一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法
阅读：248发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种 肿瘤 化疗药物 制剂及其制备方法，所述肿瘤化疗药物制剂包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的化疗药。该药物制剂中所包含的化疗药为含有 治疗 提供所述细胞囊泡的肿瘤的有效成分的化疗药。本发明还提供了所述肿瘤化疗药物制剂的制备方法。本发明提供的技术方案可使化疗药选择性地在肿瘤部位释放，使化疗药持续发挥药效，提高化疗药对肿瘤细胞的杀伤效果，并降低化疗药对正常细胞的毒 副作用 。，下面是一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法专利的具体信息内容。
1. 一种肿瘤化疗药物制剂，包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的化疗药。
2.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂，其中，该药物制剂中所包含的化疗药为含有治疗提供所述细胞囊泡的肿瘤的有效成分的化疗药。
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤化疗药物制剂，所述肿瘤化疗药物制剂包括注射制剂。
4.根据权利要求1或2所述的肿瘤化疗药物制剂，其中，所述化疗药包括治疗卵巢癌、 乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病或胶质瘤的化疗药中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂，其中，由所述细胞囊泡包裹所述化疗药所形成的肿瘤化疗药物制剂的粒度为100〜1000纳米。
6.权利要求1-5任一项所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，包括：对肿瘤细胞施用作为有效成分的化疗药使之凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药后形成的所述药物制剂；或者使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡， 收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的化疗药进行孵育，使化疗药被细胞囊泡包裹，然后收集微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药后形成的所述药物制剂。
7.根据权利要求6所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，其中，在使肿瘤细胞凋亡之前还包括对肿瘤细胞进行培养。
8.根据权利要求6或7所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，所述肿瘤细胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病和/或胶质瘤的细胞。
9.根据权利要求6所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，其中，收集细胞囊泡的方法为通过离心机，以100-100000g的离心力，收集细胞囊泡。
10.根据权利要求6所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，其中，收集微颗粒的方法通过离心机，以100-100000g的离心力，收集细胞囊泡。
一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药物制剂及其制备方法，尤其涉及一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 近年来，肿瘤作为一种严重威胁人们生命的疾病，其治疗方法已成为众多科研工作者致力于研究的课题，其中，通过化学药物（化疗药物）来消灭肿瘤细胞，是治疗肿瘤疾病过程中一种非常重要而常规的手段，然而施用化疗药物消灭肿瘤细胞的同时，会杀伤正常组织细胞，不但给患者带来难以承受的毒副作用，而且往往导致化疗失败。
[0003] 化疗药物的毒副作用的本质是化疗药物对机体正常细胞的杀伤。为了避免化疗药物对正常细胞的非特异性杀伤，现有的方案为将化疗药物通过载体包裹起来，使其选择性地在肿瘤部位释放，甚至进入肿瘤细胞内，从而将肿瘤细胞杀伤，常见的如由纳米材料制成的微粒载体系统，已经报道的可对化疗药物进行包裹进行靶向给药的纳米材料包括：聚乙二醇-脑磷脂共聚物（PEG-PE)、聚乳醛乙醇酸共聚物（PLGA)等，并且已被证实可以用于包裹化疗药物，并可以将化疗药物输送到肿瘤部位，提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。但是，由于纳米材料是外源性物质，其本身对生物机体存在一定的毒副作用，同时临床使用的纳米颗粒的粒径规格也导致其容易穿过正常细胞的细胞膜，增加了其纳米载体以及所携带的化疗药物对机体的毒副作用。此外，一些纳米颗粒所采用的特殊材料以及工艺技术，大大增加了成本，不利于临床推广应用。
[0004] 因此，如何针对性地降低化疗药物的毒副作用但又不降低甚至提高其对肿瘤细胞的杀伤效果，已成为肿瘤研究领域中亟待解决的难题。
发明内容
[0005] 本发明提供了一种肿瘤化疗药物制剂，以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为肿瘤化疗药物制剂的载体，包裹化疗药形成制剂，作为靶向药，更利于达到肿瘤治疗部位，提高化疗药的药效发挥，同时克服了使用外源给药载体给药对机体有毒副作用的缺陷。
[0006] 本发明还提供了一种肿瘤化疗药物制剂的制备方法，实现将作为治疗有效成分的化疗药包裹到源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡中。
[0007] 本发明提供的一种肿瘤化疗药物制剂，包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的化疗药。
[0008] 作为本领域的基础知识，细胞是由细胞膜包裹细胞内容物构成，而细胞膜是由磷脂双分子层中间镶嵌蛋白质分子所组成，其球状结构则通过细胞内被称为细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的向心牵拉力得以维持。当细胞受到外来信号（例如：化疗药或紫外线等）刺激细胞发生凋亡时，细胞骨架附着细胞膜部位的部分蛋白纤维丝断裂或失去附着， 向心牵拉力突然消失，使得局部细胞膜结构在外向拉力作用下，向外膨胀、突出并包裹细胞内容物以囊泡形式释放到细胞外的介于细胞和分子之间的亚层次结构中，其大小基本界于100-1000纳米（nm)，即本发明所述的“细胞囊泡”。本发明提供的药物制剂由于采用了上述细胞囊泡作为包裹化疗药的载体，成为一种微颗粒，更利于作为靶向药穿过肿瘤毛细血管组织杀伤肿瘤细胞（一般对肿瘤而言，组成其血管的细胞之间的缝隙较正常组织会显著增加，达到100-780nm大小)，而不能进入正常组织（其通透性一般在5-lOnm)，对正常组织不会产生任何损伤，也就避免了使用纳米材料等外源载体构成的靶向药给药对机体的毒害作用。
[0009] 本发明使用源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡包裹化疗药得到的制剂，相比于使用外源性载体的化疗药，更利于药效的发挥，降低机体的抗药性。因所述用于包裹化疗药的细胞囊泡源自肿瘤细胞，推荐的是源自与所要治疗的肿瘤细胞同种类型的肿瘤细胞，所述细胞囊泡可以很容易地与患者体内的肿瘤细胞的细胞膜融合，干扰肿瘤细胞细胞膜上原有的泵系统，减少对进入肿瘤细胞的化疗药的泵出，从而增强了肿瘤细胞对所述细胞囊泡内包裹的化疗药的敏感性。
[0010] 再一方面，当所述细胞囊泡包裹了一定剂量的化疗药物，施用到肿瘤细胞时，会产生“连锁反应”：即，包裹了化疗药的微颗粒杀伤了先进入的肿瘤细胞后，被杀伤而凋亡的肿瘤细胞继续形成新的囊泡而包裹化疗药，对其他肿瘤细胞进行持续给药直至药效全部发挥，可以理解，相比于直接施用化疗药，包裹有同样剂量的化疗药的微颗粒对肿瘤细胞的杀伤效果更加显著，因此本发明的肿瘤化疗药物制剂在治疗肿瘤的过程中可以根据需要适当降低该药物制剂的给药量或者选择细胞囊泡包裹的化疗药量的规格较小的药剂，以实现与直接施用化疗药时同样的治疗效果，从而本发明的肿瘤化疗药物制剂在一定程度上可减少化疗药使用量，并可使化疗药在体内充分发挥药效而避免沉积，减少化疗药对人体的伤害。
[0011] 本发明实际上提供了一种获得靶向药的新的思路和方案，该靶向药组成中的具体化疗药可以是临床使用的治疗各种肿瘤的化疗药，例如：卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病和/或胶质瘤等的化疗药，可以是一种化疗药，也可以是多种化疗药的组合，用于包裹化疗药的细胞囊泡（载体）则优选来自与所要治疗的肿瘤细胞同种类型的肿瘤细胞。
[0012] 根据本发明药物制剂的优选方案，该药物制剂中所包含的化疗药为含有治疗提供所述细胞囊泡的肿瘤的有效成分的化疗药；所包含的化疗药也可以是已经在临床上使用的药物，可以是注射制剂，或口服制剂，如果是片剂、粉剂、颗粒剂，可以将其溶解后使用（即： 溶解后与细胞囊泡进行孵育以包裹进细胞囊泡）。
[0013] 本发明提供的药物制剂可以是常规的靶向药剂型，例如注射制剂。
[0014] 作为本发明的优选方案，由所述细胞囊泡包裹化疗药所形成的肿瘤化疗药物制剂的粒度为100-1000纳米。所述肿瘤化疗药物制剂中含有的化疗药的剂量受在制备过程中加入到肿瘤细胞培养液的化疗药的量的多少所控制，但最高含量取决于所使用的化疗药在作为载体的细胞囊泡中的最大饱和度。所以，在该最高含量范围内，可以得到不同规格的药剂。
[0015] 本发明还提供了制备所述药物制剂的方法，S卩，通过任何可行的方法将化疗药包裹进所述细胞囊泡，所使用的细胞囊泡通过使肿瘤细胞凋亡而得到。
[0016] 在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供的所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，包括：对肿瘤细胞施用作为有效成分的化疗药使之凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药后形成的所述药物制剂；或者使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的化疗药进行孵育，使化疗药被细胞囊泡包裹，然后收集微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹有化疗药后形成的所述药物制剂，其优选可以为注射制剂，例如注射液。
[0017] 根据本发明的制备方法，可以控制化疗药的加入量获得不同规格（有效成分的含量）的药物制剂，方便对不同阶段的肿瘤患者的给药。所得到的药物微颗粒中化疗药物含量可以根据所选择的药物的性质、提供细胞囊泡的肿瘤种类，以及所要治疗的肿瘤患者的患病阶段，通过适当摸索而确定。一般的，控制所述肿瘤化疗药物制剂中含有的化疗药的药量可以是接近该化疗药在作为载体的细胞囊泡中的最大饱和度的量，或者根据设定药物制剂的规格控制化疗药的加入量。
[0018] 本领域技术人员也可根据所要治疗的肿瘤类型的不同，以及所使用的作为有效成分的化疗药的不同，根据以上描述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，选择适合的肿瘤细胞的凋亡方法，收集微颗粒的方法，收集细胞囊泡的方法，以及细胞囊泡和治疗肿瘤用化疗药的比例等条件，只要最终获得的细胞囊泡内包裹的作为有效成分的化疗药足以发挥所期望的治疗效果即可。本发明的方案中，优选使用紫外线或化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡，对于细胞囊泡的收集可使用超速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。优选的，通过离心机，在低温条件下左右），以100-100000g的离心力，收集细胞囊泡。同样的，对于微颗粒的收集也可使用超速离心机在低温条件下进行。优选的，通过离心机，在低温条件下左右），以100-100000g的离心力，收集微颗粒。对于使用紫外线照射肿瘤细胞获得的细胞囊泡与化疗药的孵育，优选的，化疗药以接近该化疗药在作为载体的细胞囊泡中的最大饱和度的量加入到细胞囊泡中，并在室温条件下进行孵育，实现细胞囊泡对化疗药的包裹。
[0019] 对于所收集到的微颗粒，可以按照常规方法制成药物制剂，尤其是注射制剂，例如，将收集到的微颗粒用生理盐水悬浮后制成注射液。
[0020] 在本发明提供的肿瘤化疗药物制剂的制备方法中，在使所述肿瘤细胞凋亡之前还包括对肿瘤细胞进行培养。所述肿瘤细胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病或胶质瘤的细胞。上述细胞的培养方法可采用本领域常规的培养方法进行培养。
[0021] 本发明提供的化疗药物制剂可以按照常规临床治疗方法给药，例如对于卵巢癌肿瘤可以直接腹腔注射给药，针对膀胱癌肿瘤可以经尿道膀胱灌注将所述化疗药物制剂靶向给药到膀胱癌肿瘤，给药剂量可按照或者低于所施用的化疗药的常规剂量进行使用。
[0022] 本发明所述诱导肿瘤细胞凋亡，可以按照本领域技术人员公知的判断标准，例如观察肿瘤细胞缩小、变暗，即可认为其已经凋亡；将细胞囊泡与化疗药进行孵育使细胞囊泡包裹化疗药可以通过在室温条件将添加了化疗药的细胞囊泡体系进行2-4小时的静置来实现。
[0023] 本发明中所述的被包裹在细胞囊泡中“化疗药”，可以为本发明以前已经被临床应用的化疗药物，也可以是本发明以前已经被临床应用的化疗药物中的有效成分（可以不含有或不完全含有药物辅料），即，制备本发明的药剂时，可以直接使用已经临床应用的各种商购药，也可以使用这些临床用药组成中的有效成分。所以，本发明中所涉及的药物剂量， 均应理解为该药物的有效成分量。[0024] 本发明的技术方案具有以下技术效果：
[0025] 1、将来自肿瘤的细胞囊泡作为本发明的肿瘤化疗药物制剂的载体，解决了外源载体给药对机体的毒副作用，并使作为有效成分的化疗药选择性地在肿瘤部位释放，在降低化疗药对正常细胞的毒副作用的同时，提高了化疗药对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0026] 2、本发明的肿瘤化疗药物制剂施用到肿瘤细胞时，会产生“连锁反应”，被杀伤而凋亡的肿瘤细胞继续形成新的囊泡而包裹化疗药，对其他肿瘤细胞进行持续给药直至药效全部发挥，在治疗中可以降低给药剂量，减少化疗药对人体的伤害。
[0027] 3、本发明提供的肿瘤化疗药物制剂的制备方法使所述细胞囊泡良好地包裹了化疗药，提供了一种靶向更好的肿瘤化疗药，利于提高化疗药对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0029] 图1显示了肿瘤细胞经化疗药处理后产生了微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成）。
[0030] 图2显示了肿瘤细胞经紫外线处理后，释放的细胞囊泡与化疗药孵育后，产生了微颗粒。
[0031] 图3显示了紫外线诱导小鼠肝癌细胞系产生的细胞囊泡可被小鼠肝癌细胞摄取。
[0032] 图4显示了化疗药诱导小鼠肝癌细胞系产生的微颗粒被小鼠肝癌细胞摄取后对小鼠肝癌细胞具有显著的杀伤作用。
[0033] 图5显示了施用包裹有化疗药的微颗粒在杀伤肿瘤细胞后，进一步产生的包裹化疗药的微颗粒对剩余肿瘤细胞进行杀伤。
[0034] 图6A-图6C显示了包裹化疗药的微颗粒对机体的毒副作用。
[0035] 图7A-图7D显示了包裹化疗药的微颗粒抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活时间。
[0036] 图8显示了本发明方案对更多肿瘤细胞的应用。
[0037] 图9显示了包裹化疗药的微颗粒体经血液可靶向到实体肿瘤。
具体实施方式
[0038] 为了证实肿瘤细胞来源的细胞囊泡能够包裹化疗药，对肿瘤细胞能够有效杀伤， 并且在体内不产生明显的毒副作用，下面结合附图和实施例进一步说明本发明。
[0039] 本发明使用的术语“细胞囊泡”是由凋亡肿瘤细胞产生的，没有包裹化疗药物，“微颗粒”由细胞囊泡包裹化疗药后形成。
[0040] 下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物及实验动物：
[0041] H22小鼠肝癌细胞、A2780人卵巢癌细胞、人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺癌细胞系 A549、人胃癌细胞系SNU1、人结肠癌Caco2、人肝癌细胞系H印G2、人膀胱癌细胞系T24、人白血病细胞系K562、以及人胶质瘤细胞系U251，均可从美国ATCC公司或中国典型物保藏中心 CCTCC购买。
[0042] BALB/c小鼠50只，购自武汉大学医学实验动物中心，体重18克；严重联合免疫缺陷SCID小鼠40只，购自武汉大学医学实验动物中心，体重18克；[0043] 阿霉素、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE) ,PKH26购自Sigma公司，甲氨蝶呤、顺钼购自同济医学院附属同济医院（武汉）。
[0044] 实施例1 ：使用化疗药诱导小鼠肝癌细胞、人卵巢癌细胞凋亡产生了微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成）
[0045] 1、实验材料和试剂
[0046] H22小鼠肝癌细胞，A2780人卵巢癌细胞，阿霉素（可商购获得，临床常用化疗药， 带有红色荧光）。
[0047] 2、实验步骤
[0048] 1)在DMEM细胞培养液中培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量达到2X107;培养 A2780人卵巢癌细胞，使细胞量达到2 X IO7 ；将上述H22小鼠肝癌细胞培养液分为两组，每组包括一半数量的H22小鼠肝癌细胞；同样将A2780人卵巢癌细胞培养液分为两组，每组包括一半数量的A2780人卵巢癌细胞。
[0049] 2)第1天，对取出的第一组H22小鼠肝癌细胞（带细胞培养液）施用阿霉素，使阿霉素在培养液中的终浓度为100yg/ml ；对取出的从第二组H22小鼠肝癌细胞（带细胞培养液）不做处理；
[0050] 对取出的第一组A2780人卵巢癌细胞（带细胞培养液）施用阿霉素，使阿霉素在培养液中的终浓度为100μ g/ml ；对取出的第二组A2780人卵巢癌细胞（带细胞培养液）不做处理。
[0051] 3)在施用阿霉素后的48小时，第一组H22小鼠肝癌细胞以及第一组A2780人卵巢癌细胞出现明显变小、暗淡状态，可以认为肿瘤细胞已经因药物诱导而凋亡。分别对两组凋亡肿瘤细胞实施分离取上清进行逐步离心，即以500rpm、1000rpm、5000rpm的转速各离心10分钟，之后以14000g的离心力离心1分钟，以除去细胞及碎片，取离心后的上清进一步离心，再以14000g的离心力离心1小时，分别得到来自第一组H22小鼠肝癌细胞和第一组A2780人卵巢癌细胞凋亡所产生的微颗粒，作为实验组；对第二组H22小鼠肝癌细胞和第二组A2780人卵巢癌细胞同样实施相同的离心步骤，获得细胞囊泡（尽管对照组在正常培养条件下，但也会有由于细胞死亡而释放的少量细胞囊泡），作为对照组。
[0052] 3、实验结果
[0053] 分别将上述实验组的微颗粒和对照组的细胞囊泡使用0.9% (g/ml)的生理盐水重悬后，分别涂片，然后在双光子荧光显微镜下观察，从图IA-图ID可以看出，作为对照组的，来自没有施用阿霉素的第二组H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡涂片后没有观察到红色 (见图1A)，来自没有施用阿霉素的第二组A2780人卵巢癌细胞的细胞囊泡涂片后也没有观察到红色（见图1C)；作为实验组，来自施用阿霉素的第一组H22小鼠肝癌细胞的微颗粒， 涂片后观察到红色的微颗粒（见图1B)，来自施用阿霉素的第一组A2780人卵巢癌细胞的微颗粒，涂片后观察到红色的微颗粒（见图1D)，由于单个的阿霉素分子极小，无法使用荧光显微镜分辨，只有被包裹后才能聚集而被观察到，而在荧光显微镜下观察到的红色，正是细胞囊泡包裹化疗药物阿霉素所发出的红光，可以看出肿瘤细胞经化疗药处理后，形成了由细胞囊泡包裹化疗药形成的微颗粒，大小在1 μ m左右，证实细胞囊泡包裹了化疗药。
[0054] 实施例2 ：分别使用紫外线诱导小鼠肝癌细胞、人卵巢癌细胞凋亡产生细胞囊泡与化疗药孵育后获得包裹化疗药的微颗粒[0055] 1.实验材料和试剂
[0056] 使用的H22小鼠肝癌细胞以及A2780人卵巢癌细胞同实施例1，紫外线装置为常规细胞超净工作台所有，阿霉素同实施例1。
[0057] 2、实验步骤
[0058] 1)培养H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞，使细胞量分别达到2X107，培养方法同实施例1，将上述H22小鼠肝癌细胞培养液分为两组，每组包括一半数量的H22小鼠肝癌细胞，同样将A2780人卵巢癌细胞培养液分为两组，每组包括一半数量的A2780人卵巢癌细胞。
[0059] 2)第1天，对所有的H22小鼠肝癌细胞（带细胞培养液）和A2780人卵巢癌细胞 (带细胞培养液）均使用紫外线照射30分钟。
[0060] 3)在紫外线照射后的48小时，所有的H22小鼠肝癌细胞和所有的A2780人卵巢癌细胞出现明显变小、暗淡的状态，确认这些肿瘤细胞已经被紫外线诱导凋亡，分别对两种凋亡肿瘤细胞的培养液的上清进行逐步离心，方法同实施例1，分别得到来自两种肿瘤细胞的细胞囊泡。
[0061] 4)将由第一组H22小鼠肝癌细胞和第一组A2780人卵巢癌细胞获得的的细胞囊泡分别使用Iml的0.9% (g/ml)的生理盐水进行重悬后，分别加入阿霉素，使阿霉素终浓度为200 μ g/ml阿霉素，然后在室温孵育2小时，之后以14000g的离心力离心1小时，获得微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成），作为实验组；将来自第二组H22小鼠肝癌细胞和第二组 A2780人卵巢癌细胞获得的细胞囊泡（没有包裹化疗药）不做处理，作为对照组。
[0062] 3、实验结果
[0063] 将来自上述实验组的微颗粒和对照组的细胞囊泡使用0.9% (g/ml)的生理盐水重悬后，分别涂片后在双光子荧光显微镜下观察，从图2A-图2D可以看出，作为对照组，来自没有施用阿霉素的第二组H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡没有观察到红色（见图2A)，没有施用阿霉素的第二组A2780人卵巢癌细胞的细胞囊泡，涂片后也没有观察到红色（见图 2C)；作为实验组，来自施用阿霉素的第一组H22小鼠肝癌细胞的微颗粒，涂片后观察到红色的微颗粒（见图2B)，来自施用阿霉素的第一组A2780人卵巢癌细胞的微颗粒，涂片后观察到红色的微颗粒（见图2D)，证实肿瘤细胞经紫外线处理后，释放了细胞囊泡，大小在 Iy m左右，并且与化疗药孵育后，该细胞囊泡包裹了化疗药（可参考实施例1中的相关说明），成为图中显示的微颗粒。
[0064] 实施例3 ：紫外线诱导小鼠肝癌细胞系产生的细胞囊泡可被小鼠肝癌细胞摄取
[0065] 1、实验材料和试剂
[0066] 使用的H22小鼠肝癌细胞以及紫外线装置同实施例1，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE)(绿色荧光染料，可商购获得），PKH26 (红色荧光染料，可商购获得）。
[0067] 2、实验步骤
[0068] 1)培养2X107个的H22小鼠肝癌细胞，培养方法同实施例1，将上述培养好的H22 小鼠肝癌细胞分为相同量的两组。
[0069] 2)对第一组细胞，采用绿色荧光染料CFSE按常规方法进行标记。
[0070] 对第二组细胞，采用红色荧光染料ΡΚΪΏ6按常规方法进行标记，标记后的H22小鼠肝癌细胞显示红色荧光（见图3B)。[0071] 3)第1天，对上述标记好绿色荧光染料的第一组细胞使用紫外线照射30分钟。
[0072] 4)在紫外线照射后的48小时，第一组H22小鼠肝癌细胞出现明显变小、暗淡状态， 对小鼠肝癌细胞的培养液的上清进行逐步离心，方法同实施例1，得到来自小鼠肝癌细胞的细胞囊泡，该细胞囊泡显示绿色荧光（见图3A)。
[0073] 5)将上述分离到的来自第一组H22小鼠肝癌细胞的绿色荧光细胞囊泡和第二组红色荧光H22小鼠肝癌细胞进行孵育。
[0074] 3、实验结果
[0075] 将绿色荧光细胞囊泡和红色荧光H22小鼠肝癌细胞孵育4小时后，清洗小鼠肝癌细胞3次，对小鼠肝癌细胞进行涂片，然后在荧光显微镜下观察，可见绿色荧光细胞囊泡进入红色荧光小鼠肝癌细胞（见图3C)，且红色荧光和绿色荧光重叠显示黄色（见图3D)，表明细胞囊泡能够被肿瘤细胞摄取。
[0076] 实施例4 ：化疗药诱导小鼠肝癌细胞系产生的微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成） 被小鼠肝癌细胞摄取后对小鼠肝癌细胞具有显著的杀伤作用
[0077] 1、实验材料和试剂
[0078] 使用的H22小鼠肝癌细胞以及A2780人卵巢癌细胞同实施例1，化疗药甲氨蝶呤、 顺钼均可商购获得。
[0079] 2、实验步骤
[0080] 1)培养H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞，使细胞量分别达到3 X IO7个，培养方法同实施例1，将得到的H22小鼠肝癌细胞培养液分为三组，每组包括1/3数量的H22 小鼠肝癌细胞，同样将A2780人卵巢癌细胞培养液分为三组，每组包括1/3数量的A2780人卵巢癌细胞。
[0081] 2)第1天，从第一组H22小鼠肝癌细胞中，取Iml 5X106H22小鼠肝癌细胞施用 IOyg化疗药甲氨蝶呤；同时从第一组H22小鼠肝癌细胞中取Iml 5X 106A2780人卵巢癌细胞施用100 μ g化疗药顺钼；
[0082] 从第二组H22小鼠肝癌细胞中取Iml 5 X 106H22小鼠肝癌细胞，使用紫外线照射 30分钟；同时从第二组H22小鼠肝癌中取Iml 5X106A2780人卵巢癌细胞使用紫外线照射 30分钟；
[0083] 对第三组H22小鼠肝癌细胞和第三组A2780人卵巢癌细胞，不进行任何处理。
[0084] 3)在施用化疗药后的48小时，按照实施例1的方法收集来自第一组H22小鼠肝癌细胞和第一组A2780人卵巢癌细胞的微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成），作为实验组；在紫外线照射后的48小时，按照实施例2的方法收集来自第二组H22小鼠肝癌细胞和第二组 A2780人卵巢癌细胞的细胞囊泡（没有包裹有化疗药），作为对照组。
[0085] 4)从上述实验组取一半量的微颗粒，并从对照组取一半量的细胞囊泡分别与从第三组细胞的各肿瘤细胞中取出的5X IO4肿瘤细胞在24-孔板中共同培养72小时，观察肿瘤细胞的死亡，其中与肿瘤细胞共同培养的细胞囊泡应为从同种类型肿瘤细胞获得的细胞囊泡，与肿瘤细胞共同培养的微颗粒应为从同种类型肿瘤细胞获得的细胞囊泡包裹化疗药后形成的微颗粒；
[0086] 同时还从第三组H22小鼠肝癌细胞和第三组A2780人卵巢癌细胞中取出5X IO6个 H22小鼠肝癌细胞施用单纯的化疗药甲氨蝶呤10 μ g，同时取出5X106fA2780人卵巢癌细胞施用单纯的化疗药顺钼100 μ g，观察肿瘤细胞的死亡，施用72小时后，观察肿瘤细胞的死亡。
[0087] 3、实验结果
[0088] 结果显示，不含化疗药的对照组细胞囊泡不能够诱导肿瘤细胞死亡（见图4A和图 4D)；单纯的化疗药甲氨蝶呤、顺钼分别杀伤了 H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞，但仍有一定量的肿瘤细胞存活（见图4B和图4E)；而含化疗药的微颗粒则能够使几乎全部的肿瘤细胞死亡（见图4C和图4F)，证实本发明以细胞囊泡包裹化疗药形成的微颗粒为主要成分的肿瘤化疗药制剂在施用到肿瘤细胞后，大大提高了作为有效成分的化疗药的施用效果。[0089] 实施例5 ：包裹化疗药的微颗粒体杀伤肿瘤细胞后，被杀伤的肿瘤细胞可进一步产生包裹化疗药的微颗粒对剩余肿瘤细胞进行杀伤
[0090] 1、实验材料和试剂
[0091] 使用的H22小鼠肝癌细胞以及A2780人卵巢癌细胞同实施例1，化疗药甲氨蝶呤、 顺钼均可商购获得。
[0092] 2、实验步骤
[0093] 1)培养H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞，使细胞量分别达到3 X IO8个， 培养方法同实施例1，将上述培养好的H22小鼠肝癌细胞培养液分为三组，每组包括1/3数量的H22小鼠肝癌细胞，同样将A2780人卵巢癌细胞培养液分为三组，每组包括1/3数量的 A2780人卵巢癌细胞。
[0094] 2)第1天，从第一组H22小鼠肝癌细胞中，取IOml的5 X 107H22小鼠肝癌细胞施用IOOyg化疗药甲氨蝶呤；同时从第一组H22小鼠肝癌细胞中取IOml的5X10TA2780人卵巢癌细胞施用1000 μ g化疗药顺钼；
[0095] 从第二组H22小鼠肝癌细胞中取IOml的5X l(fH22小鼠肝癌细胞，使用紫外线照射30分钟；同时从第二组H22小鼠肝癌中取IOml的5X 10TA2780人卵巢癌细胞使用紫外线照射30分钟；
[0096] 对第三组H22小鼠肝癌细胞和第三组A2780人卵巢癌细胞，不进行任何处理。
[0097] 3)在施用化疗药后的48小时，按照实施例1的方法收集来自第一组H22小鼠肝癌细胞和第一组A2780人卵巢癌细胞的微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成），作为实验组；在紫外线照射后的48小时，按照实施例2的方法收集来自第二组H22小鼠肝癌细胞和第二组 A2780人卵巢癌细胞的细胞囊泡（没有包裹有化疗药），作为对照组。
[0098] 4)将上述实验组的微颗粒和对照组的细胞囊泡分别与从第三组H22小鼠肝癌细胞和第三组A2780人卵巢癌细胞的各肿瘤细胞中取出的第一批5 X IO6个H22小鼠肝癌细胞和5 X IO6个A2780人卵巢癌细胞肿瘤细胞在6-孔板中在DMEM细胞培养液共培养12小时， 更换新的培养液，继续培养72小时后，从培养液中分离新的实验组微颗粒和新的对照组细胞囊泡，将所分离的新的实验组微颗粒和新的对照组细胞囊泡分别与从第三组H22小鼠肝癌细胞和第三组A2780人卵巢癌细胞中再次取出的5X104fH22小鼠肝癌细胞和5 X IO4 个A2780人卵巢癌细胞在24-孔板中共同培养，采用PI染料分别对24-孔板培养好的施用实验组微颗粒和对照组细胞囊泡的第二批肿瘤细胞进行染色，然后通过流式细胞仪观察第二次取出的肿瘤细胞的死亡状况，结果如图5所示。[0099] 3、实验结果
[0100] 由图5可以看出，对第二次取出的肿瘤细胞施用新的实验组微颗粒，对该肿瘤细胞仍具有高达90%的杀伤能力，而施用新的对照组细胞囊泡，对该肿瘤细胞基本没有杀伤能力，表明被实验组微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成）杀伤的第一批肿瘤细胞可进一步产生新的包裹化疗药的实验组微颗粒，并对第二次取出的肿瘤细胞进一步杀伤；没有包裹化疗药的对照组细胞囊泡，则不具有上述功能。本发明的肿瘤化疗药制剂具有对肿瘤细胞的连续杀伤能力，针对所要获得的肿瘤细胞的杀伤效果，以及不同类型的肿瘤细胞，本领域技术人员可根据本发明描述的方法对化疗药的施用量进行适当的选择。
[0101] 实施例6 ：包裹化疗药的微颗粒对机体的毒副作用实验
[0102] 1、实验材料和试剂
[0103] 使用的H22小鼠肝癌细胞以及A2780人卵巢癌细胞同实施例1，化疗药甲氨蝶呤、 顺钼均可商购获得，16只BALB/c小鼠和16只SCID (严重联合免疫缺陷）小鼠购自武汉大学医学动物中心。
[0104] 2、实验步骤
[0105] 1)培养H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞，使细胞量分别达到2X107，培养方法同实施例1。
[0106] 2)从上述培养的细胞中取Iml的5X l(fH22小鼠肝癌细胞培养液施用100 PgK 疗药甲氨蝶呤，取Iml的5X106A2780人卵巢癌细胞培养液施用ΙΟΟΟμ g化疗药顺钼。
[0107] 3)在施用化疗药后的48小时，按照实施例1的方法收集来自H22小鼠肝癌细胞和 A2780人卵巢癌细胞的微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成），将从Iml上清中所制备微颗粒定为1只小鼠的用量。
[0108] 4)将所制备的包裹化疗药（甲氨蝶呤）的H22小鼠肝癌细胞的微颗粒分别经尾静脉注射8只小鼠BALB/c小鼠，作为实验组1，将所制备的包裹化疗药（顺钼）的A2780人卵巢癌细胞的微颗粒分别经尾静脉注射8只小鼠SCID小鼠，作为实验组2 ；同时对另外8只小鼠BALB/c小鼠和8只小鼠SCID小鼠注射0. 9% (g/ml)的生理盐水，分别作为对照组1， 对照组2 ；同样的操作和给药量，实验组每天注射包裹化疗药的微颗粒一次，连续14天，对照组每天注射0.9% (g/ml)的生理盐水一次，连续14天。
[0109] 5)第15天，分别对实验组1，实验组2和对照组1，对照组2小鼠取静脉血，检测血清中谷丙转氨酶和肌酐含量，并称量小鼠体重。
[0110] 3、实验结果
[0111] 由图6A-图6C可以看出，相比于注射生理盐水的对照组小鼠，注射包裹化疗药 (甲氨蝶呤或顺钼）的微颗粒的实验组小鼠的谷丙转氨酶和肌酐含量没有明显变化（见图 6A和图6B)，体重也无变化（见图6C)。可见，将细胞囊泡作为靶向药物载体包裹化疗药得到的肿瘤化疗药物制剂对机体基本没有毒副作用。
[0112] 实施例7 ：包裹化疗药的微颗粒抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活时间
[0113] 1、实验材料和试剂
[0114] 使用的H22小鼠肝癌细胞以及A2780人卵巢癌细胞同实施例1，化疗药甲氨蝶呤、 顺钼均可商购获得，BALB/c小鼠，SCID小鼠。
[0115] 2、实验步骤[0116] 1)培养H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞，使细胞量分别达到3 X IO7个， 培养方法同实施例1。
[0117] 2)从上述培养的细胞中取Iml的5Xl(fH22小鼠肝癌细胞（带培养液）施用 IOOyg化疗药甲氨蝶呤，以及取Iml的5X 106A2780人卵巢癌细胞（带培养液）施用 1000 μ g化疗药顺钼；在施用化疗药后的48小时，按照实施例1的方法收集来自H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞的微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成），将从Iml上清中所制备的所述微颗粒的量定为1只小鼠的用量。
[0118] 再从上述培养的细胞中取Iml的5Xl(fH22小鼠肝癌细胞（带培养液）和 5X106A2780人卵巢癌细胞（带培养液）给予紫外线照射48小时后，按照实施例2的方法分别收集H22小鼠肝癌细胞和A2780人卵巢癌细胞的细胞囊泡（没有包裹有化疗药），其量定为1只小鼠的用量。
[0119] 3)第1天，从上述培养的细胞中取1 X 105H22小鼠肝癌细胞腹腔接种到BALB/c小鼠，共注射小鼠32只，获得患H22肝癌细胞腹水癌的BALB/c小鼠，随机分为等数量的两组； 从上述培养的细胞中取1X106A2780人卵巢癌细胞细胞腹腔接种严重联合免疫缺陷SCID 小鼠，共注射小鼠32只，获得患卵巢癌的SCID小鼠，也随机分为等数量的两组。
[0120] 4)第2天开始，将步骤2)制备得到的来自H22小鼠肝癌细胞的微颗粒按照确定剂量腹腔注射步骤幻获得的患肝癌的第一组BALB/c小鼠，每天一次，连续7天，第8天起正常饲养，作为实验组；对第二组患肝癌的BALB/c小鼠注射由步骤2)制备得到的细胞囊泡， 每天一次，连续7天，第8天起正常饲养，作为对照组；
[0121] 同样的，从第2天开始，将步骤2、所制备得到的来自A2780人卵巢癌细胞的微颗粒剂按照确定剂量腹腔注射步骤幻获得的患卵巢癌的第一组SCID小鼠，每天一次，连续7 天，第8天起正常饲养，作为实验组；对第二组小鼠患卵巢癌的SCID小鼠注射由步骤2)制备得到的细胞囊泡，每天一次，连续7天，第8天起正常饲养，作为对照组。
[0122] 3、实验结果
[0123] 将实验组和对照组中的BALB/c小鼠都分为等数量的两组，实验组中第一组BALB/ c小鼠和对照组中第一组BALB/c小鼠分别于第10天处死，测量腹水体积（图7A)，实验组中第二组BALB/c小鼠和对照组中第二组BALB/c小鼠分别用于观察存活时间（图7B)；
[0124] 将实验组和对照组中的SCID小鼠都分为等数量的两组，实验组中第一组SCID小鼠和对照组中第一组SCID小鼠分别于第30天处死，计算腹腔瘤结节形成数目（图7C)，实验组中的第二组SCID小鼠和对照组中第二组SCID小鼠分别用于观察存活时间（图7D)。
[0125] 结果表明，相比于对照组，实验组中H22小鼠肝癌细胞来源的包裹甲氨蝶呤的微颗粒显著抑制BALB/c小鼠的H22肝癌细胞的生长，并延长BALB/c小鼠的存活时间；同样地，A2780人卵巢癌细胞细胞来源的包裹顺钼的微颗粒显著抑制SCID小鼠的A2780卵巢癌细胞的生长，并延长SCID小鼠的存活时间。
[0126] 实施例8 ：本发明的方案对更多肿瘤细胞的应用
[0127] 1、实验材料和试剂
[0128] 不同肿瘤细胞系包括：人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系 SNU1、人结肠癌Caco2、人肝癌细胞系H印G2、人膀胱癌细胞系T24、人白血病细胞系K562、人胶质瘤细胞系U251 ；[0129] 化疗药甲氨蝶呤可商购获得。
[0130] 2、实验步骤
[0131] 1)在DMEM培养液中分别培养上述肿瘤细胞系，使细胞量分别达到2X IO8个，将培养好的上述各肿瘤细胞系分为两组。
[0132] 2)对第一组，将100 μ g化疗药甲氨蝶呤分别加入到IOml的5X IO7上述培养好的各肿瘤细胞培养液中获得源自各肿瘤细胞的含有甲氨蝶呤的微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成）；对第二组，使用紫外线照射IOml的5 X IO7的各肿瘤细胞30分钟，获得源自各肿瘤细胞的不含甲氨蝶呤的细胞囊泡。
[0133] 3)在施用化疗药后的48小时，按照实施例1的方法收集来自第一组的各肿瘤细胞系的微颗粒，作为实验组；按照实施例2的方法收集来自第二组的各肿瘤细胞系的细胞囊泡，作为对照组。
[0134] 4)取制备好的实验组一半量的微颗粒和对照组一半量的细胞囊泡分别与5X IO6 相对应的肿瘤细胞在6-孔板中共培养72小时后，采用PI染料分别对施用实验组微颗粒和对照组细胞囊泡的肿瘤细胞进行染色，染色方法同实施例5，然后通过流式细胞仪观察各肿瘤细胞的死亡状况，结果如图8所示。
[0135] 3、实验结果
[0136] 由图8可以看出，各肿瘤细胞来源的包裹化疗药的微颗粒针对其来源的肿瘤细胞系均具有90%左右的杀伤率，说明本发明提供的肿瘤化疗药制剂及其制备方法适用于多种肿瘤细胞，并且均可获得良好的化疗效果。
[0137] 实施例9 ：包裹化疗药的微颗粒体经血液可靶向到实体肿瘤
[0138] 1、实验材料和试剂
[0139] 使用的H22小鼠肝癌细胞同实施例1，化疗药阿霉素以及BALB/c小鼠均可商购获得。
[0140] 2、实验步骤[0141 ] 1)培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量达到3 X IO7,将上述H22小鼠肝癌细胞培养液分为两组，每组包括一半数量的H22小鼠肝癌细胞；同样将A2780人卵巢癌细胞培养液分为两组，每组包括一半数量的A2780人卵巢癌细胞。
[0142] 2)对从第一组H22小鼠肝癌细胞（带细胞培养液）取出的Iml的1 X 107H22小鼠肝癌细胞培养液施用300 μ g化疗药阿霉素；在施用化疗药后的48小时，按照实施例1的方法收集来自H22小鼠肝癌细胞的微颗粒（细胞囊泡包裹化疗药形成），将从Iml上清中所制备的所述微颗粒的量定为1只小鼠的用量；
[0143] 对从第二组H22小鼠肝癌细胞（带细胞培养液）取出的Iml的1 X 107H22小鼠肝癌细胞给予紫外线照射后的48小时，按照实施例2的方法收集H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡（没有包裹有化疗药），作为对照组，其量定为1只小鼠的用量。
[0144] 3)第1天，分别将2Χ1(^Η22小鼠肝癌细胞皮下接种到BALB/c小鼠，共注射小鼠 12只，获得患皮下肝癌的BALB/c小鼠，随机分为二组。
[0145] 4)第15天开始，将步骤幻制备得到的来自第一组H22小鼠肝癌细胞的微颗粒按照确定剂量尾静脉注射步骤3)获得的患肝癌的第一组BALB/c小鼠，作为实验组；用步骤 2)制备得到的来自第二组H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡注射第二组患肝癌的BALB/c小鼠，作为对照组；6小时后，取肿瘤组织进行冰冻切片，荧光显微镜观察。
[0146] 3、实验结果
[0147] 由图9A-图9B可以看出，来自第一组H22小鼠肝癌细胞的包裹阿霉素的微颗粒经血流被靶向到肿瘤组织，显示出红光（如图9B所示），而注射来自第二组H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡后的肿瘤组织未见荧光（如图9A所示），说明本发明提供的包裹化疗药物的微颗粒可以作为靶向药而选择性定位杀伤肿瘤。
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