AFP158-166特异性TCR基因及其转基因T细胞及体外增殖方法及用途
阅读：70发布：2020-05-13
专利汇可以提供AFP158-166特异性TCR基因及其转基因T细胞及体外增殖方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了AFP158-166特异性TCR基因及其转基因T细胞及体外增殖方法及用途,AFP158-166特异性TCR基因，是 序列表 SEQ ID NO.1所示。本发明的AFP158-166特异性TCR转基因T细胞，具有对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。人工 抗原 递呈细胞在IL-15分泌的同时，可通过细胞表面的MHCI型分子递呈AFP158-166表位肽，诱导AFP特异性的免疫反应，以其体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T 细胞增殖 ，可提高转基因T细胞比例，增强其特异性，并通过IL-15的分泌辅助增强T细胞活性及抗 肿瘤 能 力 。，下面是AFP158-166特异性TCR基因及其转基因T细胞及体外增殖方法及用途专利的具体信息内容。
1.AFP158-166特异性TCR基因，其特征是所述基因如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的AFP158-166特异性TCR基因的转基因T细胞，其特征是用下述方法构建：以AFP158-166特异性TCR基因构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体，感染多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。
3.如权利要求2所述的AFP158-166特异性TCR基因的转基因T细胞的体外增殖方法，其特征是包括如下步骤：以人工抗原递呈细胞体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞；所述人工抗原递呈细胞是AFP158-166抗原肽基因与IL-15基因在B细胞淋巴瘤系的协同表达。
4.如权利要求2所述的AFP158-166特异性TCR基因的转基因T细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
AFP158-166特异性TCR基因及其转基因T细胞及体外增殖方
法及用途
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及AFP158-166特异性TCR基因、AFP158-166特异性TCR转基因T细胞、AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的体外增殖方法及AFP158-166特异性TCR转基因T细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
背景技术
[0002] 肿瘤特异性T细胞过继性细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)是肿瘤免疫治+疗的最新进展。细胞免疫尤其是CD8T细胞介导的特异性MHC-I类分子限制性细胞免疫功能在抗肿瘤免疫中起决定作用。T淋巴细胞通过特异性T细胞受体(Tcell receptor，TCR)识别肿瘤细胞表面抗原肽-MHC复合物而被激活。活化的T细胞可以直接溶解肿瘤细胞，或通过分泌细胞因子，如干扰素和肿瘤坏死因子，抑制肿瘤生长，阻止肿瘤血管生成。
[0003] 分子生物学技术的进步使制备转基因T细胞成为可能，可以肿瘤特异性T细胞克隆分离获得其特异性TCR，通过病毒载体导入患者淋巴细胞，特异性TCR转基因T细胞具有MHC限制的细胞毒性，杀伤表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞，再以适当的方法体外大量扩增特异性TCR基因修饰的多克隆T细胞进行过继性免疫治疗，已在临床试验中取得一定疗效。
[0004] 甲胎蛋白(alpha-fetoprotien，AFP)是原发性肝癌的肿瘤标志物，约有50％的肝癌患者的肿瘤细胞表达AFP。研究表明AFP含有多个MHC-I型限制性抗原表位，可激活细胞毒性T细胞。AFP158-166表位肽是其中之一，其可刺激从健康志愿者外周血分离的T细胞产生免疫应答。
[0005] 过继性细胞治疗的另一障碍是特异性T细胞的体外扩增。有效的抗原递呈，共刺激信号的存在和适宜的细胞因子环境是体外诱导抗原特异性T细胞增殖的关键。目前的体外增殖系统需要将抗原，共刺激分子和细胞因子共同加入培养体系，或需要培养自体树突状细胞，其效率和经济性对细胞治疗的临床应用构成不利影响。B淋巴瘤细胞表达大量的MHC和共刺激信号分子，在体外易于培养，如果导入肿瘤抗原和细胞因子基因使其表达肿瘤抗原和细胞因子，放射线灭活的淋巴瘤细胞可望作为刺激细胞应用于T细胞的体外扩增。白介素-2(IL-2)是最常用的维持T细胞增殖的细胞因子，但最近的研究表明白介素-15(IL-15)能更有效的维持抗原特异性T细胞的功能。
发明内容
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供AFP158-166特异性TCR基因。
[0007] 本发明的第二个目的是提供AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。
[0008] 本发明的第三个目的是提供AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的体外增殖方法。
[0009] 本发明的第四个目的是提供AFP158-166特异性TCR转基因T细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0010] 本发明的技术方案概述如下：
[0012] AFP158-166特异性TCR转基因T细胞，用下述方法构建：以AFP158-166特异性TCR基因构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体，感染多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。
[0013] AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的体外增殖方法，包括如下步骤：以人工抗原递呈细胞体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞；所述人工抗原递呈细胞是AFP158-166抗原肽基因与IL-15基 因在B细胞淋巴瘤系的协同表达。
[0014] AFP158-166特异性TCR转基因T细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0015] 本发明的优点：
[0016] 以AFP158-166特异性TCR基因构建的AFP158-166特异性TCR慢病毒载体，感染多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞，使其具有对于AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。人工抗原递呈细胞在IL-15分泌的同时，可通过细胞表面的MHC I型分子递呈AFP158-166表位肽，诱导AFP特异性的免疫反应，以其体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞增殖，可提高转基因T细胞比例，增强其特异性，并通过IL-15的分泌辅助增强T细胞活性及抗肿瘤能力。附图说明
[0017] 图1为AFP158-166特异性TCR转基因T细胞细胞毒性作用。
[0018] 图2为Pro5AFP158-166-MHC五聚体(FCM)检测未经人工抗原递呈细胞刺激的AFP158-166特异性TCR转基因T细胞比例。
[0019] 图3为Pro5AFP158-166-MHC五聚体(FCM)检测经人工抗原递呈细胞刺激的AFP158-166特异性TCR转基因T细胞比例。
[0020] 图4为ELISPOT检测AFP158-166特异性TCR转基因T细胞对IFN-γ的分泌。
[0021] 图5 ELISA检测BA15对IL-15表达。
[0022] 图6为BA15对AFP158-166抗原肽的稳定表达(液相色谱-质谱联用)；其中：
[0023] 图6-1为标准品液相色谱图(箭头所示位置为标准品出峰位置；
[0024] 图6-2为标准品在图6-1所示出峰位置的质谱结果；
[0025] 图6-3为BJAB细胞洗脱液液相色谱图(箭头所示位置为与标准品相同保留时间，无明显色谱峰出现，质谱检测无信号；
[0026] 图6-4为W1BA15洗脱液液相色谱图(箭头所示位置为与标准品相同保留时间；
[0027] 图6-5为W1BA15洗脱液在图6-4所示出峰位置的质谱结果；
[0028] 图6-6为W6BA15洗脱液液相色谱图(箭头所示位置为与标准品相同保留时间；
[0029] 图6-7为W6BA15洗脱液在图6-6所示出峰位置的质谱结果。
[0030] 图7为辐照对BJAB细胞HLA-A2，CD80，CD86表达影响：辐照后BJAB细胞对于CD80，CD86，HLA-A2表达均有下降，但不明显，且与辐照剂量无明显相关性；其中：
[0031] 图7-1为辐照后BJAB细胞HLA-A2的表达；
[0032] 图7-2为辐照后BJAB细胞CD80的表达；
[0033] 图7-3为辐照后BJAB细胞CD86的表达。
[0034] 图8为辐照对BJAB细胞增殖影响。
[0035] 图9为辐照后BJAB细胞增殖(CFSE法)。
[0036] 图10为BA15对IL-15的稳定表达(ELISA)。
[0037] 图11为CFSE法检测不同种类抗原递呈细胞激活AFP158-166特异性TCR转基因T细胞增殖；其中：
[0038] 图11-1为抗原递呈细胞(DC(1:10))激活AFP158-166特异性TCR转基因T细胞增殖；
[0039] 图11-2为抗原递呈细胞(BA15(1:10))激活AFP158-166特异性TCR转基因T细胞增殖。
[0040] 图12为DC和BA15诱导的AFP158-166特异性TCR转基因T细胞细胞毒性作用；其中：
[0041] 图12-1为DC诱导的AFP158-166特异性TCR转基因T细胞细胞毒性作用；
[0042] 图12-2为BA15诱导的AFP158-166特异性TCR转基因T细胞细胞毒性作用。
具体实施方式
[0043] 人工抗原递呈细胞简称BA15。
[0044] 外周血购于天津市中心血站，经筛选，获得基因型为HLA-A0201。
[0045] HepG2细胞、T2细胞、SW480细胞和SW620细胞购于ATCC。
[0046] BJAB细胞购于上海拜力生物科技有限公司。
[0047] Human IFN-γprecoated ELISPOT kit(Catalog#DKW22-1000-096)：北京达科为生物技术有限公司
[0048] CytoTox-GloTMCytotoxicity Assay(Catalog#G9290)：Promega，USA[0049] Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit(Catalog#HPK-LvTR-20)：GeneCopoeia，USA
[0050] MHC Class I Pantamer，HLA-A0201，AFP 158-166(FMNKFIYEI)，R-PE(Catalog#F82A)：
[0051] PROIMMUNE，UK
[0052] 实施例1AFP158-166特异性TCR基因的获取
[0054] (2)成熟DC负载AFP158-166抗原肽后激活并扩增AFP158-166抗原特异性CD8+T淋巴细胞；
[0055] (3)荧光活化细胞分选技术分离Pro5MHC-AFP158-166五聚体和CD8双阳性细胞；
[0056] (4)提取AFP158-166特异性T细胞总RNA，反转录cDNA，PCR扩增AFP158-166特异性T细胞TCRα/β基因，Overlapping PCR获得2A序列连接的全长AFP158-166特异性TCR基因；
[0057] (5)构建AFP158-166特异性TCR慢病毒表达质粒，将质粒送至北京奥科鼎盛公司进行测序鉴定，AFP158-166特异性TCR基因测序结果如SEQ ID NO.1所示。
[0058] 实施例2AFP158-166特异性TCR转基因T细胞，用下述方法构建：
[0059] 以AFP158-166特异性TCR基因构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体(Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit)，感染由基因型HLA-A0201外周血以密度梯度离心法分离获得的多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。
[0060] 实施例3AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的鉴定
[0061] (1)Pro5AFP158-166-MHC五聚体(FCM)检测AFP158-166特异性TCR转基因T细胞比例：Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例为1.8％，见图2。
[0062] (2)酶联免疫斑点技术(ELISPOT)鉴定AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的功能：AFP158-166特异性TCR转基因T细胞组，可见明显斑点形成，平均斑点面积与DC诱导的AFP158-166特异性T细胞组无统计学差异，但斑点个数明显增多接近2倍，具有统计学差异，见图4。
[0063] 实施例4AFP158-166特异性TCR转基因T细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0064] 细胞毒性实验检测AFP158-166特异性TCR转基因T细胞对靶细胞的杀伤作用：AFP158-166特异性TCR转基因T细胞和负载AFP158-166的DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对SW480细胞，SW620细胞，负载Her2的T2细胞和空载的T2细胞无特异性杀伤作用。对负载+
AFP158-166肽的T2细胞和AFP 人肝癌细胞系HepG2有特异性杀伤作用，且随效靶比的增加线性升高。在相同的效靶比下，AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较负载AFP158-166的DC诱导的AFP158-166特异性T细胞特异性杀伤作用升高，具统计 学差异，见图1。
AFP158-166肽的T2细胞和AFP 人肝癌细胞系HepG2有特异性杀伤作用，且随效靶比的增加线性升高。在相同的效靶比下，AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较负载AFP158-166的DC诱导的AFP158-166特异性T细胞特异性杀伤作用升高，具统计 学差异，见图1。
[0065] 实施例5抗原递呈细胞的构建和鉴定：
[0066] (1)AFP158-166表位肽基因修饰IL-15信号序列(SEQ ID NO.2)慢病毒载体感染BJAB淋巴瘤细胞，建立稳定表达IL-15并递呈AFP158-166表位肽的B淋巴瘤细胞系；
[0067] (2)ELISA鉴定IL-15表达，见图5；
[0068] (3)液相色谱-质谱联用鉴定AFP158-166抗原表位肽的表达(见图6)；
[0069] (4)20Gy剂量的137Csγ射线辐照可诱导凋亡有效阻滞人工抗原递呈细胞增殖但不会使其迅速死亡，不会影响其表面MHC分子及协同刺激分子CD80、CD86的表达，在保证其安全性的基础上实现人工抗原递呈细胞功能；(见图7、8、9)
[0070] (5)通过ELISA和液相色谱-质谱联用分别鉴定在其反复冻存多次传代后IL-15和AFP158-166抗原肽仍可稳定表达(见图6、10)；
[0071] (6)通过CFSE染色法鉴定其在1:10比例下与最佳刺激比例(1:10)负载AFP158-166肽的DC对于特异性激活T细胞具有相同的能力；(见图11)
[0072] (7)其诱导的AFP158-166特异性T细胞较负载AFP158-166的DC诱导的AFP158-166特异+性T细胞对AFP人肝癌细胞系HepG2有更强的特异性杀伤作用。见图12。
[0073] 实施例6.AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的体外增殖方法
[0074] (1)取对数生长期的人工抗原递呈细胞予137Csγ射线辐照，剂量为20Gy；
[0075] (2)按数量比为1：10的比例将人工抗原递呈细胞加入AFP158-166特异性TCR转基因T细胞；
[0076] (3)一周后再次按数量比为1：10的比例加入人工抗原递呈细胞；
[0077] (4)以Pro5AFP158-166MHC五聚体(FCM)检测AFP158-166特异性TCR转基因T细胞比例。经过其2轮刺激后，其中Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例从1.8％上+ +升至4.2％，CD8T细胞/CD4T细胞比例由0.42上升至1.10。可通过提高AFP158-166特异性TCR转基因T细胞比例增强特异性，并通过IL-15的分泌辅助增强AFP158-166特异性TCR转基因T细胞活性及抗肿瘤能力。见图2、图3。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种细胞特异性ndrg2基因表达下调的载体 | 2020-05-12 | 24 |
| 大鼠睾丸特异性基因RSB66参与细胞周期的调控 | 2020-05-12 | 688 |
| 一种基于Ipr1基因构建的巨噬细胞异性打靶载体和重组细胞 | 2020-05-12 | 982 |
| 人异基因有核细胞工业化制备自然杀伤性细胞（NK）及注射液 | 2020-05-12 | 658 |
| 一种基于Ipr1基因构建的巨噬细胞异性打靶载体和重组细胞 | 2020-05-13 | 763 |
| 具有差异GSTT1表达或基因型的干细胞亚群 | 2020-05-12 | 600 |
| 癌抗原特异性T细胞受体基因、由该基因编码的肽及其使用 | 2020-05-13 | 573 |
| 一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白 | 2020-05-12 | 460 |
| 一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白 | 2020-05-12 | 233 |
| 肿瘤特异性细胞亚群和特征基因及其应用 | 2020-05-11 | 487 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈