天然的溶菌酶是一种在动物界和植物界中广泛存在的多肽类糖苷酶。1922 年Alexander Flemin发现多种粘液组织和分泌物以及鸡蛋清中存在能够溶解 多种革兰氏阳性细菌的物质。他把这种溶解因子称为溶菌酶。Flemin发现溶菌 酶在软骨组织和胃的匀浆液、泪液、唾液、痰、鼻腔分泌物、病理性的尿液、 血清和淋巴细胞中都有存在，但在健康的尿液、脑脊髓液或汗液中没有溶菌酶。 1963年Jolles和Canfield各自独立阐明了鸡蛋清来源的溶菌酶的一级结构。 1965年Phillips基于X-射线结晶学描绘了溶菌酶的三维结构。
溶菌酶可分为三种类型：源于鸡蛋卵清的c型、源于鹅蛋卵清的g型和源 于噬菌体的溶菌酶。三者有相似的三维结构，但氨基酸序列不同。目前已知溶 菌酶发挥生物学活性主要通过两种方式：一种是直接作用，即通过降解细菌细 胞壁肽聚糖(polypeptidoglycan)中N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine) 和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)间的β(1→4)糖苷键的连接，破坏 肽聚糖支架，引起细菌裂解。由于革兰氏阳性细菌(G+细菌)的细胞壁几乎全部 由肽聚糖组成，而革兰氏阴性细菌(G-细菌)只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌 酶可高效破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌的作用不大。间接作用就是通过 降解细菌细胞膜中的粘多糖片段引发一些尚未明确的免疫激活，刺激巨噬细胞 的噬菌活性。这种间接作用已在大鼠中得到证明，完整的细菌不引发巨噬细胞 的噬菌作用，相反经溶菌酶处理过的细菌能够被迅速吞噬。另外溶菌酶分子本 身的阳离子和疏水的特性也有助于其杀菌活性的发挥。人和动物细胞无细胞壁 结构亦无肽聚糖，因此溶菌酶对人体细胞无毒性作用。
目前已知的溶菌酶的主要作用有：1)抗菌消炎作用。溶菌酶的溶菌活性使 其在预防和治疗多种细菌性疾病中具有重要作用，如由链球菌家族微生物引起 的耳炎、窦炎、腺炎、尿道炎、阴道炎等。它还可结合并失活各种诱发炎症的 酸性物质，能增强抗生素和其它药物的疗效等。2)抗病毒作用。溶菌酶的正离 子特性使其可结合带负电荷的病毒蛋白使其失活。3)增强免疫力。溶菌酶作为 一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，可以改善和增强巨噬 细胞的吞噬和消化能力，激活白细胞的吞噬功能，并改善细胞抑制剂所导致的 白细胞减少等。4)止血、镇痛等作用。
上述溶菌酶的广泛作用表明了其药用的广阔前景，具有极大的市场。但是 目前溶菌酶在用于临床时受到了三大因素的制约：1)天然人溶菌酶很难大量获 得。目前人乳汁和胎盘是获得天然人LYZ的唯一来源，但这些材料相当有限， 使产品的价格过于昂贵。2)来源于其它物种的溶菌酶会引起许多副作用，如蛋 清来源的可引起过敏反应，牛源的具有传染疯牛病的威胁。3)其它动物来源的 溶菌酶不适合用于人用药物，因它们与人溶菌酶间的同源性较低，如鸡蛋清源 的为56.8％，大鼠的为76.4％，奶牛的为82.3％，马的为50.8％。
基因工程技术的发展为克服上述限制提供了有效途径。1986年，Jigami 等人利用酵母表达了人溶菌酶，但不具有抑菌活性。Castanon和Yoshimura也 做了类似的工作，没有取得突破。1990年，Archer等人在米曲霉中表达了12mg/l 的鸡蛋清溶菌酶；Tsuchiya等人在米曲霉中表达了1.2mg/l的人溶菌酶，但 均没有生物活性。可见，酵母和米曲霉并非表达溶菌酶的理想宿主。
近年来，利用植物表达溶菌酶的研究取得了可喜进展。1997年，Nakaiima 等人在烟草叶中低水平表达的溶菌酶可以提高植物抗真菌和细菌能力。2000 年，Takaichi和Oeda在胡萝卜中表达了人溶菌酶。Ahreholta等人在马铃薯 里中表达的T4溶菌酶具有不依赖于植物的年龄和生长环境影响的溶菌活性。 2002年，经密码子优化的人工合成的溶菌酶基因在转基因的水稻悬浮培养的细 胞里得到了表达，表达量达到可溶性蛋白的4％，并具有同人溶菌酶相似的生物 活性。由此可见，植物可以表达有活性的人溶菌酶。但是植物与动物间蛋白修 饰、剪接等方面的差异将可能影响这种重组蛋白的临床应用。
哺乳动物乳汁中蛋白的表达水平高，成本低、无污然，而人溶菌酶自身就 可在人乳中有相当量的高活性表达(0.4-0.7mg/ml)。1994年Mapa等人利用牛 的alpha sl-casein启动子调控人溶菌酶在转基因小鼠乳腺中获得了表达，表 达量为0.2～0.7mg/ml。1998年，他们进一步的研究表明这种人溶菌酶具有 同标准溶菌酶相同的活性。由于大型乳用家畜(牛和羊等)乳腺的蛋白产量大 (每头奶牛可年产250～300kg乳蛋白，一只绵羊或山羊可年产25～30KG乳蛋 白)，因此是大量生产人溶菌酶的理想场所。李宁等在CN 16699405A中公开报 道获得了整合有以PBC1(一种商业化载体，调控序列为山羊的β-酪蛋白)指导 人溶菌酶乳腺特异表达框架的转基因奶牛，但没有检测表达情况。
综上所述，尽管目前已经有人利用转基因技术和基因调控技术来使动物产 生溶菌酶。但是仍然没有找到可有效使动物高产溶菌酶的基因调控方法。因此， 现有技术迫切需要寻找到合适的基因调控区域和调控方法，以最终获得高产溶 菌酶的转基因动物。

本发明的目的是提供一种乳腺特异性表达融合基因。
本发明的另一目的是提供一种制备转基因动物的方法。
本发明的另一目的是提供一种调控外源基因(如人溶菌酶)在动物乳腺组 织中特异性表达的载体。
在本发明的第一方面，提供一种乳腺特异性表达融合基因，该融合基因从 5’至3’依次包含以下元件：牛β-乳球蛋白的5’侧翼序列，人溶菌酶基因，和 牛生长激素3’侧翼序列。
在本发明的一个优选例中，所述的人溶菌酶基因选自：
(a)包含信号肽编码序列，第1-4个外显子和第1-3个内含子(为基因组 DNA)；或
(b)包含信号肽编码序列和成熟蛋白的完整编码序列(为cDNA)。
在本发明的一个优选例中，所述的融合基因选自：
(a)具有SEQ ID NO：5中1-1260位、1267-6067位和6074-6304位依次连 接获得的核苷酸序列；
(b)具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或
(c)与(a)或(b)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供一种制备转基因动物的方法，包括以下步骤：
(a)将所述的融合基因与抗性筛选基因共转染体细胞，获得基因组中整合 有融合基因的转基因细胞；
(b)将(a)获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得可高产人 溶菌酶的动物。
在本发明的一个优选例中，在步骤(a)中，所述的细胞为动物胎儿成纤维 细胞。
在另一优选例中，采用抗性筛选基因作为筛选工具，获得基因组中整合有 融合基因的转基因细胞，所述的抗性筛选基因获自双标记选择载体。
在另一个优选例中，所述的双标记选择载体为pLNK，包含有串联的Neo和 TK两个选择标记基因，两端各有一个同向排列的Loxp位点。
在本发明的一个优选例中，所述的动物为牛、山羊、绵羊、猪、兔。
在另一个优选例中，所述的动物为山羊。
在本发明的第三方面，提供一种调控外源基因在动物乳腺中特异性表达的 载体，该载体含有所述的融合基因。
在本发明的第四方面，提供一种家畜的乳汁，它含有浓度10-8000ug/ml的 人溶菌酶。
在另一优选例中，家畜的乳汁中含有浓度50-2000ug/ml的人溶菌酶。
在本发明的第五方面，提供一种生产人溶菌酶的方法，它包括步骤：
培养用所述方法制得的转基因动物，从动物乳腺分泌的乳汁中分离纯化出 表达的人溶菌酶。
在本发明的第六方面，提供一种高产人溶菌酶的转基因克隆动物的细胞及 组织，来自采用所述的方法获得的乳腺高效表达人溶菌酶的转基因动物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1：pbLGLyz的构建流程示意图：以牛基因组DNA为模板，用PCR法扩 增BLG5’侧翼序列(-1216～+45bp)，将PCR产物克隆入pGEM-T-easy载体， 得质粒pbLG5’。XhoI+SacII双切重组质粒pTA-BGH获得300bp大小的牛生长 素基因3’UTR(PolyA sequence)，将其回收，克隆到质粒pbLG5’中成pbLGpA. 最后再用XhoI将人的溶菌酶基因从pcDNA-LYZ切出后克隆到pbLGpA的XhoI 位点，最终成pbLGLyz。
图2：pLNK的结构示意图。neo和TK基因两端各有一个同向排列的loxp 位点，这一框架可通过SalI单切出，大小3.8kb。
图3：抗性细胞株的PCR和Southern-blot的检测结果。图3A为PCR检测 结果，1、2、4、5、6、11、21、26、27、28号克隆可扩增出阳性条带；图3B 为Southern-blot的检测结果，5、6和11号有3.2kb的清晰杂交条带。
图4：存活的5头人溶菌酶转基因克隆山羊。
图5：人溶菌酶转基因克隆山羊的PCR和Southern-blot的检测结果。
图6：转基因山羊乳汁中人溶菌酶的表达检测。
图7：转基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量。
图8：转基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量。
图9：Heparin-Sepharose层析柱纯化转基因山羊乳汁中的人溶菌酶。
图10：转基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含量 是通过倍比关系较好的稀释度计算出的活性单位。可见BLG1、BLG2和含2mg/ml 天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性分别约为617600U/ml、 846400U/ml和308800U/m。
图11：用来源于人的α-乳白蛋白，山羊的β-酪蛋白，牛的α-乳球蛋白， 和牛的αS1-酪蛋白的片段与其它功能片断连接，所构建的各调控构件的结构。

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现将牛的β-乳球蛋白5’侧翼 序列，人溶菌酶基因组DNA序列或cDNA序列，以及牛生长激素3’侧翼序列 三者的融合基因转染到细胞中，将该转基因细胞作为核供体制备转基因动物， 可获得乳汁中高表达人溶菌酶(＞1mg/ml)的转基因动物。基于上述发现完成了 本发明。
为获得乳汁中高效表达hLYZ的转基因山羊，本发明人经过长期研究和试 验，率先构建出了人溶菌酶(hLYZ)的乳腺特异表达构件pbLGLyz。该构件包含 奶牛β乳球蛋白基因的5’调控序列、溶菌酶基因组DNA的全部编码序列和牛 生长激素的polyA加尾信号序列。
为方便整合细胞的筛选以及将抗性基因从细胞或个体中删除，在本发明的 优选例中，本发明人使用了一种双标记表达框架，该框架的两端各包含一个同 向loxp序列；loxp位点中间是可独立表达的新霉素(neomycin)和TK两个筛选 标记基因。其作用为：Neo基因提供细胞转染过程中的抗性筛选标记，loxp位 点和TK基因提供了利用Cre/loxp重组酶系统将双标记表达框架从细胞中删除 的工具和筛选标记。
为了获得整合有hLYZ的细胞，在本发明的优选例中，用限制性内切酶NotI 将pbLGlyz中的人溶菌酶的乳腺特异表达框架切出，用限制性内切酶SalI将 双标记表达框架切出，将两种表达框架按5∶1摩尔比混合，电穿孔方法共转染 山羊胎儿成纤维细胞，G418筛选出抗性单克隆细胞株，再通过PCR和基因组 Southern-blot的双重鉴定，获得人溶菌酶的转基因细胞。
为获得人溶菌酶的转基因山羊，用含hLYZ的转基因细胞作为供核，山羊 的卵母细胞作为供质，进行体细胞克隆。最终获得了5头成活克隆羊，经PCR 和Southern-blot分析，表明该5头羊均为人溶菌酶的转基因山羊，整合率 100％，这5头羊分别命名为BLG1、BLG2、BLG3、BLG4和BLG5。
对BLG1和BLG2两头转基因山羊做人工激素诱导泌乳，获得的乳汁经 SDS-PAGE和Western-blot分析表明人溶菌酶在这两头山羊的乳汁都获得了高 效表达，分子量与天然人溶菌酶的分子量相当，约14.6kD。定量分析表明，BLG1 的乳汁中人溶菌酶的表达量约为3mg/ml，BLG2的表达量超过了4mg/ml。经溶 壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)悬浮液的溶壁活性分析表 明，BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶活性分别约为617600U/ml和846400U/ml， 添加2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性为308800U/ml(天 然人乳中的溶菌酶购自SIGMA公司，L6394)。
经Heparin-Sepharose层析柱纯化，本发明人从BLG1泌乳第8天获得的20ml 乳汁中纯化了约19.6mg的重组人溶菌酶，经SDS-PAGE薄层扫描分析表明其纯度约 90％。委托中国科学院上海生化与细胞研究所蛋白质组研究分析中心进行N-末段测序表 明，这种溶菌酶与天然人的溶菌酶N-末段的10个氨基酸序列完全相同。
本发明获得了一种调控外源基因(如人溶菌酶)在动物乳腺组织中特异性 表达的载体；利用这一载体，通过细胞转染技术和体细胞克隆技术获得了5头 可在乳汁中高效表达高活性hLYZ的转基因山羊；本发明还提出了一种在转基 因家畜中消除抗性基因干扰转基因表达的方法。本发明适用于制备乳汁中高效 表达人溶菌酶的转基因牛、山羊、绵羊、猪和兔等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。
I.试验材料
1.1菌种和细胞株
E.coli DH5α甘油菌为上海转基因研究中心保存；萨能奶山羊88#胎儿(35 日龄)分离的成纤维细胞株(GEF88#)由上海转基因研究中心制备并保存；萨能 奶山羊，上海转基因研究中心实验牧场提供。
1.2质粒载体
pGEM-T vector载体购自Promega公司。质粒pcDNA-LYZ、pTA-BGH和pGH4 均获自上海转基因研究中心。
1.3主要试剂材料
各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶购自NEB公司，尼龙 膜购自Minipole公司，QIAquick胶回收试剂盒、QIAfilter质粒回收试剂盒 购自QIAGEN公司，Ready-to-go同位素标记试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech公司，α-32P-dCTP和Probe Quant探针纯化试剂盒同为Amersham Biosciences公司产品。GMEM购于Gibco公司，FBS、bFGF、NEAA、G418、GANC、 谷氨酰胺、丙酮酸钠、0.25％trypsin/0.02％EDTA溶液均购于Sigma公司，hLIF 购于Chemicon公司，FBS购于Biochrom公司，各类细胞培养板(瓶)是Nunc和 Costar公司的产品。蛋白酶K购于Promega公司，LA PCR试剂盒购于TAKARA 公司，秋水仙素购于Gibco公司，氯前列烯醇(PG)购于上海计划生育研究所； 促卵泡生成素(FSH)购于宁波激素制品厂；促黄体生成释放激素(LRH)购于上海 东风制药厂；2％静松灵购于长春农牧大学兽医研究所；F-10粉剂购于Gibco 公司；离子酶素、细胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤 (6-diethylaminopurine，6-DMAP)、透明脂酸酶、DL-乳酸钠、青霉素、链霉 素、DMEM粉剂、M16粉剂及所用NaHCO3等化学试剂均为Sigma公司胚胎培养用 产品。Micrococcus lysodeikticus bacterial冻干粉购自上海生工生物工程 技术服务有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
引物合成和测序工作由上海申友生物工程公司合成；蛋白N末端测序工作 由中国科学院上海生化与细胞研究所蛋白质组研究分析中心进行；人溶菌酶在乳汁中 的表达定量的部分工作由复旦大学人类遗传研究中心完成。
1.4主要仪器设备
Power PAC1000型电泳仪                BIO-RAD
5154D型离心机                        Eppendorf
GENE PULSER II型电转化仪             BIO-RAD
4520S/N型恒温摇床                    Forma Scientific
T-Gradient型PCR仪                    Biometra
AX80型显微操作仪                     OLYMPUS
CO2培养箱                            Medcenter Einrichtungen GmbH
SZ-PT型解剖镜                        OLYMPUS
EG-40型拉针器                        NARISHIGE
P-30型磨针器                         NARISHIGE
CE-450型电融合仪                     KEFA
K400型倒置显微镜                     Leica
BCM-1000A型超净工作台                苏州安泰
MCO-15A型CO2培养箱                   SANYO
PTC-100Peltier Thermal Cycler      MJ Research.
吸卵针、钨丝、移卵针、方杯、集卵器、手术器械等。
1.5主要试剂的配制
LB培养基：1％(w/v)Tryptone，0.5％(w/v)Yeast Extract，1％NaCl
TE缓冲液(pH8.0)：10mmol/l Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/l EDTA(pH8.0)
10×TAE：0.04mol/l Tris-乙酸，1mmol/l EDTA
质粒抽提溶液I：50mmol/l葡萄糖，25 mmol/l Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/l EDTA(pH8.0)
质粒抽提溶液II：0.2mol/l NaOH，1％(w/v)SDS
质粒抽提溶液III：5mol/l乙酸钾(pH4.8)
10×PBS(无Ca2+、Mg2+)：NaCl 80.0g，KCl 2.0g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO4 2.4g， 调pH7.2，终体积1000ml
封闭液：含2％(w/v)BSA的PBS缓冲溶液
PBST：含0.5％(v/v)Tween-20的PBS缓冲溶液
10×底物缓冲液：柠檬酸36.6g，K2HPO4 113.5g，pH6.0
底物反应液：OPD 0.2mg，30％H2O2 50μl，10×底物缓冲液10ml，加水至 100ml
GEF完全培养液：GMEM，10％(v/v)FBS，1×NEAA，10ng/mL bFGF，1000u/ml hLIF
GEF选择培养液：GMEM，10％(v/v)FBS，1×NEAA，10ng/ml bFGF，1000u/ml hLIF，500mg/ml G418，2μmol/L GANC
细胞裂解液：10mol/L TrisCl(pH8.0)，100mmol/L NaCl，25mol/L EDTA(pH8.0)，0.5％(w/v)SDS，100mg/ml蛋白酶K
变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl
中和液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L TrisHCl(pH7.4)
洗涤液：2×SSC
预洗液：5×SSC，0.5％SDS，1mol/L EDTA(pH8.0)
预杂交液：5×SSC，5×Denhard′s，0.5％SDS，100μg/ml鲑精DNA
洗膜液I：2×SSC，0.5％SDS
洗膜液II：0.2×SSC，0.5％SDS
固定液：甲醇∶冰醋酸体积比为1∶3
冲卵液：PBS，1％FBS(Hyclone)
饥饿液10ml：50μl FBS，100μl P/S(100×)，100μl L-GW(100×)，9.75ml DMEM
M16：1.65g M16粉剂，0.035gNaHCO3，0.33ml乳酸钠(60％)，0.006g青霉 素，0.005g链霉素，定溶至100ml。
M2：1.15g F-10粉剂，0.2101 NaHCO3，0.33ml乳酸钠(60％)，0.006g青 霉素，0.005g链霉素，定溶至100ml。
融合液：0.3mol/L甘露醇、0.1mmol/L MgSO4、0.05mmol/LCaCl2
激活液：M16，CB，离子霉素，M16，CB，6-DMAP
包埋琼脂糖液：含1％琼脂糖的PBS液
透明质酸酶液：M2，0.2％透明质酸酶
5X转移存贮液：将36.3g Tris-base和44.26g CAPS溶解在1L水中。
阳极缓冲液(100ml)：20ml5X存贮液+15ml甲醇+65ml水；
阴极缓冲液(100ml)：20ml5X存贮液+1ml10％SDS+79ml水。
II.具体实施例
实施例1人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体的构建
按照图1的流程最终获得了人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体pbLGLyz， 构建方法如下：根据GENBANK登录号X14710中的序列设计并合成如下引物：
5’-cggccgggggtctgctcc-3’(SEQ)ID NO：1)，和
5’-ctcgagggctgcagctggggtcac-3’(SEQ)ID NO：2)。
以牛基因组DNA为模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72 ℃90s，30个循环)扩增BLG5’侧翼序列(-1216～+45bp)，将PCR产物克 隆入pGEM-T-easy载体，得质粒pbLG5’。XhoI+SacII双切重组质粒pTA-BGH 获得300bp大小的牛生长素基因3’UTR(PolyA序列)，将其回收，克隆到质 粒pbLG5’中成pbLGpA。最后再用XhoI将人的溶菌酶基因从pcDNA-LYZ切出 后克隆到pbLGpA的XhoI位点，最终获得pbLGLyz表达载体。
获得的人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体pbLGLyz见图1，包含1.3kb的牛 β-乳球蛋白的5’侧翼序列(-1216～+45bp)，人溶菌酶的完整基因组编码基 因(四个外显子和三个内含子)和300bp的牛生长激素的polyA信号序列。牛的 β-乳球蛋白指导人溶菌酶基因乳腺特异表达框架的核酸序列序列如下(注： 1-1260位为牛β-乳球蛋白的调控序列；1267-6067位为人溶菌酶的基因组编 码序列；6074-6304位为牛生长激素的polyA加尾序列；1261-1266、6068-6073 位为XhoI的酶切位点)(SEQ ID NO：5)。
CGGCCGGGGGTCTGCTCCCGTGGGTGGGCTCTTTCTGGTACAGTCACCAACAGTCTCTCCGGGAAGGAAACCAGAGGCCAGAG
AGCAAGCCAGAGCTAGTCTAGGAGATCCCTGAGCCTCCACCCAAGATGCCGACCAGGCCAGCGGGCCCCCTGGAAAGACCCTA
CAGTCTAGGGGGGGAACAGGAGCCGACCCGCCAGGCCCCCGCTATCAGGAGACACCCCAACCTTGCTCCTGTTCCCCTACCCC
AGTACGCCCACCCGACCCCTGAGATGAGTGGTTTACTTGCTTAGAATGTCAATTGAAGGCTTTTGTACCCCCTTTGCCAGTGG
CACAGGGCACCCACAGCCCGCTGGGTACTGATGCCCATGTGGACTCAGCCAGGAGGACTGTCCTGCGCCCTCCCTGCTCGGGC
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实施例2共转染山羊的胎儿成纤维细胞以及抗性克隆的筛选鉴定
pbLGlyz用NotI酶将表达框架切出，用限制性内切酶SalI将双标记选择 载体pLNK(图2)的表达框架切出，按pbLGlyz∶pLNK＝5∶1的比例混合后，电穿 孔方法共转染胎儿成纤维细胞，电击参数：0.4kV，500uF。电击后，静置10 分钟，用GEF完全培养液洗出细胞，均匀接种在10个100mm细胞培养皿中， 置于37℃、5％CO2培养箱中培养；转染48小时后更换选择培养液，此后每隔两 天更换选择培养液一次，直至形成明显的细胞克隆。
在细胞克隆形成后，用克隆环挑取克隆，按照从96孔板到48孔、24孔、 12孔和6孔板顺序依次传代，当细胞在6孔板长满后冻存其中的一半(冻存密 度5×105cells/0.5ml)，另一半接入60mm培养皿中继续培养，用于抽提基因 组DNA。
当细胞在60mm培养板长满后(约2×106cells以上)，收集细胞，PBS洗两 遍，加细胞裂解液500μl，37℃裂解过夜，酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加1/10 体积的NaAC(pH5.2)后用等体积无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤一次，稍稍干燥即 用40μl含有20μg/ml RNase的TE缓冲液溶解，37℃温育过夜，4℃保存以备 用于阳性克隆的筛选。
用如下引物测定转基因的整合情况，扩增片段为人溶菌酶基因组内一段大 小为429bp的序列，退火温度为60℃。
Lyz983：TACATTTGAGGACCTGGCAGAGC(SEQ)ID NO：3)，和
Lyz1412：TCCTACCACTTTGGGAGGCTGA(SEQ)ID NO：4)。
用完整的4.8kbp的人溶菌酶的基因组DNA为探针，EcoR I酶切基因组， Southern-blot分析。可获得3.2kb的杂交条带的为正确整合克隆。将正确克 隆于液氮中保存备用。
Southern-blot实验操作步骤主要参照《分子克隆试验指南》实验方法进 行，琼脂糖凝胶浓度为1％，电泳液为1×TAE，电泳条件为30V，过夜(16h)。 DNA转移到硝酸纤维膜上，转移液6×SSC，转移过夜20小时；DNA固定-杂交： 80℃烤膜，2小时；预杂交42℃，4小时；杂交42℃，过夜(20小时)；洗膜、 放射自显影：压片后，-80℃，72小时；洗片，分析结果。
共挑取了34个分隔良好的细胞株，PCR检测表明其中有10个为阳性(1、2、 4、5、6、11、21、26、27、28)，进一步Southern-blot分析表明有3个可获 得阳性杂交条带，分别是5、6和11号，见图3。
实施例3体细胞核移植
1.卵母细胞制备与受体羊的同步
挑选出作为卵母细胞供体的母羊肌注PG 0.1mg/头，间隔10～14天后注射 第二次PG，在第二次注射PG 10～13天后开始超排，即首先肌肉注射FSH，分 6次，2次/日，用量为每天100IU，80IU，80IU。在最后一次注射FSH的同时， 注射一次PG(0.1mg/头)，间隔24小时后时注射LRH，25μg/次，注射LRH后26～ 28小时回收卵母细胞。
为与提供卵母细胞的供体羊同步，受体羊间隔9～11天分两次肌肉注射PG， 在供体羊超排注射PG后24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及 剂量同供体。
手术暴露输卵管，用F-10营养液冲卵、体视镜下检卵。透明质酸酶消化 颗粒细胞，M16洗4～5次，置M16方杯中培养，备用。
2.供核细胞的饥饿处理
把待饥饿的细胞接种于35mm平皿内。待细胞丰度达70％～75％左右时，吸 去培养液，加入含0.5％FCS的DMEM液，饥饿5天后，常规法消化收集细胞。 然后放于-85℃冰箱内保存。在核移植实验前6天，取出2小管复苏并接种于4 孔板内。再培养2天或3天后饥饿，饥饿方法同前。
3.重构卵的制备与激活
卵母细胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB 7.5μg/ml)液中洗涤3次， 在M16-Hepes(含7.5μg/ml CB)中处理10min；同时将培养的细胞用胰酶消化、 分散成单个细胞。将卵母细胞与供核体细胞同时移入置于灭菌玻片上的1ml M16-Hepes(含CB)中，在显微镜下去核并吸入供核细胞，将之从原来的切口注 射到卵周隙内，使其紧贴于胞质膜，采用电刺激的方法进行融合，融合基质为 含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化钙、0.1mM硫酸镁、0.5％BSA的溶液，融合 条件为DC600-610v/cm，脉冲持续时间80μs，连续刺激3次。融合后的胚 胎于M16中培养5小时后，在含5μM离子霉素(ionomycin)、7.5μg/ml CB 的M16液中处理5min，再在含2mM-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5μg/ml CB的M16液中处理5小时后移到M16培养液中培养，待包埋或移植。
4.重构卵的包埋、回收与发育胚胎的移植
用1％的Agarose包埋重构卵，并移植入输卵管内，体内培养5天后将胶 条冲出，将胶条内的胚胎剥离出来，选择发育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受 体羊子宫内。移植后的受体在胚胎发育至1～2月龄时用B超进行妊娠检查， 出现孕囊的判定为怀孕，妊娠足月分娩。
最终利用6号细胞株，共获得了5头成活克隆羊，见图4。
实施例4成活克隆山羊的整合检测
取克隆山羊的耳尖组织，组织匀浆机匀浆，加入500μl 1×裂解液，50μl 蛋白酶K，37℃恒温过夜。次日加入500μl酚，缓慢颠倒混匀5分钟，使其充 分乳化。13000g离心5分钟，用1000μl去尖枪头小心吸取上清至一1.5ml离 心管。用等体积酚∶氯仿(1∶1)反复抽提几次。最后加入2倍体积的无水乙醇， 缓慢混匀，静置10分钟。13000g，4℃离心10分钟，沉淀DNA。倾除上清，倒 置离心管至溶液挥发干，加入适量300μlTE(pH8.0)溶解，保存于4℃备用。
基因组DNA的PCR和Southern-blot检测方法同实施例2。经PCR和 Southern-blot分析表明均为5头克隆山羊均为转基因山羊，见图5，图5A为 PCR检测结果，N1～N3为正常山羊，1～5分别为BLG1～BLG5，+为阳性质粒对照， M为1kb的分子量标准，可见BLG1～BLG5都可扩增获得阳性条带；图5B为 Southern-blot的检测结果，1～5分别为BLG1～BLG5，M为1kb的分子量标准， 可见BLG1～BLG5都可扩增获得阳性条带，也都可杂交出3.2kb的阳性条带。
实施例5转基因山羊的诱导泌乳和重组人溶菌酶的表达检测
选取转基因山羊BLG1和BLG2，待BLG1和BLG2生长至5月龄时进行诱导 泌乳，获得乳汁。每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(2mg)及黄体酮(20mg)二次，共 七天。然后分别于第8，10，12，14天肌肉注射利血平0.5mg。于第12天收集 乳汁，乳汁保存于-20℃备用。
将羊奶用蒸馏水稀释10倍，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，于65 ℃温育15分钟。取5μl做SDS-PAGE凝胶电泳，积层胶为4％胶浓度，分离胶为 7.5％胶浓度，100V恒压。
Western-blot分析：SDS-PAGE凝胶电泳后，80mA恒流2小时，将蛋白转 至硝酸纤维素膜上。10％脱脂奶粉过夜封闭转印膜，以1∶3000的浓度加入第一 抗体(兔抗人溶菌酶多抗，DAKO产品)，室温杂交1小时；杂交结束，用PBST 溶液漂洗滤膜3次，每次10分钟；以1∶3000的浓度加入酶联二级抗体，室温 杂交1小时；杂交结束，用PBST溶液洗膜3次，每次10分钟。用DAB和双氧 水显色5分钟。
估量乳汁中重组人溶菌酶的表达水平：将转基因山羊的奶样和人的标准品 分别做梯度稀释后，通过SDS-PAGE和Western-blot检测，对检测信号进行对 比，以此对奶中人溶菌酶的表达水平进行估计。
奶样经SDS-PAGE和Western-blot分析，表明BLG1和BLG2的乳汁中都可 获得强的杂交信号。乳汁中rhLYZ的估量表明BLG1初乳中大约为3mg/ml；BLG2 初乳中的表达量在4mg/ml。上述杂交分析也表明山羊乳汁中表达的重组人溶菌 酶与天然人的溶菌酶有相同的抗原性，分子量也相当，约14.6kD。
图6显示了转基因山羊乳汁中人溶菌酶的表达检测。图6A为SDS-PAGE电 泳结果，PAA1、PBC1和PBC2是与BLG1和BLG2同一批次制备的不同调控区指 导人溶菌酶乳腺特异表达的转基因克隆山羊，正常山羊与转基因山羊催乳同 步，M为蛋白分子量标准，SDS-PAGE结果表明BLG1和BLG2的奶样在14.6kD 处都有一明显蛋白条带，其他样品无；图6B为图6A所述样品的Western-blot 检测结果，图中可看出BLG1和BLG2都有强的杂交信号，PBC1、PBC2以及人乳 汁有相应的杂交条带，但较弱。
图7是转基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量。1、2、3、4、5为人LYZ 的标准品，上样量分别为：0.4μg、0.2μg、0.1μg、0.05μg、0.025μg；A、 B、C、D为BLG2山羊乳汁，上样量分别为：0.1μl、0.05μl、0.025μl、0.0125 μl为原乳。图7A为SDS-PAGE检测结果，图7B为相应的Western-blot检测 结果，从两种结果可见D与4的信号强度相当，由此估算出的乳汁中人溶菌酶 的表达量约为4mg/ml(0.05μg/0.0125μl)。
图8是转基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量。1、2、3、4、5为人LYZ 的标准品，上样量分别为：0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg，A、 B、C、D为BLG2山羊乳汁，上样量分别为：0.25μl、0.2μl、0.15μl、0.1 μl、0.05μl为原乳。从结果可见D与3的信号强度相当，由此估算出的乳汁 中人溶菌酶的表达量约为3mg/ml(0.3μg/0.1μl)。
实施例6重组人溶茵酶的纯化
将收集的乳汁在4℃溶解，然后10000g离心30分钟。去除脂肪后的乳汁 用4N的盐酸调pH到4.7，通过40℃加热30分钟使酪蛋白沉淀，最后10000g， 离心30分钟后将乳清轻轻倒出。将乳清对10倍体积的透析液(0.05M NaCl， 5mM巴比妥-HCl，pH7.4)透析，重复3次。然后上肝素-琼脂糖凝胶柱(50ml固 定凝胶)。柱子用250ml透析缓冲液洗涤后，再通过0.05-1M的线性梯度的 NaCl(800ml)进行洗脱，流速是20ml/h。收集各洗脱峰。用Western-blot检 测各峰，确定重组溶菌酶的洗脱峰。真空浓缩后用Sephadex G-75柱进行凝胶 过滤：洗脱液为0.1M sodium acetate(pH 6.5)，流速20ml/h，收集包含 重组溶菌酶的组分。
共纯化约20ml诱导泌乳第5天BLGl转基因山羊的奶样，经肝素-琼脂糖 凝胶柱纯化后峰2共收集24ml，DC法检测蛋白浓度为0.8mg/ml，总计19.2mg， 其中大约有90％的组分为重组人溶菌酶。
图9为Heparin-Sepharose层析柱纯化转基因山羊乳汁中的人溶菌酶。图 9A为0.05-1M NaCl梯度洗脱结果；图9B为梯度洗脱各峰的SDS-PAGE结果， 可见峰2中的蛋白主要为分子量在14.6kD的蛋白；图9C为梯度洗脱各峰的 Western-blot检测结果，表明在峰2可检测到与人溶菌酶抗体的反应信号，说 明峰2中含有的蛋白主要为重组人的溶菌酶。
实施例7溶菌酶的活性检测
活性分析：通过测定A450条件下，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)浊度的变化来测定。1个酶活单位定义为在室温(20.8℃)条件下， 在0.18M的醋酸钠，pH5.5的缓冲液中，每分钟A450降低值为0.001。
首先用0.18M的醋酸钠(pH5.5)的缓冲液将溶壁微球菌配置成0.8mg/ml的 悬浮液(OD450：0.6-1.0)。将天然人溶菌酶加入正常山羊的乳汁中，浓度达 到2mg/ml，作为标准品，正常山羊的乳汁为阴性对照，正常乳汁与转基因乳汁 泌乳期相同。将标准品、阴性对照和转基因羊奶用0.18M的醋酸钠(pH5.5)做 50、100、200、400、800、1600倍稀释。将20μl样品和180μl的溶壁微球 菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)的悬浮液混合，迅速读取混合液 的A450光吸收值，5分钟后再测定一次，计算出A450/min的降低值。整个实验均 在室温(20.8℃)下完成。选择倍比关系较好的稀释度计算乳汁中的溶菌酶的活 性单位。
经溶壁微球菌悬浮液的溶壁活性分析表明，BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶 活性分别约为617600U/ml和846400U/ml，添加2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常 山羊乳汁中的溶菌酶活性为308800U/ml。
图10为转基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含 量是通过倍比关系较好的稀释度计算出的活性单位。可见BLG1、BLG2和含 2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性分别约为617600U/ml、 846400U/ml和308800U/m。
实施例8重组人溶菌酶的N-端氨基酸测序
将纯化所得的rhLYZ经SDS-PAGE电泳，半干转移至PVDF膜上。转移缓冲 液为CAPS液，操作方法简述如下：剪PVDF膜大小同凝胶，100％甲醇浸润，用 阳极缓冲液体平衡30分钟；同时两张3mm滤纸也在阳极缓冲液中平衡。阴极 缓冲液体中平衡凝胶和两张3mm滤纸。由下至上组装转移夹心装置，依次为： 滤纸(+)，PVDF膜，凝胶，滤纸(-)。恒流，1.5mA/cm2，30-60分钟。将膜用 0.1％考马斯亮蓝R250(溶解于40％甲醇，1％冰醋酸)，染色30-50秒(不可超过1 分钟)，用50％甲醇脱色后用去离子水充分清洗，滤纸上凉干。切下目的条带， 将PVDF膜保存于两张滤纸之间，送中国科学院上海生化与细胞研究所蛋白质 组研究分析中心进行N-端序列测定。
经中国科学院上海生化与细胞研究所蛋白组研究分析中心的N-端测序表明了 重组人溶菌酶的N-端10个氨基酸序列为：KVFERCELAR，与天然人的溶菌酶序 列完全相同，见表1。表明了重组人溶菌酶在山羊乳汁中进行了正确拼接和翻 译。
表1N-端测序结果
样品名称   rhlyz   批号 样品状态   □固体 □液体 ■PVDF   纯度 估计分子量   14.6K DAL   浓度或重量 测试仪器型号   ABI491A   仪器公司     PE公司 测试结果 (N端)   序号     名称   序号     名称   1     K   2     V   3     F   4     E   5     R   6     x   7     E   8     L   9     A   10     R   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20 备注说明：   NH2-K-V-F-E-R-x-E-L-A-R(x一般情况下为C)
实施例9各种溶菌酶调节构件对于山羊乳汁溶菌酶分泌的影响比较
本发明人于2004年，做了4种乳蛋白调区指导人溶菌酶的5种乳腺特异表达 框架(包括基因组DNA和cDNA)，将分别来源于人的α-乳白蛋白，山羊的β -酪蛋白，牛的α-乳球蛋白，和牛的αS1-酪蛋白的片段与其它功能片断连接， 构建用于调控的元件，各调控构件的具体结构可见图11。
通过共转染的方法，本发明人获得了上述构件的包含人溶菌酶的整合细胞 株，并将其用于体细胞克隆，情况如下：pBClyzc整合细胞株为11和26的细胞； pAAlyzc整合细胞株为6、13、43和45的细胞；pbLGlyz整合细胞株为编号为5、 6和21的细胞；pBClyzg整合细胞株为编号为8、9和10的细胞；pINS-CNlyz整合 细胞株编号为25、B6和B7细胞。
利用上述整合细胞，本发明人都获得了成活的体细胞克隆羊，出生羊情况 为：pBClyzc存活4头，pAAlyzc存活4头，pbLGlyz存活5头，pBClyzg存活5头， pINS-Cnlyz存活3头。
本发明人选择了来源于pBClyzc(PBC1和PBC2)、pAAlyzc(PAA1和PAA2)和 pbLGlyz(BLG1和BLG2)构件的各2头羊进行催乳，另外选择一只相同年龄的山羊 做对照。另两个构件的羊因年龄尚小没进行催乳。
对获得乳汁(PAA1没能获得乳汁)，进行了表达分析。检测结果表明，PAA1 羊乳汁中没有hLYZ的表达，PBC1和PBC2两只羊的乳汁中仅有很微量的表达(表 达水平相似)，而BLG1和BLG2两只羊的乳汁中hLYZ都有了高水平表达，正常羊 乳汁中没有检测到杂交信号，见图6。
因此，本发明人很幸运的找到了在乳汁中高效表达hLYZ的最佳调控组合： 牛BLG5’-hLYZ-bGHpA。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海杰隆生物工程股份有限公司
<120>一种利用家畜乳腺高效生产人溶菌酶的方法
<130>059336
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>1
cggccggggg tctgctcc                 18
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>2
ctcgagggct gcagctgggg tcac          24
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>3
tacatttgag gacctggcag agc           23
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>4
tcctaccact ttgggaggct ga            22
<210>5
<211>6304
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cggccggggg tctgctcccg tgggtgggct ctttctggta cagtcaccaa cagtctctcc    60
gggaaggaaa ccagaggcca gagagcaagc cagagctagt ctaggagatc cctgagcctc    120
cacccaagat gccgaccagg ccagcgggcc ccctggaaag accctacagt ctaggggggg    180
aacaggagcc gacccgccag gcccccgcta tcaggagaca ccccaacctt gctcctgttc    240
ccctacccca gtacgcccac ccgacccctg agatgagtgg tttacttgct tagaatgtca    300
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ccatactcag cgacacaccc agcaccagca ttcccaccac tcctgaggtc tgaaggcagc    480
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catggtttgg aggagatggt gcccaaggca gaagccaccc tccaggacac acctgccccc    900
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ttatttcttt gtgggtttgt atacttacaa tggctaaaaa catcagtttg gttctttata   1560
accagagata cccgataaag gaatacgggc atggcagggg aaaattccat tctaagtaaa   1620
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