾病或紊乱的早期迹象。

[0032] “治疗性”治疗是指为了减少或消除疾病或紊乱的病理学的迹象而给予受试对象的治疗，其中所述的受试对象展现出疾病或紊乱的病理学的迹象。

[0033] “药物可接受的载体”在本发明中是指在不具有过量毒性或其他并发症的情况下适用于将活性药物组分(例如本发明的组合物)传递给受试对象同时保持活性药物组分的生物学活性的组合物。稳定蛋白质的赋形剂(例如甘露醇、蔗糖、聚山梨醇酯-80和磷酸盐缓冲剂)通常在此类载体中发现，但是所述的载体不应该解释为仅限于这些化合物。

[0034] 在一个方面中，本发明提供了通过将治疗有效量的病毒或类病毒颗粒给予有需要的受试对象而治疗该受试对象的癌症的方法。病毒或类病毒颗粒在受试对象中应该是非复制性的和非感染性的，以避免受试对象的感染。在一些实施方案中，病毒颗粒给予接近于受试对象的肿瘤。将病毒颗粒给予接近于肿瘤涉及直接给予肿瘤位点，从而提供在肿瘤微环境中高的局部浓度的病毒颗粒。

[0035] 在一些实施方案中，使用其中不存在病毒核酸的类病毒颗粒(VLP)。缺乏病毒核酸的类病毒颗粒是非复制性的并且是非感染性的，而与引入它们的受试对象无关。类病毒颗粒的实例为空豇豆花叶病毒颗粒。在其他的实施方案中，病毒颗粒包括处于病毒颗粒中的核酸。如果存在核酸，则核酸通常为编码病毒的核酸。但是，在一些情况下，病毒核酸可以被外源核酸替代。在一些实施方案中，核酸为RNA，而在其他的实施方案中，核酸为DNA。当包含核酸的病毒颗粒被引入其不能感染的受试对象中时，该病毒颗粒仍是非复制性的和非感染性的。例如当植物病毒颗粒被引入动物受试对象中时，其通常是非复制性的和非感染性的。

[0036] 在一些实施方案中，病毒为植物病毒。然而，在本发明的一些实施方案中，可以使用噬菌体或哺乳动物病毒。当使用植物病毒时，在一些实施方案中，植物病毒为植物小核糖核酸病毒。植物小核糖核酸病毒为属于Secoaviridae科的病毒，其与哺乳动物picomaviruses一起属于Picornavirales目。植物picomaviruses是具有二十面体衣壳的相对小的非包膜的正链RNA病毒。植物picomaviruses具有多种不同于其他picomaviruses的额外性质，并且分类为secoviridae亚科。在一些实施方案中，病毒颗粒选自Comovirinae病毒亚科。得自Comovirinae亚科的病毒的实例包括豇豆花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒1和烟草环斑病毒。在其他的实施方案中，病毒颗粒得自comovirus属。Comovirus的优选实例为豇豆花叶病毒颗粒。

[0037] 病毒或类病毒颗粒可以根据本领域那些技术人员已知的多种方法来获得。在其中使用植物病毒颗粒的实施方案中，病毒颗粒可以得自被植物病毒感染的植物的提取物。例如豇豆花叶病毒可以在黑眼豆植物中生长，该植物可以在播种种子的10天内被感染。植物可以通过例如使用包含病毒的液体涂敷叶片、然后优选地在磨料粉(其损伤叶片表面从而使叶片渗透和植物感染)存在下摩擦叶片而被感染。在感染后的一周或两周内，收获叶片并提取病毒纳米颗粒。在豇豆花叶病毒的存在下，100mg病毒可以得自较少的50科植物。使用对感染植物进行提取以获得植物小核糖核酸病毒颗粒的过程是本领域那些技术人员已知的。参见Wellink J.,Meth Mol Biol,8,205-209(1998)。多个过程也可以用于获得类病毒颗粒。Saunders et al.,Virology,393(2):329-37(2009)。这两份参考文献的公开内容以引用方式并入本文。

[0038] 通过病毒颗粒的给予进行癌症治疗

[0039] 本发明提供了通过将治疗有效量的病毒或类病毒颗粒给予有需要的受试对象而治疗该受试对象的癌症的方法。尽管无意于被理论所束缚，但是明显的是由于病毒颗粒激发了对癌症的免疫应答而具有抗癌作用。“癌症”或“恶性肿瘤”作为同义术语使用，并且是指可以表征为细胞未受控制的异常的增殖、受影响的细胞局部或者通过血流和淋巴系统传播至肌体的其他部分的能力(即，转移)、以及多种特征性结构和/或分子特征的任意一种的多种疾病的任意一种。“癌细胞”是指经历多步肿瘤进展的早期、中期或晚期的细胞。使用显微镜来描述肿瘤进展的早期、中期和晚期的特征。处于肿瘤进展3个时期的各个时期的癌细胞通常具有异常的核型，包括易位、倒位、删除、等臂染色体、单体性染色体和超数染色体。癌细胞包括“增生细胞”(即，处于恶性肿瘤进展的早期的细胞)，“增生不良细胞”(即，处于肿瘤进展晚期额细胞)。癌症的实例为肉瘤、乳腺癌、肺癌、脑癌、骨癌、肝癌、肾癌、结肠癌和前列腺癌。在一些实施方案中，病毒颗粒用于治疗选自但不限于黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌的癌症。在一些实施方案中，病毒颗粒用于治疗肺癌。吸入是在治疗肺癌时给予病毒或类病毒颗粒的优选的方法。然而，吸入的病毒颗粒由于具有刺激系统性免疫应答的能力，所以能够治疗肺部以外的癌症。例如在一些实施方案中，病毒颗粒用于治疗转移癌，其被传播至发生癌症的初始点以外的一处或多处位点。在其他的实施方案中，病毒或类病毒颗粒可以给予接近于其他组织中的肿瘤。

[0040] 在一些实施方案中，所述的方法进一步包括消融癌症的步骤。消融癌症可以使用选自以下的方法来完成：冷冻消融,热消融,放射性疗法,化疗,射频消融,电穿孔,酒精消融,高强聚焦超声,光动力学疗法,给予单克隆抗体,免疫疗法和给予免疫毒素。

[0041] 在一些实施方案中，消融癌症的步骤包括将治疗有效量的抗癌剂给予受试对象。抗癌剂的实例包括血管生成抑制剂，例如血管增生抑制素Kl-3,DL-a-二氟甲基-鸟氨酸,内皮他丁,烟曲霉素,金雀异黄素(genistein),二甲胺四环素,星形孢菌素,和(+)-沙利度胺；
DNA嵌入或交联剂，例如博来霉素,卡波铂,卡氯芥,苯丁酸氮芥,环磷酰胺,顺铂,美法仑,米托蒽醌,和奥沙利铂；DNA合成抑制剂，例如甲氨蝶呤,3-氨基-l,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物,氨喋呤,胞核嘧啶β-D-阿糖胞苷,5-氟-5'-脱氧尿苷,5-氟尿嘧啶,更昔洛韦,羟基脲,和丝裂霉素C；DNA-RNA转录调节剂，例如放射菌素D,道诺霉素,亚德里亚霉素,高三尖杉酯碱,和去甲氧基柔红霉素；酶抑制剂，例如S(+)-喜树碱,姜黄色素,(-)-鱼藤素,5,6-二氯苯-咪唑Ι-β-D-呋喃糖苷,依托泊苷,福美坦,福司曲星,苯乙烯基吡喃酮(hispidin),cyclocreatine,梅奴灵,曲古柳菌素A,酪氨酸磷酸化抑制剂AG 34,和酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879；基因调节剂，例如5-氮-2'-脱氧胞二磷胆碱,5-氮胞苷,胆钙化醇,4--羟基三苯氧胺,褪黑素,米非司酮,雷洛昔芬,全反式视黄醛,全反式维甲酸,9-cis-视黄酸,视黄醇,三苯氧胺,和曲格列酮；微管抑制剂，例如秋水仙碱,dolostatin 15,噻氨酯哒唑,特素,鬼臼毒素,根霉素,长春碱,长春新碱,去乙酰长春酰胺,和长春瑞滨；多种其他的抗肿瘤试剂，例如17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧格尔德霉素,4-氨基-l,8-萘酰亚胺,芹菜甙元,布雷菲尔德菌素A,甲氰咪胍,二氯亚甲基-二磷酸,亮脯利特,黄体生成素释放激素,皮斐松-a,纳巴霉素,毒胡萝卜素,和尿抑胰酶素,以及它们的衍生物(如成像剂所定义)。

[0042] 在一些实施方案中，消融癌症的步骤包括癌症的免疫疗法。癌症的免疫疗法是基于目的在于使用免疫系统来与恶性疾病战斗的治疗性干预。其可以分成非特异性方法和特异性方法。非特异性癌症免疫疗法通常在于激活的免疫系统的部分，例如使用已知有效用于癌症免疫疗法的特定细胞因子(例如IL-2，感染素、细胞因子诱导剂)的治疗。

[0043] 相反，特异性癌症免疫疗法是基于某些抗原，其优选地或者唯一地在癌细胞上表达，或者主要由恶性疾病(通常在肿瘤位点的附近)内容中的其他细胞表达。特异性癌症免疫疗法可以分成被动和主动方法。

[0044] 在被动的特异性癌症免疫疗法中，将对某些结构(与衍生自免疫系统的成分的癌症有关)具有特异性的物质给予患者。最主要的并且最成功的方法是使用针对定义的癌症相关性结构(例如曲妥单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、阿仑单抗)的、人源化或小鼠/人类嵌合单克隆抗体的治疗。只要足够的浓度存在于患者的肌体中，则药物活性物质便发挥活性，因此，必须根据药代动力学和药效学的考察来重复给予。

[0045] 另一方面，主动的特异性癌症免疫疗法在于患者免疫系统识别并破坏癌细胞的抗原特异性刺激。因此，主动地特异性癌症免疫疗法通常为治疗性接种方法。有多种类型的可以追述的癌症疫苗方法，例如使用自体的或异体的整个肿瘤细胞(在多数情况下进行基因修饰，以便更好地进行免疫识别)、肿瘤细胞裂解物、整个肿瘤相关抗原(通过基因工程或化学合成手段生产)、衍生自蛋白质抗原的肽、编码肿瘤相关抗原的DNA疫苗、肿瘤抗原的替代物(例如用作疫苗抗原的抗独特型抗体)等的接种。这些多样的方法通常与合适的疫苗佐剂和其他的免疫调控剂一起给予，以便在数量上和质量上激发充足的免疫应答(可以同时追求许多新型的疫苗佐剂方法和癌症疫苗的研发)。另一种癌症疫苗方法依赖于操纵树突状细胞(DC)作为免疫系统的最重要的抗原提呈细胞。例如加载肿瘤抗原或肿瘤细胞裂解物、使用编码肿瘤抗原的基因的转染和体内靶向是可以与用于癌症治疗的本发明的病毒或类病毒颗粒一起使用的合适的免疫疗法。

[0046] 货物分子

[0047] 在一些实施方案中，病毒颗粒加载有货物分子或者与货物分子结合。多种不同类型的货物分子可以加入至或者与病毒颗粒结合。加载至病毒颗粒中的货物分子必须足够小，从而适合在病毒衣壳内(即，就典型的二十面体衣壳而言，大小为10nm或更小)。用于本发明的优选的货物分子包括抗肿瘤剂。备选地，与其加载至病毒颗粒上，还不如使货物分子与病毒颗粒结合。货物分子可以与病毒颗粒直接或间接偶联(例如通过连接体基团)。在一些实施方案中，货物分子直接附着在能够与所述的试剂反应的官能团上。例如亲核基团(例如氨基或巯基基团)能够与包含羰基的基团(例如酐或酸性卤化物)反应，或者与包含良好的离去基团的烷基基团(例如卤化物)。备选地，可以使用合适的化学连接体基团。连接体基团可以起到增加所述的试剂或病毒颗粒上的取代基的化学反应性的作用，因此增加偶联效率。适合作为将货物分子附着在病毒颗粒上的位点的优选基团为存在于病毒衣壳蛋白质中的一个或多个赖氨酸残基。

[0048] 病毒颗粒的剂量和配制物

[0049] 当本发明的构建体在体内使用时，其优选地作为药物组合物给予，该药物组合物包含混合物以及药物可接受的载体。加载的小核糖核酸病毒可以以0.001至99.9wt％、更优选地大约0.01至99wt％、甚至更优选地0.1至95wt％的量存在于药物组合物中。

[0050] 病毒颗粒或者包含这些颗粒的药物组合物可以通过经设计用于提供所需的效果的任何方法来给予。给予可以以肠内或肠胃外的方式进行，例如口服、直肠、脑池内、阴道、腹膜内或局部给予。肠胃外给予方法包括血管内给予(例如静脉内团注、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和导管滴注至血管中)，靶组织周围及靶组织内注射，皮下注射或沉积(包括皮下输注，例如通过渗透泵)，肌肉注射，腹腔内注射，用于CNS肿瘤的颅内和鞘内给予，以及直接应用于靶区域上(例如通过导管或其他的放置装置)。

[0051] 用于将病毒颗粒给予患有肺癌的受试对象的优选的方法为吸入法。例如可以将病毒颗粒通过气管内给予至受试对象的肺部。就通过吸入给予而言，病毒颗粒优选地配制成喷雾剂或粉末。用于用于纳米颗粒肺传递的多种方法由Mansour et al.,Int J Nanomedicine.2009；4:299-319所讨论，该文献的公开内容以引用方式并入本文。

[0052] 根据所需的配方，所述的组合物还可以包含药物可接受的非毒性载体或稀释剂，其定义为常用于配制用于动物或人类给予的药物组合物的媒介物。选择稀释剂，以便不会影响所述的组合的生物学活性。此类稀释剂的实例为蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液、右旋糖溶液和Hank溶液。此外，药物组合物或配制物还可以包含其他的载体、佐剂、或者非毒性的非治疗性的非免疫原性的稳定剂等。

[0053] 合适的剂量可以根据所用的治疗剂或成像剂而广泛改变。用于静脉内给予的典型的药物组合物为大约0.1mg至大约10g/受试对象/天。可以根据受试对象需要的并且耐受的剂量和频率给予组合物的单次或多次给予。在任何事件中，给予方案应该提供足量的本发明的组合物，从而高效地治疗受试对象。

[0054] 配制物可以方便地存在于单位剂型中，并且可以由制药领域中公知的任何方法来制备。优选地，此类方法包括使病毒颗粒与药物可接受的载体相关联的步骤，其中所述的药物可接受的载体构成了一种或多种辅助组分。通常，通过使活性试剂一致地并且亲密地与液体载体和/或细分的固体载体相关联，然后如果需要，使产物形成所需的配制物来制备配制物。本发明的方法包括将足以产生所需的作用的量的本发明的组合物给予受试对象，优选为哺乳动物，更优选为人类。

[0055] 本领域的任一技术人员通过考虑多种因素，例如受试对象的尺寸和体重，疾病渗透的程度，受试对象的年龄、健康和性别，给予途径，以及给予为局部给予还是系统给予，可以容易地测定给予给定受试对象的病毒颗粒的量。本领域的那些技术人员可以导出合适的给予剂量和时间表，从而适合特定环境和受试对象的需要。例如可以由待杀死的癌细胞的量或者将给予病毒颗粒的肿瘤的量来评估待给予的病毒颗粒的合适的剂量。

[0056] 通过比较活性试剂的体外活性和在动物模型中的体内活性来测定该活性试剂的有用剂量。用于推断在小鼠和其他动物(例如人类)中的有效剂量的方法是本领域已知的。足以取得治疗性或预防性治疗的量定义为治疗或预防有效剂量。在预防和治疗方案中，通常在多个剂量中给予所述的试剂，直至取得一定的作用。病毒颗粒的有效剂量根据多种不同的因素而改变，包括给予手段、靶位点、患者的生理学状态、患者为人类还是动物、给予的其他药剂、以及治疗是预防性还是治疗性的。

[0057] 将多个实施例包含在内以便更清楚地描述本发明的特定的实施方案。然而，在本发明的范围内具有大量的其他的实施方案，其不应该限于本发明提供的特定的实施例。实施例

[0058] 实施例1：使用植物衍生的类病毒纳米颗粒免疫疗法的原位接种抑制转移癌[0059] 目前的疗法通常对转移癌是无效的，并且新兴的免疫疗法尽管是有前景的，但是出于研发的早期阶段。原位接种是指其中被直接应用于肿瘤的免疫刺激剂改变了免疫抑制微环境、使得免疫系统能够高效地对肿瘤产生应答的过程。本发明人假设使用类病毒纳米颗粒治疗携带肺肿瘤的小鼠能够调控肺的免疫环境，并预防B 16F10类转移性损伤。本实施例显示吸入由豇豆花叶病毒(CPMV)衍生的自组装类病毒颗粒会抑制静脉内攻击后的小鼠肺中的肿瘤的发展。CPMV-与PBS-处理的小鼠之间的肿瘤负担的不一致是突出的，并且由于在Ifn-γ-/-、II-12-/-或NOD/scid/II2Rγ-/-小鼠中未见这些现象，所以所述的作用是免疫介导的。在缺乏Ly6G+细胞的情况下，也会失去效力。在肿瘤微环境中，CPMV纳米颗粒被粒细胞快速吸收，并得到它们的强力的激活和细胞因子/趋化因子的生产。CPMV纳米颗粒是稳定的、无毒的、高度可扩大规模的并且可以使用药品和抗原修饰的。这些性质，结合它们固有的免疫原性和针对免疫原性较差的肿瘤的显著效力，使得CPMV成为针对转移至肺的癌症的引人注目的新型免疫疗法。此外，CPMV在多种其他的肿瘤模型(包括皮肤黑色素瘤、转移性乳腺癌、结肠癌和卵巢癌)中展现出明确的治疗效力。这是类病毒纳米颗粒用作癌症免疫疗法(具有已经证实的治疗效力)的首次报告。

[0060] 材料和方法

[0061] eCPMV的生产和表征

[0062] 使用双元质粒pEAQexpress-VP60-24K转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的培养物，通过本氏烟(Nicotiana benthamiana)植物的农杆菌渗入法来生产eCPMV质粒，其中所述的双元质粒包含用于衣壳蛋白前体VP60及其24K病毒蛋白酶(从而将其切割成成熟形式)的基因。在渗透后6天，收获叶片，并使用所建立的过程提取eCPMV。使用UV/vis光谱仪(ε280nm＝1.28mg-1mL cm-1)测量颗粒浓度，并且通过透射电子显微镜和快速蛋白质液相色谱来测定颗粒完整性。

[0063] 小鼠

[0064] C57BL/6J(01C55)雌性小鼠购自the National Cancer Institute或TheJackson Laboratory。Il-12p35-/-(002692),Ιfn-γ-/-(002287),BALB/c(000651),和NOD/scid/I Ry-/-(005557)雌性小鼠购自The Jackson Laboratory。根据theInstitutional Animal Care and Use Committee of Dartmouth进行所有的动物研究。

[0065] 肿瘤模型

[0066] B16F10鼠科黑素瘤细胞系得自Dr.David Mullins(Geisel School of Medicine at Dartmouth College,Hanover,New Hampshire)。4Tl-荧光素酶鼠科乳房癌细胞由Ashutosh Chilkoti(Duke University,Durham,NC)提供。在完全培养基(RPMI，补充有10％FBS和青霉素/链霉素)中培养B 16F10,4Tl-luc,和CT26。如之前所述，在补充有丙酮酸钠的完全培养基中培养ID8-Defb29/Vegf-A原位卵巢浆液性癌细胞。Lizotte et al.,Oncoimmunology,3:e28926.eCollection 2014。收获细胞，在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中洗涤，并根据肿瘤模型，按照以下方式注射：在鼠尾静脉中静脉内注射处于200μl PBS中的1.25xl05活细胞(转移性肺)；在右侧腹部皮内注射处于30μL PBS中的1.25xl05活细胞(B
16F10侧腹)；在右侧部分皮内注射处于30μL PBS中的1xl05活细胞(CT26侧腹)；腹膜内注射处于200μL PBS中的2xl06活细胞(ID8-Defb29/Vegf-A腹膜卵巢)。对于4Tl-luc肿瘤攻击而
5
言，在第0天将处于30PBS中的1xl0活细胞注射至左侧乳房脂肪垫中，并且在第16天手术除去肿瘤，其中第16天为截止至该天，已经良好地建立如下情况：肿瘤自发地转移至肺。通过生物荧光成像证明原发性4Tl-luc肿瘤被完全除去。对于C57BL6J菌株而言，B16F10和ID8-Defb29/Vegf-A是同系的，而对于BALB/c背景而言，CT26和4Tl-luc是同系的。

[0067] eCPMV治疗时间表

[0068] 对使用B16F10静脉内攻击的WT,Il-12-/-,Ιfn-γ--/-,NOD/scid/IL2Rγ--/-,和Ly6G-耗竭的小鼠插管，并且在肿瘤攻击后的第3、10和17天气管内注射处于50μL PBS中的100μg eCPMV。对于肺攻击试验而言，在第21天对小鼠实施安乐死，以用于类转移性损伤和酪氨酸酶表达的定量。在第16天(与原发性肿瘤除去的同一天)和第23天(在除去肿瘤后的第7天)向携带4Tl-luc的小鼠气管内注射处于50μL PBS中的20μg eCPMV。一旦肿瘤达到
10mm2，便在肿瘤攻击后的第7天使用100μg eCPMV瘤内注射B16F10侧腹肿瘤，并且在第14天再次注射。一旦肿瘤达到10mm2，便在肿瘤攻击后的第8天使用100μg eCPMV瘤内注射CT26侧腹肿瘤，并且在第15天再次注射。每隔一天测量一次侧腹肿瘤的直径，并且当肿瘤直径达到
200mm2时，对小鼠实施安乐死。在肿瘤攻击后的第7天开始，使用100μg eCPMV对ID8-Defb29/Vegf-A小鼠IP注射，并且当肿瘤达到35g时，由于腹水的发展，对小鼠实施安乐死。

[0069] 抗体和流式细胞术

[0070] 抗小鼠抗体对CD45(30-F11),MHC-II(M5/114.15.2),CD86(GL-1),CDl lb(Ml/70),F4/80(BM8),以及得自Biolegend的Ly6G(1A8)和得自eBioscience的CD16/CD32(93)具有特异性。使用100μg Alexa-488-标记的CPMV颗粒气管内注射WT和携带B16F10肺肿瘤的小鼠，24h后实施安乐死。收获肺，并使用Miltenyi小鼠肺分离试剂盒(编号#130-095-927)将肺分离成单个细胞的悬液。使用150mM NH4Cl,10mM KHCO3,和0.5mM EDTA的裂解缓冲剂除去红细胞。在MACSQuant分析仪(Miltenyi)上实施流式细胞术。使用8.7版FlowJo 软件来分析数据。

[0071] 酪氨酸酶mRNA表达的分析

[0072] 分离整个肺，并使用RNeasy试剂盒(Qiagen,74104)提取总RNA。使用iScriptTMcDNA合成试剂盒(Bio-Rad,170-8891)合成cDNA。使用iQTM Green Supermix(Bio-Rad,170-8882)，使用浓度为0.5μΜ的引物，在CFX96TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)上实施q-PCR。使用AACT方法，在所有样品均对小鼠Gapdh归一化的情况下计算mRNA转录物的倍数变化。

[0073] 细胞因子测试

[0074] 就体内细胞因子的数据而言，在吸入100μg eCPMV颗粒后24h，由携带B16F10肺肿瘤的小鼠收获总的肺的均匀混合物，此时为肿瘤攻击后的第8天。就体外细胞因子的结果而言，在具有20μg eCPMV或PBS的96孔圆底板的200完全培养基中，以1xl06细胞/孔培养衍生自C57BL6小鼠的骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)和巯基乙醇酸盐刺激的腹腔巨噬细胞。使用小鼠32plex Luminex测试(MPXMCYTO70KPMX32,Millipore)来定量细胞因子。

[0075] 细胞耗竭

[0076] 使用购自Bio-X-Cell(编号#BE0075-1)的耗竭Ly6G的mAb(克隆号1A8)注射小鼠，并且IP给予剂量为500μg，一天后进行eCPMV处理，然后在生存试验过程中每周一次。通过流式细胞术证实肺中超过95％的靶细胞群体被耗竭。

[0077] IVIS成像

[0078] 使用处于PBS中的150mg/kg萤火虫D-荧光素(PerkinElmer编号#122796)对小鼠进行IP注射，并使其静止10min。使用the Xenogen Vivo Vision IVIS Bioluminescent and Fluorescent Imager平台进行成像，并使用Living Image 4.3.1软件(PerkinElmer)进行分析。

[0079] 统计学

[0080] 除非另作说明，使用4-12份生物学复制品至少2次重复所有的试验，并且重复试验之间的结果相似。附图将统计学意义表示为p<0.05为*,p<0.01为**,和p<0.001为***。认为p值<0.05具有统计学意义。使用非配对的Student's t-检验来计算柱状图的数据。误差柱表示平均值与所代表的试验内测试的单个样品之间的标准误差。使用双因素ANOVA来分析侧腹肿瘤生长曲线。生成试验使用用于生存分析的时序Mantel-Cox检验。使用GraphPad Prism 4软件进行统计学分析。

[0081] 结果

[0082] eCPMV纳米颗粒是固有免疫原性的

[0083] 之前公开的工作(使用VLP作为用于呼吸道病原体感染的治疗方法)使用了大量的系统，并报告可不同程度的免疫调控能力。此外，这些研究通常集中于对VLP中所包含的抗原的免疫应答，而为集中于这些颗粒本身的固有免疫原性，这在VLPs.Bessa et al.,Eur J Immunol.38(1):114-26(2008)中未明确示出。此外，一些VLP是否比其他的VLP更刺激是未知的。鉴于此，本发明人提出使用eCPMV(eCPMV是指缺乏RNA的“空”豇豆花叶病毒颗粒)作为新型免疫疗法，并且他们首次试图确定eCPMV的固有免疫原性。将eCPMV VLP加入至由C57BL6小鼠收获的骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)和原代巨噬细胞的体外培养物中。与eCPMV颗粒进行24小时培养后，诱导BMDC(图1A)和巨噬细胞(图1B)分泌更高水平的典型的促炎性细胞因子，包括ΙΙ-β,11-6,Il-12p40,Ccl3(MIPl-a)和Tnf-a，使得本发明人推断eCPMV是固有免疫刺激的。

[0084] eCPMV吸入彻底改变B16F10肺肿瘤的微环境

[0085] 接着，在免疫细胞组成以及细胞因子和趋化因子水平的变化方面来测定eCPMV吸入对肺的微环境的免疫调控作用。使不携带肿瘤的小鼠的肺暴露于eCPMV表明在暴露后24小时，Ly6G+嗜中性粒细胞被显著激活，其通过CDl lb激活标志物(Costantini et al.,Int Immunol.,22(10):827-38(2010))(图2A上方面板)和CD86共刺激标志物的上调节来评估。所述的颗粒的Alexa488-标记可以对细胞进行追踪，这能够使本发明人证实就是这种CD1lb+Ly6G+激活的嗜中性粒细胞的亚群特异性地占用eCPMV。

[0086] 携带B16F10黑素瘤肿瘤的小鼠的肺表明更复杂的免疫细胞组成。到第7天为止，观察到出现免疫抑制CD11b+Ly6G-F4/80loII类-SSClo单核骨髓细胞衍生的抑制细胞(MDSC)和CD11b+Ly6G+F4/80-II类midSSChi粒细胞MDSC的大的群体(图2A底部面板)。Gabrilovich et al.,Nat Rev Immunol.,(4):253-68(2012)。本发明人还观察到存在CD11b+Ly6G+II类midCD86hi细胞的小群体，该细胞已经下文献中描述为“肿瘤浸润性嗜中性粒细胞”或“N1嗜中性粒细胞”，已知这些细胞通过协同适应性免疫应答、高水平的促炎性细胞因子的生产、T和NK细胞的募集以及对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用而发挥抗肿瘤作用。Fridlender et al.,Cancer Cell.16(3):183-94(2009)；Mantovani et al,Nat Rev Immunol.(8):519-31(2011)。将eCPMV吸入携带B16F10的肺中在给予后24小时会急剧改变免疫细胞的组成。还观察到肿瘤浸润性嗜中性粒细胞(TIN)和CD11b+Ly6G+激活的嗜中性粒细胞群体的显著增多，以及CD11b-Ly6G+休眠嗜中性粒细胞的减少(图2A底部面板，参见箭头)。作为CD45+细胞的百分率以及总数量的百分率，TIN和激活的CD11b+嗜中性粒细胞群体急剧增多(图2B)。有趣的+是，正是这些嗜中性粒细胞亚群体占据了极大量的eCPMV颗粒，特别是TIN，其比CD11b 激活的嗜中性粒细胞占据10倍以上的eCPMV(图2C)。单核细胞MDSC、休眠嗜中性粒细胞和肺泡巨噬细胞群体未占据eCPMV，而粒细胞MDSC展示不抑制的摄入。TIN和激活的嗜中性粒细胞群体还表达II类MHC，特别地，TIN展示高水平的共刺激标志物CD86，表明潜在的抗原提呈和T细胞启动能力。在大量的单核细胞或粒细胞MDSC中为观察到显著的改变。

[0087] 嗜中性粒细胞群体被eCPMV激活符合由多通量细胞因子/趋化因子阵列收集得到的数据，所述的阵列是在携带B16F10肿瘤的肺的全部肺(使用eCPMV或PBS处理)均匀混合物上实施的(图2D)。具体而言，可见嗜中性粒细胞趋化物GM-CSF,Cxcll,Ccl5和ΜΙP-Ια的显著增多以及由激活的嗜中性粒细胞产生的细胞因子和趋化因子(例如GM-CSF,II-1β,11-9,Cxcll,Cxcl9,CxcllO,Ccl2,MIP-la和MIP-Ιβ)的显著增多。有趣的是，本发明人未观察到11-6或Tnf-a水平的显著增多，其为传统的促炎性细胞因子，这在肺免疫生物学中是不利的。

[0088] eCPMV吸入会抑制B16F10类转移性肺肿瘤的发展

[0089] 接着，本发明人研究了eCPMV颗粒在肺中的固有免疫原性在侵入性转移癌的B16F10静脉内模型中是否诱导抗肿瘤免疫力。事实上，每周气管内注射100μg eCPMV(图3A)得到显著降低的肿瘤负担，这可以通过类转移性肿瘤病灶的数量(图3，B和C)以及酪氨酸酶(图3D)的表达来评估。酪氨酸酶相关的蛋白质1(Tyrp1)为黑素细胞特异性基因(Zhu et al.,Cancer Res.,73(7):2104-16(2013))，其在肺中的表达局限于B16F10肿瘤细胞，这可以定量测量重量的发展，并且起到用于大小改变的类转移性病灶的对照。

[0090] eCPMV吸入的抗肿瘤效力是免疫介导的

[0091] 本发明人确定在以下转基因小鼠：Il-12-/-,Ιfn-γ-/-,和NOD/scid/IL2Rγ-/-中，通过重复图3所示的试验设计是否需要免疫细胞来达到治疗效力。在缺乏II-12(图4A),Ifn-γ(图4B)的情况下，或者在缺乏T、B和NK细胞(图4C)的NSG小鼠中，未观察到eCPMV-和PBS-处理的小鼠之间肺肿瘤负担的显著差异。

[0092] 在携带B 16F10肿瘤的小鼠的肺中，eCPMV在嗜中性粒细胞中累积并激活该细胞(图2，A至C)，此外，在eCPMV吸入后的小鼠的肺中检测到嗜中性粒细胞相关细胞因子和趋化因子的显著增加(图2D)。因此，使用单克隆抗体耗尽嗜中性粒细胞，从而评估嗜中性粒细胞对治疗效力的必要性。耗尽由携带肿瘤的小鼠的肺得到的嗜中性粒细胞会废除我们在WT小鼠中观察到的抗肿瘤作用(图4D)。这种情况，再结合在Il-12-/-,Ιfn-γ-/-,和NSG小鼠中观察到的效力的缺乏，使得本发明人推断eCPMV吸入对B16F10发展的抗肿瘤作用是通过肺肿瘤微环境的免疫调控进行的，特别地需要嗜中性粒细胞区室(compartment)的存在。

[0093] eCPMV抗肿瘤效力不限于B16F10静脉内肺模型

[0094] 本发明人寻求确认eCPMV治疗效力是否局限于B 16F10转移性肺模型，或者免疫调控抗肿瘤作用是否转移至其他模型中。首先使用4T1BALB/c同系乳腺癌模型，其为可转移的而且真正的转移性模型。到第16天，在乳房脂肪垫中建立的4T1肿瘤自发地转移至肺中，在所述的时间点，手术除去原发性肿瘤并开始eCPMV治疗，其中进行气管内注射，从而影响肺肿瘤的发展。4T1细胞也表达荧光素酶，从而使本发明人可以追踪转移性肺肿瘤的发展。使用eCPMV颗粒进行气管内处理的小鼠具有显著延长的肺肿瘤的发病，并显著地延长了生存(图5A)。得自eCPMV和PBS处理组的小鼠在手术除去的当天具有相当的原发性乳房脂肪垫肿瘤负担。因此，肿瘤发展和生存的差异是由于所述的处理。得自任意一组的小鼠均未经历原发性乳房脂肪垫肿瘤的复发。

[0095] 为了确定eCPMV颗粒在B16F10和4T1转移性肺模型中的确凿的效力是否是肺免疫环境独特的，还检验其治疗皮肤肿瘤的能力。在直接注射eCPMV后，皮内B16F10黑素瘤(图5B)和CT26结肠(图5C)肿瘤的生长显著延迟，并且一半的B16F10eCPMV处理的小鼠在仅2次处理后肿瘤一起消除(图5B)。

[0096] 最后，在播散性腹膜浆液性卵巢癌模型中研究eCPMV的治疗作用。Conejo-Garcia et al.,Nat Med.,(9):950-8(2004)。每周使用eCPMV处理的Defb29/Vegf-A-攻击的小鼠相对于PBS-处理的对照展现出显著改善的生成情况(图5D)。事实上，接受eCPMV的小鼠比该模型中尝试的其他免疫疗法生存的更长，包括活的减毒的单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogene)菌株(Lizotte et al.,Oncoimmunology,3:e28926.eCollection 2014)，无毒的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)(Baird et al.,Cancer Res.,73(13):3842—51(2013))，组合竞争的CD40和poly(I:C)(Scarlett et al.,Cancer Res.,69(18):7329-37(2009))，或者11-10封闭抗体(Hart et al.,T Cell Biol.,
2:29(2011))。重要的是注意，由于体外暴露于高浓度的颗粒对癌细胞的生活力或增殖不具有影响，所以在所检验的模型中eCPMV的抗肿瘤作用无助于指导肿瘤细胞的细胞毒性，逻辑结论在于由eCPMV纳米颗粒处理诱导的引人注目的抗肿瘤作用是完全免疫介导的，并且在多样的解剖位点上可以翻译成多种肿瘤模型。

[0097] 讨论

[0098] eCPMV纳米颗粒是达到惊人高度的免疫治疗，并且清楚地调控了肿瘤免疫环境。暴露于所述的颗粒的BMDC和巨噬细胞强力地分泌选择性促炎性细胞因子(图1，A和B)。eCPMV颗粒在植物中生产，然后使用聚乙烯吡咯烷酮提取植物污染物，通过PEG沉淀和蔗糖梯度离心分离eCPMV，最终通过超粒化技术(ultrapelleting)浓缩颗粒。通过UV/Vis吸光率,透射电子显微镜(TEM),快速蛋白质液相色谱(FPLC),和SDS凝胶电泳检查纯度。Wen et al.,Biomacromolecules,13(12):3990-4001(2012)。在这些过程中未检测到污染物。然后将颗粒悬浮于PBS中。此外，eCPMV完全缺乏可以刺激TLR3/7的RNA。因此，本发明人推断eCPMV的高免疫原性是由于病毒衣壳蛋白的大小、性质或固有免疫识别。这与在E.coli或其他系统中制造的类病毒或蛋白质笼形纳米颗粒不同，其中所述的纳米颗粒可以包含免疫原性污染物，例如内毒素或病毒核酸，它们对纯化过程中的移除具有挑战性。

[0099] eCPMV吸入改变了肺肿瘤微环境，并且需要Ly6G+嗜中性粒细胞(其为与肿瘤免疫疗法的应答具有最低相关性的群体)存在。值得注意的是，eCPMV颗粒表现为特异性地靶向Ly6G+嗜中性粒细胞。eCPMV已经显示与癌细胞和一些抗原提呈细胞(Gonzalez et al.,PLoS ONE.4(l l):e7981(2009))上的表面波形蛋白结合(Steinmetz et al.,Nanomed.6(2):351-64(2011))，但是肺残余嗜中性粒细胞是否通过这种机制内化所述的颗粒，或者波形蛋白的表面表达是否为鼠科嗜中性粒细胞的特征不得而知。eCPMV显示出靶向休眠嗜中+ + + hl性粒细胞，并且将它们转化成激活的CD11b表现型和CD11b-II类CD86 肿瘤浸润性嗜中性粒细胞。事实上，这两个群体(激活的嗜中性粒细胞和肿瘤浸润或“N1”嗜中性粒细胞)是显著地快速改变以下eCPMV肺暴露的唯一的天然免疫细胞群体，其急剧地增加CD45+细胞的百分率和总细胞数量的百分率(图2B)。嗜中性粒细胞被规范地视为微生物感染的哨兵，其快速地吞噬并杀死细菌，然后发生凋亡，但是它们在肿瘤免疫学中具有新兴的作用。尽管仍存在争议，但是显示出嗜中性粒细胞具有类似于巨噬细胞文献中接受的M1/M2极化的表现型可塑性。研究显示免疫抑制的促血管生成的“肿瘤相关性嗜中性粒细胞”群体在B16F10转移性肺癌、人类肝癌、肉瘤和肺腺癌模型(与增强的肿瘤进展相关)中的浸润。备选地，耗尽肿瘤残留的免疫抑制嗜中性粒细胞、将它们转化成促炎性表现型、或者募集激活的嗜中性粒细胞以浸润肿瘤微环境与治疗效力有关。激活的嗜中性粒细胞可以通过释放活性氧中间体(ROI)直接杀死肿瘤细胞，诱导(prime)CD4+T细胞，并使它们极化成Thl表现型，交叉诱导(cross-prime)CD8+T细胞，并调控NK细胞生存、增殖、细胞毒性活性和IFN-γ生产。激活的嗜中性粒细胞还可以生产Cxcr3配体Cxc19和Cxc110，其可以募集与黑素瘤模型中的抗肿瘤免疫治疗效力有关的CD4+和CD8+T细胞。显示免疫刺激性嗜中性粒细胞群体增加的数据(图
2B)符合细胞因子的数据(图2D)，其中观察到已知由嗜中性粒细胞产生的嗜中性粒细胞趋化物GM-CSF,Cxcll,Ccl5,ΜΙP-Ια,细胞因子和趋化因子的增多，包括GM-CSF,ΙΙ-Ιβ,11-9,Cxcll,Cxcl9,CxcllO,Ccl2,MIP-la和ΜΙP-1β。该数据相应地符合体内肿瘤进展数据，其显示eCPMV抗肿瘤效力需要嗜中性粒细胞。有趣的是，尽管许多细胞因子和趋化因子的水平在eCPMV处理后升高至具有统计学意义的程度，但是与实际肿瘤负担重中的巨大差异相比，所述的变化是最适度的(图3，B至D)。此外，未观察到促炎性细胞因子Tnf-a或11-6增多，已知所述的促炎性细胞引起当在肺中上调节时，会引起组织损伤。因此，显示eCPMV的肺肿瘤处理是有效的，不会引起这种导致急性非损伤的炎性细胞因子应答。

[0100] eCPMV吸入显示作为单一疗法的显著效力(图3)，所述的单一疗法极清楚地是免疫介导的(图4)。由于eCPMV颗粒不会直接杀死肿瘤细胞，或者与B 16F10肿瘤共享任何抗原性重叠，但是会要到抗肿瘤应答(其需要Th1-相关的细胞因子11-12(图4A)和Ifn-γ(图4B)、适应性免疫力(图4C)和嗜中性粒细胞(图4D))，所以所述的方法是新型的。这表明，当eCPMV被引入至肺中时，eCPMV的固有免疫原性会破坏肿瘤微环境的耐受原本性；从而在本质上，除去了对现有的受到抑制的抗肿瘤免疫应答的阻碍，或者允许新的抗肿瘤应答的发展。

[0101] 本工作还显示在静脉内B 16F10转移性肺模型中的eCPMV抗肿瘤效力并非C57BL6小鼠菌株或B16F10模型的人工产品，因为eCPMV疗法在侧腹B 16F10、卵巢癌和转移性乳腺癌和结肠癌的2种BALB/c模型中让人印象深刻地发挥同等的作用(图5)。在4T1乳腺癌细胞中构成性荧光素酶的表达以及B16F10和CT26的皮内攻击允许我们以一定的方式定量地测量肿瘤的进展，其中所述的方式不适用于B16F10肺模型。正是至这些模型中，我们观察到有效的且直接的抗肿瘤作用，该作用显著延迟肿瘤进展，并且在B 16F10和CT26皮内肿瘤的情况下会引起所建立的肿瘤的快速退化(involution)和坏死中心形成(图5，B和C)(其保持局限在肿瘤的边缘范围内，并且未显示影响周围组织)。在瘤内注射后的第3天对eCPMV的这种早期应答表明eCPMV颗粒会诱导天然免疫细胞介导的抗肿瘤应答。然而，接下来进行的确定免疫细胞在这些肿瘤中的浸润以及此类细胞的表现型的研究是有趣的。

[0102] 这是VLP基纳米颗粒用作癌症免疫疗法以及进一步的特异性靶向并激活肿瘤微环境中的嗜中性粒细胞以协调下游抗肿瘤免疫应答的免疫疗法的首次报告。单独的eCPMV纳米颗粒是免疫原性的，并且作为单一疗法是高度有效的。然而，其还可以用作用于肿瘤抗原、药品或免疫佐剂的纳米载体，从而开启eCPMV可以经修饰以传递载荷(其进一步增强并改善其免疫治疗效力)的令人兴奋的可能性。

[0103] 本发明人证明eCPMV是对抗起源于多种器官的肿瘤的有效的免疫疗法。eCPMV疗法在与其他生物学和小分子相当的剂量下是良好耐受的，并且具有观察不到的毒性副作用。总之，eCPMV自组装VLP是用于癌症治疗(其通过释放抗肿瘤免疫力的力量而发挥其治疗效力)的令人兴奋的新平台。

[0104] 实施例2：皮肤B16F10的eCPMV处理会诱导系统性抗肿瘤免疫力

[0105] 如图6所示，本发明人建立皮肤黑素瘤肿瘤，并且将eCPMV颗粒直接注射至皮肤中(100μg/注射，箭头表示注射天数)。上述处理使得半数的小鼠的肿瘤完全消失。在治愈的小鼠中，我们随后等待4周，并使用相同的肿瘤细胞再次攻击，但是我们在相对的侧腹上注射肿瘤细胞。这些小鼠的大部分未发展出继发的肿瘤。为了清楚起见，原发性肿瘤直接注射颗粒，而携带继发肿瘤的小鼠未接受处理。它们必须依赖单独的系统性抗肿瘤免疫记忆。在最初的肿瘤中局部施加eCPMV，但是诱导系统性免疫力。其中之前患有B 16F10皮肤肿瘤的“再挑战”老鼠直接注射，并且缩小和消失。

[0106] 所有专利、专利申请、公开和本发明引用的电子形式的材料的完整公开内容均以引用方式并入本文。给出上文详细的描述和实例仅为了清楚地理解。不应该理解为由此进行的不必要的限定。本发明不限于所示出的并描述的确切的详细内容，对于本领域任一技术人员显而易见的变体将包含在权利要求书定义的本发明的范围内。

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