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用于增强或抑制胰岛素-样生长因子1(IGF-1)的单克隆抗体

阅读：835发布：2021-12-12

专利汇可以提供用于增强或抑制胰岛素-样生长因子1(IGF-1)的单克隆抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种结合αvβ3整联蛋白的分离 抗体 或其 抗原 结合 片段 ，以及在 疾病 和失调的 治疗 中的使用方法。，下面是用于增强或抑制胰岛素-样生长因子1(IGF-1)的单克隆抗体专利的具体信息内容。

1.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1(KSSQSLLYSSNQKNYLA)的轻链互补决定区(CDR)序列LCDR1；SEQ ID NO：2(WASTRES)的LCDR2；和SEQ ID NO：3(KQYYTYPLT)的LCDR3。
2.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1(KSSQSLLYSSNQKNYLA)的轻链互补决定区(CDR)序列LCDR1；SEQ ID NO：2(WASTRES)的LCDR2；和SEQ ID NO：3(KQYYTYPLT)的LCDR3以及SEQ ID NO：4(NSWMN)的重链互补决定区(CDR)序列HCDR1；SEQ ID NO：5(IFPGDGDTNYNGKFKG)的HCDR2和SEQ ID NO：6(WGLTRDRRLYLDY)的HCDR3。
3.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区(HCVR)：
a)包含SEQ ID NO：7(VH1；Q A Q L V Q S G P E L K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)的氨基酸序列的HCVR；
b)包含SEQ ID NO：8(VH2；Q A Q L V Q S G P E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)的氨基酸序列的HCVR；
c)包含SEQ ID NO：9(VH3；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)的氨基酸序列的HCVR；
d)包含SEQ ID NO：10(VH4；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)的氨基酸序列的HCVR；
e)包含SEQ ID NO：11(VH5；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)的氨基酸序列的HCVR；和
f)包含SEQ ID NO：12(VH6；Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)的氨基酸序列的HCVR。
4.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自以下的轻链可变区(LCVR)：
a)包含SEQ ID NO：13(Vκ1；D I V M T Q S P D S L V V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)的氨基酸序列的LCVR；
b)包含SEQ ID NO：14(Vκ2；D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)的氨基酸序列的LCVR；和
c)包含SEQ ID NO：15(Vκ3；D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)的氨基酸序列的LCVR。
5.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：7(HV1)、SEQ ID NO：8(VH2)、SEQ ID NO：9(VH3)、SEQ ID NO：
10(VH4)、SEQ ID NO：11(VH5)或SEQ ID NO：12(VH6)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含SEQ ID NO：13(Vκ1)、SEQ ID NO：14(Vκ2)或SEQ ID NO：15(Vκ3)的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，其中HCVR和LCVR以任何组合存在。
6.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：16(Vκ2)(D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
7.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：22(Vκ1)(D I V M T Q S P D S L V V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K RTV A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
8.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：23(Vκ3)(D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
9.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：17(VH6)(Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
10.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：24(VH1)(Q A Q L V Q S G P E L K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K TH T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
11.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：25(VH2)(Q A Q L V Q S G P E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
12.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：26(VH3)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
13.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：27(VH4)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
14.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：28(VH5)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y YC A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。
15.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：12(VH6)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：14(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
16.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：11(VH5)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：14(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
17.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：17(VH6)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：16(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
18.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：28(VH5)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：16(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
19.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括人抗体框架(FR)和恒定区序列，并且其中从包含SEQ ID NO：18(D I V M S Q S P S S L V V S V G E K V T M S C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q S P K L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S V K A E D L A V Y Y C K Q Y Y S Y P L T F G A G T K L E LK)的轻链可变区氨基酸序列的鼠抗体的相应框架区序列取代轻链可变区中的一个或多个框架区氨基酸残基。
20.权利要求19的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架区氨基酸残基取代选自：
a)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置5的S至T取代；
b)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置9的S至D取代；
c)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置12的V至A取代；
d)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置15的V至L取代；
e)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置18的K至R取代；
f)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置19的V至A取代；
g)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置21的M至I取代；
h)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置22的S至N取代；
i)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置46的S至P取代；
j)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置49的S至A取代；
k)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置51的K至R取代；
l)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置84的V至L取代；
m)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置85的K至Q取代；
n)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置89的L至V取代；
o)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置106的A至Q取代；
p)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置112的L至I取代；和
q)其任意组合(SEQ ID NO：19)。
21.权利要求19的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸取代选自：
a)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置5的S至T取代；
b)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置9的S至D取代；
c)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置15的V至L取代；
d)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置18的K至R取代；
e)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置19的V至A取代；
f)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置21的M至I取代；
g)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置22的S至N取代；
h)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置49的S至A取代；
i)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置51的K至R取代；
j)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置84的V至L取代；
k)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置85的K至Q取代；
l)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置89的L至V取代；
m)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置106的A至Q取代；
n)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置112的L至I取代；和
o)其任何组合(SEQ ID NO：39)。
22.权利要求19的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸残基取代选自：
a)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置5的S至T取代；
b)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置9的S至D取代；
c)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置12的V至A取代；
d)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置15的V至L取代；
e)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置18的K至R取代；
f)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置19的V至A取代；
g)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置21的M至I取代；
h)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置22的S至N取代；
i)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置46的S至P取代；
j)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置49的S至A取代；
k)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置51的K至R取代；
l)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置69的T至S取代；
n)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置84的V至L取代；
o)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置85的K至Q取代；
p)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置89的L至V取代；
q)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置106的A至Q取代；
r)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置112的L至I取代；和
s)其任意组合(SEQ ID NO：40)。
23.权利要求19、20、21或22的抗体或其抗原结合片段，其中在SEQ ID NO：18的氨基酸99用苏氨酸取代轻链可变区的互补决定区(CDR)(S＞T取代)。
24.一种结合αvβ3整联蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含人抗体框架(FR)和恒定区序列，并且其中从包含SEQ ID NO：20(Q A Q L Q Q S G P E L V K P G A S V E I S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G K G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G K A T L T A D K S S S T A Y M Q L N S L T S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T L T V S S)的重链可变区氨基酸序列的鼠抗体的相应框架区序列取代重链可变区中的一个或多个框架区氨基酸残基。
25.权利要求24的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸残基取代选自：
a)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置2的A至V取代；
b)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；
c)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；
d)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；
e)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；
f)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；
g)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；
h)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；
i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；
j)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；
k)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；
l)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；
m)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；
n)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；
o)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
p)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
q)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；
r)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置95的F至Y取代；
s)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和
t)其任意组合(SEQ ID NO：21)。
26.权利要求24的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸残基取代选自：
a)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；
b)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；
c)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；
d)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；
e)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；
f)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；
g)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；
h)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；
i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；
j)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
k)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
l)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和
m)其任意组合(SEQ ID NO：41)。
27.权利要求24的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸残基取代选自：
a)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；
b)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；
c)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；
d)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；
e)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；
f)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；
g)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；
h)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；
i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；
j)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；
k)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
l)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
m)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；
n)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和
o)其任意组合(SEQ ID NO：42)。
28.权利要求24的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸残基取代选自：
a)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；
b)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；
c)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；
d)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；
e)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；
f)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；
g)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；
h)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；
i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；
j)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；
k)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；
l)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；
m)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
n)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
o)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；
p)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和
q)其任意组合(SEQ ID NO：43)。
29.权利要求24的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸残基选自：
a)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；
b)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；
c)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；
d)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；
e)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；
f)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；
g)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；
h)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；
i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；
j)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；
k)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；
l)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；
m)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；
n)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
o)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
p)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；
q)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和
r)其任意组合(SEQ ID NO：44)。
30.权利要求24的抗体或其抗原结合片段，其中一个或多个框架氨基酸取代选自：
a)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；
b)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；
c)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；
d)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；
e)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；
f)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；
g)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；
h)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；
i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；
j)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；
k)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；
l)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；
m)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；
n)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
o)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
p)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；
q)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置95的F至Y取代
r)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和
s)其任意组合(SEQ ID NO：45)。
31.权利要求1-30任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与至少一种治疗剂或诊断剂缀合。
32.权利要求31的抗体或其抗原结合片段，其中治疗剂选自细胞毒性剂、化疗药物、放射性核素、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂及其任意组合。
33.权利要求32的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性剂是药物或毒素。
34.一种治疗有需要的受试者中与异常IGF-1活性相关的失调的方法，包括将有效量的权利要求1-33任一项的抗体和/或其抗原结合片段施用于受试者，由此抑制受试者中的IGF-1活性并治疗所述失调，其中所述失调选自肾脏疾病、肾病、糖尿病性肾脏疾病、肾衰竭、动脉粥样硬化、冠状动脉病、外周血管病、糖尿病性溃疡、眼病、视网膜病、黄斑水肿、癌症、神经损伤、神经病、骨质疏松、致病性血管发生及其任意组合。
35.编码权利要求1-33任一项的氨基酸序列的分离的核酸分子。
36.包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列的分离的核酸分子。
37.包含SEQ ID NO：34的核苷酸序列的分离的核酸分子。
38.包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列的分离的核酸分子。
39.包含权利要求35、36、37或38任一项的核酸的分离或转化的细胞。
40.包含权利要求35、36、37或38任一项的核酸的载体。
41.包含权利要求40的载体的分离或转化的细胞。

说明书全文

用于增强或抑制胰岛素-样生长因子1(IGF-1)的单克隆抗

体

[0001] 优先权声明
[0002] 本申请依据35 U.S.C.§ 119(e)要求2012年8月31日提交的U.S.临时申请系列No.61/695,409的益处，将其完整内容按引用并入本文中。
[0003] 政府支持声明
[0004] 使用来自国家健康研究院的依据授予号HL084857-02的政府支持形成了本发明。美国政府对本发明具有一定的权利。
[0005] 关于序列表的电子提交的声明
[0006] 代替纸件复本，提供了ASCII文本格式的序列表，该序列表依据37 C.F.R.§1.821提交，名称为5470-628TS SUBSTITUTE_ST25.txt，80,724字节大小，2013年8月29日生成并通过EFS-Web提交。为了公开，在此将这一序列表按引用并入说明书中。
发明领域
[0007] 本发明描述了用于抑制胰岛素-样生长因子1(IGF-1)的作用的组合物和方法。
[0008] 发明背景
[0009] IGF-1是刺激所有类型细胞生长的小多肽激素。因为IGF-1具有光谱的作用并且刺激平衡的组织生长，因此涉及几种重要的人类癌症的发展并且还涉及动脉粥样硬化。IGF-1主要作用于这些组织中包含的依赖贴壁细胞。这些细胞还具有一类称为整联蛋白受体的受体，其负责它们与胞外基质分子的连接。为了细胞正常分化，应答胞外刺激，细胞必须感知其整联蛋白受体结合胞外基质分子。因此，整联蛋白受体的配体占领的操纵可以改变疾病发展中的重要过程，如细胞分化和迁移。
[0010] IGF-1刺激内皮细胞和平滑肌细胞分化。这些细胞利用αVβ3整联蛋白受体来传达至细胞核，它们适当地粘附于胞外基质，以便分化。一种特定的整联蛋白(αVβ3整联蛋白)的丰度在人类组织中受到相对限制，并且其主要在生长中的细胞中表达，并且特别是在涉及脉管系统维持的细胞中表达，如平滑肌细胞和内皮细胞。这种整联蛋白受体被其天然产生的配体(如，骨桥蛋白、玻连蛋白和血小板反应蛋白)的占领是这些细胞应答IGF-1所需的，具有提高的DNA合成和细胞迁移。用解联蛋白拮抗剂阻断这种整联蛋白的配体占领导致细胞生长和迁移的抑制。αVβ3与IGF-1受体之间的这种协同相互作用通过两种特定的信号传导分子的易位来调节。这些分子是1)称为SHP-2的蛋白酪氨酸磷酸酶和2)称为Shc的信号传导蛋白。在正常情况下，SHP-2位于细胞的细胞骨架和胞质区室中。αVβ3的配体占领后，β3整联蛋白的胞质结构域经历酪氨酸磷酸化。SHP-2通过与结合β3中的磷酸化酪氨酸残基的蛋白质的结合转移至细胞膜。为了将SHP-2定位至膜，需要这种转移，SHP-2在那征募其他重要的信号传导分子，如Shc。SHP-2与Shc的共同定位和/或IGF-1信号传导途径内信号传导分子的去磷酸化是其激活以及随后将信号从IGF-1受体传递至核所需的。可以通过抑制SHP-2或Shc转移至膜来抑制IGF-1激活需要的两种主要胞内信号传导途径(例如，PI-3激酶和MAP激酶途径)的激活。SHP-2和Shc的定位位点是称为SHPS-1的膜蛋白。SHPS-1应答IGF-1而被磷酸化。这种磷酸化是SHP-2和Shc转移所需的。转移至SHPS-1后，Shc被磷酸化。阻断αVβ3配体占领同时阻断SHP-2和Shc转移，因此抑制IGF-1刺激的细胞生长。
[0011] 尽管之前已经描述了用于抑制αVβ3整联蛋白的配体占领的方法，但它们全部利用抑制结合αVβ3异二聚体上的结合ECM配体内的精氨酸、甘氨酸和天冬酰胺(RGD)序列的特异结合位点的技术。αVβ3拮抗剂与这一位点的结合与药物毒性和副作用相关。因此，对于抑制IGF-1作用的新途径存在着需求，所述途径没有利用结合RGD序列的αVβ3结合位点。
[0012] 本发明通过提供在抑制IGF-1活性和治疗与其相关的失调中有效的人源化单克隆抗体克服了现有技术中之前的缺点。
[0013] 发明概述
[0014] 在一个方面中，本发明提供了结合αvβ3整联蛋白的分离抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1的轻链互补决定区(CDR)序列LCDR1(KSSQSLLYSSNQKNYLA)；SEQ ID NO：2的LCDR2(WASTRES)和SEQ ID NO：3的LCDR3(KQYYTYPLT)。
[0015] 在进一步的方面中，本发明提供了结合αvβ3整联蛋白的分离抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：4的重链互补决定区(CDR)序列HCDR1(NSWMN)；SEQ ID NO：5的HCDR2(IFPGDGDTNYNGKFKG)和SEQ ID NO：6的HCDR3(WGLTRDRRLYLDY)。
[0016] 在进一步的方面中，本发明提供了结合αvβ3整联蛋白的分离抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1的轻链互补决定区(CDR)序列LCDR1(KSSQSLLYSSNQKNYLA)；SEQ ID NO：2的LCDR2(WASTRES)和SEQ ID NO：3的LCDR3(KQYYTYPLT)以及SEQ ID NO：4的重链互补决定区(CDR)序列HCDR1(NSWMN)；SEQ ID NO：5的HCDR2(IFPGDGDTNYNGKFKG)和SEQ ID NO：6的HCDR3(WGLTRDRRLYLDY)。
[0017] 在进一步的方面中，本发明提供了结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区(HCVR)：a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HCVR(VH1；Q A Q L V Q S G P E L K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HCVR(VH2；Q A Q L V Q S G P E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；c)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HCVR(VH3；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；d)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HCVR(VH4；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；e)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HCVR(VH5；
Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；和f)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR(VH6；Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)。
[0018] 本文中还提供了结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的轻链可变区(LCVR)：a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的LCVR(Vκ1；D I V M T Q S P D S L V V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)；b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的LCVR(Vκ2：D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)；和c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的LCVR(Vκ3：D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)。
[0019] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：7(HV1)、SEQ ID NO：8(VH2)、SEQ ID NO：9(VH3)、SEQ ID NO：10(VH4)、SEQ ID NO：11(VH5)或SEQ ID NO：12(VH6)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含SEQ ID NO：13(Vκ1)、SEQ ID NO：14(Vκ2)或SEQ ID NO：
15(Vκ3)的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，其中HCVR和LCVR以任何组合存在。
[0020] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：16(Vκ2)(D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
[0021] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：22(Vκ1)(D I V M T Q S P D S L V V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
[0022] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：23(Vκ3)(D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
[0023] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：17(VH6)(Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0024] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：24(VH1)(Q A Q L V Q S G P E L K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0025] 本发明的其他方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：25(VH2)(Q A Q L V Q S G P E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0026] 本发明的另一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：26(VH3)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0027] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：27(VH4)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0028] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：28(VH5)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0029] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：12(VH6)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：14(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
[0030] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：11(VH5)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：14(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
[0031] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：17(VH6)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含SEQ ID NO：16(Vκ2)的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
[0032] 本发明的再一个方面是结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：28(VH5)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含SEQ ID NO：16(Vκ2)的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
[0033] 本发明还提供了结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括人抗体框架(FR)和恒定区序列，并且其中从包含SEQ ID NO：18(D I V M S Q S P S S L V V S V G E K V T M S C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q S P K L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S V K A E D L A V Y Y C K Q Y Y S Y P L T F G A G T K L E L K)；
Maile等，“A monoclonal antibody against αVβ3 integrin inhibits development of atherosclerotic lesions in diabetic pigs”Science Translational Medicine 2(18)：
18ra11(2010)以及在美国专利No.7,723,483；8,187,595；和8,206,706中)的轻链可变区氨基酸序列的鼠抗体的相应框架区序列取代轻链可变区中的一个或多个框架区氨基酸残基。在一些实施方案中，可以用苏氨酸在SEQ ID NO：18的氨基酸99取代本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区(CDR)(S＞T取代)。
[0034] 在一个方面中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置5的S至T取代；b)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置9的S至D取代；c)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置12的V至A取代；d)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置15的V至L取代；e)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置18的K至R取代；f)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置19的V至A取代；g)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置21的M至I取代；h)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置22的S至N取代；i)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置46的S至P取代；
j)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置49的S至A取代；k)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置51的K至R取代；l)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置84的V至L取代；m)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置85的K至Q取代；n)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置89的L至V取代；o)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置106的A至Q取代；p)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置112的L至I取代；和q)其任意组合(SEQ ID NO:19)。在这一段落的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，在SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸99处可以用苏氨酸取代轻链可变区的互补决定区(CDR)(S>T取代)。
[0035] 本文中还提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置5的S至T取代；b)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置9的S至D取代；c)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置15的V至L取代；d)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置18的K至R取代；e)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置19的V至A取代；f)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置21的M至I取代；g)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置22的S至N取代；h)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置49的S至A取代；i)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置51的K至R取代；j)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置84的V至L取代；k)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置85的K至Q取代；l)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置89的L至V取代；m)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置106的A至Q取代；n)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置112的L至I取代；和o)其任何组合(SEQ ID NO：39)。在这一段落的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，可以用苏氨酸在SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：39的氨基酸99处取代轻链可变区的互补决定区(CDR)(S＞T取代)。
[0036] 本文中进一步提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置5的S至T取代；b)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置9的S至D取代；c)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置12的V至A取代；d)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置15的V至L取代；e)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置18的K至R取代；f)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置19的V至A取代；g)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置21的M至I取代；h)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置22的S至N取代；i)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置46的S至P取代；j)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置49的S至A取代；k)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置51的K至R取代；l)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置69的T至S取代；m)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置84的V至L取代；n)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置85的K至Q取代；o)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置89的L至V取代；p)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置106的A至Q取代；q)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置112的L至I取代；和r)其任意组合(SEQ ID NO：40)。在这一段落的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，可以用苏氨酸在SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：40的氨基酸99处取代轻链可变区的互补决定区(CDR)(S＞T取代)。
[0037] 本发明进一步提供了结合αvβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人抗体框架(FR)和恒定区序列，并且从包含SEQ ID NO：20(Q A Q L Q Q S G P E L V K P G A S V E I S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G K G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G K A T L T A D K S S S T A Y M Q L N S L T S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T L T V S S)；Maile等，“A monoclonal antibody against αVβ3 integrin inhibits development of atherosclerotic lesions in diabetic pigs”Science Translational Medicine 2(18):18ra11(2011))和在美国专利No.7,723,483；8,187,595；和8,206,706中)的重链可变区氨基酸序列的鼠抗体的相应框架区序列取代重链可变区中的一个或多个框架区氨基酸残基。
[0038] 本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置2的A至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；o)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；p)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；q)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；r)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置95的F至Y取代；s)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和t)其任意组合(SEQ ID NO:21)。
[0039] 本发明进一步提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和m)其任意组合(SEQ ID NO:41)。
[0040] 另外，本文中提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和o)其任意组合(SEQ ID NO:42)。
[0041] 另外，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
o)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；p)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和q)其任意组合(SEQ ID NO:43)。
[0042] 本发明的再一个方面是分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
o)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；p)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；q)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和r)其任意组合(SEQ ID NO:44)。
[0043] 本发明的其他方面是分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
o)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；p)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；q)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和r)其任意组合(SEQ ID NO:45)。
[0044] 在本发明的各个方面中，抗体或其抗原结合片段可以是裸抗体或其抗原结合片段。
[0045] 在本发明的一些方面中，抗体或其抗原结合片段可以结合至少一种治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是但不限于，细胞毒性剂、化疗药物、放射性核素、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂及其任意组合。在一些实施方案中，细胞毒性剂可以是药物或毒素。
[0046] 本发明还提供了一种治疗受试者(例如，需要的受试者)中与异常IGF-1活性相关的失调的方法，包括将有效量的本发明的抗体和/或其抗原结合片段施用于受试者，由此抑制受试者中的IGF-1活性并治疗所述失调，其中所述失调可以是，但不限于，肾脏疾病、肾病(例如，糖尿病性肾病)、糖尿病性肾脏疾病、肾衰竭、动脉粥样硬化、冠状动脉病、外周血管病、糖尿病性溃疡、眼病、视网膜病变(例如，糖尿病性视网膜病变)、黄斑水肿(例如，糖尿病性黄斑水肿)、癌症、神经损伤(例如，糖尿病患者中的神经损伤)、神经病(例如，糖尿病性神经病)、骨质疏松、致病性血管发生及其任意组合。本发明进一步提供了一种预防或最小化糖尿病患者中截肢需求的方法，包括将有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段施用于患者。
[0047] 本发明的再一个方面是本文中所述的分离抗体或其抗原结合片段在用于制造用于进行本文中所述治疗方法的药物中的用途。
[0048] 附图简述
[0049] 图1A-C。使用NS0-衍生的Composite Human AntibidiesTM的RD细胞结合试验。通过流式细胞术测试了纯化的人源化抗体与RD细胞的结合。将不同浓度的每种人源化抗体与表达αVβ3整联蛋白的RD细胞混合，并使用人IgG重链特异的PE标记的抗体检测人抗体的结合。
[0050] 图2A-C显示了添加递增抗体浓度后产生的β3整联蛋白酪氨酸磷酸化(A)、AKT丝氨酸473磷酸化(B)和MAP激酶(ERK)丝氨酸磷酸化(C)的百分比降低。在从5ng/ml至1000ng/ml范围的浓度测试了VP12690B抗体并且与VH5/Vκ2抗体比较。效应峰在
20-50ng/ml的浓度范围。
[0051] 图3A-D显示了对于每种施用的剂量抗体，峰值血液浓度的剂量依赖性提高。在每个剂量组中，将三个剂量施用于五个动物。皮下施用抗体。这些剂量包括0.3mg/kg、1.0mg/kg和5.0mg/kg。
[0052] 图4.尸检时治疗组第二次注射后7天血清中测量的VPI-2690B的平均(±SEM)水平。
[0053] 图5.治疗组的肾溶解产物中的平均(±SEM)β3磷酸化(呈现为对照百分比)。
[0054] 图6.VPI-2690B的PK/PD关联。
[0055] 图7.尸检时治疗组的个体研究动物中的蛋白尿。
[0056] 图8.VPI-2690B结合表达人β3的CHO-K1细胞(CHO-Hub3)。图显示了C-环抗原肽(+肽)存在下VPI-2690B(-肽)的总结合和计算的特异结合[(结合-肽)-(结合+肽)]。
[0057] 图9.VPI-2690B结合表达人β3的CHO-K1细胞(CHO-Hub3)。图显示了计算的特异结合[(结合-肽)-(结合+肽)]。
[0058] 图10.VPI-2690B结合高葡萄糖条件下培养的人脐静脉内皮细胞。图显示了C-环抗原肽(+肽)存在下VPI-2690B(-肽)的总结合和计算的特异结合[(结合-肽)-(结合+肽)]。
[0059] 图11.VPI-2690B结合高葡萄糖条件下培养的人脐静脉内皮细胞。图显示了计算的特异结合[(结合-肽)-(结合+肽)]。
[0060] 图12.在高葡萄糖条件下人脐静脉内皮细胞中β3磷酸化的VPI-2690B剂量应答。图显示了用VPI-2690B处理后，与对照(无处理)相比，β3磷酸的百分比降低。
[0061] 图13.通过VH5VK2和VPI-2690B的IGF-1-刺激的AKT、ERK的磷酸化和基础β3磷酸化的抑制。
[0062] 发明详述
[0063] 以下更详细地解释本发明。这一描述不打算是其中可以实施本发明的所有不同方式的详细目录，或可以添加至本发明的所有特征。例如，关于一个实施方案说明的特征可以结合其他实施方案，并且关于特定实施方案说明的特征可以从该实施方案删除。此外，本文中表明的各种实施方案的各种改变和增加将是本领域技术人员根据本发明公开内容显而易见的，因此，以下的说明书打算用来说明本发明的一些特定实施方案，并不是详尽地指定其所有排列、组合和变化。
[0064] 除非文中另外指出，特意表示本文中所述的本发明的各个特征可以以任意组合使用。此外，本发明还考虑在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文中列出的任一个特征或特征组合。
[0065] 本发明是基于抑制IGF-1作用的人源化单克隆抗体的发现，用作例如治疗剂、成像剂和/或诊断剂和/或作为将治疗剂传送至靶标细胞的试剂。
[0066] 通常，本发明包括通过可替换的结合位点特异性抑制αVβ3整联蛋白的配体占有的技术，所述可替换的结合位点没有导致可以导致药物毒性的特定胞内信号传导事件的激活(例如，通过不结合RGD结构域)。施用抑制玻连蛋白与这一可替换的αVβ3结合位点的结合的拮抗剂已经显示出能阻断IGF-1刺激的PI-3激酶、MAP激酶、DNA合成和细胞迁移的激活。所有这些事件对IGF-1刺激动脉粥样硬化损伤内的平滑肌细胞生长是重要的。相似地，肠平滑肌细胞表达这种整联蛋白，因此抑制这种细胞类型中的IGF-1作用在炎性肠病的治疗中是有用的。这种技术对于抑制配体结合在内皮细胞的表面上表达的αVβ3上的这一位点是有用，因此抑制配体结合的拮抗剂将很可能抑制IGF-1信号传导并且因此可以有效治疗糖尿病性视网膜病并且用于与肿瘤形成相关的血管发生。本发明涉及研发抑制结合并且可以作为结合αVβ3整联蛋白上的这一结合位点的胞外基质(ECM)配体结合的竞争性拮抗剂的化合物。
[0067] 本发明帮助解决了这一领域中已经阻碍进展的药物研发中的主要问题。第一个问题涉及IGF-1受体。尽管已经研发了抑制配体结合IGF-1受体的单克隆抗体，但受体上结合位点的分子半径大，因此由于完全抑制结合需要的分子大小，使得配体结合IGF-1受体的抑制在药物研发中是个难题。相反，本发明抑制结合αVβ3整联蛋白上非常小的结合位点。整联蛋白自身上的实际结合位点被8个氨基酸包围，并且因此结合位点的分子半径实质性地小于IGF-1受体的配体结合位点并且与大分子拮抗剂相比，是允许更容易地研发小分子量拮抗剂的大小。拮抗IGF-1受体的第二个问题是其普遍存在于所有细胞上。因此，如果构想一种策略来抑制IGF-1受体活性并且将其与刺激细胞凋亡的治疗(例如，癌症化疗或抗血管发生药)结合使用，抑制正常细胞中的IGF-1作用也与正常细胞类型(如，GI上皮细胞、骨髓前体细胞和神经元)的大量凋亡相关。因此，很大程度上增强了共同施用的药剂的毒性。相似地，即使没有共同施用的药剂，施用IGF-1受体拮抗剂也很可能导致正常细胞类型中的蛋白质合成的抑制和可能的凋亡。相反，本发明的抗体选择性地靶向αVβ3整联蛋白。因为信号与IGF-1受体协同的αVβ3整联蛋白存在于脉管内皮细胞和平滑肌细胞上并且通常仅在增殖中的细胞中高浓度表达，因此通过特异性地靶向这些细胞类型，本发明的抗体的选择性是非常高的。没有表达大量αVβ3整联蛋白的细胞类型，如GI上皮细胞和骨髓前体细胞，将很可能不受毒性影响。因此，本发明解决了能够研发抑制IGF-1作用并用作治疗剂的大分子(例如，抗体)的问题。其次，本发明解决了任何抗-IGF-1受体拮抗剂明显的产生毒性的问题。第三，本发明解决了抑制IGF-1受体酪氨酸激酶的问题，IGF-1受体酪氨酸激酶也可以抑制胰岛素受体酪氨酸激酶并导致糖尿病的发生。此外，本发明在这一领域超越了之前的技术并且通过提供抑制配体结合αVβ3整联蛋白的人源化单克隆抗体提供了优于这些技术的优势，其中所述单克隆抗体与非人源化单克隆抗体相比，在受试者中具有降低的免疫原性，但具有相同或相似的结合特异性。
[0068] 在一个方面中，本发明提供了结合αVβ3整联蛋白的分离抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的轻链互补决定区(CDR)序列LCDR1(KSSQSLLYSSNQKNYLA)；SEQ ID NO:2的LCDR2(WASTRES)；和SEQ ID NO:3的LCDR3(KQYYTYPLT)。
[0069] 在进一步的方面中，本发明提供了结合αVβ3整联蛋白的分离抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4的重链互补决定区(CDR)序列HCDR1(NSWMN)；SEQ ID NO:5的HCDR2(IFPGDGDTNYNGKFKG)和SEQ ID NO:6的HCDR3(WGLTRDRRLYLDY)。
[0070] 在进一步的方面中，本发明提供了结合αVβ3整联蛋白的分离抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的轻链互补决定区(CDR)序列LCDR1(KSSQSLLYSSNQKNYLA)；SEQ ID NO：2的LCDR2(WASTRES)；和SEQ ID NO：3的LCDR3(KQYYTYPLT)以及SEQ ID NO：4的重链互补决定区(CDR)序列HCDR1(NSWMN)；SEQ ID NO：5的HCDR2(IFPGDGDTNYNGKFKG)和SEQ ID NO：6的HCDR3(WGLTRDRRLYLDY)。
[0071] 在进一步的方面中，本发明提供了结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区(HCVR)：a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HCVR(VH1；Q A Q L V Q S G P E L K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HCVR(VH2；
Q A Q L V Q S G P E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)VH2；c)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HCVR(VH3；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；d)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HCVR(VH4；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)；e)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HCVR(VH5；Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)和f)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR(VH6；Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S)。
[0072] 本文中还提供了结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自以下的轻链可变区(LCVR)：a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的LCVR(Vκ1；D I V M T Q S P D S L V V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)；b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的LCVR(Vκ2：D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)；和c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的LCVR(Vκ3；D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K)。
[0073] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：7(HV1)、SEQ ID NO：8(VH2)、SEQ ID NO：9(VH3)、SEQ ID NO：10(VH4)、SEQ ID NO：11(VH5)或SEQ ID NO：12(VH6)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)以及包含SEQ ID NO：13(Vκ1)、SEQ ID NO：14(Vκ2)或SEQ ID NO：
15(Vκ3)的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，其中HCVR和LCVR以任意组合存在。
[0074] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：16(Vκ2)(D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
[0075] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：22(Vκ1)(D I V M T Q S P D S L V V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
[0076] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：23(Vκ3)(D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)的氨基酸序列的轻链。
[0077] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：17(VH6)(Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P VTV S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0078] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：24(VH1)(Q A Q L V Q S G P E L K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N GKE Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0079] 本发明的另一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：25(VH2)(Q A Q L V Q S G P E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0080] 本发明的另一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：26(VH3)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R A T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0081] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：27(VH4)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0082] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：28(VH5)(Q A Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y YC A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)的氨基酸序列的重链。
[0083] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：12(VH6)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：14(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
[0084] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：11(VH5)的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：14(Vκ2)的氨基酸序列的轻链。
[0085] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：17(VH6)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含SEQ ID NO：16(Vκ2)的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
[0086] 本发明的再一个方面是结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO：28(VH5)的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含SEQ ID NO：16(Vκ2)的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
[0087] 本发明还提供了结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括人抗体框架(FR)和恒定区序列，并且其中从包含SEQ ID NO：18(D I V M S Q S P S S LV V S V G E K V T M S C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K S G Q S P K L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S V K A E D L A V Y Y C K Q Y Y S Y P L T F G A G T K L E L K)；Maile等，“A monoclonal antibody against αVβ3integrin inhibits development of atherosclerotic lesions in diabetic pigs”Science Translational Medicine 2(18)：18ra11(2010)以及在美国专利No.7,723,483；8,187,595；和8,206,706中)的轻链可变区氨基酸序列的鼠抗体的相应框架区序列取代轻链可变区中的一个或多个框架区氨基酸残基。在一些实施方案中，可以用苏氨酸在SEQ ID NO：18的氨基酸99取代抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区(CDR)(S＞T取代)。
[0088] 在一个方面中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个)选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置5的S至T的取代；b)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置9的S至D的取代；c)SEQ ID NO：18的氨基酸序列中位置12的V至A的取代；d)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置15的V至L的取代；e)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置18的K至R的取代；f)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置19的V至A的取代；g)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置21的M至I的取代；h)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置22的S至N的取代；i)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置46的S至P的取代；j)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置49的S至A的取代；k)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置51的K至R的取代；l)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置84的V至L的取代；m)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置85的K至Q的取代；n)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置89的L至V的取代；o)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置106的A至Q的取代；p)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置112的L至I的取代；和q)其任意组合(SEQ ID NO:19)。在这一段落的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，可以用苏氨酸在SEQ ID NO:18的氨基酸99处取代轻链可变区的互补决定区(CDR)(S>T取代)。
[0089] 本文中还提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置5的S至T的取代；b)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置9的S至D的取代；c)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置15的V至L的取代；d)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置18的K至R的取代；e)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置19的V至A的取代；f)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置21的M至I的取代；g)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置22的S至N的取代；h)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置49的S至A的取代；
i)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置51的K至R的取代；j)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置84的V至L的取代；k)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置85的K至Q的取代；l)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置89的L至V的取代；m)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置106的A至Q的取代；n)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置112的L至I的取代；和o)其任意组合(SEQ ID NO:39)。在这一段落的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，可以用苏氨酸在SEQ ID NO:18的氨基酸99处取代轻链可变区的互补决定区(CDR)(S>T取代)。
[0090] 本文中进一步提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个)选自以下的框架氨基酸残基取代：
a)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置5的S至T的取代；b)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置9的S至D的取代；c)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置12的V至A的取代；d)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置15的V至L的取代；e)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置18的K至R的取代；f)SEQID NO:18的氨基酸序列中位置19的V至A的取代；g)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置21的M至I的取代；h)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置
22的S至N的取代；i)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置46的S至P的取代；j)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置49的S至A的取代；k)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置51的K至R的取代；l)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置69的T至S的取代；m)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置84的V至L的取代；n)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置85的K至Q的取代；o)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置89的L至V的取代；p)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置106的A至Q的取代；q)SEQ ID NO:18的氨基酸序列中位置112的L至I的取代；和r)其任意组合(SEQ ID NO:40)。在这一段落的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，可以用苏氨酸在SEQ ID NO:18的氨基酸99处取代轻链可变区的互补决定区(CDR)(S>T取代)。
[0091] 本发明进一步提供了结合αVβ3整联蛋白的分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包括人抗体框架(FR)和恒定区序列，并且其中从包含SEQ ID NO：20(Q A Q L Q Q S G P E L V K P G A S V E I S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R P G K G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G K A T L T A D K S S S T A Y M Q L N S L T S E D S A V Y F C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T L T V S S；Maile等，“A monoclonal antibody against αVβ3 integrin inhibits development of atherosclerotic lesions in diabetic pigsxScience Translational Medicine 2(18)：18ra11(2010)以及在美国专利No.7,723,483；8,187,595；和8,206,706中)的重链可变区氨基酸序列的鼠抗体的相应框架区序列取代重链可变区中的一个或多个框架区氨基酸残基。
[0092] 本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个)选自以下的框架氨基酸残基取代：
a)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置2的A至V取代；b)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；c)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；d)SEQ ID NO：
20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；e)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；f)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；g)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；h)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；
i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；j)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；k)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；l)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；m)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；n)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；o)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；p)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；
q)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；r)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置95的F至Y取代；s)SEQ ID NO：20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和t)其任意组合(SEQ ID NO：21)。
[0093] 本发明进一步提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个)选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和m)其任意组合(SEQ ID NO:41)。
[0094] 另外，本文中提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；
f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和o)其任意组合(SEQ ID NO:42)。
[0095] 本发明另外提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个)选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；e)SEQID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；
f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；
n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；o)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；p)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和q)其任意组合(SEQ ID NO:43)。
[0096] 本发明的再一个方面是分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个)选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；o)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；p)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；q)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和r)其任意组合(SEQ ID NO:44)。
[0097] 本发明的另一个方面是分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个)选自以下的框架氨基酸残基取代：a)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置5的Q至V取代；b)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置9的P至A取代；c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置11的L至V取代；d)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置12的V至K取代；e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置19的E至K取代；f)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置20的I至V取代；g)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置41的P至R取代；h)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置43的K至A取代；i)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置67的K至R取代；j)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置68的A至V取代；k)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置70的L至I取代；l)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置76的S至T取代；m)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置82的Q至E取代；n)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置84的N至S取代；o)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置87的T至R取代；p)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置91的S至T取代；q)SEQ ID NO:20的氨基酸序列中位置118的L至V取代；和r)其任意组合(SEQ ID NO:45)。
[0098] 本文中进一步提供了编码本发明的氨基酸序列的核酸分子。这样的核酸分子可以存在于载体或质粒中。这样的核酸分子、载体或质粒可以存在于细胞中(例如，分离的细胞、转化的细胞、宿主细胞)。本发明的核酸分子的非限制性实例包括核酸分子，其包括以下的核苷酸序列、基本上由以下的核苷酸序列组成或由以下的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：30的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：7的氨基酸序列；VH1)；SEQ ID NO：31的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列；VH2)；SEQ ID NO：32的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：9的氨基酸序列；VH3)；SEQ ID NO：33的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：10的氨基酸序列；VH4)；SEQ ID NO：34的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：11的氨基酸序列；VH5)；SEQ ID NO：35的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列；VH6)；SEQ ID NO：36的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列；Vκ1)；SEQ ID NO：37的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：14的氨基酸序列；Vκ2)；SEQ ID NO：38的核苷酸序列(编码SEQ ID NO：15的氨基酸序列；Vκ3)；SEQ ID NO：46的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：47的氨基酸序列，其是Vκ2轻链可变区和恒定区，并包括氨基酸1-20的信号序列；然而，在活性分子中剪切掉这一信号序列(M E T H S Q V F V Y M L L W L S G V E G D I V M T Q S P D S L A V S L G E R A T I N C K S S Q S L L Y S S N Q K N Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y W A S T R E S G V P D R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q A E D V A V Y Y C K Q Y Y T Y P L T F G Q G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C)；和SEQ ID NO：48的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：49的氨基酸序列，其是VH6重链可变区和恒定区，并且包括氨基酸1-19的信号序列；然而，在活性分子中剪切掉这一信号序列(M A W V W T L L F L M A A A Q S I Q A Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y L F S N S W M N W V K Q R R G A G L E W I G R I F P G D G D T N Y N G K F K G R V T I T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R W G L T R D R R L Y L D Y W G Q G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K)。
[0099] 在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：35(VH6)的核苷酸序列的分离核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：37(Vκ2)的核苷酸序列的分离核酸分子。这些核酸分子可以一起存在于组合物中，并且在一些实施方案中，可以存在于相同的核酸构建体上。
[0100] 在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：34(VH5)的核苷酸序列的分离核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：37(Vκ2)的核苷酸序列的分离核酸分子。这些核酸分子可以一起存在于组合物中，并且在一些实施方案中，可以存在于相同的核酸构建体上。
[0101] 在本发明的一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是裸抗体或其裸抗原结合片段。如本文中所用的，“裸”表示抗体或其抗原结合片段没有有效地连接、缀合或结合另一个部分或试剂。
[0102] 在本发明的一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段缀合或有效地连接或结合至少一种治疗剂和/或诊断剂。
[0103] 本发明的治疗剂的非限制性实例包括细胞毒性剂(例如，药物或毒素)、化疗药物、放射性核素、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂及其任意组合。
[0104] 本发明进一步提供了一种包含本发明的分离抗体或其抗原结合片段和可药用载体的组合物。
[0105] 本发明的单克隆抗体或其片段和本发明的组合物可以用于各种方法中。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的受试者中的疾病或失调(例如，与异常或反常的IGF-1活性相关的疾病或失调或响应IGF-1活性抑制的失调)的方法，其包括将有效量的本发明的分离抗体或其抗原结合片段施用于受试者，由此抑制受试者中的IGF-1活性和治疗疾病或失调。
[0106] 根据本发明的方法可以治疗的疾病或失调的非限制性实例包括肾脏疾病、肾病(例如，糖尿病性肾病)、糖尿病性肾脏疾病、肾衰竭、动脉粥样硬化、冠状动脉病、外周血管病、糖尿病性溃疡、眼病、视网膜病(例如，糖尿病性视网膜病)、黄斑水肿(例如，糖尿病性黄斑水肿)、癌症、神经损伤(例如，糖尿病患者中的神经损伤)、神经病(例如，糖尿病性神经病)、骨质疏松、致病性血管发生及其任意组合。本发明进一步提供了一种预防或最小化糖尿病患者中截肢需求的方法，包括将有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段施用于受试者。
[0107] 根据本发明的方法可以治疗的癌症的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系统瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非-霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、腺癌、乳癌、胰腺癌、结肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑素瘤、鳞状细胞癌、基细胞癌、脑癌、血管肉瘤(angiosarcoma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠癌和任何现在已知的或之后鉴别的其他癌症(参见，例如，Rosenberg(1996)Ann.Rev.Med.47:481-491，将其完整内容按引用并入本文中)。
[0108] 定义
[0109] 已经指定序列识别号的本发明的氨基酸序列列于表4中。
[0110] 如本文中使用的，“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”可以表示一个或超过一个，取决于其中使用该词的内容。例如，“一个(a)”细胞可以表示一个细胞或多个细胞。
[0111] 还如本文中使用的，“和/或”是指并且包括一个或多个相关所列项目的任何以及全部可能的组合，以及在进行选择性(“或”)解释时，缺少组合。
[0112] 此外，如本文中所用的术语“约”，涉及测量值时，如本发明的化合物或试剂的量、剂量、时间、温度等，表示包括特定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％，乃至±0.1％的变化。
[0113] 如本文中使用的，过渡短语“基本上由……组成”表示权利要求的范围解释为包括权利要求中所述的特定材料或步骤“和实质上没有影响所要求的发明的基础和新的特征的那些。参见，In re Herz，537F.2d 549，551-52，190 USPQ 461，463(CCPA 1976)(原文中的重点)；还可以参见MPEP§2111.03。因此，用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”不能解释为等于“包含”。
[0114] 还如本文中使用的，“一个或多个”表示一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。
[0115] 可以通过本发明治疗的受试者包括用于医学目的的人类受试者和用于兽医目的以及药物筛选和研发目的的动物受试者。通常，其他合适的动物受试者是哺乳动物受试者，如灵长类、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、犬、兔类动物、啮齿动物(例如，大鼠和小鼠)等。人类受试者是最优选的。人类受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。
[0116] 如本文中使用的氨基酸是指在α碳上具有游离羧基基团和游离的未取代氨基基团的化合物，其可以通过肽键连接形成本文中所述的肽活性剂。氨基酸可以是标准或非标准的、天然或合成的，实例(及其缩写)包括但不限于：
[0117] Asp＝D＝天冬氨酸
[0118] Ala＝A＝丙氨酸
[0119] Arg＝R＝精氨酸
[0120] Asn＝N＝天冬酰胺
[0121] Cys＝C＝半胱氨酸
[0122] Gly＝G＝甘氨酸
[0123] Glu＝E＝谷氨酸
[0124] Gln＝Q＝谷氨酰胺
[0125] His＝H＝组氨酸
[0126] Ile＝I＝异亮氨酸
[0127] Leu＝L＝亮氨酸
[0128] Lys＝K＝赖氨酸
[0129] Met＝M＝甲硫氨酸
[0130] Phe＝F＝苯丙氨酸
[0131] Pro＝P＝脯氨酸
[0132] Ser＝S＝丝氨酸
[0133] Thr＝T＝苏氨酸
[0134] Trp＝W＝色氨酸
[0135] Tyr＝Y＝酪氨酸
[0136] Val＝V＝缬氨酸
[0137] Orn＝鸟氨酸
[0138] Nal＝2-萘丙氨酸(napthylalanine)
[0139] Nva＝正缬氨酸
[0140] Nle＝正亮氨酸
[0141] Thi＝2-噻吩丙氨酸
[0142] Pcp＝4-氯苯丙氨酸
[0143] Bth＝3-苯并噻吩丙氨酸
[0144] Bip＝4,4’-二苯丙氨酸
[0145] Tic＝四氢异喹啉-3-羧酸
[0146] Aib＝氨基异丁酸
[0147] Anb＝α-氨基正丁酸(aminonormalbutyric acid)
[0148] Dip＝2,2-二苯丙氨酸
[0149] Thz＝4-噻唑丙氨酸
[0150] 根据常规来书写本文中提及的所有肽序列，由此N-端氨基酸在左边，而C-端氨基酸在右边。两个氨基酸残基之间的短线(或没有线)表示肽键。
[0151] “碱性氨基酸”是指在6.0的pH下带正电荷的任何氨基酸，包括但不限于R、K和H。
[0152] “芳香氨基酸”是指在结合α碳的侧链中具有芳香基团的任何氨基酸，包括但不限于F、Y、W和H。
[0153] “疏水性氨基酸”是指具有结合α碳的疏水性侧链的任何氨基酸，包括但不限于I、L、V、M、F、W和C，最优选I、L和V。
[0154] “中性氨基酸”是指不带电荷的氨基酸，如M、F、W、C和A。
[0155] 如本文中使用的“αVβ3整联蛋白半胱氨酸环结构域”是指之前没有鉴别为将导致受体激活的区域的αVβ3整联蛋白受体(特别是哺乳动物受体，例如，待治疗受试者中内源性地发现的那些)上的特定区域，并且该区域特别排除RGD结合区域。结合该区域的激动剂包括含有通常称为肝素结合结构域的序列区域的那些。通常，αVβ3的半胱氨酸环结构域或区域发生在β3亚基内的位置177-184的氨基酸CYDMKTTC(SEQ ID NO:29)处。参见，例如，Vogel等，“A novel integrin specificity exemplified by binding of the alpha v beta 5integrin to the basic domain of the HIV Tat protein and vitronectin”J.Cell Biol.121:461-8(1993)。
[0156] 本文中使用的“IGF-1”表示胰岛素-样生长因子1。
[0157] 本文中使用的“治疗”是指给予患有疾病或失调或处于患有或产生疾病或失调风险中的受试者益处的任何类型的治疗，包括，例如，受试者病症的改善(例如，一个或多个症状的改善)和/或症状进展的减缓等。
[0158] 本文中使用的“预防”包括受试者的预防性治疗，以防止失调的发作或进展，例如，通过与所述失调相关的症状呈现的不存在或延迟来确定。如本文中使用的，“预防(prevent)”、“预防中(preventing)”或“预防(prevention)”不必然用来表示症状的完全消除。
[0159] 本文中使用的“治疗有效量”、“有效量”、“有效治疗量”等表示本发明的抗体或其片段的量，其足以对患有其中IGF-1诱导异常细胞生长的癌症、肿瘤、动脉粥样硬化、视网膜病、糖尿病性肾病或任何其他不希望有的医学病症的患者产生所需效果。这包括患者病症的改善(例如，一个或多个症状的改善)和/或疾病进展的延迟等。
[0160] 本文中使用的“可药用”表示化合物或组合物适合用于施用于受试者，以实现本文中所述的治疗，根据疾病的严重程度和治疗的需要没有不当的有害副作用。
[0161] 本文中使用的“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。术语“免疫球蛋白”包括这些免疫球蛋白的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。抗体可以是任何物种来源，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马或人，或可以是嵌合的或人源化抗体。本文中使用的术语“抗体”包括保留结合靶标抗原能力的抗体片段，例如，Fab、F(ab’)2和Fv片段，以及获自IgG以外的其他抗体的相应片段。这样的片段也是通过已知技术产生的。在一些实施方案中，抗体可以根据已知技术结合或缀合可检测基团或治疗基团。
[0162] 此外，本文中使用的术语“抗体”打算用来表示包含四条多肽链的免疫球蛋白分子，所述四条多肽链为通过二硫键链间-连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分成超变区，称为互补决定区(CDR)，散布在更保守的称为框架区(FR)的区域中。在本发明的抗体或其抗原结合片段的各个实施方案中，FR与人种系序列相同，或可以是天然或人工修饰的。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0163] 通常，本发明的抗体或其抗原结合片段具有非常高的亲和性，通过结合细胞表面-8 -12 -8上存在的抗原测量时，通常具有约10 至约10 M或更高的KD值，例如，至少10 M，至少-9 -10 -11 -12
10 M，至少10 M，至少10 M或至少10 M。
[0164] 本发明的抗体及其抗原结合片段具有非常高的亲和性，通过结合细胞表面上存在-8 -12 -8 -9的抗原测量时，通常具有约10 至约10 M或更高的EC50值，例如，至少10 M，至少10 M，至-10 -11 -12
少10 M，至少10 M或至少10 M。
[0165] 如本文中使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简单地“抗体部分”或“抗体片段”)是指保留了特异性结合抗原能力的抗体的一个或多个片段、部分或结构域。已经显示出全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫化物桥连接的两个F(ab)’片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 241:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，通过分开的基因编码，但可以通过能够使它们作为单个连续链形成的合成的接头，使用重组方法，使它们连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等，(1988)Science242:423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也打算包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包括其他形式的单链抗体，如双抗(参见，例如，Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。
[0166] 术语“表位”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有超过一个的表位。表位可以是构象的或线性的。通过将来自一个(或多个)线性多肽链的不同区段的氨基酸在空间上靠近来产生构象表位。线性表位是通过多肽链中的邻接氨基酸残基产生的表位。在特定的实施方案中，表位可以包括其他部分，如抗原上的糖类、磷酰基基团或磺酰基基团。
[0167] 如应用于多肽的，术语“实质性的相似性”或“基本上相似”表示两个肽序列，最佳比对时，如通过程序GAP或BESTFIT，使用缺省缺口权重比对时，共享至少95％序列同一性，甚至更优选至少98％或99％序列同一性。优选，不同的残基位置是保守性氨基酸取代的不同。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基由另一个含有具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的取代。通常，保守性氨基酸取代将基本上不会改变蛋白质的功能特性。在其中两个或多个氨基酸序列彼此不同的是保守性取代的情况中，可以向上调节相似性的百分比或程度，以校正取代的保守性质。用于进行这种调节的方式是本领域技术人员公知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，按引用并入本文中。具有相似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性取代是Gonnet等(1992)Science 256：1443-45中公开的在PAM250对数-似然矩阵中具有正值的任何变化，在此通过引用并入本文。“适度保守”取代是在PAM250对数-似然矩阵中具有非负值的任何变化。
[0168] 通常使用序列分析软件测量多肽的序列相似性。使用分配给各种取代、删除和其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性测量，蛋白质分析软件匹配相似的序列。例如，GCG软件含有如GAP和BESTFIT这样的程序，其可以与缺省参数一起使用，来测定密切相关的多肽(如，来自不同生物体物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变型蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG版本6.1。还可以使用FASTA比较多肽序列，使用缺省或推荐参数；GCG版本6.1.FASTA中的程序(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(2000)上文)。将本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用缺省参数。参见，例如，Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids.Res.25：3389-402，将每一篇的全部内容按引用并入本文中。
[0169] “治疗性基团”意思是任何合适的治疗性基团，包括但不限于放射性核素、化疗剂和细胞毒性剂。
[0170] 本文中所述的“放射性核素”可以是适用于将治疗剂量的放射传送至肿瘤或癌细227 211 131 77 109 51 67 165 155 153
胞的任何放射性核素，包括但不限于 Ac，At， Ba，Br，Cd，Cr，Cu， Dy，Eu， Gd，
198 166 113m 115m 123 125 131 189 191 192 194 52 55 59 177 109 32
Au， Ho， In， In， I， I， I， Ir， Ir， Ir，Ir，Fe，Fe，Fe， Lu， Pd，P，
226 186 188 153 46 47 72 75 105 89 35 177 117 121 166 169 90
Ra， Re， Re， Sm，Sc，Sc，Se，Se， Ag，Sr，S， Ta， mSn，Sn， Yb， Yb，Y，
212 119 197 97 100 101m 212
Bi， Sb，Hg，Ru， Pd， Rh，和 Pb。
[0171] 本文中使用的“细胞毒性剂”包括但不限于蓖麻毒素(或更特别地蓖麻毒素A链)、阿克拉霉素、白喉毒素。莫能菌素、疣孢菌素A、相思豆毒素、长春花属生物碱、单端孢霉烯族毒素(Tricothecenes)和假单胞菌外毒素A。
[0172] 本文中使用的“可检测基团”包括任何合适的可检测基团，如放射性同位素标记35 125 131
(例如，S、I、 I等)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记(例如，荧光素、绿色荧光蛋白等)等，如本领域公知的和根据已知技术使用的。
[0173] 生物或生化筛选试验。
[0174] 可以在如以下进一步讨论的本发明的生物试验或化学试验中评价本发明的抗体及其抗原结合片段在调节IGF-1引起的细胞激活中的活性。
[0175] 评价αVβ3的增强剂或抑制剂的生化和生物活性的方法。IGF-1作用的改变。除了竞争性结合试验，为了确定结合αVβ3上的半胱氨酸环结合位点的化合物是否影响IGF-1信号传导，可以利用评价这一位点通过配体激活时刺激的生化和生物作用并且这怎样改变细胞对IGF-1应答的试验。抑制剂将明显抑制IGF-1刺激这些细胞过程的能力，而刺激剂将促进其能力来进行。这些试验包括但不限于以下的：β3亚基磷酸化，β3结合SHPS-1和作为复合物的整联蛋白相关的蛋白质(IAP)，IAP与SHPS-1的结合，SHPS-1磷酸化和Shc征募至SHPS-1，Shc磷酸化，DNA合成的刺激和细胞复制或细胞迁移。通过半胱氨酸环结构域结合β3的配体常常诱导构象变化和β3磷酸化。相似地，β3磷酸化的刺激可以其次地诱导β3中的构象变化。通过将结合β3的化合物施用于培养物中的平滑肌和内皮细胞来测量β3磷酸化。首先，使用从0.1变化至1μg/ml的浓度的化合物加入10cm培养皿中汇合的平滑肌或内皮细胞单层。暴露于细胞固定时间段(2-4hr)后，将细胞在900μl RIPA缓冲液中裂解。通过针对β3的免疫印迹直接分析裂解物，来测量聚合，或用抗β3抗体免疫沉淀，然后针对磷酸酪氨酸进行免疫印迹。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离30μl细胞裂解物中含有的蛋白质后，分析了免疫印迹。对于免疫沉淀，将β3一抗以1:300稀释度加入900μl裂解物中并孵育过夜。用蛋白A琼脂糖沉淀免疫复合物并用Laemmli样品缓冲液稀释(Maile LA和 Clemmons DR,Endocrinology 143:4259-4264(2002)；Maile LA,Clarke JB,Clemmons DR,J Biol Chem,277:8955-8960(2002))。SDS-PAGE后，然后通过用单克隆抗-磷酸酪氨酸抗体(PY99)来测定磷酸化β3的量(Ling Y，Maile LA，Clemmons DR，Mol Endocrinol,17:1824-1833(2003))。
[0176] 之前已经公开了测定SHPS-1和IAP之间的复合物形成的方法(Maile LA，Clarke JB，Clemmons DR，Mol Biol Cell,14:3519-28(2003))。简而言之，将细胞暴露于通过半胱氨酸环结构域激活β3的测试剂，然后将它们暴露于IGF-1。IGF-1暴露后，如果β3是被激活配体IAP占领的配体，则SHPS-1将在大分子量复合物中结合。重要地，如果这被结合半胱氨酸环结构域的抗体或其他抑制剂完全抑制，它们将不结合。为了检测这种复合物，按照之前所述的制备细胞裂解物并且使用1:330稀释的多克隆抗血清进行针对SHPS-1的免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀的蛋白质并且使用纯化的单克隆抗体进行免疫印迹，以检测IAP(B6H12)(Id.)。
[0177] SHPS-1磷酸化。为了测定SHPS-1磷酸化，将β3配体加入培养物中，在37℃下持续30分钟至2hr的时间段。然后加入IGF-1，并在特定的时间点制备细胞裂解物。除了基线，在暴露于IGF-1后制备了3、5、10和20min裂解物。按照之前所述的制备裂解物并且使用1:330稀释的抗-SHPS-1多克隆抗血清进行针对SHPS-1的免疫印迹。然后通过SDS-PAGE分析了用蛋白A琼脂糖沉淀的免疫沉淀物，接着使用检测磷酸化酪氨酸残基的PY99单克隆抗体针对磷酸酪氨酸进行免疫沉积(Maile LA和Clemmons DR，Endocrinology 143:4259-4264(2002)；Maile LA，Clarke JB，Clemmons DR，J Biol Chem,277:8955-8960(2002)；Maile LA和Clemmons DR Circ Res，93:925-931(2003))。预期的应答是IGF-1刺激SHPS-1磷酸化并且激动剂将提高SHPS-1磷酸化的强度或延长其持续时间。相反，拮抗剂将降低强度并缩短其持续时间。
[0178] Shc磷酸化。Shc至SHPS-1的结合和征募对于Shc磷酸化是关键的，Shc磷酸化是IGF-1信号传导必需的，特别是在糖尿病的平滑肌细胞和内皮中。为了测量Shc磷酸化，按照之前所述的，将细胞培养物暴露于激动剂或拮抗剂，然后将细胞培养物暴露于IGF-1，持续10、20或30分钟。按照之前所述的，在每个时间点制备细胞裂解物，并且使用1:1000稀释的抗-Shc多克隆抗血清进行免疫沉淀。用蛋白A琼脂糖澄清免疫沉淀物，然后用Laemmli样品缓冲液洗脱蛋白质，并通过SDS-PAGE分析，接着用抗磷酸酪氨酸抗体PY99进行免疫印迹。预期的应答是IGF-1将刺激Shc磷酸化。这在暴露于β3激动剂的培养物中，在之后的时间点，将显著延长和强化。相反，拮抗剂将抑制Shc磷酸化。
[0179] Shc征募至SHPS-1。将培养物暴露于激动剂或拮抗剂，持续之前所列的时间段。然后洗涤培养物并加入IGF-1，持续5、10、20或30min的时间段。按照之前所述的制备细胞裂解物(Maile LA和Clemmons DR，Endocrinology 143:4259-4264(2002))并使用1:330稀释的抗-SHPS-1抗血清进行免疫沉淀。用蛋白A琼脂糖清除免疫复合物后，通过SDS-PAGE分析免疫沉淀物，接着使用1:2000稀释的抗-Shc抗血清针对Shc进行免疫沉淀。预期的应答是IGF-1将刺激Shc征募至SHPS-1，这是Shc进行磷酸化所需要的。然而，如果使用拮抗剂，那么SHPS-1将不会被磷酸化，并且Shc将不会结合SHPS-1，因此征募将不可检测或有很大程度的降低。
[0180] MAP激酶的激活。MAP激酶的激活对于通过IGF-1刺激平滑肌细胞和内皮中的细胞分化和细胞迁移是关键的。如之前所述的，Shc磷酸化和征募至膜是MAP激酶激活所需的。为了确定MAP激酶激活是否受到影响，将细胞暴露于激动剂或拮抗剂，持续之前所述的时间段，然后按照之前所述的制备细胞裂解物(Maile LA和Clemmons DR Circ Res,93:925-931(2003))。通过SDS-PAGE和针对ERK 1/2的磷酸化形式(MAP激酶活性的指示)的免疫印迹直接分析30μl的细胞裂解物(Ling Y，Maile LA，Clemmons DR,Mol Endocrinol,17:1824-1833(2003))。将预期MAP激酶激活的时间过程强度将通过β3延长，并被β3激动剂抑制。
[0181] 细胞复制。将平滑肌和/或内皮细胞以相对低的密度104/cm2铺板于含低血清(0.2％)的培养基中。铺板24hr后，在含有0.2％贫血小板血浆的培养基中，使细胞停滞。24hr后，将培养物暴露于0至100ng/ml之间递增浓度的IGF-1和β3激动剂或拮抗剂。
48hr后，用锥虫蓝将细胞培养物染色并通过人工计数来测定细胞数量。如果β3被激动剂占领，则在该时间段内存在至少2倍的细胞数量增加。而如果加入拮抗剂，细胞数量常常为低于20％的增加。
[0182] 细 胞 迁 移。 按 照 Maile LA，Imai Y，Clarke JB，Clemmons DR，J.Biol.Chem,277:1800-1805(2002)中所述的，用刀片划开汇合的静止的平滑肌或内皮细胞培养物。检查刀口，以确定已经获得了直的边缘并且在平板中不存在沟槽。然后用有色标记物鉴别至少五个正确划开的区域。以50或100ng/ml的浓度加入IGF-1，并将各种浓度的激动剂或拮抗剂加入至少重复两份的培养物中。72hr后，用亚甲蓝染色后，测定从刀口边缘迁移至少50微米的细胞的数量并计数。IGF-1通常刺激每个显微镜视野20至50个细胞迁移这个距离。在拮抗剂的存在下，通常少于5个细胞/显微镜视野迁移，但激动剂可以将对IGF-1的应答提高多达2倍。
[0183] 制剂和施用
[0184] 对于以下所述的使用方法中的施用，通常在施用前，将活性剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与无毒的、可药用载体物质(例如，生理盐水或磷酸盐缓冲盐水)混合，并且将使用任何医学上合适的程序来施用，例如，非肠道施用(例如，注射)，如通过静脉内或动脉内注射。
[0185] 可以根据已知技术，将上述的活性剂在药物载体中进行配制，用于施用。参见，例如，Remington，The Science And Practice of Pharmacy(最新版本)。在根据本发明的药物制剂的制造中，其中通常将活性化合物(包括其生理学上可接受的盐)尤其与可药用载体混合。当然，在与制剂中的任何其他成分相容的意义上，载体必须是可接受的，并且必须对受试者无害。载体可以是液体并且优选与化合物配制成单位-剂量制剂，其可以含有0.01或0.5％至95％或99％重量的活性化合物。载体可以是无菌的或不含对施用于或传送给受试者不利的其他杂质的形式。
[0186] 本发明适用于非肠道施用的制剂包括活性化合物的无菌水性和非水性注射液，该制剂优选与计划的受试者的血液是等渗的。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂以及使得制剂与计划的受试者的血液等渗的溶质。
[0187] 可以通过任何医学上合适的程序来施用活性剂，例如，常规的静脉内或动脉内施用。在特定的情况中，希望直接施用于动脉粥样硬化的脉管。
[0188] 可以以无菌容器中的冻干形式来提供活性剂，或可以在结合可药用载体的药物制剂中来提供活性剂，所述载体如无菌无热原水或无菌无热原生理盐水溶液。
[0189] 用于本文中所述的使用方法的本发明的抗体或其抗原结合片段的剂量其中将取决于受试者的病症、待治疗的特定失调、施用途径、所用的治疗剂的性质和受试者对特定治疗剂的敏感性。例如，剂量范围可以为约0.02至约500微克/公斤受试者体重。抗体或其抗原结合片段的具体剂量不是关键的，只要其在受影响的群体内的一些个体中有效地导致一些有益效果。通常，剂量可以低如约0.05、0.1、0.5、1、5、10、20或50微克/公斤受试者体重，或更低，以及高如约60、75、90或100微克/公斤受试者体重，或甚至更高。
[0190] 使用方法
[0191] 已经表明IGF-1作用的拮抗阻断损伤形成和早期动脉粥样硬化损伤发展。阻断αVβ3上的这一结合位点的抗体或其片段的施用将拮抗动脉粥样硬化损伤中大量的基质蛋白的作用，如玻连蛋白、骨桥蛋白和纤维蛋白原。在肝素结合表皮生长因子和结缔组织生长因子在动脉粥样硬化损伤发展中活性的程度，抗体或其片段也将起作用来抑制这种作用。
[0192] 糖尿病性肾病的早期变化包括由于肾小球内皮/足细胞屏障的机能障碍引起的蛋白尿的发展。这种屏障的正常功能是将废物过滤进尿液并将>40,000分子量的蛋白质保留在循环中。屏障机能障碍然后导致肾小球基底膜增厚和足细胞足突融合。这些变化后，足细胞从基底膜脱落并且剩余的肾小球变得纤维化和机能障碍。这些变化是渐进性的并且在几个月至几年中发生。αVβ3整联蛋白涉及糖尿病性肾病的发展。这种受体在肾小球内皮细胞和足细胞的表面上表达。在高血糖症和已知在肾脏中合成的配体的存在下，异常激活，如骨桥蛋白结合αVβ3，引起这种异常激活。
[0193] 已经研发了针对由过量αVβ3配体累积激活的区域的抗体并在本文中公开。当抗体结合称为C环结构域的αVβ3的区域时，其抑制这些配体刺激提高的内皮细胞对蛋白质的渗透性的能力。这导致了正常内皮/足细胞屏障的维持。这已经在施用了化合物来破坏胰腺中的胰岛素产生细胞的Sprague-Dawley大鼠中得到了证实。这些大鼠在四周的时间段内变成糖尿病并且产生非常显著的蛋白尿。然而，即使产生了显著的蛋白尿后，抗C环结构域抗体的施用导致其结合肾小球中的合适细胞(例如，内皮细胞和足细胞)并且抑制骨桥蛋白和其他配体刺激肾小球内皮渗透性。这通过在四周施用期内从异常蛋白尿的程度恢复成正常来呈现。本发明的抗体在停止糖尿病性肾病中证明的肾小球功能的最早期变化中是有效的(Kanwar等，“A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy”Annu Rev Pathol Mech Dis 6:395-423(2011)；Nakagawa等，“Endothelial dysfunction as a potential contributor in diabetic nephropathy”Nat Rev Nephrol 7:36-44(2011)；Diez-Sampedro “Podocytopathy in diabetes:a metabolic and endocrine disorder”Am J Kidney Dis 58:637-646(2011)；Nicholas等，“Critical role for osteopontin in diabetic nephropathy”77:588-600(2010)；Ktisiou“Glucose-1nduced changes in integrins and matrix-related functions in culture human glomerular epithelial cells”Am J Physiol Renal Physiol
284:F671-679(2003)；Yamamoto 等，“Tumstatin peptide,an inhibitor of
angiogenesis,prevents glomerular hypertrophy in the early stage of diabetic nephropathy”Diabetes 53:1831-1840(2004)；Wei等，“Modification of kidney barrier function by the urokinase receptor”Nature Med 14(1):55-63(2008))。
[0194] 本发明的抗体及其片段的另一个用途将是治疗炎性肠病。肠平滑肌细胞表达αVβ3受体并且它们在这些疾病中的增殖导致肠狭窄。因此，用本发明的抗体或其片段抑制其生长将导致这种并发症的预防。
[0195] 本发明的抗体或其片段的另一个用途是治疗骨质疏松症。成骨细胞不表达αVβ3，但其在刺激骨再吸收的破骨细胞上表达。因此，通过使用拮抗剂，破骨细胞上配体占领的刺激的抑制应当导致骨形成的增强。几种蛋白质，如骨桥蛋白，在骨胞外基质中是大量的并且可以通过其机理刺激破骨细胞，因此其作用的拮抗可以允许IGF-1提高骨形成，而没有提高骨再吸收。
[0196] 本发明的抗体及其片段的另一个用途是治疗异常血管发生的状况。血管发生在肿瘤发展中是重要的，而且在其他病理生理过程中同样重要，如糖尿病性视网膜病变。由于内皮细胞表达大量αVβ3受体，预期通过这个肝素结合结构域抑制内皮生长因子(如，脉管内皮生长因子或肝素结合表皮生长因子)与αVβ3结合的拮抗剂导致血管发生的抑制，因此本发明的抗体及其片段可以是用于这些临床病症的有用药物。
[0197] 本发明的抗体及其片段的另一个用途是治疗癌症或肿瘤，特别是具有αVβ3受体的那些(例如，Wilm’s肿瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤)。尽管αVβ3不是所有肿瘤细胞上的大量受体，但已经描述了几种表达αVβ3的肿瘤细胞类型。迄今为止的方法通常靶向刺激αVβ3的配体中的RGD序列并且使用结合这一结构域的拮抗剂来抑制αVβ3作用。在本发明中，与RGD结合位点相反，拮抗αVβ3上的半胱氨酸环提供了靶向这一受体的独特方法，并且因此在抑制这些肿瘤的发展中具有更高的功效。
[0198] 在癌症或肿瘤的治疗中，本发明的抗体及其抗原结合片段可以任选结合本文中所述的失调或病症治疗中有用的其他不同的细胞毒性剂(如，化疗或抗肿瘤化合物或放疗)(例如，化疗剂或抗肿瘤化合物)一起施用。其他化合物可以在本发明的抗体或其抗原结合片段施用之前、共同和/或之后施用。如本文中所用的，词语“共同”表示时间足够近，以产生并用效果(即，共同可以是同时，或可以彼此之前或之后发生的两次或多次施用)。
[0199] 如本文中所用的，短语“放疗”包括但不限于x-射线或γ射线，其或者从外部施加的来源(如光束)或通过植入的小放射源释放出来。
[0200] 可以与本文中所述的抗体或抗原结合片段一起施用的合适的化疗剂的非限制性实例包括道诺霉素、顺铂、维拉帕米(verapamil)、阿糖胞苷、氨基蝶呤、democolcine、他莫西芬(tamoxifen)、放线菌素D、烷化剂(包括，但不限于，氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸盐类、亚硝基脲类和三氮烯)：尿嘧啶氮芥、氮芥、环磷酰胺 异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷(Pipobroman)、三乙烯-三聚氰胺、三乙烯硫代磷胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪和替莫唑胺；抗代谢物(包括不限于，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁(Pentostatine)和吉西他滨，天然产物及其衍生物(例如，长春花属生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)：长春碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、Ara-C、紫杉醇(紫杉醇作为 可在商业上购得)、普卡霉素、喷司他丁
(Deoxycoformycin)、丝裂霉素-C、L-天冬氨酰酶、干扰素(尤其是IFN-a)、依托泊苷和替尼泊苷；其他抗增殖细胞毒性剂是诺维本(navelbene)、CPT-11、安美达(anastrazole)、来曲唑、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬。其他抗增殖细胞毒性剂包括，但不限于，美法仑、六甲三聚氰胺、噻替哌、阿糖胞苷、idatrexate、三甲曲沙、达卡巴嗪、L-天冬酰胺酶、喜树碱、拓扑替康、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、吡啶并苯并吲哚衍生物、干扰素和白细胞介素。优选的抗增殖细胞毒性剂的类别是EGFR抑制剂、Her-2抑制剂、CDK抑制剂和 (曲妥单抗)。(参见，例如，美国专利No.6,537,988；
美国专利No.6,420,377)。这样的化合物可以根据目前已知的施用技术来给予。
[0201] 抗体
[0202] 抗体及其生产是已知的。参见，例如，美国专利No.6,849,719；还可以参见美国专利No.6,838,282；6,835,817；6,824,989。
[0203] 本发明的抗体包括修饰的抗体，即，通过任何类型的分子与抗体的共价连接，使得共价连接没有妨碍抗体特异性地结合其结合位点。例如，本发明的抗体可以例如通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化来修饰，或使用其他保护/阻断基团、蛋白酶剪切、连接细胞配体或其他蛋白质等来进行修饰。可以通过已知技术进行各种化学修饰中的任何一种，包括但不限于特定化学剪切、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以含有一个或多个非典型氨基酸。
[0204] 可以使用各种技术，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或其组合，来制备单克隆抗体。例如，可以使用杂交瘤技术，包括Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版，1988)；和Hammerling 等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中教导的那些，来生产单克隆抗体。如本文中使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆，而不论生产其的方法。
[0205] 使用杂交瘤技术生产和筛选特定抗体的方法是常规的和已知的。简而言之，用抗原或表达该抗原的细胞使小鼠免疫。一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到抗原特异性的抗体，收集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过已知技术，将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如，来自从ATCC可获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法针对分泌能够结合本发明的多肽或抗原的抗体的细胞，测试杂交瘤克隆。可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠来产生腹水流体，其通常含有高水平的抗体。
[0206] 因此，本发明提供了生产单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选，通过将从用本发明的抗原免疫的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤，然后针对分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆，筛选从融合获得的杂交瘤。
[0207] 可以通过已知技术来生产识别特定表位的抗体片段。例如，可以使用酶，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)，通过免疫球蛋白分子的蛋白水解剪切来产生本发明的Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
[0208] 例如，还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生抗体。在噬菌体展示方法中，在携带编码所述功能性抗体结构域的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上展示功能性抗体结构域。这样的噬菌体可以用于展示从库(repertoire)或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用抗原(例如，使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠子的抗原)，来选择或鉴别表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体。这些方法中所用的噬菌体通常是包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述噬菌体具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合的Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括但不限于美国专利 No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,773,743和5,969,108。
[0209] 如上所述，噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并且用于产生完整抗体，包括人抗体，或任何其他所需的抗原结合片段，并且在任何所需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如以下详述的。例如，使用本领域已知的方法，也可以使用重组生产Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术。
[0210] 可以用于生产单链Fv和抗体的技术的实例包括美国专利No.4,946,778和 5,258,498；Huston 等，Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shu 等，PNAS
90:7995-7999(1993)；和Skerra等，Science240:1038-1040(1988)中所述的那些。
[0211] 对于一些使用，包括抗体在人的体内使用和体外检测试验，可以优选使用嵌合、去免疫的，人源化的或人抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分源自不同动物物种的分子，如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison.Science 229:1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等，(1989)J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利Nos.5,807,715；4,816,567和4,816,397，将全部以整体按引用并入本文中。
[0212] 如本文中使用的术语“人源化”是指来自非人物种的抗体，其氨基酸序列已经修饰，来提高其与人体中天然产生的抗体变体的相似性。因此，人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。常常，人框架区中的框架残基将被来自供体抗体的相应残基取代，以改变(优选提高)受试者中人源化抗体的抗原结合和/或降低免疫原性。通过本领域公知的方法来鉴别这些框架取代，例如，通过CDR与框架残基的相互作用的建模，以鉴别对抗原结合和/或免疫原性重要的框架残基，以及序列比较，以鉴别特定位置不常见的框架残基(参见，例如，Queen等，美国专利No.5,585,089；Riechmann等，Nature332:323(1988)，将其整体按引用并入本文中)。可以使用本领域已知的各种技术来人源化抗体，例如，CDR-移植(参见，例如，美国专利No.5,225,539；
5,530,101；和5,585,089)、镶 面 (veneering)或 表 面 再 建(resurfacing)( 参 见，例如，欧洲专利No.592,106；欧洲专利No.519,596；Padlan，Molecular Immunology
28(4/5):489-498(1991)；Studnicka 等，Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；
Roguska等，PNAS 91:969-973(1994))和链改组(美国专利No.5,565,332)。本文中的实施例部分中提供了本发明的人源化单克隆抗体的生产和表征的详细描述。
[0213] 对于人受试者的治疗性治疗、诊断和/或检测，完全人抗体是理想的。可以通过本领域已知的各种方法来制得人抗体，包括上述的噬菌体展示方法，使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库。参见，例如，美国专利No.4,444,887和4,716,111。
[0214] 还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因以外，可以将人可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以与通过同源重组的人免疫球蛋白基因座的引入分开或同时给予非功能性。特别地，JH区域的纯合删除防止内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩大并微注射至胚泡中，以产生嵌合小鼠。然后饲养嵌合小鼠，以产生表达人抗体的纯合后代。用选定的抗原，例如，本发明的多肽的全部或一部分，以常规的方式来免疫转基因小鼠。可以使用常规的杂交瘤技术，从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并且随后进行类别转换以及体细胞成熟。因此，使用该技术可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于这种用于生产人抗体的技术的综述，参见Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13:65-93)。对于这种用于生产人抗体和人单克隆抗体的技术和用于生产这样的抗体的实验方案的详细讨论，参见，例如，美国专利No.5,413,923；
5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和5,939,598。
[0215] 可以使用称为“定向选择(guided selection)”的技术来产生识别选定的表位的完全人抗体。在这一方法中，使用选定的非人单克隆抗体，例如，小鼠抗体，来指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等，Bio/technology 12:899-903(1988))。
[0216] 此外，使用本领域技术人员公知的技术，本发明多肽的抗体又可以用于产生“模仿”本发明多肽的抗-独特型抗体(参见，例如，Greenspan&Bona，FASEB J.7(5):437-444；(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8):2429-2438(1991))。例如，结合并竞争性地抑制多肽多聚化和/或本发明的多肽与配体结合的抗体可以用于产生“模仿”多肽多聚化和/或结合结构域的抗-独特型，并且因而，结合并中和多肽和/或其配体。这样的中和抗-独特型或这样的抗-独特型的Fab片段可以用于治疗方案中，以中和多肽配体。例如，这样的抗-独特型抗体可以用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，并且由此阻断其生物活性。
[0217] 本发明进一步提供了包含编码上述抗体或其部分的核苷酸序列的多核苷酸。可以通过本领域已知的任何方法来获得多核苷酸并且测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，可以从化学合成的寡核苷酸装配编码抗体的多核苷酸(例如，如Kutmeier等，BioTechniques 17:242(1994)中所述的)，其涉及合成含有编码抗体的序列部分的寡核苷酸的重叠，这些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。或者，可以从来自合适来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可获得，但抗体分子的序列是已知的，则可以从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞产生的cDNA文库，或核酸，优选多A+RNA，所述组织或细胞如选择来表达本发明抗体的杂交瘤细胞)，使用可与序列的3’和5’端杂交的合成引物通过PCR扩增，或使用特定基因序列特异性的用于鉴别例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆的寡核苷酸探针通过克隆，获得编码免疫球蛋白的核酸。然后可以使用本领域公知的任何方法，将通过PCR产生的扩增的核酸克隆至可复制的克隆载体中。
[0218] 植入物
[0219] 根据用于实施本文中所述的方法或用于防止植入物相关问题(如，狭窄和再狭窄)的已知技术，可以将本发明的活性化合物，特别是如上所述的抗体或其抗原结合片段，结合或缀合植入物或可植入医疗装置。参见，例如，美国专利No.6,786,922；6,746,686；6,718,208；6,617,142；6,352,832和6,238,872。因此可以利用任何植入物，包括但不限于支架(例如，脉管支架)、电极、导管、引线、可植入起搏器或家用心律转变器(cardioverter housing)、关节、螺钉、杆、眼部植入物(包括，但不限于，人工晶状体植入物、青光眼植入物或引流术植入物(drainage implant)，以及点(punctal)植入物或堵塞物)等。植入物可以是任何合适的材料，包括但不限于有机聚合物(包括稳定的或惰性聚合物和生物可降解聚合物)、金属(如不锈钢和钛)、无机材料(如硅)，及其复合物。
[0220] 在以下非限制性实施例中更详细地解释本发明。
[0221] 实施例1
[0222] DNA合成
[0223] 将细胞以2.5×104/cm2的密度铺板于96-孔组织培养平板中，并且生长5天，没有更换培养基。用无血清DMEM漂洗一次，并通过用DMEM加0.2％贫血小板血浆(PPP)血清饥饿孵育24h。然后将细胞暴露于IGF-1加任何处理，并且在37℃下孵育24h，并且按照Imai和Clemmons(“Roles of Phosphatidylinositol 3-Kinase and Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways in Stimulation of Vascular Smooth Muscle CellMigration and Deoxyriboncleic Acid Synthesis by Insulin-Like Growth Factor
3
1”Endocrinology 140:4228-4235(1999))中所述的，测定了整合入DNA中的[H]胸腺嘧啶的量。
[0224] 实施例2
[0225] 肽合成
[0226] 在Rainin多肽合成仪上，使用FMOC化学方法合成了肽。FMOC氨基酸的激活和酰化利用了碱(N甲基吗啉)存在下的HATU。在酰化完成时，用二甲基甲酰胺中的20％哌啶除去了FMOC保护基团。合成后，从树脂取下肽，并通过用含有合适有机清除剂的95％三氟乙酸处理来去保护。
[0227] 将经剪切的、去保护的肽在冷醚中沉淀，重悬浮于稀TFA/乙腈混合物中，并且通过反相树脂上的高性能液相色谱纯化，使用递增的乙腈梯度。
[0228] 通过分析HPLC和通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来评价肽产物的质量控制。将纯化的肽冻干并储存于-20℃。
[0229] 实施例3
[0230] 用于免疫的肽的制备
[0231] 为了制备本发明的抗体，制备了合成的肽。使用Rainin多肽合成仪，使用FMOC化学，合成了肽。FMOC氨基酸的激活和酰化利用了碱(n-甲基吗啉)存在下的HATU。在酰化完成时，用二甲基甲酰胺中的20％哌啶除去了FMOC保护基团。合成后，从树脂取下肽，并通过用含有合适有机清除剂的95％三氟乙酸处理来去保护。然后用冷醚沉淀剪切的、去保护的肽，并重悬浮于稀TFA/乙腈中，并且通过反相树脂上的高性能液相色谱纯化，并用递增的乙腈梯度洗脱。通过分析HPLC和通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来评价肽产物的质量。然后将纯化的肽冻干并储存于-20℃。通过与数据库中的已知质量相比，洗脱肽的质量证实为含有正确的氨基酸。
[0232] 将β3半胱氨酸环肽(CYDMKTTC)(SEQ ID NO:29)缀合至Imject马来酰亚胺激活的海洋养殖钥孔血蓝素(Pierce，Rockford，IL)。称重0.7mg、1.2mg和2.1mg量的肽，并且将各自分开溶解，接着加入500mcl含有0.9M氯化钠的pH7.2的0.03M NaH2PO4的KLH中。将2mg马来酰亚胺激活的KLH溶解于500mcl蒸馏水中。然后将0.7mg溶解的肽加入KLH溶液中并在室温下孵育20min。将含有0.7mg溶解于缓冲液中的肽并加入相同KLH溶液中的另一支试管在室温下再孵育25min。将1.2mg和2.1mg的肽按序加入KLH溶液中并且在每次添加后，在室温下进一步孵育1hr的间隔。取出肽缀合物，并且相对2L的0.083M NaH2PO4，pH7.2，0.9M NaCl透析24hr，更换一次溶液。将总的4.7mg的肽/KLH缀合物分成5等份，冻干，并且在-20℃下冷冻，用于之后的使用。
[0233] 实施例4
[0234] 单克隆抗体的生产和筛选
[0235] 免疫。将无病原体的BALB/c小鼠用于免疫。将上述缀合的半胱氨酸环肽(CYDMKTTC；SEQ ID NO:29)与乳化的小鼠RIBI(MPL+TDDTM乳液)佐剂混合，并通过腹膜内注射300mcg乳化的抗原。在三周的间隔重复注射两次。通过在这三周的间隔从尾静脉抽取50-100mcl血液来测定抗体滴度。通过测试小鼠血清对固定化β3抗原的反应性来测定滴度。在六周后获得了足够抗体滴度的小鼠中，处死小鼠并且取出脾脏和淋巴结，用于与骨髓瘤细胞融合，用于杂交瘤形成。
[0236] 杂交瘤形成。选择两只小鼠用于脾脏收集。用300mcg抗原第三次加强这些小鼠，然后四天后处死小鼠。收集血液和脾脏。收集脾细胞并使用50％PEG溶液，与5
63-AGA.65(ATCCCRL-1580)细胞融合。然后将这些融合的细胞以1×10细胞/孔铺板于含有HAT选择培养基的96孔平板中。12-14天后，将融合平板或克隆在HT培养基中饲养。收集培养基，用于ELISA筛选，以鉴别所需的杂交瘤细胞。
[0237] ELISA材料。使用以下材料进行了ELISA：
[0238] 96孔Immulon IV平板(Fisher目录号14-245-153)
[0239] 1x包被缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6Sigma目录号C3041)
[0240] PBS中的2％BSA(封闭缓冲液)
[0241] PBS中的0.5％BSA(ELISA缓冲液)
[0242] 0.05％Tween PBS(洗涤缓冲液)
[0243] DEA显影剂
[0244] 从4.8ml 85％二乙醇胺(Fisher目录号D45)；0.25ml 1M MgCl2；和pNPP片剂(Sigma目录号N2765)产生DEA显影剂(500ml)。为了制备显影剂，将DEA溶解于400ml的无菌水中并用HCl和NaOH调节pH至10。加入MgCl2。将体积调节至500ml。储存在4℃。将显影剂包裹在箔片中，以避光。就在使用前，立即将1片pNPP加入20ml缓冲液中。
[0245] 二抗是山羊抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合物(Jackson Immunoresearch目录号115-055-164)。
[0246] PBS中1mg/ml的肽。
[0247] ELISA方法。使用上述制得的材料，如下进行筛选如本文中所述产生的单克隆抗体的ELISA，以分离和提供本发明的单克隆抗体：
[0248] 1.在4℃下，用包被缓冲液中浓度为5μg/ml的肽以50μl/孔包被平板过夜。
[0249] 2.用0.05％吐温洗涤平板。
[0250] 3.在4℃下，用200μl/孔封闭缓冲液封闭平板过夜。
[0251] 4.重复步骤2。
[0252] 5.以40μl/孔(上清液)或50μl/孔(血清稀释液)加入一抗(测试抗体)，并在室温下孵育1小时。
[0253] 6.用PBS中的0.05％吐温洗涤平板。
[0254] 7.以1:2000稀释度加入50μl/孔二抗并且在室温下孵育1小时。
[0255] 8.用PBS中的0.05％吐温洗涤平板。
[0256] 9.加入50μl/孔DEA显影剂并使其孵育。
[0257] 10.在分光光度计中在405nm下读数。
[0258] 根据本文中所列的实验方案产生的小鼠单克隆抗体描述于Maile等(“A monoclonal antibody againstαVβ3integrin inhibits development of atherosclerotic lesions in diabetic pigs”Science Translational Medicine
2(18):18ra11(2010))以及美国专利No.7,723,483；8,187,595和8,206,706中。
[0259] 实施例5
[0260] 结合αVβ3整联蛋白的C-环的人源化单克隆抗体的制备
[0261] 目标。目标是使用Composite Human AntibodyTM技术从根据实施例4产生的鼠单克隆抗体产生人源化抗体。进行了该报告的详细工作，其中测定了HLMC抗体的重链和轻TM链V区(VH和Vκ)序列并且产生了Composite Human Antibody 。人V区序列的区段来TM
自不相关的人抗体序列数据库。使用iTOPE 分析测试每个选定的序列区段以及区段之间TM
的连接结合II类MHC的潜能，并且设计所有最终Composite Human Antibody 序列变体，以避免T细胞表位。使用编码人序列区段的组合的合成寡核苷酸产生了Composite Human TM
Antibody V区基因。然后将这些克隆至含有人恒定区的载体中，并且产生了抗体并通过荧光活化细胞分选分析(FACS)测试与靶标抗原的结合，与具有匹配的人恒定区的相应嵌合抗体相比较。
[0262] Composite Human AntibodyTM可变区序列的设计。使用瑞士蛋白质数据库(PDB)产生了鼠HLMC抗体V区的结构模型，并且进行分析以鉴别很可能是抗体结合特性必需的V区中的重要“约束(constraining)”氨基酸。认为CDR内的残基(使用Kabat和Chothia定义)与一些框架残基是重要的。
[0263] 从以上分析，认为可以产生HLMC的复合的人序列，其具有可供广泛选择的CDR外侧，但在CDR序列内仅具有窄范围的可能的可替换残基。初步分析表明来自几个人抗体的相应序列区段可以组合，以形成与鼠序列中那些相似或相同的CDR。对于CDR外部和两侧的TM区域，表示宽范围选择的人序列区段鉴别为新Composite Human Antibody 可变区可能的组成部分。
[0264] 变体的设计。基于以上分析，选择可以用于形成HLMC复合人抗体变体的大的序列TM区段的初级组，并使用用于结合人II类MHC等位基因的肽的计算机分析的iTope 技术和TM TM
使用已知的抗体序列相关的T细胞表位的T细胞表位数据库 (TCED )来分析。将鉴别为TM
人II类MHC的明显非人种系结合子的序列区段，或相对TCED 技术评分为明显命中的序列区段丢弃。这形成了缩减的区段组，并且将这些的组合再次如上分析，以确保区段之间的连接不含有潜在的T细胞表位。然后将选定的区段合并，以产生重链和轻链可变区序列，用于分析。对于HLMC，用序列表中所列的序列构建了五条重链和三条轻链。
[0265] 变体抗体的构建、表达和纯化。使用一系列重叠寡核苷酸，合成了用于HLMC的所有变体复合人抗体VH和Vκ区域基因，将这一系列重叠寡核苷酸退火、连接和聚合酶链式反应(PCR)扩增，以获得全长的合成V区。然后将装配的变体直接克隆至用于IgG1重链和κ轻链的pANT表达载体系统。
[0266] 将复合IgG1重链和轻链的所有组合(即，总的15对)通过电穿孔稳定地转染至NS0细胞中，并且使用200nM氨甲喋呤(MTX)(Sigma Cat.No.M8407)来选择。使用IgG1ELISA测试每个构建体的MTX抗性克隆的IgG表达水平，并且选择最佳的表达系并在液氮下冷冻。尽管由于生长缓慢，两个变体，VH1/Vκ1和VH4/Vκ2，在这个研究中没有进行到蛋白质纯化阶段，但所有变体都实现了成功的转染和克隆选择。
[0267] 在蛋白A琼脂糖柱(GE Healthcare Cat.No.110034-93)上，从NS0细胞培养物上清液纯化用于HLMC的十三个IgG1变体，并且使用基于氨基酸序列计算的消光系数ε(1mg/ml蛋白质溶液的吸光值)(0.1％)＝1.61，通过OD280nm来定量。在不同变体的细胞培养物上清液中存在宽范围的抗体浓度，因此纯化抗体的产量也非常不同，从0.2mg-7mg。通过还原SDS-PAGE分析了每种抗体变体的少量样品。观察对应于预测大小的重链和轻链的条带，在任何泳道中没有明显污染的迹象，尽管在一些变体中观察到了小部分的其他的较高分子量条带。
[0268] 变体抗体与表达αVβ3整联蛋白的RD细胞的结合。在流式细胞结合试验中测TM试NS0-衍生的HLMC Composite Human Antibody 变体与表达αVβ3整联蛋白的横纹肌肉瘤(RD)细胞的结合。简而言之，制备亚汇合单层的RD细胞，并且在无血清培养基中孵育
24小时，然后收集。收集细胞，在冷PBS中洗涤，重悬浮于细胞解离缓冲液中(Invitrogen Cat.No.13151-014)并使用血球计计数。将细胞重悬浮于合适体积的冷FACS缓冲液中(1％
6
FBS/0.01％叠氮化钠/PBS)，以产生4×10细胞/ml的最终细胞密度。
[0269] 制备每种HLMC变体抗体的稀释系列(20μg/ml-2.5μg/ml)并且以50μl/孔分配至V-底96孔平板(Corning Cat.No.3894)中。将50μl细胞悬浮液加入每个孔中，以获得10μg/ml-1.25μg/ml的终浓度范围。将平板在4℃下孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞，重悬浮于100μl二抗(Sigma Cat.No.P8047，山羊抗-人IgG(γ链特异性的；PE缀合的)中并在4℃下孵育1小时。将细胞洗涤两次，重悬浮于最终体积175μl的FACS缓冲液中并转移至FACS试管。通过流式细胞术测量荧光，并作为标准化的％阳性事件(门控在R2中)将数据作图。
[0270] NS0-衍生的Composite Human AntibodyTM变体具有与嵌合(人恒定区和小鼠可变区)HLMC mAb非常相似的结合谱(图1)。所有113个变体的EC50(50％细胞门控在R2中的情况下的有效浓度)显示于表1中。通过将每个变体的EC50除以嵌合抗体的EC50来计算人源化变体的相对结合评分，并且将这些评分显示于表2中。
[0271] 结论。从完全衍生自不相关的人抗体可变区的氨基酸序列区段构建了特异性TM针对αVβ3整联蛋白的肝素结合环的Composite Human Antibody 。Composite Human TM
Antibody 变体中的所有CDR和框架区包含超过一个的不相关人序列区段(源自人序列数TM
据库)，并且特意设计了所有Composite Human Antibody ，以避免T细胞表位。
[0272] 纯化并测试十三个候选物，并证明了具有平均的嵌合HLMC两倍内的结合。基于TMComposite Human Antibody 的结合数据，建议以下抗体作为用于进一步分析的主要候选物：VH4/Vκ1、VH5/Vκ2、VH3/Vκ3、VH4/Vκ3和VH5/Vκ3。
[0273] 实施例6
[0274] 测试单克隆抗体的免疫原性
[0275] 概述。目标是与参照嵌合抗体相比，评价完全人源化抗-αV/β3整联蛋白c-环抗体的致免疫的潜能。按照实施例5中所述的产生了人源化抗体。使用T细胞表位数据库TM(TECD ；Antipote，UK)，使用计算机工具测试了由多个完全人序列区段组成的候选复合重TM
链和轻链可变区(V区)的潜在T细胞表位，以及使用iTope 分析测试了结合II类MHC的TM
能力。对所有最终的Composite Human Antibody 序列变体进行设计，以避免V区中的TTM
细胞表位。使用EpiScreen 时间过程T细胞试验，通过测量相对完整抗体蛋白(与嵌合抗体相比)的离体T细胞应答来确定两个主要的人源化抗体(Vh5/Vk2和Vh4/Vk1)中的免疫原性缺乏的证实。结果表明了嵌合抗体具有明显的致免疫的潜能(20％供体应答率)，而完全人源化抗体Vh5/Vk2(5％应答率)和Vh4/Vk1(0％应答率)具有非常低的致免疫的潜能。
因此，可以认为两个人源化抗体在临床中具有低的致免疫的风险。
[0276] 引言。对生物治疗剂的免疫应答是范围广的，并且可以直接针对非人和人来源的试剂。这些应答包括引发微弱的临床作用的那些和限制功效的那些，其偶尔会导致患者发病或甚至死亡。特别地，随着中和抗体的产生可能会引起严重的并发症，尤其是它们靶向重组自身蛋白并且因此具有与患者自身的内源性蛋白交叉反应的潜能时(Lim，2005)。与生物制剂，尤其是单克隆抗体的致免疫性相关的问题，由于分子生物学的进展，已经有很大程度的降低。然而，存在许多与内源性表达的人序列相同的重组蛋白质生物制剂，其仍然引发患者中有力的中和免疫应答(Hochuli 1997，Schellekens等1997，Namaka等2006)。
[0277] 尽管可以通过与产物和患者相关的各种因素来破坏自身蛋白的耐受性，但引发免疫原性的机制仍然不清楚(综述于Chester等2005，Baker和Jones 2007)。对于产物，这些包括剂量、施用频率、途径、蛋白质治疗剂的免疫调节能力和制剂(Jaber和Baker2007)。对于患者，如免疫能力(即，患者是否正在接受免疫抑制治疗)、患者的主要组织相容性(MHC)单模标本以及对蛋白质治疗剂的内在耐受性这样的因素将影响免疫原性。与怎样引发免疫原性无关，随后的免疫应答产生中的单个最重要因素之一是能够有效刺激有力+
的CD4T细胞应答的表位的存在。
[0278] 已经研发了临床前离体T细胞试验(EpiScreenTM)，其通过定量对蛋白质治疗剂TM的T细胞应答，提供了用于评价T细胞免疫原性的有效技术。EpiScreen 时间过程T细胞试验提供了其中可以评价完整蛋白质的免疫原性的形式。使用基于MHC单模标本小心选择的一群社会捐血者，在体外测试纯化的治疗性蛋白质的T细胞免疫原性。这种技术已经成功用于针对体内诱导免疫应答的潜能来比较蛋白质变体(Jones等2004，Jones等2005)。
这些研究表明由于高度灵敏连同试验的强效性质(其允许精确地临床前评价生物制剂的TM
免疫原性的潜能)，EpiScreen 试验提供了一种理想的筛选技术。
[0279] 在本发明的研究中，使用EpiScreenTM时间过程T细胞试验评价了三个抗体的致免TM疫潜能。测试的抗体是嵌合抗体(HMLC)和使用Composite Human Antibody 技术产生的+
两个完全人源化抗体，Vh5/Vk2和Vh4/Vk1。使用CD8耗尽的PBMC，建立了大量培养物，并
3
且在添加样品后的不同时间点测量了T细胞增殖，如通过[H]胸腺嘧啶的掺入所测定的。
[0280] 供 体PBMC 的 制 备 和 选 择。 从 获 自 UK National Blood Transfusion Service(Addenbrooke’s Hospital，Cambridge，UK)的健康社会供体血沉棕黄层(来自24小时内抽取的血液)并根据由Addenbrooke’s Hospital Local Research Ethics Committee授予的批准分离外周血单核细胞(PBMC)。通过Lymphoprep(Axis-shield，+ TMDundee，UK)密度离心从血沉棕黄层分离PBMC，并使用CD8RosetteSep (StemCellTechno+
logies Inc，London，UK)耗尽了CD8T细胞。使用基于HLASSP-PCR的组织-分型试剂盒(Biotest，Solihull，UK)，通过鉴别HLA-DR单模标本，来表征供体。还测定了对对照抗原(匙孔血蓝蛋白(KLH)，Pierce(Perbio)，Northumberland，UK)以及对源自流感A和EB病毒的对照肽的T细胞应答。然后将PBMC冷冻，并储存在液氮中，直至需要。
[0281] 选择了20位供体的群(研究群VSC01)，以最好地代表世界人口中表达的HLA-DR同种异型的数量和频率。相对世界人口中表达的那些的群中表达的同种异型的分析揭示了所有主要的HLA-DR等位基因(具有世界人口中表达>5％频率的个体同种异型)都得到了充分代表。四位供体对一个或多个抗体作出了阳性应答。
[0282] 抗体的纯化。制备了人源化抗体Vh5/Vk2和Vh4/Vk1，用于EpiScreenTM分析。从1L生长至饱和的表达抗体的NS0细胞系的培养物制备嵌合抗体。通过离心，将上清液与细胞和碎片分离，调节至pH7.4，过滤除菌并通过1ml Hi-Trap Mab Select Sure protein A亲和柱(GE Healthcare，Amersham，UK)运行，其之前已经用0.5M NaOH清洁并以1ml/min的流速平衡至PBS中。用20ml PBS pH7.4洗涤柱子。用0.1M柠檬酸钠pH3.0以1ml级分形式洗脱抗体，并且用0.1ml 1M Tris-HCl立即中和每个级分。通过280nm处的UV吸收监控每个级分的蛋白质含量并且将含有蛋白质的级分合并。使用16/60Superdex S200柱(GE Healthcare，Amersham，UK)，通过大小排阻色谱，进一步纯化抗体。收集主峰级分，合并并且缓冲液交换至200mM磷酸盐缓冲液pH7.0中。然后将纯化的抗体过滤除菌，并储存在+4℃。
使用计算的摩尔消光系数，通过UV吸收，测定了终浓度，其中A2801.0＝1.51mg/ml。
[0283] 通过超载银染的SDS/PAGE，将来自每个制备物的样品比较纯度。将三个测试样品中的每一个在变性的4-12％SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，Paisley，UK)中跑胶，一侧是分子量标记。然后使用深度银染试剂盒(MoBiTec，Gottingen，The Netherlands)针对蛋白质进行染色。对于所有三个制备物，抗体重链(大约55kDa)和轻链(大约26kDa)都是可检测TM的，并且所有制备物是高纯度的。使用 -PTS 试验(Charles River，Margate，
UK)的所有三个制备物的内毒素分析显示出内毒素低于该试验的检测极限(即，>0.5Eu/ml)并且在EpiScreen试验的限度内。
[0284] 样品的制备。制备测试样品(嵌合：0.69mg/mL；Vh5/Vκ2：2.05mg/mL；VH4/Vκ1：0.506mg/mL)并且储存在+4℃。将样品在AIM-VR培养基(Invitrogen，Paisley，UK)中稀释并且最终试验浓度为50μg/ml。将KLH用作再现性对照并且作为水中的10mg/ml储液储存在-20℃。为了研究，融化等份的KLH，然后立即在AIM-VR稀释至400μg/ml(终浓度
100μg/ml)。
[0285] EpiScreenTM时间过程T细胞增殖试验。将来自每位供体的PBMC融化，计数并评价6
生存力。将细胞在室温AIM-VR培养基中复活，洗涤并重悬浮于AIM-VR中，至4-6×10PBMC/ml。对于每位供体，建立大量培养物，其中将1ml增殖细胞储液加入24孔平板的合适孔中。
将培养基(0.5ml)和0.5ml的每种稀释的测试样品加入PBMC中，以获得每个样品50μg/ml的终浓度。对于每个供体还包含再现性对照(以100μg/mlKLH孵育的细胞)，以及只含有培养基的孔。将培养物用5％CO2，在37℃下孵育总共8天。在第5、6、7和8天，将每个孔中的细胞温和地重悬浮并且将3×100μl的等份试样转移至圆底96孔平板的每个孔中。
3
用100μl AIM-VR培养基中的0.75μCi[H]胸腺嘧啶(PerkinElmer，Buckinghamshire，UK)脉冲培养物并且再孵育18小时，接着使用TomTec Mach III细胞收集器收集至滤垫(Perkin Elmer)中。在paralux、低背景计数中，通过1450MicrobetaWallacTrilux液体闪TM
烁计数器(Perkin )上的Meltilex (Perkin )闪烁计数，测定了每个
孔每分钟的次数(cpm)。
TM
[0286] EpiScreen 数据分析。对于增殖试验，之前已经建立了等于或高于2(SI≥2.0)的刺激指数的经验阈值，由此认为诱导高于该阈值的增殖应答的样品是阳性的(在包括的情况中，临界SI≥1.90突出显示)。大量的试验研发和之前的研究已经表明了这是最小的信噪阈值，允许最大的灵敏度，而没有检测到大量假阳性应答。对于增殖数据集(n＝3)，通过统计和经验阈值来限定阳性应答：
[0287] 1.使用未配对的两个样品的student’s t-检验，相对培养基对照孔比较测试孔的cpm的应答显著性(p<0.05)。
[0288] 2.等于或高于2的SI(SI≥2.0)。此外，通过从复制培养计算原始数据的CV和SD来评价批内测试的变化。TM
[0289] 结果。为了测定免疫原性的相对风险，使用EpiScreen 时间过程T细胞试验，相对20位健康供体的群测试了三个抗体。基于之前的研究，以50μg/mL的终浓度测试了样品，之前的研究显示出这一饱和浓度对于刺激可检测的抗体特异性T细胞应答就足够了。TM
[0290] 为了评价每种样品的致免疫潜能，使用了EpiScreen 时间过程T细胞试验，使用增殖的分析来测量T细胞激活。由于之前在基于PBMC的试验中未评价样品，测定了样品对PBMC生存力的任何总毒性作用的初始评价。用测试样品培养后7天，使用PBMC的锥虫蓝染料排除，计算了细胞生存力。显然测试样品没有显著影响细胞的生存力，因为来自单独培养基培养的PBMC具有与测试样品和KLH处理过的细胞相似的平均生存力。
[0291] 使用由测试样品和阳性对照、KLH诱导的CD4+ T细胞应答的EpiScreenTM T细胞增殖试验的样品筛选。在增殖试验中，在至少一位供体中，使用刺激指数(SI)≥2.0，p<0.05阈值，两个抗体诱导了阳性应答。基于研究群中应答的量值(SI)连同应答供体的频率(％)，测定了测试样品的整体致免疫潜能。测试样品在研究群的5％至20％范围的供体中诱导了阳性增殖应答。与最高增殖应答相关的测试样品是嵌合抗体，其在20％的研究群中诱导了阳性应答(应答供体：3、8、12和19)。人源化抗体Vh5/Vk2在20位供体的1位中刺激了应答(5％的研究群)，而Vh4/Vk1未能在任何供体中刺激任何应答。使用对照抗原KLH的结果表明在重复研究测试1和VSC01中的阳性和阴性结果之间存在良好的关联，这表明该试验中高水平的再现性。此外，对照孔的所有基础cpm都高于150cpm试验的最小阈值。具有低于该阈值的基础(未处理的对照)cpm的供体通常排除在进一步的分析之外。
[0292] 使用SI≥2.0的阳性T细胞增殖应答的量值(SI)的分析显示出嵌合抗体的平均量值(SI＝2.23)低于Vh5/Vk2(SI＝3.25)。然而，由于相对Vh5/Vk2只存在一个阳性应答，致免疫潜能仍然是非常低的。
[0293] 增殖应答的总耗时可以提供关于T细胞应答的可能类型的信息(首次或回忆)。在第5天检测到的最大T细胞增殖表明现有的T细胞前体频率是高的，而第8天的最大增殖表明低的现有的T细胞前体频率。高的致免疫潜能将与时间过程早期过程中的T细胞刺激相协调。使用SI≥2.0，p<0.05，概括了四个时间点过程的每一天相对样品发生的阳性增殖应答的数量。结果表明嵌合抗体特异性的T细胞应答大部分发生在第8天，并且唯一的对Vh5/Vk2的阳性T细胞应答也发生在那一天，表明现有T细胞前体频率是低的。
[0294] 结果的解释。增殖数据表明与相对完全人源化Vh5/Vk2抗体唯一的供体应答(5％)相比，相对嵌合抗体检测到了来自20位供体的四个阳性增殖应答(20％)，并且相对完全人源化Vh4/Vk1抗体没有检测到应答。表3显示了T细胞时间过程增殖试验中相对测试抗体的阳性增殖应答的概述。从该试验的数据集的分析揭示了临床中对于免疫原性潜能的分级是(从最高到最低)：嵌合抗体>Vh5/Vk2≥Vh4/Vk1。进行了阳性应答供体单模标本的分析，以评价II类MHC同种异型与对特定抗体的应答之间的任何关联。如果应答群内的同种异型的频率是研究群中观察到的频率的两倍，则认为这是可能的。该分析限于在>5％的供体中产生了应答的样品。在相对嵌合抗体的T细胞应答中观察到没有HLA关联，嵌合抗体是唯一满足在>5％的供体中具有阳性增殖应答标准的测试样品。
[0295] 进行研究来证明使用EpiScreenTM试验观察到的免疫原性水平与临床中实际观察到的相对一大组治疗性蛋白质的免疫原性(抗蛋白治疗性抗体应答)水平之间的关联(Baker和Jones，2007)。针对如英利昔单抗和Campath这样的蛋白质，在临床数据和EpiScreenTM试验中都观察到了高水平的免疫原性，而对如Xolair、Herceptin和Avastin这样的蛋白质，观察到了相对低水平的免疫原性。重要地，完全人源化的Vh5/Vk2和Vh4/Vk1抗体在<10％的研究群中诱导了应答，基于之前的经验，这与具有低风险的临床免疫原性的治疗性蛋白质相关。因此，完全人源化的Vh5/Vk2和Vh4/Vk1抗体可以认为是具有低风险免疫原性的临床候选物。
[0296] 结论。使用EpiScreenTM时间过程T细胞增殖试验来测定一个嵌合抗体和两个完全人源化抗体的临床免疫原性的相对潜能。比较抗体诱导CD4+T细胞应答的能力，如通过TM相对一组20位HLA-型供体的增殖所测量的。在相对嵌合抗体的EpiScreen 时间过程T+
细胞试验中观察到了阳性CD4 T细胞增殖应答，并且在预期的15-40％的范围中。相对对照抗原KLH观察到了频繁和有效的T细胞应答，这表明试验起到了预期的作用。结果表明嵌合抗体具有显著的致免疫潜能(20％应答率)，而完全人源化变体Vh5/Vk2(5％应答率)和Vh4/Vk1(0％应答率)具有非常低的免疫原性潜能。因此，认为两个人源化变体在临床中都具有低风险的免疫原性。还研究了II类MHC同种异型与对测试抗体的阳性应答之间的关联；然而，发现没有关联。
[0297] 之前使用各种生物制剂的EpiScreenTM时间过程T细胞试验已经表明EpiScreenTM试验中的供体T细胞应答的百分比与临床中观察到的免疫原性水平(抗蛋白质治疗性抗体TM应答)之间的明显关联。在针对致免疫抗体(如，Campath)的EpiScreen 试验中观察到了高频率的供体应答，而针对非致免疫抗体(如，Xolair和Herceptin)观察到了相对低频率TM
的供体应答。通常，在EpiScreen 试验中诱导<10％阳性应答的蛋白质治疗剂与临床中低TM
风险的免疫原性相关。目前的研究表明，通过与EpiScreen 试验中测试的其他蛋白质治疗剂相比，来自该研究的数据表明Vh5/Vk2和Vh4/Vk1落入与Xolair、Herceptin和AvastinTM
相同的范围中，并且认为具有低的免疫原性的潜在风险。通过比较，嵌合抗体在EpiScreen试验中刺激了20％的供体应答，并落入与免疫原性更高的抗体(如，Humira和MLN02)相同TM
的范围中。因此，推断该研究中分析的完全人源化抗体在EpiScreen 免疫原性试验中呈现出临床上可接受的谱，提供了作为人源化的结果免疫原性降低的证实。
[0298] 实施例7
[0299] 用于测试VPI-2690B抗体的方法
[0300] 在几个生物测试系统中分析了实施例6中鉴别为具有降低的免疫原性的纯化抗体VPI-2690B，其包括重链可变区VH6(SEQ ID NO:12)和轻链可变区Vk2(SEQ ID NO:14)，并且是本文中提供的所有实施例中描述的抗体。最初，使用培养的猪脉管平滑肌细胞和人5
脐静脉内皮细胞测试了材料。将猪平滑肌细胞或人脐静脉内皮细胞以1×10细胞/孔的密度接种于六孔培养平板中含有10％FBS的DMEM-H(高葡萄糖)中，并孵育2至3天。然后将细胞在无血清DMEM-H中血清饥饿过夜。然后将培养基换成使用抗体处理的DMEM-H，并在37℃下再孵育四小时。在5ng/ml至1000ng/ml的浓度范围内测试抗体，并且与VH5/VK2抗体进行比较。然后用IGF-1(50ng/ml)直接刺激细胞5至10min。然后将细胞在300μL RIPA中裂解。将40μL所得到的裂解物加样于SDS 8％聚丙烯酰胺凝胶上，并且分离蛋白质，然后转移至聚乙烯二氟化物(PVDF)膜，以针对磷酸化MAP激酶(ERK)、磷酸化AKT和总MAP激酶(ERK)、AKT和β3进行免疫印迹。用抗-β3抗体(1至100稀释)将剩余的裂解物免疫沉淀并且在8％聚丙烯酰胺凝胶上分离后，将其转移至PVDF膜并用抗-磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹。
[0301] 免疫印迹后，制备膜，并使用扫描密度计扫描，然后获得任意密度扫描单位，来计算磷酸MAP、AKT和β3对抗体处理的应答。暴露于高血糖或高血糖加抗体后基础地比较每种处理，然后在IGF-1刺激后各自进行比较。
[0302] 将基础或IGF-1刺激条件下扫描的印迹强度归类为测定为零抑制的任意值。假定零的扫描值等于100％抑制；因此，如下计算未知处理的值(100减去处理扫描值除以未处理样品的扫描值×100＝％抑制)。图2显示了β3整联蛋白酪氨酸磷酸化(图2A)、AKT丝氨酸473磷酸化(图2B)和MAP激酶(ERK)丝氨酸磷酸化(图2C)中的变化。
[0303] 这些数据表明10-500ng/ml浓度之间任一种抗体的添加导致β3磷酸化的抑制或IGF-1刺激的MAP激酶和AKT激活。在高于500ng/ml的浓度下，存在部分的作用颠倒。这些结果支持两种形式的抗体都是这些信号传导途径的有效抑制剂的结论，这些信号传导途径在应答高血糖和IGF-1中被激活。
[0304] 实施例8
[0305] 在猪中测试药物动力学谱
[0306] 将平均重量40kg的正常约克郡猪用来测定本发明的人源化抗体的药物动力学谱。在PBS中重建了浓度为50mg/mL的纯化抗体。将三个剂量施用于每个剂量组的五只动物。皮下施用抗体。用0.1mg/kg氯胺酮麻醉每只动物。实现完全麻醉后，施用三个剂量中的一个。这些剂量包括0.3mg/kg，1.0mg/kg和5.0mg/kg。在所示的时间间隔获取血液。每个数据点表示来自至少两只动物的测定。由于安全原因，所有时间点没有动物流血。取出1mL血液后，立即离心。移出血清并丢弃血液有形成分。将血清冷冻直至试验。用于测定血清内的药物水平的ELISA方法如下。用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(100mM；pH5)中终浓度为5ug/ml的缀合牛血清白蛋白(BSA)的C-环抗原的溶液将96孔聚苯乙烯微滴定平板的每个孔在4℃下包被过夜。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗孔后，然后用PBS中的2％BSA溶液在4℃下封闭过夜。在试验当天，通过制备VPI-2690B抗体的储液的稀释液来制备ELISA试验标准品，以获得ELISA缓冲液中1.9ng/ml至1.000ng/ml的终浓度范围。将待测试的血清样品在ELISA缓冲液中1:20、1:40和1:100稀释。用PBS漂洗包被/封闭的ELISA平板，并将孔充满50ul标准品或样品(每个重复两次)。将该试验平板在室温下摇动1小时。
然后用PBS+0.1％吐温20洗涤孔(总共3次)，然后将100ul碱性磷酸酶标记的抗人二抗(ELISA缓冲液中1:2000稀释)加入每个孔中。将平板再次在室温下摇动1小时。同时，通过将p-硝基苯基磷酸盐(二钠盐)溶解于5M二乙醇胺溶液中制备了检测试剂。用PBS再次漂洗孔，然后将50ul检测试剂加入每个孔中。使其产生颜色变化以显影，然后在405nm下在微滴定平板中测量。将标准曲线样品的吸光值相对蛋白质浓度作图，并且用于计算未知样品中的蛋白质量。
[0307] 图3A-D显示出对于每个施用的剂量峰血液浓度中的剂量依赖性增加。结果表明药物的半衰期为7天至10天。半衰期不是剂量依赖性的，但是半衰期终点时的绝对浓度反映出初始剂量。推断药物从皮下空间充分吸收并且血清浓度反映出从这个大小和重量的动物可预测的药物分布以及半衰期将允许至少每周施用。
[0308] 实施例9
[0309] 该研究的目的是通过在药效试验中测定剂量应答关系来表征VPI-2690B药物动力学-药效(PK/PD)关系，所述药效试验测量VPI-2690B在1型糖尿病啮齿动物模型中抑制αVβ3生化信号传导途径的能力(Sprague Dawley大鼠中链脲霉素[STZ]-诱导的糖尿病)。第二个目标是确定在新的糖尿病动物中是否可以测量使用肾脏终点的药理学功效。
[0310] 所有大鼠禁食4小时，然后给予载体中的单次腹膜内(IP)STZ(50mg/kg)注射。就在注射前立即新鲜制备柠檬酸钠和STZ。5天后使用尾静脉血和Free Style lite葡萄糖计证实了高血糖症。
[0311] 证实高血糖症一周后，将大鼠随机分成7组之一(0、0.01、0.03、0.1、0.3、0.5或1mg/mL VPI-2690B)，4只大鼠/组。然后给大鼠(皮下[SC])注射合适剂量的VPI-2690B。
一周后，重复了VPI-2690B的注射。
[0312] 第二次注射后一周，使用戊巴比妥(SC；80mg/kg)使大鼠安乐死。在麻醉下，打开腹部并通过注射器从膀胱收集尿液。然后打开胸腔并切开心脏，收集血液并通过注入心脏用PBS使大鼠再灌注。取出肾脏并切除肾周围的脂肪并在液氮中快速冷冻，接着储存在-80℃，用于进一步分析。将尿液离心(在4℃下13,000转/分钟[RPM]，持续15分钟)，并将上清液在-20℃下冷冻，直至之后的分析。
[0313] 使血液凝固，然后离心(4℃，13,00RPM，15分钟)，并取出所得到的血清，储存在-20℃，用于之后的分析。
[0314] 在之后的时间点，将新鲜冷冻肾脏的一部分在放射性-免疫沉淀试验缓冲液(RIPA)中均质。将匀浆在13,000×g下离心10分钟，以清除碎片。
[0315] 使用1:500稀释(R2949)，用抗-β3抗体将等量的肾脏匀浆(2mg/样品)进行免疫沉淀。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离免疫沉淀物中的蛋白质。转移至Immobilon P后，用1:1500稀释的抗-磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀。使用来自Pierce Protein Biology Pruducts的Bicinchoninic Acid试验(BCA)试剂盒测定了所有裂解物中的蛋白质浓度。
[0316] 通过在DuoScan(Agfa)上的300dpi下的扫描，将膜数字化。在Photoshop中将单独凝胶的扫描转化成tif文件。使用ImageJ中的凝胶分析仪工具，用ImageJ分析了tif文件。这一工具记录了以任意单位计的结果。
[0317] 使用NephratII来测量大鼠中的尿白蛋白。该试验是竞争性结合试验；将样品和抗-大鼠白蛋白抗体-HRP缀合物加入白蛋白包被的孔中。抗体结合固定在固定相上的白蛋白或流体相中的白蛋白，因此认为是竞争性结合。洗涤后，只有已经结合固定相的白蛋白的抗体-缀合物将保留在孔中。Nephrat中的颜色强度与流体相中的白蛋白浓度的对数成反比。
[0318] 使用自动化学分析仪测量了尿肌酸酐。
[0319] 用包被缓冲液中的5μg/mL浓度的100μl/孔的肽包被96-孔immulon平板，在4℃下摇动过夜(18-20小时)。然后用0.05％Tween PBS(200μl/孔×3次洗涤)洗涤
平板，然后用200μL/孔封闭缓冲液在4℃下摇动封闭过夜(18-20小时)。再次用0.05％Tween PBS(200μl/孔×3次洗涤)洗涤平板。
[0320] 加入标准品、对照和样品(50μl/孔)并在室温下摇动孵育1小时，并用0.05％Tween PBS(200μl/孔×3次洗涤)洗涤平板。接着，加入1:200,000的100μL/孔的HRP标记的二抗并在室温下摇动孵育1小时，然后用0.05％Tween PBS(200μl/孔×3次洗涤)洗涤平板。
[0321] 接着，加入100μL/孔TMB底物并在室温下振荡20分钟，使其产生颜色显影。然后加入100μL/孔2M硫酸，以停止反应。
[0322] 最后，将平板振荡5秒，并在分光光度计中在450nm下阅读。
[0323] 在GraphPad 或Microsoft 软件中运行数据分析。在GraphPad 或Microsoft 软件中计算平均值和标准偏差(使用数据分析工
具中的描述统计学)。
[0324] 治疗开始和研究结束时通过治疗的研究动物的平均体重和葡萄糖水平数据呈现于表5中。在7个不同的组之间不存在有意义的差异，并且在该研究中，VPI-2690对体重或葡萄糖水平都没有影响。
[0325] 在第8天和第15天(尸检时，第二次注射后7天)在血清中测量的VPI-2690B的平均水平呈现于表6中。通常，与第8天相比，动物在第15天具有相似或更高水平的VPI-2690B。尸检时的剂量-浓度曲线显示于图4中。观察到了血清药物水平的剂量-依赖性提高。
[0326] 治疗结束时肾脏裂解物中测量的平均β3磷酸化显示于表7中并且通过图呈现于图5中。与对照(未治疗)动物相比，用VPI-2690B处理的动物的肾脏中的β3磷酸化存在剂量依赖性降低。不存在颠倒剂量应答的证据，与在体外看到的相同。0.03mg/kg VPI-2690B的剂量看来似乎是这一体内药效试验中最大活性的。
[0327] 为了限定PK/PD关系并理解针对VPI-2690B的靶标啮合的参数，该研究分析了靶标器官肾脏中β3整联蛋白的磷酸化状态(αVβ3途径激活的生化测量)，β3整联蛋白是抗体的分子靶标。因为肾功能改善的相关生理终点需要用VPI-2690B的慢性(chronic)治疗，在暴露于药物14天后，在尸检时进行了药效读出。因此，β3磷酸化不是急性靶标啮合的循环测量，而是靶标器官中慢性靶标啮合的测量。
[0328] 选择十四天作为限定PK/PD关系的最佳时间。在研究结束时测量了波谷循环药物水平，同时获取了PD测量，因此可以用于限定针对靶标啮合的相关PK/PD关系和体内的抗体生化活性(图6)。如上所示，0.03mg/kg VPI-2690B的剂量在这个体内药效试验中获得了最大抑制。在相同的时间点，该剂量对应于0.175μg/mL的循环药物水平。在0.01mg/kg的剂量下，其对应于<0.04μg/mL的药物水平，VPI-2690B在这个PD试验中是部分活性的(用于试验的LLOQ)。
[0329] 在研究结束时，作为白蛋白(mg/dL)/肌酸酐(mg/dL)比例的个体动物中测量的尿白蛋白水平呈现于图7中。观察到的组之间不存在一致的差异。在糖尿病4-20周后，在这个模型中已经进行了之前使用蛋白尿作为终点的功效研究。本研究缩短至3周，以避免抗-药物抗体的产生，其已经在3或更多周剂量的VPI-2690B后在大鼠中观察到并具有混淆PK/PD分析的可能。看来3周的糖尿病不足以看到蛋白尿的明显增加；并且因此在这个研究中没有评价VPI-2690B治疗对这一参数的影响。
[0330] 在大鼠中测定了VPI-2690B的PK/PD关系，使用靶标器官肾脏中的β3整联蛋白的磷酸化状态作为PD终点，β3整联蛋白是抗体的分子靶标。因为肾功能改善的相关生理终点需要用VPI-2690B的慢性治疗，在慢性(14天)施用后测定了PK/PD关系，而且最后一次注射后7天测量了药物水平和β3磷酸化。以0.03mg/kg剂量(对应于0.175μg/mL的药物水平)施用于大鼠时，VPI-2690B呈现出完全PD活性。在这个PD试验中，0.01mg/kg剂量的VPI-2690B是部分活性的，其对应于<0.04μg/mL的药物水平(用于试验的LLOQ)。PD剂量-应答曲线是单相的，在高剂量下达到平台，并且甚至在非常高浓度的药物下没有返回基线。因此，预期～0.2mg/mL的VPI-2690B的循环浓度与体内药物的药效活性相关，对应于肾脏中靶标αVβ3信号传导途径的生化抑制。
[0331] 实施例10
[0332] 这个研究的目的是用于表征VPI-2690B的结合亲和性，以a)测定不同发育阶段相对肽抗原的VPI-2690B的结合亲和性(人、猴、大鼠和小鼠比较)；b)测定与人比较的针对猴和大鼠的VPI-2690的结合亲和性；和c)测定正常和高血糖条件下VPI-相对天然人β3的结合亲和性并且还用于表征VPI-2690结合天然αVβ3与其在阻断信号传导中的功效之间的剂量-应答关系。
[0333] 用包被缓冲液中浓度为5μg/ml的合适C-环肽缀合物以100μl/孔在4℃下摇动包被平板过夜(18-20)小时。然后用0.05％Tween PBS(200μl/孔×3次洗涤)洗涤平板，然后用200μl/孔封闭缓冲液在4℃下摇动封闭过夜(18-20小时)。然后重复洗涤步骤。
[0334] 将从每个待测试的测试物质制备物形成的标准曲线(1.95ng/mL-2000ng/mL)(50μl/孔)加入平板的两个孔中并在室温下摇动孵育1小时。然后用0.05％Tween PBS(200μl/孔×3次洗涤)再次洗涤平板。接着，加入100μl/孔HRP-标记的山羊抗-二抗(ELISA缓冲液中1:200,000稀释)，并在室温下振荡孵育2小时。用0.05％Tween PBS(200μl/孔×3次洗涤)洗涤平板。然后加入100μl/孔TMB物质，并且在室温下振荡20分钟，使得显影产生颜色。加入硫酸(100μl/孔的2M硫酸)，以停止反应。然后将平板振荡5秒钟。将平板在Molecular Devices SPECTRA MAX Plus仪器上在450nm下读数。使用GraphPad Prism，以在针对log(激动剂)vs.应答—可变量斜率(四个参数)的等式中拟合数据。
[0335] 中国仓鼠卵巢细胞系的维持。在80～90％汇合下将细胞传代并且维持于补充了5％FBS和0.8mg/mLGeneticin的αMEM培养基中。
[0336] 人脐静脉内皮细胞的维持。在80～90％汇合下将细胞传代并且维持于补充了内皮生长培养基(EGM)SingleQuot试剂盒和1×谷氨酰胺的MCDB131培养基。
[0337] 形成表达人、猴或大鼠β3的细胞系的方法。按照所述的获得人(Huβ3)和大鼠整联蛋白β3(RAβ3)构建体；基于预测的狨毛猴(Callithrix jacchus)整联蛋白的序列(登录号：XM_002748126)，使用人β3构建体作为模板，通过定点诱变产生猴整联蛋白β3(MOβ3)构建体。
[0338] 将CHO-K1细胞以～50％的汇合率铺板于6-孔平板中。第二天，将3μg脱氧核糖核酸(DNA)构建体(人、猴或大鼠)与250μL的Opti-MEM混合，然后与9μL
lipofectamine 2000和250μl Optim-MEM的混合物混合。将混合物在室温下孵育30分钟。然后将混合物逐滴加入细胞单层中，并且将细胞返回培养箱中。
[0339] 四小时后，吸取转染混合物，用DPBS将细胞漂洗一次。然后将单层重新接种于10-cm培养皿中。第二天，用含有Geneticin(终浓度1.6mg/mL)的新鲜培养基置换培养基。
每隔一天更换培养基(含有1.6mg/mL Geneticin)，持续总共10至14天，直至细胞生长至汇合。然后将单层用胰蛋白酶消化并且重新接种于新的培养基中，用于扩大。将细胞维持于含有0.8mg/mL Geneticin的培养基中。使用细胞裂解物的western免疫印迹证实了β3蛋白质的表达。
[0340] 将细胞在10cm皮氏培养皿中培养直至它们获得汇合。吸取培养基并用冰冷DPBS洗涤细胞一次。在每个培养皿中，加入1mL裂解缓冲液(补充了1×HALT蛋白酶/磷酸酶抑制剂的放射性免疫沉淀试验[RIPA]缓冲液)并且将细胞留在冰上20分钟，接着用刮刀收集。然后将裂解的细胞在12000g下离心15分钟并收集上清液。
[0341] 将细胞裂解物接受SDS-PAGE分析。简而言之，将来自每孔每种裂解物的约20μg总蛋白质加样于4～15％梯度凝胶上。将凝胶在1×电泳缓冲液中在200V下运行35分钟，以分离蛋白质，然后将其转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(100V，1小时)。将膜在1×TBST缓冲液(tris-缓冲盐水+Tween)中的3％BSA中封闭，并用自有的兔抗-整联蛋白β3抗体(1.5％BSA中1:2000稀释)在室温下进行印迹1小时。在1×TBST缓冲液中洗涤10分钟×3次后，用二抗(Ab)(抗-兔子抗体，1×TBST中1:20,000)在室温下进一步孵育膜1小时。
[0342] 将膜在1×TBST中洗涤10分钟×3次，并且接着用1×TBS洗涤10分钟。使用SuperSignal West Pico化学发光底物来检测信号。
[0343] 将本文中记载的方法用于表9，图8和图9中显示的数据。
[0344] 用聚-d-赖氨酸(0.1mg/mL)在室温下包被96-孔平板30分钟，然后用蒸馏水漂洗，并在室温下干燥2小时。
[0345] 以1250细胞/孔接种CHO细胞(表达合适的β3)并且在生长培养基中培养4天。
[0346] 在试验那天，在SFM中以2mg/mL制备VPI-2690B的2个储液。向一支试管中，加入终浓度为53.3μM的C-环肽(200倍摩尔过量的肽)。在SFM中制备了VPI2690B的两支储备试管的每一支的连续稀释，并且在室温下孵育1小时。将稀释的VPI-2690B+/-C-环肽重复三份加入96-孔平板中的细胞中并且与细胞在37℃下孵育1小时。
[0347] 用DPBST洗涤细胞两次，用DPBS洗涤两次(手动)，接着使用1×PBS中的3.7％甲醛将细胞室温固定20分钟。然后使用设定为350的在垂直位置具有歧管的平板洗涤机，用DPBS将细胞洗涤3次。然后通过加入200μL封闭缓冲液(1％酪蛋白)，将孔在室温下封闭1小时，使用适当的振荡。再次使用DPBS将平板洗涤3次，然后加入1:4000稀释的HRP-缀合的二抗，并且在37℃下孵育1小时。用DPBST手动洗涤平板×2，然后用DPBS洗涤3次(使用平板洗涤机)。然后加入TMB底物，使反应进行20分钟，接着用2M H2SO4停止反应。将平板在Molecular Devices SPECTRA MAX Plus仪器上在450nm下读数。
[0348] 将本文中记载的方法用于表10、图10和图11中所示的数据。
[0349] 将HUVEC细胞以100μL/孔接种于96-孔平板中，使用约1500细胞/孔。将细胞在96-孔平板中的生长培养基(如果需要，补充25mM D-葡萄糖)中进一步培养3至4天，然后进行基于细胞的ELISA(cELISA)。
[0350] 在1％酪蛋白中以2mg/mL制备了VPI-2690B的两个储液。向一支试管中，加入终浓度为53.3uM(200倍摩尔超量的肽)的C-环肽。在1％酪蛋白中制备VPI-2690B的2支储备试管的每一支的连续稀释，并且在室温下孵育1小时。将稀释的VPI-2690B+/-C-环肽重复三份加入96-孔平板中的细胞中并且与细胞在4℃下的冷室中孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将细胞在福尔马林(3.7％)中固定并在1％酪蛋白中封闭。用HRP缀合的二抗Ab(1:2000稀释)将细胞在室温下进一步孵育1小时。然后洗涤平板并加入TMB底物。20分钟后，加入停止缓冲液。将平板在Molecular Devices SPECTRA MAX Plus仪器上在
450nm下读数。
[0351] 将本文中所述的方法用于图12和表11中所示的数据。
[0352] 将细胞铺板于6-cm培养皿(3×105/培养皿)中的生长培养基+25mM葡萄糖中。细胞在3天内达到汇合。在第2天，用新鲜培养基+25mM葡萄糖替换生长培养基并且将细胞保持培养过夜。第3天，吸取生长培养基并且用SFM(MCDB 131)漂洗细胞一次。然后加入补充了25mM葡萄糖的SFM中稀释的VPI-2690，以获得合适的终浓度(156ng/ml至40000ng/ml)。
[0353] 将平板返回至37℃培养箱，持续30分钟。在培养结束时，从培养箱中取出平板，吸取SFM，用冰冷PBS漂洗培养物，并将300μl RIPA加入每个培养皿中。在冰上20分钟后，从每个平板刮下RIPA+细胞裂解物，并转移至1.5mL微离心试管中并在13000rpm下离心15分钟。将澄清的上清液转移至新的试管中，并储存在-80℃，接着进一步分析。
[0354] 将等量的裂解物(15μg)与2×样品缓冲液混合并且加热至95℃，持续5分钟，接着在4-15％SDS-PAGE凝胶上分离(200V，40分钟)。
[0355] 然后将蛋白质转移至含有10％MeOH的1×转移缓冲液中的PVDF(100V，60分钟)。然后将膜在3％BSA中在室温下封闭2小时，接着用抗-磷酸β3抗体(1:3000，1.5％BSA)在4℃的冷室中孵育过夜。第二天，使用1×TBST洗涤膜，10分钟，3次，接着用二抗Ab(抗-兔，1.5％BSA中1:20,000)在室温下孵育1小时。然后用1×TBST洗涤膜，
10分钟，3次，然后用1×TBS洗涤10分钟，接着用Thermo Scientific SuperSignal试剂盒(cat#34080)检测，并暴露于x-射线膜20秒。
[0356] 通过在DuoScan上在600dpi下扫描，将膜数字化。将单独胶的扫描在Photoshop中转化成tif文件。使用ImageJ中的凝胶分析仪工具，用ImageJ软件分析了tif文件。该工具记载了以任意单位计的结果。
[0357] VPI-2690B和相关抗体对肽抗原的亲和性显示于表8中。抗体对人肽抗原的亲和性在优化过程中提高了大约5倍，从亲本鼠单克隆的1.2nM提高至最终人源化抗体VPI-2690B的0.28nM。亲本鼠单克隆抗体对人肽具有比大鼠或小鼠更高的亲和性。VH5VK2中间体对人和大鼠肽具有相等的亲和性，而VPI-2690B对人比对小鼠具有更高的亲和性，但对人和大鼠肽序列具有相等的亲和性。
[0358] 通过流式细胞仪，使用横纹肌肉瘤细胞系，测量了人-小鼠嵌合体(包含C-环小鼠单克隆抗体的重链和轻链可变区[VH和Vκ]以及人IgG1重链和κ轻链恒定区)和人源化VH5VK2抗体的EC50(表9)。在转染表达人β3的CHO细胞中测量了VPI-2690B对人β3的亲和性。EC50(20.33nM)与研发形式(developmental form)获得的相当。
[0359] 表达人、猴和大鼠β3的CHO细胞的相对结合亲和性显示于表10中。VPI-2690B与表达人、猴和大鼠β3的细胞的结合相当(各自为20.33±5.8vs 22.49±4.7vs12.92±1.3)。实施例结果显示于图7中，其显示了总的结合和C-环肽存在下(非特异性的)的结合，和图8 CHO-huβ3细胞中(肽的存在和不存在下的结合之间的差异，即特异性)。
[0360] 使用HUVEC细胞测量了VPI-2690B的结合亲和性。HUVEC中VIP-2690B结合人整联蛋白β3的EC50值为11.8±1.3(平均±SEM，n＝4；表11)。这与表达人β3的CHO细胞中获得的相当。
[0361] 因为研发VPI-2690B来治疗糖尿病性肾病，还使用HUVEC细胞计算了高葡萄糖条件下VPI-2690B对天然人β3的亲和性。高葡萄糖培养基中的EC50为32.9±4.3(平均±SEM，n＝6；表11)。
[0362] 实施例数据呈现于图10中，其显示了总的结合和C-环肽存在下的结合，和图11，其显示了肽存在和不存在下的结合之间的差异(即，特异性结合)。
[0363] 通过将高葡萄糖下培养的HUVEC暴露于一定浓度范围的VPI-2690B，来测试在递减β3磷酸化下VPI-2690B的体外功效和剂量应答。VPI-2690B在150ng/mL是部分活性的，并且在300至600ng/mL浓度下在体外是完全活性的(表12和图12)，导致与600ng/mL的对照相比，β3磷酸化大约45±10.0％的显著降低[平均±SEM n＝3]p<0.05)。这比在体内完全活性的VPI-2690B的最低血清水平(200ng/mL)略高。这些数据表明β3磷酸化的最大抑制发生在<50％的受体占领。
[0364] 重要地，VPI-2690B没有刺激β3磷酸化的基线水平(图12)，表明抗体是受体的完全拮抗剂。VPI-2690B对β3磷酸化的抑制在低抗体浓度下是剂量应答性的，并且在高浓度下返回基线，表明抗体的二价性在控制完整细胞中的β3磷酸化状态中起着作用。
[0365] 对CHO细胞中表达的人β3的亲和性是20.33nM，其在VPI-2690B对HUVEC中的内源性人β3的亲和性范围内(11.8nM和32.9nM)，证实了这种比较VPI-2690B对人、大鼠和猴β3的亲和性的模型的适当性。
[0366] 对CHO细胞中表达的猴β3的亲和性是22.49±4.7nM，其与相同细胞系中表达的人β3相当(20.33±5.8)并且在相同正常葡萄糖培养条件下对HUVEC中的内源性β3的结合也相当(11.8±1.3nM)。
[0367] 对CHO细胞中表达的大鼠β3的亲和性是12.92±1.3nM，其与人和猴的值都相当。
[0368] 实施例11
[0369] 这个研究的目的是比较VH5VK2和VPI-2690B对抑制猪平滑肌细胞(SMC)中的β3磷酸化、ERK1/2和AKT的能力。
[0370] 从猪主动脉外植体分离猪SMC。简而言之，取出间质组织和内皮后，将小部分的主动脉外植体直接放置在几个p100组织培养皿的塑料表面上。用10mL称为高葡萄糖生长培养基(HG-GM)的生长培养基覆盖外植体，所述生长培养基是含有4500mg/l(25mM)葡萄糖加10％胎牛血清和青霉素(1000U/mL)和链霉素(160μg/mL)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基[DMEM]。4至7天后，观察到SMC从外植体迁移出来。
[0371] 一旦观察到SMC已经从外植体迁移出来并粘附在培养皿的表面上，除去外植体(5至7天)。在这个点，将一半的平板维持在HG-GM，而剩余一半的平板维持在含有900mg/L葡萄糖(5mM)加10％胎牛血清和青霉素和链霉素的DMEM(正常葡萄糖生长培养基[NG-GM])中。给SMC每3天喂养HG或HG-GM，并且每7天在合适的培养基中传代。将SMC维持在这些条件下，用于另外三次的传代，然后用于实验。
[0372] 所有实验在传代4至10代之间的SMC上进行。除了所描述的情况，SMC在具有相同葡萄糖浓度的培养基中维持传代。在启动每个实验之前，将汇合的单层在无血清培养基中洗涤三次，并且在含有与其中它们已经生长的培养基中葡萄糖浓度相同的葡萄糖浓度(25mM葡萄糖＝SFM-H或5mM葡萄糖＝SFM-N)的无血清培养基中孵育过夜(16-17小时)。给SFM-N补充甘露糖醇，以确保不同葡萄糖浓度之间观察到的任何差异不是由于摩尔渗透压浓度的差异引起的。
[0373] 使用1×105/孔的密度，将猪平滑肌细胞接种于六孔培养平板中的含有10％FBSd DMEM-H中，并孵育2-3天。然后将细胞在无血清DMEM-H中血清饥饿过夜。针对待测试的两个抗体的每一个，设立了每组7孔的两个组。然后将每个孔中的培养基换成单独的DMEM-H(每组7孔的孔1)或抗体处理(每组7孔的孔2-6；0.005，0.05，0.1，0.5，1和2μg/mL)并孵育4小时。然后用IGF-1(50ng/mL)直接刺激一个组的7个孔中的细胞(没有抗体和抗体处理2-6)10分钟。然后从所有孔除去培养基，然后将细胞单层在300μL放射性免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液中裂解。然后将所得到的40μL裂解物加样于8％聚丙烯酰胺凝胶上，分离，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，以针对磷酸化的和总的ERK 1/2和AKT和总β3进行免疫印迹。剩余的裂解物用抗-β3抗体进行免疫沉淀，在8％聚丙烯酰胺凝胶上分离后，并转移至PVDF膜，用抗-磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹。免疫印迹后，对膜进行扫描，然后将获得的任意密度来计算pERK、pAKT(应答胰岛素样生长因子[IGF-1])和pβ3(基础)的降低，并将每个变体与基础或IGF-1处理来比较。
[0374] 为了定量抗体处理对基础β3磷酸化的作用，将western印迹数字化，并且计算来自未处理孔的信号强度，然后与以相似方式从对应于用递增浓度的VPI-2690B或VH5VK2处理的孔获得的值进行比较。以相似的方式评价了VPI-2690B和VH5VK2抑制IGF-1刺激的ERK1/2和AKT磷酸化的相对能力，但使用获自含有抗体刺激后用IGF-1处理的细胞的孔的数据。VH5VK2和VPI-2690B对AKT、ERK的IGF-刺激的β3磷酸化和基础β3磷酸化的抑制的原始数据和概述分别呈现于表13和表14中。数据用图呈现于图13中。
[0375] 图13和表14概括了具有pAKT和pERK数据的β3磷酸化数据。“最大抑制”栏显示了抗体变体在抑制IGF-1-刺激的ERK和AKT磷酸化以及基础β3磷酸化中最大有效的浓度。“％抑制”栏显示了抑制每个测试参数的最大抑制抗体浓度的能力(表达为％，其中完全抑制＝100％)。
[0376] VH5VK2最大抑制为0.01至0.5μg/mL。相似地，VPI-2690B最大抑制为0.05至0.1μg/mL。
[0377] VPI-2690B和VH5VK2能够产生全部3个研究参数的显著抑制，与计算的EC50和体内功效相一致。
[0378] VH5K2和VPI-2690B对β3磷酸化的抑制在低抗体浓度下是剂量-应答性的，并且在高浓度下返回基线，表明抗体的二价性在控制完整细胞中的β3磷酸化状态中起着作用。
[0379] 之前是本发明的说明，并不解释为其限制。本发明通过以下权利要求，待包括在其中的权利要求的等价物来限定。
[0380] 申请人特意表示本文中引用的所有专利、专利公开和非专利参考文献将其全部按引用并入本文中。
[0381] 表1.纯化抗体变体与表达αVβ3的RD细胞的结合
[0382]
[0383] NS0-衍生的Composite Human AntibodyTM变体的EC50值(nM)。在相同的试验中，嵌合IgG1具有计算的3.58nM的EC50。
[0384] 表2.纯化抗体变体与表达αVβ3的RD细胞的结合
[0385]
[0386] 通过将变体的EC50值除以嵌合HLMC的EC50，获得了NS0-衍生的Composite Human AntibodyTM变体的相对结合分值。＞1.0的相对结合分值表示与嵌合相比，变体提高的结合。基于与RD细胞的相对结合，将粗体强调的抗体推荐为主要候选物。
[0387] 表3.对抗体的各种形式的T细胞增殖应答
[0388]
[0389] 表3.相对测试抗体的阳性T细胞增殖应答S1≥2.0，p＜0.05的量值(+SD)的概述。从整个时间过程(5-8天)观察到的所有阳性供体应答的平均计算了平均S1。
[0390] 表4.氨基酸序列和相应的序列识别号
[0391]氨基酸序列 SEQ ID NO
[0392]LCDR1 1
LCDR2 2
LCDR3 3
HCDR1 4
HCDR2 5
HCDR3 6
VH1 7
VH2 8
VH3 9
VH4 10
VH5 11
VH6 12
Vκ1 13
Vκ2 14
Vκ3 15
Vκ2和恒定区 16
VH6和恒定区 17
小鼠Vκ 18
Vκ2取代 19
小鼠VH 20
VH6取代 21
Vκ1和恒定区 22
Vκ3和恒定区 23
VH1和恒定区 24
[0393]VH2和恒定区 25
VH3和恒定区 26
VH4和恒定区 27
VH5和恒定区 28
Vκ1取代 39
Vκ3取代 40
VH1取代 41
VH2取代 42
VH3取代 43
VH4取代 44
VH5取代 45
[0394] 表5.治疗组在研究开始和结束时的平均体重和葡萄糖水平
[0395]
[0396] *没有禁食
[0397] 缩写：SD＝标准偏差；#p＜0.05vs未处理对照组。
[0398] 表6.在第8天(第二次注射前30分钟)在血清中测量的血清中的VPI-2690B水平(ug/ml)
[0399]
[0400]平均 0 0 0.1451 0.5446 1.454 1.859 2.39
标准偏差 0 0 0.04387 0.1008 0.1581 0.7583 0.8072
标准误差 0 0 0.02194 0.05822 0.07906 0.3791 0.4036
[0401] 在第15天(第二次注射后7天尸检时)在血清中测量的血清中的VPI-2690B水平(ug/ml)
[0402]
[0403]平均 0 0 0.1752 0.8669 1.592 2.085 3.178
标准偏差 0 0 0.06541 0.8708 0.8027 0.8974 1.63
标准误差 0 0 0.03271 0.4354 0.4013 0.4487 0.8149
[0404] R＝大鼠LOQ＝定量极限(0.04ug/ml)
[0405] 表7.作为对照vs.施用(mg/kg)％的β3磷酸化
[0406]Con 0.01 0.03 0.1 0.3 0.5 1
平均 100 38.4 14.31 21.72 24.24 13.65 14.88
标准偏差 0 16.52 3.264 8.889 11.49 3.291 3.129
标准误差 0 8.262 1.632 4.444 5.744 2.327 2.213

p Vs对照 0.01 0.001 0.002 0.003 0.02 0.02
[0407] 表8.VPI-2690B和相关抗体对肽抗原的亲和性
[0408]
[0409] 缩写:IGg＝免疫球蛋白g；Kd＝离解常数；ND＝未测定
[0410] 标注:所示值为平均±SD
[0411] 表9.人-小鼠嵌合体、VH5VK2和VPI-2690B结合天然人β3的EC50
[0412]
[0413]
[0414] 表10.表达人、猴和大鼠β3的中国仓鼠卵巢细胞与VPI-2690B的相对结合[0415]
[0416] 标注：所示值为平均±平均的标准误差
[0417] 表11.在正常和高葡萄糖条件下人脐静脉内皮细胞中结合人整联蛋白β3的VPI-2690B的中值有效浓度
[0418]
[0419] 表12.在高葡萄糖条件下人脐静脉内皮细胞中β3磷酸化的VPI-2690B剂量应答[0420]
[0421] 缩写：SD＝标准偏差
[0422] 表13：VH5VK2和VPI-2690B对IGF-1刺激的ERK1/2和AKT磷酸化以及基础β3磷酸化的抑制-原始数据
[0423] AKT＝蛋白激酶Bα；ERK＝胞外信号相关激酶；ND＝未进行。
[0424] 表14.计算的VH5VK2和VPI-2690B对β3磷酸化以及IGF-1刺激的ERK1/2和AKT的最大抑制浓度和最大百分比抑制
[0425]
[0426]
[0427] AKT＝蛋白激酶Bα；ERK＝胞外信号相关激酶；Max＝最大。
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