用于癌症和自身免疫疾病的免疫疗法
阅读：89发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于癌症和自身免疫疾病的免疫疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种用于 治疗 增殖性 疾病 、自身免疫疾病和同种免疫反应的嵌合融合蛋白以及编码所述嵌合融合蛋白的多核苷酸。所述嵌合融合蛋白包含CD24胞外结构域、EBV‑诱导的3(EBB)多肽亚基以及p28 IL‑27多肽亚基，其中所述EBB多肽和所述p28 IL‑27多肽亚基通过柔性连接肽共价连接。，下面是用于癌症和自身免疫疾病的免疫疗法专利的具体信息内容。
1.一种融合蛋白，其包含CD24胞外结构域、EBV-诱导的3(EBI3)多肽亚基以及p28IL-27多肽亚基，其中所述EBI3多肽亚基和所述p28IL-27多肽亚基通过连接肽共价连接。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述蛋白从氨基到羧基末端包含所述CD24胞外结构域、所述EBI3多肽亚基、所述连接肽以及所述p28IL-27多肽亚基。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述蛋白从氨基到羧基末端包含所述CD24胞外结构域、所述p28IL-27多肽亚基、所述连接肽以及所述EBI3多肽亚基。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其包含所述CD24胞外结构域的2-5个串联排列的拷贝。
5.如权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含免疫球蛋白Fc结构域。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含IgG1重链恒定区。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其中，所述IgG1重链恒定区包含去掉或消除与Fcγ受体结合的突变。
8.如权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中，所述蛋白进一步包含PD-1胞外结构域、PD-L1胞外结构域或PD-L2胞外结构域。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：77-84和88-95中任一个的氨基酸序列。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白与选自抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂或它们的组合中的一个或多个成员的组合。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂为抗体。
12.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂为siRNA。
13.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂为显性负相蛋白。
14.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白的融合蛋白序列，其中所述融合蛋白序列包含适合分泌所述IL-27融合蛋白的N-末端信号肽序列。
15.如权利要求14所述的多核苷酸，其中，所述融合蛋白序列的羧基末端包含适合用于将所述IL-27融合蛋白锚定到细胞膜上的GPI锚定信号序列。
16.一种表达载体，其包含权利要求14或15所述的多核苷酸，其中，所述融合蛋白序列可操作地连接到足以在细胞中表达所述融合蛋白的一种或多种调节序列。
17.如权利要求18所述的表达载体，其进一步包含适合表达抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂或它们的组合的一种或多种序列。
18.如权利要求16或17所述的表达载体，其中，所述表达载体是病毒载体。
19.如权利要求18所述的表达载体，其中，所述病毒载体是重组腺伴随病毒。
20.一种细胞，其包含在权利要求14-19任一项中所述的多核苷酸或表达载体，其中所述细胞表达所述融合蛋白。
21.如权利要求20所述的细胞，其进一步包含编码抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗-PD-L2剂或它们的组合的多核苷酸或表达载体，其中所述细胞表达所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂或它们的组合。
22.如权利要求21所述的细胞，其中，所述抗PD-1剂、抗-PD-L1剂或抗-PD-L2剂为抗体。
23.如权利要求21所述的细胞，其中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗-PD-L2剂为显性负相蛋白。
24.如权利要求21所述的细胞，其中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗-PD-L2剂为siRNA。
25.如权利要求23至27中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
26.一种治疗增殖性疾病的方法，包括以有效治疗所述增殖性疾病的量向有此需要的受试者施用权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白。
27.一种治疗自身免疫疾病和同种免疫反应的方法，包括以有效治疗所述自身免疫疾病或所述同种免疫反应的量向有此需要的受试者施用权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白。
28.一种治疗增殖性疾病的方法，包括以有效治疗所述增殖性疾病的量向有此需要的受试者施用权利要求16至19中任一项所述的表达载体。
29.一种治疗自身免疫疾病或同种免疫反应的方法，包括以有效治疗所述自身免疫疾病或同种免疫反应的量向有此需要的受试者施用权利要求16至19中任一项所述的表达载体。
30.如权利要求25至28中任一项所述的方法，还包括施用：
抗PD-1mAb、抗PD-L1mAb、抗-PD-L2mAb或它们的组合；
表达抗PD-1mAb、抗-PD-L1mAb，抗-PD-L2mAb或它们的组合的表达载体；
PD-1、PD-L1、PD-L2或它们的组合的显性负相蛋白；
表达PD-1、PD-L1、PD-L2或它们的组合的表达载体；
针对PD-1、PD-L1、PD-L2或它们的组合的siRNA；或
表达针对PD-1、PD-L1、PD-L2或它们的组合的一种或多种siRNA的表达载体。
31.一种治疗增殖性疾病的方法，包括以有效治疗所述增殖性疾病的量向有此需要的受试者施用权利要求20至25中任一项所述的细胞。
32.一种治疗自身免疫疾病或同种免疫反应的方法，包括以有效治疗所述自身免疫疾病或同种免疫反应的量向有此需要的受试者施用权利要求20至25中任一项所述的细胞。
33.一种AAV载体，其包含含有通过连接肽共价连接的EBV诱导的3(EBI3)多肽亚基和p28IL-27多肽亚基的融合蛋白的编码序列。
34.如权利要求33所述的AAV载体，其中所述AAV载体是AAV-IL-27。
用于癌症和自身免疫疾病的免疫疗法
技术领域
[0002] 本申请大体涉及一种运用或表达嵌合IL-27融合蛋白来治疗增殖性疾病、自身免疫疾病和同种免疫反应的组合物和方法。
背景技术
[0003] 经过几十年的研究，癌症的免疫疗法最终成为我们对抗癌症战争中的主要武器。可将现在的免疫治疗方法分为直接靶向癌细胞的方法以及直接靶向宿主免疫系统的方法。
前者包括在肿瘤细胞上大量表达的分子(如乳癌的HER-2以及白血病的CD19或CD20)的特异性抗体。后者包括与阴性检测点调节剂(如CTLA-4和PD-1)相互作用的抗体。结合力通过联合抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体应答率的显著提高来体现。近年来，很多阴性检测点调节剂已扩展到提供新的靶标，包括PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA以及VISTA(在Le Mercier等人，Front.Immunol.,(6),Article 418，2015年8月中评述)。之后制药公司热切地寻找其他的组合。
前者包括在肿瘤细胞上大量表达的分子(如乳癌的HER-2以及白血病的CD19或CD20)的特异性抗体。后者包括与阴性检测点调节剂(如CTLA-4和PD-1)相互作用的抗体。结合力通过联合抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体应答率的显著提高来体现。近年来，很多阴性检测点调节剂已扩展到提供新的靶标，包括PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA以及VISTA(在Le Mercier等人，Front.Immunol.,(6),Article 418，2015年8月中评述)。之后制药公司热切地寻找其他的组合。
[0004] IL-27是由IL-12p40-相关蛋白亚基(其被称为EBV诱导的基因3(EBI3))以及p35-相关亚基p28构成的IL-12细胞因子家族的成员。由如树突状细胞(DC)和巨噬细胞的激活抗原呈递细胞(APC)所产生，IL-27在包括T细胞、NK细胞、B细胞和骨髓细胞的多种细胞型中通过由WSX-1和gp130亚基构成的异二聚体受体(IL-27R)来传导信号。IL-27R信号传导增强几种Jak家族激酶的募集以及STAT家族转录因子1和3的激活。IL-27在调节Th1、Th2、Th17以及FoxP3+Treg(调节性T细胞)应答中已经显示具有很强的活性。鉴于IL-27的这些性质，需要用于治疗增殖性疾病、自身免疫疾病和同种免疫反应的基于IL-27的治疗剂。
[0005] IL-27是由IL-12p40-相关蛋白亚基(其被称为EBV诱导的基因3(EBI3))以及p35-相关亚基p28构成的IL-12细胞因子家族的成员。由如树突状细胞(DC)和巨噬细胞的激活抗原呈递细胞(APC)所产生，IL-27在包括T细胞、NK细胞、B细胞和骨髓细胞的多种细胞型中通过由WSX-1和gp130亚基构成的异二聚体受体(IL-27R)来传导信号。IL-27R信号传导增强几种Jak家族激酶的募集以及STAT家族转录因子1和3的激活。IL-27在调节Th1、Th2、Th17以及FoxP3+Treg(调节性T细胞)应答中已经显示具有很强的活性。鉴于IL-27的这些性质，需要用于治疗增殖性疾病、自身免疫疾病和同种免疫反应的基于IL-27的治疗剂。发明内容
[0006] 本申请的一个方面涉及包含CD24胞外结构域、EBV-诱导的3(EBI3)多肽、p28IL-27多肽亚基的IL-27融合蛋白，其中所述EBI3多肽和所述p28IL-27多肽亚基通过柔性连接肽共价连接。
[0007] 在一个实施方案中，所述IL-27融合蛋白从氨基到羧基末端包含CD24胞外结构域、EBV-诱导的3(EBI3)多肽亚基、连接肽以及p28IL-27多肽亚基。
[0008] 在另一个实施方案中，所述IL-27融合蛋白从氨基到羧基末端包含CD24胞外结构域、p28IL-27多肽亚基、连接肽以及EBV-诱导的3(EBI3)多肽。
[0009] 在某些实施方案中，所述IL-27融合蛋白包含所述CD24胞外结构域的2-10个或2-5个串联排列的拷贝。
[0010] 在另一个实施方案中，所述IL-27融合蛋白可包含上述胞外结构域的2-5个串联排列的拷贝。
[0011] 在另一个实施方案中，所述IL-27融合蛋白包含免疫球蛋白Fc结构域。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含IgG1重链恒定区。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含去掉或消除与Fcγ受体结合的突变。在某些特别的实施方案中，所述融合蛋白包含根据SEQ ID NO:77-84或88-101中任一个的氨基酸序列。
[0012] 本申请的另一方面涉及一种药物组合物，其包含根据本公开的IL-27融合蛋白与选自抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂或它们的组合中的一个或多个成员的组合。在某些实施方案中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂是抗体。在其他实施方案中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂是显性负相突变蛋白。在其他实施方案中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂是siRNA。
[0013] 本申请的另一方面涉及一种编码如本文所述的IL-27融合蛋白的多核苷酸，以及表达载体，该表达载体包含编码可操作地连接到适合在细胞中表达所述融合蛋白的核苷酸序列的所述IL-27融合蛋白的多核苷酸。各个多核苷酸或表达载体另外包含N-末端信号肽序列。
[0014] 在某些实施方案中，所述多核苷酸或表达载体另外包含在融合蛋白序列的羧基末端将所述融合蛋白锚定到细胞膜上的GPI锚定信号序列。
[0015] 在其他实施方案中，所述多核苷酸或表达载体另外包含用于将所述融合蛋白锚定到细胞膜上的跨膜结构域。
[0016] 在某些实施方案中，多核苷酸或表达载体，或另外的多核苷酸或表达载体进一步包含适合表达抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂，或它们的组合的一个或多个序列。
[0017] 在某些实施方案中，所述抗PD-1/抗PD-L1/抗PD-L2序列编码抗体。
[0018] 在其他实施方案中，所述抗PD-1/抗PD-L1/抗PD-L2序列编码显性负相突变蛋白或包含胞外结构域而没有跨膜结构域和/或胞质尾区的可溶性蛋白。
[0019] 可将编码所述抗体、显性负相突变蛋白或可溶性蛋白的多核苷酸或表达载体改造成分泌抗PD-1/抗PD-L1/抗PD-L2序列(如，抗体或Fc融合蛋白)，或可用C末端GPI-连接的锚定信号序列或跨膜结构域来改造它们以将PD-1、PD-L1和/或PD-L2变体锚定到细胞膜。
[0020] 在其他实施方案中，所述抗PD-1/抗PD-L1/抗PD-L2序列包含用于产生一种或多种siRNA的一种或多种shRNA。
[0021] 在其他实施方案中，多核苷酸或表达载体，或另外的多核苷酸或表达载体还包含适合表达针对B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA或包含来自B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIME-3、TIGIT、BTLA、VISTA或它们的组合的胞外结构域的蛋白变体的抗体的一个或多个序列。可将所述蛋白变体改造成用于分泌(如，Fc融合蛋白)或可用GPI连接的锚定信号序列或跨膜结构域来对其改造以将所述蛋白变体锚定到细胞膜上。
[0022] 所述表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。
[0023] 在某些优选的实施方案中，所述表达载体是重组腺病毒相关病毒(AAV)载体。
[0024] 本申请的另一方面涉及一种细胞，其包含编码IL-27融合蛋白的多核苷酸或IL-27融合蛋白的编码表达载体，其中，所述细胞表达IL-27融合蛋白。在某些实施方案中，所述细胞另外包含表达抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂，或它们的组合的多核苷酸或表达载体，其中所述抗PD-1/抗PD-L1/抗PD-L2剂是抗体、显性负相蛋白或siRNA。在优选的实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，如，人或小鼠细胞。
[0025] 本申请的另一方面涉及一种用于治疗增殖性疾病的方法。所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的IL-27融合蛋白的步骤。
[0026] 本申请的另一方面涉及一种用于治疗自身免疫疾病或同种免疫反应的方法。所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的IL-27融合蛋白的步骤。
[0027] 本申请的另一方面涉及一种用于治疗增殖性疾病的方法。所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的编码IL-27的表达载体的步骤。
[0028] 本申请的另一方面涉及一种用于治疗自身免疫疾病或同种免疫反应的方法。所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的编码IL-27的表达载体的步骤。
[0029] 在某些实施方案中，治疗方法进一步包括向受试者施用有效量的下列试剂的步骤：抗PD-1mAb、抗PD-L1mAb、抗PD-L2mAb，或它们的组合；表达抗PD-1mAb、抗PD-L1mAb、抗PD-L2mAb，或它们的组合的表达载体；PD-1、PD-L1、PD-L2，或它们的组合的显性负相蛋白；表达PD-1、PD-L1、PD-L2，或它们的组合的表达载体；针对PD-1、PD-L1或PD-L2的一种或多种siRNA；或表达针对PD-1、PD-L1或PD-L2的一种或多种siRNA的表达载体。
[0030] 在其他实施方案中，所述治疗方法进一步包括向受试者施用有效量的下列试剂的步骤：针对B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA，或它们的组合的mAb；表达针对B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA，或它们的组合的mAb的表达载体；B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA，或它们的组合的显性负相蛋白或胞外结构域；表达B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA，或它们的组合的显性负相蛋白或胞外结构域的表达载体；针对B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA，或它们的组合的一种或多种siRNA；或表达针对B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA，或它们的组合的一种或多种siRNA的表达载体。
[0031] 本申请的另一方面涉及一种用于治疗增殖性疾病的方法。所述方法包括以有效治疗所述增殖性疾病的量向有此需要的受试者施用有效量的表达本公开的IL-27融合蛋白的细胞本身，或其与一种或多种抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、抗B7-1剂、抗B7-2剂、抗CTLA-4剂、抗LAG-3剂、抗TIM-3剂、抗TIGIT剂、抗BTLA剂、抗VISTA剂，或它们的组合的组合的步骤。
[0032] 本申请的另一方面涉及一种用于治疗自身免疫疾病或同种免疫反应的方法。所述方法包括以有效治疗所述自身免疫疾病或同种免疫反应的量向有此需要的受试者施用有效量的表达本公开的IL-27融合蛋白的细胞本身，或其与一种或多种抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、抗B7-1剂、抗B7-2剂、抗CTLA-4剂、抗LAG-3剂、抗TIM-3剂、抗TIGIT剂、抗BTLA剂、抗VISTA剂，或它们的组合的组合的步骤。附图说明
[0033] 图1.AAV-IL-27处理抑制B16黑素瘤的生长和肺转移。A部分：用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒载体肌肉注射C57BL/6小鼠。随时间推移对小鼠取血，ELISA检测IL-27的血清浓度。B部分：将2×105个B16.F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠体内。四天后，用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒载体处理小鼠。随时间推移测量肿瘤的大小。竖条表示每组5个肿瘤的SD。显示的数据表示具有类似结果的三个实验。C部分：将2×105个B16.F10细胞静脉注射到C57BL/6小鼠中。四天后，用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒载体肌肉注射处理小鼠。肿瘤细胞注射二十一天后，处死小鼠，显示肺部肿瘤转移。来自各组小鼠的肺平均重量显示在右图中。竖条表示每组4只小鼠肺重量的SD。显示的数据表示具有类似结果的两个实验。
[0034] 图2.AAV-IL-27处理消耗Treg细胞，增强产生IFN-γ的T细胞的肿瘤浸润。将2×5
10个B16.F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠。四天后，用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒载体处理小鼠。在第18天处死小鼠，并使用流式细胞术分析FoxP3+Treg细胞(A部分)和产生IFN-γ的肿瘤浸润性T细胞(B部分)。每组5只小鼠用于实验。显示的数据表示具有类似结果的至少三个实验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，t检验。
10个B16.F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠。四天后，用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒载体处理小鼠。在第18天处死小鼠，并使用流式细胞术分析FoxP3+Treg细胞(A部分)和产生IFN-γ的肿瘤浸润性T细胞(B部分)。每组5只小鼠用于实验。显示的数据表示具有类似结果的至少三个实验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，t检验。
[0035] 图3.AAV-IL-27处理诱导T细胞上的PD-L1表达。A部分：来自用AAV-IL-27(红色)或AAV-Ctrl病毒(蓝色)载体处理的小鼠的血液(n＝3-4/组)，脾脏(n＝7-8/组)和肿瘤(n＝7-8/组)中的CD4+和CD8+T细胞的流式细胞术分析。来自各组小鼠的T细胞上PD-L1表达的平均荧光强度(MFI)如右图所示。竖条表示各组中PD-L1MFI的SD。显示的数据表示具有类似结果的两个实验。B部分：用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒载体处理的小鼠的肿瘤中PD-1+CD8T细胞的流式细胞术分析。竖条表示每组5只小鼠的PD-1MFI的SD。显示的数据表示具有类似结果的两个实验。*P<0.05；***P<0.001，t检验。
[0036] 图4.AAV-IL-27和抗PD1联合疗法消除小鼠的肿瘤。A部分：将2×105个B16.F10细胞皮下注射到每个C57BL6小鼠中。四天后，用AAV-IL-27或AAV-Ctrl载体肌肉注射处理小鼠。从第4天开始，还用300μg/小鼠的抗PD-1(RMP1-14)或同种型匹配的对照抗体(2A3)以四天间隔长达四次处理小鼠。随着时间推移测量各组小鼠(n＝5)肿瘤的大小。B部分：将2×105个B16.F10细胞皮下注射到每个C57BL6小鼠中。四天后，用AAV-IL-27载体肌肉注射处理小鼠。从第4天开始，还用300μg/小鼠的抗PD-1(RMP1-14)或抗CTLA4(4F10)或对照IgG(2A3)处理小鼠。随着时间推移测量每组小鼠(n＝5)中肿瘤的大小。*P<0.05；**P<0.01，t检验。显示的数据表示具有类似结果的三个实验。
[0037] 图5.AAV-IL-27和抗PD1联合疗法增强抗肿瘤Th1/Tc1应答。将2×105个B16.F10细胞皮下注射到每个C57BL6小鼠中。四天后，用AAV-IL-27或AAV-Ctrl载体肌肉注射处理小鼠。从第4天开始，还用300μg/小鼠的抗PD-1(RMP1-14)或同种型匹配的对照抗体(2A3)以四天间隔长达四次处理小鼠。肿瘤细胞注射后18天，处死小鼠，分离并分析其肿瘤的CD4(A部分)和CD8(B部分)T细胞产生的IFN-γ。每组小鼠(n＝5)的平均IFN-γ阳性T细胞显示于右图。*p<0.05；**p<0.01，t检验。
[0038] 图6.AAV-IL-27处理消除了FoxP3+Treg细胞。小鼠B16黑素肿瘤的建立和治疗方案与图3和图4中所述相同。肿瘤细胞注射后18天，处死小鼠，分离并分析其脾脏(A部分)和肿瘤(B部分)的CD4T细胞中Foxp3和IL-10的表达。每组小鼠(n＝5)的平均FoxP3阳性和IL-10阳性T细胞显示于右图。*p<0.05；**p<0.01，t检验。
[0039] 图7.AAV-IL-27和抗PD-1联合疗法诱导T细胞中IL-10的产生。小鼠B16黑素瘤的建立和治疗方案与图3和图4中所述相同。肿瘤细胞注射后18天，处死小鼠，分离并分析其脾脏(图A)和肿瘤(图B)的CD8T细胞中IL-10的表达。每组小鼠(n＝5)的平均IL-10阳性T细胞显示于右图。*p<0.05；**p<0.01，t检验。
[0040] 图8.AAV-IL-27抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎。用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒(2x1011DVP/小鼠，肌肉注射)处理C57BL6/小鼠(n＝5/组)(A部分)。两周后，用MOG肽免疫小鼠诱导实验性自身免疫疾病。每隔一天观察小鼠，并以0-5的等级以0.5刻度的间隔分来评分：0，无临床症状；1，尾部失调；2，摇摆步态；3，后肢麻痹；4，四肢后肢麻痹；以及5，死亡。B部分描绘了在AAV感染后45天，在A部分的小鼠脾脏的CD4+细胞亚群的流式细胞术分析。在高尔基体阻滞剂存在下，用PMA刺激脾细胞4小时，并通过细胞因子或Foxp3的细胞内染色进+行评估。Th1，产生IFNγ的细胞；TH2，IL4 细胞；Th17，产生IL-17的细胞；Tr1，产生IL-10的细胞。***P<0.001，t检验。
[0041] 图9.AAV-IL-27抑制炎症性肠病(IBD)。通过腹腔注射0.3×106个CD45RB高CD4+T细胞来诱导结肠炎。细胞注射一周后，用病毒载体2×1011个DVP/小鼠肌肉注射处理小鼠。A部分描绘了T细胞转移后的体重变化。起始重量定义为100％。B部分描绘了小鼠肠大体解剖的例子。C部分描绘了基于三个参数累积的临床评分：存在或不存在消耗症状(0或1)，结肠壁厚度程度(正常、轻度、中度和重度增厚分别为0-3)和粪便(正常、软粪便、腹泻和血便分别为0-3)。
[0042] 图10.用于免疫疗法的融合蛋白的产生。图10描述了IL27Fc和CD24IL27Fc的产生。A部分中的IL27Fc融合蛋白从N至C末端，由信号肽、EBI3、GGVPGVGVPGV(SEQ ID NO：7)“PV”连接子(linker)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)“GS”连接子、p24和Fc组成。A部分显示两种融合蛋白的产生，一个具有PV连接子(左部分)，另一个具有GS连接子(右部分)。左部分示出具有SEQ ID NO：71的氨基酸序列的融合蛋白，右部分示出具有SEQ ID NO：73的氨基酸序列的融合蛋白。在还原(左泳道)和非还原(右泳道)条件下通过SDS-PAGE分析蛋白。蛋白产量在凝胶照片下方提供。B部分描绘了CD24IL24Fc融合蛋白的产生。CD24IL27Fc融合蛋白从N至C末端由信号肽、人CD24、EBI3、连接子、PV连接肽、p28和Fc组成。B部分显示具有SEQ ID NO：79的氨基酸序列的CD24IL24Fc融合蛋白的产生。在还原(右泳道)和非还原(左泳道)条件下，通过SDS-PAGE分析蛋白。蛋白产量在凝胶照片下方提供。
[0043] 图11.在给定浓度的IL-27融合蛋白存在下，用抗CD3(1μg/ml)刺激图10A中的IL27Fc融合蛋白的B6脾细胞(2x105/孔)的体外活性。在第3天收集上清液，并分析IL-10(A部分)和IFNγ(B部分)水平。从两个独立实验获得相似的数据。
[0044] 图12.使用抗PD-1和具有SEQ ID NO：71(PV)的氨基酸序列的IL27Fc融合蛋白的联合疗法降低肿瘤生长速率和CD25+Foxp3+Treg的数量。在第8天(100μg/注射×5，每隔一天一次)注射抗PD-1，而在B16.F10肿瘤细胞攻击后第11天开始PV注射(2.5μg/小鼠×5日注射)。A部分描绘了肿瘤生长速率降低。每周两次用卡尺测量肿瘤。显示的数据为肿瘤面积。B部分描绘了Treg的减少。在第一次PV处理后第7天收集外周血。用CD4、CD25和Foxp3的特异性抗体对PBL进行染色。显示的数据为CD4隔间内的CD25+Foxp3+细胞的百分数。对照组为n＝4，治疗组为5。*P<0.05，**P<0.01。
[0045] 图13.单独施用CD24IL27mFcPV融合蛋白(SEQ ID NO：79)或与抗PD1mAb组合施用时，肿瘤生长的抑制和生存期的延长。A部分描绘了肿瘤生长的抑制。B16黑素瘤细胞(2x105/小鼠)皮下注射到C57BL/6小鼠中。在肿瘤细胞移植后第8天开始，每天三次用Fc(200μg×3)、抗PD-1(200μg×3)、CD24IL27mFcPV(30μg×3)或PD-1+CD24IL27mFcPV注射处理小鼠。每周两次测量肿瘤面积。通过双因素ANOVA分析和Bonferroni校正作为事后检验来确定P值。图B显示联合疗法延长荷瘤小鼠的生存期。数据采用Kaplan Meier生存分析，使用直径2cm的肿瘤作为终点。通过时序检验确定P值。
[0046] 图14.IL-27-rAAV在免疫功能障碍、多发性内分泌性疾病、肠病、X染色体连锁(IPEX)综合征的小鼠模型中的治疗作用。IPEX综合征是一种在男性中排他表达的X染色体相关隐性疾病。Foxp3基因突变导致小鼠和人类致命的自身免疫疾病。大多数受影响的儿童在出生后的头2年内死亡。由于具有Foxp3基因(Foxp3sf)突变的Scurfy小鼠显示与人类IPEX类似的发病机制，因此使用该模型来确定IL-27-rAAV是否可以治疗IPEX。如A部分中所示，单次注射IL-27-rAAV大大改善了小鼠的发育，正如围产期期间体重增加所证明的那样。此外，所述治疗使Scurfy小鼠的生存率几乎翻了一番(B部分)。
具体实施方式
[0047] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属的领域技术人员通常理解的含义相同的含义。必须指出，除非上下文另有明确规定，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数形式。因此，例如，提到“一个肽”即包括多个这样的肽，提到“所述肽”即是指本领域技术人员已知的一种或多种肽及其等同物，等等。
[0048] IL-27融合蛋白组合物
[0049] IL-27是由被称为EBV诱导的3(EBI3)蛋白亚基的IL-12p40相关蛋白亚基和p35相关亚基p28组成的IL-12细胞因子家族的成员。一方面，用于治疗增殖性疾病、自身免疫疾病和同种免疫反应的IL-27融合蛋白包括CD24胞外结构域(CD24ECD)、EBI3多肽亚基和p28IL-27多肽亚基，其中所述EBI3多肽亚基和所述p28IL-27多肽亚基通过连接肽(peptide linker)(PL)共价连接。如本文所用，术语“IL-27融合蛋白”广义地指本文所述的任何融合蛋白，其最少包括EBI3、p28和CD24胞外结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白包括修饰的人p28肽(SEQ ID NO：10)或其功能变体。在其他实施方案中，所述融合蛋白包括野生型人p28肽(SEQ ID NO：142，登录号NP_663634的氨基酸残基28-243)或功能变体。如下文所用，肽的“功能变体”是氨基酸序列与原始肽不同但维持原始肽的生物学功能的肽。在一些实施方案中，功能变体保留至少70％，75％，80％，85％，90％或95％的原始肽的生物活性或结构功能。
[0050] 在一个具体的实施方案中，所述IL-27融合蛋白从氨基到羧基末端包含CD24胞外结构域、EBI3多肽亚基、连接肽和p28IL-27多肽亚基。
[0051] 在另一个实施方案中，所述IL-27融合蛋白从氨基到羧基末端包含CD24胞外结构域、p28IL-27多肽亚基、连接肽和EBI3多肽亚基。
[0052] 在某些实施方案中，所述IL-27融合蛋白可包含CD24胞外结构域的2-10个或2-5个串联排列的拷贝。
[0053] 在另一个实施方案中，所述IL-27融合蛋白还包含免疫球蛋白Fc结构域。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包括IgG1重链恒定区。在另一个实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域包括去掉或消除与Fcγ受体结合的突变。
[0054] 在其它实施方案中，所述IL-27融合蛋白包含用于将融合蛋白锚定于细胞膜的GPI连接的聚糖或跨膜结构域。
[0055] 在某些实施方案中，所述IL-27融合蛋白在氨基末端包含CD24胞外结构域和/或在羧基末端包含B7-1跨膜结构域-胞质尾区。
[0056] 在一些实施方案中，所述IL-27融合蛋白进一步包含来自PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA、VISTA或其组合的胞外结构域(ECD)。在某些实施方案中，所述IL-27融合蛋白可以包含这些ECD中的一个或多个的2-5个串联排列的拷贝。
[0057] 本公开的IL-27融合蛋白具有模块化结构域结构，其具有以不同的构型连接在一起的来自例如各种非限制性来源(例如，小鼠和人)的结构和功能结构域。在IL-27融合蛋白中包含的示例性结构域及其来源示于表1中。表1中的登录号和蛋白质序列名称可用于在对应于这些氨基酸序列的核酸数据库中找到相应的核酸序列。编码SEQ ID NO：71、75、77和80中的氨基酸序列的示例性核酸序列分别列于SEQ ID NO：135、136、137和138中。这些构建体中的这些核酸序列可用于构建本文所述的其它IL-27融合蛋白编码构建体。
[0058] 表1中描述的结构域可以以各种结构构型排列，包括但不限于SEQ ID NO：67-101中的氨基酸序列(参见表2)。如本文所用，表1中列出的多肽或多肽结构域包括相应的SEQ ID NO，以及其“功能变体”。如本文所用，术语“功能变体”是指保留其功能活性且与所述融合蛋白中包含的相应野生型的多肽或多肽结构域具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％序列同一性的多肽或多肽结构域，并且还包括相对于所列SEQ ID NO在氨基和/或羧基末端区域截短的多肽或多肽结构域，其中组合的截短占在表1中列出的各个SEQ ID NO中的全部氨基酸的小于1％，小于2％，小于3％，小于4％，小于5％或小于10％。
[0059] 含有对应于SEQ ID NO：67-101的氨基酸序列的融合蛋白可用于本公开的组合物和方法中。此外，这些氨基酸序列可以进一步重排，被功能上可取代的结构域替代，或与SEQ ID NO.15-66中列出的一个或多个多肽结构域或在本公开中另外所描述的结合。可以使用额外的修饰，包括从所述结构域缺失一个或多个氨基酸来增加融合蛋白的生物活性和/或表达。通常，优选的是每个结构域保留至少90％的同一性，优选相对于本文所述的特定序列大于95％的同一性。如下文实施例6中进一步描述的，在体外检测中，提供了可用于优化临床应用的融合蛋白组合物的有用的功能测定。
[0060] 表1
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] 表2
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] CD24被表达为糖基-磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的分子，并且在不同谱系中具有广泛的分布。CD24胞外结构域(ECD)是重度糖基化的，已知其与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族(Siglecs)的成员相互作用以抑制炎症反应，特别是对危险相关分子模式(DAMPS)的组织损伤诱导的免疫应答。例如，CD24与Siglec 10的结合减少CD24与DAMPS(包括高速泳动族框1(HMGB1)、热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白90(HSP90))的联系。这用于负调节其刺激活性并抑制核因子κB(NF-κB)活化。此外，已知CD24与Siglec-G的结合减弱移植物抗宿主病(GVHD)。
[0069] 除了其抗炎活性之外，CD24的胞外结构域(CD24ECD)提供本文所述的IL-27融合蛋白的增强表达。
[0070] CD24ECD可以衍生自人CD24或小鼠CD24，因为就它们与DAMP的相互作用方面看来，它们构成功能上的等同物。人CD24的胞外结构域(登录号NP_037362)可以包含氨基酸序列SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTKV(SEQ ID NO：102)、SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(SEQ ID NO：4)、SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATT(SEQ ID NO：103)、SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNAT(SEQ ID NO：104)或其功能变体。小鼠CD24的胞外结构域可以包含氨基酸序列NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG(SEQ ID NO：105)、
NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTR(SEQ ID NO：106)、NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATT(SEQ ID NO：107)、NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNAT(SEQ ID NO：108)或其功能变体。
NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTR(SEQ ID NO：106)、NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATT(SEQ ID NO：107)、NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNAT(SEQ ID NO：108)或其功能变体。
[0071] 在一些实施方案中，术语“CD24ECD”包括CD24的全长胞外结构域，例如人CD24的全长胞外结构域(SEQ ID NO：4)或小鼠CD24的全长胞外结构域(SEQ ID NO：3)，及它们的功能变体。CD24ECD的“功能变体”是10-60个氨基酸的多肽，其保留全长野生型CD24ECD的至少一个或两个潜在的N-连接糖基化位点，以及至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或14个潜在的O-连接的糖基化位点。
[0072] CD24ECD可以融合到EBI-PL-p28(或p28-PL-EBI)的N末端侧或EBI-PL-p28(或p28-PL-EBI)的C末端侧。在一些实施方案中，CD24ECD可以融合到IL-27融合蛋白的N末端和C末端。在其它实施方案中，IL-27融合蛋白可以包含多个拷贝的CD24ECD，以2，3，4，5，6，7，8，9或10个拷贝串联排列。
[0073] 可将柔性连接肽并入IL-27融合蛋白中包含的任何一个或多个多肽结构域之间。所述柔性连接肽包含小氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或甲硫氨酸残基。或者，所述连接肽可以包含IgG铰链区。连接肽的长度可以在3至40个氨基酸之间，优选6至15个氨基酸。通常，连接肽将增加蛋白质的柔性，便于采用扩展构象和/或缓解空间位阻。连接子(linker)的修饰或其他已知连接子的使用可允许增加IL-27融合蛋白中并入的结构域的稳定性和/或功能。
[0074] 优选的连接肽由氨基酸，脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以及它们的组合组成。在一些实施方案中，连接肽包含多个甘氨酸残基，例如在连接子中40％至70％，或70％至100％的氨基酸为甘氨酸残基。在其它实施方案中，连接肽包含多个丝氨酸残基，例如连接子中40％至70％或70％至100％的氨基酸是丝氨酸残基(或例如，这些量的丙氨酸和/或脯氨酸残基)。在具体实施方案中，具有式[(Gly)n-Ser/Ala]m的间隔肽(spacer)，其中n为1至4，包括端值，m为1至4，包括端值。特异性连接肽包括但不限于GGVPGVGVPGV(SEQ ID NO：7)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)；GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：109)；
GSGRSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：110)；GGGGAGGG(SEQ ID NO：111)；AAAGGMPPAAAGGM(SEQ ID NO：112)；AAAGGM(SEQ ID NO：113)和PPAAAGGMM(SEQ ID NO：114)。
GSGRSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：110)；GGGGAGGG(SEQ ID NO：111)；AAAGGMPPAAAGGM(SEQ ID NO：112)；AAAGGM(SEQ ID NO：113)和PPAAAGGMM(SEQ ID NO：114)。
[0075] 在其它实施方案中，所述IL-27融合蛋白还包括免疫球蛋白Fc多肽结构域。Fc部分可以包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA的铰链区和CH2和CH3结构域；IgM的铰链区和CH3和CH4区；或IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的嵌合体。优选地，Fc受体结合结构域是人源的。在其它实施方案中，Fc结构域来自非人哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、猴、黑猩猩、仓鼠等。在一个特别的实施方案中，所述IL-27融合蛋白包含来自IgG1重链恒定区的免疫球蛋白Fc多肽结构域。
[0076] 在一些实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基来修饰Fc区，以便改变Fc部分的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得Fc部分对效应子配体(例如Fc受体)具有改变的亲和力和/或Fc部分不能结合Fcγ受体(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn)，因此不能或显著阻碍其介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。包含在本公开的IL-27融合蛋白的Fc区中的示例性Fcγ受体结合阴性IgG1同种型变体包括与SEQ ID NO：12相关的突变体L17A、L17F、L18A、L18E、D48A、N80A、N80Q或P114S中的任一个或它们的组合相对应的那些。在其它实施方案中，一个或多个Fc区氨基酸可以被一个或多个残基替代，使得所得Fc部分具有改变的C1q结合和/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)或改变Fc区固定补体的能力。
[0077] 在一些实施方案中，所述IL-27融合蛋白或编码IL-27融合蛋白的多核苷酸可进一步包括另外的氨基酸序列或分别编码信号肽序列、GPI锚定单序列、跨膜结构域、靶向结构域或亲和标记物的多核苷酸序列。
[0078] 在某些实施方案中，所述融合蛋白可以包括GPI锚定信号序列或跨膜结构域序列。例如当将IL-27融合蛋白直接注射到患者的肿瘤块中时，通过并入GPI锚定信号或跨膜结构域序列来将IL-27融合蛋白锚定在细胞质膜上可使它们固定，以便延长其体内半衰期，产生局部高浓度的IL-27融合蛋白，并且允许施用较高剂量。此外，纯化的GPI锚定的蛋白质拥有自发地融合到几乎任何细胞的细胞膜中的能力。
[0079] 通过GPI锚将大范围的细胞表面蛋白质，包括酶、外壳蛋白、表面抗原和粘附分子附着到质膜。如本文所用，使用术语“GPI”来指代糖肌醇磷脂，特别是糖基磷脂酰肌醇。这些磷脂样锚定物具有与蛋白质功能无关的用于膜附着的共同结构。GPI锚定单元由与肌醇磷脂连接的含有磷酸乙醇胺、三个甘露糖残基以及非乙酰化葡萄糖胺的线性聚糖组成。GPI是翻译后添加的脂质锚；因此，不同于具有不同跨膜结构域并连接到特定胞质延伸物的常规多肽锚，GPI锚使用常见的脂质结构附着于膜，这与与其连接的蛋白质无关。
[0080] 在GPI附着位点和紧随其后的残基通常是小氨基酸，例如Ala、Asn、Asp、Gly、Cys或Ser。附着残基后，在附着点后7-10个残基开始有约10至20个残基的疏水序列。已经将GPI锚定信号序列成功地改造到其他非GPI锚定蛋白的C末端，并且这些GPI锚定的蛋白质覆在细胞表面上而且是功能性的。
[0081] GPI锚定信号序列可以由任何GPI锚定的蛋白获得，包括但不限于酶，如碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、5'核苷酸酶(CO73)；粘附分子，如淋巴细胞功能相关抗原(LFA-3、CD58)和神经细胞粘附分子(NCAM)；补体调节蛋白，如衰老加速因子(DAF或CD55)，或其他，如Fcγ受体IIIB型(Fc-γ-RIII或CD16b)、Thy-1(CD90)、Qa-2、Ly-6A和活性溶胞作用的膜抑制蛋白(MIRL或CD59)。
[0082] GPI锚通过转酰胺基作用(一种伴随着GPI部分的加入，C末端GPI附着信号裂解的反应)连接到内质网中的蛋白质。因此，可以将GPI锚定序列并入IL-27融合蛋白的C末端。天然CD24蛋白是GPI锚定的蛋白。因此，在一个实施方案中，将来自CD24前肽序列的CD24GPI锚定信号序列并入IL-27融合蛋白C末端的核酸编码区中。在一个具体实施方案中，除了信号序列之外，将CD24前肽的整个部分融合到IL-27融合蛋白的C末端(例如，SEQ ID NO：60，62)。
[0083] 在一些实施方案中，可将跨膜结构域并入IL-27融合蛋白中以使其稳定地附着到细胞。在一个实施方案中，可将异源跨膜结构域并入IL-27融合蛋白的C末端。跨膜结构域可以在其他已知的跨膜蛋白上建模，或者可以包含具有高亲脂性的人工设计的肽。
[0084] 示例性跨膜结构域包括但不限于衍生自小鼠B7-1(PPDSKNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVI，SEQ ID NO：63)、人B7-1(LLPSWAITLISVNGIFVICCL，SEQ ID NO：64)、P-钙粘蛋白(FILPILGAVLALLLLLTLLALLLLV，SEQ ID NO：115)、CD2(IYLIIGICGGGSLLMVEFVALLVFYIT，SEQ ID NO：116)、CD40(ALVVIPIIFGILFAILLVLVFT，SEQ ID NO：117)、接触蛋白(ISGATAGVPTLLLGLVLPAP)、SEQ ID NO：118)、IL-4受体(LLLGVSVSCIVILAVCLLCYVSIT，SEQ ID NO：119)、甘露糖受体(VAGVVIIVILLILTGAGLAAYFFY，SEQ ID NO：120)、CSF-1受体(FLFTPVVVACMSIMALLLLLLLLLL，SEQ ID NO：121)、PDGFβ链受体
(VVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR，SEQ ID NO：122)、PDGFα链受体
(ELTVAAAVLVLLVIVSISLIVLVVTW，SEQ SEQ ID NO：123)、P-选择蛋白
(LTYFGGAVASTIGLIMGGTLLALL，SEQ ID NO：124)、TNFR-1(TVLLPLVIFFGLCLLSLLFIGLM，SEQ ID NO：125)和VCAM-1(LLVLYFASSLIIPAIGMIIYFAR，SEQ ID NO：126)的那些。
(VVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR，SEQ ID NO：122)、PDGFα链受体
(ELTVAAAVLVLLVIVSISLIVLVVTW，SEQ SEQ ID NO：123)、P-选择蛋白
(LTYFGGAVASTIGLIMGGTLLALL，SEQ ID NO：124)、TNFR-1(TVLLPLVIFFGLCLLSLLFIGLM，SEQ ID NO：125)和VCAM-1(LLVLYFASSLIIPAIGMIIYFAR，SEQ ID NO：126)的那些。
[0085] 在一个实施方案中，所述IL-27融合蛋白在C末端包含来自共刺激蛋白B7-1的跨膜结构域和胞质尾区(CT)(Pan等人，Mol.Ther.，20卷(5)：927-937，2012)。对应于B7-1跨膜结构域(TM)/胞质尾区(CT)的示例性蛋白质序列列于SEQ ID NO：65(小鼠)和SEQ ID NO：66(人)中。
[0086] 可将细胞靶向结构域并入IL-27融合蛋白中以赋予细胞类型特异性或细胞分化特异性靶向。靶向结构域可以包括抗体或抗体衍生物、肽配体、受体配体、受体片段、激素等。在一些实施方案中，靶向结构域包括来自噬菌体呈现文库的抗体衍生的或肽衍生的靶向结构域。为结合细胞表面分子或受体而设计的噬菌体呈现文库是本领域技术人员所熟知的。
[0087] 示例性抗体或抗体衍生的靶向结构域可以包括以下的任何成员：IgG，抗体可变区；分离的CDR区；包含通过连接肽连接的VH和VL结构域的允许两个结构域之间关联形成抗原结合位点的单链Fv分子(scFv)；双特异性scFv二聚体；包含连接到CH3结构域的scFv、单链双特异抗体片段、由VH或VL结构域组成的dAb片段的小分子抗体(minibody)；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的Fab'片段，其通过在重链CH1结构域的羧基末端添加少量残基而与Fab片段不同；Fab'-SH片段，其是恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab'片段；F(ab')2，包含两个连接的Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；它们的衍生物，以及保留抗原结合功能的任何其他抗体片段。可以通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定Fv、scFv或双特异抗体分子。当使用抗体衍生的靶向剂时，可以使用本领域技术人员熟知的方法将其中任何或所有的靶向结构域和/或Fc区“人源化”。
[0088] 在其它实施方案中，可以包括亲和标记物以助于采用亲和层析纯化IL-27融合蛋白和/或目标蛋白质。亲和标记物可以包括本领域技术人员已知的亲和标记物，包括但不限于谷胱甘肽S-转移酶(GST)、组氨酸标记物(例如6xHis)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、蛋白A、硫氧还蛋白、泛素、生物素、钙调蛋白结合肽(CBP)、抗生蛋白链菌素标记物(streptavidin tag)和各种免疫原性肽标记物，包括FLAG八肽标记物、血凝素A(HA)标记物、myc标记物等。
[0089] 在本公开中已经意想不到地发现IL-27融合蛋白与程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)阻断的结合可以协同提高抗肿瘤活性和自身免疫或同种反应。因此，一方面，用于治疗增殖性疾病、自身免疫疾病和同种免疫反应的药物组合物包含根据本公开的IL-27融合蛋白与选自抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂或它们的组合中的一个或多个成员的组合。
[0090] PD-1及其配体可以负调节免疫应答。PD-1具有两个配体：作为B7家族成员的程序性细胞死亡配体2(PD-L1)和程序性细胞死亡配体2(PD-L2)。PD-L1蛋白响应于LPS和GM-CSF的处理在巨噬细胞和树突细胞(DC)上被上调，在TCR细胞和B细胞受体信号传导时在T细胞和B细胞上被上调，而在静息小鼠中，可以在心脏、肺、胸腺、脾脏和肾脏中检测到PD-L1mRNA。在用IFN-γ处理时，PD-L1在几乎所有的鼠肿瘤细胞系中表达，包括PA1骨髓瘤、P815肥大细胞瘤和B16黑素瘤。还已知PD-L1与共刺激蛋白B7-1结合。这种结合相互作用可以抑制T细胞的活化和增殖，以及细胞因子的产生。PD-L2表达更受限制，主要由DC和少数肿瘤细胞系表达。
[0091] PD-1活性可能受到选择性结合并阻断PD-1活性的抗体或者与PD-1的选择性结合并阻止其与PD-L1或PD-L2结合的抗体的干扰。因此，在某些实施方式中，抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂为抗体。示例性的抗PD-1抗体包括但不限于BMS-936558(由Bristol-Meyers Squibb开发，也称为MDX-1106或ONO-4538)、CT-011或pidilizumab(由CureTech开发)，MK-3475(由Merck开发，也称为SCH 900475)。示例性的抗PD-L1抗体包括MPDL3280A或RG7446(由Genentech/Roche开发)和BMS-936559(MDX-1105；Bristol-Myers Squibb)，一种以高亲和力与人PD-L1结合并阻断PD-L1与PD-1和B7-1结合的完全人免疫球蛋白G4(IgG4)mAb。
[0092] 在一些实施方案中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂是靶向PD-1mRNA、PD-L1mRNA或PD-L2mRNA的siRNA。siRNA是可以被改造成诱导mRNA的序列特异性转录后基因沉默的双链RNA。合成所产生的siRNA在结构上模拟通常在细胞中由Dicer酶加工的siRNA的类型。可以使用熟知的算法设计合成siRNA，并使用常规DNA/RNA合成仪合成。此外，可以由合适的表达载体表达siRNA。当由表达载体表达时，将表达载体改造成转录被加工成细胞内的靶向siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)。可以使用熟知的算法设计合成shRNA，并使用常规DNA/RNA合成仪合成。
[0093] 在其它实施方案中，所述抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂是PD-1、PD-L1或PD-L2的显性负相突变体形式。如本文所用，术语“显性负相突变体”是指突变型非抗体蛋白，其干扰突变蛋白与其正常结合配对物之一的结合，或突变体与其结合配偶体结合，使得所产生的复合物的生物活性不足。例如，显性负相PD-1可能具有不能再结合PD-L1或PD-L2的突变。或者，显性负相蛋白可能与其靶标结合，但所产生的复合物在信号传导中是不足的。示例性的显性负突变体是AMP-224(由Glaxo Smith Kline和Amplimmune共同开发)。AMP-224是由PD-L2的胞外结构域和人IgG的Fc区组成的重组融合蛋白。
[0094] 在某些实施方案中，本公开的IL-27融合蛋白(或相应的多核苷酸)可另外包含或编码没有相应胞质尾区的PD-1、PD-L1或PD-L2的胞外结构域。或者，显性负相抗PD-1蛋白、抗PD-L1蛋白或抗-PD-L2蛋白(或其融合蛋白)各自可以与IL-27融合蛋白共同施用，或表达这种显性负相蛋白的多核苷酸各自可与表达IL-27的多核苷酸共同施用。
[0095] 在一些实施方案中，所述IL-27融合蛋白包括IL-27与抗PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体或它们的片段之间的融合物。在其它实施方案中，所述IL-27融合蛋白与抗PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-L2抗体或它们的片段化学连接。
[0096] 在一些实施方案中，抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂是结合PD-1但不激活PD-1的PD-L1或PD-L2的小分子或肽模拟物。
[0097] PD-1拮抗剂包括在US公开号2015/0232555、2015/0216970、2015/0210772、2015/0210769、2015/0203579、2013/0280265、2013/0237580、2013/0230514、2013/0109843、
2013/0108651、2013/0017199、2012/0251537、2012/0039906、2011/0271358、US 2011/
0171215和EP 2170959B1中描述的那些。
2013/0108651、2013/0017199、2012/0251537、2012/0039906、2011/0271358、US 2011/
0171215和EP 2170959B1中描述的那些。
[0098] 本公开的IL-27融合蛋白的上述结构和/或功能结构域中的任何一个可以通过一个或多个本文所述的柔性连接肽彼此分隔，以促进每个肽部分相对彼此独立折叠并且确保融合蛋白中的各个肽部分不互相干扰。
[0099] 编码IL-27融合蛋白的多核苷酸
[0100] 另一方面，本公开提供编码如本文所述的IL-27融合蛋白的多核苷酸。编码抗PD-1剂、抗PD-L1剂和/或抗PD-L2剂的其它多核苷酸可与编码IL-27融合蛋白的多核苷酸共同施用。
[0101] 在一个实施方案中，表达载体编码可操作地连接到适合在细胞中表达融合蛋白(和/或抗PD-1/PD-L1/PD-L2剂)的一种或多种调节序列的IL-27融合蛋白(和/或抗PD-1/PD-L1/PD-L2剂)。
[0102] 在某些实施方案中，向患者直接单独施用本公开的编码IL-27融合蛋白，或与PD-1/PD-L1/PD-L2剂的组合的表达载体以在体内表达IL-27融合蛋白(以及PD-1/PD-L1/PD-L2剂)。术语“体内表达载体”是指包含以适合来自在宿主细胞中的多核苷酸的体内表达的形式编码本公开的IL-27融合蛋白或PD-1/PD-L1/PD-L2剂的多核苷酸的病毒或非病毒载体。
[0103] 在其它实施方案中，可以用编码IL-27融合蛋白的一种或多种表达载体，或与编码本公开的抗PD-1剂、抗PD-L1剂和/或抗PD-L2剂的一种或多种表达载体的组合来转染或感染细胞，以产生稳定或瞬时的细胞系以向显示增殖性疾病、自身免疫疾病或不期望的同种免疫反应的受试者离体施用。
[0104] 核酸序列“可操作地连接”到另一个核酸序列，当前者与后者形成功能关系时。例如，如果用于前序列或信号肽的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则将其可操作地连接到所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则将其可操作地连接到编码序列；或者，如果将核糖体结合位点定位以助于翻译，则将其可操作地连接到编码序列。通常，“可操作地连接”是指连接的DNA序列是连续的，并且在信号肽的情况下，在阅读相是连续的。然而，增强子不一定是连续的。通过在方便的限制位点连接(ligation)来实现连接。如果这样的位点不存在，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接子。
[0105] 用于表达IL-27融合蛋白的核酸序列包括从成熟蛋白质中除去的氨基末端信号肽序列(例如SEQ ID NO：1和2)。由于信号肽序列可以影响表达水平，多核苷酸可以编码多种不同的N末端信号肽序列，包括但不限于MELGLSWIFLLAILKGVQC(SEQ ID NO：127)；MELGLRWVFLVAILEGVQC(SEQ ID NO：128)；MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：129)；
MDWTWRILFLVAAATGAHS(SEQ ID NO：130)，MDWTWRFLFVVAAATGVQS(SEQ ID NO：131)，MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：132)和MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：
133)。
MDWTWRILFLVAAATGAHS(SEQ ID NO：130)，MDWTWRFLFVVAAATGVQS(SEQ ID NO：131)，MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：132)和MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：
133)。
[0106] 此外，如上所述，用于表达GPI连接的IL-27融合蛋白的核酸序列将包括从成熟蛋白质中除去的C-末端GPI锚定信号序列。可以从与天然GPI连接的蛋白质相对应的蛋白质序列获得示例性GPI锚定信号序列，所述天然GPI连接的蛋白质包括但不限于酶，如碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、5'核苷酸酶(CO73)；粘附分子，如淋巴细胞功能相关抗原(LFA-3；CD58)和神经细胞粘附分子(NCAM)；补体调节蛋白，如衰老加速因子(DAF或CD55)，或其他，如Fcγ受体IIIB型(Fc-γ-RIII或CD16b)、Thy-1(CD90)、Qa-2、Ly-6A和活性溶胞作用的膜抑制蛋白(MIRL或CD59)。
[0107] 本领域技术人员将理解，表达载体的设计可以取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可将本公开的表达载体导入宿主细胞，从而产生蛋白质或肽，例如本公开的IL-27融合蛋白和抗PD-1剂、抗-PD-L1剂和/或抗-PD-L2剂。
[0108] 上述“调节序列”是指在一个或多个宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达或仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些序列(例如组织特异性调节序列)。表达载体通常含有用于终止转录的序列，并且还可以含有积极影响mRNA稳定性的一个或多个元件。
[0109] 表达载体含有用于指导IL-27融合蛋白表达的一种或多种转录调控元件，包括启动子和/或增强子。启动子包含一个DNA序列，其功能是从对于转录起始位点相对固定的位置启动转录。启动子含有对于RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以与其他上游元件和响应元件结合工作。
[0110] 如本文所用，术语“启动子”在最广的上下文中采用，并包括来自基因组基因的转录调控元件(TRE)或来自基因组基因的嵌合TRE，所述启动子包括用于准确引发转录的TATA框或启始子元件，有或没有响应于发育和/或外部刺激，以及反式作用调节蛋白或核酸而调节与其可操作地连接的基因的活化或抑制的另外的TRE(即上游激活序列，转录因子结合位点，增强子和沉默子)。启动子可以含有基因组片段，或者其可以含有一个或多个TRE组合在一起的嵌合体。
[0111] 优选的启动子是在目标细胞中能够指导表达的启动子。启动子可以包括组成型启动子(例如，HCMV、SV40、延伸因子-1α(EF-1α))或在特定目标细胞类型中表现出优先表达的启动子。增强子通常是指远离转录起始位点起作用的DNA序列，并且可以是转录单元的5'或3'。此外，增强子可以在内含子内以及编码序列内。它们的长度通常在10至300bp之间，且它们以顺式作用。增强子用于提高和/或调节附近启动子的转录。优选的增强子是在外来体表达细胞中指导高水平表达的增强子。
[0112] 启动子和/或增强子可以被光或特定的化学诱导剂特异性地活化。在一些实施方案中，可以使用例如通过施用四环素或地塞米松来调节的诱导型表达系统。在其他实施方案中，可以通过暴露于辐射(包括γ辐射和外部束放射治疗(EBRT))或烷化化疗药物来增强基因表达。
[0113] 可以将细胞或组织特异性转录调控元件(TRE)并入表达载体中以将表达限制为期望的细胞类型。可将表达载体设计为有利于IL-27融合蛋白在一种或多种细胞类型中表达。Pol III启动子(H1或U6)特别用于表达shRNA。
[0114] 此外，表达载体还可以包括编码报道产物或选择性标记的核酸序列。可以使用报道产物来确定基因是否已被递送到细胞并被表达。示例性的标记基因包括编码β半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因和绿色荧光蛋白。
[0115] 在某些实施方案中，表达载体可以被改造为表达IL-27融合蛋白和靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的siRNA。siRNA是可以被改造成诱导mRNA的序列特异性转录后基因沉默的双链RNA。合成所产生的siRNA在结构上模拟通常通过在细胞中Dicer酶加工的siRNA的类型。当由表达载体表达时，将表达载体改造成转录被加工成细胞内的靶向siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)。可以使用熟知的算法设计合成的siRNA和shRNA，并使用常规DNA/RNA合成仪合成。
[0116] 为了共表达IL-27融合蛋白和靶向PD-1/PD-L1和/或PD-L2的合适的shRNA，可以并入合适的剪接供体和剪接受体序列用于表达IL-27融合蛋白转录物(以产生IL-27融合蛋白)和shRNA转录物，由此IL-27融合蛋白编码序列位于shRNA编码序列的上游(5'端)。或者，当将shRNA并入IL-27编码序列的上游时，可以在shRNA序列和IL-27融合蛋白的下游编码序列之间插入内部核糖体结合序列(IRES)或2A肽序列。
[0117] IRES提供核糖体可以结合的结构，其不需要在mRNA的5'末端。因此，它可以指导核糖体在mRNA内的第二个起始密码子处引发翻译，允许由单个mRNA产生多于一种的多肽。2A肽包含介导自2A位点的上游和下游的肽的共翻译自切割的短序列，允许以等摩尔量由单个转录物产生两种不同的蛋白质。CHYSEL是2A肽的非限制性实例，其导致翻译的真核核糖体释放其正在合成并且不与mRNA分离的生长多肽链。核糖体继续翻译，从而产生第二多肽。所需要的仅仅是克隆2A的编码序列，然后在希望共表达的两个基因之间的框架中克隆用于下一个FMDV蛋白(例如2B)的第一个氨基酸的密码子。跳过2A的最后一个氨基酸(Gly)与2B的第一个(Pro)之间的肽键的合成，产生具有18aa(2A)的C末端尾的上游蛋白质和在N-末端具有Pro的下游蛋白质(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO：134)。
[0118] 在一个实施方案中，通过在IL-27融合蛋白编码序列与PD-1、PD-L1或PD-L2的编码序列之间插入内部核糖体结合序列(IRES)或2A肽序列(如CHYSEL)使IL-27融合蛋白与针对PD-1，PD-L1和/或PD-L2的重组抗体共表达。在该实施方案中，可将IL-27融合蛋白并入重组抗体序列的上游或下游。在另一个实施方案中，表达载体包含两个单独的表达盒，每个表达盒由其自己的一组调节元件调节。或者，可以构建多个不同的表达载体用于共同施用，其中第一表达载体编码IL-27融合蛋白，一个或多个另外的表达载体编码针对PD-1、PD-L1和/或PD-L2的重组抗体(或针对PD-1、PD-L1和/或PD-L2的shRNA)。
[0119] 表达载体可以包括病毒载体或非病毒载体。病毒载体可以衍生自腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒(包括慢病毒，如HIV-1和HIV-2)、辛德比斯病毒和其他RNA病毒，甲病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳头状瘤多型空泡形病毒、副粘病毒、细小病毒、小RNA病毒、披膜病毒等。非病毒载体是简单的“裸”表达载体，其不用病毒衍生的组分(例如衣壳和/或被膜)包裹。
[0120] 在某些情况下，可将这些载体通过使用病毒载体固有的靶向特征而改造成靶向某些疾病和细胞群体，或改造进病毒载体。特异性细胞可被“靶向”用于递送多核苷酸，以及表达。因此，在这种情况下，术语“靶向”可以基于以衣壳、被膜蛋白、用于递送到特定细胞的抗体的形式的内源或异源结合剂的使用，对细胞的特定亚群限制表达的组织特异性调节元件的使用，或两者。
[0121] 在一些情况下，重组病毒颗粒的产生需要一个或多个“辅助功能(helper function)”。“辅助功能”是编码病毒载体的复制或包装所需的功能的核酸序列。辅助功能可以包括天然存在的核酸序列，以及由其突变或改变的核酸序列。通常，辅助功能包括与调节提供必需辅助功能的多肽的表达的表达控制序列可操作地连接的核苷酸序列。重组病毒所需的辅助功能因重组病毒的类型而异。常用重组病毒所需的辅助功能是本领域已知的。
[0122] 在某些优选的实施方案中，IL-27融合蛋白由腺伴随病毒(AAV)载体递送。AAV是小的(20-26nm)复制缺陷，未发育的病毒，其依赖于用于在细胞中复制的第二病毒(例如腺病毒或疱疹病毒或合适的辅助功能)的存在。未确知AAV会引起疾病和诱导非常轻微的免疫应答。AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞，并且可以将其基因组并入宿主细胞的基因组中。超过30种天然存在的AAV血清型可用。在AAV衣壳中存在许多天然变体，使得可以鉴定和使用具有特别适用于递送细胞靶标的特性的AAV载体。AAV载体是相对无毒的，提供有效的基因转移，并且可以容易地针对特定目的进行优化。可以使用常规分子生物学技术改造AAV病毒，以优化用于IL-27融合蛋白的细胞特异性递送的重组AAV颗粒的产生，以用于最小化免疫原性，增强稳定性，递送至细胞核等。
[0123] 通常，AAV载体衍生自对哺乳动物非致病性的单链(ss)DNA细小病毒。在从人或非人灵长类动物中分离的AAV的血清型中，人血清型2是作为基因转移载体开发的第一种和表征最好的AAV。其他有用的AAV血清型包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。通常，重组的基于AAV的载体去除了rep和cap(衣壳)病毒基因(其占病毒基因组的96％)，留下两个侧翼的145个碱基对(bp)反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)，其被用于启动病毒DNA复制、包装和整合。通常，AAV载体可以容纳包含与一种或多种用于表达的调节元件可操作地连接的转基因(即，本文所述的融合蛋白)的长度为约4.5kb的“小基因”。
[0124] 可以使用任何合适的AAV血清型用于重组AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和其假型组合。假型(或嵌合)AAV载体包括来自多于一种血清型的部分，例如，来自一种AAV血清型的一部分衣壳可以融合到不同AAV血清型衣壳的第二部分，产生编码假型AAV2/AAV5衣壳的载体。或者，假型AAV载体可以在另一种AAV血清型的背景结构中含有来自一种AAV血清型的衣壳。例如，假型AAV载体可以包括来自一种血清型的衣壳和来自另一种AAV血清型的反向末端重复(ITR)。示例性的AAV载体包括重组假型AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9血清型载体。除非另有说明，本文所述的AAV ITR和其它选定的AAV组分可以容易从任何AAV血清型中选择，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或其他已知或未知的AAV血清型。使用本领域技术人员可使用的技术，可容易地从AAV血清型中分离出这些ITR或其他AAV组分。此外，AAV序列可以从学术、商业或公共来源(例如，美国标准培养收集所，马纳萨斯，维吉尼亚)中分离或获得，或者可以通过参考已公开的序列(例如可从文献或数据库，如GenBank，PubMed等中获得)通过合成或其它合适的方式获得。
[0125] 可用AAV载体的不同亚型或不同的AAV假型在体外或体内在细胞中表达IL-27融合蛋白。用于体内递送的载体的类型优选基于宿主对于选定的AAV亚型的预先存在的免疫缺陷和融合蛋白在体内的稳定表达来选择。
[0126] 用于组装到载体和/或辅助细胞中的示例性AAV片段包括衣壳亚基蛋白，vp1、vp2、vp3、高变区，和rep蛋白，rep 78、rep 68、rep 52和rep 40。当提供AAV rep和cap产物时，AAV rep和AAV cap序列都可以是一种血清型起源(例如所有AAV8起源)或可以来自多种AAV血清型。在一个实施方案中，rep和cap序列由不同的来源(例如，单独的载体，或宿主细胞和载体)表达。在一些实施方案中，这些rep序列可以在框架中融合到不同AAV血清型的cap序列中，以形成嵌合AAV载体，例如美国专利No.7,282,199中所述的AAV2/8。
[0127] 可以通过培养宿主细胞来产生重组腺伴随相关病毒(AAV)，所述宿主细胞含有如本文所定义的编码腺伴随病毒(AAV)血清型衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复(ITR)和编码融合蛋白的核酸序列组成的载体；和允许将小基因包装到AAV衣壳蛋白中的足够的辅助功能。可以以反式向宿主细胞提供需要在宿主细胞中培养的将AAV小基因包装到AAV衣壳中的组分。或者，可以由稳定的宿主细胞提供任何一种或多种所需组分(例如，小基因、rep序列、cap序列和/或辅助功能)，所述稳定的宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法被改造成包含一种或多种所需组分。例如，可以产生衍生自293细胞(其包含在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但在组成型或诱导型启动子控制下含有rep和/或cap蛋白的稳定的宿主细胞。
[0128] 可在包装宿主细胞或辅助细胞中递送或包含产生本公开的重组AAV(rAAV)所需的小基因、rep序列、cap序列和辅助功能。可以使用任何合适的方法，包括本文所述的那些和本领域可获得的任何其它方法，来递送所选择的遗传元件。产生rAAV病毒粒子的非限制性方法是本领域熟知的。
[0129] 在一些实施方案中，融合蛋白转基因处于调节元件，例如组织特异性或普遍存在的启动子的控制下。在一些实施方案中，普遍存在的启动子，如CMV启动子或CMV-鸡β-肌动蛋白杂合(CAG)启动子控制融合蛋白转基因的表达。在其它实施方案中，如肌肉的组织特异性启动子，例如肝特异性启动子用于控制转基因的表达。肌肉特异性启动子的示例性非限制性实例是人肌肉肌酸激酶(MCK)启动子；合适的肝脏特异性启动子是磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)启动子。
[0130] 如，通过鞘内注射和/或脑内注射将rAAV直接施用至脑脊髓液(CSF)后，rAAV可以遍布CNS组织。在一些实施方案中，rAAV(例如AAV-9和AAV-10)穿过血脑屏障并在静脉内施用后的受试者的CNS组织中实现广泛分布。在某些情况下，血管内(例如静脉内)给药比起其它形式给药(例如鞘内注射，脑内注射)有利于更大的体积的使用。因此，可以通过血管内(例如静脉内)给药一次递送大剂量的rAAV(例如高达1015个rAAV基因组拷贝(GC)/受试者)。血管内给药的方法是本领域熟知的，例如包括使用皮下注射针、外周插管、中心静脉线等。
[0131] 在某些实施方案中，可以构建多种不同的rAAV以用于共同给药，其中第一rAAV编码IL-27融合蛋白，第二rAAV编码靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的重组抗体。
[0132] 可通过直接注射裸DNA或通过将编码IL-27融合蛋白的多核苷酸和/或PD-1/PD-L1/PD-L2靶向多核苷酸包封在脂质体、微粒、微胶囊、病毒样颗粒或血影中，将非病毒表达载体用于非病毒基因的转运。可以通过化学偶联将这样的组合物进一步连接到例如微生物易位结构域和/或靶向结构域，以促进核酸的靶向递送和/或进入所需细胞的细胞核以促进基因表达。此外，质粒载体可与合成的基因转移分子(例如聚合DNA结合阳离子，如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白)一起培养，并可与细胞靶向配体(如非唾液血清类粘蛋白(asialoorosomucoid)、胰岛素、半乳糖，乳糖或转铁蛋白)连接。
[0134] 治疗方法
[0135] 一方面，用于治疗细胞增殖性疾病的方法包括向有此需要的受试者施用有效治疗增殖性疾病的量的本文所述的IL-27融合蛋白或表达IL-27融合蛋白的表达载体。
[0136] 另一方面，用于治疗自身免疫疾病或同种免疫反应的方法包括向有此需要的受试者施用有效治疗自身免疫疾病或同种免疫反应的量的本文所述的IL-27融合蛋白或表达IL-27融合蛋白的表达载体。
[0137] 如本文所用，术语“治疗”和“治疗”是指与细胞增殖性疾病、自身免疫疾病或同种免疫反应相关的一种或多种症状的改善；预防或延迟细胞增殖性疾病、自身免疫疾病或同种免疫反应的一种或多种症状的发作；和/或减轻细胞增殖性疾病、自身免疫疾病或同种免疫反应的一种或多种症状的严重性或频率。
[0138] 如本文中所使用的术语“改善”、“增加”或“减少”表示相对于基线测量(例如在本文所述的治疗开始之前同一个体中的测量或在不存在本文所述的治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量)的值或参数。
[0139] “对照个体”是患有与被治疗的个体相同的癌症的个体，其与被治疗的个体的年龄大致相同(以确保被治疗个体与对照个体的疾病分期是可比的)。被治疗的个体(也称为“患者”或“受试者”)可以是患有癌症的胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人。
[0140] 术语“细胞增殖性疾病”是指以细胞异常增殖为特征的病症。增殖性疾病并不意味着对细胞生长速率的任何限制，而仅表示丧失对影响生长和细胞分裂的正常控制。因此，在一些实施方案中，增殖性疾病的细胞可以具有与正常细胞相同的细胞分裂速率，但对限制这种生长的信号不响应。在“细胞增殖障碍”的范围内是肿瘤(neoplasm)或肿瘤(tumor)，其是组织的异常生长。“癌症”是指以具有入侵周围组织和/或转移到新的定植部位能力的细胞增殖为特征的各种恶性肿瘤中的任何一种，包括白血病、淋巴瘤、癌、黑素瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。用本公开方法治疗的示例性癌症包括脑、膀胱、乳腺、子宫颈、结肠、头颈部、肾、肺、非小细胞肺、间皮瘤、卵巢、前列腺、胃和子宫的癌症，白血病和成神经管细胞瘤。
[0141] 术语“白血病”是指造血器官的进行性恶性疾病，并且通常以血液和骨髓中白细胞及其前体的扭曲的增殖和发育为特征。示例性的白血病包括，例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血病性白血病、白血病性白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、格罗斯血管病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、血细胞性白血病、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴白血病(lymphatic leukemia)、成淋巴细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemia)、成淋巴性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴样白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小原粒型白血病、单核细胞性白血病、成髓性白血病(myeloblasts leukemia)、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病(myeloid granulocytic leukemia)、粒单核细胞性白血病(myelomonocytic leukemia)、Naegeli白血病、浆细胞性白血病(plasma cell leukemia)、浆细胞性白血病(plasmacytic leukemia)、前髓细胞性白血病(promyelocytic leukemia)、李德尔细胞性白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling’s leukemia)、干细胞性白血病、亚白血性白血病和未分化细胞性白血病。
[0142] 术语“癌”是指倾向于渗透周围组织并引起转移的上皮细胞的恶性生长。示例性的癌包括，例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡状癌(acinous carcinoma)、腺囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌(carcinoma of adrenal cortex)、肺泡癌(alveolar carcinoma)、肺泡细胞癌(alveolar cell carcinoma)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底样细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底样癌(basaloid carcinoma)、基底鱗状细胞癌(basosquamous cell carcinoma)、细支气管肺泡癌(bronchioalveolar carcinoma)、支气管癌(bronchiolar carcinoma)、支气管源性癌(bronchogenic carcinoma)、脑样癌(cerebriform carcinoma)、肝内胆管细胞癌(cholangiocellular carcinoma)、绒毛膜癌(chorionic carcinoma)、胶样癌(colloid carcinoma)、粉剌癌(comedo carcinoma)、子宫体癌(corpus carcinoma)、筛状癌(cribriform carcinoma)、胸廓癌(carcinoma en cuirasse)、皮肤癌(carcinoma cutaneum)、柱状癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell
carcinoma)、导管癌(duct carcinoma)、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌(epiennoid carcinoma)、腺样上皮癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外植癌(exophytic carcinoma)、溃疡性癌(carcinoma ex ulcere)、纤维癌(carcinoma fibrosum)、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、颗粒细胞癌(granulosa cell carcinoma)、毛母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌(hematoid carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、许特尔细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明质癌(hyaline carcinoma)、下胚胎癌(hypemephroid carcinoma)、幼稚型胚胎性癌(infantile embryonal carcinoma)、原位癌(carcinoma in situ)、表皮内癌(intraepidermal carcinoma)、上皮内癌(intraepithelial carcinoma)、克龙派切尔癌(Krompecher’s carcinoma)、Kulchitzky细胞癌(Kulchitzky-cellcarcinoma)、大细胞癌(large-cell carcinoma)、豆状癌(lenticular carcinoma)、脂瘤癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelial carcinoma)、髓样癌(carcinoma
medullare)、髓质癌(medullary carcinoma)、黑色素癌(melanotic carcinoma)、软癌(carcinoma molle)、粘蛋白性腺癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma
muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)、胶样癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌(naspharyngeal carcinoma)、燕麦细胞癌(oat cell carcinoma)、骨化性癌(carcinoma ossificans)、类骨质癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、门脉周癌(periportal carcinoma)、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘细胞癌(prickle cell carcinoma)、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾的肾细胞癌(renal cell carcinoma of kidney)、储备细胞癌(reserve cell
carcinoma)、肉瘤样癌(carcinoma sarcomatodes)、施奈德癌(Schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma)、单纯癌(carcinoma simplex)、小细胞癌(small-cell carcinoma)、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌(spheroidal cell carcinoma)、梭形细胞癌(spindlecell carcinoma)、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鱗癌(squamous
carcinoma)、鱗状细胞癌(squamous cell carcinoma)、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌(transitional cell carcinoma)、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)和绒毛状癌(carcinoma villosum)。
carcinoma)、导管癌(duct carcinoma)、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌(epiennoid carcinoma)、腺样上皮癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外植癌(exophytic carcinoma)、溃疡性癌(carcinoma ex ulcere)、纤维癌(carcinoma fibrosum)、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、颗粒细胞癌(granulosa cell carcinoma)、毛母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌(hematoid carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、许特尔细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明质癌(hyaline carcinoma)、下胚胎癌(hypemephroid carcinoma)、幼稚型胚胎性癌(infantile embryonal carcinoma)、原位癌(carcinoma in situ)、表皮内癌(intraepidermal carcinoma)、上皮内癌(intraepithelial carcinoma)、克龙派切尔癌(Krompecher’s carcinoma)、Kulchitzky细胞癌(Kulchitzky-cellcarcinoma)、大细胞癌(large-cell carcinoma)、豆状癌(lenticular carcinoma)、脂瘤癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelial carcinoma)、髓样癌(carcinoma
medullare)、髓质癌(medullary carcinoma)、黑色素癌(melanotic carcinoma)、软癌(carcinoma molle)、粘蛋白性腺癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma
muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)、胶样癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌(naspharyngeal carcinoma)、燕麦细胞癌(oat cell carcinoma)、骨化性癌(carcinoma ossificans)、类骨质癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、门脉周癌(periportal carcinoma)、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘细胞癌(prickle cell carcinoma)、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾的肾细胞癌(renal cell carcinoma of kidney)、储备细胞癌(reserve cell
carcinoma)、肉瘤样癌(carcinoma sarcomatodes)、施奈德癌(Schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma)、单纯癌(carcinoma simplex)、小细胞癌(small-cell carcinoma)、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌(spheroidal cell carcinoma)、梭形细胞癌(spindlecell carcinoma)、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鱗癌(squamous
carcinoma)、鱗状细胞癌(squamous cell carcinoma)、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌(transitional cell carcinoma)、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)和绒毛状癌(carcinoma villosum)。
[0143] 术语“肉瘤”是指由诸如胚胎结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞构成。示例性的肉瘤包括例如，软骨肉瘤(chondrosarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、淋巴肉瘤(lymphosarcoma)、黑素肉瘤(melanosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、Abemethy肉瘤(Abemethy'ssarcoma)、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肉瘤(liposarcoma)、泡状软组织肉瘤(alveolar soft part sarcoma)、成釉细胞肉瘤(ameloblastic sarcoma)、葡萄状肉瘤(botryoid sarcoma)、绿色瘤肉瘤(chloroma sarcoma)、绒毛膜癌(chorio carcinoma)、胚胎性肉瘤(embryonal sarcoma)、Wilns肿瘤肉瘤(Wiln’s tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤(endometrial sarcoma)、间质肉瘤(stromal sarcoma)、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、筋膜肉瘤(fascial sarcoma)、纤维母细胞肉瘤(fibroblasticsarcoma)、巨细胞肉瘤(giant cell sarcoma)、粒细胞肉瘤(granulocytic sarcoma)、霍奇金肉瘤(Hodgkin’s sarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma)、B细胞免疫母细胞肉瘤(immunoblastic sarcoma of B cells)、淋巴瘤(lymphomas)(如非霍奇金淋巴瘤)、T细胞免疫母细胞肉瘤(immunoblastic sarcoma of T-cells)、詹森肉瘤(Jensen’s sarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、白血病性肉瘤
(leukosarcoma)、恶性间叶肉瘤(malignant mesenchymoma sarcoma)、骨膜外肉瘤(parosteal sarcoma)、网状细胞肉瘤(reticulocytic sarcoma)、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)和毛细血管扩张性肉瘤(telangiectatic sarcoma)。
(leukosarcoma)、恶性间叶肉瘤(malignant mesenchymoma sarcoma)、骨膜外肉瘤(parosteal sarcoma)、网状细胞肉瘤(reticulocytic sarcoma)、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)和毛细血管扩张性肉瘤(telangiectatic sarcoma)。
[0144] 术语“黑素瘤”是指由皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。黑素瘤包括，例如肢端黑色素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无黑色素性黑色素瘤(amelanotic melanoma)、良性幼年黑色素瘤(benign juvenile melanoma)、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman’s melanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年黑色素瘤(juvenile melanoma)、恶性雀斑样痣黑色素瘤(lentigo maligna melanoma)、恶性黑色素瘤(malignant melanoma)、结节性黑色素瘤(nodular melanoma)、甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和浅表扩散性黑色素瘤(superficial spreading melanoma)。
[0145] 另外的癌症包括，例如霍奇金病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌和肾上腺皮质癌。
[0146] 如本文所用，术语“自身免疫疾病”是指个体的免疫系统(例如，活化的T细胞)攻击该个体自身的组织和细胞的病症。术语“同种免疫反应”是指个体的免疫系统攻击植入组织或细胞(如在移植(graft)或移植(transplant)中)的病症。
[0147] 用本公开方法治疗的示例性自身免疫疾病包括关节炎、秃发症、强直性脊柱炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、白塞病(Behcet's disease)、克罗恩病(Crohn's disease)、皮肌炎、糖尿病(I型)、肾小球性肾炎、Grave病(Grave’s disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、炎性肠病(IBD)、狼疮性肾炎、多发性硬化症、重症肌无力、心肌炎、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、风湿热、结节病、硬皮病、Sjogren综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、甲状腺炎(如桥本甲状腺炎和奥德甲状腺炎)、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。用本公开方法治疗的示例性同种免疫反应包括移植物抗宿主病(GVHD)和移植排斥反应。
[0148] 在一个实施方案中，单独施用IL-27融合蛋白或编码IL-27的表达载体。
[0149] 在另一个实施方案中，以有效治疗增殖性疾病，自身免疫疾病或同种免疫反应的量，将IL-27融合蛋白或编码IL-27的表达载体与一种或多种抗PD-1剂、抗-PD-L1剂和/或抗-PD-L2剂联合施用。抗PD-1剂、抗PD-L1剂或抗PD-L2剂可以是抗体、显性负相蛋白或靶向PD-1、PD-L1或PD-L2的siRNA的形式。
[0150] 在某些实施方案中，抗PD-1剂、抗-PD-L1剂或抗-PD-L2剂包括包含PD-1、PD-L1或PD-L2的胞外结构域的可溶性Fc融合蛋白。或者，可以将来自PD-1、PD-L1和/或PD-L2的一个或多个胞外结构域并入本公开的任何IL-27融合蛋白中。
[0151] 在另一个实施方案中，以有效治疗增殖性疾病，自身免疫疾病或同种免疫反应的量，将IL-27融合蛋白或表达载体与一种或多种抗B7-1剂、抗B7-2剂、抗CTLA-4剂、抗LAG-3剂、抗TIM-3剂、抗TIGIT剂、抗BTLA剂、抗-VISTA剂联合施用。抗B7-1剂、抗B7-2剂、抗CTLA-4剂、抗LAG-3剂、抗TIM-3剂、抗TIGIT剂、抗BTLA剂或抗VISTA剂可以是靶向B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA和/或VISTA的抗体，显性负相蛋白或siRNA的形式。
[0152] 在某些实施方案中，抗B7-1剂、抗B7-2剂、抗CTLA-4剂、抗LAG-3剂、抗TIM-3剂、抗TIGIT剂、抗BTLA剂或抗VISTA剂包括包含B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA或VISTA的胞外结构域的可溶性Fc融合蛋白。或者，可将来自B7-1、B7-2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA和/或VISTA的一个或多个胞外结构域并入本公开的任何IL-27融合蛋白中。
[0153] 示例性的抗PD-1抗体包括尼莫单抗(Bristol-Myers Squibb)、派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)、MK-3475、BMS-936558(Bristol-Myers Squibb)和pidilizumab/CT-011(CureTech)、MDX-1106(Medarex)。
[0154] 示例性的抗PD-L1抗体包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)、MEDI4736(Medimmune/AstraZeneca)、MPDL33280A(Genentech/Roche)、MSB0010718C(EMD Serono)。
[0155] 示例性抗CTLA-4抗体包括ipilimumab和tremelimumab。示例性抗CTLA-4显性负相蛋白包括人源化融合蛋白Abatacept(Orencia)，其包含与CTLA-4ECD融合的IgG1的Fc区，以及Belatacept(Nulojix)，其为相对于Abatacept在CTLA-4ECD中有两个氨基酸取代的第二代高亲和力CTLA-4-Ig变体。
[0156] 可以使用任何合适的给药途径或给药方式来为患者提供治疗或预防有效剂量的融合蛋白或表达载体。示例性的给药途径或给药方式包括肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、皮下、肿瘤内)、口服、局部(鼻、透皮、皮内或眼内)、粘膜(例如鼻、舌下、口腔、直肠、阴道)、吸入、淋巴内、脊柱内、颅内、腹膜内、气管内、膀胱内、鞘内、肠内、肺内、淋巴内、腔内、眼眶内、囊内和经尿道，以及通过导管或支架的局部递送。
[0157] 可在任何药学上可接受的载体或赋形剂中配置包含根据本公开的融合蛋白或表达载体的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物组合物可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。示例性载体或赋形剂包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和如聚乙二醇的聚合物。示例性的药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、或氯化钠。药学上可接受的载体还可以包括少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，增强治疗剂的保质期或有效性的防腐剂或缓冲剂。
[0158] 可将融合蛋白或重组表达载体并入适于肠胃外给药的药物组合物中。合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可以使用0-300mM浓度的氯化钠来改变溶液的毒性(液体剂型最佳为150mM)。对于冻干剂型可以包含冷冻保护剂，主要是0-10％的蔗糖(最佳为0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型可以包含疏松剂，主要是1-10％的甘露醇(最佳2-4％)。在液体和冻干剂型中均可使用稳定剂，主要为1-50mM左旋蛋氨酸(最佳为5-10mM)。其他合适的疏松剂包括甘氨酸、精氨酸，可以包含0-0.05％聚山梨醇酯-80(最佳0.005-0.01％)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
[0159] 治疗性融合蛋白制剂可被冻干并以无菌粉末保存，优选在真空下保存，然后在注射前在抑菌水(含有例如苄醇防腐剂)或无菌水中重构。可以将药物组合物配制成用于例如通过推注或连续输注来注入的肠胃外给药的剂型。
[0160] 可将药物组合物中的治疗剂配制成“治疗有效量”或“预防有效量”。“治疗有效量”是指在为实现所需治疗结果所需的剂量和时间段内有效的量。重组载体的治疗有效量可以根据以下因素而有所改变：待治疗的病症，病症的严重性和病程，给药方式，抗体或药物的施用是否用于预防或治疗目的，特定药剂的生物利用度，融合蛋白或载体在个体引发期望的反应的能力，先前的治疗，患者的年龄、体重和性别，患者的临床病史和对抗体的反应，使用的融合蛋白或表达载体的类型，主治医师的判断等。治疗有效量还是其中重组载体的治疗有益效果超过任何毒性或不利影响的量。“预防有效量”是指为达到期望的预防结果所需的剂量和时间段内有效的量。
[0161] 优选地，融合蛋白或多核苷酸中的多肽结构域衍生自它们将要被施用的相同宿主，以便减少对施用的治疗剂的炎症反应。
[0162] 将融合蛋白或表达载体在一次或一系列治疗中适当地施用于患者，并且可以在诊断之后的任何时间施用于患者。可将融合蛋白或表达载体作为唯一的治疗来施用或与可用于治疗所述病症的其它药物或疗法联合施用。
[0163] 作为一般的提议，治疗有效量或预防有效量的融合蛋白将以约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围施用，不管一次施用还是多次施用。在一个具体实施方案中，以以下的范围施用每个融合蛋白或表达载体：约1ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约1ng体重/天至约1μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约100μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约100μg/kg体重/天至约
1mg/kg体重/天，约1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
1mg/kg体重/天，约1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
[0164] 在其它实施方案中，以每三天500μg至20g的剂量，或每三天25mg/kg体重的剂量施用所述融合蛋白。
[0165] 在其它实施方案中，各融合蛋白的施用范围为每次单独给药约10ng至约100ng，每次单独给药约10ng至约1μg，每次单独给药约10ng至约10μg，每次单独给药约10ng至约100μg，每次单独给药约10ng至约1mg，每次单独给药约10ng至约10mg，每次单独给药约10ng至约100mg，每次注射约10ng至约1000mg，每次单独给药约10ng至约10,000mg，每次单独给药约
100ng至约1μg，每次单独给药约100ng至约10μg，每次单独给药约100ng至约100μg，每次单独给药约100ng至约1mg，每次单独给药约100ng至约10mg，每次单独给药约100ng至约
100mg，每次注射约100ng至约1000mg，每次单独给药100ng至约10,000mg，每次单独给药约1μg至约10μg，每次单独给药约1μg至约100μg，每次单独给药约1μg至约1mg，每次单独给药约
1μg至约10mg，每次单独给药约1μg至约100mg，每次注射约1μg至约1000mg，每次单独给药约
1μg至约10,000mg，每次单独给药约10μg至约100μg，每次单独给药约10μg至约1mg，每次单独给药约10μg至约10mg，每次单独给药约10μg至约100mg，每次注射约10μg至约1000mg，每次单独给药约10μg至约10,000mg，每次单独给药约100μg至约1mg，每次单独给药约100μg至约10mg，每次单独给药约100μg至约100mg，每次注射约100μg至约1000mg，每次单独给药约
100μg至约10,000mg，每次单独给药约1mg至约10mg，每次单独给药约1mg至约100mg，每次注射约1mg至约1000mg，每次单独给药约1mg至约10,000mg，每次单独给药约10mg至约100mg，每次注射约10mg至约1000mg，每次单独给药约10mg至约10,000mg，每次注射约100mg至约
1000mg，每次单独给药约100mg至约10,000mg，每次单独给药约1000mg至约10,000mg。可以每天，每2，3，4，5，6或7天，或每1，2，3或4周施用所述融合蛋白或表达载体。
100ng至约1μg，每次单独给药约100ng至约10μg，每次单独给药约100ng至约100μg，每次单独给药约100ng至约1mg，每次单独给药约100ng至约10mg，每次单独给药约100ng至约
100mg，每次注射约100ng至约1000mg，每次单独给药100ng至约10,000mg，每次单独给药约1μg至约10μg，每次单独给药约1μg至约100μg，每次单独给药约1μg至约1mg，每次单独给药约
1μg至约10mg，每次单独给药约1μg至约100mg，每次注射约1μg至约1000mg，每次单独给药约
1μg至约10,000mg，每次单独给药约10μg至约100μg，每次单独给药约10μg至约1mg，每次单独给药约10μg至约10mg，每次单独给药约10μg至约100mg，每次注射约10μg至约1000mg，每次单独给药约10μg至约10,000mg，每次单独给药约100μg至约1mg，每次单独给药约100μg至约10mg，每次单独给药约100μg至约100mg，每次注射约100μg至约1000mg，每次单独给药约
100μg至约10,000mg，每次单独给药约1mg至约10mg，每次单独给药约1mg至约100mg，每次注射约1mg至约1000mg，每次单独给药约1mg至约10,000mg，每次单独给药约10mg至约100mg，每次注射约10mg至约1000mg，每次单独给药约10mg至约10,000mg，每次注射约100mg至约
1000mg，每次单独给药约100mg至约10,000mg，每次单独给药约1000mg至约10,000mg。可以每天，每2，3，4，5，6或7天，或每1，2，3或4周施用所述融合蛋白或表达载体。
[0166] 在其它具体实施方案中，融合蛋白的给药量可以为约0.0006mg/天，0.001mg/天，0.003mg/天，0.006mg/天，0.01mg/天，0.03mg/天，0.06mg/天，0.1mg/天，0.3mg/天，0.6mg/天，1mg/天，3mg/天，6mg/天，10mg/天，30mg/天，60mg/天，100mg/天，300mg/天，600mg/天，
1000mg/天，2000mg/天，5000mg/天或10,000mg/天。如所预期的，剂量将取决于患者的病症、尺寸、年龄和状况。
1000mg/天，2000mg/天，5000mg/天或10,000mg/天。如所预期的，剂量将取决于患者的病症、尺寸、年龄和状况。
[0167] 在某些实施方案中，药物组合物包含有效量的重组病毒，例如rAAV，其量为每kg包10 11 12 13 14
含至少10 ，至少10 ，至少10 ，至少10 ，或至少10 个基因组拷贝(GC)或重组病毒颗粒，或其任何范围。在某些实施方案中，药物组合物包含有效量的重组病毒，例如rAAV，其量为每个受试者包含至少1010，至少1011，至少1012，至少1013，至少1014，至少1015个基因组拷贝或重组病毒颗粒基因组拷贝，或其任何范围。
含至少10 ，至少10 ，至少10 ，至少10 ，或至少10 个基因组拷贝(GC)或重组病毒颗粒，或其任何范围。在某些实施方案中，药物组合物包含有效量的重组病毒，例如rAAV，其量为每个受试者包含至少1010，至少1011，至少1012，至少1013，至少1014，至少1015个基因组拷贝或重组病毒颗粒基因组拷贝，或其任何范围。
[0168] 可以在适合于特定癌症、自身免疫疾病或同种免疫反应的几种本领域可接受的动物模型中测试剂量。
[0169] 递送方法还可以包括连接或未连接到灭活病毒的聚阳离子缩合DNA、配体连接的DNA、脂质体、真核细胞递送载体细胞、光聚合水凝胶材料的沉积的使用，手持基因转移粒子枪、电离辐射、核酸电荷中和或与细胞膜的融合、粒子介导的基因转移等的使用。
[0170] 另一方面，用于治疗增殖性疾病、自身免疫疾病或同种免疫反应的方法包括向有此需要的受试者施用单独表达本公开的IL-27融合蛋白，或联合表达抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗-PD-L2剂或其组合的细胞。
[0171] 在某些实施方案中，融合蛋白、表达载体和/或细胞可以与肿瘤抗原或嵌合抗原-受体转导的T细胞联合施用，以增强T细胞的刺激和最终的治疗功效。
[0172] 产生IL-27融合蛋白的方法
[0173] 本申请的另一方面涉及产生IL-27融合蛋白的方法，包括培养瞬时或稳定表达IL-27融合构建体的细胞；以及从培养的细胞中纯化IL-27融合蛋白。可以使用能够产生功能性IL-27融合蛋白的任何细胞。在优选的实施方案中，表达IL-27融合蛋白的细胞是真核生物或哺乳动物来源的。在某些实施方案中，产生IL-27融合蛋白的细胞是人细胞。来自各种组织细胞类型的细胞可用于单独表达IL-27融合蛋白，或与一种或多种抗PD-1、抗-PD-L1和/或抗-PD-L2试剂的组合。在其他实施方案中，细胞是酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞。
[0174] 在一些实施方案中，用表达IL-27融合蛋白的载体稳定转化产生IL-27融合蛋白的细胞。在其它实施方案中，用表达融合蛋白的载体瞬时转染产生外源体的细胞。
[0175] 表达载体可以通过任何常规方法导入细胞，例如通过裸DNA技术、阳离子脂质介导的转染、聚合物介导的转染、肽介导的转染、病毒介导的感染、物理或化学试剂或处理、电穿孔等。在一个实施方案中，用载体转染的细胞可以被直接用作外来体来源(瞬时转染)。或者，可以用表达IL-27融合蛋白的载体以及促进表达融合蛋白和/或的稳定转化的克隆的选择的选择性标记物转染细胞。可以根据本领域已知的技术，例如通过离心、色谱等收集和/或纯化由这样的细胞产生的外来体，如本文引用的参考文献和实施例中进一步描述的那样。
[0176] 对于哺乳动物细胞合适的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、湿霉素和嘌呤霉素。当将这样的可选择标记物成功转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果放置在选择的压力下，则转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的不同类别的选择形式。第一类是基于细胞的代谢和突变细胞系的使用，所述突变细胞系缺乏不依赖于补充介质的生长能力。两个实例是CHO DHFR细胞和小鼠LTK细胞。这些细胞在没有添加如胸苷或次黄嘌呤的营养物质的情况下，无法生长。因为这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径必需的某些基因，除非在补充的介质中提供缺失的核苷酸，否则它们不能存活。补充介质的替代方法是将完整的DHFR或TK基因导入缺乏相应基因的细胞中，从而改变其生长需求。未用DHFR或TK基因转化的单个细胞将不能在未补充的介质中存活。
[0177] 第二类是优势选择，其是指在任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞将表达表现耐药性的蛋白质并且将在选择后存活。这种优势选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸或潮霉素。这三个例子在真核生物控制下使用细菌基因分别传递对合适的药物G418或新霉素(遗传霉素)，xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他的药物包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
[0178] 示例性的IL-27融合蛋白表达细胞包括人Jurkat、人胚胎肾(HEK)293、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠WEHI纤维肉瘤细胞，以及单细胞原生动物物种，例如利什曼原虫(Leishmania tarentolae)。此外，可以使用用c-myc或其他永生化剂永生化的原代细胞来产生稳定转化的融合蛋白产生细胞系。
[0179] 在一个实施方案中，细胞系包含稳定转化的利什曼原虫细胞系，如利什曼原虫(Leishmania tarentolae)。已知利什曼原虫能提供一种强壮、快速生长的单细胞宿主，用于展现哺乳动物型糖基化样式的真核细胞蛋白的高水平表达。现成的有市售的利什曼原虫真核表达试剂盒(Jena Bioscience GmbH，耶拿，德国)。
[0180] 在一些实施方案中，细胞系表达至少1mg，至少2mg，至少5mg，至少10mg，至少20mg，至少50mg，或至少100mg的IL-27融合蛋白/升培养液。
[0181] 在任何合适的培养基如RPMI、DMEM和AIM 中培养和维持后，可以从IL-27融合蛋白表达细胞中分离IL-27融合蛋白。可以使用本领域技术人员已知的常规蛋白质纯化方法(例如亲和纯化、色谱等)来纯化IL-27融合蛋白。在一些实施方案中，将IL-27融合蛋白改造成分泌到培养上清液中以从中分离。可以使用常规蛋白质纯化方法分离IL-27融合蛋白，包括使用包含Fc结合区的IL-27融合蛋白的蛋白A或蛋白G免疫亲和纯化。
[0182] 类似地，可用上述方法表达蛋白质，包括针对PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体和显性负相蛋白。
[0183] 通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为限制。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图和表格通过引用并入本文。
[0184] 实施例
[0185] 实施例1.通过重组腺伴随病毒(AAV)载体表达IL-27融合蛋白
[0186] 使用引物mIL-27(Xho1)：5'-AAT CTA CTC GAG ATC ACC GGT AGG AGG GCC AA-3'(SEQ ID NO：139)和mIL-27(EcoRV)：5'-ATG TAT GAT ATC ATG TCG AGC TAG CTT AGG AA-3'(SEQ ID NO：140)，从pUNO1-mIL27(ebi3p28)(Invivogen)PCR扩增含有EBI3、p28及它们之间的连接子的cDNA。在一个实施方案中，用XhoI/EcoRV切割PCR扩增产物，并在CMV-鸡β-肌动蛋白杂合(CAG)启动子的控制下连接到AAV-8表达载体(pAM/CBA-pl-WPRE-bGH，SEQ ID NO：141)以形成IL-27表达载体。如(Wang Z等人，Nat Biotechnol.2005；23(3)：321-8；和Qiao C等人，Hum Gene Ther.2008；19(3)：241-54)所描述的，在293K细胞中使用pAAV-RC载体(AAV血清型8，AAV8)和腺病毒辅助载体包装IL-27表达载体以产生AAV-IL-27，一种表达在pUNO1-mIL27(ebi3p28)载体中编码IL-27融合蛋白的基于AAV8的重组AAV载体。
[0187] 实施例2.使用AAV-IL-27作为癌症免疫治疗的治疗剂
[0188] 为了确定IL-27是否可以被用作潜在的癌症治疗剂，在实施例1中，进行表达IL-27(AAV-IL-27)的重组腺伴随病毒载体的肌内注射(im)，并将结果与对照AAV载体(AAV-Ctrl)比较。每只AAV-IL-27的小鼠肌内注射2×1011个有缺陷的病毒颗粒(DVP)，从而在小鼠的外周血中实现了高且稳定的IL-27的产生。(图1A)。
[0189] 为了测试AAV-IL-27是否可用于治疗携带B16黑素瘤的小鼠，将B16.F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下(s.c.)注射到C57BL/6小鼠中。肿瘤细胞注射后4天，以2×1011DVP/小鼠的剂量用AAV-IL-27或AAV-Ctrl病毒肌肉注射小鼠。如图1B所示，肿瘤在AAV-Ctrl病毒治疗的小鼠中逐渐生长，而在AAV-IL-27处理的小鼠中B16肿瘤生长得到显著抑制。此外，将B16.F10细胞静脉内注射(i.v.)入B6小鼠，接着4天后，注射单剂量(2×1011DVP/小鼠)的AAV-IL-27或AAV-Ctrl对照病毒。如图1C所示，与使用AAV-Ctrl病毒治疗的小鼠相比，接受AAV-IL-27治疗的小鼠的肺部肿瘤灶明显减少。结果，两组小鼠的肺重量差异显著。因此，AAV-IL-27治疗显著抑制B16黑素瘤肿瘤生长和肺转移。
[0190] 由于已知IL-27增强Th1/Tc1应答，因此检查AAV-IL-27和AAV-Ctrl病毒处理的小鼠之间的T细胞应答是否不同是有意义的。使用流式细胞术分析来自AAV-IL-27处理的小鼠和对照组的脾脏和肿瘤中的T细胞应答。明显地发现FoxP3+Treg细胞在脾脏中耗尽，并且在来自AAV-IL-27处理的小鼠的肿瘤中大大减少(图2A)。另外，发现AAV-IL-27的治疗显著增加了肿瘤中产生IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的百分比(图2B)。这些结果表明，AAV-IL-27处理消耗外周淋巴器官中的Treg细胞，增强肿瘤中Th1/Tc1的应答。
[0191] 实施例3.关于AAV-IL-27和其它免疫治疗剂的联合疗法
[0192] 尽管AAV-IL-27治疗降低了Treg细胞并增强了肿瘤特异性Th1/Tc1细胞，但AAV-IL-27的抗肿瘤功效是不完全的，因为肿瘤最终在所有AAV-IL-27-治疗小鼠中长出。因此，还关心限制AAV-IL-27治疗功效的因素的研究。
[0193] 最近，IL-27显示诱导T细胞中PD-L1的表达，PD-L1通过与T细胞上的PD1相互作用+ +诱导T细胞耐受。在来自接受AAV-IL-27治疗的血液、脾脏和肿瘤的CD4和CD8T细胞中证实了该观察结果(图3A)。另外，发现显著比例的肿瘤浸润性CD4+和CD8+T细胞表达PD1，并发现AAV-IL-27治疗可上调T细胞中的PD1的表达(图3B)。
[0194] 为了确定T细胞中IL-27诱导的PD-L1的表达是否降低了IL-27治疗的有效性，用2×105个B16.F10细胞皮下注射了4组(n＝5只小鼠/组)C57BL/6小鼠，随后接受以下四种不同治疗之一：(1)AAV-Ctrl病毒+对照mAb；(2)AAV-Ctrl病毒+抗PD1；(3)AAV-IL-27病毒+对照mAb；和(4)AAV-IL-27病毒+抗PD1。在肿瘤细胞注射四天后，将AAV病毒以2×1011DVP的剂量肌肉注射到每只小鼠中。从第4天开始以三天间隔，将抗体以300μg/小鼠的剂量腹腔注射到小鼠中。如图4A所示，与用AAV-Ctrl病毒+对照mAb或AAV-Ctrl病毒+抗-PD1治疗的小鼠相比，用AAV-IL-27加对照mAb治疗的小鼠显示出显著降低的肿瘤生长。在用AAV-IL-27+抗PD-1处理的小鼠中观察到最显著的肿瘤生长抑制(图4A)。将用AAV-IL-27+抗PD-1处理的小鼠的功效与接受AAV-IL-27+抗CTLA-4处理的小鼠进行比较。该分析显示IL-27表达与PD1阻断的组合在抑制B16黑素瘤肿瘤生长中产生显著的协同作用(图4B)。相比之下，AAV-IL-27给药与CTLA4阻断在抑制B16黑色素瘤肿瘤生长中没有产生任何协同作用(图4B)。
[0195] 为了检查AAV介导的IL-27表达和PD1阻断联合治疗引起肿瘤抑制的机制，分析来自AAV-IL-27+抗PD1处理的小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以及来自其他小鼠对照组的TIL。发现单独的AAV-IL-27或抗PD1治疗增加产生IFN-γ的CD4+(图5A)和CD8+(图5B)T细胞+ +的比例。然而，AAV-IL-27+抗PD-1联合治疗大大增加了产生IFN-γ的CD4 (图5A)和CD8 (图
5B)T细胞的比例。然而，与抗PD-1的治疗无关的是，AAV-IL-27在脾脏(图6A)和肿瘤微环境(图6B)中都消除了FoxP3+Treg。
5B)T细胞的比例。然而，与抗PD-1的治疗无关的是，AAV-IL-27在脾脏(图6A)和肿瘤微环境(图6B)中都消除了FoxP3+Treg。
[0196] 在B16肿瘤的肿瘤微环境中，Treg似乎是IL-10的主要来源(图6B)。然而，在AAV-+ +IL-27和AAV-IL-27+抗PD-1处理的小鼠中，常规的TIL CD4T细胞，而不是脾脏中常规的CD4T细胞被诱导产生IL-10，并且AAV-IL-27和抗PD1治疗似乎协同诱导CD4+T细胞中IL-10的分泌(图6B)。尽管IL-27在脾脏CD8+T细胞中不能诱导IL-10(图7A)，但是在肿瘤的CD8+T细胞中观察到强烈的IL-10诱导(图7B)，AAV-IL-27与抗PD1的联合疗法对TIL CD8+T细胞的IL-10诱导产生协同作用。
[0197] 实施例4.使用AAV-IL-27治疗自身免疫疾病
[0198] 为了测试AAV-IL-27是否加重或减弱自身免疫疾病，根据常规程序使用MOG肽在C57BL/6小鼠中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，随后用对照AAV或AAV-IL-27进行治疗。如图8A所示，用对照AAV处理的EAE小鼠产生很强的自身免疫疾病。相反，用AAV-IL-27处理的EAE小鼠尽管Th1的产生增加且Treg的产生减少(图8B)但没有显示临床症状。AAV-IL-+ +27处理的小鼠中EAE的减少与Th17 细胞百分比的减少和Tr1 细胞百分比的增加相关(图
8B)。
8B)。
[0199] 为了测试AAV-IL-27在治疗自身免疫疾病中的一般效用，通过将CD45RBhi CD4T细胞过继转移到免疫缺陷的Rag1缺陷小鼠中，在小鼠中诱导炎症性肠病。如图9所示，AAV-IL-27治疗防止体重减轻(图9A)，减少结肠肿胀(图9B)并消除炎症性肠病的所有临床症状(图
9C)。相比之下，与IL-27的p28亚基相同的AAV-IL30几乎没有或没有作用。
9C)。相比之下，与IL-27的p28亚基相同的AAV-IL30几乎没有或没有作用。
[0200] 图8和图9的结果显示IL-27以及由本文公开的IL-27组成的各种形式的融合蛋白可用于治疗自身免疫疾病。IL-27治疗可用于显示活动性疾病发作或自身免疫疾病正在缓解的患者。
[0201] 实施例5.IL-27融合蛋白的组成和产生：GS-IL27Fc、PV-IL27Fc、GS-IL27mFc和PV-IL27mFc
[0202] 与病毒载体相比，重组蛋白质更容易标准化以用于临床应用，并且对于监管批准具有更容易的途径。然而，在复杂蛋白质的产生中存在若干挑战。首先，IL-27由两条链组成，因此如果分开表达，则可能难以正确地折叠在一起。为了确保将来大规模生产和纯化，并提供增加的体内稳定性，将IL-27融合构建体融合到免疫球蛋白Fc片段。在某些实施方案中，引入突变以防止与Fc结合相关的不期望的生物效应，包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。由此，产生两种IL-27融合蛋白(SEQ ID NO：71和73)。
[0203] 如图的上部所示，图10A中的IL27Fc融合蛋白从N至C末端由信号肽、EBI3、PV(SEQ ID NO：7)或GS连接子(SEQ ID NO：8)、p24和Fc组成。图10A显示了两种融合蛋白的产生，一个具有PV连接子(左图)，另一个具有GS连接子(右图)。左图示出了具有SEQ ID NO：71氨基酸序列的融合蛋白，右侧显示具有SEQ ID NO：73氨基酸序列的融合蛋白。通过SDS-PAGE在还原(左泳道)和非还原(右泳道)条件下分析蛋白质。该分析证实该融合蛋白形成二聚体。在凝胶照片下方提供蛋白质产量。
[0204] 通过亲和纯化实现了这两种融合蛋白的成功纯化；两种融合蛋白(SEQ ID NO：71，73)以相似的产率表达和纯化(图10A)。这些数据表明，可以产生突变Fc形式，而对纯化没有显著的不利影响。
[0205] 如上进一步描述的，考虑几种额外的结构构型，包括表1和2中的那些。实施例5中IgG1的使用仅仅是IgG Fc(即，IgG重链恒定区)的示例性IgG同种型来源；基于图10中所示的相同设计也可以使用其它Fc亚类。
[0206] 实施例6.IL-27融合蛋白活性的功能测定
[0207] 为了测试IL-27融合蛋白的生物活性，利用产生IL-10的诱导用于体外筛选，因为该活性对于IL-27诱导的T细胞存活和肿瘤排斥是必需的。如图11A中所示，发现实施例5中描述的两种IL-27融合蛋白都是抗CD3刺激的脾细胞中IL-10的有效诱导剂。此外，虽然低剂量的IL-27融合蛋白适度增强IFNγ产生，但较高剂量抑制了IFNγ的产生，这表明高剂量时，融合蛋白可用于抑制自身免疫疾病(图11B)。
[0208] 可用这些功能测定来监测IL-27融合蛋白的生物活性，并可用其来优化氨基酸组成以确保高产量和有效的生物活性。
[0209] 实施例7.在体内直接注射IL-27融合蛋白
[0210] 为了测试IL27mFc是否可以促进肿瘤排斥，用B16F10肿瘤细胞系攻击C57BL/6小鼠。由于IL-27与抗PD-1抗体协同作用，并且由于抗PD-1单独不影响小鼠中肿瘤的生长(图4)，测试了使用直接注射IL27mFc融合蛋白联合抗-PD1mAb的联合疗法。如图12A所示，直接注射IL-27mFc融合蛋白联合抗PD1抗体显著延缓肿瘤生长。这些数据显示，当与抗PD1联合使用时，IL-27Fc是肿瘤生长的有效抑制剂。优选地，将使用与人组分最同源的融合蛋白组合物用于癌症治疗。
[0211] 实施例8.CD24-IL-27-Fc融合蛋白的制备
[0212] 许多癌症免疫治疗剂，例如抗CTLA-4mAb引起不良的自身免疫作用。因此，优选进一步提高针对自身免疫疾病的治疗效果，而不降低癌症治疗效果。因此，在一个实施方案中，构建了其中CD24的胞外结构域插入IL27Fc中的IL-27融合蛋白(图10B)。如图10B(上图)所示，CD24IL27Fc前蛋白含有信号肽、CD24细胞外结构域(CD24ECD)、通过连接子连接的EBI3和p28亚基以及IgG Fc。含有SEQ ID NO：79氨基酸序列的这些蛋白质之一通过转染CHO细胞中获得成功表达。如图10B(下图)所示，与IL27Fc(SEQ ID NO：71,73)相比，发现该融合蛋白以约6倍的更高水平表达。这些数据表明，CD24ECD的包含可能通过增加稳定性和/或溶解度来提高表达和产量。
[0213] 实施例9.CD24IL27Fc作为癌症治疗剂
[0214] 为了测试CD24IL27mFc(SEQ ID NO：79)作为癌症治疗的治疗剂的潜力，将B10F10肿瘤细胞皮下移植到同基因C57BL/6小鼠中。在第8天，当肿瘤可被明确摸到时，用Fc对照、CD24IL27mFc融合蛋白(SEQ ID NO：79)、抗PD1或抗PD1与CD24IL27mFc联合治疗小鼠。每日三次处理后，观察小鼠4周以上。如图13A中所示，尽管抗PD-1不能减少肿瘤生长，但单独的或与抗PD1联合的CD24IL27mFc显著降低肿瘤生长(图13A)。当使用抗PD-1和CD24IL27mFc时，观察到统计学上显著的存活延长(图13B)。总之，这些数据减少了CD24IL24Fc可以用于单一疗法或与其他免疫治疗药物(如抗PD-1)联合治疗的实践。
[0215] 实施例10.用于治疗IPEX综合征的模型系统
[0216] Foxp3基因的突变引起小鼠和人类的致命性自身免疫疾病。将该症状称为IPEX(免疫功能障碍、多发性内分泌病、肠病、X染色体连锁(IPEX)综合征)。尽管骨髓移植已成为选择的治疗方法，但尚未治愈。大多数受影响的儿童在出生后的前2年内死亡。IPEX综合征是一种在男性中排他表达的X染色体连锁隐性疾病。由于具有Foxp3基因(Foxp3sf)突变的Scurfy小鼠显示与人类IPEX类似的发病机制，因此使用该模型来确定IL-27-rAAV是否可以治疗IPEX。如图14所示，单次注射IL-27-rAAV大大改善了如围产期期间增加体重所表明的小鼠的发育(图14A)。此外，该治疗使Scurfy小鼠的存活率几乎翻了一番(图14B)。
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