本发明涉及重组的胚干细胞、胚种系细胞和成人的干细胞，其中 含有非细胞损伤的可检测蛋白质的基因和抗性基因，制备细胞的方法 以及其他实施方案。

建议将培养物中的分化的胚干细胞(ES)的体外的心肌发生作为 未限制的心肌细胞的来源，用于在不可逆受损的心脏组织替代治疗中 进行移植(Klug等，1996)。这一途径实际进行时的一个主要障碍是 分化的ES起源的心肌细胞的产量相对较低，它们通常只构成了不超 过1-3％的分化的全部的ES-细胞群体(Muller M.等，2000)。

另外，仍然存在的非分化的ES-供体细胞在与肿瘤发展相关的分 化的后期中增加了受体的潜在危险。所以，开发有效的和高度特异的 选择方法的目的认为是在心脏紊乱的细胞治疗中的里程碑。较早的时 候已经证明，可以成功地从遗传修饰的ES-细胞中选择富含心肌细胞 的群体，这些ES细胞是用受α-心脏-肌球蛋白-重链启动子控制的氨基 糖苷磷酸转移酶(α-MHC-Neo)的药物抗性基因的转基因稳定转染的 (Klug等，1996)。这一工作进一步显示了这一途径发展成大规模的 有效方法的潜在问题：

a)在分化的ES细胞的贴壁培养物中进行了用选择药物(G418) 来处理，而从有效性以及技术可行性的观点来看，最佳的途径是在ES- 细胞-胚状体(胚状体＝EB)的聚集体的悬浮液上直接应用选择药物 (Wobus等，1991)。

b)通过工作证明在没有供体细胞的存活标记时导入的后果，显 然使得有关在受体动物的心脏中导入遗传选择细胞的进一步实验更为 复杂。

DE-A-19727962叙述了非人哺乳动物的胚胎干细胞，是用含有 DNA序列的DNA构建体来稳定转染的，该DNA序列编码了非细胞 损伤的荧光蛋白质，其中所述DNA序列是在细胞和/或发育依赖的启 动子的控制之下(Kolossov等，1998)。这样的重组ES-细胞具有下 面的优点：

1.虽然用这一方法可以在体外提供特异的细胞类型，然而纯化 这些重要的染色的细胞是困难的。一方面，这可以通过目的细胞(如 心肌细胞)的数目仅占EB中产生的细胞约1-3％的事实来解释。另一 方面，细胞纯化的方法(例如荧光活化细胞的分类，FACS)理想地 是适于免疫细胞的。但是，在纯化例如心肌细胞时，许多细胞死亡或 不可逆地损伤。

2.另外，结果证明，在平铺的EB上，用潮霉素纯化方法，非 潮霉素抗性细胞甚至在选择的7-14天后也难于除去。尽管预先利用了 潮霉素作为选择标记，还是发生了肿瘤。这在用新霉素选择时是同样 的。

本发明的目的是提供从胚干细胞、胚种系细胞和成人干细胞的分 化的培养物中分别选择和萃取细胞的新系统，从而避免了上面提到的 问题。如本发明所述，作为“系统”，选择方法、细胞和细胞的利用 以及尤其医学领域中的方法的组合还有待于理解。这一目的是通过权 利要求1所述的胚干细胞、胚种系细胞和成人干细胞来达到的。本发 明的优选的实施方案描述在权利要求1后的权利要求中。

本发明公开了一种系统，其在细胞和/或发育特异的启动子的共 同控制下，通过(药物)抗性基因和可检测的报道基因的结合应用， 用于细胞和/或发育特异性选择分化的胚干细胞、胚种系细胞和成人干 细胞。

本发明首先一般性地，随后通过从用两种载体转染的胚干细胞的 分化培养物中遗传选择心脏细胞的实施例进行了说明。需强调的是， 本发明不局限于这些特定的实施方案，但可适用于所有3种胚层起源 的细胞类型，即内胚层、中胚层和内胚层，和由于干细胞和种系细胞 的多能性分别从中起源的细胞。本领域的技术人员能够在根据下面的 叙述和常识，在所附的权利要求的范围内改变本发明。

根据本发明，将至少一种抗性基因和至少一种编码例如非细胞损 伤的可检测蛋白质的可检测的报道基因的信息导入胚干细胞、胚种系 细胞和成人干细胞。两种基因的信息可以在一种载体上或分布在两种 载体上获得。关键是可检测的例如荧光蛋白质的基因以及抗性基因的 表达在同一个启动子的控制之下。

根据本发明，启动子是从细胞特异的启动子和发育特异的启动子 中选择的。细胞和组织特异的启动子分别指那些在特异的细胞群体和 组织中有活性的那些启动子。所以，它们属于例如神经元细胞、内皮 细胞、骨骼肌细胞、平滑肌组织细胞以及角质细胞。特别优选的是心 肌细胞(心肌细胞)。

组织特异启动子的其他实施例是，在神经胶质细胞、造血细胞、 神经元细胞，优选胚神经元细胞、内皮细胞、软骨细胞和表皮细胞以 及胰岛素分泌β细胞中有活性的那些启动子。“组织特异”归类在术 语“细胞特异”下。

心脏特异启动子的例子有：Nkx-2.5(分别特异于非常早期的心 肌细胞和中胚层前体细胞(Lints等，1993))；人-心脏-α-肌动蛋白 (特异于心脏组织(Sartorelli等，1990))；MLC-2V(特异于心室 心肌细胞(O’Brien等，1993)和WO-A-96/16163)。

非心脏特异启动子的其他实施例有：PECAM1、FLK-1(内皮)、 巢蛋白(nestine)(神经元前体细胞)、酪氨酸-羟化酶-1-启动子(多 巴胺能神经元)、平滑肌α-肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白(平滑肌)、 α1-胎蛋白(内胚)、平滑肌重链(SMHC最小启动子(特异于平滑 肌(Kall-meier等，1995)。

术语发育特异的启动子指，在发育过程的某些时间点中有活性的 启动子。这些启动子的例子有β-MHC启动子，其在小鼠心室 (Nentriculum)的胚发育过程中表达，并且在出生前的时期中用α-MHC 启动子替代；NKx2.5，在早中胚层/心脏发育过程中的启动子；心钠 素，除了起博点也是在后发育期下调的早期胚心脏的标记；F1k-1，在 早期血管发生过程中有活性的内皮特异的启动子；在神经元前体细胞 (胚胎神经元和胶质细胞)和成人胶质细胞(部分仍然能够分裂)中 表达的nestine基因的内含子2-区段(Lothian和Lendahl，1997)。

根据本发明，启动子涉及控制基因转录的DNA序列区。在一个 实施方案中，它至少包括一个最小的序列，该序列定位于起始密码子 的上游，并且包括转录起始的RNA聚合酶的结合位点。这一最小序 列可以用其他功能DNA部分，特别是增强子来补充。同样可适用的 是定位于内含子区并且可能定位于待转录基因的下游的调节元件。在 这种情况中，转录速度例如可以通过本身不具有活性的其他增强子元 件来控制。也可以利用启动子构建体，其中一个本身非组成型的活性 元件(热休克蛋白质增强子)是与起源于内含子的基因的增强子区段 一起利用的。

在本发明的其他实施方案中，利用了允许选择，例如中胚层细胞 的发育特异的启动子。控制抗性基因和可检测蛋白质的基因转录的可 适用的启动子元件是NKx2.5、ANF和brachyuria启动子。在检测了 表达可检测蛋白质的细胞后，例如，如果利用中胚层特异的启动子， 则检测的细胞可以是中胚层细胞，加入适于抗性基因的选择试剂，选 择中胚层前体细胞。通过转录受到共同启动子控制的可检测蛋白质的 基因和抗性基因后，以高度特异的方式可以消除非分化细胞，例如胚 多能性干细胞，从而可以相当大地减少肿瘤后来发展的可能性。这样 得到的中胚层细胞可以移植进各个组织并且进一步在那里分化，例如 移植后在预先受损的心脏区域中分化成心脏细胞。一方面，这一途径 允许产生大量的预先纯化的前体细胞，另一方面，这一途径允许进一 步移植后在天然条件下进一步分化。

以相似的方法，通过内胚层或外胚层特异的启动子选择内胚层或 外胚层细胞是可能的。

中胚层细胞的例子有所有的肌肉细胞类型(心肌、骨骼肌和平滑 肌细胞)、造血细胞和内皮细胞。外胚层细胞的例子有皮肤细胞、神 经元和胶质细胞；内胚层细胞的例子有肠胃道的上皮细胞。

通过上面提到的细胞类型的特异的启动子，和利用本发明的方法 和本发明的细胞，在这些内胚层、外胚层和中胚层细胞和组织中分别 发生了高度特异的发育，其中受同一个启动子控制下的报道基因和抗 性基因的表达保证了最大的安全性，因为一方面非分化的多能性胚干 细胞得到消除，另一方面也是其他组织类型得到消除。

根据本发明，在荧光蛋白质的一个实施方案中，报道基因编码了 例如，非细胞损伤的可检测蛋白质。这样的非细胞损伤荧光蛋白质本 身是已知的。

根据本发明，可以利用来自水母Aequorea victoria的绿荧光蛋白 质(GFP)(在WO-A-95/07463、WO-A-96/27675和WO-A-95121 191 中描述)和它的衍生物“蓝GFP”(Heim等，Curr.Biol.6(2)：178-182 (1996)和Redshift GFP”(Muldoon等，生物技术22(1)：162-167 (1997))。特别优选的是增强的绿荧光蛋白质(EGFP)。其他的实 施方案是黄色的和蓝绿色的荧光蛋白质(YFP，CFP)。其他荧光蛋白 质是本领域技术人员已知的，并且可以根据本发明来利用，只要它们 不损伤细胞。荧光蛋白质的检测是通过本身已知的荧光检测方法来进 行的。

特别是在体内应用中，替代荧光蛋白质，也可以利用其他可检测 蛋白质，特别是这些蛋白质的表位。还可以利用虽然能损伤细胞本身， 但其表位不损伤细胞的蛋白质的表位。

优选地，它涉及了定位于细胞表面的表位，允许例如结合抗体分 别通过荧光标记和成像方法(磁颗粒)进行简单的检测。优选地在体 内应用中分别选择这些蛋白质和它们的表位，以致它们是与寄主免疫 兼容的，这意味着它们不诱导排斥。同样优选应用的是不连接胞内信 号级联的蛋白质的转基因表位，特别是CD8或CD4的表面表位。另 一个例子是受体的表位。重要的是它分别涉及了在细胞例如心脏细胞 中不存在，即不表达的蛋白质和它们的表位，所述蛋白质和表位是通 过从用本发明的载体转染的干细胞和种系细胞中分化和选择而得到 的。可以利用在分化和选择的细胞例如心脏细胞中不表达的任何蛋白 质，或特异性可检测的，并在选择细胞中不表达的转基因表位。这些 蛋白质和表位分别称为细胞标记，细胞标记基因或报道基因。这些可 检测蛋白质和表位的检测分别可以例如利用特异性结合这些可检测蛋 白质和表位并且可以通过例如荧光介导的方法或成像方法来鉴定的抗 体。例子有抗-CD8或抗CD4-荧光共轭细胞表面抗体和铁磁颗粒结合 抗体成分。作为允许最高纯度纯化的其他技术，细胞分类是适用的。 在加入选择剂，例如抗生素嘌呤霉素已经高度富集所需的分化细胞 后，可以通过MACS分类到99％来进一步纯化细胞。

在胚或成人干细胞和胚种系细胞是在本发明的优选的实施方案中 可以已知作为胚体的聚集体形式获得。图4显示了得到胚体的方案。 制备优选地用“悬滴”方法或用甲基纤维素培养来进行(Wobus等， 分化(1991)48，172-182)。

或者，可以利用旋转烧瓶(搅拌培养物)作为培养方法。在搅拌 培养物中加入未分化的ES-细胞，并且根据确立的方法持久地混合。 所以，在150ml含有20％FCS的培养基中加入1千万的ES-细胞，不 停地搅拌，速度为20rpm，其中有规律地改变搅拌运动的方向。在加 入ES-细胞后24小时，另加入含有血清的100ml培养基，每天换100- 150ml培养基(Wartenberg等，2001)。在这些培养条件下，根据培 养基的组成，可以得到大量的ES-细胞起源的细胞，即心肌细胞、内 皮细胞、神经元等。通过抗性基因，仍然在搅拌的培养物中或在平铺 后选择细胞。

或者，可以不平铺在悬滴中分化的EB，而是简单地保持在悬浮 液中。甚至在这些条件下，凭经验可以观察到分化的发展。但是，令 人惊奇的是，应用抗性基因导致非心肌细胞更快地染色，并且其余的 心肌细胞随后开始自发地搏动。这一实验发现清楚地表明，心肌细胞 不需要来自它们生存的周围组织的特异信号，并且进一步表明嘌呤霉 素选择的心肌细胞在功能上是完整的。洗去非心肌细胞也明显地简化 了，因为单独用机械混合和加入低浓度的酶(如胶原酶、胰蛋白酶)， 在简单地洗去非心肌细胞后可以获得单一的细胞悬浮液。

胚干细胞是起源于哺乳动物，特别优选地是起源于啮齿动物，例 如小鼠、大鼠和兔子。特别优选的ES细胞是D3细胞(Doetschmann 等，1985)(Doetschmann等，J.Embryol.Exp.Morphol.(胚实验形 态学杂志)，87，27(1985))，R1细胞(Nagy等，PNAS(1995))， E14细胞(Handyside等，Roux Arch.Develop.Biol.198，48(1989))， CCE细胞(Bradley等，自然，309，255(1985))(当然可以利用 已知的或将来有待开发的其他ES细胞)和P19细胞(这些是特征有 限的畸胎瘤起源的细胞(Mummery等，Dev.Biol.109，402(1985))。

在另一个优选的实施方案中，如Thomson，J.A.等，1995所述利 用了灵长类的胚干细胞。

在特别优选的实施方案中，利用了人胚干细胞。这些胚干细胞的 制备已经确立(Thomson JA等，1998)。所以，得到了胚泡的内部细 胞质量，铺在小鼠的饲养细胞上。在成功繁殖后，分开细胞，通过对 特异的干细胞基因进行RT-PCR，采用免疫组织化学鉴定特异的蛋白 质和代谢产物来分析它们的干细胞特性。另外，通过体外分化成不同 的细胞类型及经几次传代后繁殖和分开可以确定干细胞状态。

用胚种系细胞(EG)替代胚干细胞也是合适的(Shambott MJ等， 1998)，它们是从早期的胚中得到的，可以在后面的时间象胚干细胞 一样培养和分化。

本发明也适用于成人干细胞。参照Anderson等，1001，Gage，F.H.， 2000和Prockop，D.J.，1997的文献，其中叙述了这些细胞的萃取和培 养。

抗性基因本身是已知的。这些基因的例子有，核苷和氨基糖苷抗 生素抗性基因，例如嘌呤霉素(嘌呤霉素-N-乙酰转移酶)、链霉素、 新霉素、庆大霉素或潮霉素。抗性基因的其他例子是脱氢叶酸还原酶， 它给予抗氨基蝶呤和氨甲蝶呤的抗性，已经多个药物抗性基因，它们 给予抗多个抗生素的抗性，例如抗长春碱、阿霉素和放线菌素D。特 别优选的是给予嘌呤霉素抗性的构建体。以同样意义，本文利用了术 语抗性基因和药物或活性物质抗性基因，是指例如在各种情况中编码 抗生素抗性的基因。其他编码药物和活性物质抗性的基因也可以利 用，例如DHFR基因。

可以利用不是抗性基因的其他可选择标记基因，其允许特异性选 择含有本发明构建体的细胞，可以在体内不损伤病人生存的情况下应 用。本领域的技术人员可以得到适当的基因。

在第一个例子中，可检测蛋白质的基因和抗性基因定位于两种不 同的构建体上。利用两种不同的载体，其中抗性基因定位于第一种载 体，受体基因定位于第二种载体，例如EGFP，其中两种都是受细胞 和组织特异或发育特异的启动子，例如受α-MHC启动子的控制，证 明了在本发明中所述的多方面优点，它们适于某些目的。但是，另外 的实验表明，这一系统令人吃惊地也与一些缺点相关，即与细胞的构 成相关，所述细胞尽管抗抗性基因但其中含有亚细胞克隆，不表达报 道基因例如EGFP，所以是例如EGFP阴性。这样的亚克隆可能是畸 胎瘤的潜在的来源，因为不是全部的非特异细胞，同样例如非心肌细 胞即使在应用抗生素后得到消除。这可能潜在地导致可以形成肿瘤的 快速增殖的ES细胞的生存。

在进行的实验中，观察到确实EGFP阴性细胞甚至可以在嘌呤霉 素接触后15天中生存。这一观察结果可能的原因是在双转染的细胞 中导入了两种载体。然后，这些载体在阴性基因组的不同位点上部分 地整合进了寄主基因组，所以受到了不同基因和它们的控制序列的影 响，具有不同的转录活性。

所以，在本发明的另一个实施方案(实施例2)中，在一个启动 子的控制下在一种载体构建体上安排了报道基因和抗性基因。在本发 明的实施例2中，嘌呤霉素抗性盒(Pac)以及报道基因EGFP均在组 织特异的启动子α-MHC的共同控制下。这一系统的主要优点是非常 低的抗性细胞发生率，这些抗生细胞不是细胞或组织特异或发育特异 的。例如，嘌呤霉素抗性细胞不是心脏细胞出现的可能性非常低。这 似乎是由于下列事实：Pac-盒子和EGFP基因只在寄主基因组的一个 或几个位点整合，所以不受到在各个上游或下游定位的基因结构的不 同活性速度的影响。通过得到的克隆的进一步选择，可能得到了实际 上纯的细胞系统。这一估计是利用EGFP表达进行的。在这一点上， 应当再次指出，EGFP、α-MHC和Pac是本发明的实施方案的例子。 本领域的技术人员可以进行关于上面的应用中所述的或选方法的修 改。

在胚干细胞中导入载体构建体或构建体是在已知的方法中进行 的，例如通过转染、电穿孔、脂转染或借助于病毒载体。

为了选择稳定性转染的ES-细胞，载体构建体另外含有给予例如 抗抗生素例如新霉素抗性的可选择标记基因。当然，其他已知的抗性 基因以及上面所述的与荧光蛋白质编码基因相关的抗性基因也可以利 用。选择稳定转染的ES细胞的选择基因是在不同启动子的控制下的， 而不是调节可检测蛋白质的表达的控制。经常可以利用组成型活性启 动子，例如PGK启动子。

利用第二种选择基因对于完全鉴定成功转染的克隆(有效性是相 对低的)的能力是重要的。否则绝大部分非转染ES细胞将存在，并 在分化过程中，例如不能检测到EGFP阳性细胞。

在转染后，构建体稳定地转染进天然的DNA中。在活化了细胞 特异和/或发育特异的胞内信号后，启动子被激活，可检测蛋白质以及 (第一)抗性基因表达。不仅例如通过在荧光激发下发射荧光检测ES- 细胞成为可能，而且那些在细胞特异和/或发育特异的启动子控制下的 细胞也可以在同一时间和高度特异地得到选择。用这一更好的方法， 对在特定的发育期有活性或特定组织特有的特定细胞进行高度富集是 可能的。本文的特别重要的例子是富集起源于ES细胞的心肌细胞。 优点举例如下：

1.在同一个启动子控制下的抗性基因以及发育特异和/或细胞特 异的基因保证了有效和快速地选择例如组织特异的细胞，例如选择心 脏细胞。通过FAC分析，可以表明，将近99％的非心脏特异细胞消 除了。在胚体的高度异源细胞群体内这一高纯度级的特异细胞类型不 仅对毒性物质的药理测试、药物筛选、胚毒性效应、分化中细胞增殖 因子的筛选是可适用的工具，而且启动为治疗应用制备高度纯化的细 胞群体用于分别替代组织和在体外产生组织样品(生物工程)的可能 性。

2.虽然本发明优选利用“悬滴”的分化方法允许平铺时产生相 对稳定分化特征的细胞群体，但胚体在启动分化即自发搏动的时间点 上是显然不同的。通过例如荧光基因的表达，可以得到关于分化的启 动，例如心肌细胞生成(cardiomyogenesis)的可靠信息，加入选择培 养基在启动细胞特异或发育特异的启动子的转录后的时间里进行调 节。根据本发明，编码可检测的例如荧光蛋白质的基因与选择基因结 合，其中两种基因是在一个启动子的控制下的，因此允许根据细胞的 分化期准确确定加入选择培养基的时间，其中分化期可以通过荧光蛋 白质的表达由操作者来确定。在体内条件下，利用报道基因不是关键， 因为它可能不是任何方法可以检测的。但重要的是，在本方法的实验 测试中(对于确定纯化以及外科方法非常重要)，由于潜在的抗原性 不适用于治疗目的。或者，特定地为了治疗目的，利用转基因表位是 适当的，它不与胞内信号级联(例如CD8或CD4)连接，并且分别 是在细胞特异和组织特异的启动子的控制下的。在该技术的辅助下， 在通过例如Percoll梯度的富集、MACS分类和嘌呤霉素富集后可以得 到高度纯化的心肌细胞制剂；另外在体内和体外通过抗CD8(抗CD4) 荧光结合细胞表面抗体可以鉴定转基因细胞。同时，可以得到最大可 能量的所需细胞类型的富集。任意地加入其他选择培养基，不依赖细 胞分化的信息，将导致前体细胞的早熟破坏或仅仅导致低数目的最终 分化的细胞。

因为在器官周围区域存在促进ES细胞的组织特异分化的其他因 子，可以假设ES细胞分化成特异的细胞类型，特别是在各个器官的 天然周围是特别有效地进行的。确实，我们能够证明，在我们的移植 实验中，没有组织损伤(没有分化因子)，不能观察到移植的胚心肌 细胞的生长和分化。另外，在移植进冷冻梗死区域后，利用未分化的 胚干细胞可以观察到心肌的产生明显增加(体外只有3-5％，体内更 有效，但同时产生了肿瘤)。由于没有抗生素抗性基因，ES细胞高度 敏感，本发明的方法可以将本发明提供的转基因ES细胞体内或体外 导入到各个器官，其中例如高度有效地分化成了心脏细胞。几个星期 后，加入选择培养基，所有起源于ES细胞的细胞在系统中杀死了， 除了那些携带抗性基因的没有杀死。利用这一途径，可以期望更有效 的产生组织而没有肿瘤发展的相关危险。对本文开发的系统，关键是 抗生素抗性基因和报道基因是在相同的启动子的控制下的。其中的原 因是，报道基因表明了细胞特异和发育特异分化例如心脏分化的启动 的时间点，即早期心脏细胞的主要部分已经形成并且仍然在增殖。在 这一时间点上，抗生素抗性基因产生，从而所有细胞在加入抗生素后 杀死，除了表达抗性基因的细胞，例如心肌细胞。在DE19727962中， 利用了不同的启动子，以致产生了同步，所以选择是无效的。

代替双转染，可以构建含有IRES的载体，其中同一个启动子例 如α-MHC启动子，驱动了报道基因和抗生素抗性基因，所以单转染 就足够了。

本发明的重要的目的当然不仅是体外而且特别是体内应用本发明 的方法提供的分化细胞，特别是心脏细胞。为了排除在移植过程中， 例如可以发展成肿瘤细胞的多能性干细胞或种系细胞进入病人，本发 明的一个实施方案的细胞可以通过过表达例如利用Oct-4启动子，制 造成对抗性基因更敏感。这将进一步减少多能细胞幸免于抗性试剂的 攻击的可能性。

在本发明的另一个实施方案中，可以另外操作细胞，以致不形成 特异的组织。这可以例如通过插入阻遏元件，例如doxizyclin诱导型 阻遏物元件来进行。所以，在所需分化细胞中，多能的潜在致瘤细胞 的可能污染可以排除。

在另一个实施方案中，人们可以选择适当的启动子例如鸡-β-肌动 蛋白启动子来挑选高速分裂的细胞，并由此方法进一步减少多能细胞 生存的可能性。

在优选的实施方案中，利用两种载体稳定地转染胚干细胞，和特 异地选择来自胚干细胞的分化培养物的心脏细胞：

1.心脏-α-MHC启动子控制嘌呤霉素的抗性基因(α-MHC- pur)；

2.心脏-α-MHC启动子控制增强氯荧光蛋白质的基因(增强的 绿荧光蛋白质＝EGFP)(α-MHC-EGFP)。

本发明的新颖性组成是结合应用在同一个优选心脏特异启动子 (例如，α-MHC)控制下的抗性基因(例如pur)以及例如活动的荧 光报道基因(例如EGFP)。这样的途径表明了下面优点的结合，所 述优点例如对ES起源的心肌细胞简化遗传选择：

i)例如通过检测特异的，例如心脏特异的荧光来监测胚干细胞 的分化，例如非常早的发育期的心脏分化(Kolossov等，1998)。

ii)通过确定荧光作为例如控制抗性基因的α-MHC-启动子活性的 指示物，使药物应用的启动时间最佳化。

iii)通过实时监测荧光和非荧光细胞组分的比例来肉眼控制药物 选择的过程。通过荧光激活细胞分类术(FACS)来定量估计特异的 细胞类型富集水平的可行性。

iv)优选利用在心脏特异启动子控制下的pur基因允许在分化ES- 细胞的贴壁物和悬浮培养物中通过嘌呤霉素来进行高度有效的心脏特 异选择，因为嘌呤霉素对非抗性细胞比其他已知的选择试剂，例如G418 和潮霉素具有更快和更强的毒性效应。

与其他抗生素抗性基因相反，本发明采用嘌呤霉素后，高度有效 并且非常快速的选择是令人吃惊的。另外，这是ES-细胞完全未知的 观察结果。

v)通过简单地应用例如EGFP荧光检测移植后监控导入的选择 细胞的结果的可能性。这对于新的外科技术的确立是非常重要的。

本发明含有涉及本领域状态的几个方面，不可能以合理的预测和 推知来成功实现。

1.首先，ES细胞可以被双转染的简单性是惊人的。我们的实验 证明，在大多数转染的克隆中，发生了用两种构建体的有效的转染。

2.另外，结果证明，在分化的早期，特别是心脏细胞的分化的 早期，加入选择试剂，对于抗生素抗性的效力至关重要。所以，在体 外心肌细胞发生的效力明显增加，最大可能是由于周围细胞释放了阴 性信号。早期指铺后的2-4天，特别是在用平铺的悬滴方法中，这是 一个仍然显示关于增殖(细胞仍然增殖)以及离子通道表达(如果通 道仍然是在所有心肌细胞中表达，包括心室细胞的所有细胞类型表达 了这一离子通道并且自发地搏动)和它们的调节(通过一氧化氮系统 的毒蝇碱能(muscarinergic)激动剂基本抑制L型Ca2+回流)的早期 方式的阶段。

3.同样惊人的是，嘌呤霉素的高度有效的作用导致在12-24小 时内消除了99％的非心肌细胞。

4.本发明极其重要的优点是在非平铺的EB和搅拌的培养物中分 别选择的可能性，因为本文中杀死的细胞可能没有洗出的问题，从而 首次从ES细胞中得到纯的特异细胞类型的培养物。非重要细胞的消 除部分通过酶消化(如胰蛋白酶、胶原)来提高。这一方法的效力可 以进一步通过在非平铺的EB中的心肌细胞来证实，这些EB在细胞 网络中就开始重新收缩。

在本发明的其他实施方案中，用两套载体选择系统来稳定地转染 胚干细胞。第一种载体含有第一种非细胞损伤的可检测的例如荧光蛋 白质和/或第一种抗性基因的信息，两种基因是在第一种细胞特异或发 育特异的启动子的控制下的，所述载体可操作地与前面提到的基因连 接。第二种载体含有第二种非细胞损伤的可检测的例如荧光蛋白质和/ 或第二种抗性基因的信息，两种基因是第二种细胞特异或发育特异的 启动子的控制下，所述载体是依次与这些基因可操作地连接的。替代 电穿孔，可以用病毒或脂转染进行高度有效的转染。关于在心脏中的 成功的移植，特别值得提到的是体外选择中胚层前体细胞。这些细胞 的选择是根据上面提到的方法进行的，优选地是通过brachyuria，表 达荧光和抗性基因的Nkx2.5和ANF启动子开关元件，然后移植。除 了荧光基因，上面的可检测蛋白质的其他基因当然也可以利用。这一 方法理想地适用于产生大量的纯化的前体细胞，例如，在移植到受损 的心肌中后，这些前体细胞在天然的分化因子下，原位分化成心脏细 胞而没有任何危险。

另外，这一途径理想地适用于体外测试不同的活性试剂/分化因 子，这些能将中胚层前体细胞分化成不同专一的细胞类型(即免疫细 胞、平滑肌和骨骼肌细胞以及内皮细胞)。所以，系统理想地适用于 测试分化因子、药物和另外的活性剂(即毒理学的物质、环境毒素、 日用化学品、用于测试致畸/胚胎毒性效果和药物学)。

另外，除了体外分化和选择，确立了一个完全新的组织再生的方 法。一方面，开发的优点是，在损伤的组织(例如在心脏梗死区域)， 释放了天然的因子，这些因子可以正面影响心脏细胞的分化。所以， 例如产生了转基因的胚干细胞，其中一方面，例如特别是嘌呤霉素抗 性基因，其在例如α-MHC启动子(α-MHC-嘌呤霉素)的控制下，排 除了肿瘤产生的可能性。另外，利用了痘病毒驱动tk-元件。所以，胚 干细胞是用遍在表达的启动子(例如鸡β-肌动蛋白启动子)和抗-tk元 件在α-MHC启动子的控制下3倍地转染。随后，将转基因分化ES细 胞注射进损伤的心脏区域。与体外的分化能力相反，内部因子促进了 体内高效的ES细胞的心脏发育。14-21天后，通过结合的全身性应用 抗性剂，例如嘌呤霉素和抑制病毒生长的9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟 嘌呤来选择非心肌细胞。通过这一结合性选择，避免了未分化的ES 细胞的潜在的生存和产生肿瘤的危险。另外，达到了相当有效的心肌 的发育。

下面，通过实施例和附图说明本发明。附图表示：

图1：分别经嘌呤霉素处理1、2、3和5天后，在发育的10.(A)、 11.(B)、12.(C)和14.(D)天，起源于pαMHC-pur转基因ES 细胞的平铺的EB的结合的透射/荧光显微成像。

图2：经嘌呤霉素处理10天后，在发育的19天，pα-MHC-pur EGFP/pαMHC-pur EB的悬浮液培养物的结合的透射/荧光显微成像。

图3：(A)起源于pαMHC-EGFP转基因ES细胞的离解的16 天大的EB的FACS图谱。所有的ES含有大的搏动的荧光心肌细胞簇。 EGFP阳性细胞(M1)构成小于整个细胞群体的1％。

(B)经嘌呤霉素处理13天后，起源于pαMHC-EGFP和pα- MHC-purES细胞的共转染的离解22天大的EB的FACS图谱。EGFP 阳性细胞(m1)构成了整个细胞群体的42-45％。

图4：制备胚体的方案。

实施例1

材料和方法

载体

载体含有调节性5.5kb的Maus α-MHC-基因的片段，由J.Robbins 博士提供的(儿童医院医学中心，Cincinnati，美国)(Gulick等，1991)。

用BamHI和SalI从载体切出片段，钝化末端，并且克隆进pEGFP-1 载体的多克隆位点的SmaI-位点(含有EGFP的编码序列、GFP的增 强版和G418-抗性的新盒)(CLONTECH实验室，Palo Alto，CA，USA)。 在得到的载体中，关于EGFP编码序列的正确的“从尾到头”取向的 启动子是受控的，并且通过EcoRI-限制性酶切证实。

将Pur-基因(HindIII-SalI片段)的编码部分钝化连接到由 BamHI-AflII切出的pα-MHC-EGFP上的EGFP编码序列的位置中(钝 化末端的连接)。在得到的pα-MHC-Pur载体中，准确的排列和取向 是通过SmaI和ClaI-StuI限制性酶切来证实的。

细胞培养、转染和选择方法

繁殖和选择ES细胞克隆的所有步骤都是在由下列成分组成的ES- 细胞繁殖培养基中进行的，葡萄糖丰富的DMEM培养基添加有非必 需氨基酸(0.1mM)、L-谷氨酸(2mM)、青霉素和链霉素(5μg/ml)、 β-巯基乙醇(0.1mM)、LIF(ESGROTM)(500u/ml)、胎牛血清(FCS) (15％v/v)。

在用ES-细胞(D2系)电穿孔共转染之前，通过HindI-II-限制酶 使pαMHC-EGFP和pαMHC-Pur两种载体线性化。电穿孔的条件：

细胞：0.8ml PBS(无钙和镁离子)中4-5×106

载体-DNA：20-40μg；

电穿孔-小杯：0.4cm(Bio-Rad实验室，Hercules，CA，USA)

电穿孔器：基因脉冲仪TM(Bio-Rad实验室)；

电脉冲条件：240V，500μF。

电脉冲后，在冰上冷却细胞悬浮液20分钟，然后将此悬浮液与 10毫升的ES细胞繁殖培养基中的G418抗性成纤维饲喂层一起转移 到10厘米的组织质量培养皿中。2天后，加  Genticin G418 (GibcoBRL)300μg/ml用于选择G418抗性细胞。每两天交换含有G418 的培养基(300μg/ml)。在8-10天的选择后，出现了药物抗性克隆。 取出克隆，分别在0.1％胰蛋白酶/EDTA溶液中胰蛋白酶化，并平铺 在含有ES细胞繁殖培养基中的G418抗性成纤维细胞饲喂层和G418 (300μg/ml)的48孔平板上。在生长2-4天后，随后将ES细胞克隆 胰蛋白酶化，并且在5厘米的组织培养皿上的24孔的平板中繁殖。 在ES-细胞克隆繁殖的所有时期都存在G418(300μg/ml)和G418抗 性成纤维饲喂层。

ES细胞的分化和心脏特异选择

在“分化培养基“中进行分化方案的所有步骤，所述分化培养基 包括前面提到的“ES-细胞繁殖培养基”的所有成分，除了LIF，并且 其中用20％的FCS替代15％的FCS。在繁殖后，将选定的G418抗 性ES克隆胰蛋白酶化，并且重悬浮于“分化培养基”中，最终浓度 高达0.020-0.025×106细胞/毫升。随后，通过在细菌培养皿(Greiner Labortechnik，Germany)的盖子上安排20μl的该悬浮液(400-500个 细胞)形成了悬滴。在37℃和5％CO2中温育2天后，ES-细胞形成了 聚集体或“胚体”，它们在细菌培养皿中用分化培养基洗出，并且再 温育5天。然后，在分化培养基中，将胚体单独铺在用明胶预调节的 24孔组织质量平板上。在平行实验中，许多胚体保留在悬浮液中，在 悬浮液中它们是象已铺的那样处理的。

在所有的生长中，利用FITC Filterset(Zeiss，Jena，Germany)， 在荧光显微镜下检测EB。

在典型的实验中，在发育的9-10天，当首先监控到EGFP荧光 时，开始应用选择性药物嘌呤霉素(1-2μg/ml)。每2-3天交换含有 活性物质的培养基。

FACS分析

为了进行FACS分析，用PBS洗涤来自不同的发育和选择时期 的10-20个胚体，然后通过胰蛋白酶处理(120μl胰蛋白酶/EDTA溶 液)2-3分钟离解成单一的细胞悬浮液。随后，加入1ml DMEM+20 ％FCS的单一细胞悬浮液。离心(1000upm)5分钟后，在0.5-1.0ml 的含有Ca2+(1mM)和Mg2+(0.5mM)的PBS中重悬浮细胞。

用装备了488nm的氩离子激光仪(15mW)的FACSCaliburFM流 式细胞仪(Becton Dickinson，BRD)确定起源于胚干细胞的不同年龄 细胞的GFP表达。将细胞重悬浮于PBS(pH7.0，0.1％的BSA)，浓 度高达5×105细胞/ml，然后用FACScaliburTM来分析从每个样品中抽 提的最低10,000个存活细胞。在530nm(FITC-带式滤波器)测量GFP 的发射荧光。通过在测量之前立即在样品中加入碘化丙锭(propidium iodine)(2μg/ml)进行实时门控。与存活的PI阴性细胞比较，具有 阳性碘化丙锭(PI)染色(885nm带式滤波器)的坏死细胞显示了更 高的侧分散信号(SSC)。让具有低SSC信号的细胞通过，从而将非 存活的细胞从随后的实验中排除。利用细胞系D3的非转染ES细胞作 为阴性对照。利用CellQuest软件进行实验(Becton Dicknson)。

结果

将关于pαMHC-EGFP以及pαMHC-pur-载体的转基因ES细胞培 养，并用于心脏分化的方案中。所有的测试克隆表明，在ES细胞状 态和在达到平铺的日子形成EB后(形成“悬”滴后7天)没有可显 微证实的EGFP荧光。在平铺后的第一到第二天(8-9天大的EB)， 出现了第一个EGFP荧光区，通常在一天后开始自发搏动。很明显， 在搏动的簇的外面有大量的EB细胞，显示没有可显微检测的荧光水 平，表明在ES细胞心肌发生过程中EGFP表达的高度组织特异性。

在应用嘌呤霉素后(通常在发育的9-10天开始)，在下一天的12 小时内(通过长期的检测系统)检测到了平铺的EB的形态首先有明 显的变化：围绕EGFP荧光细胞的搏动簇的细胞生长剧烈减少，游离 周围细胞生长的簇的搏动强度确实出乎意料地加强(图1A)。在接 下来的2天中，这些变化发展了，表明非荧光细胞质量的严重破坏以 及具有强烈收缩活性的荧光心脏簇的压缩(图1B，C)。已经在嘌呤 霉素处理的第一天，一些胚体已经处置了肉眼可见的周围的非荧光细 胞和看上去分离的、搏动的和荧光的簇(图1D)。甚至在发育的4 天后，以及在嘌呤霉素处理18天后，这些分离的簇仍然表明了强烈 的收缩活性，而在它们未处理对照部分，这一活性通常在发育的17-20 天终止。

在悬浮液培养物的嘌呤霉素处理体与未处理的对照部分比较，检 测了增强的EGFP荧光以及持续的收缩活性。在发育超过3星期和嘌 呤霉素处理超过2星期后，胚体的悬浮液含有许多强烈荧光和收缩的 胚体，其中一些是作为可见和集体地搏动的荧光簇(图2)呈现的。 这些结果清楚地表明，心肌细胞可以在没有周围细胞的情形下保持存 活并分化。自发的搏动进一步表明了选择的心肌细胞的功能整体性。 但是，关键的优点是嘌呤霉素选择的快速，导致在应用后12-24小时 的过程中有99％的非心肌细胞的破坏。

FACS分析证明，嘌呤霉素对转基因ES细胞的选择是高度有效 的。而EGFP荧光细胞仅代表约1％的含有pαMHC-EGFP载体的未处 理细胞的整个细胞群体，嘌呤霉素处理的分化的胚干细胞是用 pαMHC-EGFP以及pαMHC-pur载体转基因的，导致了EGFP荧光细 胞中42-45％的细胞群体的富集(图3)。简单的计算表明，在嘌呤霉 素处理转基因ES细胞的悬浮液培养物过程中，97-99％的整个非心肌 细胞群体被有效地杀死。仍然存在的嘌呤霉素抗性的非荧光细胞或微 弱的荧光细胞的部分(图3)可以用在一些非心肌细胞中的pα-MHC 启动子的非特异活性来解释。这样的一部分是通过高浓度的嘌呤霉素 或通过FACS分类方法来消除的。

实施例2

利用pIRES2-EGFP(Clontech实验室，Palo Alto，CA)作为起 始载体。这一载体在多个克隆位点(MCS)和EGFP基因之间含有脑 心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)。这使得嘌呤霉素抗性以 及EGFP基因独立地从一个单一的双顺反子mRNA翻译。用AseI和 ECO47III限制酶将pIRES2-EGFP载体末端钝化并重连接，目的是删 除巨细胞病毒立即早期(CMV-IV)启动子。以SmaI消化得到的载体 用α-MCH-pur-盒连接，该盒已经通过SacI和ClaI切出了上面所述的 α-MHC-pur载体。通过用SacI/SmaI消化证实了得到的pα-MHC- IRES-EGFP(pα-PIG)载体的正确方向。

用pa-PIG转染ES-细胞(D3-细胞系)；如实施例1中已经叙述 的，在G418选择后，进行了所得的稳定克隆的繁殖和分化。

在进行标准的分化方案后，可以证明在第8和第9天的发育之间 EGFP阳性心脏细胞的搏动簇，其中加入了5μg/ml的嘌呤霉素。在嘌 呤霉素处理的头3-4天后，胚体(EB)主要含有EGFP阳性的、强烈 搏动的心脏细胞簇；分开非心脏细胞，并在改变培养基时消除。通过 在悬浮液培养物中EB完全生长，和用抗生素进行抗性处理可获得相 同的结果。FACS分析表明在这样得到的细胞培养物中至少富集了70 ％(利用EGFP流式细胞计作为读出值)。所以，在一个启动子的控 制下，使一个载体上安排报道基因和抗性基因，优选结合IRES，极其 适用于产生至今可能无分化的干细胞的分化的胚干细胞。当然，不仅 应用于胚干细胞，同样应用于种系细胞和成人干细胞。特别是，通过 这一实施例可以表明，突出的高度的组织特异性可从ES细胞发育的 心脏细胞取得。

嘌呤霉素选择方案的有效性

随后在自身的小鼠模型中测试了嘌呤霉素选择方法，其中模拟了 心脏的损伤，并且可能因此而有效。为了这一目的，利用了小鼠移植 模型，其中将通过体外分化ES细胞(10,000-100,000个细胞)得到的 胚干细胞或心脏细胞注射进受体，该受体的心脏部分地被低温处理损 伤。肿瘤的发育在形态上通过整个小鼠、分离的心脏和组织玻片来检 测；这些检测是在两天到两个月时期内的操作后，在不同的时间点进 行的。这一途径允许对不同细胞制剂的肿瘤潜力进行准确的评估。将 非分化的ES细胞注射进冷冻损伤(100,000个细胞)的大肿瘤中后， 在小鼠中发育。操作后10天，动物死于这些肿瘤。但当ES细胞在体 外分化成心脏细胞和博动区时，肿瘤也发育了，对起源于ES细胞的 心肌细胞是典型的，将它们分开和分离，并把10,000-50,000个细胞注 射进小鼠。这证明，在心脏中胚干细胞有高度的肿瘤潜力，和非常需 要高度特异的选择方法。

在下一个实验中，将用本发明的构建体稳定转染的转基因ES细 胞(在一个载体上的一个启动子控制下的报道基因和抗性基因)在证 明EGFP表达后，通过嘌呤霉素处理5-7天。在一大测试中，有25只 以上的小鼠如上述对心脏进行外科冷冻处理，甚至在几个月后没有观 察到肿瘤的发育，前提是如果这些嘌呤霉素抗性ES细胞起源的细胞 (10,000-50,000个细胞)注射进损伤的小鼠心脏区域(双转染构建 体)。确实，我们成功地在移植后鉴定了细胞，并且可清楚地证明， 细胞能成功地移植，并且它们分化成最后分化的心肌细胞。这些实验 清楚地表明，根据本发明所述的技术能够有效地富集体外分化的细 胞，并且可以得到不含有任何未分化的ES细胞的群体。如本文所示， ES起源的细胞在心脏中涉及高度的肿瘤发生，这一有效性是特别明显 的。

结论

1.制备了与表达载体pαMHC-EGFP和pαMHC-pur共转染的稳 定的转基因胚干细胞克隆。

2.在体外分化的过程中，嘌呤霉素处理转基因胚干细胞与潮霉 素处理前面产生的pαMHC-Hyg ES细胞系比较表明了有高度有效的 心肌特异的选择(数据未显示)。

3.选择分化细胞表明，如它们未处理对照部分一样有更高程度 的形态学和功能的存活性和持久性，这暗示遗传选择途径有效地从周 围细胞的阴性影响中释放出分化的胚干细胞。

4.在共同细胞类型特异的启动子下，实时的荧光报道基因和药 物抗性基因的结合使用允许严密监测和量化整个过程，包括分化和细 胞类型特异的选择。得到的细胞适用于进一步的移植实验的，这允许 监测导入的细胞。

5.所示途径可以应用于ES细胞分化系统中的任何细胞类型特 异的选择，前提是如果鉴定和克隆了各种细胞类型的高度特异的启动 子或发育的特异时期。原则上，该系统允许结合使用含有各自两种着 色的体外荧光蛋白质例如黄色的(EYEP)和青色(蓝色)的(ECFP) EGPF版本，和两种药物抗性基因的两个不同的启动子。这样的途径 可以增加整个方法的选择性和有效性。本发明提供的胚干细胞，优选 胚体，可以用于物质的毒性实验，例如重金属和药物的毒性实验(也 参见上面所述)。对于这一目的，利用双载体构建体和胚干细胞培养 物，在开始细胞典型的分化后加入选择试剂(检测荧光)。在细胞纯 化后，或已经在ES细胞培养过程中，向细胞培养物中加入了不同的 待测物质，在不同时间点，通过比较对照由不同的读出方法(例如， 流动细胞计，荧光读数器)分别测量荧光单一细胞和整个荧光。

本发明提供的胚干细胞可以用于产生具有细胞特异或发育特异的 荧光蛋白质表达的转基因非人哺乳动物。在本文中，将本发明叙述的 ES细胞导入非人哺乳动物的胚泡中。在下一个步骤中，将胚泡转移到 代孕母亲中作为嵌合体，通过回交变成纯合子，从而产生了转基因的 非人哺乳动物。

在本发明的其他实施方案中，为移植目的，以药物组合物的形式 利用转基因胚干细胞。为了这一目的，需要高度纯化的胚干细胞起源 的培养物，因为已知有未分化的增殖干细胞的污染导致了肿瘤的产 生。因此，本文叙述的方法理想地适用于得到对移植理想的高度纯化 的ES细胞起源的细胞特异培养物(Klug等，1996)。

最后，应该再次强调，上面本发明说明了，利用胚干细胞的方法 也适用于胚种系细胞和成人干细胞。

本发明公开了一种系统，其用于在细胞特异和/或发育特异的启 动子的共同控制下，通过结合利用抗性和可检测报道基因，细胞特异 和发育特异性选择分化的胚和成人干细胞或胚种系细胞。

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