一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法
技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体涉及一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法。
背景技术
[0002] 斑马鱼肾脏具有强大再生能
力，其原因是斑马鱼肾脏存在肾脏祖细胞。对斑马鱼肾脏祖细胞进行研究，将会为
治疗肾脏
疾病提供新的方法或者药物。而目前还没有可以高效标记并且方便在肾脏祖细胞中进行基因过表达和基因抑制的方法。
[0003] 本
发明人在斑马鱼中利用基因敲入的方法构建成功了Six2a：GFF的转基因鱼系，该鱼系与UAS：GFP、UAS：Dendra2-NTR等鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞，以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。同时，该系统可以用于高通量的药物筛选，为找到在人类肾脏中制造肾脏祖细胞提供方法。本发明的UAS-GFF系统可以灵活的在斑马鱼肾脏祖细胞中表达各种基因，为科学研究和药物筛选提供了一个新的研究模型。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法，所述方法是在斑马鱼中利用基因敲入的方法构建成功了Six2a：GFF的转基因鱼系。
[0005] 本发明的方法，首先设计针对目标基因内含子的单导向RNA(sgRNA)，构建包括有基因部分序列和外源基因序列的质粒作为供体(donor)，通过利用CRISPR/cas9(以下简称Cas9)系统的核酸内切酶活性，同时切割基因组和供体质粒，使得被切割后的质粒在基因组的切口处，通过非同源整合的修复方式，将外源基因敲入到基因组中。
[0006] 将外源基因插入到基因组中的目标基因位点的方法是不影响内源基因表达的方法，内源基因包括目标基因。sgRNA靶序列位于目的基因
片段的一个内含子中，该位点将是sgRNA识别位点和cas9切割位点。通常内含子是靠近目标基因3’端的内含子，本发明选择的是最末端的一个内含子。由于目的区段5’端内含子和外显子直至终止子的序列均被
覆盖入左同源臂中,因此当进行非同源臂重组将外源基因插入后，该目标基因自身的表达及功能并不会受到影响。
[0007] 使用CRISPR/cas9系统,通过内含子靶向介导GFF敲入斑马鱼six2基因位点。将供体质粒，sgRNA和Cas9mRNA共同注入斑马鱼胚胎中，就可以使six2-p2A-EGFF质粒定向整合进入six2位点。
[0008] 在一实施方案中。本发明的一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法，包括以下过程：
[0009] 1)six2敲入靶点筛选：选取six2基因的最后一个内含子为敲入靶点；
[0010] 2)根据选取靶点确定sgRNA的DNA序列；
[0011] 3)将过程2)的sgRNA的DNA序列克隆到PT7-sgRNA质粒中，通过T7体外转录
试剂盒进行体外转录，制得sgRNA；
[0012] 4)制备T-P2A-GFF质粒；
[0013] 5)通过PCR引物分别扩增左臂和右臂，将左臂用KpnI和BamHI双酶切连接到T-P2A-EGFF质粒中，再将右臂通过AgeI和SalI连接到已经连接左臂的T-P2A-EGFF的质粒中，形成供体质粒，其中，所述引物为：
[0014] 左臂PCR扩增引物：
[0015] six-LF GAATTCGAGCTCGGTACCACGACAACGCGACCGAGCAGC
[0016] six-LR GAGCCAAGGTCGACCAAGTTTG
[0017] 右臂PCR扩增引物：
[0018] six-RF TAAACGTGGACCCTTTCAAAAG
[0019] six-RR CCTAGGGCATGCCTCGAGCCTAATGTGCTCGATAACAAG
[0020] 6)将cas9mRNA，sgRNA和供体质粒一起通过显微注射仪注入到1细胞期的斑马鱼受精卵中，即建成Six2a：GFF的转基因鱼系。
[0021] 上述本发明的方法，所述sgRNA的DNA序列为GGGAAAAGTCTTAAAGCCCG。
[0022] 上述本发明的方法，所述制备T-P2A-GFF质粒，以PEM-GFF VP16为模板，P2A-GFF融合序列扩增引物扩增得到P2A-GFF融合序列，然后通过T-A克隆的方法转入PMD-19T载体中。
[0023] 上述本发明的方法，所述cas9mRNA，由表达Cas9的质粒通过内切酶线性化后，用试剂盒转录纯化得到。
[0024] 上述本发明的方法，进一步包括将Six2a：GFF的转基因鱼系与选自UAS：GFP、UAS：Dendra2-NTR的鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞，以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。
[0025] 另一方面，上述本发明的方法构建的Six2a：GFF的转基因鱼系统在高通量的药物筛选中的用途以及上述的方法构建的系统在人类肾脏中制造肾脏祖细胞的用途。
[0026] 本发明的斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法在斑马鱼中利用基因敲入的方法构建成功了Six2a：GFF的转基因鱼系，该鱼系与UAS：GFP、UAS：Dendra2-NTR等鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞，以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。同时，该该方法构建的系统(鱼系)可以用于高通量的药物筛选，为找到在人类肾脏中制造肾脏祖细胞提供方法。并可以灵活的在斑马鱼肾脏祖细胞中表达各种基因，为科学研究和药物筛选提供了一个新的研究模型。
附图说明
[0027] 图1为靶点6切割后的基因组测序图，
[0028] 图2为靶点7切割后的基因组测序图；
[0029] 图3为six2a-P2A-GFF.DNA图；
[0030] 图4为提取转基因鱼基因组经引物扩增后条带图；
[0031] 图5为F0的six2a-P2A-GFF转基因鱼第筛选结果；
[0032] 图6为5#F0和Tg(UAS:EGFP)外交产F1，
荧光显微镜图；
[0033] 图7为有绿色荧光的six2a-P2A-GFF转基因小鱼再次进行PCR鉴定筛选结果；
[0034] 图8为Six2-EGFF
抗体染色图。
具体实施方式
[0035] 以下
实施例为代表性的，用于进一步阐明和理解本发蝗的实质。但不以此限制本发明的范围，任何在本发明的精神实质下进行的简单修饰和变通，也属于本发明的范围。
[0036] 实施例1 Six2a：GFF的转基因鱼系的构建
[0037] 1)six2敲入靶点筛选：
[0038] a.靶点选择并确认(最后一个intron上)：
[0039] 通过靶点设计原则在six2基因(见基因核苷酸序列SEQ ID NO.1)的最后一个内含子上找到了8个靶点如下Target1-Target8，分别通过基因组测序来验证切割效率，筛选出效率最高的靶点。
[0040] 靶点设计：
[0041]
[0042] b.切割效率验证：
[0043] 将8个靶点分别注射到斑马鱼胚胎后，提取3dpf幼鱼基因组测序，只有靶点6和靶点7出现乱峰见图1和图2；
[0044] c.克隆验证切割效率和切割形式：
[0045] 靶点6：15个有效测序结果中，2个出现双峰不可用，12个有缺失或增加，1个没有突变；故切割效率为12/13。
[0046]
[0047] 靶点7：15个有效测序结果中，5个出现双峰不可用，4个有缺失或增加，6个没有突变；故切割效率为4/10。
[0048]
[0049] 由于靶点6的切割效率比较高，因此敲入位点选择靶点6，其sgRNA的DNA序列SEQ：GGGAAAAGTCTTAAAGCCCG。
[0050] 2)six2敲入载体构建并验证：
[0051] a.根据野生型斑马鱼基因组，分别设计引物，扩增左右臂，分别连接P2A-GFF，并测序验证，见图3。
[0052] b.制备T-P2A-GFF质粒
[0053] 以PEM-GFF VP16为模板，P2A-GFF融合序列扩增引物扩增得到P2A-GFF融合序列。然后采用同规格T-A克隆的方法转入PMD-19T载体中。通过用M13正向引物测序质粒，筛选正向插入的质粒。质粒中，P2A序列是一种被剪切的序列，用于分别表达P2A序列前后两种蛋白。
[0054] c.制备最终质粒(供体质粒)
[0055] 用斑马鱼基因组DNA为模板，分别设计PCR引物扩增左臂和右臂，将左臂用KpnI和BamHI双酶切连接到T-P2A-GFF中。在此
基础上，再将右臂通过AgeI和SalI连接到已经连接左臂的T-P2A-GFF的质粒中，最终形成供体质粒。
[0056] 左臂PCR扩增引物：six-LF GAATTCGAGCTCGGTACCACGACAACGCGACCGAGCAGC[0057] six-LR GAGCCAAGGTCGACCAAGTTTG
[0058] 右臂PCR扩增引物：six-RF TAAACGTGGACCCTTTCAAAAG
[0059] six-RR CCTAGGGCATGCCTCGAGCCTAATGTGCTCGATAACAAG[0060] PCR扩增体系(50ul)：
[0061]
[0062]
[0064]
[0065] 凝胶
电泳检测，之后切下目的片段用胶回收试剂盒回收。
[0066] 连接体系(10ul)：4℃过夜
[0067]
[0068] 右臂的连接方法与左臂一致，只是对已经连接了左臂的质粒用AgeI和SalI再次进行酶切，回收大片段后，再与右臂相连接，最后得到同时连接了左臂和右臂的质粒。
[0069] d.sgRNA和Cas9mRNA合成
[0070] 用于制备sgRNA的DNA序列为GGGAAAAGTCTTAAAGCCCG(靶点6)
[0071] 将上面的sgRNA序列克隆到PT7-sgRNA质粒中，通过T7体外转录试剂盒进行体外转录，然后回收得到sgRNA。
[0072] Cas9mRNA由表达Cas9的质粒通过内切酶线性化后，用试剂盒转录纯化得到。
[0073] e.显微注射并PCR验证
[0074] 显微注射方法：提前准备好一细胞期的胚胎，固定在注射板中，将显微注射的液体按下面的配比配好后，注入到毛细管拉成的注射针中，安装好且调整好注射的速度，用显微注射仪注射到胚胎中。
[0075] 将cas9mRNA，sgRNA和供体质粒一起通过显微注射仪注入到一细胞期的斑马鱼受精卵中。每个受精卵注入1nl液体。其中含有800ng/ul Cas9mRNA，80ng/ul sgRNA，和15ng/ul供体质粒。共注射约1800颗受精卵，成活率约10％。该批受精卵正常饲养，用于后期筛选鉴定，其中任意挑选10颗左右用于鉴定，发现有正确敲入。受精卵在体外条件培养下可以直接发育成斑马鱼。
[0076] f.鉴定引物及结果：
[0077] 通过抽样提取转基因鱼基因组，分别用鉴定引物扩增，通过观察目的条带来筛选有正确敲入的鱼系,结果见图4。
[0078] 3 F0转基因鱼系筛选
[0079] a.F0外交产F1，提取3dpf幼鱼基因PCR验证，条带大小正确的测序验证。筛选出与阳性对照结果一致的鱼即为six2基因敲入成功，表示为six2a-P2A-GFF。
[0080] 模板DNA提取方法：
[0081] 分别用
镊子从3dpf幼鱼的尾部取1-2片鱼鳞溶解在10ul 0.05％的NaOH溶液中，然后于95℃20min，取出冷却后加1ul Tris-Hcl。
[0082] 鉴定引物：
[0083] F：GGAGAAAAGGGAACTAGCTGAG(基因组位点特异引物)
[0084] R：GAGGCATATCAGTCTCCACTGAAGC(敲入质粒特异引物)
[0085] 根据以上模板和引物进行PCR扩增，挑选出与阳性对照相同条带的实验组[0086] PCR扩增体系：
[0087]
[0088] six2a-P2A-GFF鉴定引物：
[0089] six-MF CTTGGTCGACCTTGGCTCTggatccggagctactaat
[0090] six-MR2 TGAAAGGGTCCACGTTTAttagttacccgggagcata
[0091] six2a-P2A-GFF筛选结果如图5所示：筛选效率：3/32
[0092] 5#F0和Tg(UAS:EGFP)外交产F1，荧光显微镜下观察，挑选出有绿色荧光的小鱼，如图6所示：5#F0遗传比率：14/130。
[0093] b.对于挑选出来的有绿色荧光的小鱼再次进行PCR鉴定，鉴定方法与之前相同。
[0094] six2a-P2A-EGFF鉴定引物：
[0095] six-MF CTTGGTCGACCTTGGCTCTggatccggagctactaat
[0096] six-MR1 TTGAAAGGGTCCACGTTTActacttgtacagctcgtcca
[0097] Six2-GFF X UAS：GFP早期胚胎筛选结果如图7所示：
[0098] Six2-GFF X UAS：GFP鱼系标记肾脏祖细胞如图8所示。
