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酪氨酸酶多肽抑制剂

阅读：870发布：2020-11-15

专利汇可以提供酪氨酸酶多肽抑制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种酪氨酸酶抑制剂，该抑制剂系由多肽组成。该多肽中一个或多个氨基酸进一步经过乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、脂质修饰、甲基化或磷酸化修饰。本发明的酪氨酸酶抑制剂可做为医药组合物，其包含上述多肽，更包含一种医药可接受载剂。本发明的医药组合物，其通过酪氨酸酶活性抑制进而抑制黑色素的生成，并可应用于化妆品，例如作为美白剂。，下面是酪氨酸酶多肽抑制剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种酪氨酸酶抑制剂，其特征是包括如下多肽序列：
R1n1-Xaa-R2n2-Yaa-R3n3
其中Xaa或Yaa为酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸或精氨酸中的一种，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。
2.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂，其特征是所述多肽序列为：
R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3
或
R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3，
其中取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。
3.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂，其特征是所述多肽序列为：
R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3
或
R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3，
其中取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。
4.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂，其特征是所述多肽序列为：
R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3
或
R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3，
其中取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。
5.根据权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂，其特征是所述多肽序列为：
R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3
或
R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，
其中取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。
6.一种酪氨酸酶抑制剂，其特征是含有多肽序列选自Tyr-Cys-Cys、Glu-Cys-Val、Cys-Arg、Cys-Asp-Tyr、Arg-Tyr-Cys-Arg、Asp-Cys-Gly、Arg-Cys-Tyr-Arg、Cys-Gly-Ser、Asn-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys、Arg-Cys-Tyr-Val、Val-Cys-Gly、Cys-Gly-Tyr、Tyr-Phe-Cys、Cys-Val、Arg-Phe-Tyr-Cys、Gly-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys-Arg、Cys-Tyr-Gly、Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Tyr-Phe-Arg或Tyr-Asp的一种或多种。
7.一种酪氨酸酶抑制剂，其特征是含有多肽序列选自 Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Gly-Cys-Tyr、Tyr-Phe-Arg或Tyr-Asp中的一种或多种。
8.根据权利要求1-7任一所述的酪氨酸酶抑制剂，其特征是所述多肽序列中的一个或多个氨基酸经过乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、脂质修饰、甲基化或磷酸化修饰。
9.一种抑制酪氨酸酶活性的医药组合物，其特征是含有如权利要求1-7任一所述酪氨酸酶抑制剂。
10.根据权利要求9所述的医药组合物，其特征是还包括一种医药学上可接受载体。
11.根据权利要求10所述的医药组合物，其特征是所述载体为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、界面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料。
12.一种如权利要求9所述的医药组合物的应用，其特征是应用于化妆品、农产品或美白剂。
13.一种减少哺乳动物皮肤中黑色素含量的方法，其特征是包括将权利要求1-7任一所述的酪氨酸酶抑制剂传输至哺乳动物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征是所述酪氨酸酶抑制剂为通过口服、经皮吸收、注射或吸入的方式进行传输。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征是所述的酪氨酸酶抑制剂还包含一种医药学上可接受的载体。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征是所述的哺乳动物为人类。

说明书全文

酪氨酸酶多肽抑制剂

技术领域

[0001] 本发明涉及一种酪氨酸酶抑制剂，特别是涉及一种含有多肽的酪氨酸酶抑制剂。

背景技术

[0002] 1.黑色素的来源及功能

[0003] 在胚胎发育时，由神经嵴(neuralcrest)分化出的黑色素细胞(melanocytes)，会分布在皮肤(表皮基底层)、眼睛-视网膜色素上皮、葡萄膜(uvealtract)、毛囊基质、耳朵-血管纹(striavascularis)、黏膜和中枢神经系统-软脑膜(leptomeninges)。在黑色素细胞中有一膜结合(membrane-bound)胞器称为黑色素体(melanosomes)会合成黑色素(melanin)，当黑色素合成出來后，会由黑色素细胞的树枝状突起移动至邻近的角质细胞(keratinocytes)，进而呈现出皮肤的颜色，而皮肤颜色的不同主要是因为黑色素的产生和分布不同。黑色素的主要功能是吸收阳光中的紫外光(UV)，保护皮肤避免受到紫外光的伤害，并且能移除活性氧(reactive oxygen species，ROS)，以减少自由基对正常细胞的伤害。

[0004] 2.黑色素的生合成路径

[0005] 酪氨酸(tyrosine)是黑色素生合成中重要的受质。在反应中，酪氨酸先被羟基化(hydroxylation)：经由酪氨酸酶(tyrosinase)的催化，在羟基(hydroxyl group)的邻位碳加上一个羟基，形成多巴(L-3，4-dihydroxyphenylalanine，L-dopa)，接着再将多巴转换成多巴醌(dopaquinone)。然后多巴醌会走两个途径，第一个途径，会经由酪氨酸酶相关蛋白的催化形成带棕、黑色的真黑色素(eumelanin)；另一个途径，多巴醌经由谷胱甘肽(glutathione)或半胱氨酸(cysteine)的作用，生成带黄、红色的深黑色素(pheomelanin)，如图1所示。

[0006] 3.酪氨酸酶的催化机制

[0007] 酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)在黑色素的生合成中扮演很重要的角色。它是一种多功能、具醣基化的含铜穿膜蛋白，存在于黑色素细胞中，在哺乳类中分子量大小约为60-70kD，且通常专一表现在黑色素细胞中，属于第三型含铜蛋白质(Type 3copperprotein)，在进行催化反应时，铜离子是很重要的辅助因子。在催化过程中，活化位的结构有三个不同形式，各自扮演不同的角色：分别为氧化态(Oxy-form)、还原态(Deoxy-form)、静止态(Met-form)。还原态酪氨酸酶不具活性，其活化位的铜离子带正一价且不含氧离子，在催化反应中，还原态酪氨酸酶需经氧化作用，失去2个电子形成氧化态酪氨酸酶，此时活化位中具有带正二价铜离子及带负一价氧离子，氧化态酪氨酸酶可接受2种受质，分别为酪氨酸和多巴，当和酪氨酸结合时，会生成静止态酪氨酸酶-多巴复合体(Met-E-Dopa)，在释放出多巴醌后，酪氨酸酶又变成还原态继续循环；另一方面当与多巴结合时，除了生成多巴醌外，同时酪氨酸酶也由氧化态变成静止态，此形式的酪氨酸酶如果和多巴作用会生成多巴醌，如果和酪氨酸结合，会形成不具催化作用的复合体而不会继续黑色素生成途径。由此可知，在催化过程中，氧化态酪氨酸酶扮演着重要的角色，如图2所示。

[0008] 4.酪氨酸酶的影响

[0009] 酪氨酸酶是造成水果和蔬菜在贮存或加工时产生酵素性褐变的原因，褐变对某些产品的制造，可以赋予产品特殊的色泽及风味，例如红茶、葡萄干，但对大部分生鲜蔬果而言，酪氨酸酶是使得蔬菜水果的颜色和气味改变、组织软化、降低其消化性、抑制蛋白水解和糖分解的酵素，酪氨酸酶在催化过程中所产生的非营养及有毒化合物可能进一步使营养价值丧失，甚至影响食品的安全。在2003年Dr.Asanuma(参考文献Neurotox Res 5，p165-76，2003)则指出酪氨酸酶可能和帕金森氏症(Parkinson’s disease)以及其它的神经退化性疾病有关。

[0010] 5.酪氨酸酶抑制剂的应用

[0011] 5-1、在农业及食品工业上：

[0012] 蔬菜水果发生褐变后，会影响其外观、气味以及食用上的味道，这是种植者和食品工业者所关心的问题。而酵素性褐变的发生速率是依据组织内活化酪氨酸酶和酚类化合物的浓度、可利用的氧气、pH值和温度等条件来决定。因此，利用不同方法来停止由酪氨酸酶引起的酵素性褐变是必要的。酪氨酸酶抑制剂应用在食品工业上也行之有年，传统常用的褐变反应抑制剂有抗坏血酸(ascorbic acid)、柠檬酸(citric acid)及亚硫酸盐等，虽然亚硫酸盐的抑制效果极佳，但却有严重的副作用，因此，寻找天然且无害的酪氨酸酶抑制剂有其必要性。

[0013] 5-2、在化妆品工业：

[0014] 酪氨酸酶抑制剂在化妆品工业上越来越重要是因为其具有美白功能。先前已发现的天然抑制剂包括熊果素(Arbutin)、曲酸(Kojic acid)、亚麻油酸(Linoleic acid)、对苯二酚(Hydroquinones)等，但仅有少数被用做皮肤美白剂，主要是因为这些天然的酪氨酸酶抑制剂可能会引发副作用。

[0015] 目前卫生署核准使用于美白化妆品的八种成分，如维他命C磷酸镁盐(Magnesium Ascorbyl Phosphate)、维他命C磷酸钠盐(Sodium Ascorbyl Phosphate)、维他命C醣苷(Ascorbyl Glucoside)、曲酸(Kojioc Acid)、熊果素(Arbutin)、鞣花酸(Ellagic Acid)、止血环酸(Tranexamic acid)和洋甘菊萃取物(Chamomile ET)，其中曲酸和熊果素即为酪氨酸酶抑制剂，可经由抑制酪氨酸酶达到美白的功能，亦是美白保养品受欢迎的成分。

[0016] 熊果素是由越橘科植物熊果叶抽取而得，一些水果中也可以发现熊果素的踪迹，例如西洋梨、小山梨。熊果素的结构与卫生署公告列为药品之对苯二酚相似，经皮肤吸收后会被水解成对苯二酚与葡萄糖，因此，其作用机转与对苯二酚雷同，都是透过抑制酪氨酸酶的活性，淡化已形成的黑色素，然而对苯二酚可同时抑制黑色素形成和破坏黑色素细胞，使用初期美白及除斑的效果很好，但却会对皮肤造成永久性伤害，如产生其它斑点或腐蚀皮肤，由于熊果素的结构比对苯二酚多带了葡萄糖分子，因此刺激性较低，而得以在保养品中出现，但是因为它还是必须还原成对苯二酚才能作用，因而引起部份人士怀疑，认为仍有机会产生类似对苯二酚的副作用，但至目前为止卫生署仍将熊果素公告为核可的美白成分，且规定熊果素在保养品中的浓度必须在7％以下，避免高浓度的熊果素使皮肤免疫力下降。

[0017] 曲酸是从曲菌萃取出的成分，在黑色素形成过程中，铜离子扮演催化角色，而曲酸可以抓住铜离子，抑制黑色素形成，使色素生成细胞代谢正常，抑制黑斑或雀斑，达到美白功效。Dr.Noh在2007年(参考文献Biopolymers 88，p300-7，2007)指出在曲酸-三肽的羧酸端加上氨基，将有助于提高其抗酸碱能力、耐热性、存放的稳定度以及酪氨酸酶的抑制效果。然而近期日本厚生省怀疑曲酸作为食品添加物有致癌危险，目前已停止使用于食品之中，化妆品类则要求进行临床测试，以评估曲酸是否禁用。自日本政府公告禁用曲酸食品添加物后，含曲酸的保养品是否安全，各家说法纷纭，直至目前为止并无明确数据与研究证实其有危害，台湾卫生署目前仍将曲酸公告为核可的美白成分，并规定曲酸在保养品中的浓度必须在2％以下。

[0018] 虽然目前卫生署公布核准使用于美白化妆品的成分有八种，但部分种类仍有安全性的疑虑，对美白我们必须抱持正确期待，不应有立即见效的想法，为拥有健康且白皙的肌肤，如何做好有效且安全的美白，是目前美白化妆品领域中重要的课题。

[0019] 为解决目前美白化妆品领域所遇到的问题，美国专利申请案20090099093A1提供一种酪氨酸酶抑制剂，该抑制剂由一多肽组成，该多肽序列包含6至8个氨基酸，相较于现有技术所使用化合物作为酪氨酸酶抑制剂，该案所使用的多肽更具安全性，效果温和而易于人体吸收和代谢，然而多肽合成的费用是厂商进行酪氨酸酶抑制剂商品化的一大考虑，多肽合成长度越长费用越高，此外多肽的运送方式亦为考虑重点，2008年Dr.Agarwal S(参考文献Int J Pharm 359，7-14，2008)提出以适当的医药组合物运送，可提高肽类前驱物(peptide prodrug)的水溶性、渗透力等，避免肽类前驱物在过程中受到蛋白酶的分解，进而维持药物的浓度。因此，研发一种既有效、安全且多肽长度更短的酪氨酸酶抑制剂，将是目前急欲解决的问题。

发明内容

[0020] 鉴于上述发明背景，研发一种既有效、安全且多肽长度更短的天然酪氨酸酶抑制剂，是当前急欲解决的问题。本发明依据酪氨酸酶的结构特性，设计一系列的酪氨酸酶抑制剂，经由体外酪氨酸酶活性实验测试、安全性测试结果以及活体动物实验的黑色素含量分析，证实本发明所提出的酪氨酸酶抑制剂具有显著的抑制效果。并且该酪氨酸酶抑制剂较现有技术所提出的肽序列更为有效、安全且长度更短。

[0021] 本发明所引用的氨基酸序列名称定义对照表：

[0022]英文中文缩写
Glycine 甘氨酸 Gly(G)
Alanine 丙氨酸 Ala(A)
Valine 缬氨酸 Val(V)
Leucine 亮氨酸 Leu(L)
Isoleucine 异亮氨酸 Ile(I)
Serine 丝氨酸 Ser(S)
Threonine 苏氨酸 Thr(T)
Cystine 半胱氨酸 Cys(C)
Methionine 甲硫氨酸 Met(M)
Proline 脯氨酸 Pro(P)
Lysine 赖氨酸 Lys(K)
Arginine 精氨酸 Arg(R)
Phenylalanine 苯丙氨酸 Phe(F)
Tyrosine 酪氨酸 Tyr(Y)
Tryptophan 色氨酸 Trp(W)
Histidine 组氨酸 His(H)
Aspartate 天冬氨酸 Asp(D)
Glutamate 谷氨酸 Glu(E)
Asparagine 天冬酰氨 Asn(N)
Glutamine 谷氨酰胺 Gln(Q)

[0023]

[0024] 本发明内容所指的氨基酸的分类：

[0025] 1.脂肪性氨基酸类(Aliphatic)包括：丙氨酸(Alanine，A)、异亮氨酸(Isoleucine，I)、亮氨酸(Leucine，L)、缬氨酸(Valine，V)、脯氨酸(Proline，P)。

[0026] 2.芳香性氨基酸类(Aromatic)包括：苯丙氨酸(Phenylalanine，F)、色氨酸(Tryptophan，W)、酪氨酸(Tyrosine，Y)。

[0027] 3.酸性氨基酸类(Acidic)包括：天冬氨酸(Aspartic acid，D)、谷氨酸(Glutamicacid，E)。

[0028] 4.碱性氨基酸类(Basic)包括：精氨酸(Arginine，R)、组氨酸(Histidine，H)、赖氨酸(Lysine，K)。

[0029] 5.羟基氨基酸类(Hydroxylic)包括：丝氨酸(Serine，S)，、苏氨酸(Threonine，T)。

[0030] 6.含硫氨基酸类(Sulfur containing)包括：半胱氨酸(Cysteine，C)、甲硫氨酸(Methionine，M)。

[0031] 7.酰胺氨基酸类(Amidic)包括：天冬酰氨(Asparagine，N)、谷氨酰胺(Glutamine，Q)。

[0032] 本发明一方面提供一种酪氨酸酶抑制剂，其含有的多肽序列为

[0033] R1n1-Xaa-R2n2-Yaa-R3n3

[0034] 其中Xaa或Yaa为酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸或精氨酸中的一种，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。

[0035] 本发明另一方面提供一种酪氨酸酶抑制剂，其多肽序列为：R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3。

[0036] 本发明又一方面提供一种酪氨酸酶抑制剂，其多肽序列为：R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3。

[0037] 本发明再一方面提供一种酪氨酸酶抑制剂，其多肽序列为：R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3。

[0038] 本发明还提供一种酪氨酸酶抑制剂，其多肽序列为：R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3。

[0039] 其中，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。

[0040] 本发明酪氨酸酶抑制剂的多肽序列的详细说明：

[0041] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3

[0042] 其中，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。

[0043] 如下表1所示，多肽序列设计以各氨基酸官能基类型择一为代表，交叉排列成不同序列的短多肽。

[0044] 表1多肽序列设计及其例子

[0045]

[0046]

[0047] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3

[0048] 其中，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。

[0049] 如表2所示，其多肽序列设计以各氨基酸官能基类型择一为代表，交叉排列成不同序列短多肽。

[0050] 表2多肽序列设计及其例子

[0051]

[0052]

[0053] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3

[0054] 其中，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。

[0055] 如表3所示，其多肽序列设计以各氨基酸官能基类型择一为代表，交叉排列成不同序列的短多肽。

[0056] 表3多肽序列设计及其例子

[0057]

[0058]

[0059] (四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3

[0060] 其中，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种，且其中n1、n2或n3为取代基的数目，n1、n2、n3分别为0或1。

[0061] 如表4所示，其多肽序列设计以各氨基酸官能基类型择一为代表，交叉排列成不同序列的短多肽。

[0062] 表4多肽序列设计及其例子

[0063]

[0064]

[0065] 其中，本发明的酪氨酸酶抑制剂，所述的多肽序列优选为：

[0066] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、

[0067] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、

[0068] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3、

[0069] 或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，

[0070] 其中，n1＝0、n2＝0且n3＝1时，取代基R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种。

[0071] 特别是，本发明的酪氨酸酶抑制剂，所述的多肽序列优选为：

[0072] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、

[0073] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、

[0074] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3、

[0075] 或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，

[0076] 其中，n1＝0、n2＝1且n3＝0时，取代基R2选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种。

[0077] 特别是，本发明的酪氨酸酶抑制剂，所述的多肽序列优选为：

[0078] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、

[0079] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、

[0080] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3、

[0081] 或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，

[0082] 其中n1＝1、n2＝0且n3＝0时，取代基R1选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种。

[0083] 特别是，本发明的酪氨酸酶抑制剂，所述的多肽序列优选为：

[0084] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、

[0085] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、

[0086] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3、

[0087] 或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，

[0088] 其中n1＝1、n2＝0且n3＝1时，取代基R1或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种。

[0089] 特别是，本发明的酪氨酸酶抑制剂，所述的多肽序列优选为：

[0090] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、

[0091] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、

[0092] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3，

[0093] 或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，

[0094] 其中n1＝1、n2＝1且n3＝0时，取代基R1或R2选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种。

[0095] 特别是，本发明的酪氨酸酶抑制剂，所述的多肽序列优选为：

[0096] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、

[0097] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、

[0098] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3、

[0099] 或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，

[0100] 其中n1＝0、n2＝1且n3＝1时，取代基R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种。

[0101] 特别是，本发明的酪氨酸酶抑制剂，所述的多肽序列优选为：

[0102] (一)R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3、

[0103] (二)R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3、

[0104] (三)R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3、

[0105] 或(四)R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3，

[0106] 其中n1＝1、n2＝1且n3＝1时，取代基R1、R2或R3选自甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸或酰胺氨基酸中的一种或多种。

[0107] 本发明提供一种酪氨酸酶抑制剂，其含有多肽序列选自：

[0108] Tyr-Cys-Cys、Glu-Cys-Val、Cys-Arg、Cys-Asp-Tyr、Arg-Tyr-Cys-Arg、Asp-Cys-Gly、Arg-Cys-Tyr-Arg、Cys-Gly-Ser、Asn-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys、Arg-Cys-Tyr-Val、Val-Cys-Gly、Cys-Gly-Tyr、Tyr-Phe-Cys、Cys-Val、Arg-Phe-Tyr-Cys、Gly-Cys-Tyr、Phe-Tyr-Cys-Arg、Cys-Tyr-Gly、Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Tyr-Phe-Arg或Tyr-Asp的一种或多种。

[0109] 本发明再一方面提供一种酪氨酸酶抑制剂，其含有多肽序列选自Arg-Cys-Tyr、Val-Ser-His-Tyr、Gly-Cys-Tyr、Tyr-Phe-Arg或Tyr-Asp中的一种或多种。

[0110] 其中，本发明的酪氨酸酶抑制剂，其多肽序列中的一个或多个氨基酸进一步经过乙酰化(Acetylated)、酰胺化(Amidated)、甲酰化(Formylated)、羟基化(Hydroxylated)、脂质修饰(Lipid Modified)、甲基化(Methylated)或磷酸化(Phosphorylated)的修饰，在2009年Anan Abu Ubeid同样也是发现的多肽序列可作为酪氨酸酶的抑制剂，而在同时间发表的专利(WO2009003034(A1))也有提到经过修饰的多肽序列也算在专利范围中，认为其经过修饰的多肽序列并不会因此而改变其作用的活性机制。

[0111] 本发明另一方面提供一种含有上述酪氨酸酶抑制剂的抑制酪氨酸酶活性的医药组合物。

[0112] 其中，所述医药组合物还含有包含一种医药学上可接受载体。

[0113] 特别是，所述载体为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、界面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料。本发明的医药组合物通过抑制酪氨酸酶的活性进而抑制黑色素的生成，降低细胞内黑色素含量，并可应用于化妆品或农产品，当其应用于化妆品时可作为美白剂。

[0114] 本发明又一方面提供一种将上述酪氨酸酶抑制剂传输至哺乳动物，减少哺乳动物皮肤中黑色素含量的方法，此机制主要是透过抑制酪氨酸酶的活性，该方法包括将上述之酪氨酸酶抑制剂经由口服、经皮吸收、注射或吸入之方式传输至一哺乳动物。其中哺乳动物包含人类等生物。附图说明

[0115] 图1是黑色素的生合成途径。

[0116] 图2是酪氨酸酶的催化过程。

[0117] 图3是不同序列的短多肽抑制剂的安全性测试结果。

具体实施方式

[0118] 下列实施例为非限制性且仅作为本发明于各方面之代表例。

[0119] 实施例1：体外(In vitro)酪氨酸酶活性测试

[0120] I.药品

[0121] 洋菇酪氨酸酶(Mushroom tyrosinase，100U/ml)、熊果素(Arbutin)、酪氨酸(L-tyrosine，0.5mM)、曲酸(Kojic acid)和2至5个不同序列的短多肽(0.5mM)。短多肽序列为R1n1-Xaa-R2n2-Yaa-R3n3，Xaa或Yaa为酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸及精氨酸五种氨基酸中的一种，取代基R1、R2或R3的氨基酸依官能基分为以下八种类型：甘氨酸、脂肪性氨基酸、芳香性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、羟基氨基酸、含硫氨基酸和酰胺氨基酸，各类型择一，n1、n2或n3为取代基的数目，分别等于0或1，以上氨基酸交叉排列成为2至5个不同序列的短多肽。

[0122] II.实验步骤

[0123] 以分光光度计(Varian cary-50Bio UV-Visible spectrophotometer)在475nm下测dopachrome之OD值。再以下列公式计算tyrosinase的剩余活性百分比：

[0124] Tyrosinase activity(剩余酪氨酸酶活性，％)＝(D-C)/(B-A)×100％[0125] 其中A：阴性对照组反应前的475nm吸光值；

[0126] B：阴性对照组反应后的475nm吸光值；

[0127] C：样品组反应前的475nm吸光值；

[0128] D：样品组反应后的475nm吸光值。

[0129] III.实验结果

[0130] 以熊果素和曲酸(先前实验结果显示，曲酸在浓度0.4mM下，可以100％抑制酪氨酸酶的活性，测试时间为30分钟)做为阳性对照组来比较。

[0131] 表5-9所列为在5分钟时，不同序列的短多肽抑制酪氨酸酶活性的效果。将本发明所设计的短多肽和市售的美白成分熊果素与曲酸比较，熊果素抑制酪氨酸酶活性为32.2％，本发明所设计的短多肽效果远优于熊果素，而曲酸抑制酪氨酸酶活性为0.10％，与本发明的短多肽具有同样优越的效果，然而考虑用于人体的安全性问题，本发明的短多肽比曲酸更为安全。

[0132] 表5、5分钟时，不同序列的短多肽抑制酪氨酸酶活性的效果(序列[0133] R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3)

[0134]序列 Tyrosinase活性(％) 序列 Tyrosinase活性(％)
YCC 0 ECY 0.074653674
CDY 0 DYC 0.087482961
YCN 0 VYCR 0.091795925
CVY 0 CGY 0.096860964
YGC 0 CYN 0.097461159
RYC 0 DYCR 0.101490686
RFYC 0 KA 0.10591521
YNC 0 VCY 0.109361087
RCYV 0 NYCR 0.121654937
RCYC 0 YCS 0.140878234
NCY 0 CYS 0.148467869
VYC 0 CNY 0.152249737
YSC 0 CCY 0.170952487
RCYD 0 YCV 0.201675903
RYCR 0 RCYW 0.240532622
SYCR 0 YC 0.282109105
CSY 0 RCYL 0.306704013
YCG 0 RCYI 0.315981809
YFC 0 RCY 0.356030441
RCYN 0 CYR 0.383016975
FYC 0 GCY 0.388680245
GYC 0 RCYG 0.422501613
RCYR 0 RCYA 0.422863366
CYC 0 WCY 0.433679474
GYCR 0 RCGY 0.439602446
CYG 0 YCE 0.440729397
YEC 0 CYD 0.445290753
VRCY 0 CY 0.516055046
SCY 0 YCD 0.67074304
YRC 0 CFY 0.872799404
YDC 0 CRY 1.102088681
RCYF 0.019169001 RCYCR 1.146788991
FYCR 0.020633759 YVC 4.196121435
YCR 0.036315672 Arb 32.242669
RCYS 0.0382263 阴性对照组 100
YCF 0.047937278

[0135]

[0136] 表6、5分钟时，不同序列的短多肽抑制酪氨酸酶活性的效果(序列R1n1-Cys-R2n2-Gly-R3n3或R1n1-Gly-R2n2-Cys-R3n3)

[0137]序列 Tyrosinase活性(％) 序列 Tyrosinase活性(％)
CGS 0 VCG 0.16501671
CGR 0 CGN 0.184239081
DCG 0 GCG 0.194596694
CGD 0 CGV 0.20573982
CGG 0 ECG 0.332101409
CGC 0 NCG 0.440803923
SCG 0 CG 0.496941896
CCG 0.00758032 Arb 32.242669
RCG 0.028104759 阴性对照组 100
KA 0.1059152

[0138] 表7、5分钟时，不同序列的短多肽抑制酪氨酸酶活性的效果(序列R1n1-Glu-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Glu-R3n3)

[0139]序列 Tyrosinase活性(％) 序列 Tyrosinase活性(％)
ECV 0 REC 0.244581269
ECR 0 CEC 0.268719348
ECN 0 ECG 0.332101409
ECC 0 DEC 0.350414781
ECS 0.046361766 NEC 0.39675514
GEC 0.05283631 ECD 0.39964605
KA 0.10591521 Arb 32.242669
VEC 0.207898268 阴性对照组 100

[0140] 表8、5分钟时，不同序列的短多肽抑制酪氨酸酶活性的效果(序列R1n1-Arg-R2n2-Tyr-R3n3或R1n1-Tyr-R2n2-Arg-R3n3)

[0141]序列 Tyrosinase活性(％) 序列 Tyrosinase活性(％)
RSY 0 WRFY 9.830538813
RFYW 0 RYY 15.8876895
KA 0.10591521 Arb 32.242669
RWY 1.04109589 YR 44.9087323
RFY 1.259403349 YFR 47.37618551
RIY 2.4216621 RGY 51.92132116
RLY 2.525159817 RY 54.22843594
RTY 2.608200147 RPYR 82.384621
RMY 2.708666667 RFYE 83.06501065
RAY 3.633065449 阴性对照组 100
RVY 4.551878234

[0142]

[0143] 表9、5分钟时，不同序列的短多肽抑制酪氨酸酶活性的效果(序列Val-Ser-His-Tyr)

[0144]序列 Tyrosinase活性(％)
KA 0.105915208
VSHY 1.366590214
Arb 32.24266895
HY 47.81793167
YH 48.56735741
VY 68.98319048
VH 69.42109648
阴性对照组 100

[0145] 进一步试验5及30分钟时，不同序列的短多肽抑制酪氨酸酶活性效果(仅列出序列为R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3的部分)。表10所列结果显示5和30分钟分别有不同的抑制效果，本发明的短多肽在5分钟已有抑制效果，至30分钟仍持续有效，而以时间经济考虑，本发明在5分钟已有足够的抑制效果。

[0146] 将本发明所设计的短多肽和熊果素与曲酸比较，熊果素抑制酪氨酸酶活性在5分钟为32.24％，至30分钟时回复至49.14％，可推知熊果素在30分钟已被代谢，抑制效果已慢慢回复，而曲酸抑制酪氨酸酶活性在5分钟为0.1％，至30分钟为0.24％，效果十分显著，然而以效果考虑，本发明所设计的短多肽效果远优于熊果素，以安全性考虑，本发明的短多肽比曲酸更为安全，因此整体而言，本发明较市售的美白成分熊果素与曲酸更为优越。

[0147] 表10、分别在5及30分钟时，酪氨酸酶活性被不同序列的短多肽的抑制效果(序列R1n1-Tyr-R2n2-Cys-R3n3或R1n1-Cys-R2n2-Tyr-R3n3)

[0148]

[0149] 实施例2：不同序列的短多肽进行安全性测试结果

[0150] I.药品來源

[0151] 1.多肽序列为YD、YFR、GCY及YC

[0152] II.实验步骤

[0153] 利用MTT试验来测定抑制剂是否含有细胞毒性，活细胞内粒线体中的琥珀酸去氢酶(succinate dehydrogenase)能将黄色的MTT还原成紫色的结晶(formazan)，然后再加入DMSO将紫色结晶(formazan)溶解，并以分光光度计测量此溶液在OD 595nm下的吸光值，并估算测试物质对细胞生长的影响。

[0154] (1)先配制含MTT培养液，每500μl培养液加入80μl MTT(原始浓度为5mg/ml)。

[0155] (2)将细胞培养液全部吸起，每个96孔盘加入100μl含MTT培养液(24-孔盘中则加入500μl含MTT培养液)，于37℃的5％C02培养箱静置一小时。

[0156] (3)去除细胞培养盘的培养基，加入适当体积的DMSO(96-孔盘中加入200μl)，静置10分钟。以连续波长微孔盘分析系统(Molecular Devices，SPECTRAMAX M2)测定波长550nm吸光值，之后以未处理对照组的平均吸光值为100％，计算实验组的吸光值百分比。

[0157] III.实验结果

[0158] 图3所列为不同序列的短多肽抑制剂的安全性测试结果。不同短多肽在5分钟时抑制酪胺酸酶活性之效果。从MTT实验结果中，当加入5mM的熊果素或是1mM的曲酸时，细胞活性就已经降至95％的最低值。在MTT assay实验结果中，加入了GCY 100μM仍然不影响细胞活性。而其它抑制剂YC，YD，YFR也有相同情形，所以由以上实验证实：这四个短多肽不具有毒性且不会影响细胞活性。

[0159] 实施例3：体内(In vivo)黑色素含量分析

[0160] 在本篇专利中有部分的顺反向化合物，其抑制效果并不会受到顺反向而有所差异，但是也有些顺向与反向化合物的抑制效果可以差距50％左右，另一方面，部分化合物溶于溶液之后有呈色的情形，因此为了排除呈色的情形可能会影响吸光值过高，并证实本研究所设计的抑制剂在人体也能有同样良好的美白功效，所以我们挑选部分化合物YD、YFR、GCY、YC进行黑色素含量分析。

[0161] I.药品來源

[0162] 1.多肽序列为YD、YFR、GCY及YC

[0163] II.实验步骤

[0164] 将黑色素细胞培养在24孔盘中，并将不同的抑制剂，以1，5，10，25，50及100μM的浓度分别培养七天。七天后，加入trypsin/EDTA(0.25％/0.1％inphosphate bufferedsaline)短暂培养，使得细胞分离。之后将细胞培养液全部吸起，加入HBSS清洗两次，利用超声波将细胞振碎，再加入0.3ml 1N NaOH(70℃)，并置入50℃的烘箱静置10分钟。最后将溶出的黑色素(melanin)混匀后，取0.2ml至96孔盘，用分光光度计测定OD
405nm melanin的吸光值。

[0165] III.实验结果

[0166] 表11、YD序列短多肽的黑色素含量分析结果

[0167]YD 相对melanin含量 SD
阴性对照组 100.00 11.24
1 80.57 1.65
5 78.20 2.98
10 77.94 2.98
25 73.02 10.87
50 80.37 7.97
100 75.72 1.08
kojic acid(0.5mM) 81.87 3.01
kojic acid(1mM) 67.63 2.87
Arbutin(5mM) 74.52 4.19

[0168] 表12、YFR序列短多肽的黑色素含量分析结果

[0169]YFR 相对melanin含量 SD
阴性对照组 100.00 10.93
1 91.65 6.06
5 86.78 2.53
10 86.12 0.81
25 84.15 3.29
50 84.48 1.70
100 81.02 1.75
kojic acid(1mM) 67.63 2.87
kojic acid(0.5mM) 81.87 3.01

[0170]Arbutin(5mM) 74.52 4.19

[0171] 表13、GCY序列短多肽的黑色素含量分析结果

[0172]GCY 相对melanin含量 SD
阴性对照组 100.00 7.84
1 107.05 18.26
5 90.40 2.83
10 85.93 5.66
25 92.75 3.28
50 90.47 0.71
100 82.41 2.19
kojic acid(1mM) 67.63 2.87
kojic acid(0.5mM) 81.87 3.01
Arbutin(5mM) 74.52 4.19

[0173] 表14、YC序列短多肽的黑色素含量分析结果

[0174]YC 相对melanin含量 SD
阴性对照组 100 5.75
1 96.33 5.13
5 95.00 2.53
10 95.39 1.60
25 100.97 2.19
50 92.26 1.86
100 91.21 4.28
kojic acid(1mM) 67.63 2.87
kojic acid(0.5mM) 81.87 3.01
Arbutin(5mM) 74.52 4.19

[0175] 从实验结果中，可以发现当熊果素加入5mM时，可以使黑色素(melanin)的含量降至74.52％，而加入曲酸1mM时，就可以使黑色素的含量降至67.63％，所以曲酸的抑制效果在人类酪氨酸酶中也是表现的比熊果素良好。

[0176] 从表11的实验结果中，我们可以看到当加入YD 100μM时，只需熊果素的0.02倍剂量即可达到相同的抑制效果，使得黑色素的含量降至75％左右；而当加入YD 1μM时，即可达到与加入曲酸0.5mM相同的抑制效果，使得黑色素的含量降至80％左右。从表12的实验结果中，我们可以看到当加入YFR 100μM时，只需曲酸的0.2倍剂量，即可达到与加入曲酸0.5mM相同的抑制效果，使得黑色素的含量降至80％左右。

[0177] 所以由以上的数据结果得知：YD，YFR在人类酪氨酸酶中，的确是有抑制效果的，而且其抑制能力甚至优于曲酸以及熊果素。所以反推回体外洋菇酪氨酸酶活性测试实验结果，YD，YFR化合物之所以会被误判为抑制效果不佳，主要是受到化合物在溶液当中有呈色情形的影响，进而产生过高的吸光值，另一方面，以上数据也证实了顺反向化合物对于tyrosinase的抑制效果是差异不大的。

[0178] 根据GCY的实验结果(表13)，从数据中可以得知：当加入GCY 100μM时，只需少许的剂量，即可达到与加入曲酸0.5mM相同的抑制效果，使得黑色素(melanin)的含量降至80％左右。另一方面，YC的实验结果(表14)与GCY的实验数据相较之下，我们可以发现：
在人类酪氨酸酶中，GCY的抑制效果也是优于YC，这个情形与在体外洋菇酪氨酸酶活性测试结果中是相符合的。所以根据以上实验结果，我们推论：对于洋菇酪氨酸酶有抑制效果的化合物，在人类酪氨酸酶中有可能也具有相同良好的抑制情形。

[0179] 从MTT assay的结果，得知1mM的曲酸或是5mM的熊果素，就已经使得细胞活性降至最低值95％，而比对体外洋菇酪氨酸酶活性测试实验结果，得知加入YD100μM可以达到与曲酸1mM或是熊果素5mM相近的七成抑制效果，但是加入YD100μM时并不会影响其细胞活性，所以从以上两个实验证实：这些化合物相较于化妆品工业上常用的曲酸及熊果素，不仅有良好的抑制效果，且不具有细胞毒性。

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