用于癌症免疫疗法的新颖的靶向MSLN的DNA疫苗
阅读：440发布：2020-05-15
专利汇可以提供用于癌症免疫疗法的新颖的靶向MSLN的DNA疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种减毒沙 门 氏菌属突变株，其包含编码间皮素的重组DNA分子。具体地，本发明涉及所述减毒沙门氏菌属突变株在 癌症免疫疗法 中的用途。，下面是用于癌症免疫疗法的新颖的靶向MSLN的DNA疫苗专利的具体信息内容。
1.减毒沙门氏菌属突变株，其包含重组DNA分子的至少一个拷贝，所述重组DNA分子包含编码间皮素(MSLN)的表达盒。
2.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中所述减毒沙门氏菌属突变株属于肠道沙门氏菌种，特别地其中所述减毒沙门氏菌属突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a。
3.根据权利要求1或2所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中所述表达盒是真核表达盒。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中MSLN选自人MSLN和与其具有至少80％序列同一性的蛋白，特别地其中MSLN具有如在SEQ ID NO 1中发现的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中所述重组DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1 ori和在CMV启动子控制下的、编码人MSLN或与其具有至少80％序列同一性的蛋白的真核表达盒，特别地其中人MSLN具有如在SEQ ID NO 2中发现的核酸序列。
6.用作药物的根据权利要求1-5中的任一项所述的减毒沙门氏菌属突变株。
7.用作疫苗的根据权利要求6所述的减毒沙门氏菌属突变株。
8.用在癌症免疫疗法中的根据权利要求7所述的减毒沙门氏菌属突变株。
9.根据权利要求8所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中癌症免疫疗法还包括施用一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株，其包含重组DNA分子的至少一个拷贝，所述重组DNA分子包含编码肿瘤抗原和/或肿瘤间质抗原的表达盒，特别地其中所述一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a，更特别地其中所述一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株包含编码人VEGFR-2和/或人威尔曼瘤蛋白(WT1)的减毒沙门氏菌属突变株。
10.前述权利要求中的任一项、特别是根据权利要求9所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中所述减毒沙门氏菌属突变株与所述一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株共同施用。
11.根据权利要求8-10中的任一项所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中癌症免疫疗法伴有化学疗法、放射疗法或生物学癌症治疗，特别地其中在化学疗法或放射疗法治疗周期之前或过程中、或在生物学癌症治疗之前或过程中、或在化学疗法或放射疗法治疗周期或生物学癌症治疗之前和过程中施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
12.根据权利要求6-11中的任一项所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中口服地施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
13.根据权利要求8-12中的任一项所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中所述癌症选自间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宫颈的鳞状细胞癌、头颈癌、外阴癌、肺和食管癌、肺腺癌、子宫内膜癌、双相性滑膜肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤和胃腺癌。
14.根据权利要求6-13中的任一项所述的减毒沙门氏菌属突变株，其中单次剂量包含约105至约1011个、特别地约106至约1010个、更特别是约106至约109个、更特别是约106至约
108个、最特别是约106至约107个菌落形成单位(CFU)。
15.用在个体化的癌症免疫疗法中的、根据权利要求8-14中的任一项所述的减毒沙门氏菌属突变株，所述癌症免疫疗法包括评估患者的MSLN表达模式和/或针对MSLN的免疫前应答的步骤。
用于癌症免疫疗法的新颖的靶向MSLN的DNA疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 间皮素是一种存在于多种人实体瘤的细胞表面上的糖基-磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白。用单克隆抗体(mAb)K1首次鉴别出间皮素(Chang等人,1992)。间皮素(MSLN)基因编码一种71-kDa前体蛋白，其被加工成40-kDa糖基-磷脂酰肌醇锚定的蛋白(即mAB K1所结合的成熟部分，被称作间皮素)和NH2-端31-kDa片段(被称作巨核细胞促进因子，其从细胞释放)。间皮素是一种以低水平存在于有限集合的正常成年组织(诸如间皮)上的肿瘤分化抗原，但是在间皮瘤、卵巢和胰腺癌中异常地过表达(Hassan等人,2004)。因而，MSLN对于癌症疫苗的开发而言是一种有前途的候选物。
[0003] 间皮素(MSLN)已经被描述为免疫疗法的靶抗原(Hassan等人,Clin Cancer Res,2004)。几种免疫治疗方案已经用于靶向过表达MSLN的肿瘤类型。Hassan等人(Clin Cancer Res,2004)公开了在成年裸鼠中表现出抗肿瘤活性的抗-间皮素免疫毒素SS1P[SS1(dsFv)PE38]。近年来，已经开始了几个早期临床试验，它们基于通过快速推注或连续静脉内输注来施用抗-间皮素免疫毒素SS1P或嵌合的抗-间皮素单克隆抗体MORAb-009(综合总结在Kelly等人,Mol Cancer Ther 2012中)。目前在I/II期临床试验中试验的另一个免疫治疗方案是基于抗-间皮素改造的淋巴细胞的施用(ClinicalTrials.gov；Identifyers NCT01355965和NCT01439152)。Dung等人(Clin Cancer Res,2012)公开了基于单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的间皮素疫苗，其以静脉内方式施用。Yamasaki等人(Int J Cancer,2013)公开了基于人腺病毒40的静脉内遗传间皮素疫苗。
[0004] 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的减毒衍生物是用于将异种抗原递送至哺乳动物免疫系统的有吸引力的媒介物，因为肠道沙门氏菌(S.enterica)菌株可以潜在地通过免疫接种的粘膜途径(即口服地或经鼻地)递送，这会提供与胃肠外施用相比的简单性和安全性的优点。此外，沙门氏菌属菌株会在全身和粘膜隔室的水平引起强烈的体液和细胞免疫应答。批制备成本较低，并且活细菌疫苗的制剂是高度稳定的。减毒可以通过删除多个基因(包括毒力基因、调节基因和代谢基因)来完成。
[0005] 已经证实几种通过aro突变减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株是异种抗原在动物模型中的安全且有效的递送媒介物。
[0006] 在WO 03/073995中描述了通过活的减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株向小鼠靶细胞中递送DNA构建体的方案，所述DNA构建体编码抗原、尤其是肿瘤间质抗原VEGFR。Niethammer等人(Nature Medicine 2002,8(12),1369)证实，携带编码鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2或FLK-1)(其是肿瘤血管生成所必需的)的表达载体的减毒的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)aroA菌株SL7207可作为癌症疫苗起作用。
[0007] 但是，仅存在一种减毒的肠道沙门氏菌血清变型菌株，即肠道沙门氏菌伤寒血清变型Ty21a(缩写：S.typhi Ty21a)，其已经被接受用于人类中，且以 (Berna Biotech Ltd.,a Crucell Company,Switzerland；日期为1996年12月16日的销售许可号PL
15747/0001)的商品名称进行分配。
15747/0001)的商品名称进行分配。
[0008] 这种良好耐受的针对伤寒的活口服疫苗通过野生型毒性细菌分离物S.typhi Ty2的化学诱变而衍生出，且携带galE基因中的功能缺失突变以及其它不太确定的突变。在它在实地试验中被证实有效和安全以后，它已经在许多国家被许可作为伤寒疫苗。
[0009] WO 2013/091898公开了一种用于培养减毒突变的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)菌株的方法，所述菌株缺少半乳糖差向异构酶活性且携带重组DNA分子。
[0010] MSLN对于癌症疫苗的开发而言是一种有前途的肿瘤抗原。以前可得到的MSLN疫苗的主要限制是经由静脉内施用途径的施用和有关的副作用。对基于靶向MSLN的改进癌症治疗方案的巨大需求到目前为止尚未得到满足。
[0011] 发明目的
[0012] 考虑到现有技术，本发明的一个目的是提供一种新颖的靶向MSLN的口服癌症疫苗。这样的靶向MSLN的癌症疫苗会为改善癌症患者的治疗选择提供重大优势。
发明内容
[0013] 在一个方面，本发明涉及减毒沙门氏菌属突变株，其包含重组DNA分子的至少一个拷贝，所述重组DNA分子包含编码间皮素(MSLN)的表达盒。
[0014] 本发明的减毒沙门氏菌属菌株经证实在健康小鼠中引起强烈的免疫应答。据发明人所知，该新颖的减毒沙门氏菌属菌株是第一种靶向MSLN的口服癌症疫苗。由于MSLN在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和多种其它肿瘤中过表达，本发明的减毒沙门氏菌属菌株作为用于治疗这些适应症的癌症疫苗具有巨大潜力。
[0015] 在第一个研究中，已经证实了根据本发明的疫苗(VXM04)会在健康小鼠中引起强烈的MSLN-特异性的免疫应答。这些结果指示，使用VXM04的疫苗接种可以导致免疫应答和针对过表达MSLN的肿瘤细胞的免疫记忆的发展。值得注意和惊人的是，新颖的疫苗VXM04在相对较低的剂量是有效的。本发明的减毒沙门氏菌属突变株可以应用在单一疗法中或与第二种减毒沙门氏菌属突变株联合应用，所述第二种减毒沙门氏菌属突变株包含编码第二种肿瘤抗原的DNA分子。此外，本发明的减毒突变株可以与化学疗法、放射疗法或生物学癌症治疗联合施用。如果患者已经形成对化学疗法的抗性(化疗难治的患者)，使用VXM04的治疗也可能是有效的。因此，本发明的新颖的减毒沙门氏菌属菌株可能用在新颖的、巨大改进的癌症治疗方案中。
[0016] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株属于肠道沙门氏菌种。在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a。
[0017] 在特定实施方案中，所述表达盒是真核表达盒。
[0018] 在特定实施方案中，MSLN选自人MSLN和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白。
[0019] 在特定实施方案中，所述MSLN具有如在SEQ ID NO 1中发现的氨基酸序列。
[0020] 在特定实施方案中，所述重组DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和在CMV启动子控制下的真核表达盒，所述真核表达盒编码人MSLN或与其具有至少80％序列同一性的蛋白。在特定实施方案中，人MSLN具有如在SEQ ID NO 2中发现的核酸序列。
[0021] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用于用作药物。
[0022] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用于用作疫苗。
[0023] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用于用在癌症免疫疗法中。
[0024] 在特定实施方案中，癌症免疫疗法还包括施用一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株，其包含重组DNA分子的至少一个拷贝，所述重组DNA分子包含编码肿瘤抗原和/或肿瘤间质抗原的表达盒。在特定实施方案中，所述一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。在特定实施方案中，所述一种或多种其它沙门氏菌属菌株包括编码肿瘤间质抗原人VEGFR-2和/或肿瘤抗原人威尔曼瘤蛋白(WT1)的减毒沙门氏菌属突变株。
[0025] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株与所述一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株共同施用。
[0026] 在特定实施方案中，癌症免疫疗法伴有化学疗法、放射疗法或生物学癌症治疗。
[0027] 在特定实施方案中，在化学疗法或放射疗法治疗周期中或在生物学癌症治疗过程中施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
[0028] 在特定实施方案中，在化学疗法或放射疗法治疗周期之前或在生物学癌症治疗之前施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
[0029] 在特定实施方案中，在化学疗法或放射疗法治疗周期之后或在生物学癌症治疗之后施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
[0030] 在其它实施方案中，在化学疗法、放射疗法治疗周期和生物学癌症治疗中的至少一个之前和过程中施用所述减毒沙门氏菌属突变株。在进行化学疗法、放射疗法和生物学癌症治疗中的超过一种的情况下，可以在这些疗法中的至少一种之前或过程中或者之前和过程中、特别是在这些疗法中的至少两种的过程中施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
[0031] 在特定实施方案中，口服地施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
[0033] 在特定实施方案中，单次剂量是约105至约1011个、特别是约106至约1010个、更特别是约106至约109个、更特别是约106至约108个、最特别是约106至约107个菌落形成单位(CFU)。
[0034] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用在个体化的癌症免疫疗法中，所述个体化的癌症免疫疗法包括评估患者的MSLN表达模式和/或针对MSLN的免疫前应答的步骤。
具体实施方式
[0035] 通过参考以下发明详述和其中包含的实施例，可以更容易地理解本发明。
[0036] 在一个方面，本发明涉及一种减毒沙门氏菌属突变株，其包含重组DNA分子的至少一个拷贝，所述重组DNA分子包含编码间皮素(MSLN)的表达盒。
[0037] 根据本发明，所述减毒沙门氏菌属菌株充当包含编码间皮素(MSLN)的表达盒的重组DNA分子的细菌载体用于将所述重组DNA分子递送进靶细胞中。
[0038] 在本发明的上下文中，术语“减毒的”表示这样的细菌菌株：其具有与不携带减毒突变的亲本细菌菌株相比降低的毒力。减毒的细菌菌株已经优选地丧失它们的毒力，但是保留它们的诱导保护性免疫的能力。减毒可以通过删除多个基因(包括毒力基因、调节基因和代谢基因)来完成。减毒的细菌可以天然地存在，或它们可以在实验室中人工地产生，例如通过适应新的培养基或细胞培养物，或它们通过重组DNA技术来生产。
[0039] 在本发明的上下文中，术语“突变株”表示在它的基因组中携带突变的细菌菌株。在该背景下，术语“突变”表示核酸序列中的变化，包括点突变、插入、缺失、易位和倒位。
[0040] 在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”是指“包括、但不限于”。该术语意图是开放式的，以指定任何所述的特征、元件、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个其它特征、元件、整数、步骤、组分或其集合的存在或添加。术语“包含”因而包括更限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方案中，贯穿本申请和尤其是在权利要求书内使用的术语“包含”可以用术语“由……组成”替代。
[0041] 在本发明的上下文中，术语“重组DNA分子”表示经工程改造的DNA构建体，优选地由不同起源的DNA片段组成。所述重组DNA分子可以是直链核酸，或优选地，是通过将编码MSLN的开放读码框引入表达载体质粒中而产生的环状重组DNA质粒。
[0042] 在本发明的上下文中，术语“表达盒”表示至少包含MSLN基因的核酸单元，其在控制它的表达的调节序列的控制下。在所述减毒沙门氏菌属突变株中包含的表达盒可以优选地介导包含的编码MSLN的开放读码框在靶细胞中的转录。表达盒典型地包含启动子、至少一个开放读码框和转录终止信号。
[0043] 间皮素是一种存在于正常间皮细胞上并在几种人肿瘤(包括间皮瘤和卵巢和胰腺腺癌)中过表达的40-kDa细胞表面糖蛋白。间皮素基因编码一种71-kDa前体蛋白，其被加工以产生31-kDa脱落蛋白(shed protein)(被称作巨核细胞促进因子(MPF))和40-kDa细胞结合片段间皮素。证实了间皮素在有白介素-3存在下表现出巨核细胞-集落形成活性。间皮素是一种以低水平存在于有限集合的正常成年组织(诸如间皮)上的肿瘤分化抗原，但是在多种人肿瘤中异常地过表达，所述人肿瘤包括间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宫颈的鳞状细胞癌、头颈癌、外阴癌、肺和食管癌、肺腺癌、子宫内膜癌、双相性滑膜肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤和胃腺癌。间皮素的正常生物学功能是未知的。在间皮素敲除的小鼠中的研究没有揭示可检测的表型，并且雄性和雌性小鼠都产生健康的后代。在胰腺癌中的研究提示，间皮素通过增加细胞增殖、迁移和S-期细胞群体而在肿瘤发生中起作用。此外，有证据表明，间皮素是一种免疫原性蛋白。由于它的表达模式、它的致癌功能和它的免疫原性潜力，肿瘤抗原间皮素对于癌症疫苗的开发而言是一种有前途的候选物。
[0044] 间皮素是一种以低水平存在于有限集合的正常成年组织(诸如间皮)上的肿瘤分化抗原，但是在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌中异常地过表达(Hassan等人,2004)。因而，MSLN对于癌症疫苗的开发而言是一种有前途的候选物。
[0045] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株属于肠道沙门氏菌种。在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a。所述减毒的S.typhi Ty21a菌株是Typhoral (也被称作 )(由Berna Biotech Ltd.,a Crucell Company,Switzerland制造)的活性组分。目前它是唯一被许可的针对伤寒的口服活疫苗。该疫苗已经经过广泛试验并被证实关于患者毒性以及向第三方的传播而言是安全的(Wahdan等人,J.Infectious Diseases 1982,145:292-295)。该疫苗在超过40个国家中被许可。Typhoral的销售许可号是日期为1996年12月16日的PL 15747/0001。一剂疫苗含有至少2x109个存活的S.typhi Ty21a菌落形成单位和至少5x109个非存活的S.typhi Ty21a细胞。
[0046] 伤寒沙门氏菌Ty21a细菌菌株的生化性能之一是它不能代谢半乳糖。所述减毒的细菌菌株也不能将硫酸盐还原成硫化物，这将它与野生型伤寒沙门氏菌Ty2菌株区分开。关于它的血清学特征，伤寒沙门氏菌Ty21a菌株含有O9-抗原(这是一种细菌外膜多糖)且缺乏O5-抗原(这又是鼠伤寒沙门氏菌的一种特征性组分)。该血清学特征支持在用于批次放行的一组鉴别试验中包括各个试验的原理。
[0047] 在特定实施方案中，所述表达盒是真核表达盒。在本发明的上下文中，术语“真核表达盒”表示允许开放读码框在真核细胞中表达的表达盒。已经证实，诱导适当免疫应答所需的异种抗原的量可能对于细菌而言是有毒的，并导致细胞死亡、异种抗原的表达的过度减少或缺失。使用在细菌载体中不表达、但是仅在靶细胞中表达的真核表达盒可能克服该毒性问题，并且表达的蛋白可能显示真核糖基化模式。
[0048] 真核表达盒包含能够控制开放读码框在真核细胞中的表达的调节序列，优选启动子和多腺苷酸化信号。在本发明的减毒沙门氏菌属突变株所包含的重组DNA分子中所含的启动子和多腺苷酸化信号优选地选择成在要免疫的受试者的细胞内起作用。合适的启动子(特别对于用于人类的DNA疫苗的生产而言)的例子包括、但不限于来自巨细胞病毒(CMV)(诸如强CMV立即早期启动子)、猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)(诸如HIV长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及来自人基因(诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白)的启动子。在一个特定实施方案中，所述真核表达盒含有CMV启动子。在本发明的上下文中，术语“CMV启动子”表示强立即早期巨细胞病毒启动子。
[0049] 合适的多腺苷酸化信号(特别对于用于人类的DNA疫苗的生产而言)的例子包括、但不限于牛生长激素(BGH)多腺苷酸化位点、SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸化信号。在一个特定实施方案中，在本发明的减毒沙门氏菌属突变株所包含的重组DNA分子中所含的真核表达盒包含BGH多腺苷酸化位点。
[0050] 除了异源MSLN基因的表达所需的调节元件(如启动子和多腺苷酸化信号)以外，在重组DNA分子中还可以包括其它元件。这样的另外的元件包括增强子。所述增强子可以是，例如，人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子，和病毒增强子诸如来自CMV、RSV和EBV的那些。
[0051] 调节序列和密码子通常是物种依赖性的，所以为了使蛋白生产最大化，调节序列和密码子优选地选择成在要免疫的物种中是有效的。本领域技术人员可以生产在给定的受试者物种中有功能的重组DNA分子。
[0052] 在特定实施方案中，MSLN选自人MSLN和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白。
[0053] 在该背景下，术语“约”或“大约”是指，在给定的值或范围的80％至120％内，可替换地在90％至110％内，包括在95％至105％内。
[0054] 在本发明的上下文中，术语“与人MSLN具有至少约80％序列同一性的蛋白”表示在人MSLN的氨基酸序列和/或编码人MSLN的氨基酸序列的核酸序列中存在差异的蛋白。所述蛋白可以具有天然来源，例如不同物种的MSLN的同系物，或是经工程改造的蛋白，例如经工程改造的MSLN衍生物。已知的是，密码子的使用在物种之间是不同的。因而，当在靶细胞中表达异源蛋白时，使核酸序列适应靶细胞的密码子使用可能是必要的，或至少是有用的。用于设计和构建给定蛋白的衍生物的方法是本领域的任何普通技术人员众所周知的。
[0055] 与人MSLN具有至少约80％序列同一性的蛋白可以含有一个或多个突变，所述突变包括一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或置换。根据本发明的教导，所述缺失、添加和/或置换的氨基酸可以是连续氨基酸，或可以散布在与人MSLN具有至少约80％序列同一性的蛋白的氨基酸序列的长度上。根据本发明的教导，可以添加、缺失和/或置换任意数目的氨基酸，只要与人MSLN的序列同一性是至少约80％即可。在特定实施方案中，与人MSLN的序列同一性是至少约80％、至少约85％、至少约90％，或最特别地是至少约95％。用于确定序列同一性的方法和算法(包括对比亲本蛋白和它的与亲本序列相比具有缺失、添加和/或置换的衍生物)是本领域的普通技术人员众所周知的。在DNA水平，编码与人MSLN具有至少约80％序列同一性的蛋白的核酸序列可以由于遗传密码的简并性而具有更大程度的差异。
[0056] 在特定实施方案中，MSLN具有如在SEQ ID NO 1中发现的氨基酸序列。
[0057] 在特定实施方案中，所述重组DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和在CMV启动子控制下编码人MSLN或与其具有至少80％序列同一性的蛋白的真核表达盒。在特定实施方案中，人MSLN具有如在SEQ ID NO 2中发现的核酸序列。
[0058] 在特定实施方案中，所述重组DNA分子源自商购可得的pVAX1TM表达质粒(Invitrogen,San Diego,California)。通过用pBR322的低拷贝pMB1复制起点替换高拷贝pUC复制起点，改造该表达载体。进行所述低拷贝改造，以便减小代谢负担和使得所述构建体更稳定。产生的表达载体骨架被命名为pVAX10。通过NheI/XhoI将具有在SEQ ID NO 2中发现的核酸序列的人MSLN插入该表达载体骨架中，产生表达质粒pVAX10.hMSLN。在图3中示意地描绘了表达质粒pVAX10.hMSLN。
[0059] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用于用作药物。
[0060] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用于用作疫苗。
[0061] 在本发明的上下文中，术语“疫苗”表示在施用后能够在受试者中诱导免疫应答的试剂。疫苗优选地可以预防、改善或治疗疾病。根据本发明的疫苗包含减毒沙门氏菌属突变株，优选S.typhi Ty21a。根据本发明的疫苗还包含重组DNA分子的至少一个拷贝，所述重组DNA分子包含编码MSLN的表达盒，优选真核表达盒，所述MSLN优选地选自人MSLN或与其具有至少约80％序列同一性的蛋白。
[0062] 包含编码MSLN的重组DNA分子的、根据本发明的活的减毒沙门氏菌属突变株可以用作用于口服递送该重组DNA分子的媒介物。这样的包含编码异种抗原(诸如MSLN)的DNA分子的递送载体被称作DNA疫苗。
[0063] 基因免疫接种可能比常规疫苗接种有利。靶DNA可以在相当长的时间段内检测到，因而充当抗原的储库。在某些质粒中的序列基序(如GpC岛)是免疫刺激性的，且可以充当被LPS和其它细菌组分引起的免疫刺激促进的佐剂。
[0064] 活细菌载体在原位产生它们自己的免疫调节因子诸如脂多糖(LPS)，这可以构成胜过其它施用形式(诸如微囊化)的一个优点。此外，天然进入途径的应用证实是有利的，因为许多细菌(如沙门氏菌属)通过派伊尔斑的M细胞从肠腔流出并最终迁移进淋巴结和脾中，从而允许疫苗靶向免疫系统的诱发位点。迄今为止已经证实伤寒沙门氏菌的疫苗菌株Ty21a具有优良的安全性。在通过M细胞从肠腔离开后，所述细菌被吞噬细胞(诸如巨噬细胞和树突细胞)摄入。这些细胞被病原体活化并开始分化，并且可能迁移进淋巴结和脾中。由于它们的减毒突变，S.typhi Ty21菌株的细菌不能在这些吞噬细胞中持续，而是在该时间点死亡。重组DNA分子被释放并随后通过特定运输系统或通过胞内体渗漏转移进吞噬性免疫细胞的胞质溶胶中。最后，重组DNA分子进入细胞核中，在此处它们被转录，导致吞噬细胞的胞质溶胶中的MSLN表达。活化的抗原呈递细胞会诱导针对MSLN的特异的细胞毒性的T细胞。
[0065] 迄今为止还没有可得到的数据指示，S.typhi Ty21a能够全身地进入血流中。活的减毒的伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗菌株因而允许免疫系统的特异性靶向，同时表现出优良的安全性。相反，基于腺病毒的DNA疫苗可能带有不希望的病毒复制的固有风险。
[0066] 肠道沙门氏菌的减毒衍生物作为将异种抗原递送至哺乳动物免疫系统的媒介物是有吸引力的，因为肠道沙门氏菌菌株可以潜在地通过免疫接种的粘膜途径(即口服地或经鼻地)递送，这会提供与胃肠外施用相比的简单性和安全性的优点。此外，沙门氏菌属菌株会在全身和粘膜隔室的水平引起强烈的体液和细胞免疫应答。
[0067] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用于用在癌症免疫疗法中。
[0068] 在特定实施方案中，癌症免疫疗法还包括施用一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株，其包含重组DNA分子的至少一个拷贝，所述重组DNA分子包含编码肿瘤抗原和/或肿瘤间质抗原的表达盒。在特定实施方案中，所述一种或多种其它沙门氏菌属突变株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。在特定实施方案中，所述一种或多种其它沙门氏菌属菌株包括编码人VEGFR-2和/或人威尔曼瘤蛋白(WT1)的减毒沙门氏菌属突变株。
[0069] 将本发明的减毒沙门氏菌属突变株与包含编码第二种肿瘤抗原的DNA分子的第二种减毒突变株组合可能具有协同抗肿瘤作用。具体地，不同肿瘤抗原的同时靶向可能使肿瘤逃逸的风险最小化。将基于MSLN的癌症免疫疗法与基于VEGFR-2的免疫疗法组合可以证实是特别有效的，因为过表达MSLN的肿瘤细胞和肿瘤脉管系统同时受到攻击。
[0070] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株与所述一种或多种其它减毒沙门氏菌属突变株共同施用。
[0071] 在本发明的上下文中，术语“共同施用(“co-administration”或“co-administer”)是指，在连续3天内，更特别地在连续2天内，更特别地在同一天，更特别地在12小时内，施用两种不同的减毒沙门氏菌属突变株。最特别地，在本发明的上下文中，术语“共同施用”表示两种不同的减毒沙门氏菌属突变株的同时施用。
[0072] 在特定实施方案中，癌症免疫疗法伴有化学疗法、放射疗法或生物学癌症治疗。为了治愈癌症，癌症干细胞的完全根除可能是必需的。为了最大效力，不同治疗方案的组合可能是有益的。
[0073] 在本发明的上下文中，术语“生物学癌症治疗”表示包括使用活生物体、从活生物体衍生出的物质、或这样的物质的实验室生产的形式的癌症治疗。一些生物学癌症疗法目标在于刺激身体的免疫系统以针对癌细胞起作用(所谓的生物学癌症免疫疗法)。生物学癌症治疗方案包括递送肿瘤抗原、递送作为药物的治疗性抗体、施用免疫刺激性的细胞因子和施用免疫细胞。治疗性抗体包括靶向肿瘤抗原或肿瘤间质抗原的抗体以及充当检验点抑制剂的抗体，诸如抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA4。
[0074] 可以与本发明的减毒沙门氏菌属突变株联合使用的化学治疗剂可以是，例如：吉西他滨、氨磷汀(阿密磷定)、卡巴他赛、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、多西他赛、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂质体(doxil)、亚叶酸、吉西他滨(健择)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(daunoxome)、丙卡巴肼、酮康唑、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇(泰素)、多西他赛(泰索帝)、阿地白介素、天门冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、伊立替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酪、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥和它们的组合。
[0075] 与VXM04组合的根据本发明的最优选化学治疗剂是卡巴他赛、卡铂、奥沙利铂、顺铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、多柔比星、紫杉醇(泰素)、伊立替康、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、亚叶酸、5-氟尿嘧啶和博来霉素，特别是吉西他滨。
[0076] 取决于可能副作用的发生，也可能有利的是，包括使用抗生素或抗炎剂的治疗。
[0077] 如果发生类似于由组胺、白三烯或细胞因子介导的超敏反应的不利事件，则对于发热、过敏反应、血压不稳定性、支气管痉挛和呼吸困难的治疗选择是可利用的。不希望的T-细胞衍生的自身攻击的情况下的治疗选择源自在干细胞移植以后在急性和慢性移植物抗宿主病中应用的标准治疗方案。环孢菌素和糖皮质激素被提议作为治疗选择。
[0079] 在特定实施方案中，在化学疗法或放射疗法治疗周期中或在生物学癌症治疗过程中施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
[0080] 在特定实施方案中，在化学疗法或放射疗法治疗周期之前或在生物学癌症治疗之前施用所述减毒沙门氏菌属突变株。该方案可能具有可以在增强的癌症免疫的条件下执行化学疗法或放射疗法的优点。
[0081] 在特定实施方案中，在化学疗法或放射疗法治疗周期之后或在生物学癌症治疗之后施用所述减毒沙门氏菌属突变株。
[0082] 在特定实施方案中，口服地施用所述减毒沙门氏菌属突变株。口服施用比胃肠外施用更简单、更安全和更舒适。相反，Dung等人(Clin Cancer Res,2012)描述的活细菌疫苗(诸如基于单核细胞增生李斯特菌的间皮素疫苗)的静脉内施用最初会造成与脓毒症型的安全性风险有关的菌血症。因而，活细菌疫苗的静脉内施用需要小心地观察和监测临床征状诸如细胞因子释放。本发明的减毒突变株的口服施用可以至少部分地克服所述的风险。但是，必须指出，本发明的减毒沙门氏菌属突变株也可以通过任意其它合适的途径来施用。
优选地，将治疗有效剂量施用给受试者，并且该剂量取决于特定应用、恶性肿瘤的类型、受试者的重量、年龄、性别和健康状态、施用方式和制剂等。根据需要，施用可以是单次或多次。
优选地，将治疗有效剂量施用给受试者，并且该剂量取决于特定应用、恶性肿瘤的类型、受试者的重量、年龄、性别和健康状态、施用方式和制剂等。根据需要，施用可以是单次或多次。
[0083] 本发明的减毒沙门氏菌属突变株可以以溶液、混悬液、冻干粉剂或任意其它适合形式的形式提供。它可以与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂联合提供。还可以包括用于调节pH值的试剂、缓冲剂、用于调节毒性的试剂等。在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”表示当施用给哺乳动物(例如，人)时生理学上可耐受的且通常不会产生不良反应的分子实体和药物组合物的其它成分。术语“药学上可接受的”也可以是指被联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其它普遍公认的药典中列出用于哺乳动物和更具体地用于人类。
[0084] 在特定实施方案中，所述癌症选自间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宫颈的鳞状细胞癌、头颈癌、外阴癌、肺和食管癌、肺腺癌、子宫内膜癌、双相性滑膜肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤和胃腺癌。
[0085] 本发明的疫苗在相对较低的剂量是惊人地有效的。在特定实施方案中，所述单次剂量是约105至约1011个、特别是约106至约1010个、更特别是约106至约109个、更特别是约1068 6 7
至约10个、最特别是约10至约10个菌落形成单位(CFU)。低剂量的该活细菌疫苗的施用会使排泄的风险和因而向第三方传播的风险最小化。
至约10个、最特别是约10至约10个菌落形成单位(CFU)。低剂量的该活细菌疫苗的施用会使排泄的风险和因而向第三方传播的风险最小化。
[0086] 在该背景下，术语“约”或“大约”是指，在给定值或范围的3倍内，可替换地在2倍内，包括在1.5倍内。
[0087] 在特定实施方案中，所述减毒沙门氏菌属突变株用在个体化的癌症免疫疗法中，所述癌症免疫疗法包括评估患者的MSLN表达模式和/或针对MSLN的免疫前应答的步骤。
[0088] VXM04可以单独地或者与其它包含真核表达系统的基于伤寒沙门氏菌Ty21a的癌症疫苗联合地用于治疗多种癌症类型。在特定实施方案中，VXM04可以用于个体化的患者特异性的癌症治疗。对于该目的，可以在第一步中评估患者的肿瘤和/或间质抗原表达模式和/或患者针对肿瘤和/或间质抗原的免疫前应答，例如通过靶向患者的特定肿瘤和/或间质抗原模式的伴随诊断。取决于患者的肿瘤和/或间质抗原表达模式或患者针对肿瘤和/或间质抗原的免疫前应答，VMX04可以单独地或者与一种或多种合适的其它包含真核表达系统的基于伤寒沙门氏菌Ty21a的癌症疫苗联合地施用。但是，VXM04与一种或多种其它基于伤寒沙门氏菌Ty21a的癌症疫苗的组合也可以作为固定组合来施用。这些组合两种或更多种基于伤寒沙门氏菌Ty21a的癌症疫苗的混合物可以由单独的现成的产品组成。所述固定的或个体化的组合可以含有VXM01(WO 2013/091898)作为抗血管生成的基本疗法。
[0089] 图和表的简单描述
[0090] 图1:在质粒pVAX10.hMSLN中包含的MSLN cDNA编码的人MSLN的氨基酸序列[0091] 图2:pVAX10.hMSLN的核酸序列
[0092] 图3:pVAX10.hMSLN的质粒图谱
[0093] 图4:通过MSLN-GSL-Penta检测到的来自健康C57Bl/6小鼠的脾中的间皮素-特异性的CD8+细胞的百分比。显示了与用VXM-04m治疗的小鼠整体对比的用VXM-04m-空治疗的小鼠整体的各个百分比。
[0094] 图5:通过MSLN-GSL-Penta检测到的来自健康C57Bl/6小鼠的脾中的间皮素-特异性的CD8+细胞的百分比。显示了根据治疗组分配的各个百分比。
[0095] 图6:通过MSLN-GSL-Penta检测到的来自健康C57Bl/6小鼠的脾中的间皮素-特异性的CD8+细胞的百分比。显示了根据治疗组分配的各个百分比。
[0096] 图7:通过MSLN-IQL-Penta检测到的来自健康C57Bl/6小鼠的脾中的间皮素-特异性的CD8+细胞的百分比。显示了与用VXM-04m治疗的小鼠整体对比的用VXM-04m-空治疗的小鼠整体的各个百分比。
[0097] 图8:通过MSLN-IQL-Penta检测到的来自健康C57Bl/6小鼠的脾中的间皮素-特异性的CD8+细胞的百分比。显示了根据治疗组分配的各个百分比。
[0098] 图9:通过MSLN-IQL-Penta检测到的来自健康C57Bl/6小鼠的脾中的间皮素-特异性的CD8+细胞的百分比。显示了根据治疗组分配的各个百分比。
[0099] 表1：在Pentamer分析中使用的 重组MHC Pentamer。
[0100] 实施例
[0101] 实施例1：重组质粒pVAX10.mMSLN和pVAX10.hMSLN的制备
[0102] 将人MSLN(1893bp，根据NCBI参照序列NM_013404.4的MSLN序列)和鼠MSLN(1878bp，根据NCBI参照序列NM_018857.1的MSLN序列)克隆进pVAX10.VR2-1衍生的pVAX10骨架中。通过双链基因合成产生MSLN DNA片段，其中使用热稳定的连接酶将寡核苷酸连接在一起。将得到的连接产物通过PCR扩增。扩增后，通过NheI/XhoI将体外合成的人和鼠MSLN的DNA片段克隆进pVAX10骨架中(用人或鼠MSLN替换重组质粒pVAX10.VR2-1的VEGFR-2编码区)。对于质量控制，将整个质粒测序并在转化进大肠杆菌(E.coli)中以后与各个参照序列比对。两个序列都被证实没有错误。得到的质粒被命名为pVAX10.mMSLN和pVAX10.hMSLN。
[0103] 实施例2:用重组质粒转化减毒沙门氏菌属菌株：
[0104] 用质粒pVAX10.hMSLN转化S.typhi Ty 21a。用质粒pVAX10.mMSLN转化鼠伤寒沙门氏菌SL7207(aroA-)。通过电穿孔执行所述转化。
[0105] 感受态沙门氏菌属细胞的制备：
[0106] 将S.typhi Ty21a和鼠伤寒沙门氏菌SL7207的甘油培养物接种在LB平板(无动物组分的[ACF]大豆蛋白胨)上。将平板在37℃温育过夜。将各一个菌落用于过夜-液体-预培养。将接种了各一个菌落的3ml LB培养基(ACF大豆蛋白胨)在37℃和180rpm温育过夜。为了制备感受态细胞，给2x 300ml LB培养基(ACF大豆蛋白胨)接种3ml过夜培养物并在37℃和180rpm温育直到约0.5的OD600。然后将培养物放在冰上10分钟。随后，将细菌在3000xg在4℃离心10分钟，并将每种沉淀物再悬浮于500mL冰冷的H2Odest中。一个新的离心步骤以后，将细菌沉淀物在10％冰冷的甘油中洗涤2次。将两个托盘一起放在2ml 10％甘油中，并最后在干冰上在50μL的等分试样中冷冻。使用的甘油不含有任何动物成分(Sigma Aldrich,G5150)。
[0107] 感受态沙门氏菌属细胞的转化：
[0108] 对于每个转化反应，将感受态细胞的50μl等分试样在冰上融化10分钟。加入3-5μL质粒DNA(对于感受态S.typhi Ty21a细胞而言为pVAX10.hMSLN，和对于感受态鼠伤寒沙门氏菌SL7207细胞而言为pVAX10.mMSLN)以后，将混合物在冰上温育5分钟。随后，将混合物转移至预冷却的比色皿(1mm厚度)。在12.5kV/cm进行电脉冲。此后立即将1ml LB培养基(ACF大豆蛋白胨)加给细胞，并将细胞转移进2ml Eppendorf试管和在37℃摇动1小时。在台式离心机上的短离心步骤(16600rcf,20s)以后，将细菌沉淀物再悬浮于200μl不含抗生素的LB(ACF大豆蛋白胨)培养基中。用Drigalski刮勺将混合物涂布于含有卡那霉素(浓度＝25μg/ml或50μg/ml)的LB平板(ACF大豆蛋白胨)。将平板在37℃温育过夜。
[0109] 重组沙门氏菌属克隆的质粒制备：
[0110] 将每种重组沙门氏菌属菌株的3个克隆在3ml含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基(ACF大豆蛋白胨)中在37℃温育过夜。然后将细菌培养物通过离心(16600rcf,30s)进行沉淀。使用来自Macherey-Nagel的NucleoSpin Plasmid Kit执行质粒分离。用50μl水从硅胶柱洗脱质粒DNA。将5μl洗脱液用在琼脂糖凝胶电泳中进行对照。
[0111] 为了长期贮存，生产了阳性克隆的1ml甘油培养物。为此目的，将172μl甘油(无动物成分)加入对数生长的3ml培养物在1低ml螺口微管中的828μl培养基中。将样品在-70℃保存备用。
[0112] 从沙门氏菌属分离的重组质粒DNA的全测序：
[0113] 给3ml液体LB-Kan培养基(ACF大豆蛋白胨)接种重组沙门氏菌属(携带pVAX10.hMSLN的S.typhi Ty21a和携带pVAX10.mMSLN的鼠伤寒沙门氏菌SL7207)的一个菌落并在37℃和180rpm温育过夜。将过夜培养物通过在台式离心机(Biofuge pico,Heraeus)上在1300rpm离心30s进行沉淀。使用来自Macherey-Nagel的NucleoSpin Plasmid Kit执行质粒分离。在高分子量基因组DNA和细胞组分的碱性裂解和沉淀以后，将质粒DNA加载到具有硅胶(silica)膜的柱上。一个洗涤步骤以后，将质粒用50μl无菌水从柱洗脱并测序。然后通过克隆特异性的比对将序列与各个参照序列进行对比，即将每个沙门氏菌属克隆的质粒序列逐个与参照序列比对。所有序列与各个参照序列一致。将重组沙门氏菌属菌株命名为VXM04(携带质粒pVAX10.hMSLN的S.typhi Ty21a)和VXM04m(携带质粒pVAX10.mMSLN的鼠伤寒沙门氏菌SL7207)。
[0114] 实施例3：在健康的C57Bl/6小鼠中评估VXM04m的免疫动力学
[0115] 通过Pentamer分析和ELISpot评价健康C57Bl/6小鼠中针对鼠间皮素的特异性免疫活化的动力学。作为阴性对照，在研究方案中包括载体对照组(接受VXM04m-空＝不含有表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌)以将期望的免疫学效应与由沙门氏菌属空载体造成的任何非特异性的背景刺激区分开。在使用VXM04m和VXM04m-空(各1010CFU/剂)的4倍每2天疫苗接种以后，在疫苗接种后D5、D7、D10、D14和D21进行免疫监测。
[0116] 1.动物维持
[0117] 从JANVIER(Le Genest St Isle,France)得到52只健康雌性C57Bl/6小鼠(在接收时6周龄)，并在无特定病原体(SPF)的动物监护单元中观察7天，然后开始程序。在温度(23±2℃)、湿度(45±10％)、光周期(12h亮/12h暗)和空气交换的受控条件下将动物维持在房间中。将动物维持在SPF条件中。连续地监测室温和湿度。将空气处理系统程序化为14次换气/小时，没有再循环。使新鲜室外空气穿过一系列过滤器，然后均匀地扩散进每个房间。在实验室中维持正压(20±4Pa)以防止污染或啮齿动物群体内的病原体的传播。将动物圈养在聚碳酸酯笼子(Techniplast,Limonest,法国)中，所述笼子配有提供食品和水的装置。使用的标准面积笼子是800cm2，每个笼子最多10只小鼠(来自相同组)。动物的垫层是无菌玉米轴垫层(参考：LAB COB 12,SERLAB,Cergy-Pontoise,法国)，每周更换2次。动物木购自DIETEX(Saint-Gratien,法国)。辐照过的RM1用作无菌控制颗粒。从配有橡胶塞和snipper管的水瓶随意提供食品。将水瓶通过无菌过滤进行灭菌并每周更换2次。在D0，使用Vivo软件(Biosystemes,Couternon,法国)根据它们各自的体重将52只小鼠中的50只分成2组各25只小鼠。两组的平均体重没有统计不同(方差分析)。
[0118] 2.治疗计划
[0119] 来自组1-5的小鼠接受VXM04m-空的施用，来自组6-10的动物接受VXM04m的施用。将VXM04m-空和VXM04m融化并在30min内施用，使用后抛弃工作溶液。VXM04m-空和VXM04m的治疗剂量是在每次施用的100μl中的1010CFU。以0.1ml的体积通过经口管饲法(口服,PO)用插管施用VXM04m-空和VXM04m。不论动物组，在给药之前每只动物接受给药前应用缓冲液以中和胃中的酸(100μl/动物/应用)。因而缓冲液由溶解在100ml饮用水中的2.6g碳酸氢钠、
1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物组成，并在应用VXM04m-空和VXM04m之前30min内应用。治疗计划如下：
1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物组成，并在应用VXM04m-空和VXM04m之前30min内应用。治疗计划如下：
[0120] 来自组1-5的小鼠接受1010CFU的VXM04m-空的每天口服施用，每2天1次连续4次(Q2Dx4)。
[0121] 来自组6-10的小鼠接受1010CFU的VXM04m的每天口服施用，每2天1次连续4次(Q2Dx4)。
[0122] 3.动物监测和处死
[0123] 每天记录动物的生存力和行为，每周2次地测量体重。
[0124] 不论施用的沙门氏菌属疫苗，在疫苗接种阶段(每个动物组和时间点5只小鼠)以后5天(组1和6)、7天(组2和7)、10天(组3和8)、14天(组4和9)和21天(组5和10)将小鼠处死。在处死之前使用异氟烷(Baxter,法国)麻醉动物。通过颈椎脱位将动物处死。对所有处死的动物执行尸体剖检(心脏、肺、肝、脾、肾和胃肠道的肉眼检查)。在小鼠处死时，将脾收集并逐个放入单个ID标记的各自含有冷PBS(2-8℃)的试管中，并在2-8℃储存过夜。将新鲜分离的和纯化的脾细胞用于Pentamer分析。将新鲜制备的CD8+细胞用于ELISpot分析。
[0125] 4.脾细胞制备
[0126] 如下执行脾细胞制备：在洗涤步骤中，抛弃PBS的一部分，并用新鲜PBS替换。将100μm尼龙Cell Strainer(BD Falcon)悬挂在含有5ml 1x PBS的50ml Falcon的开口中。将脾用解剖刀切割，然后用5ml注射器的柱塞推动穿过Cell Strainer。每个脾使用一个Strainer，总是将Strainer在间隙之间用无菌1x PBS冲洗。将细胞在2-8℃在1,500rpm(大约450g)离心10min，并抛弃上清液。每个脾加入1ml ACK-Ery-Lysis缓冲液(8.3g/l NH4、1g/l KHCO3、0.037g/l EDTA；pH 7.2-7.4)以裂解红血细胞。将溶液在室温温育30秒。加入
10ml PBS，并将细胞在2-8℃在1,500rpm再次离心10min，抛弃上清液。将沉淀物再悬浮于
10ml DMEM培养基中。用锥虫蓝执行活/死细胞染色，并计数细胞数目。将细胞混悬液分份用于随后分析。将约1/3用于Pentamer分析，将剩余用于ELISpot分析。
10ml PBS，并将细胞在2-8℃在1,500rpm再次离心10min，抛弃上清液。将沉淀物再悬浮于
10ml DMEM培养基中。用锥虫蓝执行活/死细胞染色，并计数细胞数目。将细胞混悬液分份用于随后分析。将约1/3用于Pentamer分析，将剩余用于ELISpot分析。
[0127] 5.Pentamer分析
[0128] Pentamer分析包括生存力染色和Pentamer染色。对于生存力染色，在除去帽子之前，使1瓶荧光反应性染料(Pacific Orange-组分A)和1瓶无水DMSO(组分B)达到室温。将50μl DMSO(组分B)加入反应性染料(组分A)的瓶中。随后，将孔混合，并用肉眼证实所有染料6
已经溶解。将反应性染料的溶液在重构的几小时内没有迟延地使用。将含有至少1x 10 个细胞的细胞混悬液离心并抛弃上清液。将细胞用1ml PBS洗涤1次并再悬浮于1ml PBS中。将细胞计数，并将密度用PBS调至在1ml体积中的1x 106个细胞。将1μl重构的荧光反应性染料加入1ml细胞混悬液中。然后将混悬液彻底混合并在室温避光温育30min。将细胞用1ml含有
1％胎牛血清(FCS)的PBS洗涤1次，并再悬浮于1ml含有1％FCS的PBS中。
已经溶解。将反应性染料的溶液在重构的几小时内没有迟延地使用。将含有至少1x 10 个细胞的细胞混悬液离心并抛弃上清液。将细胞用1ml PBS洗涤1次并再悬浮于1ml PBS中。将细胞计数，并将密度用PBS调至在1ml体积中的1x 106个细胞。将1μl重构的荧光反应性染料加入1ml细胞混悬液中。然后将混悬液彻底混合并在室温避光温育30min。将细胞用1ml含有
1％胎牛血清(FCS)的PBS洗涤1次，并再悬浮于1ml含有1％FCS的PBS中。
[0129] 对于Pentamer染色，使用用于生存力门控的Pacific Orange预标记的脾细胞。使用的 重组MHC Pentamer列出在下表1中：
[0130]
[0131] 将 Pentamer在冷微量离心机中在14,000xg离心5-10分钟以将存在于溶液中的任何蛋白聚集体收集在瓶底，以便避免非特异性的染色。将上清液用于Pentamer染色。将所有试剂避光维持在冰上直到需要。每种染色条件分配1x106个脾细胞。将细胞用2ml洗涤缓冲液(含有1％FCS的PBS)洗涤并离心(500x g 5分钟)，抛弃上清液，并将细胞再悬浮于残余体积(～50μl)中。将试管保持在冰上冷藏用于所有后续步骤，除非另有指示。将一个试验(2μl)的未标记的Pentamer加给细胞，并将溶液通过移液管上下吹吸进行混合，并在室温(22℃)避光温育10min。然后将细胞用2ml洗涤缓冲液洗涤并再悬浮于残余液体(～50μl)中。将 Fluorotag R-PE在冷微量离心机中在14,000x g离心3分钟以除去否则会促进非特异性结合的蛋白聚集体。将试剂避光维持在冰上直到需要。将上清液用于Pentamer染色。加入8μl Fluorotag和1μl抗-CD8FITC和0.5μl抗-CD3APC/Cy-7抗体，并将溶液通过移液管上下吹吸进行混合。将样品避光在冰上温育20分钟。将细胞用2ml洗涤缓冲液洗涤
2次并将每个试管混合。加入200μl固定溶液(1％FCS,2.5％甲醛在PBS中的溶液)，并将试管涡旋。彻底涡旋对于避免细胞团集来说是重要的。在准备好数据采集之前，将试管在冰箱中在暗处保存。在任何情况下，由于固定以后形态学变化，在着手数据采集之前将样品放置3小时。
2次并将每个试管混合。加入200μl固定溶液(1％FCS,2.5％甲醛在PBS中的溶液)，并将试管涡旋。彻底涡旋对于避免细胞团集来说是重要的。在准备好数据采集之前，将试管在冰箱中在暗处保存。在任何情况下，由于固定以后形态学变化，在着手数据采集之前将样品放置3小时。
[0132] 研究了各自与Pentamer(由Proimmune制造)的特异性结合。在选择适当的门以后，计数m间皮素特异性的CD8+T细胞。基于与Pentamer的结合亲和力，计算m间皮素特异性的CD8+T细胞的比率。在VXM04m和VXM04m-空对照组之间和在组内随时间对比所述比率。使用Vivo 软件(Biosystems,Dijon,法国)执行所有统计分析。认为p值<0.05的是显著的。间皮素-特异性的CD8+细胞的各个百分比呈现在图4–9中。图4-6代表通过MSLN-GSL-Penta检测到的间皮素-特异性的CD8+细胞；图7-9代表通过MSLN-IQL-Penta检测到的间皮素-特异性的CD8+细胞。免疫动力学(平均值)在疫苗接种后10天达到峰值。不论使用的Pentamer，间皮素-特异性的CD8+细胞在第10天的百分比与对照组相比显著增加。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于癌症免疫疗法的NKG2D-IG融合蛋白 | 2020-05-13 | 522 |
| 癌症免疫疗法的组合物和方法 | 2020-05-13 | 595 |
| 用于癌症和自身免疫疾病的免疫疗法 | 2020-05-13 | 89 |
| 用共刺激分子的联合癌症免疫疗法 | 2020-05-14 | 436 |
| 用于治疗癌症的组合免疫疗法 | 2020-05-11 | 722 |
| 针对癌症的靶向细胞周期蛋白A1的T细胞免疫疗法 | 2020-05-18 | 189 |
| 在癌症免疫疗法中有用的生物标记 | 2020-05-12 | 44 |
| 用于癌症免疫疗法的组合物和方法 | 2020-05-13 | 272 |
| 用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体 | 2020-05-17 | 16 |
| 癌症免疫疗法组合物和方法 | 2020-05-14 | 162 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
癌症免疫疗法热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈