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用于癌症免疫疗法的NKG2D-IG融合蛋白

阅读：522发布：2020-05-13

专利汇可以提供用于癌症免疫疗法的NKG2D-IG融合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供用于癌症免疫疗法的方法和组合物。所述方法涉及使用包含二聚NKG2D部分和Fc部分的嵌合分子(例如融合蛋白)，所述嵌合分子结合一或多种NKG2D配体。在一些实施例中，所述分子进一步包含药物部分(例如IL15/Ra部分)。本文所公开的所述方法适用于治疗与一或多种NKG2D配体的异常表达相关的癌症。，下面是用于癌症免疫疗法的NKG2D-IG融合蛋白专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种二聚NKG2D-Fc嵌合体，其包含：NKG2D1-NKG2D2-Fc，其中
NKG2D1和NKG2D2各自包含NKG2D或其片段并且能够结合NKG2D配体；并且
Fc包含免疫球蛋白的片段可结晶区Fc。
2.根据权利要求1所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其进一步包含药物部分。
3.根据权利要求2所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述药物部分连接到所述嵌合体的氨基端或羧基端。
4.根据权利要求2所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述药物部分连接到所述嵌合体的所述羧基端。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其进一步包含至少一种连接分子，其中所述至少一种连接分子并非所述NKG2D1、NKG2D2、Fc或药物部分的连续部分并且共价连接：
(a)NKG2D1的氨基酸与NKG2D2的氨基酸；
(b)NKG2D2的氨基酸与Fc的氨基酸；或
(c)Fc的氨基酸与所述药物部分。
6.根据权利要求5所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述嵌合体包含三种连接分子X1、X2和X3，其中
X1共价连接NKG2D1的氨基酸与NKGD2的氨基酸；
X2共价连接NKG2D2的氨基酸与Fc的氨基酸；并且
X3共价连接Fc的氨基酸与所述药物部分。
7.根据权利要求5所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述至少一种连接分子是肽连接子。
8.根据权利要求7所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述肽连接子的长度在约2到约25个氨基酸范围内。
9.根据权利要求5所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述至少一种连接分子是甘氨酸-丝氨酸连接子。
10.根据权利要求9所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述甘氨酸-丝氨酸连接子由式(GS)n表示，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
11.根据权利要求9所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述甘氨酸-丝氨酸连接子由式(GGGGS)n(SEQ ID NO:2)表示，其中n为1、2、3、4或5。
12.根据权利要求6所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中X1是(GS)3并且X2、X3和X4各自是(GGGGS)4(SEQ ID NO:3)。
13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述NKG2D片段包含NKG2D的胞外片段。
14.根据权利要求13所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述NKG2D胞外片段由SEQ ID NO:1表示。
15.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述Fc包含人类免疫球蛋白(IgG)的片段可结晶区Fc。
16.根据权利要求15所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述人类免疫球蛋白是IgG1。
17.根据权利要求2到16中任一权利要求所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述药物部分选自由以下组成的群组：细胞因子、趋化因子、小分子、毒素、放射性核种和酶。
18.根据权利要求17所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述药物部分是选自由以下组成的群组的细胞因子：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-α。
19.根据权利要求17所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述药物部分包含IL-15和可溶性IL-15受体α链的杂合物。
20.根据权利要求19所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中所述IL-15通过GS连接子连接到所述可溶性IL-15受体α链。
21.一种组合物，其包含根据权利要求1到20中任一权利要求所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体和药学上可接受的载剂。
22.一种用于治疗癌症的方法，其包含：
以有效治疗所述癌症的量向患有NKG2D配体表达癌症的个体施用根据权利要求1到20中任一权利要求所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述NKG2D配体表达癌症是黑素瘤、肺癌、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、胰脏癌或前列腺癌。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其进一步包含用其它抗癌疗法治疗所述个体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述其它抗癌疗法选自由以下组成的群组：手术、放射疗法、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、辅助疗法和免疫疗法。
26.根据权利要求22到24中任一权利要求所述的方法，其中所述其它癌症疗法是损伤DNA的化疗。
27.根据权利要求22到26中任一权利要求所述的方法，其中相比于单体NKG2D-Fc嵌合体，所述二聚NKG2D-Fc嵌合体以增加的亲合力结合到NKG2D配体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述NKG2D配体是MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5或ULBP6。
29.根据权利要求27到28中任一权利要求所述的方法，其中所述亲合力增加2倍、5倍、
10倍、100倍或1000倍。

说明书全文

用于癌症免疫疗法的NKG2D-IG融合蛋白

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求2015年11月13日提交的美国临时申请第62/255,016号在35U.S.C.§119(e)下的优先权，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

[0003] NKG2D是具有胞外凝集素样结构域的II型跨膜糖蛋白。这一结构域缺乏真C型凝集素中发现的可辨识钙结合位点并且结合蛋白质而非碳水化合物配体。NKG2D是在各种免疫细胞中表达的活化受体。人类NKG2D在CD8+αβT细胞、γδT细胞、NK细胞和NKT细胞上表达。在小鼠系统中，NKG2D也出现在巨噬细胞上。NKG2D的人类配体包括MHC I类链相关分子(MICA和MICB)、UL16-结合蛋白(ULBP1、ULBP2、ULBP3和ULBP4)和RAET-1G；并且NKG2D的小鼠配体包括少量组织相容抗原60(H60)和视黄酸早期可诱导转录本(RAE-1)。NKG2D配体的表达在肠上皮细胞、肿瘤细胞中并且在应激或感染条件下也出现。

[0004] NKG2D以配体结合时传递活化信号的二硫键连接的均二聚体形式存在。信号传递需要与接头蛋白质的关联。NKG2D mRNA的选择性剪接产生具有不同细胞质结构域的同功异型物，其可与DAP12关联以递送真活化信号或与DAP10关联从而产生协同刺激信号。NKG2D已涉及对病毒感染的免疫监视和免疫反应。另外，已在增殖细胞和许多类型的癌症中检测到较高含量的NKG2D配体。

[0005] 某些NKG2D-Fc嵌合体和其用途先前已公开于例如出版的PCT申请WO/2010/080124中，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。发明内容

[0006] 在本公开内容中，提供用于癌症疗法的新颖组合物和方法。本发明至少部分地基于以下出人意料的发现：包含两个NKG2D片段和Fc片段的嵌合分子(例如二聚NKG2D-Fc嵌合体)能够结合一或多种NKG2D配体，相比于包含单个NKG2D片段和Fc片段的嵌合分子(例如单体NKG2D-Fc嵌合体)，所述嵌合分子用提高的功效诱导肿瘤细胞死亡。在一些实施例中，相比于单体NKG2D-Fc嵌合体，此文件所描述的二聚NKG2D-Fc嵌合体以增加的亲合力结合到NKG2D配体。在一些实施例中，亲合力增加2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。

[0007] 因此，在一些方面中，本公开提供包含以下的二聚NKG2D-Fc嵌合体：NKG2D1-NKG2D2-Fc，其中NKG2D1和NKG2D2各自包含NKG2D或其片段并可结合NKG2D配体；并且Fc包含免疫球蛋白的片段可结晶区(Fc)。在一些方面，本公开提供组合物，其包含如本文所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体和药学上可接受的载剂。

[0008] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体进一步包含药物部分。在一些实施例中，药物部分连接到嵌合体的氨基端或羧基端。在一些实施例中，药物部分连接到嵌合体的羧基端。

[0009] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体进一步包含至少一种连接分子，其中至少一种连接分子并非NKG2D1、NKG2D2、Fc或药物部分的连续部分并且共价连接：NKG2D1的氨基酸与NKG2D2的氨基酸；NKG2D2的氨基酸与Fc的氨基酸；或Fc的氨基酸与药物部分。

[0010] 在一些实施例中，至少一种连接分子是肽连接子。在一些实施例中，肽连接子的长度在约2到约25个氨基酸范围内。在一些实施例中，至少一种连接分子是甘氨酸-丝氨酸连接子。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子由式(GS)n表示，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子由式(GGGGS)n(SEQ ID NO:2)表示，其中n为1、2、3、4或5。

[0011] 在一些实施例中，嵌合体包含三种连接分子X1、X2和X3，其中X1共价连接NKG2D1的氨基酸与NKGD2的氨基酸；X2共价连接NKG2D2的氨基酸与Fc的氨基酸；并且X3共价连接Fc的氨基酸与药物部分。在一些实施例中，X1是(GS)3(SEQ ID NO:4)并且X2、X3和X4各自是(GGGGS)4(SEQ ID NO:3)。

[0012] 在一些实施例中，NKG2D片段包含NKG2D的胞外片段。在一些实施例中，NKG2D胞外片段由SEQ ID NO:1表示。

[0013] 在一些实施例中，Fc包含人类免疫球蛋白(IgG)的片段可结晶区(Fc)。在一些实施例中，人类免疫球蛋白是IgG1。

[0014] 在一些方面中，本公开提供用于治疗癌症的方法，包含以可有效治疗癌症的量向患有NKG2D配体表达癌症的个体施用如此文件所描述的二聚NKG2D-Fc嵌合体。

[0015] 在一些实施例中，NKG2D配体表达癌症是黑素瘤、肺癌、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、胰脏癌或前列腺癌。在一些情况下，这些癌症中的一种或多种可存在于个体中。

[0016] 在一些实施例中，方法进一步包含用其它抗癌疗法治疗个体。在一些实施例中，其它抗癌疗法选自由以下组成的群组：手术、放射疗法、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、辅助疗法和免疫疗法。

[0017] 在一些实施例中，其它癌症疗法是损伤DNA的化疗。

[0018] 在一些实施例中，NKG2D配体是MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5或ULBP6。

[0019] 本发明的限制中的每一个可以包涵本发明的各种实施例。因此，预期涉及任何一种要素或要素的组合的本发明的限制中的每一个可以包含在本发明的每一方面中。本发明在其应用中不限于以下描述中阐述或图式中说明的组件的建造和布置的细节。本发明能够具有其它实施例并且以各种方式实践或进行。此外，本文所用的措词和术语是出于描述的目的并且不应被视为是限制性的。本文“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”以及其变体的使用意指涵盖在其后所列举的项目和其等效物以及额外项目。附图说明

[0020] 图1展示具有(右)和无(左)药物部分的二聚NKG2D-Fc嵌合体的图式。

[0021] 图2展示hNKG2Dx2-hIgG1-hIL15/Ra以单融合蛋白形式产生，并且通过蛋白A纯化。

[0022] 图3展示hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra类似于IL-15促进人类NK细胞的增殖。

[0023] 图4展示hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra促进多个细胞系的有效杀灭，并且优于具有中度配体表达的细胞株中的hNKG2Dx2-hIgG1。图A展示构筑体均未促进不表达NG2D-L的B16肿瘤细胞系的杀灭。图B展示两种构筑体同等地促进表达高含量NKG2D配体的合成B16肿瘤细胞系的杀灭。图C展示各种肿瘤在其细胞表面上表达不同含量的NKG2D配体，如通过NKG2D融合蛋白结合所测量。图D展示hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra比hNKG2Dx2-hIgG1更有效地杀灭表达中度NKG2D配体的细胞。

[0024] 图5展示静息NK细胞由融合蛋白活化以产生IFN-γ，但最大生产率需要所有三种组分：NKG2D、hIgG1和IL-15。N297Q是防止CD16(在NK上表达)结合于hIgG1的hIgG1中的突变。

[0025] 图6展示预活化NK细胞需要CD16结合于杀灭靶细胞，但不需要IL-15。

[0026] 图7展示静息NK细胞的最佳活化和通过静息NK细胞的杀灭需要CD16结合和IL-15活化。

[0027] 图8展示ELISA分析，所述ELISA分析表明相比于作为单体NKG2D-Fc嵌合体的hNKG2Dx1-hIgG1，NKG2Dx2-hIgG1用提高的亲合力结合于MICA*008。

[0028] 图9展示流式细胞测量术分析，所述分析表明相比于hNKG2Dx1-hIgG1，hNKG2Dx2-hIgG1用提高的亲合力结合到NKG2D配体表达细胞。

[0029] 图10展示NKG2D-Fc驱动配体阳性标靶的NK细胞杀灭。二聚NKG2D-Fc嵌合体比单体NKG2D-Fc嵌合体更有效地介导杀灭。*描绘p<0.5并且**描绘p<0.01。

[0030] 图11展示二聚NKG2D-Fc嵌合体(例如hNKG2Dx2-hIgG1)比单体NKG2D-Fc嵌合体(例如hNKG2Dx1-hIgG1)更高效地杀灭NKG2D配体表达细胞。**描绘p<0.01。

[0031] 图12展示可溶性MICA的NKG2Dx2-hIgG1中和优于NKG2Dx1-hIgG1中和。*描绘p<0.05；**描绘p<0.01；***描绘p<0.005；并且****描绘p<0.001.

[0032] 图13展示具有人类MICA的复合物(hMICA)中的二聚hNKG2D-hIgG1的结构模型。(G4S)4是SEQ ID NO:3；GGSGGGSG是SEQ ID NO:5。

具体实施方式

[0033] 本文所公开的是用于癌症免疫疗法的新颖组合物和方法。本发明的组合物和方法至少部分地基于以下出人意料的发现：包含两个NKG2D片段和Fc片段的嵌合分子(例如二聚NKG2D-Fc嵌合体)能够结合一或多种NKG2D配体，相比于包含单个NKG2D片段和Fc片段的嵌合分子(例如单体NKG2D-Fc嵌合体)，所述嵌合分子用提高的功效诱导肿瘤细胞死亡。

[0034] 现有技术中所描述的单体NKG2D-Fc嵌合体(例如出版的PCT申请WO/2010/080124中所描述的构筑体)对NKG2D配体展现较低的结合亲合力(例如低结合亲合力指数)。相比于通过在同一分子上提供多个NKG2D受体(或其部分)的现有技术单体构筑体，本文所描述的二聚NKG2D-Fc构筑体提供增加的结合亲合力(例如至少1.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的提高的亲合力指数)。不希望受任何具体的理论所束缚，认为单分子上的多种NKG2D受体的存在增加NKG2D-NKG2D配体结合相互作用的数目和持续时间，从而导致抗肿瘤活性提高。实际上，如实例部分中所示，相比于现有技术单体NKG2D-Fc嵌合体，二聚NKG2D-Fc嵌合体展现高达100倍提高的结合亲合力。然而，这种方法的成功是不可预测的，因为不知道提高嵌合构筑体中的受体(或其部分)的数目将抑制结合相互作用(例如通过位阻)还是造成可能干扰分子稳定性的嵌合体的聚集。

[0035] 已知NKG2D配体在癌细胞上表达。因此，在一些实施例中，本公开提供用于个体(例如人类个体)中的癌症疗法的方法，所述方法包含向患有NKG2D配体表达癌症的个体施用如本文所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体。不同于采用对NKG2D配体(如MICA)的单克隆抗体的免疫疗法，基于NKG2D结合于多种配体，认为本文所提供的方法对癌症具有广泛作用。

[0036] 二聚NKG2D-Fc嵌合体可靶向任何或所有在人类肿瘤细胞上表达的NKG2D配体，并因此能够通过补体溶解和ADCC介导肿瘤细胞破坏。NKG2D-Fc嵌合体也能够调理任何表达至少一种NKG2D配体的肿瘤细胞。NKG2D-Fc嵌合体可通过树突状细胞促进有效的交叉呈递(例如激活)，从而引起对肿瘤的有效T细胞反应的诱导。此外，这种嵌合体能够结合并隔离通过肿瘤细胞产生的任何“梭口”(例如可溶性或释放)NKG2D配体，进而由于回应于肿瘤衍生的可溶性配体下调NKG2D表达而缓解免疫抑制。

[0037] NKG2D-Fc

[0038] 在一些方面中，本公开提供包含以下的二聚NKG2D-Fc嵌合体：NKG2D1-NKG2D2-Fc，其中NKG2D1和NKG2D2各自包含NKG2D或其片段并可结合NKG2D配体；并且Fc包含免疫球蛋白的片段可结晶区(Fc)。在一些实施例中，NKG2D片段包含NKG2D的胞外片段。在一些实施例中，NKG2D胞外片段由SEQ ID NO:1表示。

[0039] 如本文所用，“二聚NKG2D-Fc嵌合体”是包含两个NKG2D配体结合位点的嵌合分子，其中每个配体结合位点包含至少一部分或所有NKG2D受体并能够结合NKG2D配体。配体结合位点融合到Fc片段。在实例部分和图示中，二聚NKG2D-Fc嵌合体的两个NKG2D配体结合位点也共同称为“NKG2Dx2”。现有技术中所描述的单体NKG2D-Fc嵌合体可以称为“NKG2Dx1”。术语“嵌合体”、“嵌合分子”等一般指代由来自多种源或来源的部分组成的分子。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc以重组嵌合融合蛋白的形式产生。

[0040] 在一些实施例中，相比于单体NKG2D-Fc嵌合体，本文所描述的二聚NKG2D-Fc嵌合体以增加的亲合力结合到NKG2D配体。如本文所用，“亲合力”指代遍及配体与受体之间的单独非共价结合交互作用的多种亲和力的综合强度。测量结合亲合力的方法为本领域中已知并且包括例如ELISA、表面等离子共振分析、CD分析、荧光骤冷、尺寸排阻结合分析和等温滴定量热法。为简要描述这些分析，参见例如伦吉尔(Lengyel)等人,2007《, 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,282:30658-666)。在一些实施例中，通过测量亲合力指数确定结合亲合力。在一些实施例中，相比于单体NKG2D-Fc嵌合体，二聚NKG2D-Fc嵌合体对NKG2D配体的结合亲合力的增加在约2倍与约2000倍之间。在一些实施例中，结合亲合力增加在约2倍与1000倍之间。在一些实施例中，结合亲合力增加在约2倍与100倍之间。在一些实施例中，结合亲合力增加在约5倍与1000倍之间。在一些实施例中，结合亲合力增加在约5倍与200倍之间。在一些实施例中，结合亲合力增加在约2倍与约20倍之间。在一些实施例中，结合亲合力增加2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，结合亲合力增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、或至少1000倍。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc构筑体相比于单体NKG2D-Fc嵌合体具有提高的结合亲合力指数，例如至少1.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的提高的亲合力指数。

[0041] NKG2D

[0042] 在一些方面中，本公开提供包含两种NKG2D或其片段的二聚NKG2D-Fc嵌合体。也称为KLRK1的NKG2D；杀手细胞凝集素样受体子族K，成员1；CD314；KLR；NKG2-D；FLJ17759；FLJ75772或D12S2489E是NK细胞的主要触发受体中的一种并为本领域中所熟知。参见例如加里蒂(Garrity)等人(2005)。用于二聚NKG2D-Fc的NKG2D受体的部分基于结合至少一种配体的NKG2D(例如寄存号：NP_031386)或其衍生物的已知序列。可用于本发明的组合物和方法的NKG2D的衍生物包括但不限于含有一个或多个突变的NKG2D序列，所述突变如点突变、取代、缺失突变和/或插入突变。本领域的技术人员可根据本公开内容的教示和本领域中可用的知识容易地确定NKG2D的适合衍生物。在cDNA水平下，这类突变可以是沉默突变。或者，突变可导致对应氨基酸残基的改变。在后者情况下，变化可构成保守性变化，使得氨基酸残基被具有类似特征的另一胺基酸残基置换。然而，在一些情况下，突变可产生非保守取代。
这类突变达到二聚NKG2D-Fc嵌合体能够结合于NKG2D配体的程度为可接受的。

[0043] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体的每个NKG2D部分是全长NKG2D多肽。NKG2D的全长序列已描述于文献中。参见例如参考序列寄存号：NP_031386。另外，已描述NKG2D的选择性剪接变体。出于本发明的目的，可以使用这类选择性剪接变体中的任一种，其限制条件为当构建为二聚NKG2D-Fc嵌合体时，所得多肽能够结合其配体。

[0044] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体的每个NKG2D部分是NKG2D受体多肽的部分序列(即片段)，其限制条件为所得多肽在构建为二聚NKG2D-Fc嵌合体时保留结合其配体的能力。举例来说，二聚NKG2D-Fc构筑体的每个NKG2D部分可以由NKG2D序列的任一末端缩短一或多个氨基酸残基。更具体来说，NKG2D序列的N端可缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个或更多个残基。类似地，NKG2D序列的C端可缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个残基。在一些实施例中，N端和C端两者均可以如所描述缩短。

[0045] 已经证明NKG2D的胞外部分有助于形成均二聚体并形成配体-结合位点。因此，有可能删除部分或全部NKG2D的胞内部分并仍维持结合其配体的能力。举例来说，本公开中所描述的二聚NKG2D-Fc嵌合体可主要含有NKG2D受体的胞外片段。结构分析已揭示人类NKG2D序列的氨基酸残基78到216对应于含有配体-结合位点的NKG2D的胞外部分。对于小鼠对应物，细胞外结构域是氨基酸残基78-232、94-232或92-232。

[0046] 因此在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc构筑体的每种NKG2D包含NKG2D序列的胞外部分，例如人类NKG2D的氨基酸残基78-216；小鼠NKG2D的78-232、94-232或92-232。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc构筑体包含一部分细胞外结构域。因此，二聚NKG2D-Fc构筑体的细胞外结构域可以在N端、C端或两者处缩短。举例来说，相对于多肽的全部胞外部分，用于产生二聚NKG2D-Fc的细胞外结构域的N端可以缩短一或多个氨基酸残基，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、约30个、约40个、约50个、约60个等等。相对于多肽的全部胞外部分，用于产生NKG2D-Fc的细胞外结构域的C端可以缩短一或多个氨基酸残基，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、约30个、约40个、约50个、约60个等等。使用人类NKG2D作为实例，二聚NKG2D-Fc构筑体可含有细胞外结构域的片段，其中结构域的N端开始于氨基酸残基79、80、81、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、约110、约120、约130、约140、或约150处。类似地，二聚NKG2D-Fc构筑体可含有细胞外结构域的片段，其中结构域的C端结束于氨基酸残基231、230、229、228、227、226、225、
224、223、222、221、220、219、218、217、216、215、214、213、212、211、210、209、208、207、206、
205处等等。可以组合这类在NKG2D序列的细胞外结构域的每一末端处的缺失。

[0047] 熟练技术人员认识到本公开所描述的二聚NKG2D-Fc嵌合体可包含两个相同NKG2D片段或两个不同NKG2D片段。举例来说，在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包含对应于人类NKG2D的氨基酸残基78到216的两个NKG2D片段。在一些其它实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包含两个NKG2D片段，其中第一片段对应于人类NKG2D的氨基酸残基78到216并且第二片段对应于NKG2D细胞外结构域的不同部分(例如人类NKG2D的氨基酸位置140到210)。

[0048] 还涵盖二聚NKG2D-Fc衍生物，其包括位于NKG2D-配体结合的界面处的构筑体的NKG2D部分中的一或多个突变。具体来说，已知某些突变影响NKG2D受体与其配体(例如MICA)之间的结合亲和力。参见例如伦吉尔(Lengyel)等人,2007《, 生物化学杂志》,282:30658-666。已描述NKG2D与MICA之间的复合物的三维结构。因此，本领域的技术人员可确定有助于与其配体相互作用的NKG2D的氨基酸残基并通过系统改变关键残基测试突变效果。
在任何实施例中，所得二聚NKG2D-Fc嵌合体都能够结合配体。为综合回顾涉及受体-配体接触的氨基酸残基，参见例如斯特朗(Strong)和麦克法兰(McFarland),2004《,蛋白质化学进展(Advances in Protein Chemistry)》,68:281-213。根据出版的研究，已将认为对与配体相互作用重要的关键残基映射到人类NKG2D中的氨基酸残基约150到207，其对应于小鼠NKG2D中的残基约166到223。因此，本发明的二聚NKG2D-Fc构筑体的每个NKG2D片段优选地包含跨越至少大部分这些残基(例如人类NKG2D中的残基150到207)的片段。同样，应理解这些区域外部的保守取代、缺失或突变在许多情况下可能容易耐受。

[0049] 已鉴别一些氨基酸残基对介导配体结合尤其重要。具体地说，对结合于MICA重要的人类NKG2D的残基包括Y152、Q185、K197、Y199、E201和N207。对结合于ULBP3重要的人类NKG2D的残基包括I182、Y199和Y152。对结合于RAE-1β重要的小鼠NKG2D的残基包括K166、Y168、Y215、K213、E217和N223。因此，在优选实施例中，(对应二聚NKG2D构筑体的)这些残基的大多数或全部在无突变或缺失下维持在其中期望多种配体的广泛容许性(例如特异性)的位置处。然而，也有可能设计二聚NKG2D-Fc构筑体，其通过在赋予选择性配体识别和结合的这些关键残基中的一个或多个处策略性引入突变来优选地将一个配体结合另一配体。另一方面，某些氨基酸残基涉及各种配体的结合。举例来说，分别等效于小鼠对应物中的Y168和Y215的人类NKG2D中的Y152和Y199有助于结合MICA以及ULBP3。因此在一些实施例中，这些残基未经修饰以便保留广泛的配体特异性。

[0050] 下文提供的实例存在代表性二聚NKG2D-Fc嵌合体，其中每个NKG2D片段对应于人类NKG2D的氨基酸残基78到216。然而，应了解可以将相同的方法用于来源于已知罹患癌症的任何其它物种的NKG2D序列。举例来说，二聚NKG2D-Fc的NKG2D片段可具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸变化，如缺失、插入和取代，只要二聚NKG2D-Fc保留其配体结合活性。

[0051] 本发明包括含有一或多种如上文所述的氨基酸变化的二聚NKG2D-Fc构筑体的变体，就二聚NKG2D-Fc嵌合体结合于其一或多种天然配体来说。为判定含有特定突变的二聚NKG2D-Fc变体是否保留配体结合活性，可以进行结合分析，其中可以评估特定二聚NKG2D-Fc嵌合体到其配体的结合亲和力和/或结合能力。本领域中已知许多方法，通过所述方法可以测量受体-配体相互作用。用于分析配体结合的这些方法包括但不限于ELISA、表面等离子共振分析、CD分析、荧光骤冷、尺寸排阻结合分析和等温滴定量热法。为简要描述这些分析，参见例如伦吉尔(Lengyel)等人(2007)。

[0052] Fc片段

[0053] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包含免疫球蛋白的片段可结晶区(Fc)。免疫球蛋白的Fc区在介导免疫防御中起到重要作用。FcγRs在许多细胞类型上广泛表达为跨膜糖蛋白，所述细胞包括巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞、嗜中性白细胞和肥大细胞。Fc介导的活性包括通过Fc-FcγR相互作用进行的效应细胞的募集。存在两类可以功能上区分的Fc受体：活化Fc受体类和抑制性Fc受体类。活化Fc受体包括人类FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA，以及其小鼠直系同源，即FcγRI、FcγRIII FcγRIV。活化FcγR介导ADCC和ADCP，诱导引起抗原呈递的免疫复合物的内饮作用，并有助于生产和释放细胞因子和促炎因子。为总体回顾IgG结构和作用机制，参见刘(Liu)等人(2008；《免疫学评论
(Immunological Reviews)》,222:9-27)。如本文中更详细地描述，二聚NKG2D-Fc的Fc部分是结合活化Fc受体，并优选地活化Fc Ig结构域并且包括允许二聚的铰链区的结构域。

[0054] 适用于本公开的二聚NKG2D嵌合体的Fc部分可以容易地经调适以使其显现物种特异性。为用于小鼠系统，例如来源于小鼠的细胞，用于产生二聚NKG2D-Fc的Fc片段优选地是小鼠来源的Fc片段。在一些实施例中，优选的是小鼠IgG2a的Fc片段。

[0055] 为用于人类个体，例如用于癌症治疗，用于产生二聚NKG2D-Fc的Fc片段优选地是人类来源的Fc片段。在尤其优选的实施例中，NKG2D-Fc包含活化Fc Ig结构域。在四种人类IgG同型中，IgG1的活化Fc结构域优选用于制备二聚NKG2D-Fc。因此在一些实施例中，Fc包含人类免疫球蛋白(IgG)的片段可结晶区(Fc)。在一些实施例中，人类免疫球蛋白是IgG1。涉及含有人类IgG1的Fc区的嵌合构筑体的实验数据提供于实例部分。

[0056] 本领域了解到不同的抗体同型具有不同的体内细胞毒性潜能度(参见例如尼莫雅恩F.(Nimmerjahn F.)和雷弗克JV.(Ravetch JV.),2006《, 免疫力(Immunity)》,24:19-28)。举例来说，小鼠IgG2a和IgG2b同型比其IgG1或IgG3对应物更高效地清除如细菌感染和病毒感染的感染以及杀灭肿瘤细胞。这可至少部分归因于体内存在的活化FcR与抑制性FcRs的差异比值。类似地，相对于人类IgG同型，IgG1和IgG3与FcR的相互作用强于与IgG2或IgG4的相互作用。此外，给定同型的某些多态性同种异型可影响Fc受体的亲和力。实际上存在将显著影响某些抗体同型的亲和力的活化FcR的等位基因变异体。举例来说，FcγRIIIa受体158V异型显示对人类IgG1较高的亲和力和增加的抗体依赖性细胞的细胞毒性(卡特恩G.(Cartron G.)等人,2002,Blood,99:754-758)。

[0057] 不希望受任何具体的理论所束缚，有可能通过策略性选择或修饰用于制备二聚NKG2D-Fc嵌合体的Fc等位基因来优化二聚NKG2D-Fc嵌合体的Fc部分与其对应的Fc受体之间的相互作用。因此，本发明涵盖使用Fc片段的突变体或异型。已描述Fc结构域内的许多有用突变，所述突变会影响Fc与其受体的相互作用、Fc的效应功能以及含Fc分子的半衰期。这些包括对Fc中的碳水化合物部分的特异性氨基酸取代和/或修饰。关于综述参见例如刘(Liu)等人,2008《,免疫学评论(Immunological Reviews)》,222:9-27；尼莫雅恩和雷弗克,2007《, 免疫学新观点(Curr.Opin.Immunol.)》,19(2):239-45。

[0058] Fc片段的结构一般为本领域中已知的。简单来说，典型的IgG分子的Fc区是重链的羧基端部分的对称均二聚体并由CH2和CH3结构域构成，所述结构域通过柔性铰链区与Fab分开。Fc区通过结构域之间的非共价相互作用稳定。Fc区与FcR相互作用以发挥效应功能或调节IgG的分解代谢。重恒定区(Cγ2和Cγ3)和位于可变结构域与恒定区之间的铰链区与C1q和Fc受体(FcR)相互作用。因此，IgG分子的重恒定区负责其效应功能，因为其包括不同效应细胞上的补体和FcR的结合位点。因此效应细胞的募集通过Fc-FcγR相互作用介导。

[0059] 一般来说，抗体与补体的相互作用起始补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)，并且FcγR相互作用介导抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cell toxicity；ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell phagocytosis；ADCP)。CDC的典型活化路径是在所述路径的第一组分C1结合于抗原-抗体复合物中的IgG的铰链-Fc部分时触发。补体级联的后续活化最终诱导导致靶细胞死亡的C5-C9攻膜复合物的形成。另一方面，ADCC依赖于先天免疫系统的携带FcγR的细胞(例如NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞)识别结合于靶细胞的抗体的Fc结构域的能力。这一识别触发效应细胞释放诱导靶细胞的细胞凋亡和溶解的细胞质穿孔素、粒溶素和颗粒酶。ADCC中的主要效应细胞是NK细胞，其表达识别IgG1和IgG3子类并触发体内细胞毒性作用的FcγR的类型。

[0060] 在本发明的上下文中，如实例中所说明，本文所描述的二聚NKG2D-Fc嵌合体结合可广泛但特异性地识别并结合于其配体的二聚NKG2D部分能够借助于具有功能性Fc部分介导等效细胞效应。

[0061] 如所提及，存在活化受体(FcγRI、FcγRIIA和FcγRIII)和抑制性(FcγRIIB)受体。一般来说，IgG与活化FcγR的相互作用触发细胞活化，而与FcγRIIB的相互作用抑制细胞活化。除B细胞和NK细胞之外，活化和抑制性FcγR共表达在相同效应细胞上，进而产生细胞活化的临限值。B细胞仅表达抑制性FcγRIIB并且因此在生理条件下无法通过内源性IgG活化。NK细胞表达活化FcγRIII，使得其可独立于预活化(或激活)而杀灭靶细胞。

[0062] FcγRIIA和FcγRIII(CD16)具有对单体IgG较低的亲和力并且认为对触发效应功能至关重要，从而产生抗肿瘤活性。因此，有可能设计二聚NKG2D-Fc，使得其经基因工程改造以具有对活化FcγRIII增加的亲和力，并且对抑制性FcγRIIB降低的亲和力。

[0063] 因此，可以修饰有助于其与FcγR直接相互作用的二聚NKG2D-Fc分子的氨基酸残基，所述残基主要位于较低的铰链区中并邻接于Cγ2区，并且本发明包涵这类变体。已经证明结合于FcγR需要对应于IgG的氨基酸残基234-237的区。另外，已证明对IgG-FcγR相互作用重要的其它残基位于Cγ2结构域中并且包括Asp265、Asp270、Ala327、Pro329和Lys338。

[0064] 设想用以产生具有增强的活性的二聚NKG2D-Fc嵌合体的若干策略。为工程改造具有增强的ADCC能力的二聚NKG2D-Fc，设想至少两种方法。首先，基于经鉴别对其结合于活化和抑制性FcγR至关重要的IgG1中的氨基酸残基，本发明提供分别提高或降低对这些受体的亲和力的二聚NKG2D-Fc嵌合体的变体。因此，在一个实施例中，提供三重氨基酸取代Ser298Ala/Glu333Ala/Lys334Ala，其中每个残基的位置基于IgG1。含有这一三重突变的二聚NKG2D-Fc应展现对FcγRIIIA较高的亲和力但不对FcγRIIB展现较高的亲和力，进而促进ADCC。类似地，在另一实施例中，二聚NKG2D-Fc变体在Fc中含有双重突变Ser239Asp/Ile332Glu，预期其产生提高的ADCC。用于提高ADCC的其它突变包括但不限于Ser239Asp/Ala330Leu/Ile332Glu和Ser239Asp/Ser298Ala/Ile332Ala。类似地，在一些实施例中，预期组合对FcγRIIIA增加的结合(例如活化受体)和对FcγRIIB减少的结合的突变。在不限制的情况下(残基位置基于IgG1)，这类Fc突变的实例包括Phe243Leu/Arg292Pro/Tyr300Leu/Val305Ile/Pro396Leu。

[0065] 基于观测到一些修饰显著影响Fc对FcγR的亲和力，第二种方法涉及修饰Fc中的碳水化合物部分。已经证明Fc结构域含有两个天冬酰胺N连接寡醣位点(回顾于刘(Liu)等人,2008)。ADCC需要某些寡糖的存在并取决于寡糖结构的变化。具体来说，先前的研究已证明去除连接到双触角复合物型寡糖的最内部GlcNAc的岩藻糖部分可通过在不损害CDC活性下改善Fc到FcγRIIIa的结合来显著提高ADCC。基于这一观测，在一个实施例中，本发明提供岩藻糖缺陷型二聚NKG2D-Fc。在一些实施例中，嵌合体完全缺乏岩藻糖部分(即非岩藻糖基化)。在其它实施例中，嵌合体经岩藻糖基化。

[0066] 为制备含有经修饰的碳水化合物的二聚NKG2D-Fc，宿主细胞可以经工程改造以表达催化所需修饰的酶。举例来说，如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞的宿主细胞可以用酶β-(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnT-III)转染，所述酶提高等分非岩藻糖基化寡糖的含量。由这些宿主细胞产生的NKG2D-Fc产物可以具有显著提高的ADCC活性。另外，在一些实施例中，NKG2D-Fc中的岩藻糖的含量可以通过缺乏核岩藻糖基转移酶活性的α-1,6-墨角藻糖基转移酶(FUT8)操控。或者，小干扰RNA可用于构成性抑制FUT8酶的表达以实现相同效果。在一些实施例中，在鸟苷二磷酸(GDP)-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)中缺乏的宿主细胞可用于产生非岩藻糖基化NKG2D-Fc。

[0067] 接着，为工程改造具有提高的补体活性的二聚NKG2D-Fc，设想Fc结构域中的各种突变。一般来说，补体可以通过至少三个途径活化，从而引起膜附着复合物C5b-9的形成，所述膜附着复合物C5b-9在靶细胞的质膜中形成孔隙并导致其溶解。C1q结合于Fc结构域是此方法中的重要步骤。在人类IgG子类中，仅IgG1和IgG3可以起始补体级联。在一些实施例中，将突变引入到二聚NKG2D-Fc的Fc结构域，以便促进C1q募集和C1q-Fc相互作用。对这类突变靶向的Fc的残基包括但不限于：Asp270、Lys322、Pro329和Pro331。这些突变涉及用非极性中性氨基酸，如Ala、Met或Trp取代对应残基。在一特定实施例中，二聚NKG2D-Fc含有突变Lys326Trp、Clu333Ser或两者。

[0068] 为实现增加的C1q结合和提高的CDC，本发明的一些实施例涉及将一或多个突变引入到人类IgG1的铰链区的某些残基。这类突变的非限制性实例包括：Lys222Trp/Thr223Trp、Cys220Asp/Asp221Cys、Cys220Asp/Asp221Cys/Lys222Trp/Thr223Trp、
Lys222Trp/Thr223Trp/His224Trp和Asp221Trp/Lys222Trp。

[0069] 另外，应注意当具有人工序列和活性的融合蛋白用作治疗剂时，在一些情况下，用这类融合蛋白治疗的患者触发非所需免疫反应，如对试剂的抗体的出现。Fc片段的某些结构修饰已展示降低治疗性融合蛋白的免疫原性。参见例如吉利斯(Gillies)等人的美国专利6,992,174B2，所述专利以引用的方式并入本文中；刘(Liu)等人,2008《, 免疫学评论(Immunological Reviews)》,222:9-27。这类修饰可以适用于本公开内容中描述的二聚NKG2D-Fc的有效设计。

[0070] 连接子

[0071] 用于本公开内容的方法的二聚NKG2D-Fc构筑体可以进一步包含至少一个连接部分，所述连接部分连接第一NKG2D部分(例如NKG2D1)与第二NKG2D部分(NKG2D2)、NKG2D部分(NKG2D1或NKG2D2)与Fc片段，和/或将Fc片段连接到药物部分。在一些实施例中，连接部分(例如连接分子)称为X1、X2或X3。在一些情况下，Fc融合蛋白分子的铰链区充当Fc区与融合肽(例如可溶性受体)之间的间隔子，从而使分子的这两个部分分别地起作用(参见例如阿什肯纳兹(Ashkenazi)等人,1997)。

[0072] 在一些实施例中，至少一个连接部分(例如连接分子)并非NKG2D1、NKG2D2、Fc或药物部分的连续部分并共价连接：NKG2D1的氨基酸与NKG2D2的氨基酸、NKG2D2的氨基酸与Fc的氨基酸、或Fc的氨基酸与药物部分。如本文所用，“非连续部分”的连接分子意味着嵌合体的每个NKG2D部分(例如NKG2D1和NKG2D2)、NKG2D部分和Fc部分和/或Fc部分和药物部分通过并非NKG2D或免疫球蛋白或药物部分的部分的其它元素连接，所述元素本质上与其所连接的嵌合体的部分连续并充当连接子。下文描述并非NKG2D、Fc或药物部分的连续部分的连接分子的非限制性实例。

[0073] 连接分子可以是肽连接子。在一些实施例中，肽连接子的长度在约2到约25个氨基酸范围内。在一些实施例中，肽连接子的长度为20个氨基酸。在一些实施例中，肽连接子的长度在约4到约16个氨基酸范围内。在一些实施例中，肽连接子的长度为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、
22个、23个、24个或25个氨基酸。在一些实施例中，肽连接子的长度大于25个氨基酸。在连接子是肽连接子的情况下，可以使用常规的分子生物/重组DNA方法以单重组多肽的形式产生二聚NKG2D-Fc嵌合体。

[0074] 在一些实施例中，肽连接子提供蛋白酶依赖性可裂解位点。蛋白酶可裂解肽连接子的实例包括但不限于MMP敏感性连接子GGPLGLWAGG(SEQ ID NO:6)和因子Xa敏感性连接子IEGR(SEQ ID NO:7)。本领域熟悉各种可以用于本文所提供的方法的可裂解序列，例如陈(Chen)等人《, 药物载体研究进展(Adv.Drug Deliv.Rev.)》(2013),65(10):1357-69)中所公开的那些。

[0075] 在本发明的一些实施例中，使用柔性肽连接子。柔性肽连接子的长度优选地为约25个或更少个氨基酸。在一些实施例中，柔性肽连接子的长度为20个氨基酸。在一些实施例中，肽连接子含有约20个或更少个氨基酸残基，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、
10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19和20个。在一些实施例中，肽连接子含有约12个或更少个氨基酸残基，例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个和12个。
在一些情况下，肽连接子包含以下氨基酸中的两种或更多种：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。在一些实施例中，柔性肽连接子是甘氨酸-丝氨酸连接子。

[0076] 在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子由式(GS)n表示，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接子由式(GGGGS)n(SEQID NO:2)表示，其中n为1、2、3、4或5。

[0077] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包含三种连接分子X1、X2和X3，其中X1共价连接NKG2D1的氨基酸与NKGD2的氨基酸；X2共价连接NKG2D2的氨基酸与Fc的氨基酸；并且X3共价连接Fc的氨基酸与药物部分。在一些实施例中，X1是(GS)3(SEQ ID NO:4)并且X2、X3和X4各自是(GGGGS)4(SEQ ID NO:3)。

[0078] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体含有IEGR(SEQ ID NO:7)肽连接子。

[0079] 或者，连接分子可以是非肽连接子。如本文所用，“非肽连接子”是包括两个或更多个连接到彼此的重复单元的生物相容性聚合物。非肽聚合物的实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨基甲酸酯、聚磷腈、多醣、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳素、玻尿酸和肝素。为更详细地描述适用于Fc融合分子的非肽连接子，参见例如以引用的方式并入本文中的WO/2006/107124。通常，取决于特定连接子，这类连接子将具有约1kDa到50kDa的分子量范围。举例来说，典型的PEG具有约1到5kDa的分子量，并且聚乙二醇具有约5kDa到50kDa的分子量，并且更优选地约10kDa到40kDa。

[0080] 药物部分

[0081] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体进一步包含药物部分。如本文所用，“药物部分”指代意欲用于递送到靶细胞(例如癌细胞)的治疗剂。一般来说，药物部分共轭(例如直接或间接共价结合)到二聚NKG2D-Fc嵌合体的羧基端。然而，熟练技术人员认识到在一些实施例中，药物部分共轭到二聚NKG2D-Fc嵌合体的氨基端。“药物部分”的实例包括药物(例如小分子)、毒素(例如淋巴毒素家族的分子)、放射性核素、酶、细胞因子、趋化因子、针对活化化合物或阻碍血管生成的抗体单链可变片段或基本上任何抗肿瘤化合物。

[0082] 在一些实施例中，药物部分包含细胞因子或其功能性部分。细胞因子是能够调节免疫细胞功能的蛋白质和肽。细胞因子的“功能性部分”是保留调节免疫细胞功能(例如结合于一或多种细胞因子受体)的能力的细胞因子片段。细胞因子的实例包括但不限于干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)和干扰素-γ(IFN-γ)、白介素(例如IL-1到IL-29，具体来说IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和IL-18)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α和TNF-β)、红血球生成素(EPO)、MIP3a、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein；MCP)-1、胞内粘附分子(ICAM)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施例中，药物部分包含选自由以下组成的群组的细胞因子：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-α。

[0083] 在一些实施例中，药物部分包含细胞因子/细胞因子受体杂合物。细胞因子/细胞因子受体杂合物为本领域中已知并且描述于例如罗利(Rowley)等人《, 欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》2009年2月；39(2):491-506。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包括药物部分，所述药物部分包含IL-15(例如基因银行AAX37025)/IL-15Ra(例如基因银行AAP69528.1)杂合物。在一些实施例中，药物部分包含融合到IL-15(基因银行AAX37025)的氨基酸22-135的人类IL-15受体α(hIL15Ra，基因银行AAP69528.1)的氨基酸31-107。在一些实施例中，IL-15和IL-15Ra由连接子，例如20-氨基酸(G4S)4(SEQ ID NO:3)连接子分离。包含IL-15/IL-15Ra杂合物的二聚NKG2D-Fc嵌合体进一步描述于实例部分。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包括药物部分，所述药物部分包含IL-12p35和IL-12p40的杂合物。在一些实施例中，IL-12p35和IL-12p40由连接子，例如20-氨基酸(G4S)4(SEQ ID NO:3)连接子分离。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包括药物部分，所述药物部分包含IL-23p19和IL-23p40的杂合物。在一些实施例中，IL-23p19和IL-23p40由连接子，例如20-氨基酸(G4S)4(SEQ ID NO:3)连接子分离。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体包括药物部分，所述药物部分包含IL-27p28和EB1的杂合物。在一些实施例中，IL-27p28和EB1由连接子，例如20-氨基酸(G4S)4(SEQ ID NO:3)连接子分离。在一些实施例中，细胞因子/细胞因子受体杂合物的每个次单位位于二聚NKG2D-Fc嵌合体的不同链上。

[0084] 在一些实施例中，药物部分是抗体单链可变片段(single chain variable fragment；ScFv)。如本文所用，“抗体单链可变片段”指代与短连接肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。尽管去除了恒定区并引入了连接子，但scFV蛋白质保持初始免疫球蛋白的特异性。在一些实施例中，ScFv结合于免疫检查点蛋白(例如PD1或CTLA4)。在一些实施例中，ScFv阻碍血管生成(例如结合于血管生成的调节因子，如VEGF)。

[0085] 在一些实施例中，药物部分是趋化因子。如本文所用，“趋化因子”指代刺激白细胞募集的低分子量蛋白质。一般来说，趋化因子是通过原生促炎介体，如白介素-1(IL-1)或肿瘤坏死因子(TNF)诱导的次生促炎介体。趋化因子可以分类成四个家族：CC趋化因子(例如CCL1到CCL-28)、CXC(例如CXCL1到CXCL17)、C(例如XCL1、XCL2)和CX3C(CX3CL1)。

[0086] 在一些实施例中，药物部分是小分子。如本文所用，“小分子”指代在实验室中合成或在自然界中发现的非肽、非寡聚有机化合物。小分子药物的非限制性实例包括小分子激酶抑制剂(例如依维莫司(everolimus)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)等)、溴结构域抑制剂(例如JQ1、I-BET 151、RVX-208等)、抗生素(例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素、环丙沙星(ciprofloxacin)等)和抗病毒剂(例如利巴韦林(ribavirin)、金刚乙胺(rimantadine)、齐多夫定(zidovudine)等)。在一些实施例中，小分子是抗肿瘤化合物。在本公开中的其它地方进一步详细论述抗肿瘤化合物。

[0087] 在一些实施例中，药物部分是放射性核种。如本文所用，“放射性核种”指代医疗上有用的放射性核素。放射性核素的实例包括99mTc、188Re、186Re、153Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、45Ti、60Cu、61Cu、和67Cu。

[0088] 其它部分

[0089] 在一些实施例中，适用于本文所描述的方法的二聚NKG2D-Fc嵌合体可以进一步包含一或多个辅助部分，如标签序列和信号序列。举例来说，标签序列可用于检测和/或分离多肽。标签的实例包括但不限于：HA、Flag、Myc、Glu、His和麦芽糖碱性蛋白。标签序列可以位于氨基端、羧基端，或位于二聚NKG2D-Fc嵌合分子当中的某处(例如模块化肽片段之间)，其限制条件为这类标签的存在不干扰二聚NKG2D-Fc分子的功能。在一些情况下，标签序列为可裂解的。

[0090] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体可以任选地包含信号序列。信号序列是短(通常约3-60个氨基酸长)肽链，其引导多肽的翻译后传输，进而允许多肽的更大产率。信号序列的氨基酸序列将多肽(在胞质溶胶中合成)引导到某些亚细胞区室，例如细胞器。信号序列也称为导向信号、信号肽、转运肽或定位信号。在一些实施例中，在传输多肽之后信号序列通过信号肽酶自多肽裂解。

[0091] 在一些实施例中，二聚NKG2D嵌合体含有N端修饰的IL-2信号序列，这允许NKG2D-Fc构筑体的最优表达和分泌。参见例如张(Zhang)等人,2004,J《. 基因药物(Gene Med.)》,7:354-65。在一些实施例中，二聚NKG2D嵌合体含有来源于CD33的多肽序列的信号肽。举例来说，CD33信号肽可对应于CD33多肽序列的氨基酸残基1-16。本领域的技术人员将理解，存在许多可用于实践本公开中所提供的方法的其它合适的信号肽序列。另外，在NKG2D嵌合体中存在信号肽的情况下，可以任选地将额外的氨基酸残基，例如间隔子嵌入在嵌合体的N端信号肽与Fc部分之间。在一些实施例中，例如信号序列之后为Met-Asp二肽间隔子。

[0092] 二聚NKG 2D-Fc的制备

[0093] 本领域熟悉用于制备具有所需特征的二聚NKG2D-Fc嵌合体的分子生物和生物化学技术。优选地，二聚NKG2D-Fc嵌合构筑体通过常规重组DNA方法产生。在优选实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合体以单个(例如连续)重组多肽的形式产生。在其它实施例中，二聚NKG2D-Fc的两个或更多个部分以独立片段的形式产生并随后连接在一起以产生二聚NKG2D-Fc分子。举例来说，嵌合体的每个NKG2D部分(例如NKG2D1、NKG2D2)和二聚NKG2D-Fc的Fc部分各自以独立的重组多肽形式产生，所述重组多肽随后通过化学连接手段融合在一起以产生二聚NKG2D-Fc。这种生产方法在其中采用非肽连接分子的情况下可以是尤其优选的。类似地，如果在制造为单个连续多肽时二聚NKG2D-Fc嵌合体未恰当地折叠(例如未适当地结合配体)，那么这种生产方法也可以为优选的。

[0094] 为生产重组多肽，可以使用各种宿主生物体。适合的主体包括但不限于：如大肠杆菌(E.coli)的细菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。适合的宿主生物体的选择将取决于二聚NKG2D-Fc嵌合体的特定应用。熟练技术人员将理解在选择用于制造重组多肽的适合宿主中如何考虑某种准则。影响适合宿主选择的因素包括例如翻译后修饰，如磷酸化和糖基化图案，以及技术因素，如总预期产率和易于纯化。应谨慎地考虑待用于体内的二聚NKG2D-Fc的宿主特异性翻译后修饰，因为已知某些后特异性修饰为高度免疫原性(抗原)的。

[0095] 一旦生产，二聚NKG2D-Fc就可以通过任何合适手段纯化，如本领域技术人员已知的色谱方法。色谱方法的实例包括凝胶过滤色谱法。参见例如凯恩(Caine)等人《,蛋白质表达与纯化(Protein Expr.Purif.)》,1996,8:159-66。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc通过蛋白A免疫亲和色谱法纯化。

[0096] 如本领域的技术人员将认识到，二聚NKG2D嵌合体部分也可以分别制备和分离，并通过化学合成连接。

[0097] NKG2D受体配体

[0098] 在本公开中所描述的任一个实施例中，二聚NKG2D-Fc能够结合NKG2D受体的内源性配体。人类中的已知NKG2D配体包括MICA、MICB、RAET-1G、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。优选地，本公开内容中的二聚NKG2D-Fc嵌合体能够结合超过一种类型的NKG2D受体配体。

[0099] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc嵌合分子用10-4M或更小、10-7M或更小的高亲和力，或用次纳摩尔亲和力，例如0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1nM或甚至更少结合配体。在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc分子对其配体的结合亲和力为至少5×106Ka、至少1×107Ka、至少2×107Ka、至少1×108Ka或更大。

[0100] 在一些实施例中，NKG2D-Fc优选地结合到(例如用对其较高的亲和力)NKG2D受体配体的亚群。3D结构数据组合诱变分析已揭示NKG2D容许其内源性配体的不同阵列的识别和结合。

[0101] NKG2D的配体可以在细胞表面上表达。或者，NKG2D的配体可以从细胞表面“脱落”并以可溶性配体形式存在。已知在某些癌症中，如MICA的NKG2D配体过表达并且在某些情况下呈可溶形式释放(例如脱落)到血流或周围组织，例如血清中。认为这至少部分地促进癌症的发病机理和/或进展。因此，二聚NKG2D-Fc适用于结合存在于细胞表面上或呈释放形式的这类配体，通过充当中和剂平衡以异常较高的含量存在的配体的表达。

[0102] 在NKG2D配体在个体的癌细胞的表面上表达的情况下，当向个体施用时本公开内容中所描述的二聚NKG2D-Fc结合于细胞表面配体。二聚NKG2D-Fc嵌合体结合到其配体可防止存在于NK细胞上的内源性NKG2D受体的活化。在NKG2D配体从癌细胞“脱落”，例如释放到个体血流的情况下，本文所描述的二聚NKG2D-Fc结合于可溶性配体，隔离其进一步作用。

[0103] 治疗应用

[0104] 通常，NKG2D配体的表达表现为被限制于胃肠道上皮。在静止上皮细胞中观测到极少表达，但在快速增殖细胞中发生较高水平的表达。NKG2D配体的表达也在各种转化细胞中上调，尤其是上皮源的那些细胞。因此，本文提供用于治疗个体中的癌症或癌症症状的方法。所述方法包含向个体施用治疗有效量的体内结合NKG2D配体的二聚NKG2D-Fc。

[0105] 术语“治疗(treating/treatment/treat)”等在癌症疗法的情形下指代向患有癌症的个体施用包含如本文所述的二聚NKG2D-Fc的组合物。以治疗有效的量向个体施用组合物。如本文所用，治疗有效量指代认为实现对患有疾病或病症，如某些类型癌症的个体的统计显著性有益效果的治疗的量。一般来说，治疗有效量通过向患有指定病状(如疾病的进展或阶段)的个体群体施用组合物并评估作为回应的结果来测定。如本文所使用，治疗性治疗应包括例如完全预防或消除疾病症状，延迟疾病症状的发作，或减轻疾病的严重程度。

[0106] 癌症

[0107] 认为二聚NKG2D-Fc嵌合体广泛适用于各种癌症的免疫疗法，其中一或多种NKG2D配体的表达在个体中较高。癌症广泛指代涉及转化细胞的增殖性疾病，包括癌前和恶性病症两者。本发明适用于治疗患有癌症的个体，所述癌症的特征为一或多种NKG2D配体的过表达。在一些实施例中，癌症的特征在于NKG2D受体的一种(或主要一种)配体的过表达。在其它实施例中，癌症的特征在于两种或更多种NKG2D配体的过表达。

[0108] 本文所公开的方法为适用于治疗癌前病症的疗法，所述癌前病症伴随进展到恶性病的风险。

[0109] 这类病症的实例包括但不限于异型增生、增生和浆细胞病症，如意义未明单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance；MGUS)和郁积性多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma；SMM)。在一些实施例中，癌症是黑素瘤、肺癌、乳癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胰脏癌、胃癌和结肠癌、淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，癌症是黑素瘤。在一些实施例中，癌症是浆细胞恶性病，例如多发性骨髓瘤(multiple myeloma；MM)或浆细胞的癌前病状。在一些实施例中，癌症是黑素瘤、肺癌、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、胰脏癌或前列腺癌。在一些实施例中，个体已诊断患有癌症或易患癌症。因此，本文所公开的方法也适用于治疗患有癌转移并因此易于复发或再发的个体。所述方法尤其适用于例如具有癌症或转移性肿瘤家族病史，或展示癌症癌转移的基因易感性的高风险个体。具体地说，方法涉及治疗与NKG2D配体表达相关的癌症。在一些实施例中，NKG2D配体是MICA。因此在一些实施例中，癌症导致MICA相关的肿瘤。

[0110] 可以通过测试个体中的一或多种NKG2D配体的异常表达确定特定个体(例如患者)是否应接受包含NKG2D-Fc的癌症疗法。个体中的“一或多种NKG2D配体的异常表达”意味着从个体中获得的生物样品中的配体的过表达。在一些实施例中，生物样品可包括取自疑似患有癌症的个体的组织的活检样品。举例来说，在一些情况下，从实体肿瘤收集生物样品以测试恶性程度。在其它情况下，生物样品可构成血液样品，例如血清、大便样品、尿液样品等。出于测试疾病，如癌症的诊断或进展的目的，生物样品可以是从个体收集的任何细胞或组织样品。

[0111] 本领域的技术人员熟悉用于分析存在于生物样品中的一或多种标记的存在和含量的各种实验室技术和方案。为确定个体是否患有与NKG2D配体的过表达相关的癌症，通常进行免疫亲和力分析。在某些情形下，取决于可用的生物样品的类型，可以进行免疫组织学或免疫细胞化学分析。可商购许多抗体以进行这些分析。为此目的通常采用的方法包括但不限于ELISA、免疫墨点法和免疫组织化学。

[0112] 个体

[0113] 本文所公开的方法可应用于已知罹患癌症的广泛范围的物种，例如人类、非人类灵长类动物(例如猴)、马、牛、猪、绵羊、鹿、麋鹿、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。因此，如本文所用的“个体”是患有疾病，或处于罹患与至少一种NKG2D配体的异常表达相关的疾病，如癌症风险的哺乳动物个体。在优选实施例中，个体是患有呈现较高含量的一或多种NKG2D配体的癌症的人类个体。在一些实施例中，NKG2D配体包括MICA。

[0114] 如果个体已展示表达较高含量的一或多种NKG2D配体，那么个体可以用本文所描述的方法治疗。在一些情况下，个体已接受或正在接受另一癌症疗法。在一些实施例中，癌症可以处于缓解中。在一些情况下，个体处于患有复发，例如癌转移的风险中。在一些实施例中，一或多种NKG2D配体的过表达限于癌细胞，例如肿瘤。在一些实施例中，癌细胞表达的NKG2D配体中的至少一种脱落到血流中，并且因此可在个体的血清中检测到。

[0115] 根据特定癌症的表型，有可能靶向超过其它配体过表达(通过肿瘤细胞表达)的一或多种配体，所述其它配体的表达不受显著影响。

[0116] 作用方式

[0117] 本发明至少部分地基于以下出人意料的发现：相比于包含单个NKG2D片段和Fc片段的嵌合分子(例如单体NKG2D-Fc嵌合体)，包含两个NKG2D片段和Fc片段的嵌合分子(例如二聚NKG2D-Fc嵌合体)能够结合一或多种NKG2D配体，以提高的功效诱导肿瘤细胞死亡。

[0118] 不受任何特定理论限制，表现出二聚NKG2D-Fc嵌合体可通过免疫系统的两种主要组分起作用：先天免疫和适应性免疫。如本文所用，先天免疫或先天免疫系统指代对外源致病菌的非特异性宿主防御机制。先天免疫包括物理屏障(例如皮肤、胃酸、粘液或泪液以及细胞)和主动机制，如NK细胞、吞噬细胞和补体系统两者。NK细胞代表先天免疫系统的主要组分。NK细胞具有细胞毒性，例如能够攻击已被微生物感染的细胞，以及一些种类的肿瘤细胞。NK细胞的细胞毒性活性通过识别MHC I类等位基因的细胞表面受体介导。本领域中已知许多受体类型，包括作为一种受体亚型的NKG2D。吞噬细胞包括嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱粒细胞和嗜酸粒细胞。补体系统是有助于从宿主生物体清除致病菌的免疫系统的生物化学级联。

[0119] 一般来说，适应性免疫或适应性免疫系统指代抗原-特异性抗体-介导的免疫反应。适应性免疫一般通过B淋巴细胞的特异性抗体产生和T淋巴细胞的抗原特异活性介导。由B淋巴细胞介导的体液反应主要通过产生标记外源细胞和分子的循环抗体对抗胞外致病菌，从而由其它特化细胞和蛋白质破坏。由T淋巴细胞介导的细胞反应主要通过直接结合并破坏患病细胞来对抗细胞内致病菌和癌细胞。根据本公开案，认为作为非抗体分子的二聚NKG2D-Fc功能上模仿一般为特异性抗体的功能。

[0120] 本发明因此涵盖用于癌症治疗的方法，其中二聚NKG2D-Fc直接结合到在细胞表面上表达NKG2D配体的肿瘤细胞。在这一作用模式中，二聚NKG2D-Fc可特异性鉴别过表达NKG2D配体的破坏肿瘤细胞，但不鉴别未过表达NKG2D配体的健康细胞。

[0121] 二聚NKG2D-Fc可以至少两种方式靶向在人类肿瘤细胞上表达的任何或所有NKG2D配体。介导肿瘤细胞破坏的一种机制是通过补体溶解(也称为补体依赖性溶解、补体依赖性细胞毒性或CDC)过程。介导肿瘤细胞破坏的第二种方式是通过触发抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity；ADCC)。

[0122] 在一些实施例中，二聚NKG2D-Fc充当调理剂。调理作用过程为：细胞或粒子涂布有使其结合于其它细胞(如树突状细胞或吞噬细胞)上的受体以促进摄取的分子。对于如树突状细胞和巨噬细胞的抗原呈递细胞，调理作用促进有效处理和抗原呈递。尤其有用的是能够特异性结合到可介导内化和后续抗原处理的抗原呈递细胞(例如FcR)上的标靶(例如配体)和特定受体两者的调理剂。

[0123] 在细胞表面上表达一种或多种NKG2D受体的配体的肿瘤细胞可予以调理，例如涂布有二聚NKG2D-Fc分子。举例来说，嵌合体的NKG2D部分可结合于肿瘤细胞表面上的配体，而使嵌合体的Fc部分暴露。树突状细胞具有FcγR，因此可结合并内化肿瘤抗原(例如NKG2D配体)，继而导致抗原呈递到又称为CD8+T细胞的细胞毒性T细胞。这一过程称为交叉激活。类似地，调理作用导致产生MHCII类限制的CD4+T细胞反应。因此，通过调理作用，NKG2D-Fc嵌合体可促进树突状细胞的有效交叉呈递(例如激活)，从而引起有效T细胞反应对肿瘤的诱导。

[0124] 癌症患者常常遭受免疫抑制。在一些情况下，认为免疫抑制可能至少部分地由减弱的NKG2D受体信号传递引起。举例来说，基于流行模型，脱落的MICA通过诱导淋巴细胞上的NKG2D受体分子的内化损害宿主防御。因此，根据这一模型，脱落MICA的肿瘤细胞通过下调NKG2D表面表达导致免疫抑制。

[0125] 因此，本文所提供的方法适用于通过施用包含二聚NKG2D-Fc的组合物来抵抗或减轻免疫抑制，尤其在患者展现较高含量的可溶性(即脱落)NKG2D配体或可在血清中检测到的配体的情况下。作用模式是向患者施用的NKG2D-Fc结合于(因此隔离)自肿瘤脱落的NKG2D的过量可溶性配体，进而逆转导致免疫抑制的细胞表面上的NKG2D受体的下调表达。

[0126] 因此，二聚NKG2D-Fc嵌合体可以具有多种治疗功能，包括：中和由肿瘤细胞脱落的可溶性配体；促进表达细胞表面配体的肿瘤细胞中的ADCC和/或CDC；和介导适应性免疫系统的交叉呈递和激活，所述适应性免疫系统包括CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和产生肿瘤特异性抗体的B细胞。

[0127] 施用

[0128] 可以向个体直接施用二聚NKG2D-Fc组合物。个体优选的是哺乳动物。术语“施用(administration/administer)”指代向个体提供医药剂使得医药剂体内，即在个体的身体中接触其靶细胞(例如癌细胞)的手段。在一些实施例中，向个体系统地施用包含NKG2D-Fc的组合物。在优选实施例中，通过静脉内注射递送系统性施用。在一些实施例中，局部施用包含二聚NKG2D-Fc的组合物。举例来说，在一些情况下，可以将组合物直接递送到实体肿瘤或极为接近实体肿瘤。

[0129] 药学上可接受的载剂

[0130] 在一些方面，本公开提供组合物，其包含如本文件所述的二聚NKG2D-Fc嵌合体和药学上可接受的载剂。一般来说，包含二聚NKG2D-Fc的组合物可以悬浮于药学上可接受的载剂(例如生理盐水)中。这类载剂可以包括但不限于无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例包括例如矿物油、丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯。水性载体包括但不限于水、醇、盐水和缓冲溶液。还可以存在防腐剂、调味剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。应了解，将向哺乳动物施用的本文所描述的任何材料都可以含有一或多种药物学上可接受的载剂。

[0131] 施用途径

[0132] 可以通过各种施用途径向个体身体的任何部位施用本文所述的任何组合物。可以通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、肌肉内、直肠内、阴道内、鞘内、气管内、皮内、或经皮注射、通过口服或经鼻施用、通过吸入、或通过随时间推移逐步灌注来施用组合物。可以将组合物递送到特定组织。举例来说，组合物可以递送到但不限于哺乳动物的关节、鼻粘膜、血液、肺部、肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔。在另一实例中，可以通过吸入将组合物的气雾剂给到个体。

[0133] 剂量

[0134] 所需剂量取决于施用途径、配制物性质、患者疾病的性质、个体身高、重量、表面积、年龄和性别、所施用的其它药物和主治医师的判断。适合的剂量通常在0.01-1,000μg/kg范围内。鉴于可用多种二聚NKG2D-Fc组合物和各种施用途径的不同效率，预期所需剂量大幅变化。如本领域中所熟知，这些剂量含量的变化可以使用标准经验常式来调整以使其优化。施用可以是单次或多次(例如2倍、或3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍或更多倍)。组合物在适合递送媒剂(例如，聚合微粒子或可植入器件)中的封装可提高递送效率。

[0135] 治疗方案

[0136] 使用本文所提供的任何组合物的治疗的持续时间可以是任何时间长度，短到一天到长到主体的寿命(例如许多年)。举例来说，二聚NKG2D-Fc组合物可以每月施用一次，持续三个月，或一年一次，持续十年时段。还应注意，治疗频率可以变化。举例来说，二聚NKG2D-Fc组合物可以每日、每周、每月或每年施用一次(或两次、三次等)。二聚NKG2D-Fc组合物可以例如在同一时间点或依序与一或多种其它癌症疗法一起施用。举例来说，患者可以接受自体肿瘤细胞疫苗，之后为抗CTL4抗体，之后为二聚NKG2D-Fc疗法，由数小时、天、月或年的间隔分离。

[0137] 有效量

[0138] 可以向个体施用有效量的本文所述的任何组合物。如本文所用的术语“有效”指代诱导所需治疗效果，如免疫反应，而不诱导个体中的显著毒性的任何量。这类量可以通过评估在施用已知量的特定组合物之后个体的生物反应(例如免疫反应)和症状改善来确定。另外，可以通过在投与已知量的特定组合物之前和之后评估个体的临床症状来测定毒性(如果存在)水平。应注意，向个体施用的特定组合物的有效量可以根据所需结果以及主体反应和毒性水平调节。显著毒性可以针对每个特定主体改变并取决于多种因素，包括但不限于个体的疾病病况、年龄和疼痛耐受程度。

[0139] 组合疗法

[0140] 在一些实施例中，需要癌症治疗的个体用本文所述的二聚NKG2D-Fc组合物与其它癌症疗法结合治疗。在一些实施例中，其它癌症疗法包括细胞毒性剂和/或非细胞毒性剂。“细胞毒性剂”指代抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。所述术语意欲包括放射性同位素(例如131I、125I、90Y和186Re)、化学治疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或合成毒素，或其片段。非细胞毒性剂指代不抑制或阻止细胞功能和/或不造成细胞破坏的物质。“非细胞毒性剂”可包括可被活化成为细胞毒性的试剂。非细胞毒性剂可包括珠粒、脂质体、基质或粒子(参见例如以引用的方式并入本文中的美国专利公开
2003/0028071和2003/0032995)。这类试剂可以共轭、偶联、连接或与本文所述的二聚NKG2D-Fc组合物相关。

[0141] 在一些实施例中，常规的癌症药剂与本文所描述的组合物一起施用。在一些情况下，需要癌症治疗的个体用本文所述的二聚NKG2D-Fc组合物与针对于靶向癌细胞的一或多种额外试剂结合治疗。高度适合的试剂包括促进癌细胞中DNA损伤(例如细胞DNA中双股断裂)的那些试剂。可以使用本领域的技术人员已知的任何形式的DNA损伤试剂。DNA损伤通常可以通过放射疗法和/或化疗产生。DNA损伤试剂也称为遗传毒性剂。如本文所用，“与……结合”应意味着与一或多种额外疗法(同时或分别但极为接近)、在施用一或多种额外疗法之前或之后向个体施用二聚NKG2D-Fc。

[0142] 放射疗法的实例包括但不限于外放射疗法和内放射疗法(也称为近接疗法)。用于外放射疗法的能源包括x射线、γ射线和粒子束；用于内放射的能源包括放射性碘(碘125或碘131)，锶89，或磷、钯、铯、铟、磷酸或钴的放射性同位素。施用放射疗法的方法是本领域的技术人员众所周知的。

[0143] DNA损害化学治疗剂的实例包括(但不限于)白消安(Busulfan)(马利兰(Myleran))、卡铂(Carboplatin)(铂尔定(Paraplatin))、卡莫司汀(Carmustine)(BCNU)、苯丁酸氮芥(瘤可宁(Leukeran))、顺铂(Cisplatin)(普拉迪诺(Platinol))、环磷酰胺(环磷氮介(Cytoxan)、尼欧萨(Neosar))、达卡巴嗪(Dacarbazine)(DTIC-都米(Dome))、异环磷酰胺(艾菲克斯(Ifex))、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、双氯乙基甲胺(氮芥、木斯塔根(Mustargen))、美法仑(Melphalan)(爱克兰(Alkeran))和丙卡巴肼(Procarbazine)(甲苯肼(Matulane))。

[0144] 许多其它化学治疗剂也可以单独或呈组合形式用于本文所描述的方法。这些试剂包括：甲胺喋呤、长春新碱、亚德里亚霉素、顺铂、含非糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博莱霉素、小红莓、达卡巴嗪(dacarbazine)、紫杉醇、弗拉吉林(fragyline)、甲葡胺GLA、伐柔比星(valrubicin)、卡莫司汀和聚苯丙生、MMI270、BAY 12-9566、RAS法呢基转移酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索(Lometexol)、Glamolec、CI-994、TNP-470、和美新(Hycamtin)/拓朴替康(Topotecan)、PKC412、伐司扑达(Valspodar)/PSC833、诺安托(Novantrone)/米托蒽醌(Mitoxantrone)、麦塔瑞(Metaret)/苏拉明(Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、英赛尔(Incel)/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/马米司他(Marmistat)、BB2516/马米司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、乐蒙那(Lemonal)DP 2202、FK 317、毕西巴尼(Picibanil)/OK-432、AD 32/伐柔比星(Valrubicin)、美他特龙(Metastron)/锶衍生物、帝盟多(Temodal)/替莫唑胺、阿霉素脂质体(Evacet)/脂质体小红莓、Yewtaxan/太平洋紫杉醇、紫杉醇/太平洋紫杉醇、希罗达(Xeload)/卡培他滨
(Capecitabine)、氟铁龙(Furtulon)/去氧氟尿苷、Cyclopax/口服太平洋紫杉醇、口服紫杉烷类、SPU-077/顺铂、HMR 1275/夫拉平度(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(喃氟啶/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋咪唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂、开普拓(Campto)/左旋咪唑、坎普土沙(Camptosar)/伊立替康、Tumodex/雷替曲塞(Ralitrexed)、乐司他丁(Leustatin)/克拉屈滨(Cladribine)、Paxex/太平洋紫杉醇、多希/脂质体小红莓、Caelyx/脂质体小红莓、福达华(Fludara)/氟达拉宾、Pharmarubicin/表柔比星、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/双萘酰亚胺、LU 103793/多拉司他汀(Dolastain)、Caetyx/脂质体小红莓、健择(Gemzar)/吉西他滨、ZD 0473/Anormed、YM 116、罗丁种子、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/德西弗斯酰胺、Ifes/Mesnex/异环磷酰胺(Ifosamide)、威猛(Vumon)/替尼泊甙(Teniposide)、铂尔定(Paraplatin)/卡铂、Plantinol/顺铂、足叶乙苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD 9331、克癌易
(Taxotere)/多西他赛、鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、如美法仑(melphalan)和环磷酰胺的烷化剂、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂、阿糖胞苷HCl、放线菌素、道诺霉素HCl、雌氮芥磷酸钠、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(羟基尿素)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、亮丙立德乙酸酯(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、氮芥HCl(氮芥)、巯基嘌呤、美司钠(Mesna)、米托坦(Mitotane)(o.p′-DDD)、米托蒽醌HCl、奥曲肽(Octreotide)、普卡霉素、丙卡巴肼HCl、链脲霉素、他莫昔芬柠檬酸盐、硫鸟嘌呤、噻替派、长春碱硫酸盐、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、红细胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白介素2、丙脒腙(甲基-GAG；甲基乙二醛双-脒基腙；MGBG)、喷司他汀(2'
deoxycoformycin)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊甙(VM-26)和长春地辛硫酸盐，但其不如此受限制。

[0145] 另外，以下试剂也可以适用于本发明：烷化剂，如卡铂和顺铂；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂，如卡莫司汀(BCNU)；抗代谢物，如甲胺喋呤、亚叶酸、嘌呤类似物抗代谢物、巯基嘌呤、嘧啶类似物抗代谢物，如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨(gemcitabine) 激素抗肿瘤药，如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙立德(leuprolide)和他莫昔芬；天然抗肿瘤药，如阿地白介素(aldesleukin)、白细胞介素-2、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(VP-16)、干扰素α、太平洋紫杉醇和维甲酸(ATRA)；抗生素天然抗肿瘤药，如博莱霉素、放线菌素D、柔红霉素、小红莓、道诺霉素和包括丝裂霉素C的丝裂霉素；以及长春花属生物碱天然抗肿瘤药，如长春碱、长春新碱、长春地辛、羟基脲、丙酮、亚德里亚霉素、异环磷酰胺、依诺他滨(enocitabine)、环硫雄醇、阿克拉霉素、安西他滨(ancitabine)、尼莫司汀(nimustine)、丙卡巴肼盐酸盐、卡波醌、卡铂、卡莫氟、色霉素A3、抗肿瘤多醣、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺裂殖菌多糖、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、达卡巴嗪(dacarbazine)、硫肌
苷、噻替派、喃氟啶、海兔毒素、如奥瑞斯他汀(auristatin)的海兔毒素类似物、CPT-11(伊立替康)、米托蒽醌(mitozantrone)、长春瑞滨、替尼泊甙、氨基喋呤、碳霉素、埃斯波霉素(参见例如以引用的方式并入本文中的美国专利第4,675,187号)、新抑癌蛋白、OK 432、博莱霉素、氟铁龙、broxundine、白消安、二磷酸已烯雌酚四钠、培洛霉素、贝他定(bestatin)干扰素-β、美雄烷、米托布鲁托(mitobromtol)、美法仑(melphalan)、层粘连
蛋白肽、香菇多糖、采绒革盖菌提取物、喃氟啶/尿嘧啶、雌氮芥(雌激素/氮芥)、沙立度胺(thalidomide)和来那度胺

[0146] 其它合适的化学治疗剂包括蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体抑制剂阻碍蛋白酶体、降解蛋白质的细胞复合物，尤其那些涉及细胞维持、生长、分裂和细胞死亡的短时间存活的蛋白质的作用。蛋白酶体抑制剂的实例包括硼替佐米(bortezomib) 乳胞素(AG科学公司，加利福尼亚州圣地亚哥)、MGl 32(Biomol International，宾夕法尼亚州普利茅斯米丁)PS-519、埃波纳霉素(eponemycin)、环氧霉素、阿克拉霉素A、二肽苯甲酰胺、CVT-
63417和乙烯基砜三肽蛋白酶体抑制剂。

[0147] 在一些实施例中，本文所描述的方法结合包括癌症免疫疗法的一或多种其它癌症治疗使用。癌症免疫疗法是利用免疫系统排斥癌症。主要前提是刺激个体的免疫系统攻击造成疾病的肿瘤细胞。这可以通过免疫接种个体，在此情况下呈现个体的自身免疫系统以将肿瘤细胞识别为待破坏的标靶；或通过施用疗法，如抗体作为药物，在此情况下通过治疗剂恢复个体的免疫系统以破坏肿瘤细胞。癌症免疫疗法包括基于抗体的疗法和基于细胞因子的疗法。

[0148] 许多治疗性单克隆抗体已经过FDA批准用于人类，并且更多在进行中。用于癌症免疫疗法的经过FDA批准的单克隆抗体包括对CD52、CD33、CD20、ErbB2、血管内皮生长因子和表皮生长因子受体的抗体。靶向一或多种癌症相关的抗原的这些和其它抗体因此适用于将与二聚NKG2D-Fc结合施用的组合疗法。经过FDA批准用于癌症疗法的单克隆抗体的实例包括但不限于：利妥昔单抗(Rituximab)(可以RituxanTM购得)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)(可以HerceptinTM购得)、阿仑单抗(Alemtuzumab)(可以Campath-IHTM购得)、西妥昔单抗(Cetuximab)(可以ErbituxTM购得)、贝伐单抗(Bevacizumab)(可以AvastinTM购得)、帕尼单抗(Panitumumab)(可以VectibixTM购得)、吉妥单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)(可以MylotargTM购得)、替坦异贝莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(可以ZevalinTM购得)和托西莫单抗(Tositumomab)(可以BexxarTM购得)。目前在美国中正在针对癌症疗法进行人类临床测试的单克隆抗体的实例包括但不限于：WX-G250(可以RencarexTM购得)、易普利姆玛(Ipilimumab)(可以MDX-010购得)、扎木单抗(Zanolimumab)(可以HuMax-CD4购得)、奥法木单抗(Ofatunumab)(可以HuMax-CD20购得)、ch14.18、扎芦木单抗(Zalutumumab)(可以HuMax-EGFr购得)、奥戈伏单抗(Oregovomab)(可以B43.13,OvalRexTM购得)、依决洛单抗(Edrecolomab)(可以IGN-101,PanorexTM购得)、131I-chTNT-I/B(可以CotaraTM购得)、帕特姆单抗(Pemtumomab)(可以R-1549,TheragynTM购得)、林妥珠单抗(Lintuzumab)(可以SGN-TM33购得)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)(可以hMN14,CEAcide 购得)、卡托莫西单抗
(Catumaxomab)(可以RemovabTM购得)、CNTO 328(可以cCLB8购得)、3F8、177Lu-J591、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、SGN-30、替西木单抗(Ticilimumab)(可以CP-675206购得)、达利珠单抗(Daclizumab)(可以ZenapaxTM购得)、依帕珠单抗(Epratuzumab)(可以hLL2,
TM 90
LymphoCide 购得)、Y-依帕珠单抗(Epratuzumab)、加利昔单抗(Galiximab)(可以IDEC-
114购得)、MDX-060、CT-011、CS-1008、SGN-40、玛帕单抗(Mapatumumab)(可以TRM-I购得)、阿泊珠单抗(Apolizumab)(可以HuID10,RemitogenTM购得)和伏洛昔单抗(Volociximab)(可以M200购得)。

[0149] 癌症免疫疗法还包括基于细胞因子的疗法。基于细胞因子的癌症疗法利用调节个体的免疫反应的一或多种细胞因子。适用于癌症治疗的细胞因子的非限制性实例包括干扰素-α(IFN-α)、白介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-12(IL-12)。

[0150] 在整个本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考、授予的专利、公开的专利申请以及共同待决专利申请)的全部内容特此以引用的方式明确地并入。

[0151] 实例

[0152] 构筑体

[0153] hIgG1

[0154] 这一构筑体是来自亲本pFUSE-hIgG1载体(英伟杰)的hIgG1部分。

[0155] hNKG2Dx2-hIgG1

[0156] 氨基酸间隔子在其之间的人类NKG2D(F78-V216)的两种复本通过pFUSE-hIgG1载体(英伟杰)的无限制克隆5'来克隆。这一构筑体的示意图描绘于图1中，左图。

[0157] hNKG2D，参考序列NP_031386.2，氨基酸78-216：

[0158]FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV(SEQ ID NO:1)[0159] hIgG1-X or hNKG2Dx2-hIgG1-X

[0160] 使用上文所述的hIgG1载体或hNKG2Dx2-hIgG1亲本载体，各种构筑体经克隆hIgG1区段的3'(通过上文“X”表示)。下文描述这些构筑体。

[0161] hIL15/hIL15Ra

[0162] 将一部分人类IL-15受体α(hIL15Ra，基因银行AAP69528.1，氨基酸31-107)的密码子优化形式融合到IL-15的密码子佳化形式(IL15，基因银行AAX37025，氨基酸22-135)。hIL15Ra和hIL-15由二十个氨基酸(G4S)4(SEQ ID NO:3)分离。下文展示氨基酸序列。

[0163] hIL15Ra，基因银行AAP69528.1，氨基酸31-107：

[0164]ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP(SEQ ID NO:8)

[0165] IL15，基因银行AAX37025，氨基酸22-135：

[0166]NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:9)

[0167] aPD1

[0168] 抗小鼠PD1的ScFv经克隆hIgG1载体或hNKG2Dx2-hIgG1载体中的hIgG1区段的3'。

[0169] aCTLA4

[0170] 抗小鼠CTLA4的ScFv经克隆hIgG1载体或hNKG2Dx2-hIgG1载体中的hIgG1区段的3'。

[0171] 异源表达和纯化

[0172] 所指示的融合构筑体通过编码构筑体的质粒的磷酸钙转染在293FT细胞中产生。收集上清液，并且融合构筑体通过蛋白A色谱法纯化。将每种构筑体(用2-巯基乙醇还原并加热到70℃持续10分钟或不加热)的1μg装载到8-10％SDS-PAGE凝胶上，在100V下进行60-
120分钟，并且用考马斯亮兰染色(Coomassie Blue staining)观测蛋白质。图2展示
hNKG2Dx2-hIgG1-hIL15/Ra以单融合蛋白形式产生，并且容易通过蛋白A纯化。

[0173] 增殖分析

[0174] 使用RosetteSep(StemCell Technologies)自正常供体分离人类NK细胞。NK细胞用5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)(英杰公司)标记。细胞随后在具有IL-15构筑体(hIgG1-hIL15/Ra或hNKG2Dx2-20AA-hIgG1-hIL15/Ra)或IL-15的各种稀释液的RPMI+10％FBS中培养4天，并使用FACSCanto(BD)测量CFSE稀释液。图3提供结果，所述结果展示与hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra一起培育类似于与IL-15一起培育促进人类NK细胞的增殖。

[0175] 杀灭分析

[0176] 使用RosetteSep(StemCell Technologies)自正常供体分离人类NK细胞，并在BamBanker(Wako)中冷冻。将NK细胞解冻，并将其在RPMI+10％FBS+200IU/mL hIL-2中过夜回收。随后在PBS中将细胞洗涤三次，并添加到各种先前标记有CFSE(英杰公司)的肿瘤标靶。细胞在1000rpm下离心1分钟，并且在潮湿CO2培育箱中在37度下共同培养5小时。在4小时之后，添加7-氨放射菌素D(7-AAD)，并分析肿瘤靶细胞死亡。

[0177] 图4展示hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra促进多个细胞系的有效杀灭，并且优于具有中度配体表达的细胞株中的hNKG2Dx2-hIgG1。图A展示构筑体未促进不表达NG2D-L的B16肿瘤细胞系的杀灭。hNKG2Dx2-hIgG1和hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra构筑体两者同等地促进表达高含量NKG2D配体(图4，图B)的合成B16肿瘤细胞系的杀灭。各种肿瘤在其细胞表面上表达不同含量的NKG2D配体，如通过NKG2D融合蛋白结合所测量(图4，图C)。hNKG2Dx2-hIgG1和hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra构筑体也促进自然表达高含量NKG2D配体的肿瘤的杀灭(K562)，但hNKG2Dx2-hIgG1-IL15/Ra构筑体以与NKG2D配体表达负相关的渐变方式驱动较优的杀灭(图4，图D)。

[0178] IFNγELISA

[0179] 人类NK细胞经分离、冷冻并添加到如上文所述的肿瘤标靶，不同之处在于对于NK细胞而言不存在过夜回收时段(例如RPMI+10％FBS+200IU/mL hIL-2)，并且肿瘤标靶不标记CFSE。在共同培养24小时之后，盘经离心沉降并通过IFN-γ(百克顿-迪金森公司)抽吸上清液以进行分析。

[0180] 图5展示静息NK细胞由融合蛋白活化以产生IFN-γ，但最大生产率需要所有三种组分：NKG2D、hIgG1和IL-15。应注意N297Q是防止CD16(在NK上表达)结合于hIgG1的hIgG1中的突变。

[0181] CD16和IL-15活化

[0182] 图6展示预活化NK细胞(例如用hIL-2培育过夜)需要CD16结合以杀灭靶细胞，但不需要IL-15。

[0183] 人类NK细胞经分离、冷冻并添加到如上文所述的肿瘤标靶。不存在针对NK细胞的过夜回收时段。肿瘤标靶标记有CFSE。图7展示静息NK细胞的最佳活化和通过静息NK细胞的杀灭需要CD16结合和IL-15活化。

[0184] 二聚NKG2D-Fc构筑体的改进的特征

[0185] 展示具有NKG2D配体MICA的复合物中的NKG2Dx2-hIgG1的蛋白质模型展示于图13中。通过ELISA和流式细胞测量术分析NKG2Dx2-hIgG1和hNKG2Dx1-hIgG1构筑体结合到MICA*008。图8展示ELISA数据，所述ELISA数据表明相比于hNKG2Dx1-hIgG1，NKG2Dx2-hIgG1使用提高的亲合力结合于MICA*008。图9描绘流式细胞测量术数据，所述数据展示相比于hNKG2Dx1-hIgG1，hNKG2Dx2-hIgG1用提高的亲合力结合到NKG2D配体表达细胞。

[0186] 图10展示NKG2D-Fc驱动配体阳性(例如NKG2D配体表达)标靶的NK细胞杀灭。具体来说，hNKG2Dx2-20AA-hIgG1比hNKG2Dx1-20AA-hIgG1介导显著更高的B16细胞的杀灭。

[0187] 图11展示相比于hNKG2Dx1-hIgG1，hNKG2Dx2-hIgG1提高NKG2D配体表达细胞的杀灭。B16-测试ULBP2OE和HeyA8细胞。

[0188] 肿瘤可以使其NKG2D配体脱落，这进一步损害免疫反应。这一问题的一种可能的解决方案是“吸掉”可溶性NKG2D配体(例如可溶性MICA)以恢复免疫系统功能。图12展示可溶性MICA的NKG2Dx2-hIgG1中和优于NKG2Dx1-hIgG1中和。

[0189] 等效物

[0190] 本领域的技术人员顶多使用常规实验即可识别或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。这类等效物意图由以下权利要求书涵盖。

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