乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体及应用
阅读：979发布：2020-05-13
专利汇可以提供乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体及应用，所述同源重组载体是以真核表达载体为骨架载体，重组载体中至少包括正筛选元件、负筛选标记基因、抗菌肽Cecropin基因表达盒以及rosa26基因的同源左臂和同源右臂；其中，正筛选元件包括顺次连接的重组酶识别序列-正筛选标记基因-重组酶基因-重组酶识别序列。利用所述同源重组载体 转染 哺乳动物 体细胞 ，获得的阳性细胞rosa26基因第一个内含子定点整合抗菌肽Cecropin基因。利用本发明方法成功获得了乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin的转基因猪细胞系，为通过转基因技术制备抗腹泻转基因猪奠定 基础 。，下面是乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体及应用专利的具体信息内容。
1.乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体，其特征在于，所述同源重组载体是以真核表达载体为骨架载体，所述同源重组载体中至少包括正筛选元件、负筛选标记基因、抗菌肽Cecropin基因表达盒以及rosa26基因的同源左臂和同源右臂；
其中，所述正筛选元件包括顺次连接的重组酶识别序列-正筛选标记基因-重组酶基因-重组酶识别序列；
所述正筛选元件的一端与所述同源左臂连接，另一端与所述抗菌肽Cecropin基因表达盒连接；所述抗菌肽Cecropin基因表达盒的另一端与所述同源右臂连接，同源右臂的外侧连接有负筛选标记基因。
2.根据权利要求1所述的同源重组载体，其特征在于，所述正筛选标记基因包括编码新霉素磷酸转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因；所述负筛选标记基因包括编码白喉毒素或胸腺去氧核苷的基因；所述重组酶基因包括编码Cre酶或Flp酶的基因。
3.根据权利要求2所述的同源重组载体，其特征在于，所述正筛选元件为Loxp-OCT4启动子-Cre-PGK-Neo-Loxp。
4.根据权利要求1所述的同源重组载体，其特征在于，所述抗菌肽Cecropin基因表达盒为人乳铁蛋白hLF启动子-抗菌肽Cecropin基因-hLF终止子。
5.根据权利要求1所述的同源重组载体，其特征在于，所述同源重组载体包含如下顺次连接的元件：同源左臂-Loxp-OCT4启动子-Cre-PGK-Neo-Loxp-人乳铁蛋白hLF启动子-抗菌肽Cecropin基因-hLF终止子-同源右臂-PGK-dTA。
6.根据权利要求5所述的同源重组载体，其特征在于，所述同源左臂和同源右臂为来自于猪rosa26基因的同源左臂和同源右臂，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；
所述抗菌肽Cecropin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求1所述的同源重组载体，其特征在于，所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
8.特异性表达抗菌肽Cecropin基因的细胞系，其特征在于，利用权利要求1-7任一项所述同源重组载体转染哺乳动物体细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为特异性表达抗菌肽Cecropin基因的细胞系。
9.权利要求1-7任一项所述同源重组载体或权利要求8所述细胞系在制备乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin转基因动物中的应用，其中，所述动物包括猪。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述同源重组载体转染到与其同源臂DNA来源相同的猪细胞系中。
乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体及应用
技术领域
[0001] 本发明属于动物基因工程领域，具体地说，涉及一种乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体及应用。
背景技术
[0002] 抗菌肽(天蚕素，Cecropin)于上世纪70年首先发现，不久便被分离。近年来发现抗菌肽不仅具有不同于传统抗生素的特殊作用机制，同时兼具抑制病毒，寄生虫，肿瘤细胞的生长，杀死有害病院的能力。已成为一类具有巨大发展潜力的新型抗菌、抗病毒、抗寄生虫和抗癌的药物。抗菌肽分子量约为4kD左右，由30多个氨基酸残基组成。具有N端亲水和C端疏水的水脂两亲性质，热稳定性好等优势。
[0003] 传统抗生素是通过与病原特定受体结合来破坏或者抑制某些生物过程，以达到抑菌或杀菌的作用。当抗生素靶点发生突变，其抗菌作用就会减弱甚至消失。而抗菌肽主要通过作用于细菌细胞膜，破坏细菌完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出而死亡。几乎所有的抗菌肽都是阳离子型或者两亲性，对脂多糖(LPS)具有较强亲和作用，而LPS作为革兰氏阴性菌(G-)的主要组分，抗菌肽可以通过取代结合LPS的阳离子，导致细胞外膜破坏进而破坏细菌；对于革兰氏阳性菌(G+)，抗菌肽可以与其细胞膜表面带负电荷的胞壁酸、磷壁酸和氨基酸羧基结合，使肽聚糖层破坏形成穿膜通道，使得胞内物质大量流出导致细胞死亡。抗菌肽对于病毒、寄生虫和肿瘤细胞等同样具有作用，但机制尚不十分清楚，有待进一步研究。
[0004] 作为养猪大国，猪病疫情严重制约了养猪企业的扩张与发展。仔猪腹泻是目前最严重的仔猪疾病群之一，也是引起仔猪死亡的重要因素。近年来，我国仔猪腹泻十分普遍，据报道，30kg以下的仔猪，全年平均发病率46.5％，死亡率10.3％，给养猪业带来重大的经济损失。引起仔猪腹泻的传染性因素主要是指传染性病原，其中病毒主要有猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和轮状病毒，细菌主要有大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌等；细菌主要有沙门氏菌，大肠杆菌，志贺菌、金黄色葡萄球菌和弯曲菌等。然而，我国猪用疫苗和抗生素的应用尚存在许多问题，如副反应较大、免疫效果不理想、出现超级细菌等。基于抗菌肽的生物学功能，提示可通过转基因手段增强仔猪抗腹泻能力。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体及应用。
[0006] 本发明构思如下：通过基因工程手段(通过构建乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体)将抗菌肽Cecropin基因转入猪成纤维细胞内，并使其在乳腺特异表达，从而增加乳汁中抗菌肽Cecropin的含量，针对乳猪达到降低仔猪腹泻发病率的目的。
[0007] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体，所述同源重组载体是以真核表达载体为骨架载体，所述同源重组载体中至少包括正筛选元件、负筛选标记基因、抗菌肽Cecropin基因表达盒以及rosa26基因的同源左臂和同源右臂。
[0008] 优选地，所述同源重组载体是以载体BAC作为骨架载体。
[0009] 其中，所述正筛选元件包括顺次连接的重组酶识别序列-正筛选标记基因-重组酶基因-重组酶识别序列。
[0010] 所述正筛选元件的一端与所述同源左臂连接，另一端与所述抗菌肽Cecropin基因表达盒连接；所述抗菌肽Cecropin基因表达盒的另一端与所述同源右臂连接，同源右臂的外侧连接有负筛选标记基因。
[0011] 优选地，所述正筛选标记基因包括但不限于编码新霉素磷酸转移酶(Neo)、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因。
[0013] 本发明所述重组酶基因包括编码Cre酶或Flp酶的基因。
[0014] 优选地，所述同源重组载体中的正筛选元件为Loxp-OCT4启动子-Cre-PGK-Neo-Loxp。其中，Cre表达框由胚胎期特异性启动子OCT4调控。所述新霉素Neo作为正筛选标记，dTA为负筛选标记。LoxP位点位于Cre表达框上游和Neo表达框下游。
[0016] 更优选地，所述同源重组载体包含如下顺次连接的元件：同源左臂-Loxp-OCT4启动子-Cre-PGK-Neo-Loxp-人乳铁蛋白hLF启动子-抗菌肽Cecropin基因-hLF终止子-同源右臂-PGK-dTA。
[0017] 其中，所述同源左臂为来自于猪rosa26基因的同源左臂，优选来自于猪rosa26基因内含子1的一段至少1.1kb序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述同源右臂为来自于猪rosa26基因的同源右臂，优选来自于猪rosa26基因内含子1的一段至少6.0kb序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0018] 所述抗菌肽Cecropin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0019] 在本发明的一个具体实施方式中，所述特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体为pHS-AVC-YW077cecropin(图1)，其中，O代表猪早期胚胎发育转录因子OCT4的特异性启动子；C代表编码重组酶Cre基因；N代表真核细胞常用的药物筛选标记基因Neo；Cec代表抗菌肽Cecropin基因；R代表插入位点rosa26基因。
[0020] 所述同源重组载体pHS-AVC-YW077cecropin的核苷酸序列全长如SEQ ID NO:4所示。
[0022] 更具体地，本发明提供一种特异性表达抗菌肽Cecropin的转基因猪胎儿成纤维细胞系，将上述同源重组载体转染到与其同源臂DNA来源相同的猪细胞系中，获得经鉴定为定点整合抗菌肽Cecropin基因的猪细胞系。
[0023] 第三方面，本发明提供所述同源重组载体或所述细胞系在制备乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin转基因动物中的应用，其中，所述动物包括猪。
[0024] 前述的应用，将所述同源重组载体转染到与其同源臂DNA来源相同的猪细胞系中。
[0025] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0026] 本发明首次构建得到乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体，并成功获得了乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin的转基因猪细胞系，为通过转基因技术制备抗腹泻转基因猪奠定基础。附图说明
[0027] 图1为本发明同源重组载体pHS-AVC-YW077cecropin的质粒图谱。
具体实施方式
[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0030] 实施例1特异性表达抗菌肽Cecropin基因的同源重组载体的构建
[0031] 1、构建中间载体pHS-AVC-YW056
[0032] 1)从本实验室前期构建的pBC1-hLZ-GFP-Neo(Jia et al.,2011)扩增同源左臂Left arm，扩增引物如下：
[0033] F:CTCTTCTCTTCCTCCCACAGGGCCTCGTTTGTTACGCTGGAAGG
[0034] R:AAGCATAAAAACGCACCAATTGTCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTAGCTTAGGTGTTGCCTGGACTC
[0035] 2)酶切Seq1-XhoI-Seq2载体
[0036] 将Seq1-XhoI-Seq2骨架载体使用XhoI 37℃酶切3h，然后80℃热失活20min。
[0037] 3)重组反应的建立
[0038] 将PCR片段与载体酶切片段按照下表进行组装反应：
[0040] 吹打混匀体系，并放入金属浴中反应，50℃保持恒温反应60min即可进行后续的转化实验。
[0041] 2、构建中间载体pHS-AVC-YW059
[0042] 1)从本实验室前期构建的pBC1-hLZ-GFP-Neo(Jia et al.,2011)载体为模板扩增OCT4-Cre-PGK-Neo(分两段扩增)
[0043] F1:TCGACGTTAACGCTAGTGATCTAGAGCTAGGCGCGCCTCCG
[0044] R1:CAGGCCAGGTATCTCTGACCAGAGTCATCCTAAAATACAC
[0045] F2:GGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTG
[0046] R2:GCACCTGAGGAGTGAATTCATCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG
[0047] 2)2)合成Seq1-XhoI-Seq2序列:
[0048] GGTTTACCGAGCTCTTATTGGTTTTCAAACTTCATTGACTGTGCC CTCGAGGGTGCGTTTTTATGCTTGTAGTATTGTATAATGTTTTTAAGATCC
[0049] 酶切Seq2-GTW-Seq3载体
[0050] 将Seq2-GTW-Seq3骨架载体使用EcoRV/MluI 37℃酶切3h，然后80℃热失活20min。
[0051] 3)重组反应的建立
[0052] 将PCR片段与载体酶切片段按照Easyclone拼装试剂进行组装反应。吹打混匀体系，并放入金属浴中反应，50℃保持恒温反应60min即可进行后续的转化实验。
[0053] 3、构建中间载体pHS-AVC-YW063
[0054] 1)从本实验室前期构建的pBC1-hLZ-GFP-Neo(Jia et al.,2011)载体为模板扩增Loxp-HLF(分两段扩增)
[0055] F1:AAAAGTTGGCTCCGAATTTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGACATTCCGTCATGAACACATGATGTGGAGC
[0056] R1:TAGGTCACCTGAACACCTTTCTTGG
[0057] F2:AAAGGTGTTCAGGTGACCTATTATTTCCC
[0058] R2:GTCGAATTATGATCAGTTACGTCTGCGGTCTGGAGGCGACTTG
[0059] 2)酶切pENTR-L4-MCS2-R1载体
[0060] 将pENTR-L4-MCS2-R1骨架载体使用XhoI/XmaI 37℃酶切3h，然后80℃热失活20min。
[0061] 3)重组反应的建立
[0062] 将PCR片段与载体酶切片段按照Easyclone拼装试剂进行组装反应。吹打混匀体系，并放入金属浴中反应，50℃保持恒温反应60min即可进行后续的转化实验。
[0063] 4、构建中间载体pHS-AVC-YW066
[0064] 将pHS-AVC-YW063，pENTR-L1-Cecropin-L2(基因合成)，Seq3-ccdB-Seq4(骨架载体)分别稀释成20nM(10ul体系)，各取0.5ul加入0.5ul LR酶及0.5ul ddH2O，室温反应3h即可。
[0065] 5、构建中间载体pHS-AVC-YW058
[0066] 1)从本实验室前期提供的pBC1-hLZ-GFP-Neo(Jia et al.,2011)扩增同源右臂Right arm，扩增引物如下：
[0067] F1:TCTTCCTCCCACAGGGCCTCGAGACGTTAGTAACTGAGCTCAGTTGCCGGTAGACATTCCGTCATGAACACATGATGTGGAGC
[0068] R1:ATTACTGCTTTTGCAAGCAACCGATCACTAGGGACAGTACTGATAGTCAGCCTC
[0069] 2)酶切Seq4-GTW-Seq5载体
[0070] 将Seq4-GTW-Seq5骨架载体使用EcoRV/MfeI 37℃酶切3h，然后80℃热失活20min。
[0071] 3)重组反应的建立
[0072] 将PCR片段与载体酶切片段按照Easyclone拼装试剂进行组装反应。吹打混匀体系，并放入金属浴中反应，50℃保持恒温反应60min即可进行后续的转化实验。
[0073] 6、构建中间载体pHS-AVC-YW055
[0074] 1)将pENTR-L4-mPGK-R(pHS-AVC-YW053)、pENTR-L1-dTA-L2(pHS-AVC-YW054)、Seq5-GTW-Seq6(骨架载体)分别稀释成20nM(10ul体系)。
[0075] 2)按照下表的反应体系进行LR反应，室温反应3h。
[0077] 3)反应完成后，进行转化实验。
[0078] 7、多个元件载体的拼装
[0079] 拼装同源左臂-Loxp-OCT4启动子-Cre-PGK-Neo-Loxp-人乳铁蛋白hLF启动子-抗菌肽Cecropin基因-hLF终止子-同源右臂-PGK-dTA，即同源重组载体pHS-AVC-YW077。
[0080] 构建方法如下：
[0081] 1)线性化片段的制备
[0082] ①将pHS-AVC-YW056/059/066/058/055每个载体计算42fmol的量，放在同一离心管中使用I-SceI酶切3小时(10ul体系)，然后80℃热失活20min。
[0083] ②将pZ306载体(42fmol)使用PacI酶切3小时(10ul体系)，然后80℃热失活20min。
[0084] ③将pKan-6-X载体(42fmol)使用XbaI/XhoI酶切3小时(10ul体系)，然后80℃热失活20min。
[0085] 2)重组反应体系的建立
[0087]试剂 体积
IOS buffer 5X 400ul
T5exonuclease*(10U/ul) 0.8ul
Phusion polymerase(2U/ul) 25ul
Taq ligase(40U/ui) 200ul
ddH2O 375ul
Total 1ml
IOS buffer 5X 400ul
T5exonuclease*(10U/ul) 0.8ul
Phusion polymerase(2U/ul) 25ul
Taq ligase(40U/ui) 200ul
ddH2O 375ul
Total 1ml
[0088] ②取出15μl 1.33×gibson assembly放入PCR管中，按照等摩尔的比例依次加入含有连接片段的溶液，总体积加至20μl，如果加入所有的片段溶液后，总体积不足20μl，用ddH2O补齐至20μl。按下表在0.2ml离心管中加入各试剂：
[0089]试剂 体积
1.33×gibson assembly组装混合液 15ul
组装片段 1.67ul
线性化的pZ306 1.67ul
pKan-6-X 1.67ul
1.33×gibson assembly组装混合液 15ul
组装片段 1.67ul
线性化的pZ306 1.67ul
pKan-6-X 1.67ul
[0090] ③吹打混匀体系，50℃保持恒温反应60min。
[0092] ⑤测序验证其正确后，扩大培养，去内毒素大提。即得同源重组载体pHS-AVC-YW077cecropin(图1，SEQ ID NO:4)。
[0093] 实施例2特异性表达抗菌肽Cecropin转基因细胞系的制备
[0094] 选用性别为母的50胎龄的大白猪胎儿成纤维细胞系，细胞复苏、培养和传代参照《精编细胞生物学实验指南》(J.S.博尼费斯农等著，章静波等译，2007年，科学出版社)。待细胞生长汇合至80％左右，消化收集细胞(约1×106个)，加入实施例1构建的载体pHS-AVC-YW077cecropin 2μg和100μL Nucleofector试剂混匀，加入电击杯中，用A-024程序进行电击转染。然后按1:20接种至10cm培养皿中，37.5℃，5％CO2培养箱中培养。24h后更换含500μg/mL G418的完全培养基(10％FBS+DMEM)，每3～4天换液一次，72h后G418浓度增加到800μg/mL。培养至第8天可见克隆点形成。镜下标记克隆点位置，用细胞克隆环将其消化，接种到24孔板。待汇合度达90％，消化细胞，一部分留在原孔继续培养用于鉴定其整合位点，另一部分接种到6孔板用于细胞冻存。
[0095] 阳性细胞单克隆鉴定：
[0096] 对获得的414个细胞克隆进行鉴定。短臂引物SF：5’-TGGGTGCTTGAGGTGGTCT-3’，短臂引物SR：5’-CAAGCATAAAAACGCACCAATTGTC-3’，PCR扩增产物大小为1300bp(图2，A)。长臂引物LF：5’-GGAAGTGAGCAGGTAGAGGGTC-3’，长臂引物LR：5’-ATCCAGTGTTGCCGTGAGC-3’，PCR扩增产物大小为7975bp(图2，B)。消化12孔板单克隆细胞，提取基因组，以野生型猪成纤维细胞基因组为阴性对照，用KOD聚合酶对长、短臂进行扩增，0.8％琼脂糖电泳检测。结果如图2所示。其中阳性克隆为8个，状态良好，适宜做核移植供体细胞。即，本发明中抗菌肽Cecropin基因定点整合效率约为1.9％。
[0097] 上述结果表明，本发明已成功构建得到乳腺特异性表达抗菌肽Cecropin转基因猪细胞系。
[0098] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0099] 参考文献:
[0100] [1]Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001.
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