用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体
阅读：16发布：2020-05-17
专利汇可以提供用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及嵌合 抗原 受体(CAR)，其是能够重定向对于挑选的膜抗原的免疫细胞特异性和 反应性 的重组嵌合 蛋白质 ,以及更特别地，其中结合胞外配体是来源于ROR1单克隆 抗体 的scFV,其赋予对抗ROR1阳性细胞的特异性免疫。具有这样的CAR的工程化的免疫细胞特别地适于 治疗 淋巴瘤和白血病,以及实体瘤例如乳腺、结肠、 肺 和肾脏 肿瘤 。，下面是用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体专利的具体信息内容。
1.ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)，其具有选自如在图4中阐明的V3、V5和V1的一种多肽结构，所述结构包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、CD8α跨膜结构域和胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3δ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域。
2.根据权利要求1的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR),其中所述的CD8α跨膜结构域与SEQ ID NO.6具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。
3.根据权利要求1或2的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR),其中所述的铰链选自CD8α铰链、IgG1铰链和FcγRIIIα铰链。
4.根据权利要求1或2的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR),其中分别对于结构V3、V5和V1，所述的铰链与SEQ ID NO.4(CD8α)、SEQ ID NO.5(IgG1)和SEQ ID NO.3(FcγRIIIα)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。
5.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其中所述铰链是与SEQ ID NO.4具有至少80％序列同一性的CD8α铰链。
6.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其具有多肽结构V3，该多肽结构V3包含具有SEQ ID NO.4中所列的氨基酸序列的CD8α铰链和具有SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
7.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR，其中所述铰链是与SEQ ID NO.5具有至少80％同一性的IgG1铰链。
8.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其具有多肽结构V5，该多肽结构V5包含具有SEQ ID NO.5中所列的氨基酸序列的IgG1铰链和具有SEQ ID NO.6中所列的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
9.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其中所述铰链是与SEQ ID NO.3具有至少80％序列同一性的FcγRIIIα铰链。
10.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其具有多肽结构V1，该多肽结构V1包含具有SEQ ID NO.3中所列的氨基酸序列的FcγRIIIα铰链和具有SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
11.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含:
-可变的重VH链，其包含来自SEQ ID NO.54(CDR-H1)、SEQ ID NO:55(CDR-H2)和SEQ ID NO:56(CDR-H3)的小鼠单克隆抗体H10的CDR,和；
-可变的轻VL，其包含来自SEQ ID NO.59(CDR-L1)、SEQ ID NO:60(CDR-L2)和SEQ ID NO:61(CDR-L3)的小鼠单克隆抗体H10的CDR。
12.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含:
-可变的重VH链，其包含来自SEQ ID NO.28(CDR-H1)、SEQ ID NO.29(CDR-H2)和SEQ ID NO.30(CDR-H3)的小鼠单克隆抗体D10的CDR,和；
-可变的轻VL，其包含来自SEQ ID NO.33(CDR-L1)、SEQ ID NO:34(CDR-L2)和SEQ ID NO:35(CDR-L3)的小鼠单克隆抗体D10的CDR。
13.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链，其分别地与SEQ ID NO:53(H10-VH)和SEQ ID NO:58(H10-VL)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。
14.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链，其分别地与SEQ ID NO:27(D10-VH)和SEQ ID NO:32(D10-VL)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。
15.根据权利要求1至14中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链，所述VH和VL链来自已经被人源化的H10或D10抗体。
16.根据权利要求15的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链,其中
-VH链具有被SEQ ID NO:57编码的多肽,和
-VL链具有被SEQ ID NO:62编码的多肽。
17.根据权利要求15的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含:
-VH链具有SEQ ID NO:31编码的多肽,和
-VL链具有SEQ ID NO:36编码的多肽。
18.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述CAR多肽与SEQ ID NO:117(H10v3-CAR序列)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。
19.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述CAR多肽与SEQ ID NO:93(D10v3-CAR序列)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。
20.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述CAR多肽分别地与SEQ ID NO:95(D10v5-CAR序列)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少
95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。
21.根据权利要求1至20中任意一项的ROR1特异性的CAR,其中来自4-1BB的共刺激结构域与SEQ ID NO.8具有至少80％的同一性。
22.根据权利要求1至21中任意一项的ROR1特异性的CAR,其中所述CD3δ信号传导结构域与SEQ ID NO.9具有至少80％的同一性。
23.根据权利要求1至22中任意一项的ROR1特异性的CAR，其进一步包含对于ROR1不是特异性的另一种胞外配体结合结构域。
24.根据权利要求1至23中任意一项的ROR1特异性的CAR,其进一步包含信号肽。
25.根据权利要求24的ROR1特异性的CAR,其中所述信号肽与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少80％的序列同一性。
26.编码根据权利要求1至25中任意一项的嵌合抗原受体的多核苷酸。
27.包含权利要求26的核酸的表达载体。
28.工程化的免疫细胞，其在所述的细胞表面膜处表达根据权利要求1至25中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体。
29.根据权利要求28的工程化的免疫细胞,其来源于炎性T淋巴细胞、细胞毒性的T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。
30.根据权利要求28的工程化的免疫细胞,其中它源自于NK细胞。
31.根据权利要求28至30中任意一项的工程化的免疫细胞，其用于治疗。
32.根据权利要求28至31中任意一项的工程化的免疫细胞，其用于人的治疗。
33.根据权利要求28至32中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中，其中所述的状况是特征在于表达ROR1的细胞的前恶性的或恶性的癌症状况。
34.根据权利要求28至33中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中，其中所述的状况是特征在于过多的表达ROR1的细胞的状况。
35.根据权利要求28至34中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中，其中所述的状况是血液学的癌症状况。
36.根据权利要求28至35中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中，其中所述的血液学癌症状况是白血病。
37.根据权利要求28至36中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中,其中所述的血液学癌症状况是慢性淋巴细胞白血病(CLL)或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。
38.根据权利要求28至36中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中，其中所述白血病选自由急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和脊髓发育不良综合征组成的组。
39.根据权利要求28至36中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中,其中所述白血病是套细胞淋巴瘤(MCL)、具有t(1；19)染色体易位的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。
40.根据权利要求28至34中任意一项的工程化的免疫细胞,用于治疗中，其中所述的状况是实体瘤。
41.根据权利要求40的工程化的免疫细胞，用于治疗中，其中所述的肿瘤是乳腺、结肠、肺或肾脏的肿瘤。
42.根据权利要求40的工程化的免疫细胞，用于治疗中，其中所述的肿瘤是肾、胰腺或卵巢的肿瘤。
43.根据权利要求28至42中任意一项的工程化的免疫细胞,其中在所述免疫细胞中TCR的表达被抑制。
44.根据权利要求28至43中任意一项的工程化的免疫细胞,其中在所述免疫细胞中，至少一种MHC蛋白,优选地β2m或HLA的表达被抑制。
45.根据权利要求28至44中任意一项的工程化的免疫细胞,其中所述细胞被突变以赋予对至少一种免疫抑制药物或化学疗法药物的抗性。
46.损害血液学癌细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求28至45中任意一项的工程化的免疫细胞以有效引起对所述癌细胞的损害的量接触。
47.将免疫细胞工程化的方法，其包括:
(a)提供免疫细胞,
(b)在所述的细胞的表面处表达根据权利要求1至25中任意一项的至少一种ROR1特异性的嵌合抗原受体。
48.权利要求47所述的将免疫细胞工程化的方法，其包括:
(a)提供免疫细胞,
(b)把至少一种编码所述ROR1特异性的嵌合抗原受体的多核苷酸引入所述细胞中,(c)把所述多核苷酸表达到所述细胞中。
49.权利要求47所述的将免疫细胞工程化的方法，其包括:
(a)提供免疫细胞,
(b)把至少一种编码所述ROR1特异性的嵌合抗原受体的多核苷酸引入所述细胞中,(c)引入至少一种对于ROR1不是特异性的其它嵌合抗原受体。
50.治疗需要治疗的受试者的方法，其包括:
(a)提供免疫细胞，其在表面处表达根据权利要求1至25中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体；
(b)向所述患者施用所述免疫细胞。
51.根据权利要求50的治疗需要治疗的受试者的方法,其中在施用步骤(b)之前所述患者的淋巴被消耗，并且所述的免疫细胞根据权利要求28至45中的一项。
52.根据权利要求51的治疗需要治疗的受试者的方法,其中通过施用药物如氟达拉滨(F)、环磷酰胺(C)、苯达莫司汀(B)或利妥昔单抗(R)或其组合来进行所述淋巴消耗。
53.根据权利要求50至52中任意一项的方法,其中所述免疫细胞是从供体提供的。
54.根据权利要求50至52中任意一项的方法,其中所述免疫细胞是从患者本人提供的。
用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体
发明领域
[0001] 本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够重定向对于ROR1的免疫细胞特异性和反应性的重组嵌合蛋白质，ROR1是在大多数骨髓细胞上发现并且被用于在患者中诊断慢性淋巴细胞白血病(CLL)或实体瘤例如乳腺、结肠、肺和肾脏肿瘤的细胞表面糖蛋白。当其在T细胞或NK细胞中被表达时，根据本发明所述的CAR特别地可用于治疗带有ROR1抗原的恶性细胞。所产生的工程化的免疫细胞展示高水平的对于恶性细胞的特异性,赋予免疫疗法以安全性和效率。
[0002] 发明背景
[0003] 过继性免疫疗法涉及离体产生的自体抗原特异性的T细胞的转移,是一种有前途的用来治疗病毒感染和癌症的策略。用于过继性免疫疗法的T细胞可以或者通过抗原特异性的T细胞的扩增或者通过遗传工程重定向T细胞而产生(Park,Rosenberg等人2011)。病毒抗原特异性的T细胞的转移是一种得到确认的用于治疗与移植相关联的病毒感染和与稀有病毒有关的恶性肿瘤的方法。已经显示肿瘤特异性的T细胞的分离和转移在治疗黑素瘤方面是成功的。
[0004] 通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移，已经成功地在T细胞中产生了新的特异性(Jena,Dotti等人2010)。在图1中呈现了3代的CAR的略图。CAR是合成的受体，其由与单个融合分子中一个或更多个信号传导结构域缔合的靶向部分组成。一般而言,CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻并且可变的片段。也已经成功地使用了基于受体或配体结构域的结合部分。第一代CAR的信号传导结构域源自于CD3ζ的胞质区或Fc受体γ链。已经显示第一代CAR成功地重定向T细胞的细胞毒性。然而,它们未能提供持续的扩增和体内抗肿瘤活性。已经添加了来自共刺激分子的信号传导结构域以及跨膜和铰链结构域来形成第二和第三代的CAR,导致在人中某些成功的治疗性试验,其中可以重定向T细胞使其对抗表达CD19的恶性细胞(June等人,2011)。然而,针对CD19 ScFv使用的信号传导结构域、跨膜结构域和共刺激结构域的特定组合是相当抗原特异性的并且不能被扩展到任何抗原标记。
[0005] 慢性淋巴细胞白血病(CLL)是由执业血液学家管理的一种最通常诊断的白血病。持续多年，患有CLL的患者一直被看作类似的具有长的自然史并且仅仅边际有效的治疗，其很少产生完全应答。最近,与VH突变状态和相关联的ZAP-70过表达、破坏的p53功能和染色体畸变的生物学显著性相关的几个重要的观察已经导致能够鉴定处于早期疾病发展和弱生存力的高风险的患者。与这些研究同时,包括核苷类似物、单克隆抗体利妥昔单抗和阿仑单抗在内的几种治疗已经被引入。当被用作有症状的CLL的初始治疗时，这些治疗的组合在临床试验中已经导致高度完全的和总的响应速率。因此,CLL和治疗的初始风险分层化的复杂性已经显著地增大了。此外,当这些初始治疗没有效果时,对患有氟达拉滨顽固性疾病的CLL患者的方法可能是相当具有挑战性的(Byrd J.C等人,2014)。
[0006] 针对慢性淋巴细胞白血病(CLL)的免疫疗法的一种候选抗原是酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1(也被称为NTRKR1；UniProtKB/TrEMBL)条目:Q01973)。ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)是一种包含胞外免疫球蛋白(Ig)样、三环域和卷发样半胱氨酸富集域的120-kDa糖蛋白(图2)。被这种基因编码的蛋白是在中枢神经系统中调节轴突生长的受体酪氨酸激酶。它是I型膜蛋白并且属于ROR亚族的细胞表面受体(Reddy等人,1997)。尽管在患有关于正常白血球的CLL的患者中ROR1蛋白表达以及它在CLL的病理学中的作用值得进一步研究，ROR1可能是用于癌症免疫疗法的合适的靶(Daneshmanesh等人；2008)。ROR1实际上是在多种B细胞恶性肿瘤上被表达的，而且也在包括乳腺、结肠、肺和肾脏肿瘤在内的某些实体瘤的亚组上被表达的。相信ROR1在致癌的信号传导中起作用以改善肿瘤细胞在上皮肿瘤中的生存力。重要地,ROR1不在除了脂肪和胰腺组织之外的重要器官上被表达,这减小了来自杀伤正常细胞的潜在毒性(Hudecek等人,2013)。ROR1是在胚胎形成期间被表达的，但是在正常的成熟组织中不存在,除了不成熟的B细胞前体亚组以及在脂肪细胞上低水平的表达以外(Hudecek等人,2010；Matsuda等人,2001)。通过转录的剖析首次证明了ROR1在B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)中被表达(Klein等人,2001；Rosenwald等人,2001)并且随后在包括套细胞淋巴瘤(MCL)、具有t(1；19)染色体易位的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和肺、乳腺、结肠、胰腺、肾和卵巢癌亚组在内的许多癌症的表面上鉴定了ROR1(Baskar等人,2008；Bicocca等人,2012；Daneshmanesh等人,2008；Dave等人,2012；Fukuda等人,2008；
Yamaguchi等人,2012；Zhang等人,2012a,2012b)。在肺腺癌和t(1；19)ALL这两者中,ROR1在致癌的信号传导和ROR1的敲减方面与siRNA合作暴露了关于这种分子在保持肿瘤细胞生存力方面的关键作用(Bicocca等人,2012；Choudhury等人,2010；Gentile等人,2011；
Yamaguchi等人,2012)。因此,ROR1损失不能容易地被肿瘤忍受，使得它成为可能被广泛地应用的CAR定向的T细胞疗法的有吸引力的候选者。因此本发明人已经考虑到通过利用表达CAR的T细胞，ROR1可能是用于治疗CLL以及实体瘤例如乳腺、结肠、肺、卵巢和肾脏肿瘤的有价值的靶抗原。
Yamaguchi等人,2012；Zhang等人,2012a,2012b)。在肺腺癌和t(1；19)ALL这两者中,ROR1在致癌的信号传导和ROR1的敲减方面与siRNA合作暴露了关于这种分子在保持肿瘤细胞生存力方面的关键作用(Bicocca等人,2012；Choudhury等人,2010；Gentile等人,2011；
Yamaguchi等人,2012)。因此,ROR1损失不能容易地被肿瘤忍受，使得它成为可能被广泛地应用的CAR定向的T细胞疗法的有吸引力的候选者。因此本发明人已经考虑到通过利用表达CAR的T细胞，ROR1可能是用于治疗CLL以及实体瘤例如乳腺、结肠、肺、卵巢和肾脏肿瘤的有价值的靶抗原。
[0007] Stanley Riddell博士和Laurence Cooper博士的实验室先前已经工程化并且确认了分别地包含4A5和2A2 scFvs的抗ROR1 scCAR(Cooper等人2010；Hudecek等人,2013)。特别地,Hudecek等人公开了抗ROR1 scCAR，其包含不同长度的IgG4铰链和CD28跨膜结构域。
[0008] 仍然存在着对通过设计CAR结构并且利用合适的组件来改进CAR功能的需要，因为这些参数发挥着重要作用并且精细调谐是必需的。
[0009] 因此,作为先前策略的备选,本发明提供ROR1特异性的CAR,其可以在免疫细胞中被表达以靶向ROR1恶性细胞，具有显著的临床优点。本发明人已经发现:通过把CAR结构与合适组件的选择结合,他们可以得到对于癌性的靶细胞具有高细胞毒性的ROR1特异性的单链CAR。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明人已经生产了具有不同的结构并且包含来源于不同的ROR1特异性抗体的不同scFV的ROR1特异性的CAR。
[0012] 正如在图4中阐明的那样，根据本发明的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)可以具有选自V1至V6的一种多肽结构，所述结构包含结合细胞外配体的结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、铰链、跨膜结构域和胞质结构域，包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。
[0013] 更特别地,正如在图4中阐明的那样，根据本发明的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)可以具有选自V3、V5和V1的多肽结构中的一种结构,所述结构包含结合细胞外配体的结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、铰链、CD8α跨膜结构域、胞质结构域，包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。已经发现这样的ROR1(NTRKR1)特异性的抗原受体在细胞毒性方面具有意想不到的优越的效果。
[0014] 在一个实施方式中,ROR1特异性的CAR具有结构V1，其包含FcγRIIIα铰链和CD8α跨膜结构域。
[0015] 在一个优选的实施方式中,ROR1特异性的CAR具有结构V3并且包含CD8α铰链和CD8α跨膜结构域。
[0016] 在另一个优选的实施方式中,ROR1特异性的CAR具有结构V5，其包含IgG1铰链和CD8α跨膜结构域。
[0017] 特别地,所述抗原结合结构域(scFv)来源于H10和D10抗ROR1抗体，已经显示了显著的抗癌性质。
[0018] 而且,已经从鼠H10和D10抗ROR1抗体产生了人源化的scFv。
[0019] 本发明的优选的CAR多肽包含选自SEQ ID NO.79至138的氨基酸序列。在体外非特异性的活化(例如采用抗CD3/CD28包被的珠子和重组的IL2)以后,采用表达这些CAR的多核苷酸利用病毒转导转化了来自供体的T细胞。在某些情形中,进一步把所述的T细胞工程化以产生非等位反应性T细胞,更特别地通过破坏TCR的组件(αβ–T细胞受体)来预防移植物抗宿主反应。已经发现本发明所述的CAR在同种异体的T细胞的背景中是特别地有效的。
[0020] 所产生的工程化T细胞在体外展示了对抗ROR1阳性细胞的反应性达到各种程度，这显示本发明所述的CAR对T细胞的抗原依赖性活化和增殖有贡献,使得它们可用于免疫疗法。
[0022] 本发明所述的工程化的免疫细胞特别地可用于治疗性应用,例如用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小的淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、具有t(1；19)染色体易位的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。也可以使用它们用于治疗实体瘤例如乳房、结肠、肺和肾脏肿瘤。
[0024] 图1:单链嵌合抗原受体(scCAR)最通常地是通过把与特异性抗原结合的单克隆抗体的重和轻链可变区连接到T细胞信号分子的胞内部分例如与TCR缔合的CD3复合物的组件(ζ链)而产生的(图1B)。第一代scCAR仅仅包含传送活化信号的T细胞信号传导结构域(图1C左边)。第二代scCAR另外掺入了增强T细胞持久性和体内抗肿瘤功能的单个共刺激分子内结构域,例如CD28或41BB的内结构域(图1C中间)。第三代scCAR掺入了至少两个共刺激分子内结构域,例如CD28和41BB的内结构域(图1C右边)。
[0025] 图2:ROR1蛋白的结构，其由胞外的部分、跨膜部分和胞内结构域组成；正如先前阐明的那样，胞外和胞内的部分包含多个部件。
[0026] 图3A、3B、3C和3D:(I)来自D10和H10 VH的序列和VL鼠序列与由编码免疫球蛋白的可变区的V和J基因编码的生殖系人序列的比对,那些序列与鼠的序列具有高的同源性。为了稳定性目的(特别地CDR的稳定性),在对应于应该是来自鼠来源的AA的上面的线中，用箭头显示AA的“最关键的”位置,并且在下面的线中“不太关键的”位置是可以是人或鼠来源中的任何一种的那些位置。(II)MGT/DomainGapAlign(Lefranc等人Dev.Comp.Immunol.,29,185-203(2005))允许对D10和H10 VH的结构域氨基酸序列与VL鼠序列进行比对和“IMGT缺口”。展示了输入序列,将其与IMGT结构域目录的最接近的生殖系V-区域或最接近的C-结构域比对以及根据关于V-区域、C-结构域和C样-结构域的IMGT单一编号与缺口比对。
[0027] 图4:不同的CAR结构(V1至V6)的略图。
[0028] 图5:在不同的人细胞系上的ROR1表面分子的编号。
[0029] 图6:scCAR筛选程序
[0030] 图7:在人T细胞中scCAR的总的表达。(A)实验1，(B)实验2。
[0031] 图8:scCAR在人T细胞上的细胞表面表达。(A)实验1，(B)实验2。
[0032] 图9:在与靶细胞共培养时，scCAR修饰的T细胞的脱粒。实验1，(B)实验2(细胞系和/或处理，从左到右:MDA-MB-2301、PC-3、MCF-7、没有活化、PMA+离子霉素)。
[0033] 图10:scCAR在人T细胞上的细胞表面表达。以4次独立实验的平均值+/-标准差形式呈列数据。
[0034] 图11:在与靶细胞共培养时，scCAR修饰的T细胞的脱粒。以4次独立实验的平均值+/-标准差形式呈列数据。
[0035] 图12:在与靶细胞共培养时，经由scCAR修饰的T细胞生产IFNγ。以4次独立实验的平均值+/-标准差形式呈列数据(细胞系和/或处理，从左到右:Jeko-1、K562、MDA-MB-2301、PC-3、MCF-7、没有活化)。
[0036] 图13:在与附着的靶细胞共培养时，scCAR修饰的T细胞的细胞毒性活性。以4次独立实验的平均值+/-标准差形式呈列数据。
[0037] 图14:在与悬浮的靶细胞共培养时，scCAR修饰的T细胞的细胞毒性的活性。以4次独立实验的平均值+/-标准差形式呈列数据。
[0038] 图15:根据本发明的工程化的免疫细胞的略图。呈现在这个图中的工程化的免疫细胞是采用编码逆转录病毒多肽的CAR转导的T细胞。进一步把这种T细胞工程化以允许更好地并且更安全地植入到患者中，这在本发明的框架之内是任选的。例如X基因可以是表达TCR的组件(TCRα或TCRβ)的基因,Y可以是参与到T细胞对免疫抑制性药物例如CD52(针对阿仑单抗)或HPRT(针对6-硫代鸟嘌呤)的敏感性中的基因。
[0039] 表1：除scFv以外的不同的CAR组件的序列
[0040]
[0041] 表2：来自鼠来源的scFv的序列、它们的scFv和来自D10和H10的人源化scFv的CDR[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047] 表3：结构V-1的CAR
[0048]
[0049] 表4:结构V-2的CAR
[0050]
[0051] 表5:结构V-3的CAR
[0052]
[0053] 表6：结构V-4的CAR
[0054]
[0055] 表7：结构V-5的CAR
[0056]
[0057] 表8：结构V-6的CAR
[0058]
[0059] 发明详述
[0060] 除非在本文中具体地定义,使用的所有技术和科学术语具有与基因疗法、生物化学、遗传学和分子生物学领域中技术人员通常理解的相同的意义。
[0061] 可以把与本文中描述的那些方法和物质类似的或等同的所有方法和物质与本文中描述的合适的方法和物质一起用于本发明的实践或测试中。本文中提到的所有公布、专利申请、专利以及其它参考文献通过以它们的整体引用并入。在冲突的情况下,包括定义在内的本说明书将会占优势。进一步,除非另外指定，所述的物质、方法和实施例仅仅是阐明性的并且不意图是限定性的。
[0062] 除非另有指示,本发明的实践将会利用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些都在本领域技术的范围之内。在文献中充分地阐明了这样的技术。参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,美国)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,(Sambrook等人,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Mullis等人美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries与S.J.Higgins编辑1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames与S.J.Higgins编辑1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Guide To Molecular Cloning(1984)；系列,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon主要编辑,Academic Press,Inc.,New York),具体地,第
154和155卷(Wu等人编辑.)和第185卷,“Gene Expression Technology”(D.Goeddel编辑.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,
1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编辑,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
154和155卷(Wu等人编辑.)和第185卷,“Gene Expression Technology”(D.Goeddel编辑.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,
1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编辑,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
[0063] ROR1特异性的嵌合抗原受体
[0064] 本发明涉及抗ROR1嵌合抗原受体(CAR)的新设计，其包含胞外配体结合结构域、跨膜结构域和传导信号的转导结构域。
[0065] 正如本文中所用的那样，术语“胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地,所述的结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如,可以选择所述的胞外配体结合结构域以识别与特定的疾病状态有关的在靶细胞上作为细胞表面标志而起作用的配体。在一个优选的实施方式中,所述胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包括通过柔性接头连接靶抗原特异性的单克隆抗CD-123抗体的轻(VL)和重(VH)可变片段。所述VL和VH优选地选自被称为2A2、4A5和D10的抗体，正如在表2中所指示的那样。
[0066] 而且,表2也涉及G6、G3、H10、2A4和1C11的VL和VH,其公开了它们各自的序列SEQ ID NO.37、41、45、49、53、58、63、67、71和75,以及涉及D10和H10的人源化的VL和VH，其分别具有序列SEQ ID ID NO.31、36、57和62。
[0067] 图4显示根据本发明所述的CAR的6种形式的结构。正如实施例那样，表1显示在进一步实验中使用的组件。
[0068] 根据本发明的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)可以具有选自V1至V6的一种多肽结构，正如在图4中阐明的那样,所述结构包含胞外配体结合结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、铰链、跨膜结构域和胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。
[0069] 更具体地,本发明涉及具有选自V3、V5和V1的一种多肽结构的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)，正如在图4中阐明的那样,所述结构包含胞外配体结合结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、铰链、CD8α跨膜结构域和胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。
[0070] 抗原结合结构域
[0071] 本发明所述的ROR1 CAR的抗原结合结构域可以是与离开组织(off-tissue)的抗原结合的任何结构域，该抗原包括但不限于单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化的抗体以及其功能性片段。
[0072] 在一个优选的实施方式中,所述胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包括通过柔性接头连接的靶抗原特异性的单克隆ROR1抗体的轻(VL)和重(VH)可变片段。所述VL和VH优选地选自被称为H10、D10、4A5、G6、G3、2A2、2A4和1C11的抗体，正如在表2中指示的那样。优选地，通过包含例如序列SEQ ID NO:10的柔性接头将它们连接在一起。换句话说,所述CAR优先地包含胞外配体结合结构域，其包括展示与由VH和VL链与它们之间的接头组合产生的多肽序列至少90％、95％、97％或99％同一性的多肽序列，正如在表3至表8中关于形式V1至V6描绘的那样。
[0073] 在特别优选的实施方案中,所述VL和VH源自于抗体H10。
[0074] 在其它特定的实施方式中,所述VL和VH源自于抗体D10。
[0075] 正如本文中所用的那样,术语“重组抗体”意指利用重组DNA技术产生的抗体或抗体片段,例如,举例来说,由噬菌体、酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统以及更特别地由采用病毒载体转导的T细胞表达的抗体或抗体片段，该病毒载体包含编码抗体的CDR区域的核酸序列。也应该把该术语解释成意指通过合成编码所述的抗体或抗体片段的DNA分子(并且该DNA分子表达抗体或抗体片段蛋白)而产生的抗体或抗体片段，或意指限定所述的抗体或抗体片段的氨基酸序列,其中已经利用本领域中能够得到的并且熟知的重组或合成DNA或氨基酸序列技术，得到了所述的DNA或氨基酸序列。
[0076] 正如本文中所用的那样,术语“人源化的抗体”意指多肽，其包括人源化的重链可变区和人源化的轻链可变区。例如,所述的多肽可以包括人抗体的轻和重链可变区的构架(FR)区,同时实质上保留亲本单克隆抗体的抗原结合特异性。所述的人源化的重链可变区和/或人源化的轻链可变区是至少大约87％人源化的、至少大约90％人源化的、至少大约95％人源化的、至少大约98％人源化的或至少大约100％人源化的,不包括互补决定区(CDR)。所述的结合抗原的多肽分子可以来源于单克隆抗体供体(例如小鼠单克隆抗体供体)并且可以包括来自单克隆抗体的CDR(例如小鼠单克隆的CDR)。
[0077] 正如本文中所用的那样,术语“单克隆抗体”意指由杂交瘤或病毒转化的淋巴细胞中任何一种的实验室生长的细胞克隆生产的抗体，它比天然抗体更丰富和均一并且能够与ROR1抗原上的单个位点特异性地结合。它们是由作为单一亲本细胞的全部克隆的相同的免疫细胞制造的单特异性抗体，和由几种不同的免疫细胞制造的多克隆抗体形成对比。单克隆抗体具有单价亲和性,因为它们与相同的表位结合。
[0078] 本发明公开了如上的ROR1特异性的嵌合抗原受体(ROR1 CAR),其中所述胞外配体结合结构域包含人源化的VH和VL链。
[0079] 表2显示对应于D10和H10抗ROR1抗体的人源化scFv(VH和VL链)的序列。
[0080] 图3A至3D呈现在已经应用了根据Lefranc MP等人的方法(Lefranc,MP,Ehrenmann F,Ginestoux C,Giudicelli V,Duroux P“使用IMGT 数据库和工具用于抗体工程和人源化”,Methods Mol Biol.2012；907:3-37)以后，鼠的D10和H10 scFv与它们的人源化形式的比对。在这4种比对中指示了:
[0081] -CDR；
[0082] -具有上面的箭头的“最关键的”氨基酸(AA)，其意指作为鼠源保持的那些AA；
[0083] -具有上面的箭头的“不太关键的”氨基酸，其意指可能是鼠来源或人来源的那些AA；应该明白，本发明所述的人源化序列实际上是一组所有可能通过这样的来自人或鼠来源的“不太关键的”AA的所有组合制造的不同的序列；包含CDR和“最关键的”AA的那些序列如刚好先前呈现的那样。
[0084] 可以利用本领域中已知的多种技术来生产人源化的抗体，这些技术包括但不限于CDR接枝(参见例如欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089,通过引用将其每一篇全文并入本文中)、贴面或表面重建(参见例如欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/
5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6:805-814；和Roguska等人,
1994,PNAS,91:969-973,通过引用将其每一篇全文并入本文中)、链改组(参见例如美国专利号5,565,332,通过引用将其全文并入本文中)和在例如下列文献中公开的技术:美国专利申请公开号US2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,
213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO 9317105、Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods,20(3):
267-79(2000)、Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto等人,Cancer Res.,55(23增刊):5973s-5977s(1995)、Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994),将其每一篇全文并入本文中。常常,在构架区中的构架残基将会被来自CDR供体抗体的相应残基替代，以改变,例如改善抗原结合。通过本领域中众所周知的方法，例如通过建立CDR和构架残基相互作用的模型来鉴定这些构架替代，以鉴定对于抗原结合和序列比较重要的构架残基而鉴定处于特定位置的不寻常的构架残基(参见例如Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323,通过引用将其全文并入本文中)。
5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6:805-814；和Roguska等人,
1994,PNAS,91:969-973,通过引用将其每一篇全文并入本文中)、链改组(参见例如美国专利号5,565,332,通过引用将其全文并入本文中)和在例如下列文献中公开的技术:美国专利申请公开号US2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,
213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO 9317105、Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods,20(3):
267-79(2000)、Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto等人,Cancer Res.,55(23增刊):5973s-5977s(1995)、Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994),将其每一篇全文并入本文中。常常,在构架区中的构架残基将会被来自CDR供体抗体的相应残基替代，以改变,例如改善抗原结合。通过本领域中众所周知的方法，例如通过建立CDR和构架残基相互作用的模型来鉴定这些构架替代，以鉴定对于抗原结合和序列比较重要的构架残基而鉴定处于特定位置的不寻常的构架残基(参见例如Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323,通过引用将其全文并入本文中)。
[0085] 本发明的一个方面特别地涉及具有选自V3、V5和V1的一种多肽结构的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)，正如在图4中阐明的那样,所述结构包含胞外配体结合结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、铰链、CD8α跨膜结构域(CD8αTM)和胞质结构域，其包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。
[0086] 根据一个优选的实施方式,所述跨膜结构域是由与SEQ ID NO.6(CD8αTM)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％序列同一性的多肽编码的。
[0087] 根据另一个优选的实施方式,所述铰链是由一种多肽编码的,分别地对于结构V3、V5和V1,该多肽与SEQ ID NO.4(CD8α)、SEQ ID NO.5(IgG1)和SEQ ID NO.3(FcγRIIIα)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％序列同一性。
[0088] 根据一种更优选的实施方式,本发明所述的ROR1特异性的CAR具有多肽结构V3，其包含具有列在SEQ ID NO.4中的氨基酸序列的CD8α铰链和具有列在SEQ ID NO:6中的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
[0089] 根据另一种更优选的实施方式,本发明所述的ROR1特异性的CAR具有多肽结构V5，其包含具有列在SEQ ID NO.5中的氨基酸序列的IgG1铰链和具有列在SEQ ID NO.6中的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
[0090] 根据一个实施方式,所述ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)具有选自V3、V5和V1的一种多肽结构，正如在图4中阐明的那样,其中所述的胞外配体结合结构域包含:
[0091] -可变的重链VH，其包含SEQ ID NO.54(CDR-H1)、SEQ ID NO:55(CDR-H2)和SEQ ID NO:56(CDR-H3)的来自小鼠单克隆抗体H10的CDR,和；
[0092] -可变的轻VL，其包含SEQ ID NO.59(CDR-L1)、SEQ ID NO:60(CDR-L2)和SEQ ID NO:61(CDR-L3)的来自小鼠单克隆抗体H10的CDR；
[0093] 或:
[0094] -可变的重VH，其包含SEQ ID NO.28(CDR-H1)、SEQ ID NO.29(CDR-H2)和SEQ ID NO.30(CDR-H3)的来自小鼠单克隆抗体D10的CDR,和；
[0095] -可变的轻VL，其包含SEQ ID NO.33(CDR-L1)、SEQ ID NO:34(CDR-L2)和SEQ ID NO:35(CDR-L3)的来自小鼠单克隆抗体D10的CDR。
[0096] 在一个优选的实施方式中,所述ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)具有选自V3、V5和V1的一种多肽结构，正如在图4中阐明的那样,其中所述胞外配体结合结构域包含分别地与
[0097] -SEQ ID NO:53(H10-VH)和SEQ ID NO:58(H10-VL)或
[0098] -SEQ ID NO:27(D10-VH)和SEQ ID NO:32(D10-VL)
[0099] 具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％序列同一性的VH和VL链,或；
[0100] 在另一个实施方式中,所述ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)具有选自V3、V5和V1的一种多肽结构，正如在图4中阐明的那样,其中所述胞外配体结合结构域包含来自已经被人源化的H10或D10抗体的VH和VL链。
[0101] 特别地,所述结合细胞配体的结构域包含人源化的VH和VL链,其中
[0102] -可变的重Hu H10 VH具有由SEQ ID NO:57编码的多肽,并且
[0103] -可变的轻Hu H10 VH具有由SEQ ID NO:62编码的多肽；
[0104] 或:
[0105] -可变的重Hu D10 VH具有由SEQ ID NO:31编码的多肽,并且
[0106] -可变的轻Hu D10 VH具有由SEQ ID NO:36编码的多肽。
[0107] 根据另一个实施方式,所述ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)具有选自V3、V5和V1的一种多肽结构，正如在图4中阐明的那样,其中所述CAR多肽与SEQ ID NO:117(H10v3-CAR序列)或与SEQ ID NO:93(D10v3-CAR序列)或与SEQ ID NO:95(D10v5-CAR序列)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％序列同一性。
[0108] CAR结构
[0109] 根据本发明所述的CAR的信号转导结构域或胞内信号传导结构域对胞外配体的结构域与靶结合以后的胞内信号传导负责，导致免疫细胞的活化和免疫应答。换句话说,所述的信号转导结构域对其中表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化负责。例如,T细胞的效果子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子在内。因此,术语“信号转导结构域”是指转导效应子信号并且指导细胞以执行专业化功能的蛋白质的部分。
[0110] 优选的用于CAR中的信号转导结构域的实例可以是T细胞受体和辅助受体的胞质序列，其在抗原受体接合以后协同行动以启动信号转导,以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包含两种不同的类别的胞质信号传导序列,启动抗原依赖性初级活化的那些信号传导序列和以不依赖于抗原的方式行动以提供次级或共刺激信号的那些信号传导序列。初级胞质信号传导序列可以包含信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。ITAM是在充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的多种受体的胞质内尾部中发现的被很好地确定的信号传导基序。作为非限定性的实例，在本发明中使用的ITAM的实例可以包括来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个优选的实施方式中,所述的CAR的传导信号的转导结构域包含CD3ζ信号传导结构域，其氨基酸序列与氨基酸序列(SEQ ID NO:9)具有至少70％,优选地至少80％,更优选地至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。
[0111] 在特别的实施方式中，本发明所述的CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子或它的一部分。共刺激分子是除有效的免疫应答所需要的抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子。“共刺激配体”是指抗原呈递细胞上的一种分子，其特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子,从而提供信号，除了由例如TCR/CD3复合物与装载了肽的MHC分子的结合提供的初级信号之外,所述信号介导T细胞应答,包括但不限于增殖活化、分化等等。共刺激配体可以包括但是不局限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘着分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性地结合的配体。共刺激配体也包括与在T细胞上存在的共刺激分子(例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3)特异性地结合的抗体、与CD83特异性地结合的配体。
[0112] “共刺激分子”是指在T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性地结合,从而经由所述的细胞介导共刺激应答,例如但不限于增殖。共刺激分子包括但是不限于I类MHC、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体等等。
[0113] 在一个优选的实施方式中,本发明所述的CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子或它的一部分，选自由4-1BB(GenBank:AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)的片段组成的组。特别地，本发明所述的CAR的信号转导结构域包含与选自由SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列具有至少70％,优选地至少80％,更优选地至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。
[0114] 根据本发明的CAR是在细胞的表面膜上表达的。因此,这样的CAR进一步包含跨膜结构域。合适的跨膜结构域的区别特征包括在细胞(在本发明中优选免疫细胞,特别是淋巴细胞或天然杀伤(NK)细胞)的表面上表达以及一起相互作用用于定向免疫细胞针对预先确定的靶细胞的细胞应答的能力。跨膜结构域可以来源于天然来源或者合成来源。跨膜结构域可以源自于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限定性的实例,跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基例如α、β、γ或δ、构成CD3复合物的多肽、IL2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链、Fc受体的亚基链,特别是Fcγ受体III或CD蛋白质。备选地，跨膜结构域可以是合成的并且可以包含占优势的疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一个优选的实施方式中，所述跨膜结构域源自于人CD8α链(例如NP_001139345.1)。跨膜结构域可以进一步包含在所述胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。在本文中使用的术语“铰链区”一般地意指起着连接跨膜结构域与胞外配体结合结构域作用的任何寡肽或多肽。特别地,使用绞链区来为胞外配体结合结构域提供更多的柔性和可接近性。绞链区可以包含至多300个氨基酸,优选地10至100个氨基酸以及最优选地25至50个氨基酸。绞链区可以来源于所有或部分天然存在的分子,例如来源于所有或部分CD8、CD4或CD28的胞外区,或来源于所有或部分抗体恒定区。备选地，绞链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列,或可以是完全地合成的铰链序列。在一个优选的实施方式中，所述铰链结构域包含人CD8α链、FcγRIIIα受体或IgG1的部分，在本说明书中分别地被称为SEQID NO.3、SEQID NO.4和SEQID NO.5，或铰链多肽的一部分，其优选地展示与这些多肽至少80％,更优选地至少90％、95％、97％或99％序列同一性。
[0115] 根据本发明的CAR一般地进一步包含更特别地选自CD8α和4-1BB的跨膜结构域(TM)，其显示与SEQ ID NO.6或7的多肽的同一性。优选SEQ ID NO.6的CD8αTM。
[0116] 根据优选的实施方式,ROR1特异性的CAR具有选自V3、V5和V1的多肽结构，正如在图4中的那样,所述结构包含胞外配体结合结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、CD8α铰链、CD8α跨膜结构域和胞质结构域，包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。
[0117] 根据另一个优选的实施方式,ROR1特异性的CAR具有选自V3、V5和V1的多肽结构，正如在图4中阐明的那样,所述结构包含胞外配体结合结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、IgG1铰链、CD8α跨膜结构域和胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。
[0118] 根据一个优选的实施方式,ROR1特异性的CAR具有选自V3、V5和V1的多肽结构，正如在图4中阐明的那样，所述结构包含胞外配体结合结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、FcγRIIIα铰链、CD8α跨膜结构域和胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。
[0119] 表3-8显示关于所有的6种形式V1至V6的CAR结构。
[0120] 通常在癌细胞中观察到靶抗原的下调或突变,产生抗原损失脱逸变体。因此,为了弥补肿瘤脱逸和使免疫细胞对靶更有特异性,根据本发明所述的ROR1特异性的CAR可以包含另一个胞外配体结合结构域,以同时地结合靶中的不同元件，从而增大免疫细胞活化与功能。在一个实施方式中,可以在相同的跨膜多肽上串联地放置所述的胞外配体结合结构域,并且任选地可以通过接头将所述的胞外配体结合结构域分开。在另一个实施方式中,可以把所述不同的胞外配体结合结构域置于组成CAR的不同的跨膜多肽上。在另一个实施方式中,本发明涉及每一种包含不同的胞外配体结合结构域的CAR群。在一种特定的方面中，本发明涉及将免疫细胞工程化的方法，其包括提供免疫细胞并且在所说细胞的表面上表达每一种包含不同的胞外配体结合结构域的CAR群。在另一种特定的实施方式中,本发明涉及将免疫细胞工程化的方法，其包括提供免疫细胞和向所述细胞中引入编码多肽的多核苷酸，该多肽组成了CAR群，其每一种CAR包含不同的胞外配体结合结构域。就CAR群来说,它意指至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种CAR，每一种包含不同的胞外配体结合结构域。根据本发明所述的不同的胞外配体结合结构域可以优选地同时地结合靶中的不同元件，从而增大免疫细胞活化与功能。本发明也涉及包含CAR群的分离的免疫细胞，其每一种CAR包含不同的胞外配体结合结构域。
[0121] 多核苷酸、载体:
[0122] 本发明也涉及编码根据本发明以上描述的CAR的多核苷酸、载体。
[0123] 所述的多核苷酸可以存在于表达盒或表达载体(例如用于引入到细菌宿主细胞中的质粒,或病毒载体例如用于转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体,或质粒或病毒载体例如用于转染哺乳动物宿主细胞的慢病毒)。
[0124] 在特定的实施方式中,可以把所述的不同的核酸序列包括在一个多核苷酸或载体中，所述多核苷酸或载体包含编码核糖体跳跃序列的核酸序列(例如编码2A肽的序列)。2A肽是在细小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚群中鉴定的，引起核糖体从一个密码子"跳跃"到下一个密码子，而无需在由所述的密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见(Donnelly and Elliott2001；Atkins,Wills等人2007；Doronina,Wu等人2008))。“密码子”意指在mRNA上(或在DNA分子的有义链上)的三个核苷酸，其被核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此,当所述的多肽被框架中的一种2A寡肽序列分开时，可以从在mRNA之内的单个的毗连的可读框合成两条多肽。这样的核糖体跳跃机制是本领域中熟知的并且已知被几种载体被使用，用于由单个信使RNA编码的几种蛋白质的表达。
[0125] 为了把跨膜多肽定向到宿主细胞的分泌途径中,在多核苷酸序列或载体序列中提供了分泌信号序列(也被称为前导序列、前原序列或前序列)。使所述的分泌信号序列与跨膜核酸序列有效连接,即使所述的两条序列沿着正确的读框相连并且定位以把新合成的多肽定向到宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的核酸序列的5'端,然而某些分泌信号序列可以位于所述的目的核酸序列中的其它地方(参见例如Welch等人,美国专利号5,037,743；Holland等人,美国专利号5,143,830)。在一个优选的实施方式中，所述的信号肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或2。
[0126] 本领域技术人员将会认识到:鉴于遗传密码的简并性,在这些多核苷酸分子之中有相当多的序列变化是可能的。优选地,为了在哺乳动物细胞中表达，优选地为了在人细胞中表达，本发明所述的核酸序列是密码子优化的。密码子优化是指一般地在给定物种的高度表达的基因中稀有的密码子的目的序列被一般地在这样的物种的高表达的基因中常见的密码子替换，这样的密码子与将要被替换的密码子编码相同的氨基酸。
[0127] 将赋予CAR的免疫细胞工程化的方法:
[0128] 本发明包括制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法，包括向所述免疫细胞中离体引入编码先前描述的一种ROR1 CAR的多核苷酸或载体。
[0129] 在一个优选的实施方式中,鉴于其在免疫细胞中被稳定地表达，所述多核苷酸被包括在慢病毒载体中。
[0130] 根据进一步的实施方式,所述方法进一步包括遗传修饰所述细胞以使得它们更适用于同种异体移植的步骤。
[0131] 根据第一个方面,可以使免疫细胞成为同种异体的,例如按照WO 2013/176915中描述的那样，通过失活至少一种表达T细胞受体(TCR)的一个或更多个组件的基因，可以把该失活与编码或调节HLA或β2m蛋白表达的基因的失活组合。相应地，移植物抗宿主反应综合征和移植排斥的风险被显著地减小了。
[0132] 根据另一个方面,可以以遗传方式进一步把免疫细胞工程化以改善它们对免疫抑制药物或化学疗法治疗的抗性,这些治疗被用作治疗ROR1阳性的恶性细胞的标准护理。例如,作为Campath(阿仑单抗)和糖皮质激素治疗的药物靶的CD52和糖皮质激素受体(GR)可以被失活以使得所述的细胞对这些治疗有抗性并且给予它们胜过不具有特异性的ROR1 CAR的患者自己的T细胞的竞争优势。还可以抑制或减少CD3基因的表达以赋予对Teplizumab的抗性，Teplizumab是另一种免疫抑制性药物。根据本发明，还可以抑制或减小HPRT的表达以赋予对6-硫代鸟嘌呤的抗性，6-硫代鸟嘌呤是通常被用于化学疗法，尤其是用于治疗急性成淋巴细胞白血病中的一种细胞生长抑制剂。
[0133] 根据本发明的进一步方面,通过将编码充当“免疫检查点”的作为T细胞活化的调节剂的蛋白质的基因(例如PDCD1或CTLA-4)失活，可以进一步操作免疫细胞，使得它们更有活力或限制消耗。在表9中指示了其表达可以被减少或抑制的基因的实例。
[0134] 表9：编码免疫检查点蛋白的基因列表
[0135]
[0136]
[0137] 在一个优选的实施方式中，所述进一步将免疫细胞工程化的方法涉及通过DNA切割引入编码特异性的罕见切割的内切核酸酶的所述T细胞多核苷酸,特别是mRNA，以选择性地失活所述的基因,例如上述的那些基因。在一种更优选的实施方式中，所述罕见切割内切核酸酶是TALE核酸酶或Cas9内切核酸酶。迄今为止，TAL核酸酶已经证明了具有比其它类型的罕见切割内切核酸酶更高的特异性和切割效率,使得它们成为用于以恒定的周转率大规模地生产工程化的免疫细胞的内切核酸酶的选择。
[0138] 递送方法
[0139] 上面描述的不同的方法涉及把CAR引入到细胞中。作为非限定性的实例,可以以由一种质粒载体编码的转基因形式引入所述CAR。所述质粒载体还可以包含筛选标志，其提供用于鉴定和/或筛选接受所述载体的细胞。
[0140] 作为把编码所述多肽的多核苷酸引入到细胞中的结果，可以在细胞中原位合成多肽。备选地,可以在细胞外面生产所述多肽然后将其引入到细胞。用于把多核苷酸构建体引入到细胞中的方法是本领域中已知的，并且作为非限定性的实例，包括稳定转化方法，其中把多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中，瞬时转化方法，其中不把多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中，和病毒介导的方法。可以通过例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒属)、脂质体等等把所述多核苷酸引入细胞中。例如,瞬时转化方法包括例如显微注射、电穿孔或粒子轰击。鉴于在细胞中被表达，所述多核苷酸可以被包括在载体中,更特别地包括在质粒或病毒中。
[0141] 工程化的免疫细胞
[0142] 本发明也涉及容易通过所述方法将细胞工程化而得到的分离的细胞或细胞系。特别地，按照上面描述的那样，所述分离的细胞包含至少一个CAR。在另一个实施方式中,所述分离的细胞包含CAR群，其每一种包含不同的胞外配体结合结构域。特别地,所述分离的细胞包含编码CAR的外源性多核苷酸序列。本发明的遗传修饰的免疫细胞是活化的并且独立于抗原结合机制而增殖。
[0143] 在本发明的保护范围中也包括分离的免疫细胞,优选地根据先前描述的任意一种方法得到的T细胞。所述免疫细胞是指在功能上参与先天的和/或适应性的免疫应答的启动和/或执行的造血来源的细胞。根据本发明所述免疫细胞可以源自于干细胞。所述的干细胞可以是成熟的干细胞、非人胚胎干细胞,更特别地是非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导的多潜能干细胞、全能性干细胞或造血干细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞还可以是树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、NK-细胞、B细胞或选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性的T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞组成的组的T细胞。在另一个实施方式中,所述细胞可以源自于由CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞组成的组。在本发明所述的细胞扩增和遗传修饰之前,可以通过多种非限定性的方法从受试者中获得细胞来源。可以从许多非限定性的来源获得细胞，这些来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中,可以使用本领域技术人员可得到的和已知的许多T细胞系。在另一个实施方式中,所述细胞可以源自于健康的供体、被诊断患有癌症的患者或被诊断患有感染的患者。在另一个实施方式中,所述细胞是呈现不同的表型特征的混合细胞群的一部分。在本发明所述的保护范围中还包括从根据先前所述方法的转化T细胞获得的细胞系。对抑制免疫的治疗有抗性并且容易通过先前的方法得到的修饰的细胞被包括在本发明所述的保护范围中。
[0144] 作为优选的实施方式,本发明提供具有上面描述的ROR1 CAR的T细胞或T细胞群,其不表达功能性TCR并且对于ROR1阳性细胞是反应性的，用于将它们同种异体移植到患者中。
[0145] T细胞的活化和扩增
[0146] 无论在T细胞的遗传修饰之前还是之后,即使本发明所述的遗传修饰的免疫细胞是活化的并且独立于抗原结合机制而增殖,可以一般地使用例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,
318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中描述的方法，进一步将本发明所述的免疫细胞(特别地T细胞)活化和扩增。可以使T细胞在体外或体内扩增。
318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中描述的方法，进一步将本发明所述的免疫细胞(特别地T细胞)活化和扩增。可以使T细胞在体外或体内扩增。
[0147] 一般地,通过与刺激CD3 TCR复合物的作用剂和T细胞表面上的共刺激分子接触以产生关于T细胞的活化信号，来使本发明所述的T细胞扩增。例如,可以使用化学品例如钙离子载体A23187、佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)或促有丝分裂的凝集素样植物凝集素(PHA)来产生T细胞的活化信号。
[0148] 作为非限定性的实例,通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触,或者通过与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)和钙离子载体一起接触，可以在体外刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子,使用结合所述的辅助分子的配体。例如,可以使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体在适合于刺激T细胞增殖的条件下接触。适合于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5,(Lonza))，其可以包含增殖和生存所必需的因子,包括血清(例如胎牛或人血清)、干扰素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp和TNF-或熟练技术人员已知用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但是不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer,其含有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素,是不含血清的或者是补充有合适数量的血清(或血浆)或确定组的激素和/或足够T细胞生长和扩增的数量的细胞因子。仅仅在实验性的培养物中,而不是在将要被输注到受试者中的细胞培养物中包含青霉素和链霉素。在支持生长所必需的条件下，例如合适的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)下保持靶细胞。已经被暴露于变化的刺激时间的T细胞可能展示不同的特征。
[0149] 在另一种特定的实施方式中,通过与组织或细胞共培养可以使所述细胞扩增。还可以使所述细胞在体内(例如在把所述细胞施用到受试者中以后，在受试者的血液中)扩增。
[0150] 治疗性应用
[0151] 在另一个实施方式中,通过先前描述的不同方法得到的分离的细胞或来源于所述分离的细胞的细胞系可以用作药物。在另一个实施方式中,可以使用所述药物用于治疗癌症,特别地用于治疗需要治疗的患者中的B细胞淋巴瘤和白血病。在另一个实施方式中,可以把根据本发明所述分离的分离的细胞或来源于所述分离的细胞的细胞系用于生产用于治疗需要治疗的患者中癌症的药物中。
[0152] 在另一个方面中,本发明依靠用于治疗需要治疗的患者的方法,所述方法包含至少一个下列步骤:
[0153] (a)提供能够通过任意一种先前描述的方法获得的免疫细胞；
[0154] (b)向所述患者施用所述转化的免疫细胞。
[0155] 在一个实施方式中,本发明所述T细胞可以发生稳健的体内T细胞扩增并且可以持续延长数量的时间。
[0156] 所述治疗可以是改善性的、治愈性的或预防性的。它可以或者是自体免疫疗法的一部分，或者是同种异体免疫疗法治疗的一部分。自体的意指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群来自于所述患者或来自于人白细胞抗原(HLA)相容的供体。同种异体的意指用于治疗患者的细胞或细胞群不来自于所述患者而是来自于供体。
[0157] 在先前的部分中描述了可以与所述的公开的方法一起使用的细胞。可以使用所述治疗来治疗被诊断的患者，在该患者中前恶性的或恶性的癌症状况的特征在于ROR1表达细胞,特别地特征在于过多的ROR1表达细胞。在血液学癌症,例如白血病或恶性淋巴组织增生病症中发现了这样的状况。
[0158] 白血病可以是急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和脊髓发育不良综合征。
[0159] 淋巴组织增生性病症可以是淋巴瘤,特别是慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。
[0160] 根据一个优选的实施方式,提供所述工程化的T细胞，用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。
[0161] 根据另一个优选的实施方式,在输注ROR1-CAR-T细胞之前，向淋巴已经被消耗的患者施用所述CLL或SLL治疗。通常通过化学疗法,并且优选地通过使用药物如氟达拉滨(F)、环磷酰胺(C)、苯达莫司汀(B)或利妥昔单抗(R)或其组合来进行所述淋巴消耗。典型地,在施用CAR-T细胞之前，可以使用εR或FBR的组合用于淋巴消耗。
[0162] 根据另一个优选的实施方式,提供所述工程化的T细胞用于治疗具有t(1；19)染色体易位的套细胞淋巴瘤(MCL),急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。
[0163] 可以被治疗的癌症可以包括非实体肿瘤(例如血液学肿瘤,包括但不限于前B ALL(小儿指征)、成年人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤等等。将要采用本发明所述的CAR治疗的癌症类型包括但是不限于白血病或淋巴恶性肿瘤。也包括成年人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。
[0164] 也可以通过本发明所述的CAR治疗实体瘤例如乳房、结肠、肺和肾脏肿瘤。还可以使用本发明的工程化T细胞作为对胰腺、肾或卵巢癌症的治疗。
[0165] 可以把根据本发明所述的采用工程化的免疫细胞的治疗与选自抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法组的一种或更多种抗癌疗法组合。
[0166] 根据本发明的一个优选的实施方式,可以把所述治疗施用到正在进行免疫抑制治疗的患者中。实际上,本发明优选地依靠细胞或细胞群，由于对编码关于这样的免疫抑制剂的受体的基因的失活，已经使得该细胞或细胞群变成对至少一种免疫抑制剂有抗力。在这个方面中,免疫抑制的治疗将要帮助在所述的患者体内对根据本发明所述的T细胞的挑选和扩增。
[0167] 可以以任何方便的方式来进行根据本发明所述的细胞或细胞群的施用,所述方式包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可以以皮下方式、以皮内方式、以肿瘤内方式、以结内方式、以髓内方式、以肌内内方式、通过静脉内或淋巴内注射或以腹膜内方式，向患者施用本文中描述的组合物。在一个实施方式中,优选地通过静脉内注射施用本发明所述的细胞组合物。
[0168] 施用所述的细胞或细胞群可以由施用104-109个细胞/kg体重,优选地105至106个细胞/kg体重(包括在那些范围之内全部整数值的细胞数目)组成。可以以一个或更多个剂量施用所述的细胞或细胞群。在另一个实施方式中,以单剂量施用所述有效量的细胞。在另一个实施方式中,以在一段时间上多于一个剂量的形式施用有效量的所述细胞。施用的时间安排在管理医师的判断范围之内并且取决于患者的临床状况。可以从任何来源例如血库或供体获得所述的细胞或细胞群。虽然个人需要变化,但是针对特定的疾病或状况确定给定的细胞类型的最佳的有效量范围在本领域的技术范围之内。有效量意指提供治疗性或预防性益处的数量。施用的剂量将会取决于接受者的年龄、健康情况和体重、同时进行的治疗的类型(如果有的话)、治疗的频度和想要的效果的本质。
[0169] 在另一个实施方式中,以肠胃外方式施用所述有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。所述施用可以是静脉内施用。可以通过在肿瘤之内注射来直接地进行所述施用。
[0170] 在本发明的某些实施方式中,和许多有关的治疗形式一起(例如在之前、同时或在以后)向患者施用细胞，该治疗形式包括但是不限于采用作用剂的治疗例如针对MS患者的抗病毒治疗、西多福韦(cidofovir)和白介素-2、阿糖胞苷(也被称为ARA-C)或nataliziimab治疗或针对牛皮癣患者的efaliztimab治疗或针对PML患者的其它治疗。在进一步的实施方式中，可以与化学疗法、放射、免疫抑制剂例如环孢菌素、咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫消除剂例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射组合使用本发明所述的T细胞。这些药物或者抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或者抑制对于生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Henderson,Naya等人1991；Liu,Albers等人1992；Bierer,Hollander等人1993)。在进一步的实施方式中,和骨髓移植、使用化学治疗剂例如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外部束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体例如OKT3或CAMPATH一起(例如在之前、同时地或在之后)，向患者施用本发明所述的细胞组合物。在另一个实施方式中,在B细胞消融疗法例如与CD20反应的作用剂例如Rituxan以后，施用本发明所述的细胞组合物。例如,在一个实施方式中,受试者可以承受采用高剂量化学疗法的标准治疗，随后承受周围血液干细胞移植。在某些实施方式中,在移植以后,受试者接受本发明所述的扩增的免疫细胞的输注。在一种另外的实施方式中，在手术之前或以后施用扩增的细胞。
[0171] 其它定义
[0172] -除非另外指定,“一个”、“一种”、“所述的”和“至少一个(种)”可被互换地使用并且意指一个(种)或多于一个(种)。在本文中根据单字母密码命名多肽序列中的氨基酸残基,其中例如Q意指Gln或谷氨酰胺残基,R意指Arg或精氨酸残基以及D意指Asp或天冬氨酸残基。
[0173] -氨基酸替代意指一个氨基酸残基被另一个替换,例如在一个肽序列中一个精氨酸残基被一个谷氨酰胺残基替换是一种氨基酸替代。
[0174] -按照下列命名核苷酸:使用单字母密码来命名核苷的碱基:a是腺嘌呤,t是胸腺嘧啶,c是胞嘧啶,以及g是鸟嘌呤。对于简并的核苷酸,r代表g或a(嘌呤核苷酸),k代表g或t,s代表g或c,w代表a或t,m代表a或c,y代表t或c(嘧啶核苷酸),d代表g、a或t,v代表g、a或c,b代表g、t或c,h代表a、t或c,以及n代表g、a、t或c。
[0175] -正如在本文中使用的那样“, 核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸,例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段以及通过连接、分裂、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任意一种产生的片段。核酸分子可以由单体组成，该单体是天然地存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然地存在的核苷酸的类似物(例如天然地存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合。修饰的核苷酸可以在糖部分中和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括例如一个或更多个羟基被卤素、烷基、胺和叠氮基替换,或糖可以被官能化成醚或酯。而且,全部糖部分可以被在空间上和在电子上类似的结构例如氮杂糖和碳环糖类似物替换。在碱基部分中修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶,或其它众所周知的杂环取代。可以通过磷酸二酯键或这样的键的类似物连接核酸单体。核酸可以或者是单链的或者是双链的。
[0176] -嵌合抗原受体(CAR)意指分子，它把对抗靶细胞上存在的组件的结合结构域(例如基于抗体的对于所要的抗原(例如肿瘤抗原)的特异性)与T细胞受体活化的胞内结构域组合而产生展示特异性的抗靶细胞免疫活性的嵌合蛋白。一般地,CAR由与T细胞抗原受体复合物ζ链的胞内信号传导结构域(scFvFc:ζ)融合的胞外单链抗体(scFvFc)组成，并且当在T细胞中被表达时，具有基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识别的能力。在本发明中使用的CAR的一个实例是针对ROR1抗原定向的CAR并且作为非限定性的实例，可以包含氨基酸序列:SEQ ID NO:79至138。
[0177] -术语“内切核酸酶”是指能够催化DNA或RNA分子,优选地DNA分子之内核酸之间的键的水解(切割)的任何野生型或变体酶。内切核酸酶不切割无关它的序列的DNA或RNA分子，而是识别和切割在特异性的多核苷酸序列处(进一步被称为“靶序列”或“靶位点”)的DNA或RNA分子。当其典型地具有长度大于12个碱基对(bp),更优选地14-55bp的多核苷酸识别位点时，内切核酸酶可以被分类为罕见切割的内切核酸酶。罕见切割的内切核酸酶通过在确定的位点诱导DNA双链断裂(DSB)而显著地增大了HR(Perrin,Buckle等人1993；Rouet,Smih等人1994；Choulika,Perrin等人1995；Pingoud和Silva 2007)(Perrin,Buckle等人1993；Rouet,Smih等人1994；Choulika,Perrin等人1995；Pingoud和Silva 2007)。罕见切割的内切核酸酶例如可以是归巢内切核酸酶(Perrin,Buckle等人1993；Rouet,Smih等人
1994；Choulika,Perrin等人1995；Pingoud和Silva 2007)、由工程化的锌指结构域与限制性内切酶(例如FokI(Paques and Duchateau 2007)、来自CRISPR系统(Porteus和Carroll
2005)的Cas9内切核酸酶或化学内切核酸酶(Gasiunas,Barrangou等人2012；Jinek,Chylinski等人2012；Cong,Ran等人2013；Mali,Yang等人2013))的催化结构域的融合产生的嵌合锌指核酸酶(ZFN)。在化学内切核酸酶中,使化学或肽切割剂与核酸聚合物缀合，或者与识别特异性靶序列的另一种DNA缀合,从而把切割活性靶到特异性的序列。化学内切核酸酶还包括已知结合特异性的DNA序列的合成的核酸酶像邻二氮杂菲、DNA切割分子和形成三联体的寡核苷酸(TFO)的缀合物(Kalish and Glazer 2005)。根据本发明，这样的化学内切核酸酶被包括在术语“内切核酸酶”内。
1994；Choulika,Perrin等人1995；Pingoud和Silva 2007)、由工程化的锌指结构域与限制性内切酶(例如FokI(Paques and Duchateau 2007)、来自CRISPR系统(Porteus和Carroll
2005)的Cas9内切核酸酶或化学内切核酸酶(Gasiunas,Barrangou等人2012；Jinek,Chylinski等人2012；Cong,Ran等人2013；Mali,Yang等人2013))的催化结构域的融合产生的嵌合锌指核酸酶(ZFN)。在化学内切核酸酶中,使化学或肽切割剂与核酸聚合物缀合，或者与识别特异性靶序列的另一种DNA缀合,从而把切割活性靶到特异性的序列。化学内切核酸酶还包括已知结合特异性的DNA序列的合成的核酸酶像邻二氮杂菲、DNA切割分子和形成三联体的寡核苷酸(TFO)的缀合物(Kalish and Glazer 2005)。根据本发明，这样的化学内切核酸酶被包括在术语“内切核酸酶”内。
[0178] -“TALE核酸酶”(TALEN)意指由典型地来源于转录活化剂样效应子(TALE)的核酸结合结构域和一个用来切割核酸靶序列的核酸酶催化结构域组成的融合蛋白。所述的催化结构域优选地是核酸酶结构域以及更优选地是具有内切核酸酶活性的结构域,如例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在特定的实施方式中,可以把TALE结构域融合到大范围核酸酶如例如I-CreI和I-OnuI或其功能性变体。在更加优选的实施方式中,所述核酸酶是单体TALE-核酸酶。单体TALE核酸酶是一种TALE核酸酶，其不需要用于特异性识别和切割的二聚化,例如在WO2012138927中描述的工程化TAL重复单元与I-TevI的催化结构域的融合体。转录活化剂样效应子(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属的蛋白质，其包含许多重复序列,每一个重复序列在第12和13位包含对所述的核酸靶序列的每一个核苷酸碱基特异性的二残基(RVD)。具有相似的模块碱基/碱基核酸结合性质的结合结构域(MBBBD)还可以源自于最近由申请人在不同的细菌物种中发现的新的模块蛋白质。所述的新的模块蛋白质具有展示比TAL重复单元更多序列可变性的优点。优选地,与识别不同的核苷酸有关的RVD是用于识别C的HD、用于识别T的NG、用于识别A的NI、用于识别G或A的NN、用于识别A、C、G或T的NS、用于识别T的HG、用于识别T的IG、用于识别G的NK、用于识别C的HA、用于识别C的ND、用于识别C的HI、用于识别G的HN、用于识别G的NA、用于识别G或A的SN和用于识别T的YG、用于识别A的TL、用于识别A或G的VT和用于识别A的SW。在另一个实施方式中,可以把关键的氨基酸12和13朝向其它氨基酸残基突变，以便调节它们对于核苷酸A、T、C和G的特异性以及特别地以便增强这种特异性。TALE核酸酶已经被描述并且被用于刺激基因寻靶和基因修饰(Boch,Scholze等人2009；Moscou and Bogdanove2009；Christian,Cermak等人2010；Li,Huang等人2011)。根据商品名TALENTM(Cellectis,8rue de la Croix Jarry,75013巴黎,法国)可在市场上买到定制的TAL核酸酶。
[0179] 根据本发明所述的罕见切割的内切核酸酶还可以是Cas9内切核酸酶。最近,已经基于来自II型原核CRISPR(群集的有规则地间隙的短回文序列重复单元)适应性免疫系统的RNA指导的Cas9核酸酶(Gasiunas,Barrangou等人2012；Jinek,Chylinski等人2012；Cong,Ran等人2013；Mali,Yang等人2013)发展了新的基因组工程化工具(参见综述(Sorek,Lawrence等人2013))。首次在细菌中发现了所述CRISPR相关的(Cas)系统并且其发挥着防御外源DNA(病毒或者质粒的)的功能。CRISPR介导的基因组工程化首先通过筛选靶序列来进行，该靶序列常常侧翼有短序列基序,其被称为原间隔区相邻的基序(PAM)。在靶序列筛选以后,把与这种靶序列互补的特异性的crRNA工程化。在II型CRISPR系统中所需要的反式激活的crRNA(tracrRNA)与crRNA配对并且与所提供的Cas9蛋白结合。Cas9起着分子锚的作用，促进tracRNA与cRNA的碱基配对(Deltcheva,Chylinski等人2011)。在这种三元复合物中,双tracrRNA:crRNA结构起着指导RNA的作用，其把内切核酸酶Cas9定向到同源的靶序列。经由Cas9-tracrRNA:crRNA复合物的靶识别是通过扫描靶序列和crRNA之间靶序列的同源性而启动的。除了所述的靶序列-crRNA互补性之外,DNA寻靶需要与原间隔区邻接的短基序(原间隔区相邻基序-PAM)的存在。在所述的双-RNA和靶序列之间配对以后,Cas9随后在PAM基序的上游3个碱基处引入平末端的双链断裂(Garneau,Dupuis等人2010)。
[0180] 罕见切割的内切核酸酶可以是归巢内切核酸酶,也以大范围核酸酶的名字被人知晓。这样的归巢内切核酸酶是本领域中众所周知的(Stoddard2005)。归巢内切核酸酶识别DNA靶序列并且产生单或双链断裂。归巢内切核酸酶是高度特异性的,识别长度范围从12至45个碱基对(bp),通常长度范围从14到40个bp的DNA靶位点。根据本发明所述的归巢内切核酸酶例如可以对应于LAGLIDADG内切核酸酶、HNH内切核酸酶、或GIY-YIG内切核酸酶。根据本发明优选的归巢内切核酸酶可以是I-CreI变体。
[0181] -“递送载体”意指可以被用于本发明中以使在本发明中需要的作用剂/化学试剂和分子(蛋白质或核酸)进入细胞接触(即“接触”)中或将其递送到细胞或亚细胞区室(即“引入”)内部的任何递送载体。它包括但是不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载体、聚合物载体、脂质复合体、多复合体、树枝状聚合物、微泡(超声造影剂)、纳米微粒、乳液或其它合适的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学试剂、大分子(基因、蛋白质)或其它载体例如质粒、经由Diatos开发的肽。在这些情形中,递送载体是分子载体。“递送载体”也意指用来进行转染的递送方法。
[0182] -术语“载体”是指能够输送已经与它连接的另一种核酸的一种核酸分子。在本发明中“载体”包括但是不限于病毒载体、质粒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可以由染色体的、非染色体的、半合成的或合成的核酸组成。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达与它们连接的核酸的那些载体(表达载体)。大量的合适的载体是本领域技术人员已知的并且是市场上可买到的。
[0183] 病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒属、细小病毒属(例如腺伴随病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒例如正黏病毒(例如流感病毒属)、弹状病毒(例如狂犬病和水泡性口炎病毒)、副黏病毒(例如麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒例如微小RNA病毒和甲病毒属,以及双链DNA病毒，包括腺病毒属、疱疹病毒(例如I型和II型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如疫苗、禽痘和金丝雀痘)。其它病毒例如包括诺沃克病毒、披膜病毒、黄热病病毒、呼肠弧病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括:禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields等人编辑,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
[0184] -“慢病毒载体”意指基于HIV的慢病毒载体，其是非常有希望用于基因递送的，因为它们的相对大的包装容量、减小的免疫原性和它们以高效率稳定地转导大范围的不同细胞类型的能力。慢病毒载体通常是在把三种(包裹、包封和转移)或更多种质粒瞬时转染到生产者细胞中以后产生的。像HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体的相互作用进入靶细胞。一旦进入,病毒RNA发生由病毒逆转录酶复合物介导的反转录。反转录的产物是双链线性病毒DNA,它是被感染细胞的DNA中病毒整合的底物。作为非限定性的实例，“整合的慢病毒载体(或LV)”意指这样的载体，其能够整合靶细胞的基因组。处于对立面，“非整合的慢病毒载体(或NILV)”意指没有通过病毒整合酶的作用整合靶细胞基因组的有效的基因递送载体。
[0185] -可以把递送载体和载体与任何细胞透化技术例如超声穿孔或电穿孔或这些技术的衍生物联合或组合。
[0186] -细胞意指任何真核的活细胞、原代细胞和来源于这些生物体用于体外培养的细胞系。
[0187] -“原代细胞”意指直接从活组织(活体检查材料)获得并且建立用于体外生长的细胞,其已经经历很少的群加倍并且因此与连续的发生肿瘤的或人工地无限增殖的细胞系相比，更加代表来自它们所源自的组织的主要功能性组件和特征。
[0188] 作为非限定性的实例，细胞系可以选自由下列组成的组:CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞、U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；Jurkat细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞。
[0189] 可以通过本发明所述的方法修饰所有这些细胞系以提供用来生产、表达、定量、检测、研究目的基因或蛋白的细胞系模型；还可以使用这些模型来在研究和生产以及各种领域例如化学制剂、生物燃料、治疗学和农艺学中筛选生物学上活性的目的分子，作为非限定性的实例。
[0190] -“突变”意指在多核苷酸(cDNA,基因)或多肽序列中最多一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、二十个、二十五个、三十个、四十个、五十个或更多个核苷酸/氨基酸的替代、缺失、插入。所述的突变可以影响基因的编码序列或它的调节序列。它也可能影响基因组序列的结构或编码的mRNA的结构/稳定性。
[0191] -就“变体”来说，它意指重复变体、变体、结合DNA的变体、TALE核酸酶变体、通过母体分子的氨基酸序列中至少一个残基的突变或替换而得到的多肽变体。
[0192] -“功能性变体”意指蛋白质或蛋白质结构域的具有催化活性的突变体；与它的亲本蛋白质或蛋白质结构域或附加性能比较，这样的突变体可以具有相同的活性或较高的或较低的活性。
[0193] -“同一性”是指在两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较为了比较的目的被比对的每一个序列中的位置来测定同一性。当在被比较的序列中的一个位置被相同的碱基占据时，则在该位置处，所述的分子是相同的。在核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性的程度是被所述的核酸序列具有的多个位置处相同或匹配的核苷酸数目的函数。可以使用各种比对算法和/或程序来计算两个序列之间的同一性,包括FASTA或BLAST，可以利用其作为GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的一部分,并且可以采用例如默认设置来使用它们。例如,考虑与本文中描述的特异性多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选地实质上展示相同的功能的多肽以及编码这样的多肽的多核苷酸。除非另有指示，相似性得分将会基于使用BLOSUM62。当使用BLASTP时,相似性％基于BLASTP正的得分并且序列同一性％基于BLASTP同一性得分。
BLASTP“同一性”显示在高得分序列对中相同的总残基数目和分数；而BLASTP“正的”显示具有正值的比对得分并且彼此相似的残基的数目和分数。本公开考虑和包括与本文中公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中间的同一性或相似性程度的氨基酸序列。利用遗传密码推断了类似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过传统方法,特别地通过利用遗传密码逆翻译它的氨基酸序列得到它们。
BLASTP“同一性”显示在高得分序列对中相同的总残基数目和分数；而BLASTP“正的”显示具有正值的比对得分并且彼此相似的残基的数目和分数。本公开考虑和包括与本文中公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中间的同一性或相似性程度的氨基酸序列。利用遗传密码推断了类似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过传统方法,特别地通过利用遗传密码逆翻译它的氨基酸序列得到它们。
[0194] -“信号转导结构域”或“共刺激配体”是指在抗原呈递细胞上的分子，其特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子,从而除了通过例如使TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子结合而提供的初始信号之外，还提供一种信号,其介导T细胞应答，包括但不限于增殖活化、分化等等。共刺激配体可以包括但是不局限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘着分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性地结合的配体。共刺激配体也包括与存在于T细胞上的共刺激分子(例如但不限于CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3)特异性地结合的抗体、与CD83特异性地结合的配体。
[0195] “共刺激分子”是指T细胞上的同源结合组件，其与共刺激配体特异性地结合，从而经由所述的细胞介导共刺激应答,例如但不限于增殖。共刺激分子包括但是不限于I类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。
[0196] 正如本文中所用的那样，“共刺激信号”是指一种信号,其与初始信号例如TCR/CD3连接组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
[0197] 正如本文中所用的那样，术语“胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地,所述的结构域将会能够与细胞表面分子相互作用。例如,可以选择胞外配体结合结构域，使其识别充当在靶细胞上与特定的疾病状态有关的细胞表面标志的配体。因此，可以充当配体的细胞表面标志的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自体免疫疾病和癌细胞有关的那些标志。
[0198] 正如本文中所用的那样，术语“受试者”或“患者”包括动物界的所有成员，包括非人灵长类和人在内。
[0201] 提供以上描述以确保本领域技术人员制造和使用本发明,并且以上描述是在特定的应用以及它的要求的背景中被提供的。对优选的实施方式的各种修饰将会对本领域技术人员是显而易见的,并且在不偏离本发明所述的精髓和保护范围的情况下，在本文中定义的一般原理可以被应用于其它实施方式和应用。因此,本发明意图不局限于所示的实施方式,而是与最宽的保护范围相符合，与本文中公开的原理和特征一致。
[0202] 已经一般性地描述了本发明,通过参考某些具体的实施例可以获得进一步的理解,在本文中仅仅为了阐明的目的提供这些具体的实施例,并且除非另外指定，这些具体的实施例意图不是限定性的。
[0203] 一般方法
[0204] 原代细胞
[0205] 通过密度梯度离心从来自健康的志愿者供体的血沉棕黄层中分离了外周血单核细胞(Etablissement Francais du Sang)。然后使用EasySep人T细胞富集试剂盒(Stemcell Technologies)纯化了T淋巴细胞,并且采用在补充有20ng/ml IL-2(Miltenyi)和5％人AB血清(Seralab)的X-vivo 15培养基(Lonza)中的Dynabeads人T-活化剂CD3/CD28(Life Technologies)活化。
[0206] 细胞系
[0207] K562、Jeko-1、MDA-MB-231、PC-3和MCF-7细胞系是从美国典型培养物保藏中心获得的。在补充有10％热灭活的FCS、2mmol/L L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素和100μg/mL链霉素的IMDM中培养K562细胞。在补充有20％热灭活的FCS、2mmol/L L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI中培养Jeko-1细胞。在补充有10％热灭活的FCS、2mmol/L L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中培养MDA-MB-231细胞。在补充有10％热灭活的FCS、2mmol/L L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素和100μg/mL链霉素的F-12K中培养PC-3细胞。在补充有10％热灭活的FCS、2mmol/L L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素和100μg/mL链霉素以及0.01mg/ml人胰岛素的DMEM中培养MCF-7细胞。
[0208] ROR1细胞表面表达的定量
[0209] 按照生产商的说明书使用单克隆抗ROR1抗体克隆2A(Miltenyi)和Dako QiFIKIT，通过饱和结合测定了在不同的人细胞系上ROR1表面分子的数目。
[0210] 编码scCAR的DNA的合成
[0211] 通过GenScript合成了编码scCAR的DNA。
[0212] 用于scCAR的体外转录mRNA载体的构建
[0213] 在质粒pCLS9632中在T7启动子和BGH poly A之间克隆了编码scCAR的DNA。
[0214] RNA体外转录
[0215] 使用mMessage mMachine T7Ultra试剂盒(Life technologies)遵照生产商的说明书，在体外转录了编码scCAR的mRNA并且使其聚腺苷酸化。采用RNeasy柱子(Qiagen)纯化RNA,在细胞穿孔培养基T(Harvard Apparatus)中洗脱,并且通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计测定在260nm处的吸光度来定量。在变性甲醛/MOPS琼脂糖凝胶上证实了所述的RNA的品质。
[0216] T细胞的RNA电穿孔
[0217] 活化后4-5天或11-12天,使用AgilePulse MAX系统(Harvard Apparatus)通过电转移信使RNA来转染T淋巴细胞。使5x106个细胞与15μg编码scCAR的mRNA混合到0.4cm样品池中。按照在WO2013176915中提出的实验规程进行电穿孔。在电穿孔以后,把细胞稀释到培养基中并且在37℃/5％CO2下培育。
[0218] scCAR的检测
[0219] 通过流式细胞术:采用PE标记的多克隆山羊抗小鼠(Fab)2抗体(Jackson Immunoresearch)或生物素标记的蛋白L(GenScript)随后藻红蛋白标记的链霉亲和素(BD pharmingen)将T细胞染色,最后使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)进行分析。
[0220] 通过蛋白质印迹:在包含1mM原钒酸盐、3μg/ml蛋白酶抑制剂和2mMPMSF的50μl RIPA缓冲液中对1x106个T细胞进行细胞溶解。通过SDS-PAGE在Any kDTM丙烯酰胺凝胶(BioRad)上分离细胞裂解液。在转移到硝化纤维素膜以后,将其与小鼠抗人CD3z(pharmingen)一起培育，然后与山羊抗小鼠IgG辣根过氧化酶缀合的抗体(Sigma)一起培育。通过使用ECL试剂盒(Pierce)显示了抗体结合。
[0221] 脱粒试验
[0222] 将5×104个T细胞与5×104个ROR1阳性的或ROR1阴性的细胞以0.1ml/孔在96-孔板中共培养。在共培养开始时，除了1μg/ml抗CD49d(BD Biosciences)、1μg/ml抗CD28(Miltenyi)和1x莫能菌素溶液(eBioscience)之外，还添加APC标记的抗CD107a(BD Biosciences)。在培育6h以后,采用可固定的生存力染料(eBioscience)和vioblue标记的抗CD8(Miltenyi)染色细胞并且使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)进行分析。脱粒的细胞毒性T细胞对应于CD8+CD107a+细胞。
[0223] 细胞因子释放试验
[0224] 将5x104个T细胞与5x104个ROR1阳性的或ROR1阴性的细胞以0.1ml/孔在96-孔板中共培养。在培育24小时以后,收集培养上清液并且分析IFNγROR1阳性的或ROR1阴性的细胞。
[0225] 细胞毒性试验
[0226] 对于附着的靶细胞:把2x104个ROR1阳性的或ROR1阴性的细胞以0.1ml/孔接种在96孔板中。在铺板后的第二天,采用CellTrace CFSE标记ROR1阳性的和ROR1阴性的细胞并且与4x105个T细胞共培养4小时。然后收获所述的细胞,采用可固定的生存力染料(eBioscience)染色并且使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)进行分析。
[0227] 使用下式计算特异性裂解的百分比:
[0228]标记ROR1阳性的和ROR1阴性的细胞。把大约2x104个ROR1阳性的细胞与2x104个ROR1阴性的细胞与4x105个T细胞以0.1ml/孔在96孔板中共培养。在培育4小时以后,收获所述的细胞,采用可固定的生存力染料(eBioscience)染色并且使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)进行分析。
[0229] 使用上式计算特异性裂解的百分比。实施例
[0230] CAR多肽序列的实施例：
[0231] 此后,呈列了60种ROR1 scCAR的序列SEQ ID NO.79至138(含有肽信号)。这些具有V1至V6的CAR结构和来自8种不同抗体的scFv:2A2、4A5、D10、G6、G3、H10、2A4和1C11。
[0232] 在下列实验中分析了形式V1、V3和V5(含有CD8α跨膜结构域的scCAR)，含有2A2 scFv的scCAR除外,对其仅仅测试了V1形式(作为基准用于比较),这个具有与Hudecek等人所描述的(2013)相同的结构。
[0233] 框架序列对应于优选的VH和VL序列。然而,可以交换VH和VL以改善根据本发明的CAR效率。
[0234] 2A2 v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.79)
[0235]
[0236] 2A2 v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.80)
[0237]
[0238]
[0239] 2A2 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.81)
[0240]
[0241] 2A2 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.82)
[0242]
[0243] 2A2 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.83)
[0244]
[0245] 2A2 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.84)
[0246]
[0247] 4A5 v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.85)
[0248]
[0249]
[0250] 4A5 v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.86)
[0251]
[0252] 4A5 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.87)
[0253]
[0254] 4A5 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.88)
[0255]
[0256]
[0257] 4A5 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.89)
[0258]
[0259] 4A5 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.90)
[0260]
[0261] D10 v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.91)
[0262]
[0263] D10 v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.92)
[0264]
[0265] D10 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.93)
[0266]
[0267] D10 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.94)
[0268]
[0269] D10 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.95)
[0270]
[0271] D10 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.96)
[0272]
[0273]
[0274] 人源化的D10-V1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.97)
[0275]
[0276] 人源化的D10-V2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.98)
[0277]
[0278] 人源化的D10-V3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.99)
[0279]
[0280]
[0281] 人源化的D10-V4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.100)
[0282]
[0283] 人源化的D10-V5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.101
[0284]
[0285] 人源化的D10-V6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.102)
[0286]
[0287] G6v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.103)
[0288]
[0289] G6v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.104)
[0290]
[0291]
[0292] G6 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.105)
[0293]
[0294] G6 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.106)
[0295]
[0296] G6 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.107)
[0297]
[0298]
[0299] G6 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.108)
[0300]
[0301] G3 v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.109)
[0302]
[0303] G3 v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.110)
[0304]
[0305] G3 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.111)
[0306]
[0307] G3 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.112)
[0308]
[0309]
[0310] G3 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.113)
[0311]
[0312] G3 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.114)
[0313]
[0314] H10 v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.115)
[0315]
[0316]
[0317] H10 v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.116)
[0318]
[0319] H10 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.117)
[0320]
[0321] H10 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.118)
[0322]
[0323]
[0324] H10 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.119)
[0325]
[0326] H10 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.120)
[0327]
[0328]
[0329] 人源化的H10-v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.121)
[0330]
[0331] 人源化的H10-v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.122)
[0332]
[0333] 人源化的H10-v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.123)
[0334]
[0335]
[0336] 人源化的H10-v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.124)
[0337]
[0338] 人源化的H10-v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.125)
[0339]
[0340] 人源化的H10-v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.126)
[0341]
[0342] 2A4 v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.127)
[0343]
[0344] 2A4 v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.128)
[0345]
[0346]
[0347] 2A4 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.129)
[0348]
[0349] 2A4 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.130)
[0350]
[0351] 2A4 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.131)
[0352]
[0353]
[0354] 2A4 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.132)
[0355]
[0356] 1C11 v1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.133)
[0357]
[0358] 1C11 v2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.134)
[0359]
[0360] 1C11 v3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.135)
[0361]
[0362] 1C11 v4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.136)
[0363]
[0364] 1C11 v5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.137)
[0365]
[0366] 1C11 v6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.138)
[0367]
[0368] 实施例1:ROR1阳性的和阴性的细胞系的筛选
[0369] 为了鉴定表达不同的细胞表面表达水平的ROR1的细胞系,通过流式细胞术，使用Qifikit(Dako)和抗人ROR1mAb克隆2A2分析了12种人细胞系(参见材料和方法)。先前已经在文献中描述了这些细胞系中的九种在mRNA或蛋白质水平上对于ROR1是阳性的(表10)。
[0370] 表10:在文献中报道的对于ROR1是阳性的细胞系
[0371]细胞系 描述 细胞类型
MDA-MB-231 贴壁的 乳腺癌
PC-3 贴壁的 前列腺腺癌
MDA-MB-468 贴壁的 乳腺癌
Hs 746T 贴壁的 胃癌
NCI-H1993 贴壁的 非小细胞肺癌
HT-29 贴壁的 结肠直肠腺癌
A549 贴壁的 人肺腺癌
Cal51 贴壁的 乳癌
Jeko-1 悬浮的 套细胞淋巴癌
MDA-MB-231 贴壁的 乳腺癌
PC-3 贴壁的 前列腺腺癌
MDA-MB-468 贴壁的 乳腺癌
Hs 746T 贴壁的 胃癌
NCI-H1993 贴壁的 非小细胞肺癌
HT-29 贴壁的 结肠直肠腺癌
A549 贴壁的 人肺腺癌
Cal51 贴壁的 乳癌
Jeko-1 悬浮的 套细胞淋巴癌
[0372] 流式细胞术结果指示MDA-MB-231( HTB-26)、MDA-MB-468(HTB.132)、Hs746T( HTB-135)和HT-29( HTB-38)细胞表达最高水平的
ROR1细胞表面表达。在PC-3( CRL-1435)、NCI-H1993( CRL 5909)、A549
(ATCC CCL-185)和Jeko-1(ATCC CRL-3006)细胞上检测到较低水平的ROR1细胞表面表达,大约是高表达的细胞系的ROR1细胞表面表达的一半(图5)。
ROR1细胞表面表达。在PC-3( CRL-1435)、NCI-H1993( CRL 5909)、A549
(ATCC CCL-185)和Jeko-1(ATCC CRL-3006)细胞上检测到较低水平的ROR1细胞表面表达,大约是高表达的细胞系的ROR1细胞表面表达的一半(图5)。
[0373] 从这些结果中也观察到:在它们的表面上，MCF-7、K562和T细胞不表达ROR1并且Cal51仅仅表达很低水平的ROR1。
[0374] 从这些细胞系中挑选了三种贴壁的细胞系，用来筛选抗ROR1 scCAR的活性:表达不同水平的ROR1的PC-3和MDA-MB-231细胞以及ROR1阴性的MCF-7细胞。
[0375] 还挑选了两种悬浮细胞系，用来筛选抗ROR1 scCAR的活性:ROR1阳性的Jeko-1细胞和ROR1阴性的K562细胞。
[0376] 实施例2：抗ROR1 scCAR的产生
[0377] 在下列实验中产生和测试了一组18种第二代ROR1特异性的scCAR(图1C)。
[0378] 它们由下列表1-2的构件的融合体产生:
[0379] -来自鼠来源的scFv或来自D10、G6、G3、H10、2A4或1C11的人源化形式；
[0380] -一个间隔区:人FcγRIIIα、CD8α或IgG1铰链；
[0381] -人CD8α的跨膜结构域和人41BB的共刺激结构域；
[0382] -人CD3ζ的活化结构域
[0383] 把不同的scFv用在scCAR中以产生具有不同的结合亲和性和不同的表位特异性的受体。
[0384] mAb D10和G6靶向3’Ig样区和Ig样结构域和ROR1的CRD结构域之间的接头区(图2)[0385] mAb G3、H10和2A4靶向ROR1的IgG样区(图2)
[0386] mAb 1C11靶向ROR1的CRD结构域(图2)。
[0387] 把不同长度的三种间隔区(16AA、45AA和231AA)用在scCAR中，以试图经由ROR1的近端表位和远端表位优化scCAR的接合(Guest等人,2005)。
[0388] 实施例3:抗ROR1 scCAR的体外测试
[0389] 在人原代T细胞中，使用在图6中呈现的两步筛选法测试了先前设计的抗ROR1 scCAR。
[0390] 在所述的筛选方法的第一步中,采用编码早些时候呈现的18种抗ROR1 scCAR的mRNA，把预先采用抗CD28/CD3珠子和IL-2活化了4-5天的原代人T细胞电穿孔。在电穿孔一天后,通过流式细胞术和蛋白质印迹评估scCAR表达,并且通过测定T细胞脱粒来评估scCAR修饰的T细胞活性。挑选通过蛋白质印迹检测的并且在与至少一种ROR1阳性的细胞系共培养时诱导显著的特异性的T细胞脱粒(≥20％)的scCAR，使其经过所述的筛选方法的第二步。
[0391] 在所述的筛选方法的第二步中,采用在第一筛选步骤以后选择的编码抗ROR1 scCAR的mRNA，把预先采用抗CD28/CD3珠子和IL-2活化了11-12天的原代人T细胞电穿孔。在电穿孔一两天后,通过流式细胞术评估scCAR表达,并且通过测定T细胞的效应子功能(脱粒、IFNg生产和细胞裂解活性)来评估scCAR修饰的T细胞活性。挑选在与至少一种ROR1阳性的细胞系共培养时诱导显著的特异性的T细胞脱粒(≥20％)、显著的特异性的T细胞的细胞毒性(≥20％的靶细胞裂解)和显著的经由T细胞的IFNg生产(≥1500pg/ml)的scCAR，作为潜在的scCAR候选者。
[0392] 把上述scCAR与包含和短铰链(SEQ ID NO.79)融合的2A2 scFv的基准scCAR进行系统性地比较，因为先前在Hudecek等人,2013中显示了这种scCAR是功能性的。
[0393] a)scCAR的初步筛选:
[0394] scCAR表达
[0395] 首先,通过蛋白质印迹使用抗人CD3ζmAb在T细胞中评估了抗ROR1 scCAR的总表达。观察到在T细胞裂解物中强烈地检测到包含中间区(CD8α铰链)或长的间隔区(IgG1铰链)的scCAR，无论它们包含什么scFv。然而,对于包含短间隔区(FcγRIIIα)的scCAR，具有G6、G3和H10scFv的那些scCAR被很好地检测到了,而具有D10、2A4和1C11 scFv的那些scCAR被微弱地检测到或没有被检测到(图7A和7B)。
[0396] 然后,通过流式细胞术，使用抗Fab或蛋白L评估了抗ROR1 scCAR在T细胞上的表面表达(图8A和8B)。
[0397] 观察到
[0398] -通过蛋白质印迹在T细胞裂解物中很好地检测到的scCAR D10-v3、D10-v5、G6-v3、G6-v5、G3-v3、G3-v5、H10-v3、H10-v5、2A4-v3和2A4-v5也通过流式细胞术在T细胞表面上被很好地检测到；
[0399] -通过蛋白质印迹在T细胞裂解物中没有或几乎没有检测到的scCARD10-v1、2A4-v1和1C11-v1，通过流式细胞术在T细胞表面上也未被检测到。
[0400] scCAR活性
[0401] 为了评估scCAR活性,在与ROR1阳性的(MDA-MB-231和PC-3)或ROR1阴性的(MCF-7)细胞共培养时，分析了scCAR修饰的T细胞的脱粒。
[0402] 观察到:和在与MCF-7细胞共培养时相比较，在与MDA-MB-231和PC-3细胞共培养时，采用scCAR D10-v1、D10-v3、D10-v5、H10-v1、H10-v3和H10-v5修饰的T细胞显著地更多地脱粒(≥20％)(图9A和9B)。
[0403] 图9A和图9B显示:在与MDA-MB-231、PC-3和MCF-7细胞共培养时，没有修饰的T细胞以及采用scCAR H10和D10修饰的T细胞完全脱粒，比采用scCAR G6、G3、2A4和1C11的好得多。
[0404] 初步筛选的结论:
[0405] 总而言之，这些结果证明:在本发明之内设计的18种抗ROR1 scCAR之中,有6种(D10-v1、D10-v3、D10-v5、H10-v1、H10-v3和H10-v5)满足被挑选的标准，其将经过所述的筛选方法的第二步。
[0406] b)scCAR的第二步筛选
[0407] scCAR表达
[0408] 通过流式细胞术使用蛋白L评估了抗ROR1 scCAR在T细胞上的表面表达。
[0409] 观察到:在活化后4-5天在电穿孔的T细胞上很好地检测到的scCAR D10-v3、D10-v5、H10-v3和H10-v5(图8A和8B)，在活化后11-12天在电穿孔的T细胞上没有被检测到或仅仅被微弱地检测到(图10)。
[0410] scCAR活性
[0411] 首先,为了评估scCAR活性,在与ROR1阳性的(MDA-MB-231、PC-3和Jeko-1)或ROR1阴性的(MCF-7和K562)细胞共培养时，分析了scCAR修饰的T细胞的脱粒。
[0412] 观察到:与采用scCAR D10-v1、H10-v1和H10-v5修饰的T细胞相反，和在与MCF-7细胞共培养时或在单独的培养基中相比较，在与MDA-MB-231和PC-3细胞共培养时，采用scCAR D10-v1、D10-v3、D10-v3、H10-v1、H10-v3和H10-v3修饰的T细胞显著更多地脱粒(≥20％)(图11)。
[0413] 然后在与ROR1阳性的(MDA-MB-231、PC-3和Jeko-1)或ROR1阴性的(MCF-7和K562)细胞共培养时，分析了经由scCAR修饰的T细胞的IFNγ生产。
[0414] 观察到:与采用scCAR D10-v1、H10-v1、H10-v5修饰的T细胞相反，在与MCF-7细胞、K562细胞或单独的培养基共培养时相比较，在与MDA-MB-231、PC-3和Jeko-1细胞共培养时，采用scCAR D10-v3、D10-v5和H10-v3修饰的T细胞显著地生产更多的IFNγ(≥1500pg/ml)(图12)。
[0415] 最后,在与ROR-1阴性的(MCF-7和K562)或ROR1阳性的(MDA-MB-231、PC-3和Jeko-1)细胞共培养时，分析了scCAR修饰的T细胞的细胞毒性活性。
[0416] 观察到:与采用scCAR D10-v1、H10-v1和H10-v5修饰的T细胞相反,采用scCAR D10-v3、D10-v5和H10-v3修饰的T细胞特异性地杀死超过20％的共培养中的PC-3细胞(图13)。尽管采用scCAR D10-v3和H10-v3修饰的T细胞也杀死超过20％的共培养中的MDA-MB-
231和Jeko-1细胞,但是对于采用scCAR D10-v5修饰的T细胞，情况不是这样的(图13和图
14)。
231和Jeko-1细胞,但是对于采用scCAR D10-v5修饰的T细胞，情况不是这样的(图13和图
14)。
[0417] 第二步筛选的结论:
[0418] 总而言之，这些结果证明:从所有测试的scCAR中，D10-v3、D10-v5和H10-v3代表最有价值的scCAR。
[0419] 可以注意到在诱导细胞毒性方面，形式V2的2种CAR的轻微的优势(很好地针对所测试的不同ROR1阳性的细胞系的应答)。
[0420] 实施例4:TCRα失活的表达ROR1 CAR的细胞的增殖
[0421] 图15显示通过使用罕见切割的内切核酸酶的TCRα失活的略图。设计和生产了靶向两个17-bp长序列(被称为半靶)的杂二聚体TALE核酸酶，这两个17-bp长序列被T细胞受体α恒定链区(TRAC)基因内部的15-bp间隔区分开。每一个半靶被列在表11中的半TALE核酸酶的重复序列识别。
[0422] 表11:靶向TCRα基因的TAL核酸酶
[0423]
[0424] 使用限制性内切酶消化，在T7启动子的控制下，在哺乳动物表达载体中亚克隆了每一种TALE核酸酶构建体。从携带T7启动子下游的编码序列的质粒合成编码切割TRAC基因组序列的TALE核酸酶的mRNA。
[0425] 采用编码两种半TRAC_T01 TALE核酸酶的2种mRNA中的每一种，将采用抗CD3/CD28包被的珠子在72小时期间预先活化的纯化的T细胞转染。在转染以后48小时,分别地采用编码先前描述的一种ROR1CAR(SEQ ID NO:79至138)的慢病毒载体转导来自相同供体的不同组的T细胞。在转导后2天,使用抗CD3磁珠纯化CD3NEG细胞，并且在转导后5天，采用可溶性抗CD28(5μg/ml)重新激活细胞。
[0426] 在重新激活以后，通过每个星期计数细胞2次来跟踪细胞增殖至多30天。观察到与没有转导的细胞比较，在表达ROR1 CAR的TCRα失活的细胞中增大的增殖,特别是当采用抗CD28重新激活时。
[0427] 为了研究表达ROR1 CAR的人T细胞是否显示活化状态,在转导后7天，通过FACS分析了活化标志CD25的表达。为了评估它们与没有转导的细胞比较的活化，分析了采用编码ROR1 CAR的慢病毒载体转导的纯化的细胞在它们的表面处的CD25表达。增加的CD25表达指示抗CD28的重新激活或没有重新激活状况。
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