癌症免疫疗法的组合物和方法
阅读：595发布：2020-05-13
专利汇可以提供癌症免疫疗法的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种组合疗法，其依赖于小分子免疫刺激因子，环状‑二‑核苷酸(CDN)，其经由最近发现的被称为STING(干扰素基因刺激因子)的胞质受体来活化DC，所述免疫刺激因子与经过工程化以分泌大量DC生长因子GM‑CSF的同种异体人 肿瘤 细胞系一起配制。此组合疗法可提供与有效DC活化刺激物偶合的多个肿瘤相关联 抗原 ，DC募集和增殖的理想协同作用。，下面是癌症免疫疗法的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种组合物，其包括：
环状嘌呤二核苷酸，其结合至干扰素基因刺激因子并且诱导干扰素基因刺激因子依赖性TANK结合激酶1活化；和
灭活肿瘤细胞，其表达并分泌刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子，
其中所述一种或多种细胞因子包含GM-CSF。
2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的赋形剂。
3.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包括CTLA-4拮抗剂和TLR-4激动剂中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤细胞通过辐射处理来灭活。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述环状嘌呤二核苷酸选自由以下组成的组：c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-IMP、c-AMP-GMP、c-AMP-IMP和c-GMP-IMP或其组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述环状嘌呤二核苷酸与一种或多种脂质一起配制。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述一种或多种脂质包括毛地黄皂苷。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述一种或多种脂质形成脂质体。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包括一种或多种佐剂。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述一种或多种佐剂包括CpG和/或单磷酰脂质A。
11.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其中所述灭活肿瘤细胞是表达并分泌GM-CSF的灭活肿瘤细胞和与表达并分泌GM-CSF的灭活肿瘤细胞不同的肿瘤细胞的混合物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物在制备用于诱导针对个体的癌症的免疫响应的药物中的用途，其中所述灭活肿瘤细胞与所述个体的癌症是类型匹配的。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述灭活肿瘤细胞或不同肿瘤细胞的混合物是一种或多种同种异体肿瘤细胞系。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述灭活肿瘤细胞是自体肿瘤细胞。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的用途，其中所述肿瘤细胞选自由以下组成的组：结直肠癌细胞、呼吸-消化道鳞状癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、肉瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、乳腺癌细胞、黑素瘤细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和肾癌细胞。
癌症免疫疗法的组合物和方法
[0002] 发明背景
[0003] 以下发明背景论述仅提供来帮助读者理解本发明，且并非承认描述或构成本发明的现有技术。
[0004] 人免疫系统可总体上划分成两个支组，其被称为“先天性免疫”和“适应性免疫”。免疫系统的先天支组经由包括补体系统和趋化因子/细胞因子系统的许多可溶性因子；和包括肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞的许多专门细胞类型主要负责最初炎症响应。相比之下，适应性免疫支组涉及延迟和更长效的抗体响应，以及CD8+和CD4+ T细胞响应，其在针对抗原的免疫记忆中发挥关键作用。免疫系统的第三支组可确定为涉及γδ T细胞和具有有限T细胞受体谱系的T细胞如NKT细胞和MAIT细胞。
[0005] 对于针对抗原的有效免疫响应，抗原呈递细胞(APC)必须加工抗原并且在适当MHC情境下将抗原显示给T细胞，然后引起细胞毒性和辅助T细胞的T细胞刺激。在抗原呈递之后，必须发生APC和T细胞上的共刺激分子的成功相互作用，否则活化中止。GM-CSF和IL-12在许多肿瘤模型中充当有效促炎症性分子。举例来说，GM-CSF诱导骨髓前驱细胞来增殖并分化成树突状细胞(DC)，但是需要额外信号来将其活化至成熟成为有效抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞是活化T细胞必不可少的。有效免疫疗法的障碍包括可限制适当大小和功能的细胞毒性CD8 T细胞的诱导的对于目标抗原的耐受性、所产生的T细胞到达恶性细胞位点的输送不佳，和所诱导的T细胞响应的持久性不佳。
[0006] 吞噬肿瘤细胞残骸的DC加工用于主要组织相容性复合物(MHC)呈递的材料、上调共刺激分子的表达，并且迁移至局部淋巴节来刺激肿瘤特异性淋巴细胞。此途径导致与肿瘤相关联抗原起反应的CD4+和CD8+ T细胞的增殖和活化。事实上，这类细胞可常常在患者的血液、淋巴组织和恶性病灶中检测到。
[0008] 基因修饰来分泌GM-CSF的肿瘤细胞已被用于各种策略中以试图产生针对肿瘤的有效免疫响应，然而在随机化控制试验中，全身细胞因子施用未诱导直接抗癌响应。皮下注射至患者体内的经过照射的GM-CSF分泌性肿瘤细胞已被证明刺激局部反应，包括DC、巨噬细胞和粒细胞。大量APC的积累暗示在此模型中的GM-CSF的一个功能涉及增强肿瘤抗原呈递。此外，肿瘤细胞疫苗证明为在患者中是安全的。然而，此方法的临床功效仍有待证明。
[0009] 在感染情形中，Toll样受体(“TLR”)激动剂已被证明使得树突状细胞活化产生免疫性，而缺乏TLR信号转导可导致耐受性。这些研究的含义是局部TLR刺激在作为组合疫苗的一部分给出时可以增强抗肿瘤响应。WO2011139769描述配制并使用组合GM-CSF-分泌肿瘤细胞(GVAX)疫苗，以及TLR4刺激，其据报告在多个鼠科模型中提供抗肿瘤功效。然而，它在人中的功效仍然有待证明。
[0010] 仍然需要治疗可能对传统治疗方法顽固性的疾病如癌症的免疫策略的改进组合物和方法。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明的目标是提供治疗癌症的组合疗法。
[0013] 在第一方面，本发明提供组合物，其包括：
[0014] 一种或多种环状嘌呤二核苷酸(“CDN”)，其结合至干扰素基因刺激因子(“STING”)并诱导STING-依赖性TBK1活化；和
[0015] 灭活肿瘤细胞，其表达并分泌刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子。
[0016] 如以下描述，许多CDN适用于本发明。优选环状嘌呤二核苷酸包括但不限于c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-IMP、c-AMP-GMP、c-AMP-IMP、c-GMP-IMP和其类似物中的一种或多种。这个清单并非意味着要限制。
[0017] 类似地，优选共刺激剂包括刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子，包括但不限于GM-CSF、CD40配体、IL-12、CCL3、CCL20和CCL21中的一种或多种。这个清单并非意味着要限制。
[0018] 本发明的组合物可以含有药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的制剂形式通过各种肠胃外和非肠胃外途径来施用至有需要的个体。优选途径是肠胃外，并且包括但不限于皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、鞘内和硬膜外施用中的一者或多者。尤其优选通过皮下施用来施用。优选药物组合物配制为水性或水包油乳液。
[0019] 本发明的组合物可包括或与以下一起施用，一种或多种额外药学活性组分如佐剂、脂质如毛地黄皂苷、脂质体、CTLA-4和PD-1途径拮抗剂、PD-1途径阻断剂、诱导先天性免疫的灭活细菌(例如，灭活或减弱的单核细胞增生利斯特菌)、经由Toll样受体(TLR)、(NOD)-样受体(NLR)、基于维甲酸可诱导的基因(RIG)-I-样受体(RLR)、C-类型凝集素受体(CLR)来介导先天免疫活化的组合物、病原体相关联分子模式(“PAMP”)、化学治疗剂等。
[0020] 如以下描述，与一种或多种脂质一起配制的环状嘌呤二核苷酸可展现改进的性质，包括改进的树突状细胞活化活性。因此，本发明还涉及包括一种或多种CDN和一种或多种脂质的组合物。在某些优选实施方案中，一种或多种CDN与毛地黄皂苷、脂质体制剂和/或水包油乳化液一起配制。虽然本发明的这些制剂可在没有表达并分泌刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子的灭活肿瘤细胞的情况下来施用，但是在某些实施方案中，CDN与一种或多种脂质的制剂连同一种或多种这类细胞系一起提供。
[0021] 在相关方面，本发明涉及诱导个体的癌症的免疫响应的方法。这些方法包括将根据本发明的组合物施用至有需要的个体，其中灭活肿瘤细胞或不同肿瘤细胞的混合物与个体的癌症是类型匹配的。
[0022] 在某些实施方案中，灭活肿瘤细胞或不同肿瘤细胞的混合物是同种异体肿瘤细胞或自体肿瘤细胞或两者的混合物。
[0023] 本发明的方法可针对治疗以下癌症的患者：结直肠癌、呼吸-消化道鳞状癌、肺癌、脑癌、肝癌、胃癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌和肾上腺癌。
[0024] 附图简述
[0025] 图1描绘环状嘌呤二核苷酸(“CDN”)介导的信号转导。CDN(例如，c-二-AMP c-二-GMP、c-AMP-GMP)具有通过磷酸桥键以典型双-(3’,5’)键或非典型2’,5’和3’,5’键来交替连接的两个嘌呤核苷，其由c[G(2’,5’)pA(3’,5’)p]表示。典型或非典型CDN诱导NF-kB依赖性促炎症性细胞因子和IFN-β的产生，方法是结合至细胞质受体STING(干扰素基因刺激因子)，经由TBK-1/IRF-3途径来活化信号转导，经由结合至IFN受体和后续信号转导来导致DC的自分泌和旁分泌活化。
[0026] 图2A描绘HIV Gag的CDN辅助T-细胞响应。
[0027] 图2B描绘在将小鼠用图中展示的疫苗组合物免疫接种之后，PBMC中的初级和次级OVA-特异性CD4和CD8T细胞响应。
[0028] 图2C描绘使用OVA作为模型抗原、由CDN辅助疫苗诱导的免疫响应。
[0029] 图3A描绘响应于GVAX/CDN组合疫苗(被称为“Stingvax”)的B16黑素瘤的生长抑制。
[0030] 图3B描绘响应于GVAX/CDN组合疫苗的TRAMP-GM细胞和骨髓衍生巨噬细胞中的干扰素-β诱导。
[0031] 图4描绘响应于GVAX/CDN组合疫苗的B16黑素瘤的生长抑制的浓度依赖性。
[0032] 图5描绘响应于GVAX/CDN组合疫苗的B16黑素瘤肿瘤的CD8+ T-细胞浸润。
[0033] 图6描绘响应于GVAX/CDN组合疫苗的成熟干扰素γ-产生脾脏DC(CD11c+细胞)的诱导。
[0034] 图7描绘在CDN处理后的人树突状细胞的诱导，如通过共刺激分子的表达来评估。
[0035] 图8描绘在用先天性免疫的各种活化剂(包括环状-二-GMP(CDG)、干扰素刺激DNA(ISD)和聚肌苷-胞嘧啶(Poly I:C))刺激之后，从15个独立供体分离的培养人外周血单核细胞中的IFN-α的表达。
[0036] 图9描绘“STINGVAX”的协同作用机制。
[0037] 发明详述
[0038] FDA批准 (Dendreon Corporation)治疗去势难治性转移性前列腺癌(mCRPC)已经证实有效癌症免疫疗法作为治疗领域并且振兴这个领域。然而，因为基于自体树突状细胞(DC)的疫苗， 是不实用的、复杂的和昂贵的，并且只提供有限的—尽管显著—存活益处。改进的癌症疫苗应不仅应至少与 一样有效，而是应更实用，并且优选地能够引起目标响应。此方向上的一个步骤是ProstVac VF，一种编码PSA和三种共刺激分子(B7.1、ICAM-1和Lfa-3)的基于重组痘病毒的疫苗。ProstVac VF已证明在患有mCRPC的男性之间进行的随机化阶段2研究中增加总体存活–虽然存活益处未达到p<0.05统计显著性-并且目前在阶段3功效研究中加以评估。这些疫苗使用由正常前列腺组织和前列腺癌的表达的单一抗原。需要用治疗性疫苗接种策略来靶向多个癌症抗原以减少抗原损失变体的潜在负面影响、肿瘤相关联抗原表达谱的不同患者之间的差异，或MHC单倍体型差异，所有问题利用单一TAA疫苗接种策略。
[0039] 本发明涉及新颖和高度活性组合疗法，其依赖小分子免疫刺激因子，环状-二-核苷酸(CDN)，其经由最近发现的被称为STING(干扰素基因刺激因子)的胞质受体来活化DC，所述免疫刺激因子与经过工程化以分泌大量DC生长因子GM-CSF的经过照射的同种异体人肿瘤细胞系一起配制。此组合疗法可提供与有效DC活化刺激物(CDN)偶合的多个肿瘤相关联抗原，DC募集和增殖(GM-CSF)的理想协同作用。
[0040] CDN环状-二-AMP(由单核细胞增生利斯特菌产生)和它的类似物环状-二-GMP(由嗜肺军团菌产生)被宿主细胞辨识为PAMP(病原体相关分子模式)，其结合至被称为STING的PRR(病原体识别受体)。STING是宿主哺乳动物细胞的细胞质中的衔接蛋白质，其活化TANK结合激酶(TBK1)—IRF3信号转导轴，导致诱导IFN-β和强烈活化先天性免疫力的其它IRF-3依赖性基因产物。现在认识到STING是宿主细胞质监测途径的组成部分，其感测细胞内病原体的感染并且作为响应，诱导IFN-β的产生，导致显现适应性保护病原体特异性免疫响应，所述免疫响应由抗原特异性CD4和CD8T细胞以及病原体特异性抗体组成。
[0041] 定义
[0042] “施用”在本文中关于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽医受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体使用时，是指不限于外源性配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触。“施用”可意指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。细胞的处理涵盖试剂与细胞接触，以及试剂与流体接触，其中流体与细胞接触。“施用”也涵盖试剂、诊断剂、结合组合物或由另一个细胞在体外和离体处理例如细胞。“一起施用”不意味着暗指两种或更多种药剂以单一组合物来施用。虽然本发明涵盖以单一组合物来施用，但是这类药剂可以单独施用来递送至单一受试者，这些施用可在相同或不同时间，并且可通过相同施用途径或不同施用途径。
[0043] 所谓“纯化”和“分离”是指指定物质占存在于组合物中的物质的至少50重量％、更经常占至少60重量％、通常占至少70重量％、更通常占至少75重量％、最通常占至少80重量％、通常占至少85重量％、更通常占至少90重量％、最通常占至少95重量％并且通常占至少98％重量或更大。水、缓冲剂、盐、洗涤剂、还原剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂(包括添加的蛋白质如白蛋白)和赋形剂的重量总体上不用于确定纯度。
[0044] “特异性”或“选择性”结合，在涉及配体/受体、核酸/互补核酸、抗体/抗原或其它结合对(例如，细胞因子与细胞因子受体)(各自总体上在本文中称为“靶标生物分子”或“靶标”)时，指示与蛋白质和其它生物制剂的异质群体中的靶标的存在相关的结合反应。特异性结合可意味着，例如，从所涵盖方法的抗体的抗原结合位点衍生的结合化合物、核酸配体、抗体或结合组合物以比与非靶标分子的亲和力经常大至少25％、更经常大至少50％、最经常大至少100％(2倍)、通常大至少十倍、更通常大至少20倍并且最通常大至少100倍的亲和力结合至它的靶标。
[0045] “配体”是指结合至靶标生物分子的小分子、核酸、肽、多肽、糖、多糖、聚糖、糖蛋白、糖脂或其组合。虽然这类配体可为激动剂或拮抗剂受体，但是配体也涵盖并非激动剂或拮抗剂，并且不具有激动或拮抗性质的结合剂。配体对于它的同源靶标的特异性结合经常根据“亲和力”来表示。在优选实施方案中，本发明的配体以约104M-1与约108M-1之间的亲和力结合。亲和力计算为Kd＝k解离/k缔合(k解离是解离速率常数，K缔合是缔合速率常数并且Kd是平衡常数)。
[0046] 亲和力可通过测量各种浓度(c)下的标记配体的结合分率(r)来在平衡状态下确定。数据使用斯卡查德方程来绘制：r/c＝K(n-r)：其中r＝平衡状态下的结合配体的摩尔数/受体的摩尔数；c＝平衡状态下的游离配体浓度；K＝平衡缔合常数；并且n＝每个受体分子的配体结合位点的数目。通过图解分析，r/c相比于X轴上的r来在Y轴上作图，由此产生斯卡查德(Scatchard)绘图。通过斯卡查德分析的亲和力测量在本领域中是熟知的。参见例如van Erp等人,J.Immunoassay 12:425-43,1991；Nelson和Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988。在替代方案中，亲和力可通过等温滴定量热(ITC)来测量。在典型ITC实验中，将配体溶液滴定至它的同源靶标的溶液中。在其相互作用后的释放的热量(ΔH)随着时间的推移加以监测。因为连续量的配体滴定至ITC细胞中，吸收或释放的热量与结合量成正比。随着系统到达饱和，热量信号减弱直到只观察到稀释热为止。然后，结合曲线从每次注射的热量相对于细胞中的配体与结合搭配物与比率的绘图来获得。结合曲线用适当结合模型分析以确定KB、n和ΔH。注意KB＝1/Kd。
[0047] 如本文使用的术语“受试者”是指人或非人生物体。因此，本文所述的方法和组合物可适用于人和兽医疾病。在某些实施方案中，受试者是“患者”，即接受疾病或病状的医疗护理的活人。这包括针对病理体征进行研究的未患有所定义疾病的人。优选是目前诊断患有由本发明的组合物和方法靶向的特定癌症的受试者。用本文所述的组合物治疗的优选癌症包括但不限于前列腺癌、肾癌、黑素瘤、胰癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、头和颈癌、肺癌和乳腺癌。
[0048] “治疗有效量”定义为足以展示患者益处，即，导致所治疗的病状的症状减少、预防或改善的试剂或药物组合物的量。当试剂或药物组合物包括诊断剂时，“诊断有效量”定义为足以产生信号、图像或其它诊断参数的量。药物制剂的有效量根据因素如个体的易患病程度，个体的年龄、性别和体重，和个体的特质响应而变化。“有效量”涵盖不限于可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学病状或病症的症状或病征或其致病过程的量。除非另外明确地或通过上下文来规定，否则“有效量”不限于足以改善病状的最小量。
[0049] “治疗(treatment)”或“治疗(treating)”(关于病状或疾病)是获得包括并且优选地临床结果的有利或所需结果的方法。出于本发明目的，关于疾病的有利或所需结果包括但不限于以下一个或多个：预防疾病、改善与疾病相关联的病状、治愈疾病、减轻疾病的严重性、延缓疾病进程、减轻与疾病相关联的一个或多个症状、增加患有疾病的人的生活质量和/或延长存活。同样地，出于本发明目的，关于病状的有利或所需结果包括但不限于以下一个或多个：预防病状、改善病状、治愈病状、减轻病状的严重性、延缓病状的进程、减轻与病状相关联的一个或多个症状、增加患有病状的人的生活质量和/或延长存活。例如，在其中本文所述的组合物用于治疗癌症的实施方案中，有利或所需结果包括但不限于以下一个或多个：减少赘生或癌细胞的增殖(或对其进行破坏)、减少在癌症中发现的赘生细胞的转移、缩小肿瘤的尺寸、减少由癌症产生的症状、增加患有癌症的人的生活质量、减少治疗疾病所需要的其它药物的剂量、延缓癌症的进程和/或延长患有癌症的患者的存活。取决于上下文，“治疗”受试者可暗示受试者需要治疗，例如，在受试者包括预期通过施用试剂来改善的病症的情况中。
[0050] 如本文使用的术语“抗体”是指由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段衍生、对其进行仿效或基本上由其编码的肽或多肽，所述肽或多肽能够特异性结合抗原或表位。参见例如Fundamental Immunology,第3版,W.E.Paul编,Raven Press,N.Y.(1993)；Wilson(1994；J.Immunol.Methods 175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。术语抗体包括保持结合抗原的能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如、片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为包含由在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341:544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也包括于术语“抗体”中供参考。
[0051] 免疫调节细胞系
[0052] “灭活肿瘤细胞”是指经过处理以防止细胞分裂的肿瘤细胞(对于患者为“自体”或“同种异体”)。出于本发明的目的，这类细胞保持其免疫原性和其代谢活性。作为癌症疗法的一部分，这类肿瘤细胞经过基因修饰以表达在患者体内表达的转基因。因此，本发明的组合物或疫苗包括赘生(例如，肿瘤)细胞，其对于经历治疗的患者为自体或同种异体的并且最优选地是与困扰患者的细胞相同的一般类型的肿瘤细胞。举例来说，通常向患有黑素瘤的患者施用从黑素瘤得到的基因修饰细胞。将用于本发明的肿瘤细胞灭活的方法，如使用照射在本领域中是熟知的。
[0053] 本发明的灭活肿瘤细胞与一种或多种共刺激分子或试剂一起施用至患者。优选共刺激剂包括刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子。评估这类共刺激剂的方法在文献中为熟知的。DC的诱导和成熟通常通过在刺激之后某些膜分子如CD80和CD86的增加的表达，和/或如IL-12和I型干扰素的促炎症性细胞因子的分泌来评估。
[0054] 在优选实施方案中，将灭活肿瘤细胞本身修饰以表达并分泌刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子。本发明关于GM-CSF的使用来示例性地描述。因此，举例来说，肿瘤细胞可表达编码GM-CSF的转基因如美国专利号5,637,483、5,904,920、6,277,368和6,350,445以及美国专利公布号20100150946中所描述，所述专利各自明确通过引用并入本文。用于治疗胰癌的GM-CSF表达性基因修饰癌细胞形式或“细胞因子表达性细胞疫苗”描述于美国专利号6,033,674和5,985,290中，所述专利均明确通过引用并入本文。
[0055] 代替或与GM-CSF一起，可由这类灭活肿瘤细胞和/或旁观者细胞表达的其它合适细胞因子包括但不限于CD40配体、IL-12、CCL3、CCL20和CCL21中的一个或多个。这个清单并非意味着要限制。
[0056] 虽然施用至受试者的灭活肿瘤细胞表达所感兴趣的一种或多种细胞因子是优选的，但是肿瘤细胞系可伴随有灭活旁观者细胞系，其表达并分泌刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子。旁观者细胞系可提供刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的所有细胞因子，或可补充由灭活肿瘤细胞表达并分泌的刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的细胞因子。举例来说，免疫调节细胞因子表达性旁观者细胞系公开于美国专利号6,464,973和8,012,469中Dessureault等人,Ann.Surg.Oncol.14:869-84,2007以及Eager和Nemunaitis,Mol.Ther.12:18-27,2005，所述专利各自明确通过引用并入本文。
[0057] “粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽”是指具有免疫调节活性并且与GenBank登录号AAA52122.1具有至少约85％氨基酸序列一致性的细胞因子或其片段。
[0058] 环状嘌呤二核苷酸
[0059] 如本文描述，这些共刺激剂中的另一个是环状嘌呤二核苷酸，其结合至STING并且诱导STING依赖性TBK1活化。可包括在内的其它共刺激分子在以下描述。
[0060] 原核以及真核细胞使用各种小分子用于细胞信号转导以及细胞内和细胞间通信。环状核苷酸如cGMP、cAMP等已知在原核和真核细胞具有调控和引发活性。不同于真核细胞，原核细胞也使用环状嘌呤二核苷酸作为调控分子。在原核生物中，两个GTP分子的缩合通过酶双鸟苷酸环化酶(DGC)来催化以给出c-diGMP，其代表细菌中的重要调控因子。
[0061] 最近研究暗示环状diGMP或其类似物也可刺激或增强患者中的免疫或炎症响应或可通过充当哺乳动物中的佐剂来增强对于疫苗的免疫响应。病原体衍生DNA的细胞质检测需要经由TANK结合激酶1(TBK1)和它的下游转录因子IFN-调控因子3(IRF3)来信号转导。称为STING的跨膜蛋白质(IFN基因的刺激因子；也称为MITA、ERIS、MPYS和TMEM173)充当这些环状嘌呤二核苷酸的信号转导受体，导致刺激TBK1-IRF3信号转导轴和STING依赖性I型干扰素响应。参见例如图1。Burdette等人,Nature 478:515-18,2011证明STING直接结合至环状双鸟苷酸单磷酸，但是不结合至其它不相关的核苷酸或核酸。
[0062] 用于本发明的合适环状嘌呤二核苷酸相当详细地描述于例如美国专利号7,709458和7,592,326；WO2007/054279；和Yan等人,Bioorg.Med.Chem Lett.18:5631(2008)中，其各自通过引用并入本文。优选环状嘌呤二核苷酸包括但不限于c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-IMP、c-AMP-GMP、c-AMP-IMP和c-GMP-IMP，和其类似物，包括但不限于硫代磷酸酯类似物。
[0063] 佐剂
[0064] 除如上所述的灭活肿瘤细胞和环状嘌呤二核苷酸之外，本发明的组合物可进一步包括一种或多种额外物质，由于其辅助性质，所述额外物质可起作用来刺激免疫系统以对存在于灭活肿瘤细胞上的癌症抗原起响应。这类佐剂包括但不限于脂质、脂质体、诱导先天性免疫的灭活细菌(例如，灭活或减弱的单核细胞增生利斯特菌)、经由Toll样受体(TLR)、(NOD)-样受体(NLR)、基于维甲酸可诱导的基因(RIG)-I-样受体(RLR)和/或C-型凝集素受体(CLR)来介导先天免疫活化的组合物。PAMP的实例包括脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母多糖、脂多糖、奈瑟氏菌孔蛋白、鞭毛蛋白、抑制蛋白、半乳糖神经酰胺(galactoceramide)、胞壁酰二肽。肽聚糖、脂蛋白和脂磷壁酸是革兰氏阳性的细胞壁组分。脂多糖由大多数细菌表达，其中MPL是一个实例。鞭毛蛋白是指由致病和共生细菌分泌的细菌鞭毛的结构部件。α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)是自然杀伤细胞T(NKT)细胞的活化剂。胞壁酰二肽是所有细菌共有的生物活性肽聚糖基元。这个清单并非意味着要限制。优选佐剂组合物在以下描述。
[0065] CTLA-4和PD-1途径拮抗剂
[0066] CTLA-4被认为是适应性免疫响应的重要负性调控因子。活化的T细胞上调CTLA-4，其以比CD28高的亲和力结合抗原呈递细胞上的CD80和CD86，由此抑制T-细胞刺激、IL-2基因表达和T-细胞增殖。CTLA4阻滞的抗肿瘤效应已经在结肠癌、转移性前列腺癌和转移性黑素瘤的鼠科模型中观察到。
[0067] 伊匹珠单抗(YervoyTM)和曲利木单抗是结合至人CTLA4并且防止它与CD80和CD86的相互作用的人源化单克隆抗体。使用伊匹珠单抗和曲利木单抗的I期和II期研究证明在癌症患者中的临床活性。可通过类似策略来靶向的其它负性免疫调控因子包括程序性细胞死亡1、B和T淋巴细胞弱化子、转化生长因子β、白介素-10和血管内皮生长因子。
[0068] PD-1是在活化T-细胞上表达的适应性免疫响应的另一种负性调控因子。PD-1结合至B7-H1和B7-DC，并且PD-1的接合抑制T-细胞活化。已经证明PD-1途径阻滞的抗肿瘤效应。BMS-936558、MK3475、CT-011、AMP-224和MDX-1106在文献中报告是可适用于本发明的PD-1途径阻滞剂的实例。
[0069] TLR激动剂
[0070] 如本文使用，术语“Toll样受体”(或“TLR”)是指感测微生物产物且/或启始适应性免疫响应的Toll样受体家族蛋白质或其片段的成员。在一个实施方案中，TLR活化树突状细胞(DC)。Toll样受体(TLR)是最初被识别为辨识微生物病原体的先天免疫系统的传感器的模式识别受体家族。TLR包括保守性跨膜分子家族，其含有富含亮氨酸重复序列的胞外域、跨膜域和细胞内TIR(Toll/IL-1R)域。TLR辨识微生物中的独特结构，经常被称为“PAMP”(病原体相关联分子模式)。配体结合至TLR引起细胞内信号转导途径的级联，诱导涉及炎症和免疫的因子的产生。
[0071] 在人体内，已经识别十种TLR。在细胞表面上表达的TLR包括TLR-1、-2、-4、-5和-6，而TLR-3、-7/8和-9表达于ER区室。人树突状细胞子集可基于独特TLR表达模式来识别。举例来说，骨髓或“常规”子集的DC(mDC)在被刺激时表达TLR 1–8，并且产生活化标志物(例如CD80、CD86、MHC I类和II类、CCR7)、促炎症性细胞因子和趋化因子的级联。此刺激和所产生的表达的结果是抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞初免(priming)。这些DC获得吸收抗原并且将其以适当形式呈递至T细胞的增强能力。相比之下，类浆细胞子集的DC(pDC)在活化后只表达TLR7和TLR9，并且导致NK细胞以及T-细胞的活化。因为死亡肿瘤细胞可不利地影响DC功能，所以提出用TLR激动剂来活化DC可有利于以治疗癌症的免疫疗法途径来初免抗肿瘤免疫力。也提出使用辐射和化疗来成功治疗乳腺癌需要TLR4活化。
[0072] 在本领域中已知并且适用于本发明的TLR激动剂包括但不限于以下：
[0073] Pam3Cys，TLR-1/2激动剂；
[0074] CFA，TLR-2激动剂；
[0075] MALP2，TLR-2激动剂；
[0076] Pam2Cys，TLR-2激动剂；
[0077] FSL-1，TLR-2激动剂；
[0078] Hib-OMPC，TLR-2激动剂；
[0079] 聚核糖肌苷酸:聚核糖酸胞苷酸(Poly I:C)，TLR-3激动剂；
[0080] 聚腺苷-聚尿苷酸(poly AU)，TLR-3激动剂；
[0082] 单磷酰脂质A(MPL)，TLR-4激动剂；
[0083] LPS，TLR-4激动剂；
[0084] 细菌鞭毛蛋白，TLR-5激动剂；
[0086] 咪喹莫特，TLR-7激动剂；
[0087] 雷西莫特，TLR-7/8激动剂；
[0088] 洛索立宾，TLR-7/8激动剂；和
[0089] 非甲基化CpG二核苷酸(CpG-ODN)，TLR-9激动剂。
[0090] 因为其辅助性质，TLR激动剂优选地与其它疫苗、佐剂和/或免疫调节剂组合使用，并且可以各种组合来组合。因此，在某些实施方案中，如本文描述的结合至STING并诱导STING依赖性TBK1活化的环状嘌呤二核苷酸和表达并分泌刺激树突状细胞诱导、募集和/或成熟的一种或多种细胞因子的灭活肿瘤细胞可与用于治疗用途的一种或多种TLR激动剂一起施用。
[0091] 脂质和脂质体
[0092] 脂质体是由一个(“单层”)或多个(“多层”)磷脂层形成的囊泡。因为磷脂结构单元的两亲性，所以脂质体通常包括亲水层，及呈现亲水外表面并且封闭亲水核心。脂质体在并入亲水性/疏水性组分中的多功能性、其无毒性质、生物降解性、生物相容性、佐剂性、诱导细胞免疫、持续释放性质和迅速由巨噬细胞吸收使得其成为递送抗原的有吸引力的候选物。
[0093] 以引用方式整体并入本文的WO2010/104833描述脂质体制剂，其包括：
[0094] a)水性媒介物；
[0095] b)脂质体，其包括
[0096] (i)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)，
[0097] (ii)二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)，二肉豆蔻三甲基铵丙烷(“DMTAP”)，或DMPG和DMTAP，
[0098] 和
[0099] (iii)至少一种固醇衍生物；和
[0100] c)一种或多种免疫原性多肽或碳水化合物，其共价连接至1％与100％之间的所述至少一种固醇衍生物。
[0101] 以上提及的具有或不具有“免疫原性多肽或碳水化合物”的这类脂质体制剂，在本文中称为 (Molecular Express,Inc.)，可含有一种或多种额外组分如肽聚糖、脂肽、脂多糖、单磷酰脂质A、脂磷壁酸、雷西莫特、咪喹莫特、鞭毛蛋白、含有非甲基化CpG基元的寡核苷酸、β-半乳糖基神经酰胺、胞壁酰二肽、全反式维甲酸、双链病毒RNA、热休克蛋白质、二十八烷基二甲基溴化铵、阳离子表面活性剂、toll样受体激动剂、二肉豆蔻三甲基铵丙烷和nod样受体激动剂。有利地，这些脂质体制剂可用于递送根据本发明的一种或多种环状嘌呤二核苷酸。
[0102] 此外，虽然以上论述的脂质体制剂使用“类固醇衍生物”作为将免疫原性多肽或碳水化合物连接至脂质体的锚定物，但是类固醇可仅以未偶联类固醇如胆固醇形式来提供。
[0103] 从脂质混合物来制备脂质体的合适方法在本领域中是熟知的。参见例如Basu&Basu,Liposome Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press,2002；Gregoriadis,Liposome Technology,第3版,Informa HealthCare,2006。优选方法包括其中描述的挤出、均质化和超声处理方法。制备用于本发明的脂质体的示例性方法，包括干燥脂质混合物，随后在水性媒介物中水化并且超声处理以形成脂质体，描述于WO2010/104833中。
[0104] 在某些实施方案中，提供在特定平均大小范围内的脂质体。可选择脂质体大小，方法是例如通过将包含脂质体的水性媒介物经由具有预选孔径的膜挤出并且收集流经膜的材料。在优选实施方案中，脂质体选择为基本上在50与500nm之间的直径，更优选地基本上在50与200nm之间的直径，并且最优选地基本上在50与150nm之间的直径。在这种情况下，如本文使用术语“基本上”意指至少75％、更优选地80％并且最优选地至少90％的脂质体在指定范围内。
[0105] 可适用本发明的其它脂质和脂质样佐剂包括水包油(o/w)乳液(参见，例如，Muderhwa等人,J.Pharmaceut.Sci.88:1332–9,1999))、 TLR(Molecular Express,Inc.)、毛地黄皂苷(参见，例如，美国专利5,698,432)和吡喃葡萄糖基脂质(参见，例如，美国专利申请20100310602)。
[0106] 化学治疗剂
[0107] 在额外实施方案中，所述方法进一步涉及向受试者施用有效量的一种或多种化学疗法作为患者肿瘤的额外治疗。在某些实施方案中，一种或多种化疗治疗剂选自醋酸阿比特龙、六甲蜜胺、脱水长春碱、奥里斯他汀(auristatin)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺、BMS184476、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟基-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、博来霉素、N,N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-1-L脯氨酸-叔-丁酰胺、恶病质素、西马多丁、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、3',4'-双脱氢-4'-脱氧-8'-降长春花碱、多烯紫衫醇、多西他赛、环磷酰胺、卡铂、卡莫司汀、顺铂、念珠藻素、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、柔红霉素、地西他滨多拉司他汀、多柔比星(阿霉素)、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、非那雄胺、氟他胺、羟基脲和羟基脲紫杉烷、异环磷酰胺、利罗唑、氯尼达明、洛莫司汀(CCNU)、MDV3100、二氯甲基二乙胺(氮芥)、美法仑、米伏布林羟乙基磺酸盐、根霉素、sertenef、链佐星、丝裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉烷类、尼鲁米特、奥那司酮、紫杉醇、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、RPR109881、磷酸雌莫司汀、他莫西芬、他索纳明、紫杉醇、维A酸、长春碱、长春新碱、硫酸长春地辛和长春氟宁。
[0108] 药物组合物
[0109] 如本文使用的术语“药物”是指预定用于治愈、治疗或预防疾病并且经受美国食品和药物管理局(或其非美国的相应部门)成为处方或非处方药物产品的批准过程的化学物质。配制并施用这类组合物的技术的详细资料可见于Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版(Mack Publishing Co.,Easton,PA)以及Nielloud和Marti-Mestres,Pharmaceutical Emulsions and Suspensions:第2版(Marcel Dekker,Inc,New York)。
[0110] 出于本公开目的，药物组合物可通过包括口服、肠胃外、吸入喷雾、局部或经直肠的各种手段以含有药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的制剂形式来施用。如本文使用的术语肠胃外包括但不限于使用各种输注技术来皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、鞘内和硬膜外注射。如本文使用的动脉内和静脉内注射包括经由导管来施用。也涵盖经由冠状动脉内支架和冠状动脉内储集器来施用。如本文使用的术语口服包括但不限于口服摄取，或通过舌下或口腔途径来递送。口腔施用包括流体饮料、能量棒以及小丸制剂。
[0111] 药物组合物可呈适合于预定施用方法的任何形式。例如，当欲用于口服时，可制备诸如片剂、含片(troches)、锭剂(lozenges)、水性悬浮液或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳状液、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。可根据本领域已知的用于制造药用组合物的任意方法制备欲用于口服用途的组合物，而且这样的组合物可包含一种或多种试剂(包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂)以提供口感合适的制备物。含有与适合于制造片剂的无毒药学上可接受的赋形剂掺合的药物化合物的片剂是可接受的。这些赋形剂可为例如惰性稀释剂，如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或褐藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未经包衣或通过已知工艺进行包衣的，所述工艺包括肠溶包衣、结肠包衣或微囊封以延缓胃肠道内的崩解和吸收且/或提供较长时间内持续作用。例如，可以单独使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯这样的延时材料或将其同蜡一起使用。
[0112] 用于口服使用的制剂也可作为硬明胶胶囊存在，其中所述药物化合物与惰性固体稀释剂(例如磷酸钙或高岭土)混合，或作为软明胶胶囊存在，其中所述活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
[0113] 药物组合物可配制成与适合于制造水性悬浮液的赋形剂掺合的水性悬浮液。此种赋形剂包括：混悬剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶及阿拉伯树胶；以及分散剂或湿润剂，如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪族醇(例如十七烷乙烯氧十六醇)的缩合产物、环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的缩合产物(例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)。水性混悬液还可含有一种或多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
[0114] 可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油如液体石蜡中来配制油性混悬液。油性混悬液可以包含增稠剂如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂如上文所提到的那些甜味剂，及调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
[0115] 适合用于通过添加水来制备水性混悬液的可分散的粉剂和颗粒剂提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。通过以上已经提到的那些来举例说明适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂。还可以存在额外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
[0116] 本发明的药物组合物也可为水包油型乳液形式。所述油相可为植物油，诸如橄榄油或花生油，可以是矿物油，诸如液体石蜡，或这些油类的混合物。适合的乳化剂包括天然存在的树胶，诸如阿拉伯树胶和黄蓍胶；天然存在的磷脂，诸如大豆卵磷脂，由脂肪酸衍生的酯类或偏酯类；己糖醇酐，诸如单油酸山梨醇酐酯；以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合物，诸如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。所述乳状液还可包含甜味剂和调味剂。
[0117] 可以使用诸如甘油、山梨醇或蔗糖这样的甜味剂来配制糖浆和酏剂。这些制剂还可包含缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
[0118] 本公开的药物组合物可以是呈无菌可注射制剂的形式，例如，作为无菌可注射水性或油性混悬液。可根据已知技术，使用上述那些适合的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来配制所述悬浮液。所述无菌可注射制备物还可以是处于无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂之中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如处于1,3-丙二醇中的溶液或制备为冻干粉末。可用媒介物和溶剂中可以使用的是水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油可通常被用作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以使用包括合成的单甘油酯或二甘油酯的任何温和的不挥发性油。另外，脂肪酸(例如油酸)可类似地用于注射物的制备。
[0119] 可以与载体材料组合以生成单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定施用模式而改变。例如，意图对人口服施用的延时释放制剂可含有大约20至500mg的与合适且适宜量的载体材料相混合的活性材料，所述载体材料可能在总组合物的约5％至约95％之间变化。优选地，制备提供便于施用的容易测量的量的药物组合物。典型地，全身施用的有效量是约0.1mg/kg至约100mg/kg并且取决于许多因素，包括例如受试者(例如，哺乳动物如人)的年龄和体重、需要治疗的确切病状和其严重性、施用途径并且最终由主治医师或兽医酌处。然而，应了解，任何特定患者的具体剂量水平取决于各种因素，包括所使用的具体化合物的活性，所治疗的个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间和途径；排泄速率；以前施用的其它药物；和经历治疗的特定病状的严重性，如已得到本领域技术人员充分认识。
[0120] 适于经口施用的本文公开的化合物的制剂可提供为如各自含有预定量的活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂的离散单位；粉末或颗粒；在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。药物组合物还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。
[0121] 片剂可通过压制或模制来制备，任选地含有一种或多种辅助成分。压制的片剂可通过在适合的机器中对自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分进行压制来制备，所述活性成分任选与粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙乙基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)表面活性剂或分散剂混合。模塑的片剂可以通过在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。片剂可任选地包衣或刻痕并且可配制以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放，使用例如不同比例的羟基丙基甲基纤维素来提供所需释放特征。片剂可任选被提供有肠溶或结肠包衣以在肠的部分而不是胃内提供释放。这对于式1化合物是尤其有利的，当这类化合物对酸水解敏感时。
[0122] 适于在口中局部施用的制剂包括锭剂，其在调味的基剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分；软锭剂(pastille)，其在惰性基剂如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分；以及漱口剂，其在适合的液体载剂中包含活性成分。
[0123] 直肠施用的制剂可以具有包括例如可可脂或水杨酸盐的合适基剂的栓剂形式呈现。
[0125] 用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；及水性和非水性无菌混悬液，其可包括助悬剂和增稠剂。制剂可被包装于单剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以储存于冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液体载体(例如水)以供注射。注射溶液及混悬液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0126] 如本文使用，药学上可接受的盐包括但不限于：醋酸盐、吡啶、铵、哌嗪、二乙胺、烟酰胺、甲酸盐、尿素、钠、钾、钙、镁、锌、锂、肉桂酸盐、甲氨基、甲磺酸盐、苦味酸盐、酒石酸盐、三乙氨基、二甲氨基和三(羟甲基)氨基甲烷。额外药学上可接受的盐是本领域技术人员已知的。
[0127] 特定患者的有效量可取决于因素如所治疗的病状、患者的总体健康状况、施用途径和剂量以及副作用的严重性来变化。可获得治疗和诊断方法的指导(参见，例如，Maynard等人(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK)。
[0128] 有效量可以一个剂量给出，但是不限于一个剂量。因此，施用可为两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次施用药物组合物。当在本发明方法中存在药物组合物的一次以上施用时，施用可隔开一分钟、两分钟、三分钟、四分钟、五分钟、六分钟、七分钟、八分钟、九分钟、十分钟或更多分钟的时间间隔，约一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、十小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时等的间隔。在小时情况下，术语“约”意指加上或减去30分钟内的任何时间间隔。施用也可隔开一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天和其组合的时间间隔。本发明不限于在时间上相等地隔开的给药间隔，而是涵盖不相等间隔的给药间隔。
[0129] 例如一次/周、两次/周、三次/周、四次/周、五次/周、六次/周、七次/周、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次等的给药排程可用于本发明。给药排程涵盖例如一周、两周、三周、四周、五周、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月和十二个月的给药总时间。
[0130] 提供上述给药排程的循环。循环可约例如每七天；每14天；每21天；每28天；每35天；42天；每49天；每56天；每63天；每70天等来重复。非给药的间隔可在循环之间出现，其中间隔可为约例如七天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天等。在这种情况下，术语“约”意指加上或减去一天、加上或减去两天、加上或减去三天、加上或减去四天、加上或减去五天、加上或减去六天或加上或减去七天。
[0131] 与额外治疗剂共同施用的方法在本领域中是熟知的(Hardman等人(编)(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill,New York,NY；Poole and Peterson(编)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA；Chabner and Longo(编)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,PA)。
[0132] 如提及，本发明的组合物优选地配制成肠胃外或肠内递送的药物组合物。施用至动物的典型药物组合物包括药学上可接受的媒介物如水溶液、无毒赋形剂包括盐、防腐剂、缓冲剂等。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第15版,Easton编，Mack Publishing Co.,第1405-1412和1461-1487页(1975)；The National Formulary XIV,第14版，American Pharmaceutical Association,Washington,DC(1975)。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外媒介物如氯化钠、林格氏葡萄糖等。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。药物组合物的各种组分的pH和精确浓度根据在本领域中的常规技能来调节。
[0133] 特定疫苗(同源增强)的反复施用已经证明可有效增强体液响应。这类方法在增强细胞性免疫方面不太有效，因为以前对于载体的免疫力倾向于削弱稳定抗原呈递和适当炎症信号的产生。避免此问题的一种方法是连续施用使用不同抗原递送系统的疫苗(异源增强)。在异源增强方案中，至少一个初免或增强递送包括递送本文所述的灭活肿瘤细胞/环状嘌呤二核苷酸组合物。方案的异源支组可包括使用以下策略中的一种或多种来递送抗原：
[0134] 包含所感兴趣的抗原的灭活细菌或病毒，其为使用一些变性条件来处理以使得其在发动病原侵入方面无效或低效率的颗粒；
[0135] 纯化抗原，其通常为从病原体的细胞培养物纯化的天然产生抗原或含有病原体的组织样品，或其重组型式；
[0136] 活病毒或细菌递送载体，其重组工程化以在受试者的宿主细胞中表达且/或分泌抗原。这些策略依赖于减弱(例如，经由遗传工程)病毒或细菌载体成为非病原性和无毒的；
[0137] 抗原呈递细胞(APC)载体，如树突状细胞(DC)载体，其包括负载有抗原，或转染有包括编码抗原(例如，用于治疗去势难治性转移性前列腺癌的 (Dendreon Corporation)的核酸的组合物的细胞；
[0138] 脂质体抗原递送媒介物；和
[0139] 裸DNA载体和裸RNA载体，其可通过基因枪、电穿孔、细菌膜影、微球、微粒、脂质体、聚阳离子纳米颗粒等来施用。
[0140] 初免疫苗和增强疫苗可通过以下途径中的任何一个或组合来施用。在一方面，初免疫苗和增强疫苗通过相同途径来施用。在另一方面，初免疫苗和增强疫苗通过不同途径来施用。术语“不同途径”涵盖但是不限于身体上的不同位点，例如，口服、非口服、肠内、肠胃外、直肠、节点内(淋巴结)、静脉内、动脉、皮下、肌肉内、瘤内、瘤周、瘤内、输注、粘膜、鼻腔、脑脊髓空间或脑脊液等的位点，以及通过不同模式，例如，口服、静脉内和肌肉内。
[0141] 有效量的初免或增强疫苗可以一个剂量给出，但是不限于一个剂量。因此，施用可为两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次施用疫苗。当存在疫苗的一次以上施用时，施用可隔开一分钟、两分钟、三分钟、四分钟、五分钟、六分钟、七分钟、八分钟、九分钟、十分钟或更多分钟的时间间隔，约一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、十小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时等的间隔。在小时情况下，术语“约”意指加上或减去30分钟内的任何时间间隔。施用也可隔开一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天和其组合的时间间隔。本发明不限于在时间上相等地隔开的给药间隔，而是涵盖不相等间隔的给药，例如由1天、4天、7天和25天施用组成的初免排程，仅提供非限制性实例。
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实施例
实施例
[0191] 以下实施例用来示出本发明。这些实施例决非用来限制本发明范围。
[0192] 实施例1
[0193] 刺激针对广泛谱系TAA的免疫力的一种途径是“GVAX”，其为基于经过工程化以分泌GM-CSF的同种异体人肿瘤细胞系的疫苗，所述GM-CSF是刺激DC募集、分化和成熟的主要细胞因子。GVAX疫苗形成多种癌症适应症中的多个临床试验的基础，并且已被证明是安全、较好耐受、免疫原性的并且展示提供一些临床益处。在患有mCRPC的男性中比较前列腺GVAX免疫疗法(G)与多西紫杉醇加上泼尼松(D+P)的3期临床研究由发起人提前终止，此时早期非预定无效分析显示试验具有满足它的改善总体存活的预定义主要端点的＜30％机会。然而，在研究中的＞600个患者的连续随访和分析显示在～21个月时，G支组的Kaplan-Meier存活曲线超过D+P支组。此外，基于Halabi列线图，如与化学疗法相比，从基线起预测存活时间≥18个月的患者在用GVAX处理时具有2.5个月存活益处，其中长期存活者的“尾区”为30％。这些结果示出GVAX前列腺免疫疗法提供优于化学疗法的存活益处，其相应地展示如与安慰剂相比，～2个月存活益处。
[0194] 由于个别地使用的经由MyD88-和TRIF-依赖性途径来信号传导的TLR靶向佐剂通常是CD8T细胞免疫力的较差诱导剂，所以我们评估经由胞质STING受体来信号传导的CDN是否可促进MHC I类-和II类-限制免疫力的初免。CDN诱导对于疫苗重组蛋白Ag、HIV Gag或OVA具有特异性的Th1CD4和CD8T细胞的初免。Balb/c小鼠用与2％水包油佐剂(Addavax,Invivogen)一起配制的5μg HIV Gag蛋白质和图2中指示的剂量水平的CDN以3周间隔在尾部基底(皮下)处皮下免疫接种两次。
[0195] 如2A图中展示，CDN-辅助HIV Gag疫苗诱导多功能Ag-特异性Th1CD4T细胞响应。在增强后第5天，在用I-Ad限制HIV Gag表位来刺激之后，通过IFN-γ、IL-2和TNF-α阳性脾细胞的细胞内细胞因子染色来测量次级CD4T细胞响应。条形图代表个别小鼠。如4B图中展示，CDN-依赖性疫苗诱导T细胞响应的程度通过CDN与 脂质体的制剂来增强。
[0196] 在5只C57BL/6小鼠的群组用图2展示的疫苗组合物皮下免疫接种之后，PBMC中的初级(1)和次级(2)OVA-特异性CD4和CD8T细胞响应通过IFN-γELISPOT来测量，并且结果描绘于图2C中。5只C57BL/6小鼠的群组以3周间隔用图中指示的疫苗，或用静脉内给予的5x106CFU的Lm-OVA来皮下免疫接种两次。增强后4周，小鼠用5x105PFU的VV-OVA激发，并且5天后，将卵巢收获、加工并且VV-OVA通过噬菌斑测定来定量。
[0197] 如图中展示，疫苗效力取决于制剂，并且我们的初始结果指示具有 脂质体的制剂是最佳的，可能归因于有效疫苗递送至细胞溶质中。值得注意的是，用CDN-辅助OVA免疫接种的小鼠通过用牛痘病毒激发而完全得到保护。通过与给予HBSS的阴性对照组比较，此保护水平为>4对数。由CDN-辅助疫苗给出的保护水平比MPL-辅助OVA(使用50μg的人MPL剂量)，或李斯特菌-OVA疫苗更好。
[0198] 图7描绘在CDN处理后的人树突状细胞的诱导，如通过共刺激分子如CD80和CD86的表达所评估。在此实验中，CD14+单核细胞从PBMC中分离并且在GM-CSF和IL-4存在下培养。第6天，105个DC用100ng/ML LPS、20μM CDN(c-二-AMP)、369μg脂质体 或脂质体加上CDN处理，如图中指示。所指示的共刺激分子在48小时后通过流式细胞术检测到。如提及，脂质体大大改进CDN诱导树突状细胞成熟的能力。
[0199] 实施例2.
[0200] B16黑素瘤肿瘤模型是侵略性的并且具有较差免疫原性，并且用经过照射的GM-CSF分泌性B16黑素瘤肿瘤细胞(B16-GM)进行治疗性疫苗接种并不有效，除非与免疫检查点如CTLA-4或PD-1的阻断组合。在此实例中，我们证明在B16肿瘤细胞植入后7天施用时，单一注射的STINGVAX(与毛地黄皂苷一起配制并且与经过照射的B16-GM一起孵育的CDN)显著抑制已确立的可触知B16肿瘤的生长，此时肿瘤是可触知的并且已确立的。
[0201] 5x104个B16黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠的足垫中并且当肿瘤在第7天可触知时，将小鼠在对侧大腿中用图3指示的疫苗皮下注射一次。以下量的疫苗组分用于每次注射：经过照射的B16GM-CSF(GVAX)，1.5x106个细胞；仅CDN，20ng；毛地黄皂苷，10μg/mL。如下制备STINGVAX：将经过照射的B16GM-CSF与CDN和毛地黄皂苷一起在20℃下孵育30分钟，用PBS洗涤3x，并且所得组合物在再悬浮于200μL PBS中之后注射。关于配制信息，还参见Woodward等人2010年5月27日在Science ExpressDOI:10.1126/science.1189801上的在线支持材料。每日测量肿瘤生长。相比于无药方组，生长被STINGVAX显著抑制(P<0.01)。如3A图中展示，肿瘤抑制取决于B16-GM与CDN的组合，因为如与未经处理的对照小鼠相比，用单独组分处理对于肿瘤生长没有影响。另外，与B16-GM处理小鼠相比，对于p15E，一种在B16肿瘤上表达的内源性逆转录病毒特异性Ag，具有特异性的CD8T细胞响应在经STINGVAX处理的荷瘤小鼠中得到增强(数据未展示)。
[0202] 根据这些数据，认为STING-靶向CDN并且经过照射的GM-分泌肿瘤细胞疫苗之间的协同作用要求IFN-β的CDN依赖性诱导应导致GM-CSF分化的DC的活化，由此提供强的“信号3”，其导致更有效的抗肿瘤T细胞响应。出于这个原因，我们确定是否CDN可在TRAMP-GM细胞中直接诱导IFN-β的产生。如3B图中展示，在与毛地黄皂苷一起配制时，CDN有效地诱导IFN-β在TRAMP-GM和主要巨噬细胞中的表达，但是不诱导在来自缺乏功能性STING蛋白质的goldenticket(gt)小鼠的巨噬细胞中的表达。
[0203] 图4展示由STING-靶向的CDN/GVAX组合展示的治疗益处的剂量依赖性。在此实验4
中，5x10 个B16黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠的足垫中。一旦在第6天肿瘤可触知，GVAX(B16 GM-CSF(GVAX)、1.5x106个细胞)或2、20或200ng CDN/动物的CDN/GVAX组合皮下注射至对侧大腿中。在组合治疗的情况下，CDN在20℃下与10μg/mL的毛地黄皂苷一起配制30分钟并且随后用PBS洗涤4x以移除未并入的CDN，然后如上所述注射。每日以总计20只动物/治疗组测量肿瘤体积。如图中展示，抗肿瘤响应随着CDN浓度从2ng/动物增加至20ng/动物而增加，但是通过将剂量增加至200ng/mL未观察到进一步增加。
中，5x10 个B16黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠的足垫中。一旦在第6天肿瘤可触知，GVAX(B16 GM-CSF(GVAX)、1.5x106个细胞)或2、20或200ng CDN/动物的CDN/GVAX组合皮下注射至对侧大腿中。在组合治疗的情况下，CDN在20℃下与10μg/mL的毛地黄皂苷一起配制30分钟并且随后用PBS洗涤4x以移除未并入的CDN，然后如上所述注射。每日以总计20只动物/治疗组测量肿瘤体积。如图中展示，抗肿瘤响应随着CDN浓度从2ng/动物增加至20ng/动物而增加，但是通过将剂量增加至200ng/mL未观察到进一步增加。
[0204] 图5提供CDN/GVAX组合的协同抗肿瘤响应的进一步证据。在此图中，B16黑素瘤细胞从动物中收获并且将细胞固定至载玻片上以进行免疫组织化学分析。对于荧光素标记的抗-CD8抗体观测CR8+T-细胞浸润至肿瘤中。DAPI用于将肿瘤细胞的细胞核复染色。此图中展示的四个图是未经处理的B16黑素瘤细胞(A)，以及用CDN(B)、GVAX(C)和CDN/GVAX(D)处理的细胞。如展示，与单独CDN或GVAX相比，对于CDN/GVAX观察到CD*+T-细胞肿瘤浸润的大致上改善。
[0205] 类似地，图6展示与单独CDN或GVAX相比，通过CDN/GVAX实现成熟干扰素γ-产生脾脏DC(CD11c+细胞)的改进的诱导。在此实验中，如上所述处理小鼠，并且将来自2只小鼠/组的脾脏收获。将总脾细胞收获并且用抗-CD11c和抗-IFNa偶联物染色。处理(未经处理的B16、CDN、CDN+毛地黄皂苷、GVAX和CDN/GVAX+毛地黄皂苷)在图中指示。
[0206] 实施例3.
[0207] 图9描绘“STINGVAX”的协同作用机制，其为与表达同种异体肿瘤细胞的经过照射的GM-CSF一起共配制的STING-活化环状嘌呤二核苷酸(GVAX；STING+GVAX＝STINGVAX)。GVAX肿瘤细胞疫苗将多个肿瘤相关联抗原无偏性呈递至免疫系统。由GVAX产生的GM-CSF将树突状细胞(DC)募集至注射位点。CDN活化所募集的DC，进而活化或初免有效抗原特异性CD4和CD8T细胞，这些T细胞展开行动并且杀灭肿瘤，产生临床益处。STINGVAX可增强肿瘤响应，方法是充当GM-CSF募集的DC的储库，或经由自分泌信号转导来表达TBK-1/IRF-3依赖性IFN-β和NF-κB促炎症性细胞因子，其在组合下活化GM-CSF募集的DC。
[0208] 增加STINGVAX的抗肿瘤功效的机制被认为归因于先天性免疫的活化，所述先天性免疫通过CDN直接结合至STING来介导，触发此受体中的构象变化，导致经由TBK-1/IRF-3轴和1型干扰素(IFN)(包括IFN-α和IFN-β)的活化来进行信号转导。由GVAX肿瘤细胞疫苗产生的GM-CSF将树突状细胞(DC)募集至注射位点。CDN活化募集的DC，进而活化或初免有效的抗原特异性CD4和CD8T细胞，所述T细胞展开行动并且杀灭肿瘤，产生临床益处。
[0209] 为了确定作为活化先天性免疫的CDN效力的标志的IFN-α水平，将从十五个独立人供体中分离的1x106个原代人PBMC利用Effectene转染试剂(Qiagen)、在37℃、5％CO2下在具有50μM c-二-GMP(CDG)、1μg/mL干扰素刺激DNA(ISD)或4μg/mL Poly(I:C)的96孔U底板中孵育30分钟以将分子转移至PBMC中。ISD(干扰素刺激DNA)是与TLR无关的(Stetston,D.B.等人Immunity 24,93–103,2006年1月)并且经由cGAS来信号传导，因此是STING依赖性的，而Poly(I:C)可经由TLR3和RIG-I途径来信号传导，因此是与STING无关的。30分钟之后，将细胞洗涤并且置换为含有10％FBS的RPMI培养基并且在37℃，5％CO2下孵育。24小时孵育之后，IFN-α水平通过流式细胞仪珠粒阵列(CBA,BD Biosciences)来确定(图8)。这些结果证明环状-二-GMP在从多个独立供体制备的人白细胞中活化先天性免疫，因而支持STINGVAX的作用机制。
[0210] 本领域技术人员易于了解，本发明充分适于执行目标并且获得所提到的以及其中固有的结果和优点。本文中提供的实施例代表优选实施方案，为示例性的，并且并非旨在作为本发明的范围的限制。
[0211] 将理解，本发明在其应用中不限于构造的细节和以下描述中所阐述或在附图中示出的组件的布置。本发明能够进行除描述的那些之外的实施方案，并且能够以多种方式实践和实行。另外，将理解，本文中使用的用语和术语，以及抽象概念是出于描述目的，并且不应被视为限制。
[0212] 这样，本领域技术人员将了解，可容易地将本公开所基于的概念用作用于实行本发明的若干目的的其它结构、方法和系统的设计基础。因此，重要的是，在这类等同构造不脱离本发明的精神和范围的限度内，权利要求书被认为是包括所述等同构造的。
[0213] 虽然本发明以使得本领域技术人员能够制得并使用它的足够细节来描述并例示，但是各种替代方案、变化和改进应是显而易知的，而不背离本发明的精神和范围。本文中提供的实施例代表优选实施方案，为示例性的，并且并非旨在作为本发明的范围的限制。本领域技术人员可想到这些方法和组合物的改变和其它用途。这些都涵盖在由权利要求的范围所界定的本发明的精神范围内。
[0216] 本文中适当地说明性地描述的发明可在缺少在本文中并未具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制的情况下实践。因此，例如，在本文中的每一个例子中，术语“包括”、“主要由……组成”和“由……组成”中的任何术语可由其它两个术语中的任何一个代替。已使用的术语和措辞是用作描述而非限制的术语，并且在使用这类术语和措辞时并非旨在排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到，各种修改在本发明要求的范围内是可能的。因此，应理解，尽管本发明已由优选实施方案和任选特征具体公开，但是本领域技术人员可采用本文中公开的概念的修改和变化，并且应理解，所述修改和变化被视为在如由所附权利要求书定义的本发明的范围内。
[0217] 在以上权利要求书内阐述其它实施方案。
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