一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用
阅读：963发布：2023-01-27
专利汇可以提供一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种经修饰的生长分化因子，由修饰物与生长分化因子偶联形成，所述生长分化因子为：(a)来源于 哺乳动物 的天然生长分化因子11；(b)将所述天然生长分化因子11的 氨 基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进神经元再生能 力 的由天然生长分化因子11衍生的 蛋白质 或多肽；或(c)与(a)或(b)所示的氨基酸序列具有至少50％同源性且具有促进神经元再生能力的由(a)或(b)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质或多肽。本发明的经修饰的生长分化因子可以更好地用于 预防 、改善和 治疗 老年痴呆症，还可以起到增强记忆力的作用。另外，生长分化因子所调控的代谢产物具有诊断和筛查老年痴呆症的用途。，下面是一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种经修饰的生长分化因子，由修饰物与生长分化因子偶联形成，其中，所述生长分化因子为如下(a)或(b)或(c)所示：(a)来源于哺乳动物的天然生长分化因子11；(b)将所述天然生长分化因子11的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进神经元再生能力的由天然生长分化因子11衍生的蛋白质或多肽；(c)与(a)或(b)所示的氨基酸序列具有至少50％同源性且具有促进神经元再生能力的由(a)或(b)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质或多肽。
2.根据权利要求1所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，
所述修饰物为标签多肽、血浆蛋白或所述血浆蛋白片段。
3.根据权利要求2所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，
所述标签多肽为His-tag，Flag-tag，HA-tag，c-Myc-tag，AVi-tag，MBP-tag，GST-tag，SNAP-tag，Halo-tag或SUMO-tag。
4.根据权利要求2所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，
所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个所述标签多肽偶联形成的；优选地，所述标签多肽通过共价键与所述生长分化因子的N端和/或C端偶联。
5.根据权利要求4所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，
所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个His-tag偶联形成的，其中，所述His-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求4所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个GST-tag偶联形成的，其中，所述GST-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求3所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，所述Flag-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示，所述HA-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.13所示，所述c-Myc-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所示，所述AVi-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.15所示，所述MBP-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，所述SNAP-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示，所述Halo-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.18所示，所述SUMO-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.19所示。
8.根据权利要求2所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，所述血浆蛋白为白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、免疫球蛋白、转甲状腺蛋白和甲状腺结合蛋白中的一种或多种；
所述血浆蛋白的片段为免疫球蛋白的Fc区域。
9.根据权利要求2所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个血浆蛋白或所述血浆蛋白片段偶联形成的；
优选地，所述血浆蛋白或所述血浆蛋白片段通过共价键与所述生长分化因子的N端和/或C端偶联。
10.根据权利要求1所述的经修饰的生长分化因子，其特征在于，所述生长分化因子是人源生长分化因子11，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；或者所述生长分化因子是鼠源生长分化因子11，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；或者所述生长分化因子是人源生长分化因子11的活性片段，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；或者所述生长分化因子是具有序列表中SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
11.编码权利要求1-10任一所述经修饰的生长分化因子的核酸分子。
12.一种包含权利要求11所述核酸分子的重组表达载体。
13.根据权利要求12所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是基于pET28a(+)质粒载体构建的载体。
14.一种包含权利要求11所述核酸分子或包含权利要求12-13任一所述重组表达载体的宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
16.权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子的制备方法，其特征在于，所述修饰物通过化学修饰或融合表达的方式与所述生长分化因子偶联。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述融合表达方式制备所述经修饰的生长分化因子的方法包括：
编码所述经修饰的生长分化因子的基因序列的合成步骤；
所述经修饰的生长分化因子的基因序列与基础载体连接形成重组载体的步骤；
所述重组载体的转化步骤；
转化后宿主细胞的筛选步骤；
诱导融合蛋白的表达步骤；
融合蛋白的收集步骤；
融合蛋白的分离纯化步骤。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化步骤采用亲和层析柱、阳离子交换柱和/或分子筛。
19.一种药物组合物，包含：权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞，和药学上可接受的载体。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为：药学上可接受的各种常用缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。
21.一种缓释制剂，包含：权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞、或者权利要求19-20任一所述的药物组合物，以及药学上可接受的生物相容物质；优选地，所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。
22.一种包含权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞、或者权利要求19-20任一所述的药物组合物、或者权利要求21所述缓释制剂的试剂盒。
23.权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞、或者权利要求19-20任一所述的药物组合物、或者权利要求21所述缓释制剂、或者权利要求22所述的试剂盒在预防、改善或/和治疗老年痴呆症药物中的应用。
24.权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞、或者权利要求19-20任一所述的药物组合物、或者权利要求21所述缓释制剂、或者权利要求22所述的试剂盒在改善或治疗认知功能失常药物中的应用。
25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述认知功能失常是指与衰老相关的记忆力减退。
26.一种预防、改善或治疗老年痴呆症的方法，该方法是通过一定的给药途径给予老年痴呆症病人权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞、或者权利要求19-20任一所述的药物组合物、或者权利要求21所述缓释制剂。
27.一种改善或治疗认知功能失常的方法，该方法是通过一定的给药途径给予认知功能失常的人权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞、或者权利要求19-20任一所述的药物组合物、或者权利要求21所述缓释制剂。
28.根据权利要求26或27的方法，其特征在于，所述给药途径为口服、鼻黏膜给药、静脉注射、肌肉注射、静脉滴注、腹腔注射，肝动脉注射或皮下包埋。
29.一种延长权利要求1所述的生长分化因子在体内半衰期的方法，将所述生长分化因子修饰制备成权利要求1-10任一所述的经修饰的生长分化因子、或者权利要求11所述核酸分子、或者权利要求12或13所述重组表达载体、或者权利要求14或15所述宿主细胞、或者权利要求19-20任一所述的药物组合物、或者权利要求21所述缓释制剂。
30.权利要求1所述的生长分化因子所调控的代谢产物在诊断和筛查老年痴呆疾病中的用途。优选地，所述生长分化因子所调控的代谢产物为如下代谢产物中的一种或多种：丙酰Propionyl AC(C3)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC a C18:2、磷脂酰PC aa C36:6、磷脂酰C16:
1–OH、磷脂酰PC aa C38:0、磷脂酰PC aa C38:6、磷脂酰PC aa C40:1、磷脂酰PC aa C40:2、磷脂酰PC aa C40:6、磷脂酰PC ae C40:6。
31.一种确定受试患者是否患有老年痴呆症或者具有罹患老年痴呆症风险的方法，包括检测该受试者的血液样本中权利要求30所述的代谢产物一种或多种的浓度，如果所述代谢产物的浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有老年痴呆症或者具有罹患老年痴呆症的风险。优选地，所述代谢产物的浓度是采代谢组学的方法测定的。
一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种修饰蛋白，特别涉及一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 阿尔兹海默综合症又叫老年痴呆症，其特点是病人的记忆和认知能力逐渐丧失。病人在确诊后3到9年内死亡，占临床死亡病例的50％到56％。对于该病病因，目前的认识是大脑内积累了异常折叠的beta-淀粉样蛋白和Tau蛋白，从而导致了老年痴呆症的发生(Querfurth H.W.Alzheimer’s Disease.N Engl J Med 2010；362,329-344)。
[0003] 目前市场上治疗老年痴呆症的药物主要是西药，其特征是必须长期坚持服用，然而疗效却微小，只能缓解部分症状，不能控制病情的发展。长期服用的另外一个缺陷是药物副作用大，同时病人产生药物依赖性(Becker,R.E.What can triumphs and tribulations from drug research in Alzheimer's disease tell us about the development of psychotropic drugs in general？Lancet Psychiatry 2015；2(8):756-764)。为此市场上急需疗效更好，副作用更低的药物。
[0004] GDF11蛋白又被称为骨形态发生蛋白(BMP-11，Bone morphogenetic protein 11)。人源GDF11蛋白在NCBI上的参考序列号(NCBI Reference Sequence)：NP_005802.1。
GDF11蛋白属于TGF-β蛋白超家族成员，其在很多组织器官中均有表达，比如：视网膜、嗅觉系统、神经系统、胰腺、肠道、肾、骨骼肌和心脏(C.McPherron,Alexandra.Metabolic functions of Myostatin and Gdf11.Immunol Endocrinol Metab Agents Med Chem,Volume10,Number 4,December 2010,pp.217–231.)。GDF11在早期胚胎发育阶段发挥着重要作用，其可以调节脊髓、嗅神经、骨骼、肾和胰腺等组织器官的发育。GDF11还能显著提高大脑的认知水平，控制心肌肥大，以及提升骨骼肌代谢(Li,Q.and Z.-M.Hao,."GDF11:a New Member of TGF-beta Superfamily."Progress in Biochemistry and Biophysics
2015，42(7):616-623)。GDF11的这种作用，目前认为是通过TGF-β信号转导实现的。GDF11可以和TGF-β的受体(I型和II型)结合，激活TGF-β下游信号转导通路(Rochette,L.,M.Zeller,et al.."Growth and differentiation factor 11(GDF11):Functions in the regulation of erythropoiesis and cardiac regeneration."Pharmacology&
Therapeutics,2015,156:26-33.)。
GDF11蛋白属于TGF-β蛋白超家族成员，其在很多组织器官中均有表达，比如：视网膜、嗅觉系统、神经系统、胰腺、肠道、肾、骨骼肌和心脏(C.McPherron,Alexandra.Metabolic functions of Myostatin and Gdf11.Immunol Endocrinol Metab Agents Med Chem,Volume10,Number 4,December 2010,pp.217–231.)。GDF11在早期胚胎发育阶段发挥着重要作用，其可以调节脊髓、嗅神经、骨骼、肾和胰腺等组织器官的发育。GDF11还能显著提高大脑的认知水平，控制心肌肥大，以及提升骨骼肌代谢(Li,Q.and Z.-M.Hao,."GDF11:a New Member of TGF-beta Superfamily."Progress in Biochemistry and Biophysics
2015，42(7):616-623)。GDF11的这种作用，目前认为是通过TGF-β信号转导实现的。GDF11可以和TGF-β的受体(I型和II型)结合，激活TGF-β下游信号转导通路(Rochette,L.,M.Zeller,et al.."Growth and differentiation factor 11(GDF11):Functions in the regulation of erythropoiesis and cardiac regeneration."Pharmacology&
Therapeutics,2015,156:26-33.)。
[0005] 目前的最新研究发现：给年老老鼠持续注射年轻老鼠的血浆能提升年老老鼠的认知水平(Villeda S.A.Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.Nature Medicine 2014；20:659-663)。为此，血浆中可能含有某种成分能有效的提升老年痴呆症患者的认知水平。进一步研究表明：年老老鼠的血浆成分和年轻老鼠的血浆成分有着显著的不同，其中最大的差异是年老老鼠血浆中生长分化因子11(Growth differentiation factor 11，GDF11)的含量显著低于年轻老鼠(Loffredo F.S.Growth Differentiation Factor 11Is a Circulating Factor that Reverses Age-Related Cardiac Hypertrophy.Cell,2013,153,828-839)。
[0006] 尽管GDF11与大脑的认知水平有关，但其对认知水平的提高很有限，因此需要找到一种效果更好地可以治疗或者有效缓解老年痴呆症的新药。
发明内容
[0007] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种经修饰的生长分化因子。
[0008] 本发明的目的之二在于提供上述经修饰的生长分化因子的制备方法。
[0009] 本发明的目的之三在于提供上述经修饰的生长分化因子的应用。
[0010] 本发明的目的之四在于提供所述生长分化因子所调控的代谢产物的用途。
[0011] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0012] 一种经修饰的生长分化因子，由修饰物与生长分化因子偶联形成，其中，所述生长分化因子为如下(a)或(b)或(c)所示：(a)来源于哺乳动物的天然生长分化因子11；(b)将所述天然生长分化因子11的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进神经元再生能力的由天然生长分化因子11衍生的蛋白质或多肽；(c)与(a)或(b)所示的氨基酸序列具有至少50％同源性且具有促进神经元再生能力的由(a)或(b)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质或多肽。
[0013] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述修饰物为标签多肽、血浆蛋白或所述血浆蛋白片段。
[0014] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述标签多肽为His-tag，Flag-tag，HA-tag，c-Myc-tag，AVi-tag，MBP-tag，GST-tag，SNAP-tag，Halo-tag或SUMO-tag。
[0015] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个所述标签多肽偶联形成的；优选地，所述标签多肽通过共价键与所述生长分化因子的N端和/或C端偶联。
[0016] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个His-tag偶联形成的，其中，所述His-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
[0017] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个GST-tag偶联形成的，其中，所述GST-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
[0018] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述Flag-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示，所述HA-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.13所示，所述c-Myc-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所示，所述AVi-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.15所示，所述MBP-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，所述SNAP-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示，所述Halo-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.18所示，所述SUMO-tag的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.19所示。
[0019] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述血浆蛋白为白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、免疫球蛋白、转甲状腺蛋白和甲状腺结合蛋白中的一种或多种；所述血浆蛋白的片段为免疫球蛋白的Fc区域。
[0020] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述经修饰的生长分化因子是由一个所述生长分化因子与一个或多个血浆蛋白或所述血浆蛋白片段偶联形成的；优选地，所述血浆蛋白或所述血浆蛋白片段通过共价键与所述生长分化因子的N端和/或C端偶联。
[0021] 在上述经修饰的生长分化因子中，作为一种优选实施方式，所述生长分化因子是人源生长分化因子11，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；或者所述生长分化因子是鼠源生长分化因子11，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；或者所述生长分化因子是人源生长分化因子11的活性片段，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；或者所述生长分化因子是具有序列表中SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
[0022] 一种编码上述经修饰的生长分化因子的核酸分子。
[0023] 一种包含上述核酸分子的重组表达载体。
[0024] 在上述重组表达载体中，作为一种优选实施方式，所述重组表达载体是基于pET28a(+)质粒载体构建的载体。
[0025] 一种包含上述核酸分子或包含上述重组表达载体的宿主细胞。
[0026] 在上述宿主细胞中，作为一种优选实施方式，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0027] 上述经修饰的生长分化因子的制备方法，所述修饰物通过化学修饰或融合表达的方式与所述生长分化因子偶联。
[0028] 在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，所述融合表达方式制备所述经修饰的生长分化因子的方法包括：
[0029] 编码所述经修饰的生长分化因子的基因序列的合成步骤；所述经修饰的生长分化因子的基因序列与基础载体连接形成重组载体的步骤；所述重组载体的转化步骤；转化后宿主细胞的筛选步骤；诱导融合蛋白的表达步骤；融合蛋白的收集步骤；以及融合蛋白的分离纯化步骤。
[0030] 在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，所述分离纯化步骤采用亲和层析柱、阳离子交换柱和/或分子筛。
[0031] 一种药物组合物，包含：上述经修饰的生长分化因子、或者上述核酸分子、或者上述重组表达载体、或者上述宿主细胞，和药学上可接受的载体。
[0032] 在药物组合物中，作为一种优选实施方式，所述药学上可接受的载体为：药学上可接受的各种常用缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。
[0033] 一种缓释制剂，包含：上述经修饰的生长分化因子、或者上述核酸分子、或者上述重组表达载体、或者上述宿主细胞、或者上述药物组合物，以及药学上可接受的生物相容物质；优选地，所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。
[0035] 上述经修饰的生长分化因子、或者上述核酸分子、或者上述重组表达载体、或者上述宿主细胞、或者上述药物组合物、或者上述缓释制剂、或者上述试剂盒在预防、改善或/和治疗老年痴呆症药物中的应用。
[0036] 上述经修饰的生长分化因子、或者上述核酸分子、或者上述重组表达载体、或者上述宿主细胞、或者上述药物组合物、或者上述缓释制剂、或者上述试剂盒在改善或治疗认知功能失常药物中的应用。
[0037] 在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述认知功能失常是指与衰老相关的记忆力减退。
[0038] 一种预防、改善或治疗老年痴呆症的方法，该方法是通过一定的给药途径给予老年痴呆症病人上述经修饰的生长分化因子、或者上述核酸分子、或者上述重组表达载体、或者上述宿主细胞、或者上述药物组合物、或者上述缓释制剂。
[0039] 一种改善或治疗认知功能失常的方法，该方法是通过一定的给药途径给予认知功能失常的人上述经修饰的生长分化因子、或者上述核酸分子、或者上述重组表达载体、或者上述宿主细胞、或者上述药物组合物、或者上述缓释制剂。
[0040] 在上述预防、改善或治疗老年痴呆症的方法和改善或治疗认知功能失常的方法中，其特征在于，所述给药途径为口服、鼻黏膜给药、静脉注射、肌肉注射、静脉滴注、腹腔注射，肝动脉注射或皮下包埋。
[0041] 一种延长上述生长分化因子在体内半衰期的方法，将所述生长分化因子修饰制备成上述经修饰的生长分化因子、或者上述核酸分子、或者上述重组表达载体、或者上述宿主细胞、或者上述药物组合物、或者上述缓释制剂。
[0042] 上述生长分化因子(未经修饰的)所调控的代谢产物在诊断和筛查老年痴呆疾病中的用途。优选地，所述生长分化因子所调控的代谢产物为如下代谢产物中的一种或多种：丙酰Propionyl AC(C3)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC a C18:2、磷脂酰PC aa C36:6、磷脂酰C16:1–OH、磷脂酰PC aa C38:0、磷脂酰PC aa C38:6、磷脂酰PC aa C40:1、磷脂酰PC aa C40:2、磷脂酰PC aa C40:6、磷脂酰PC ae C40:6。
[0043] 一种确定受试患者是否患有老年痴呆症或者具有罹患老年痴呆症风险的方法，包括检测该受试者的血液样本中上述代谢产物中的一种或多种的浓度，如果所述代谢产物的浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有老年痴呆症或者具有罹患老年痴呆症的风险。优选地，所述代谢产物的浓度是采代谢组学的方法测定的。
[0044] 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0045] 1、本发明提供的经修饰的生长分化因子在保证其基本功能的前提下有效地延长了其在体内的半衰期。
[0046] 2、同时相比于无修饰的生长分化因子11或其活性片段，本发明经修饰的生长分化因子具有更好地生物学活性，可以更好地用于预防、改善和治疗老年痴呆症，此外其还可以起到增强记忆力的作用。
[0047] 3、本发明提供的经修饰的化合物及包含该化合物的药物具有体内代谢的稳定性，可以直接用于或者作为药物组合物成分来预防、改善和治疗老年痴呆症。
[0048] 4、本发明涉及的生长分化因子在老年痴呆患者体内含量明显降低，其下游信号通路的相关酶的含量和活性降低，导致多种磷脂酰和肉碱代谢产物含量降低。这种代谢小分子含量的变化可以有效的预测老年痴呆潜伏者的患病风险，并可对老年痴呆疾病进行辅助诊断和筛查。即生长分化因子的下游代谢产物可用于老年痴呆的辅助诊断。附图说明
[0049] 图1是通过全基因合成方法合成的编码His-tag与人生长分化因子11的活性片段(具有序列表中SEQ ID No.6所示的氨基酸序列)N端的偶联产物的基因图谱；
[0050] 图2是通过全基因合成方法合成的编码GST-tag与人生长分化因子11的活性片段(具有序列表中SEQ ID No.6所示的氨基酸序列)N端的偶联产物的基因图谱；
[0051] 图3是实施例2中具有序列表中序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的His-tag与具有序列表中SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的人生长分化因子(即人生长分化因子11的活性片段)的N端进行偶联后用亲和层析进行纯化得到的洗脱液的SDS电泳检测的结果。纯化是指将实施例1得到的含有偶联产物的上清液过镍柱，最后用含400mM咪唑的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)洗脱柱子得到洗脱液。泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2-10均为偶联产物经过镍柱纯化的洗脱液。
[0052] 图4是实施例4中GST-tag与具有序列表中SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的人生长分化因子(即人生长分化因子11的活性片段)的N端进行偶联后用亲和层析进行纯化得到的洗脱液的SDS电泳检测的结果。纯化是指将实施例3获得的含有偶联产物的上清液过含有固定型谷胱甘肽的亲和柱子，最后用含25mM游离的谷胱甘肽的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)洗脱柱子，得到洗脱液。泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2-10均为偶联产物经过亲和柱子纯化的洗脱液。
[0053] 图5是实施例6中20kD聚乙二醇与具有序列表中SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的人生长分化因子(即人生长分化因子11的活性片段)的N端进行偶联后用阴离子柱SourceQ进行纯化得到的洗脱液的SDS电泳检测的结果。纯化是指将含有偶联产物的反应液过SourceQ柱子，最后用含有500mM氯化钠的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)进行梯度洗脱，从而收集含有单位点修饰产物的洗脱液。泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2-10为偶联产物经过SourceQ纯化的洗脱液。
[0054] 图6是实施例8中40kD聚乙二醇与具有序列表中SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的人生长分化因子(即人生长分化因子11的活性片段)的N端进行偶联后用阴离子柱SourceQ进行纯化得到的洗脱液的SDS电泳检测的结果。纯化是指将实施例7得到的含有偶联产物的反应液过SourceQ柱子，最后用含有500mM氯化钠的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)进行梯度洗脱，从而收集含有单位点修饰产物的洗脱液。泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2-10为偶联产物经过SourceQ纯化的洗脱液。
[0056] 图8是实施例12中，实施例3和4制备的经修饰后的生长分化因子(即化合物Ⅱ或者GST-tag-GDF11)促进原代海马细胞增值的活性图。
[0057] 图9是实施例15中，实施例5和6制备的经修饰后的生长分化因子(即化合物Ⅲ或者20KD聚乙二醇-GDF11)促进原代海马细胞增值的活性图。
[0058] 图10是实施例18中，实施例7和8制备的经修饰后的生长分化因子(即化合物Ⅳ或40KD聚乙二醇-GDF11)促进原代海马细胞增值的活性图。
[0059] 图11是实施例10中，化合物Ⅰ促进原代海马细胞突触形成的活性图。
[0060] 图12是实施例13中，化合物Ⅱ促进原代海马细胞突触形成的活性图。
[0061] 图13是实施例16中，化合物Ⅲ促进原代海马细胞突触形成的活性图。
[0062] 图14是实施例19中，化合物Ⅳ促进原代海马细胞突触形成的活性图。
[0063] 图15是实施例20中，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ对年老老鼠认知水平的提升活性图。(a)找到隐藏平台所用时间随时间变化曲线；(b)在目标象限所花费的时间。
[0064] 图16是实施例21中，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ对老年痴呆老鼠认知水平的提升活性图。(a)找到隐藏平台所用时间随时间变化曲线；(b)在目标象限所花费的时间。
[0065] 图17是实施例10中，不同处理后的原代海马细胞的成像图。往原代海马细胞的培养基里分别加入等摩尔量的化合物Ⅰ和具有序列表中SEQ ID No.6所示氨基酸序列的人生长分化因子即GDF11活性片段作为实验组。对照组海马细胞只加DMEM培养基。一天后在显微镜下对海马细胞进行成像。图中，(a),(b),(c)分别是化合物Ⅰ、GDF11活性片段和DMEM处理后的原代海马细胞。
[0066] 图18为实施例22中，正常人群和老年痴呆病人血清蛋白提取物中GDF11的含量对比。
[0067] 图19为实施例23中，正常人群和老年痴呆病人10种代谢小分子的含量变化对比表格。
具体实施方式
[0068] 为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明，下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
[0069] 本发明提供一种经修饰的生长分化因子(也可称为经修饰的化合物)，该化合物是将生长分化因子修饰后的化合物，其由修饰物与生长分化因子偶联形成。所述生长分化因子为如下(a)或(b)或(c)所示：(a)来源于哺乳动物的天然生长分化因子11；(b)将所述天然生长分化因子11的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基(比如2个、8个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个)的取代和/或缺失和/或添加且具有促进神经元再生能力的由天然生长分化因子11衍生的蛋白质或多肽；(c)与(a)或(b)所示的氨基酸序列具有至少50％(比如50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％)同源性且具有促进神经元再生能力的由(a)或(b)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质或多肽。所述天然生长分化因子11中天然是指与生俱来的或者自然形成的。
[0070] 本发明中所述生长分化因子可以是人源、鼠源或者其他哺乳动物的天然的生长分化因子11，其不同来源的生长分化因子同源性可达到83.5％；也可以是天然生长分化因子11的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进神经元再生能力的由天然生长分化因子11衍生的蛋白质或多肽，比如：这些生长分化因子11的活性片段；或者与这些生长因子或者活性片段具有50％以上同源性且具有促进神经元再生能力的由这些生长分化因子11或者活性片段衍生出的蛋白质或多肽。当生长分化因子11是人源生长分化因子11，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述生长分化因子11是鼠源生长分化因子11，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。生长分化因子11的活性片段是来源于生长分化因子11、且和生长分化因子11同样具有促进神经元再生能力的肽段(Katsimpardi L.Science 2014；344,630-634)，比如序列表中SEQ ID NO.6，该SEQ ID NO.6的氨基酸序列人源生长分化因子11和鼠源生长分化因子11的共同部分，本发明的实施例也进一步证实了SEQ ID NO.6所示氨基酸序列多肽具有促进神经元再生能力(参见图7-
14)；所述生长分化因子还可以是与人源生长分化因子11具有70％以上同源性且具有促进神经元再生能力蛋白质或多肽，比如序列表中SEQ ID NO.7所示的蛋白质，其氨基酸序列是人源生长分化因子8和鼠源生长分化因子8的共同部分。
14)；所述生长分化因子还可以是与人源生长分化因子11具有70％以上同源性且具有促进神经元再生能力蛋白质或多肽，比如序列表中SEQ ID NO.7所示的蛋白质，其氨基酸序列是人源生长分化因子8和鼠源生长分化因子8的共同部分。
[0071] 所述经修饰的生长分化因子是由一个上述生长分化因子与一个或多个修饰物偶联形成的，偶联可以是共价键也可以是非共价键；可通过化学修饰或者融合表达来实现修饰物与生长分化因子的偶联。
[0072] 所述修饰物可以为标签多肽、血浆蛋白、所述血浆蛋白片段、高分子或小分子。
[0073] 在本发明中，所述多肽是指由2～100氨基酸分子脱水缩合而成的线性化合物，其分子量低于10,000Da。所述蛋白质是由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。高分子是指除蛋白质以外的由众多原子或原子团主要以共价键结合而成的相对分子量在一万以上的化合物。小分子是指分子量小于500的分子。
[0074] 当所述修饰物为标签多肽时，优选地，所述标签多肽为His-tag，Flag-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列)，HA-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列)，c-Myc-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列)，AVi-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列)，MBP-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列)，GST-tag，SNAP-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列)，Halo-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列)，SUMO-tag(其具有序列表中SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列)。更优选地，所述标签多肽为His-tag，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，一个所述标签His-tag通过共价键即肽键与所述生长分化因子的N端和/或C端偶联。更优选地，所述标签多肽为GST-tag，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，一个所述标签多肽GST-tag通过共价键即肽键与所述生长分化因子的N端和/或C端偶联。加上上述标签可以加大蛋白本身的分子量，可以降低代谢率；另外，在表达时可以增加蛋白的稳定性；最后还可以促进蛋白以正确的方式进行折叠。
[0075] 当所述修饰物为血浆蛋白或血浆蛋白的片段时，优选地，所述血浆蛋白为白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、免疫球蛋白、转甲状腺蛋白和甲状腺结合蛋白中的一种或多种；所述血浆蛋白的片段为免疫球蛋白的Fc区域。一个所述血浆蛋白或血浆蛋白的片段通过共价键即肽键与所述生长分化因子的N端和/或C端偶联。
[0076] 当所述修饰物为标签多肽或血浆蛋白或血浆蛋白的片段时，可通过化学修饰或者融合表达的方式来实现修饰物与所述生长分化因子的偶联，即制备本发明经修饰的生长分化因子。
[0077] 所述融合表达方式制备所述经修饰的生长分化因子的方法，依次包括：
[0078] 编码所述经修饰的生长分化因子的基因序列的合成步骤；所述经修饰的生长分化因子的基因序列与基础载体连接形成重组载体的步骤；所述重组载体的转化步骤；转化后宿主细胞的筛选步骤；诱导融合蛋白的表达步骤；融合蛋白的收集步骤；融合蛋白的分离纯化步骤。优选地，所述分离纯化步骤采用亲和层析柱、阳离子交换柱和/或分子筛。
[0079] 当所述修饰物为高分子时，高分子为药学上常用的高分子，优选地，所述高分子为聚乙二醇(PEG)；所述聚乙二醇是线性或分叉的分子，分子量为1-100KD，更优选地，所述聚乙二醇的分子量5-40KD，进一步地，所述聚乙二醇为单甲基聚乙二醇。PEG可通过共价键与生长分化因子的游离的氨基，巯基或羧基偶联。可通过化学修饰的方式来实现修饰物与生长分化因子的偶联，即制备本发明经修饰的生长分化因子。所述化学修饰方式制备所述经修饰的生长分化因子的方法包括：混合步骤：将所述生长分化因子与修饰物以适当的摩尔比混合；反应步骤：向混合后的溶液中加入反应试剂，发生化学反应，从而得到反应液；纯化步骤：将所述反应液纯化，从而得到所述经修饰的生长分化因子。优选地，所述化学反应过程中控制反应液的pH值为3-10；所述纯化步骤采用亲和层析柱、阳离子交换柱和/或分子筛。如果想要修饰物对生长分化因子进行单位点修饰，则需选用专门单位点修饰聚乙二醇(单点修饰的聚乙二醇名称为：mPEG－butyrALD,购买自北京凯正生物，货号为KZ-SC)来实现的。
[0080] 当所述修饰物为小分子时，优选地，所述小分子为糖类、磷酸、自由基团如甲基、乙基或苯环。小分子通过共价键与生长分化因子中的游离的氨基、巯基或羧基偶联，不同的小分子偶联基团可能不同。即生长分化因子被糖基化、磷酸化、酰基化、乙基化或甲基化。具体的制备方法为酶催化反应法：将生长分化因子与小分子修饰物混合，加入相应的酶催化反应即可。
[0081] 当修饰物为标签多肽、血浆蛋白或血浆蛋白的片段时，本发明还提供编码上述经修饰的生长分化因子的核酸分子，包括DNA分子和RNA分子。其核酸分子可以是通过全基因合成的方法获得，也可以通过设计相同的酶切位点，将编码修饰物的核酸分子，与编码血浆蛋白或血浆蛋白的片段的核酸分子连接在一起。
[0082] 当修饰物为标签多肽、血浆蛋白或血浆蛋白的片段时，本发明还提供包含上述核酸分子的重组表达载体。优选地，所述重组表达载体是基于pET28a(+)，pET15b，pGEX-6p-1，pGEX-4T-1等质粒载体构建的载体。
[0083] 当修饰物为标签多肽、血浆蛋白或血浆蛋白的片段时，本发明还提供包含上述核酸分子或包含上述重组表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0084] 本发明还提供了一种药物组合物，包含：上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体或上述宿主细胞；和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体为：药学上可接受的各种常用缓冲液(比如：有机酸缓冲液如柠檬酸缓冲液、无机酸缓冲液如磷酸缓冲液、生理盐水)、蛋白质(如白蛋白和免疫球蛋白)、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂(如EDTA)、糖醇(如甘露醇)、聚乙二醇、以及表面活性剂(如TWEEN和PLURONICS)中的一种或多种。
[0085] 优选地，所述药物组合物，以总体积为100微升计，包括如下组分：0.01-0.2M磷酸缓冲液(pH 7.0)，0.01-0.1M葡萄糖，0.001-0.05M甘露醇，1-5微克所述经修饰的生长分化因子。更优选地，所述药物组合物，以总体积为100微升计，包括如下组分：0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0)，0.05M葡萄糖，0.01M甘露醇，2微克生长分化因子。
[0086] 所述药物组合物的剂型可以是：片剂、胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸；水针、冻干粉针、无菌粉针、注射液剂、喷雾制剂。优选为注射液剂型或喷雾制剂。
[0087] 所述药物组合物可以按照如下方式给药：口服、鼻黏膜给药、静脉注射、肌肉注射、静脉滴注、腹腔注射，肝动脉注射和皮下包埋。单次给药剂量为：1微克所述经修饰的生长分化因子/千克体重。
[0088] 本发明还提供了一种缓释制剂，包含：上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体、上述宿主细胞、或者上述药物组合物；以及药学上可接受的生物相容物质；优选地，所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。
[0089] 本发明还提供了一种包含上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体、上述宿主细胞、上述药物组合物或者上述缓释制剂的试剂盒。试剂盒中还可以包括其他物质，比如阴性对照或阳性对照等。
[0090] 上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体、上述宿主细胞、上述药物组合物、上述缓释制剂或者上述试剂盒在预防、改善或/和治疗老年痴呆症药物中的应用。
[0091] 上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体、上述宿主细胞、上述药物组合物、上述缓释制剂或者上述试剂盒在改善或治疗认知功能失常药物中的应用。所述认知功能失常是指与衰老相关的记忆力减退。
[0092] 一种预防、改善或治疗老年痴呆症的方法，该方法是通过一定的给药途径给予老年痴呆症病人上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体、上述宿主细胞、上述药物组合物、上述缓释制剂。
[0093] 一种改善或治疗认知功能失常的方法，该方法是通过一定的给药途径给予认知功能失常的人上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体、上述宿主细胞、上述药物组合物、上述缓释制剂。
[0094] 优选地，所述给药途径为口服、鼻黏膜给药、静脉注射、肌肉注射、静脉滴注、腹腔注射、肝动脉注射或皮下包埋。
[0095] 一种延长上述生长分化因子体内半衰期的方法，将所述生长分化因子修饰制备成上述经修饰的生长分化因子、上述核酸分子、上述重组表达载体、上述宿主细胞、上述药物组合物或者上述缓释制剂。
[0096] 下面通过实施例对本发明中的化合物制备和应用进行详细说明。
[0097] 本发明中使用的各种培养基和常用试剂均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，请参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)或相应产品的说明书。
[0098] 实施例1：His-tag与人生长分化因子11活性片段的N端进行偶联制备得到的含有His-tag-GDF11(化合物Ⅰ)的液体
[0099] 本实施例制备的His-tag-GDF11，其氨基酸序列参见序列表SEQ ID NO.8，其中His-tag具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，人生长分化因子11的活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，His-tag序列中C端即组氨酸上的游离羧基偶联到人生长分化因子N端的alpha-氨基上，形成肽键。
[0100] 本实施例化合物Ⅰ的具体制备方法如下：
[0101] (1)通过全基因合成的方法合成编码化合物Ⅰ的基因：该基因具有序列表中SEQ ID NO.10所示的碱基序列，该基因从5’端到3’端依次含有(详见图1和SEQ ID NO.10)：Nco I酶切位点(第1碱基-第6碱基)、编码His-tag的核苷酸序列(第7碱基-第32碱基)、编码人生长分化因子11活性片段的核苷酸序列(第33碱基-第362碱基)、Xho I酶切位点(第363碱基-第368碱基)；本步骤由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，该基因连接在pUC57质粒载体上。
[0102] (2)将含有编码化合物Ⅰ的基因(具有SEQ ID NO.10所示的碱基序列)的pUC57质粒载体进行限制性内切酶切割：限制性内切酶为Nco I和Xho I，切割反应温度为37℃，时间为2小时，切割反应的基因含量为50ng；得到小片段：基因序列A(即编码化合物Ⅰ的基因)；(3)将pET28a(+)质粒载体用Nco I和Xho I进行双酶切：切割反应温度为37℃，时间为4小时，切割反应的质粒含量为50ng；得到大片段：质粒的框架序列B；(4)酶切产物纯化和连接：分别对上述基因序列A和质粒的框架序列B进行琼脂糖电泳纯化，将纯化后的基因序列A和质粒的框架序列B用T4连接酶进行连接，连接条件为16℃过夜，连接反应中基因序列A和质粒的框架序列B的摩尔比为4：1，得到连接产物；
[0103] (5)将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化的条件为42℃热击90秒；(6)将转化后的大肠杆菌均匀涂抹到含有氨苄霉素抗性的固体LB平板(其中氨苄霉素的含量为50微克/毫升)上，37℃过夜培养，此时LB平板上会长出很多菌落；(7)用牙签挑4到5个菌落至1升含有氨苄霉素抗性的液体LB培养基(其中氨苄霉素的含量为50微克/毫升)里，37℃摇晃培养，摇晃的转速设定为220rpm。培养至菌液在600nm处吸光度为0.4-0.6之间时，加入IPTG诱导蛋白表达，加入的IPTG最终浓度为0.6mM；诱导蛋白表达的条件为37℃，220rpm；
[0104] (8)诱导5个小时后，离心收集大肠杆菌，离心条件为1500g，15分钟；
[0105] (9)将收集的大肠杆菌用5mM Tris盐酸缓冲液悬浮，然后进行超声破碎，最后通过12000g离心15min沉淀残渣，此时得到的上清液里含有大量His-tag与人生长分化因子11活性片段在N端进行偶联的复合物即His-tag-GDF11(化合物I)，其上清液可以直接上镍柱进行实施例2的纯化。
[0106] 实施例2：His-tag修饰人生长分化因子11活性片段的N端后用镍柱进行纯化[0107] 本实施例里面的His-tag具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，人生长分化因子具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，His-tag偶联到生长分化因子11活性片段的N端。具体地，本实施例的His-tag修饰的生长分化因子为实施例1得到的His-tag-GDF11。
[0108] 本实施例具体实施方法依次为：
[0109] (1)将镍柱进行平衡：镍柱里含有2毫升葡聚糖珠子，用20毫升的5mM Tris盐酸(pH8.0)进行过柱子平衡；
[0110] (2)将实施例1得到的含有偶联产物的上清液过镍柱，流速为2ml/min，这里的偶联产物为N端与His-tag偶联的生长分化因子；
[0111] (3)用含有20mM咪唑的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)冲洗柱子，流速为2ml/min，去除杂蛋白；
[0112] (4)再用含有400mM咪唑的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)洗脱柱子，流速为2ml/min，收集洗脱液，洗脱液里含有大量N端与His-tag偶联的生长分化因子，结果参见图3，偶联产物的大小为13kDa。
[0113] 实施例3：GST-tag与人生长分化因子11活性片段在N端进行偶联制备得到含有GST-tag-GDF11(化合物Ⅱ)的液体
[0114] 本实施例里面的GST-tag具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，GST-tag C端的羧基通过共价键即肽键偶联到人生长分化因子11活性片段的N端，偶联产物即GST-tag-GDF11，该修饰蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0115] 本实施例具体实施方法如下：
[0116] (1)通过全基因合成的方法合成编码GST-tag-GDF11的基因：该基因具有序列表中SEQ ID NO.11所示的碱基序列，该基因从5’端到3’端依次含有(详见图2和SEQ ID NO.11)：Nco I酶切位点(第1碱基-第6碱基)、编码GST-tag的核苷酸序列(第7碱基-第660碱基)、编码人生长分化因子11活性片段的核苷酸序列(第661碱基-第990碱基)、Xho I酶切位点(第
991碱基-第996碱基)；本步骤由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，该基因连接在pUC57质粒载体上。
991碱基-第996碱基)；本步骤由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，该基因连接在pUC57质粒载体上。
[0117] (2)将包含编码GST-tag-GDF11的基因(具有序列表中SEQ ID NO.11所示的碱基序列)的pUC57质粒载体进行限制性内切酶切割：限制性内切酶为Nco I和Xho I，切割反应温度为37℃，时间为2小时，切割反应的基因含量为50ng；得到小片段：基因序列A(编码GST-tag-GDF11的基因)；
[0118] (3)将pET28a(+)质粒载体用Nco I和Xho I进行双酶切：切割反应温度为37℃，时间为4小时，切割反应的质粒含量为50ng得到大片段：质粒的框架序列B；
[0119] (4)限制酶切割后的基因和质粒的纯化和连接：分别对上述基因序列A和质粒的框架序列B进行琼脂糖电泳纯化，将纯化后的基因序列A和质粒的框架序列B用T4连接酶进行连接，连接条件为16℃过夜，连接反应中基因序列A和质粒的框架序列B的摩尔比为4：1，得到连接产物；
[0120] (5)将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化的条件为42℃热击90秒；
[0121] (6)将转化后的大肠杆菌均匀涂抹到含有氨苄霉素抗性的固体LB平板(其中氨苄霉素的含量为50微克/毫升)上，37℃过夜培养，此时LB平板上会长出很多菌落；
[0122] (7)用牙签挑4到5个菌落至1升含有氨苄霉素抗性的液体LB培养基(其中氨苄霉素的含量为50微克/毫升)里，37℃摇晃培养，摇晃的转速设定为220rpm。培养至菌液在600nm处吸光度为0.4-0.6之间时，加入IPTG诱导蛋白表达，加入的IPTG最终浓度为0.6mM；诱导蛋白表达的条件为37℃，220rpm；
[0123] (8)诱导5个小时后，离心收集大肠杆菌，离心条件为1500g，15分钟；
[0124] (9)将收集的大肠杆菌用5mM Tris盐酸缓冲液悬浮，然后进行超声破碎，最后通过12000g离心15min沉淀残渣，此时的上清液里含有大量GST-tag与人生长分化因子11活性片段在N端进行偶联的复合物即GST-tag-GDF11(化合物Ⅱ)，上清液可以直接用于纯化。
[0125] 实施例4：GST-tag修饰人生长分化因子11活性片段的N端后用含谷胱甘肽的亲和柱进行纯化。
[0126] 本实施例里面的GST-tag具有SEQ ID NO.3序列，人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6序列，GST-tag偶联到生长分化因子的N端。具体地，本实施例的His-tag修饰的生长分化因子为实施例3得到的GST-tag-GDF11。
[0127] 本实施例具体实施方法依次为：
[0128] (1)将含有结合型谷胱甘肽的亲和柱进行平衡：QIAGEN结合型谷胱甘肽的亲和柱里含有2毫升葡聚糖珠子，用20毫升的5mM Tris盐酸(pH8.0)进行过柱子平衡；
[0129] (2)将实施例3制备的含有偶联产物的上清液过柱子，流速为2ml/min，这里的偶联产物为N端与GST-tag偶联的生长分化因子；
[0130] (3)用含有200mM氯化钠的5mMTris盐酸缓冲液(pH8.0)冲洗柱子，流速为2ml/min，去除杂蛋白；
[0131] (4)用含有25mM游离的谷胱甘肽的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)洗脱柱子，流速为2ml/min，收集洗脱液，洗脱液里含有大量N端与GST-tag偶联的生长分化因子，纯化结果参见图4，偶联产物的大小为38kDa。
[0132] 实施例5：20kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端进行偶联制备得到含有20kDa聚乙二醇-GDF11(化合物Ⅲ)的液体
[0133] 本实施例使用的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0134] 本实施例具体实施方法如下：
[0135] (1)取2微升人生长分化因子11活性片段(即具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，购自PeproTech,120-11)，在280nm波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到5mg/ml；
[0136] (2)取10ml浓度为5mg/ml的人生长分化因子11活性片段，向其中加入20kDa用于蛋白N端特异修饰的聚乙二醇(mPEG-ButyrALD,分子量20kDa，Nektar，该修饰剂只能和蛋白N端游离的alpha氨基偶联)固体100mg，在室温条件搅拌至完全溶解，这里的聚乙二醇用于特异修饰人生长分化因子11活性片段的N端，该聚乙二醇与上述人生长分化因子11活性片段混合的摩尔比为5:1，得到20kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段的混合物；
[0137] (3)向混合物中加入还原剂氰基硼氢化钠(CH3BNNa)(加入后还原剂在混合物中的浓度为50mM)，室温静置24小时，得到的含有20kDa聚乙二醇-GDF11的反应液。此时90％以上的人生长分化因子11活性片段被单一聚乙二醇修饰，即一个聚乙二醇与一个生长分化因子11分子发生偶联，偶联位点是生长分化因子11N端的α-氨基。这时，反应液可以直接用于上阴离子交换柱纯化。
[0138] 实施例6：20kDa聚乙二醇修饰人生长分化因子11活性片段的N端后用阴离子柱SourceQ纯化
[0139] 将实施例5得到的含有20kDa聚乙二醇-GDF11(化合物Ⅲ)的反应液用SourceQ层析柱(GE Healthcare)纯化。具体方法如下：
[0140] (1)用含有5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)将层析柱进行平衡；
[0141] (2)平衡后将实施例5得到的含有20kDa聚乙二醇-GDF11的反应液进行上样；
[0142] (3)上样后，用A液和B液混合液进行梯度洗脱，其中A液为5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)，B液为含有500mM氯化钠的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)，具体的梯度洗脱方法为：一开始只用A液过柱子5min，在此之后逐渐降低A液的比例，于此同时逐渐提升B液的比例，使得经过柱子的单位体积洗脱液中，B液的比例在50min中内，从0％逐步线性提升到100％，从而有效地建立了一个过柱子的氯化钠浓度梯度，进行梯度洗脱(本步骤可以通过Akta蛋白纯化系统软件设定，GE Healthcare)。从梯度洗脱开始时计时，未反应的聚乙二醇基本上不带电荷，所以在10min后最先被洗脱出来，洗脱出现蛋白峰的顺序为多位点修饰的人生长分化因子11活性片段(洗脱开始后18min出峰)、单位点修饰的人生长分化因子11活性片段(洗脱开始后30min出峰)和未修饰的人生长分化因子11活性片段(洗脱开始后45min出峰)。
通过280nm的紫外检测可以收集不同的洗脱蛋白峰，收集第二个蛋白峰的洗脱液即得到仅生长分化因子11活性片段N端的α-氨基被聚乙二醇修饰的化合物，从而分离纯化出单位点修饰的人生长分化因子11活性片段。纯化结果参见5，偶联产物的大小为33kDa。
通过280nm的紫外检测可以收集不同的洗脱蛋白峰，收集第二个蛋白峰的洗脱液即得到仅生长分化因子11活性片段N端的α-氨基被聚乙二醇修饰的化合物，从而分离纯化出单位点修饰的人生长分化因子11活性片段。纯化结果参见5，偶联产物的大小为33kDa。
[0143] 实施例7：40kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端进行偶联制备得到含有40kDa聚乙二醇-GDF11(化合物Ⅳ)的液体
[0144] 本实施例采用的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。本实施例具体实施方法如下：
[0145] (1)取2微升人生长因子11活性片段(即具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，购自PeproTech,120-11)，在280nm波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到5mg/ml；
[0146] (2)取10ml浓度为5mg/ml的人生长分化因子11活性片段，向其中加入40kDa聚乙二醇固体100mg，在室温条件搅拌至完全溶解，从而得到人生长分化因子11活性片段与40kDa聚乙二醇的混合物；这里的聚乙二醇为特异修饰蛋白N端的聚乙二醇(mPEG-ButyrALD,分子量40kDa，Nektar，该修饰剂只能和蛋白N端游离的alpha氨基偶联)，聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段混合的摩尔比为5:1；
[0147] (3)加入浓度为还原剂氰基硼氢化钠(CH3BNNa)(加入后还原剂在混合物中的浓度为50mM)，用盐酸调节pH至5，室温静置24小时。得到的含有40kDa聚乙二醇-GDF11的反应液。此时该反应液中90％以上的人生长分化因子11活性片段被单一聚乙二醇修饰，即一个聚乙二醇与一个生长分化因子11活性片段分子发生偶联，偶联位点是生长分化因子11N端的α-氨基。这时，反应液可以直接用于上阴离子交换柱纯化。
[0148] 实施例8：40kDa聚乙二醇修饰人生长分化因子11活性片段的N端后用阴离子柱SourceQ纯化
[0149] 将实施例7得到的含有40kDa聚乙二醇-GDF11(化合物Ⅳ)的反应液用SourceQ层析柱(GE Healthcare)纯化。具体方法如下：
[0150] (1)将层析柱用含有5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)进行平衡；
[0151] (2)平衡后将实施例7得到的含有40kDa聚乙二醇-GDF11的反应液进行上样；
[0152] (3)上样后，用A液和B液混合液进行梯度洗脱，其中A液为5mMTris盐酸缓冲液(pH8.0)，B液为含有500mM氯化钠的5mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)，具体的梯度洗脱的方法为：一开始只用A液过柱子5min，在此之后逐渐降低A液的比例，于此同时逐渐提升B液的比例，使得经过柱子的单位体积洗脱液中，B液的比例在50min中内，从0％逐步线性提升到100％，从而有效地建立了一个过柱子的氯化钠浓度梯度，进行梯度洗脱(本步骤可以通过Akta蛋白纯化系统软件设定，GE Healthcare)。从梯度洗脱开始时计时，未反应的聚乙二醇基本上不带电荷，所以在6min后最先被洗脱出来。洗脱出现蛋白峰的顺序为多位点修饰的人生长分化因子11活性片段(洗脱开始后15min出峰)、单位点修饰的人生长分化因子11活性片段(洗脱开始后22min出峰)和未修饰的人生长分化因子11活性片段(洗脱开始后45min出峰)。通过280nm的紫外检测可以收集不同的洗脱蛋白峰，收集第二个蛋白峰的洗脱液即得到仅生长分化因子11活性片段N端的α-氨基被聚乙二醇修饰的化合物，从而分离纯化出单位点修饰的人生长分化因子11活性片段。纯化结果参见图6，偶联产物的大小为53kDa。
[0153] 实施例9：N端与His-tag偶联的人生长分化因子11活性片段，即实施例1和2制备得到的His-tag-GDF11促进原代海马细胞增值的活性
[0154] 本实施例具体实施方法如下：
[0155] 取出2微升的纯化后的His-tag-GDF11偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养大鼠来源的原代海马细胞(本发明中使用的原代海马细胞的培养方法均参照以下文献中记载的方法：Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronal activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260.)，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的一些孔里(6个孔)加入偶联产物，每个孔中加入的偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组-His-tag-GDF11。同时往24孔板的另外一些孔里(6个孔)加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组-GDF11。最后，24孔板里剩余的一些孔(6个孔)不做处理，作为空白对照组。
[0156] 在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行细胞计数，分别计算实验A组、实验B组细胞数目占空白对照组细胞数目的比例。可以发现偶联产物(His-tag-GDF11)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马细胞增值，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段的活性的4倍多，具体参见图7。
[0157] 实施例10：His-tag与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例1和2制备得到的His-tag-GDF11促进原代海马细胞突触形成的活性
[0158] 本实施例具体实施方法如下：
[0159] 取出2微升的纯化后的His-tag-GDF11偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的部分孔里加入偶联产物，每个孔中加入的偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组-His-tag-GDF11(A组共处理6个孔)。同时往24孔板的另外部分孔里加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组(B组共处理6个孔)。最后，24孔板里剩余的一些孔不做处理，作为空白对照组(空白对照组共6个孔)。
[0160] 在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行突触计数，分别计算实验A组、实验B组突触数目占空白对照组突触数目的比例。可以发现偶联产物(N端与His-tag偶联的人生长分化因子11活性片段)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马突触的形成，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段的活性的5倍多，具体参见图11。在显微镜下对不同组的海马细胞进行成像，参见图17，从图17可见，实验B组(即具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的人生长分化因子11活性片段处理)明显比空白对照组形成更多的突触，实验A组(His-tag-GDF11处理)明显又比实验B形成更多的突触。
[0161] 实施例11：GST-tag与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例3和4制备得到的GST-tag-GDF11在血液中的长效效益
[0162] 本实施例里面的GST-tag具有SEQ ID NO.3序列，人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，GST-tag偶联到生长分化因子的N端。
[0163] 本实施例通过测量GST-tag-GDF11偶联产物和未修饰的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)在小鼠体内的半衰期，从而检验GST-tag修饰后人生长分化因子11活性片段的长效效益。具体如下：选用12只C75BL/6品系的成年小鼠，平均体重为30g左右。将小鼠分为两组，每组6只，分别通过尾静脉注射未修饰的人生长分化因子11活性片段和GST-tag-GDF11偶联产物，注射的剂量为20mg/kg体重。注射后，在以下时间点用取血针在小鼠眼部取血：5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，1小时，3小时，6小时，9小时，12小时，15小时，18小时，21小时，24小时，36小时，72小时。取血后，室温离心收集血浆，离心转速为1000g，离心时间为30分钟。
[0164] 用ELISA分别测血浆中人生长分化因子11活性片段和GST-tag-GDF11偶联产物的浓度。测量结果发现：人生长分化因子11活性片段在小鼠体内的半衰期为平均5小时，GST-tag-GDF11偶联产物在小鼠体内的半衰期为平均24小时。这表明GST-tag修饰的偶联产物能显著提高人生长分化因子11活性片段在小鼠体内代谢的半衰期，从而具有更长时间的疗效。
[0165] 实施例12：GST-tag与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例3和4制备得到的GST-tag-GDF11促进原代海马细胞增值的活性
[0166] 本实施例里面的GST-tag具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，GST-tag偶联到人生长分化因子活性片段的N端。
[0167] 本实施例具体实施方法如下：取出2微升的GST-tag-GDF11偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的一些孔里加入GST-tag-GDF11偶联产物，每个孔中加入的偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组。同时往24孔板的另外一些孔里加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组。最后，24孔板里剩余的一些孔不做处理，作为空白对照组。
[0168] 在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行细胞计数，分别计算实验A组、实验B组细胞数目占空白对照组细胞数目的比例。可以发现偶联产物(GST-tag-GDF11)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马细胞增值，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段活性片段的活性的2倍多，具体参见图8。
[0169] 实施例13：GST-tag与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例3和4制备得到的GST-tag-GDF11促进原代海马细胞突触形成的活性
[0170] 本实施例里面的GST-tag具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，GST-tag偶联到人生长分化因子的N端。
[0171] 本实施例具体实施方法如下：取出2微升的GST-tag-GDF11偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的一些孔里加入GST-tag-GDF11偶联产物，每个孔中加入的偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组。同时往24孔板的另外一些孔里加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组。
[0172] 最后，24孔板里剩余的一些孔不做处理，作为空白对照组。在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行突触计数，分别计算实验A组、实验B组突触数目占空白对照组突触数目的比例。可以发现偶联产物(GST-tag-GDF11)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马突触的形成，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段活性的3倍多，具体参见图12。
[0173] 实施例14：20kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例5和6制备的20kDa聚乙二醇-GDF11在血液中的长效效用
[0174] 本实施例里面的偶联产物为N端与20kD聚乙二醇偶联的人生长分化因子11活性片段，涉及的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0175] 本实施例通过测量20kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物和未修饰的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)在小鼠体内的半衰期，从而检验20kD聚乙二醇修饰后的GDF11长效效益。具体如下选用12只C75BL/6品系的成年小鼠，平均体重为30g左右。将小鼠分为两组，每组6只，分别通过尾静脉注射未修饰的人生长分化因子11活性片段和20kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物，注射的剂量为20mg/kg体重。注射后，在以下时间点用取血针在小鼠眼部取血：5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，1小时，3小时，6小时，9小时，12小时，15小时，18小时，21小时，24小时，36小时，72小时。取血后，室温离心收集血浆，离心转速为
1000g，离心时间为30分钟。
1000g，离心时间为30分钟。
[0176] 用ELISA分别测血浆中人生长分化因子11活性片段和20kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物的浓度。测量结果发现：人生长分化因子11活性片段在小鼠体内的半衰期为平均5小时，偶联产物在小鼠体内的半衰期为平均18小时。这表明20kD聚乙二醇修饰的偶联产物能显著提高人生长分化因子11活性片段在小鼠体内代谢的半衰期，从而具有更长时间的疗效。
[0177] 实施例15：20kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例5和6制备的20kDa聚乙二醇-GDF11促进原代海马细胞增值的活性
[0178] 本实施例里面的偶联产物为N端与20kD聚乙二醇偶联的人生长分化因子11活性片段，涉及的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0179] 本实施例具体实施方法如下：取出2微升的偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的一些孔里加入偶联产物，每个孔中加入的偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组。同时往24孔板的另外一些孔里加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组。最后，24孔板里剩余的一些孔不做处理，作为空白对照组。
[0180] 在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行细胞计数，分别计算实验A组、实验B组细胞数目占空白对照组细胞数目的比例。可以发现偶联产物(20kDa聚乙二醇-GDF11)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马细胞增值，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段活性的1.5倍左右，具体参见图9。
[0181] 实施例16：20kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例5和6制备的20kDa聚乙二醇-GDF11促进原代海马细胞突触形成的活性
[0182] 本实施例里面的偶联产物为N端与20kD聚乙二醇偶联的人生长分化因子11活性片段，涉及的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0183] 本实施例具体实施方法如下：取出2微升的20kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的一些孔里加入偶联产物，每个孔中加入的偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组。同时往24孔板的另外一些孔里加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组。最后，24孔板里剩余的一些孔不做处理，作为空白对照组。
[0184] 在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行突触计数，分别计算实验A组、实验B组突触数目占空白对照组突触数目的比例。可以发现偶联产物(20kDa聚乙二醇-GDF11)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马突触的形成，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段活性的1.2倍左右，具体参见图13。
[0185] 实施例17：40kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例7和8制备的40kDa聚乙二醇-GDF11在血液中的长效效用
[0186] 本实施例里面的偶联产物为N端与20kD聚乙二醇偶联的人生长分化因子11活性片段，涉及的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0187] 通过测量40kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物和未修饰的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)在小鼠体内的半衰期，从而检验40kD聚乙二醇修饰后的GDF11长效效益。具体如下：选用12只C75BL/6品系的成年小鼠，平均体重为30g左右。将小鼠分为两组，每组6只，分别通过尾静脉注射未修饰的人生长分化因子11活性片段和40kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物，注射的剂量为20mg/kg体重。注射后，在以下时间点用取血针在小鼠眼部取血：5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，1小时，3小时，6小时，9小时，12小时，15小时，18小时，21小时，24小时，36小时，72小时。取血后，室温离心收集血浆，离心转速为1000g，离心时间为30分钟。
[0188] 用ELISA分别测血浆中人生长分化因子11活性片段和40kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物的浓度。测量结果发现：人生长分化因子11活性片段在小鼠体内的半衰期为平均5小时，偶联产物在小鼠体内的半衰期为平均16小时。这表明40kD聚乙二醇修饰的偶联产物能显著提高人生长分化因子11活性片段在小鼠体内代谢的半衰期，从而具有更长时间的疗效。
[0189] 实施例18：40kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例7和8制备的40kDa聚乙二醇-GDF11促进原代海马细胞增值的活性
[0190] 本实施例里面的偶联产物为N端与40kD聚乙二醇偶联的人生长分化因子11活性片段，涉及的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0191] 本实施例具体实施方法如下：取出2微升的40kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的一些孔里加入偶联产物，每个孔中加入的40kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组。同时往24孔板的另外一些孔里加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组。最后，24孔板里剩余的一些孔不做处理，作为空白对照组。
[0192] 在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行细胞计数，分别计算实验A组、实验B组细胞数目占空白对照组细胞数目的比例。可以发现偶联产物(40kDa聚乙二醇-GDF11)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马细胞增值，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段活性的1.8倍左右，具体参见图10。
[0193] 实施例19：40kDa聚乙二醇与人生长分化因子11活性片段在N端偶联的产物即实施例7和8制备的40kDa聚乙二醇-GDF11促进原代海马细胞突触形成的活性
[0194] 本实施例里面的偶联产物为N端与40kD聚乙二醇偶联的人生长分化因子11活性片段，涉及的人生长分化因子11活性片段具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0195] 本实施例具体实施方法如下：取出2微升的40kDa聚乙二醇-GDF11偶联产物，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算偶联产物的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往24孔板的一些孔里加入偶联产物，每个孔中加入的偶联产物含蛋白500微克，作为实验A组。同时往24孔板的另外一些孔里加入500微克的人生长分化因子11活性片段(其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列)，作为实验B组。最后，24孔板里剩余的一些孔不做处理，作为空白对照组。
[0196] 在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验A组、实验B组和空白对照组分别进行突触计数，分别计算实验A组、实验B组突触数目占空白对照组突触数目的比例。可以发现偶联产物(40kDa聚乙二醇-GDF11)比人生长分化因子11活性片段更能促进原代海马突触的形成，偶联产物的活性是人生长分化因子11活性片段活性的1.4倍左右，具体参见图14。
[0197] 实施例20：化合物Ⅰ(实施例1和2制备的His-tag-GDF11)、化合物Ⅱ(实施例3和4制备的GST-tag-GDF11)、化合物Ⅲ(实施例5和6制备的20KD聚乙二醇-GDF11)、化合物Ⅳ(实施例7和8制备的40KD聚乙二醇-GDF11)对成年老小鼠(18个月龄)认知能力提升的活性。
[0198] 具体方法如下：化合物Ⅰ-Ⅳ通过鼠尾静脉分别注射进不同老鼠(C57BL/6,CD1品系)体内。给药组保证25微克/次的给药剂量，在24天内的给药8次(平均每三天给药一次)，给药组1-4均为20只18个月C57BL/6雄鼠，化合物Ⅰ-Ⅳ依次分配给1-4给药组。无给药组为20只18个月的C57BL/6雄鼠，在行为学实验前24天接受了8次Saline注射。阴性对照组为20只3个月的C57BL/6雄鼠，同样在行为学实验前24天接受了8次Saline注射。行为学实验为水迷宫实验用于检测老鼠的学习能力和记忆力。
[0199] 水迷宫实验在上午8点到下午1点间进行。水迷宫空间记忆训练期为4天，每天4次，每次训练间隔时间为10分钟。在实验中，每四个小鼠被随机分为一个训练组。对于每个训练组，水迷宫的平台位置被随机分配，且在整个训练中保持不变。训练中，小鼠从任意位置释放入水迷宫中，并允许它在120秒中搜索隐藏的平台。如果小鼠没有在120秒内找到平台，它将被引导到平台。每次训练中找到平台所用的时间和所经过的距离被智能摄像头自动记录下来。水迷宫测试在最后一次训练48小时后进行，每只小鼠被释放入没有放置平台的水迷宫中，并允许其自由活动60秒。其游动路线被智能摄像头自动记录下来。测试期比训练期时间短一倍，以避免小鼠产生抑郁行为。小鼠在目标象限花费的时间与其他三个象限花费的时间被记录下来，用于对小鼠记忆力的评估。测试结果参见图15，其中图(a)是训练第一天到第四天，每组小鼠找到隐藏平台所用时间，从图中可以看出聚乙二醇修饰后的Gdf11可明显提高小鼠的空间学习能力；图(b)是水迷宫测试中小鼠在目标象限所用时间，从图中可以看出20kD聚乙二醇修饰后的Gdf11可明显提高小鼠的空间记忆力。
[0200] 实施例21：化合物Ⅰ(实施例1和2制备的His-tag-GDF11)、化合物Ⅱ(实施例3和4制备的GST-tag-GDF11)、化合物Ⅲ(实施例5和6制备的20KD聚乙二醇-GDF11)、化合物Ⅳ(实施例7和8制备的40KD聚乙二醇-GDF11)在小鼠阿尔兹海默症模型治疗中的活性。
[0201] 5XFAD老年痴呆老鼠模型订购于美国jackson laboratory,并按照动物实验标准进行繁殖和饲养。每一只实验小鼠模型都通过鼠尾进行基因鉴定，确保APP基因和PS1基因的稳定突变。化合物Ⅰ-Ⅳ通过鼠尾静脉分别注射进老鼠体内。给药组保证25微克/次的给药剂量，在行为学实验前24天内的给药8次，给药组1-4均为20只14周龄5XFAD小鼠，化合物Ⅰ-Ⅳ依次分配给1-4给药组。无给药组为20只14周龄的5XFAD小鼠，在行为学实验前24天接受了8次Saline注射。阴性对照组为20只14周龄的C57BL/6雄鼠，同样接受Saline注射。行为学实验为水迷宫实验用于检测老鼠的学习能力和记忆力。水迷宫实验同实施例20。测试结果参见图16，其中图(a)是空间记忆力学习能力曲线图，从图中可以看出20kD聚乙二醇修饰后的Gdf11可明显提高老年痴呆小鼠的空间学习能力；图(b)是老年痴呆模型小鼠空间记忆力测评图，从图中可以看出His-tag修饰可明显提高老年痴呆小鼠的空间记忆力。
[0202] 实施例22
[0203] 正常人20例，经确诊的老年痴呆病人20例。
[0204] 首先，用柠檬酸钠的采血管采集静脉每个人的血浆3毫升，离心取上清1毫升，上下颠倒混匀后4℃运输至实验室用于蛋白萃取。在实验室中将分离出的血浆平均分装到1.5mlEP管内，-80℃冰箱保存。
[0205] 其次，将血浆从-80℃冰箱取出，插在冰上解冻，解冻后震荡混匀插在冰内。在转印缓冲液(48毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷，39毫摩尔每升甘氨酸，0.03％十二烷基硫酸钠)，封闭液(5％脱脂奶粉、0.1％TBST)的条件下，通过使用聚偏氟乙稀膜和半干转印系统进行蛋白印迹法，使用ECL溶液(GE Healthcare，rpn2108)进行可视化。在同一体积下检查正常人组和老年痴呆患者组的蛋白表达水平的变化，一维非变性凝胶电泳将目标蛋白分离后进行免疫印迹法。GDF11的抗体在5％的脱脂奶粉共同孵育和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体联用。正常人和老年痴呆症患者的血浆中GDF11的浓度对比结果参见图18，正常人的GDF11浓度明显高于老年痴呆患者。
[0206] 实施例23
[0207] 将实施例22中每个人的血浆小分子萃取物用于小分子质谱检测，其检测出的有明显含量变化的小分子及其变化趋势如图19。
[0208] 一、萃取
[0209] 1)将血浆从-80℃冰箱取出，插在冰上解冻，解冻后震荡混匀插在冰内；
[0210] 2)用打孔器将滤纸打成6mm的滤纸片平铺在96孔板内；
[0211] 3)用移液枪吸取5μL血浆加至滤纸片上，加入100ul100％甲醇；
[0212] 4)将样本室温静置40min；
[0213] 5)静止后吸取全部上清至EP管内，并离心4℃，12000rpm，20min；
[0214] 6)离心后用枪吸取80ul上清至上机专用样本瓶内，等待上机。
[0215] 二、上机检测
[0216] 设置液相色谱和质谱参数，使得样品上样量为5微升。液相色谱采用如下参数：流速为0.5mL/min，采用BEH C18柱子(2.1毫米高，50毫米内径)(GE Healthcare)，流动性采用乙腈和异丙醇的混合物(体积比为2：1)；质谱采用如下参数：内部气压为25psi，离子化器为ESI，离子化器电压设置为5000V，温度设置为300度，Q2室碰撞能力40eV。
[0217] 检测结果表明，GDF11的代谢产物中，丙酰Propionyl AC(C3)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC a C18:2、磷脂酰PC aa C36:6、磷脂酰C16:1–OH、磷脂酰PC aa C38:0、磷脂酰PC aa C38:6、磷脂酰PC aa C40:1、磷脂酰PC aa C40:2、磷脂酰PC aa C40:6、磷脂酰PC ae C40:6的浓度在正常人和老年痴呆患者中存在明显差别，具体参见图19，由此可以确定，上述代谢产物可以用于诊断和筛查老年痴呆疾病，即将上述代谢产物作为老年痴呆症的标志物。当该受试者的血液样本中上述一种或多种代谢产物的浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有老年痴呆症或者具有罹患老年痴呆症的风险。所述代谢产物的浓度是采用代谢组学方法测定的。
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