[0024] 基因递送和体内表达:最近,已证明有可能以某种方式将 特定基因递送到体细胞组织,以纠正先天性或后天性缺陷和失调 (Herzog等,2001;Song等,2001;Vilquin等,2001)。基因基础 的药物递送相较于施用重组蛋白具有很多优点。这些优点包括天然蛋 白结构的保守性,改进的生物活性,避免了系统毒性,避免了感染和 有毒杂质。另外,核酸载体疗法延长了治疗范围内对蛋白的暴露,因 为新分泌的蛋白在血液循环中持续地存在。在某些情况下,简易质粒 注射后获得的相对较低的表达水平已足够使分泌多肽的生物活性达到 生理可接受水平(Danko和Wolff,1994;Tsurumi等,1996)。
[0025]施用重组蛋白的首要限制是在施用后有限的蛋白利用率。 使用可注射DNA质粒载体进行的核酸载体疗法克服了这个缺陷,因为 向个体骨骼肌进行的单次注射可允许长时期的生理表达(WO99/05300 和WO01/06988)。载体的注射以更近似于天然过程的方式,促进动物 体内酶和激素的产生。并且,在体内基因转移的非病毒技术中,直接 将质粒DNA注射到肌肉组织中更加简单,低廉且安全。
[0031]可直接注射的DNA质粒载体的应用在过去是被限制的。在 简易地直接注射后,肌肉纤维对于DNA摄入效率低,导致相对较低的 表达水平(Prentice等,1994;Wells等,1997)。另外,转基因表 达的持续时期很短(Wolff等,1990)。以前最成功的临床应用限于 疫苗领域(Danko和Wolff,1994;Tsurumi等,1996)。
[0032]尽管本领域有针对用线性DNA电穿孔真核细胞的参考文献 (McNally等,1988;Neumann等,1982)(Toneguzzo等,1988) (Aratani等,1992;Nairn等,1993;Xie和Tsong,1993;Yorifuji 和Mikawa,1990),这些实例说明了对细胞悬浮液,细胞培养物等的 转染作用,但在体细胞组织中并不存在转染的细胞。
[0033]美国专利4,956,288涉及制备重组宿主细胞的方法,该宿 主细胞含有大量外源DNA的拷贝,该方法是在外源DNA的存在下,电 穿孔细胞群,培养细胞,然后破坏这些含有较低外源DNA拷贝数目的 细胞。
[0037]本发明的组合物包括有效量的编码生长激素释放激素 (“GHRH”)或其功能性生物等同物的核酸表达构建体,其中GHRH或 其功能性生物等同物向个体组织中的递送和随后的表达作用足以延缓 肿瘤生长并延缓恶病质或通常与肿瘤生长相关的消瘦作用。还描述了 本发明核酸表达构建体的具体元件。例如,该构建体含有组织特异性 启动子;GHRH或其功能性生物等同物;和操作性连接的3’非翻译区 (“3’UTR”)。本发明核酸表达构建体包括一个基本上不含病毒骨 架的构建体。还提供了本发明所用的核酸表达构建体的具体实例。编 码的GHRH功能性生物等同物包含与GHRH多肽相比具有类似的或改进 的生物活性的多肽。本发明应用的由核酸表达构建体编码的GHRH或其 功能性生物等同物包含具有下述通用序列的氨基酸结构:-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQHQGA-OH
其中通式具有下述特征:X1是D-或L-异构体酪氨酸(“Y”), 或组氨酸(“H”); X2是D-或L-异构体丙氨酸(“A”),缬氨酸 (“V”),或异亮氨酸(“I”); X3是D-或L-异构体丙氨酸(“A”) 或甘氨酸(“G”); X4是D-或L-异构体蛋氨酸(“M”)或亮氨酸 (“L”);X5是D-或L-异构体丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”), 或以上组合。列出了可用于本发明的GHRH或其功能性生物等同物氨基 酸序列的具体实例。在一个具体实施例中,编码的GHRH或其功能性生 物等同物在接受核酸表达构建体的个体中促进生长激素(“GH”)分 泌。在本发明的具体实施例中,提高组织吸收核酸表达构建体能力的 转染-促进多肽包含一个带电荷的多肽,例如聚-L-谷氨酸盐。
[0038]本发明的一个实施方案涉及质粒介导的补充方法用于治疗 贫血;提高个体体内总红细胞量;逆转消瘦;逆转异常体重降低;治 疗免疫功能障碍;逆转淋巴生成的抑制;或者延长慢性病个体的寿命。 这可利用有效量的含有组成型启动子和生长激素释放激素(“GHRH”) 或其功能性生物等同物编码序列的核酸表达构建体来完成。当该核酸 序列被递送到个体的特定细胞(如体细胞,干细胞,或生殖细胞)中 时,获得GHRH的组织特异性和组成型表达。组成型启动子和GHRH或 其功能性生物等同物编码序列的优选递送方法是通过体内电穿孔方法 直接递送到个体细胞。电穿孔可涉及外部应用的电极,或当使用针的 情况下,当细胞是在个体组织中时,内部应用的电极帮助目的核苷酸 序列进入个体细胞。
[0039]本发明的另一实施方案涉及通过利用调节GHRH或其功能性 生物等同物表达的能力,进行质粒介导的方法来治疗贫血;消瘦;免 疫功能障碍和慢性病个体的寿命。所述调节可如下获得:将第一核酸 序列和第二核酸序列递送到个体细胞,然后再将分子开关递送到个体 细胞;其中第一核酸序列含有诱导型启动子和生长激素释放激素或其 类似物的编码区域(“诱导型-GHRH”),第二核酸序列具有组成型启 动子和无活性调节蛋白的编码区域。通过将分子开关分子(如米非司 酮(mifepistone))递送到个体体内,无活性的调节蛋白转变为活性 蛋白并在个体体内起始诱导型-GHRH的转录。通过修饰细胞在个体体 内GHRH或其功能性生物等同物的外部调控、表达和确保释放,可治疗 贫血症,消瘦,免疫功能障碍和提高慢性疾病个体的寿命。可通过体 内电穿孔方法将能够对GHRH或其功能性生物等同物类似物进行外部 调节的核酸序列直接递送到个体细胞。
[0044]图3显示在第0天接受了100mcg/kg而总量不超过1000mcg pSP-HV-GHRH质粒注射的癌症狗体内,在注射后9-27和28-56天IGF-I 水平上升的百分比。
[0051]图10显示在左肋腹接受了2X106 Lewis肺腺癌细胞的免疫 活性C57/B16小鼠体内肿瘤体积的发展。被治疗的动物在肿瘤细胞植 入后第1天接受20毫克表达人生长激素释放激素的质粒,而对照接受 了对照β-半乳糖苷酶质粒。GHRH治疗的肿瘤动物中肿瘤发育和进展 明显缓慢。[00521图11显示在左肋腹接受了2X106 Lewis肺腺癌细胞的免疫 活性C57/B16小鼠存活率。被治疗的动物在肿瘤细胞植入后第1天接 受20毫克表达人生长激素释放激素的质粒,而对照接受了对照β-半 乳糖苷酶质粒。GHRH治疗的肿瘤动物的存活率有所提高。
[0053]图12显示在左肋腹接受了2X106 Lewis肺腺癌细胞的免疫 活性C57/B16小鼠的肾脏大小。被治疗的动物在肿瘤细胞植入后第1 天接受20毫克表达人生长激素释放激素的质粒,而对照接受了对照β -半乳糖苷酶质粒。对照动物的肾脏明显更小,是肾衰竭的迹象。
[0055]图14显示在接受质粒介导的生长激素释放激素(组成型活 性pGHRH或受调节的Gene Switch系统GHRH-IS+/-MFP)治疗的裸鼠 中肿瘤生长并没有增加。NCI——人肺腺癌细胞系。在治疗后33天, 以组成型活性GHRH治疗的动物与对照相比肿瘤更小(p<0.02)。其它 组与对照相比差异不显著。
[0064]这里所用的术语“类似物”指GHRH的任何突变型,或合 成的或天然存在的GHRH多肽片段,例如HV-GHRH(SeqID #1),TI-GHRH(SeqID#2),TV-GHRH(SeqID#3),15/27/28-GHRH(SeqID #4),(1-44)NH2(SeqID#5),或(1-40)OH(SeqID#6)形式,或更短的但不 少于(1-29)氨基酸的形式。
[0071]这里所用的术语“细胞-转染脉冲”指力量的传送,该力 量可引起载体——例如线性DNA片段——转染到细胞。在一些实施方 案中,该力量是来自电力,如在电穿孔中,或者该力量来自血管压力。
[0072]这里所用的术语“慢性病个体”指患有慢性阻塞性肺病, 慢性心衰竭,中风,痴呆,臀部骨折后复原,慢性肾衰竭,风湿性关 节炎,和老年个体多发性紊乱,且在至少2年时间内,每个月要看医 生和/或住院的个体。
[0075]这里所用的术语“递送”或“运输”指将材料导入组织, 个体,细胞或任何受体的方法,该方法是在有或没有压力的情况下, 利用化学或生物方法,注射,混合,电穿孔,声纳穿孔,或其组合。
[0076]这里所用的术语“DNA片段”或“核酸表达构建体”指实 质上双链的DNA分子。尽管可用本领域公知的常规分子生物方法产生 片段,但是在一些实施例中,该DNA片段或表达构建体是通过对亲代 DNA分子进行限制性酶消化而得到。术语“表达载体”,“表达盒” 或“表达质粒”在此可以互换使用。尽管亲代分子可以是任何常规分 子生物DNA物质,但在一些实施方案中亲代DNA分子是质粒。
[0079]这里所用的术语“有效量”指施用给人,动物或组织培养 物中的足够量的核酸表达构建体或编码蛋白,以生成足够水平的蛋白, RNA,或激素。本领域技术人员公知足够水平的蛋白或RNA依赖于所应 用的特定核酸表达构建体。这些水平可根据给药和治疗或接种的类型 而不同。
[0083]这里所用的术语GHRH“功能性生物等同物”是一种多肽, 该多肽氨基酸序列不同于野生型GHRH多肽,并且相较于GHRH多肽, 同时具有类似的或改进的生物活性。功能性生物等同物可以天然存在 或经人工修饰。本领域技术人员公知这里所用的类似的或改进的生物 活性指促进和/或释放生长激素或其它垂体激素。本领域技术人员公知 在一些实施方案中,编码的GHRH功能性生物等同物是被改造而含有不 同的氨基酸序列并且相较于GHRH多肽同时还具有类似的或改进的生 物活性的多肽。本领域公知的操作这种序列的方法包括定点突变。
[0086]这里所用的术语“GeneSwitch”(Valentis Inc.的注册 商标,(Burlingame,CA))指米非司酮-诱导型异源核酸序列编码调 节蛋白,GHRH,功能性生物等同物或其组合的技术。这种技术在图1 和图9中用示意图表示。本领域技术人员公知米非司酮的替代物抗黄 体酮物质是可获得的,包括onapristone,ZK112993,ZK98734和5α -孕烷-3,2-二酮。
[0087]这里所用的术语“生长激素”(“GH”)指与生长相关, 并作为化学信使在靶细胞上行使功能的激素。在一个具体实施方案中, 该生长激素通过生长激素释放激素的作用而释放。
[0090]这里所用的术语“免疫功能障碍”指个体免疫系统异常的, 削弱的,或不完全的功能,如通过免疫特异性标记(如IGF-I水平, 或%淋巴细胞)间接或直接侧定的。
[0101]这里所用的术语“注射后”指将含有编码GHRH或其功能性 生物等同物的异源核酸序列的核酸序列盒导入个体细胞之后,且当修 饰的细胞在活有机体内时允许该编码基因表达的时期。
[0105]这里所用的术语“质粒骨架”指通常含有细菌起始复制位 点和细菌抗生素选择基因的DNA序列,该选择基因对于只允许那些用 适当质粒转化的细菌的特定生长非常必要。但是,还有一些质粒,称 为迷你环,缺少抗生素抗性基因和复制起始位点(Darquet等,1997; Darquet等,1999;Soubrier等,1999)。体内扩增表达质粒DNA(即 非病毒表达体系)的应用避免了病毒载体相关的风险。由于应用了“种 -特异性”成分进行基因运输,将病毒载体相关的风险最小化,所以非 病毒表达体系产物通常具有低毒性。本发明的一个特点是质粒骨架不 含有病毒核苷酸序列。
[0106]这里所用的术语“启动子”指能够指导基因转录的DNA序 列。启动子可以指导原核或真核基因的转录。启动子可以是“诱导型”, 响应诱导物质而起始转录,或者,相反,启动子可以是“组成型”, 由此诱导物质并不能调节转录速度。启动子可以组织特异性或组织优 选性的方式被调节,这样只在特定组织类型中的操作性连接编码区域 的转录中具有活性。
[0108]这里所用的术语“复制元件”包括能够在特定宿主中引起 质粒复制的核酸序列。分子生物领域技术人员公知这种复制元件可以 包括但不限于:选择性标记基因启动子,核糖体结合位点,选择性基 因序列,和复制起始位点。
[0111]这里所用的术语个体“红细胞量”(“RBC-量”)用下述3 种测试之一来进行测定:1)血细胞比容:血浆中红细胞的百分比;2) 红细胞(“RBC”)计数:血浆中红细胞的数目;和3)血红蛋白:个 体红细胞中携氧蛋白的水平。
[0115]这里所用的术语“组织”指类似细胞以及环绕其周围的细 胞间物质的集合。技术人员公知组织是行使特定功能的特征类似细胞 集合。在本发明的范围内,该术语组织并不指细胞系,细胞悬浮液或 细胞培养物。在一个具体实施方案中,组织在体内被电穿孔。在另一 实施方案中,该组织并非植物组织。技术人员公知在体内有四种基本 组织:1)上皮2)结缔组织:包括血液、骨和软骨;3)肌肉组织;以 及4)神经组织。在一个具体实施方案中,该方法和组合物涉及通过 电穿孔将线性DNA转移到肌肉组织。
[0116]这里所用的术语“治疗元件”包括可导致编码基因产物体 内表达的核酸序列。分子生物领域技术人员公知治疗元件可以包括但 不限于,启动子序列,转基因,多聚腺苷序列,或者3’或5’UTR。
[0120]这里所用的术语“血管压力脉冲”指来自大体积液体的压 力来促进细胞吸收载体。本领域技术人员公知血管压力脉冲的大小和 时间依赖于组织,大小和受体个体的总健康状况,并且可进一步知道 凭经验如何确定这些参数。
[0121]这里所用的术语“载体”指含有遗传材料的构建体,该遗 传材料被设计成通过将核酸序列运输到靶细胞而指导靶细胞的转化。 载体可以含有多个元遗传元件,这些元件在位置上和序列上与其他必 要的元件相关,这样,诱导的核酸序列盒可被转录,且如果有必要, 在转染细胞中可被翻译。术语“表达载体”指含有信息的DNA质粒, 该信息指在异源细胞内产生重组蛋白所必需的所有信息。
[0122]这里所用的术语“消瘦”指体重降低,特点是脂肪组织及 肌肉量显著降低,这就使得患有进行性疾病如癌症,AIDS等的个体增 加体重十分困难。消瘦可与疾病本身或针对疾病的治疗作用相关,或 与这二者都相关。
[0123]本发明一方面涉及用于延缓癌症个体中异常细胞生长,促 进减少肿瘤进展的方法。本发明方法包括用质粒介导的基因补充来治 疗个体。本发明包括将有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”) 或其功能性生物等同物的核酸表达构建体递送到个体组织,如肌肉组 织中。本发明的具体实施方案是针对各种类型的肿瘤(例如腺瘤;恶 瘤;白血病;淋巴瘤;肺肿瘤;肥大细胞瘤;黑素瘤;肉瘤;和实体 肿瘤)。在个体体内GHRH或其功能性生物等同物的随后表达足够延缓 肿瘤生长,预防肾衰竭,延缓恶病质或通常与肿瘤生长相关的消瘦作 用。还可以如下增强本方法:在选定组织中安置多个电极,然后在插 入电极的区域将核酸表达构建体递送到选定的组织中,对选定组织的 选定区域施加细胞转染脉冲(如电脉冲),所述选定组织的选定区域 是核酸表达构建体被递送到的区域。但是,细胞转染脉冲不一定必须 为电脉冲,还可使用血管压力脉冲。在一些具体实施方案中使用电穿 孔,直接注射,基因枪,或金颗粒轰击来递送编码GHRH或其功能性生 物等同物的核酸表达构建体到个体体内。本发明所述的个体包括哺乳 动物(例如人,猪,马,母牛,小鼠,大鼠,猴,绵羊,山羊,狗或 猫)。
[0125]尽管不希望被理论束缚,但是可以用转染-促进多肽来提高 组织细胞吸收核酸表达构建体能力。在本发明的具体实施例中,转染- 促进多肽包含一个带电荷的多肽,例如聚-L-谷氨酸盐。
[0126]本发明另一方面涉及组合物和方法,用于延缓癌症动物中 异常细胞的生长,减少肿瘤发展,防止肾衰竭,降低癌转移,提高存 活率。本发明的组合物包括有效量的编码生长激素释放激素(“GHRH”) 或其功能性生物等同物的核酸表达构建体,其中在个体体内GHRH或其 功能性生物等同物的递送和随后的表达足够延缓异常细胞的生长,促 进减少肿瘤发展的作用,预防肾衰竭,提高癌症动物的存活率。本发 明的具体实施方案针对特定类型的癌症和肿瘤(例如腺瘤;恶瘤;白 血病;淋巴瘤;肺肿瘤;肥大细胞瘤;黑素瘤;肉瘤;和实体肿瘤)
[0127]GHRH或其功能性生物等同物的随后表达足够延缓异常细 胞的生长,促进减少肿瘤发展的作用,预防肾衰竭,提高癌症动物的 存活率。还可以如下增强本发明组合物(即核酸表达构建体)的吸收: 在选定组织中安置多个电极,然后在插入电极的区域将核酸表达构建 体递送到选定的组织中,对选定组织的选定区域施加细胞转染脉冲(如 电脉冲),所述选定组织的选定区域核酸表达构建体被递送到的区域。 但是,细胞转染脉冲不一定必须为电脉冲,还可使用血管压力脉冲。 在一些具体实施方案中使用电穿孔,直接注射,基因枪,或金颗粒轰 击来递送编码GHRH或其功能性生物等同物的核酸表达构建体到个体 体内。本发明所述的个体包括哺乳动物(例如人,猪,马,母牛,小 鼠,大鼠,猴,绵羊,山羊,狗或猫)。
[0128]另外,本发明涉及用质粒介导的补充方法以治疗慢性疾病 个体贫血,消瘦,肿瘤生长,免疫功能障碍,肾衰竭和/或延长寿命。 贫血指血流中红血球数目、体积或二者都减少,或血红蛋白的总量降 低,从而导致面色苍白,全身无力等症状的疾病。个体的消瘦可定义 为体重降低,特点是脂肪组织及肌肉量显著降低,这就使得患有进行 性疾病(如癌症,AIDS等)的个体增加体重十分困难。贫血,消瘦, 肿瘤生长,免疫功能障碍,肾衰竭和预期寿命降低可与特定疾病或疾 病的治疗效果相关。更具体地,本发明涉及将编码生长激素释放激素 (“GHRH”)或其功能性生物等同物的异源核酸序列运动到个体细胞 中(如体细胞,干细胞,或生殖细胞),并当修饰的细胞在个体体内 时,使编码的GHRH或其功能性生物等同物基因表达。GHRH或其功能 性生物等同物的随后表达由组织特异性启动子(如肌肉),和/或含有 修饰配体结合结构域(如分子开关)的调节蛋白进行调控,所述调节 蛋白只有当正确修饰的配体(如米非司酮)被外部施用给个体时,才 具有活性。修饰细胞在个体体内颅外表达和确保释放GHRH或其功能性 生物等同物可治疗慢性疾病个体的贫血症,消瘦,免疫功能障碍和延 长寿命。将GHRH或其功能性生物等同物递送到个体细胞的优选方法是 电穿孔。
[0130]在体内基因转移的非病毒技术中,将质粒DNA直接注射到 肌肉组织十分简单、低廉且安全。在简易直接注射后,DNA到肌纤维 的低吸收率导致相对较低的表达水平(Prentice等,1994;Wells等, 1997)。另外,转基因表达的持续时间很短(Wolff等,1990)。以 前最成功的临床应用是在疫苗领域(Danko和Wolff,1994;Tsurumi 等,1996)。最近,利用电穿孔技术获得了提高质粒体内递送以及随 后得到生理水平的分泌蛋白的显著进步。最近,使用电穿孔来提高质 粒体内递送已取得巨大进步。已经成功地应用电穿孔在注射质粒后转 染肿瘤细胞(Lucas等,2002;Matsubara等,2001)或在人体内递送 抗肿瘤药物博莱霉素到皮肤和皮下肿瘤(Gehl等,1998;Heller等, 1996)。电穿孔还被广泛用于小鼠(Lesbordes等,2002;Lucas等, 2001;Vilquin等,2001),大鼠(Terada等,2001;Yasui等,2001), 和狗(Fewell等,2001)来递送编码各种激素、细胞因子或酶的治疗 性基因。我们使用生长激素释放激素(“GHRH”)进行的前期研究显 示用电穿孔进行质粒治疗颇具潜力并且代表诱导蛋白在大动物和人类 体内产生并受调节分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等,1999; Draghia-Akli等,2002)。电穿孔还广泛用于啮齿动物和其它小动物 (Bettan等,2000;Yin和Tang,2001)。已知电极的构造能够影响 电场分布以及随后的结果(Gehl等,1999;Miklavcic等,1998)。 预实验显示,对于大动物模型,针式电极比外部卡尺电极更能持续产 生重复性好的结果。
[0131]如上所述,电穿孔提高骨骼肌摄取质粒的能力已被完全证 实。另外,已观察到用PLG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)配制的质粒在 小鼠,大鼠,和狗骨骼肌中提高基因转染及转基因表达提高10倍 (Fewell等,2001;Mumper等,1998)。尽管不希望被理论束缚,但 是PLG会在电穿孔过程中增强质粒的转染,不仅通过稳定质粒DNA, 促进其通过细胞膜上的孔进行细胞内转运,还通过一种活性机制。例 如,细胞上带正电的表面蛋白可以通过蛋白-蛋白相互作用结合带负电 的PLG,该PLG与质粒DNA相连。当使用电场时,蛋白的表面翻转方 向然后主动地将该DNA分子包容于其内,该方法能够显著地提高转染 效率。
[0133]这里所用的给药是指将DNA载体或携带体导入体内的路径。 给药可以直接递送到靶组织或在系统给药后定向递送到靶组织。特别 地,本发明可通过对身体施用载体来进行疾病的治疗,在组织内以用 于质粒介导补充的特定水平建立任何特定核酸序列的受控表达。施用 载体的优选方法和递送方法的应用如上所述。
[0134]在简单地将DNA颗粒作为溶液,悬浮液或胶体注射到肌肉 中后,肌细胞具有独特的从细胞外空间吸收DNA的能力。通过这种方 法进行的DNA表达可以维持几个月。应用体内电穿孔进一步提高DNA 到肌肉细胞内的吸收。
[0135]制剂的DNA载体的递送涉及将DNA并入大分子复合物,该 复合物会经历靶细胞的内吞作用。这种复合物可包括脂类,蛋白,碳 水化合物,合成的有机化合物,或无机化合物。这些用载体形成的化 合物的特征(大小,电荷,表面特征,组成)决定了该载体在体内的 生物利用率。制剂的其它元素作为能够与细胞表面或内部特异性受体 反应的配体来发挥作用。合成的其它元素的功能在于促进进入细胞, 从内涵体释放以及进入核。
[0136]递送还可以通过应用DNA转运子(transporter)。DNA转 运子指可以结合DNA载体并能够被表皮细胞吸收的分子。DNA转运子 包含能够非共价地结合到DNA上并有效递送该DNA通过细胞膜的分子 复合物。优选该转运子还可以递送DNA通过核膜。例如参见下述申请, 将这些申情(包括附图)并入本文作为参考:(1)Woo等,美国专利 6,150,168,标题:“DNA转运系统及应用方法;”(2)Woo等, PCT/US93/02725,标题:“核酸转运系统及应用方法”,申请日1993 年3月19日;(3)Woo等,美国专利6,177,554“核酸转运系统及 应用方法;”(4)Szoka等,美国专利5,955,365,标题“自我组装 的多核苷酸递送系统;”和(5)Szoka等,PCT/US93/03406,标题“自 我组装的多核苷酸递送系统”,申请日1993年4月5日。
[0139]基因递送还可以通过移植遗传改造的细胞来完成。例如, 可使用称为成肌细胞的未成熟肌细胞将基因递送到肌肉纤维中。被遗 传改造以表达重组人生长激素的成肌细胞可以向动物血液中分泌生长 激素。被插入基因的分泌可维持3个月以上。
[0142]尽管不希望被理论束缚,但相信为提供在人体内应用这些 异源核酸序列的可接受的安全系数,调节基因表达体系应该具有低水 平的GHRH基本表达,并且仍保持高度的可诱导性。这样,可通过合并 分子开关的技术来调节靶基因的表达,该技术如图9的示意图所示并 在实施例1进一步讨论。相较于半衰期只有6-12分钟的天然GHRH, HV-GHRH或其功能性生物等同物分子显示出高度血浆稳定性,其半衰 期为6小时。这样,通过将强有力的电穿孔DNA递送法和稳定的可调 节GHRH或其功能性生物等同物的编码核酸序列相结合,可进行治疗来 逆转慢性消瘦,使个体体重增加,并延长个体的预期寿命。I.载体
[0145]在一些实施方案中,来自质粒载体的线性DNA期望用于转 染真核细胞,特别是哺乳动物细胞。含有复制子和来源于宿主细胞相 似物种的调控序列的质粒载体通常与这些宿主联合使用。该载体通常 带有复制位点,和能够在被转染细胞中产生表型选择的标记序列。在 一个非限制性实施例中,通常用pBR322衍生物转化大肠杆菌,该 pBR322是来源于大肠杆菌物种的质粒。pBR322含有氨卞青霉素和四环 素抗性基因,这样就提供了鉴定转化细胞的简易方法。该pBR质粒, 或其他微生物的质粒或噬菌体必须含有,或经过修饰后含有,例如能 够被微生物应用的启动子,来表达其自身的蛋白。本领域技术人员公 知本领域的任何质粒都可以被修饰而应用于本发明方法。例如,在一 个具体实施方案中,用于治疗应用的GHRH载体来自pBlueScript KS+, 并且具有卡那霉素抗性基因。
[0146]另外,含有复制子和来源于宿主微生物相似物种的调控序 列的噬菌体载体可作为转化载体与这些宿主结合使用。例如,λ噬菌 体GEMTM-11可用于制备重组噬菌体载体,该载体可用于转化宿主细胞, 例如E.coli LE392。
[0147]更多的有用质粒载体包括pIN载体(Inouye等,1985); 和pGEX载体,产生谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)可溶性融合蛋白用 于随后分裂片段的纯化和分离。其它适当的融合蛋白是带有β-半乳糖 苷酶、泛素等的那些。
[0149]启动子是控制基因产物转录起始和转录速度的一段核酸序 列。其含有遗传元件,调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其它转录 因子)能够与该遗传元件结合,而起始核酸序列的特异性转录。短语 “操作性定位”,“操作性连接”,“受控”,和“受转录调控”指 启动子相对于一段核酸序列而言,位于正确的功能性位点和/或定位, 能够调控该序列的转录起始和/或表达。
[0151]启动子元件之间的距离常常是可变的,这样,当元件被相 对翻转或移动时,仍可保留启动子的功能。在tk启动子中,启动子元 件之间的距离可增加到50bp而启动子的活性未降低。似乎单独的元件 可以联合地,也可以独立地活化转录,这要视不同的启动子而定。启 动子可以与“增强子”联合使用,也可以不与其联合使用,增强子是 指与核酸序列的转录活化相关的顺式作用调控序列。
[0153]显而易见地,使用能有效地指导DNA序列在被选择用于表 达的细胞器,细胞类型,组织,器官或有机体中表达的启动子和/或增 强子非常重要。分子生物领域技术人员公知启动子,增强子和细胞类 型结合用于蛋白表达(例如,参见Sambrook等,1989,并入作为参考)。 所用的启动子可以是组成型的,组织特异性的,诱导型的,和/或用于 适当条件下指导导入的DNA序列高水平表达的,这对大规模生产重组 蛋白和/或多肽非常有利。该启动子可以是异源或同源。
[0156]组织特异性启动子或元件的鉴定,以及检定其活性的试验 是本领域技术人员公知的。这些序列非限制性地包括人LIMK2基因 (Nomoto等,1999),生长激素抑制素受体2基因(Kraus等,1998), 鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等,1999),人CD4(zhao-Emonet 等,1998),鼠α2(XI)胶原(Liu等,2000;Tsumaki等,1998), D1A多巴胺受体基因(Lee等,1997),胰岛素样生长因子II(Dai等, 2001;Wu等,1997),和人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等, 1996)。
[0158]为有效翻译编码序列还需要一个特定的起始信号。这些信 号包括ATG起始密码子或邻近的序列。可能需要提供外源翻译调控信 号,包括ATG起始密码子。本领域技术人员能够显而易见地确定并提 供必要的信号。公知起始密码子必须是与目的编码序列的阅读框“符 合读框”来确保整个插入序列的翻译。外源翻译调控信号和起始密码 子可以是天然或合成的。表达的效率可通过容纳合适的转录增强子元 件而提高。
[0159]在本发明的一些实施方案中,内部核糖体进入位点 (“IRES”)元件被用于产生多基因,或多顺反子信使。IRES能够绕 过5’甲基化帽子依赖的翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻 译(Pelletier和Sonenberg,1988)。来自细小核糖核酸病毒科(脊 髓灰质炎和脑心肌炎)二个成员的IRES元件已被描述(Pelletier和 Sonenberg,1988),还有来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow, 1991)。IRES元件可与异源开放阅读框相连。多元开放阅读框可被一 起转录,由一个IRES彼此分隔,产生多顺反子信息。通过IRES元件, 每个开放阅读框可以接近核糖体进行有效翻译。可使用单独的启动子/ 增强子转录单一的信息有效表达多基因(参见美国专利5,925,565和 5,935,819,在此将其并入本文作为参考)。V.多克隆位点[MCS]
[0160]载体可包括MCS,MCS是含有多个限制性酶切位点的核酸序 列,其中的限制性酶可与常规重组技术结合用于消化载体(例如,参 见(Carbonelli等,1999;Cocea,1997;Levenson等,1998),并 入本文作为参考)。“限制性酶切”指用仅在核酸分子特定位置起作 用的酶对核酸分子催化切割。许多限制性酶都可商业获得。本领域技 术人员公知这种酶的应用。通常,使用在MCS内部切割的限制性酶使 载体呈线状或片段以使外源序列能够连接到载体上。“连接”指在两 个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程,其中这两个核酸片段可以是 互相连续的也可以不连续。VI.剪接位点
[0161]多数被转录的真核RNA分子都会经历RNA剪接而从第一转 录产物中去除内含子。含有真核基因组序列的载体可能需要供体和/ 或受体剪接位点来确保蛋白表达所需要的正确的转录加工(参见,例 如(Chandler等,1997),将其并入本文作为参考。)。VII.终止信号
[0162]本发明的载体或构建体通常包括至少一个终止信号。一个 “终止信号”或“终止子”包含一个DNA序列,该DNA序列与RNA聚 合酶催化的RNA转录的特定终止子相关。这样,在一些实施方案中, 考虑终止RNA转录产物生成的终止信号。为获取目的信息水平,终止 子可能有必要存在于体内。
[0163]在真核体系中,终止子序列还可包含能够使新转录产物在 特定位点分裂的特定DNA序列,以使得多聚腺苷位点暴露出来。这给 一种专门的内源聚合酶传递一种信号,使该酶给转录产物的3’末端 加上一个约200个A残基(“多聚A”)的延长序列。用该多聚A尾 巴修饰的RNA分子似乎更稳定,且能更有效地翻译。这样,在另一些 涉及真核生物的实施例中,优选终止子含有使RNA分裂的信号,更优 选终止子信号能促进信使的多聚腺苷化。终止子和/或多聚腺苷化位点 元件能够提高信使水平并能最小化从该盒到其它序列的通读。
[0164]期望用于本发明的终止子包括这里描述的任何已知终止子 或本领域技术人员公知的终止子,包括但不限于,例如,基因的终止 序列如牛生长激素终止子,或病毒终止子序列如SV40终止子。在一些 实施方案中,例如由于序列截短,该终止信号可能缺少可转录或可翻 译的序列。VIII.多聚腺苷化信号
[0165]在表达体系特别是真核表达体系中,典型地可以包括一个 多聚腺苷化信号来实现适当的转录产物多聚腺苷化。并不认为多聚腺 苷化信号的种类对于本发明的成功实施至关重要,可以使用任何这类 序列。优选的实施例包括SV40多聚腺苷化信号,骨骼α肌动蛋白3’ UTR或人或牛生长激素多聚腺苷化信号,比较方便且已知能够在各种 靶细胞中很好的发挥作用。多聚腺苷化可以提高转录产物的稳定性或 促进细胞质内的运输。IX.复制起始位点
[0166]为使载体在宿主细胞内增殖,可以包含一个或多个复 制起始位点(通常称为“ori”),其为起始复制的特定核酸序列。或 者,如果宿主细胞是酵母,也可以使用自主复制序列(“ARS”)。X.可选择的或可筛选的标记
[0168]通常,包含药物选择标记可以帮助克隆和鉴定转化的细胞, 例如,能够赋予新霉素,嘌呤霉素,潮霉素,DHFR,GPT,zeocin和 组氨醇抗性的基因都可以用作选择标记。除能在可执行条件下提供转 化细胞可区分表型的标记外,还预期其它的标记类型,包括可筛选标 记如GFP,其依据是比色分析。或者,可以使用可筛选的酶,例如单 纯疱疹病毒胸苷激酶(“tk”)或氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)。本 领域技术人员公知如何使用免疫标记,也可以与FACS分析结合。所用 的标记并不关键,只要其能够与编码核酸产物的核酸同时表达。其它 的可选择标记和可筛选标记是本领域技术人员公知的。XI.电穿孔
[0169]在本发明的一些实施例中,核酸是通过电穿孔被导入细胞器, 细胞,组织或有机体内。电穿孔涉及使细胞悬浮液和DNA接受高电压的 放电。在该方法的一些改变中,可应用某些细胞壁降解酶,例如果胶降 解酶,使靶受体细胞比未处理的细胞更加容易受到电穿孔转化的作用(美 国专利5,384,253,并入本文作为参考)。或者,可通过机械损伤和本领 域公知的其它方法而使受体细胞更易受到电穿孔转化的作用。
[0171]下面的电穿孔现象被认为在所有情况下都相同,但是引起 所见效果的精确机制还未阐明。尽管不希望被理论束缚,电穿孔作用 的明显表现为:细胞接受电脉冲后,细胞膜瞬间地变为大分子通透性 的。存在通过细胞壁的通道,该通道在正常情况下,通过施加双向离 子移动,维持约90mV的跨膜电位。
[0172]尽管不希望被理论束缚,电穿孔利用相同的结构,通过迫 使高离子流通过这些结构而开启或扩大通道。现有技术中,金属电极 被设置成与组织接触,并对其施加预定的电压,所述电压与电极之间 的距离成比例。用于电穿孔的方案依据最后得到的电场强度而定,根 据公式E=V/d,其中(“E”)是电场,(“V”)是施加的电压,(“d”) 是电极之间的距离。
[0173]现有技术中,设置用于递送药物或大分子到个体细胞的电 穿孔工具时,电场强度是一个很重要的值。相应地,通过施加预定电 压的脉冲,可以计算多种方案的任何电场强度,所述电压是与电极之 间距离成比例。但应注意:可以使用绝缘电极(即,离子流并非必须 要产生电场)在组织中产生电场。尽管不希望被理论束缚,但电流是 成功电穿孔的必要条件,而不是电场本身。
[0175]控制电极之间的电流可以测定细胞的相对供热。这样,任 何指定方案随后效率的决定因素是电流,而不是跨越电极的电压。预 定的电压不产生预定的电流,并且现有技术并没有提供一种方法来精 确地测定电流,这就限制了该技术的应用。这样,将两个电极间在组 织中维持的电流控制在一定限度内就可以改变脉冲条件,减少细胞供 热,降低细胞死亡率,并相较于预定的电压脉冲,能更有效地将大分 子合并到细胞内。
[0176]本发明的一个实施方案通过精确地控制冲击细胞膜上通道 的离子流,提供了一种有效地控制递送到内部电极空间细胞的电流量 的方法,从而克服了上述问题。施加给组织的精确电流量可以作为电 流水平、脉冲强度和被传递的脉冲数目的积而计算。这样,本发明的 具体实施方案可通过多元途径,将导致电穿孔的电流传递给一定体积 的组织,而不会在任何位点导致过量浓度的累积电流,从而避免了由 于过度加热组织而引起的细胞死亡。
[0177]尽管不希望被理论束缚,待生成的电压脉冲的特性由组织 的特性、所选组织的大小以及电极之间的距离决定。期望电压脉冲是 尽可能均质且具有适当振幅。过量的电场强度会导致细胞裂解,而过 低的电场强度会导致电穿孔效率降低。一些电穿孔设备利用电极之间 的距离来计算电穿孔地电场强度和预定的电压脉冲。这种对已知电极 之间距离的依赖是设计电极的限制因素。因为可设计的电流脉冲控制 器决定着两个电极之间一定体积组织的阻抗,所以电极之间的距离对 于确定合适的电流脉冲而言,不是至关重要的因素。另外,本领域技 术人员在不背离本发明精神和范围情况下,可设想任何数目的适当的 对称和非对称的针式电极矩阵。在矩阵中以及目的组织中,每个独立 电极的深度可随可比较的结果而变化。另外,大分子的多注射位点可 被加入到针式电极矩阵中。XII.限制性酶
[0178]在本发明的一些实施例中,线性DNA片段通过用限制性酶 消化亲代DNA分子而得到。以下提供了限制性酶的实例。 名称 识别位点
AatII GACGTC
Acc65 I GGTACC
Acc I GTMKAC
Aci I CCGC
Acl I AACGTT
Afe I AGCGCT
Afl II CTTAAG
Afl III ACRYGT
Age I ACCGGT
Ahd I GACNNNNNGTC
Alu I AGCT
Alw I GGATC
AlwN I CAGNNNCTG
Apa I GGGCCC
ApaL I GTGCAC
Apo I RAATTY
Asc I GGCGCGCC
Ase I ATTAAT
Ava I
Ava II
Avr II
Bae I
BamH I
Ban I
Ban II
Bbs I
Bbv I
BbvC I
Bcg I
BciV I
Bcl I
Bfa I
Bgl I
Bgl II
Blp I
Bmr I
Bpm I
BsaA I
BsaB I
BsaH I
Bsa I
BsaJ I
BsaW I
BseR I
Bsg I
BsiE I
BsiHKA I
BsiW I
Bsl I
BsmA I
BsmB I
BsmF I
Bsm I
BsoB I
Bsp1286 I
BspD I
BspE I
BspH I
BspM I
EsrB I
BsrD I
BsrF I
BsrG I
Bsr I
BssH II
BssK I
Bst4C I
BssS I
BstAP I
BstB I
BstE II
BstF5 I
BstN I
BstU I
BstX I
BstY I
BstZ17 I
Bsu36 I
Btg I
Btr I
Cac8 I
Cla I
Dde I
Dpn I
Dpn II
Dra I
Dra III
Drd I
Eae I
Eag I
Ear I
Eci I
EcoN I
EcoO109 I
EcoR I
EcoR V
Fau I
Fnu4H I
Fok I
Fse I
Fsp I
Hae II
Hae III
Hga I
Hha I
Hinc II
Hind III
Hinf I
HinP1 I
Hpa I
Hpa II
Hph I
Kas I
Kpn I
Mbo I
Mbo II
Mfe I
Mlu I
Mly I
Mnl I
Msc I
Mse I
Msl I
MspA1 I
Msp I
Mwo I
Nae I
Nar I
Nci I
Nco I
Nde I
NgoMI V
Nhe I
Nla III
Nla IV
Not I
Nru I
Nsi I
Nsp I
Pac I
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Pci I
PflF I
PflM I
Ple I
Pme I
Pml I
PpuM I
PshA I
Psi I
PspG I
PspOM I
Pst I
Pvu I
Pvu II
Rsa I
Rsr II
Sac I
Sac II
Sal I
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Sau3A I
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SexA I
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Sfc I
Sfi I
Sfo I
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Sma I
Sml I
SnaB I
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Sph I
Ssp I
Stu I
Sty I
Swa I
Taq I
Tfi I
Tli I
Tse I
Tsp45 I
Tsp509 I
TspR I
Tth111 I
Xba I
Xcm I
Xho I
Xma I
Xmn I
[0180]以下实施例是为说明本发明优选实施例。本领域技术人员 应能理解以下这些实施例中公开的技术表示本发明者发明的技术在本 发明的实践中作用良好,所以可以认为构成了实践中的优选模式。但 是在本发明前提下,本领域技术人员应该理解:在不背离本发明的精 神和范围情况下,在公开的具体实施例中可以有许多改变,仍可获得 同样或类似的结果。实施例1
DNA载体的构建和动物个体中的方法
[0181]为治疗贫血;提高总红细胞量;逆转消瘦;逆转异常体重 降低;治疗免疫功能障碍;逆转淋巴细胞生成的抑制作用;或者延长 慢性病个体的预期寿命,首先应设计几种GHRH表达构建体。大体上, 这些质粒载体包含与猪野生型GHRH或类似物相连的肌特异性合成启 动子SPc5-12(Li等,1999)。GHRH类似物序列是按方法部分中所述, 通过定点突变获得的。将编码GHRH或类似物的核酸序列克隆到 pSPc5-12质粒的BamHI/HindIII位点,来产生pSP-GHRH。质粒中包含 的其它元件包括如方法部分中所述的生长激素3’非翻译区域和来自 pSEAP-2 Basic Vector的SV40 3’UTR。图1显示了构建体所应用的 独特核酸分子。
[0182]DNA构建体:含有肌特异性合成启动子SPc5-12(SeqID#7) 的质粒载体已在前面描述(Li等,1999)。野生型和通过对GHRH cDNA (SeqID#9)进行定点突变(改变的位点II体外突变体系(Altered Site II in vitro Mutangenesis System),Promega,Madison,WI)而产 生的突变猪GHRH cDNA,被克隆到pSPc5-12的BamHI/HindIII位点, 分别产生pSP-wt GHRH(SeqID#15),或pSP-HV-GHRH(SeqID#11)。生长 激素的3’非翻译区域(“3’UTR”)被克隆到GHRH cDNA的下游。 所获的质粒含有突变的GHRH编码序列,所获的氨基酸序列并非天然地 存在于哺乳动物中。尽管不希望被理论束缚,对于治疗贫血;提高个 体总红细胞量;逆转消瘦;逆转异常体重降低;抑制肿瘤生长;预防 肾衰竭;治疗免疫功能障碍;逆转淋巴细胞生成的抑制作用;或者延 长慢性病个体的预期寿命的效果通过突变激素的循环水平最终测定。 编码不同突变GHRH或其功能性生物等同物的氨基酸序列的不同质粒 如下所示:质粒 编码的氨基酸序列
wt-GHRH YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMBRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#10)
HV-GHRH HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#1)
TI-GHRH YIDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#2)
TV-GHRH YVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#3)
15/27/28-GHRH YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(SEQID#4)
[0183]通常,编码的GHRH或其功能性生物等同物如下式所示:-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH (SeqID#6)
其中:X1是选自酪氨酸(“Y”),或组氨酸(“H”)的D-或L- 异构体氨基酸;X2是D-或L-异构体氨基酸,该氨基酸选自:丙氨酸 (“A”),缬氨酸(“V”),或异亮氨酸(“I”); X3是D-或L- 异构体氨基酸,该氨基酸选自:丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”); X4是D-或L-异构体氨基酸,该氨基酸选自:蛋氨酸(“M”)或亮氨 酸(“L”);X5是D-或L-异构体氨基酸,该氨基酸选自丝氨酸(“S”) 或天冬酰胺(“N”)。
[0184]使用的另一质粒包括pSP-SEAP构建体(SeqID#16),其含 有SacI/HindIII SPc5-12片段,SEAP基因和来自pSEAP-2 Basic Vector的SV40 3’UTR(Clontech Laboratories,Inc.;Palo Alto, CA)。
[0185]上面描述的质粒 并不含有多位点接头,IGF-I基因,骨骼α 肌动蛋白启动子或骨骼α肌动蛋白3’UTR/NCR。而且,这些质粒如下 面所述通过肌肉注射被导入,然后在体内电穿孔。
[0186]至于“功能性生物等同物”,本领域技术人员公知,“功 能性生物等同物”蛋白和/或多核苷酸的定义中固有的概念是:在维 持分子具有可接受水平的同等生物活性情况下,在分子的规定部分可 进行的改变是有(或密码子)限的。这样功能性生物等同物在此就定 义为在所选氨基酸位可被替换的那些蛋白(和多肽)。含有GHRH功能 性生物等同物的多肽就是被遗传改造而含有不同的氨基酸序列,但相 较于GHRH,同时具有类似或改善的生物活性的多肽。例如,GHRH的一 个生物活性是促进个体体内分泌生长激素(“GH”)。
[0187]大动物研究:健康狗:将4只狗的组作为对照(2雄2雌), 用pSP-HV-GHRH体系注射3组8只狗的组(4雄4雌)。在卡尺电穿 孔之后,仅用载体(对照),或用200mcg,或600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射狗。
[0190]肌肉注射质粒DNA到患病犬中:四组健康受试犬(“狗”), 体重为8-12kg,用于研究生物分解毒理学。3组8只狗的组(4雄4 雌)分别用200mcg,600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射。将4只狗 的组作为对照(2雄2雌)。持续地监测动物以观察副作用。另外, 使用两组患癌症(自发性恶性肿瘤)的狗。根据NIH指南,USDA和Animal Welfare Act方针养狗,并经Baylor College of Medicine IACUC批 准。
[0194]蛋白代谢,骨代谢和血液值:在质粒注射前和注射后第14, 28和56天收集血液和尿样,并进行生化,代谢和激素分析。每一时 间点都用相同的独立实验室(Antech Diagnostics,Irvine,CA)来 评估完全CBC和代谢图谱。
[0195]质粒IGF-I:通过不同的人辐射免疫度量试验 (radioimmunometric assay)(Diagnostics System Lab.,Webster, TX)测定IGF-I水平。试验的灵敏度为0.8ng/ml;试验内部和试验间 的变差分别为3.4%和4.5%。
[0197]直接肌肉内注射质粒DNA然后再电穿孔是局部且受控递送 质粒DNA到骨骼肌的方法。其优点是使用较低的质粒数量(低至 0.1mg),而不是被动运输形式典型使用的较高的质粒数量。尽管不希 望被理论束缚,但电穿孔引起质粒吸收率提高的机制很可能是在有或 没有蛋白主动运输情况下,通过新产生的膜孔发生。已经显示:肌细 胞渗透性程度依赖于电场强度,脉冲长度,电极的形状和类型(Bureau 等,2000;Gilbert等,1997),以及细胞大小(Somiari等,2000)。 经典的电极结构——板式或电线电极对被设置成相距4mm——已显示 对啮齿动物有效,但在大动物如猪或人中,皮肤阻抗增大,皮下脂肪 组织加厚,并且如果电场强度按比例增加则关系到组织损伤,使得这 些类型的电极不可用。猪或狗的肌纤维很大所以比啮齿动物肌肉更加 适用于电通透性研究。这里,我们表明:用肌内给药器单独注射各种 剂量的GHRH或核酸序列类似物,然后再电穿孔,足以在大动物中产生 治疗性质粒激素水平,对于治疗贫血,逆转消瘦,使个体体重增加, 并延长慢性病个体的预期寿命等具有显著生物效果。
[0198]通过体内电穿孔将pSP-HV-GHRH体系注射到左胫前肌(the left tibialis anterior muscle)中。将4只狗的组作为对照(2雄 2雌),用pSP-HV-GHRH体系注射3组8只狗的组(4雄4雌)。仅用 载体(对照),或用200mcg,600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射狗, 然后电穿孔。GHRH和GH的系统水平有所提高的指标是血清IGF-I浓 度提高。所以,在注射后28天,收集仅用载体(对照),或用200mcg, 600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射的狗的血清,测定IGF-I水平。 注射了600mcg pSP-HV-GHRHX的狗的IGF-I水平比对照(仅载体)治 疗动物高出3倍(图2)。IGF-I水平的提高呈统计学差异显著 (p<0.046)。尽管用200mcg和1000mcg质粒注射的动物比对照IGF-I 水平高,但其IGF-I水平低于用600mcg注射的动物。相应于更高GHRH 水平的有所增长的IGF-I水平与其它应用重组的猪GH(“pGH”)在 狗体内进行的研究相一致。例如,在pGH-治疗的狗中存在剂量相关的 IGF-I水平增长(约2-10倍),这与血清GH水平的提高相关。
[0199]尽管不希望被理论束缚,生长激素释放激素(GHHR)能刺 激垂体前叶产生并释放生长激素(GH),生长激素反过来可以刺激肝 脏或其它靶器官产生IGF-I。这样,提高的GHRH和GH系统水平的指 标是血清IGF-I浓度的提高。注射后28天,在用200mcg,600mcg或 1000mcg pSP-HV-GHRH注射的健康狗体内血清IGF-I水平都高于注射 前的值。注射了600mcg pSP-HV-GHRHX的狗的IGF-I水平具有最高的 统计学显著增长(如高于90%,p<0.046),这说明600mcg可能是健 康狗的最优浓度。实施例3
提高癌症动物个体的存活
[0201]为说明提高的GHRH或其生物等同物水平能够改变大型健康 动物体内的代谢,测定体重。如图4所示,与注射后56天的对照相比, 接受治疗的狗体重有所增长。尽管用200mcg和1000mcg质粒注射的动 物体重大于对照,但低于用600mcg注射的动物。这些结果有力地说明 用pSP-HV-GHRH注射的狗体内的代谢有所改变,这种改变是剂量依赖 性的。另外,与GHRH产量提高相关的额外体重增加也指示GH的水平 有所提高。这个观察与其它应用重组的猪GH(“pGH”)在狗体内进 行的研究相一致。在这些研究之一,对狗施用重组pGH 14周。与分别 为0.4kg和0.8kg的对照和低剂量组相比,猪GH导致中高剂量组(分 别为2.8kg和4.7kg)体重增加。实施例5
GHRH或生物等同物疗法能够改进健康狗体内的蛋白利用
[0202]图15显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体内 与蛋白代谢相关的各个数值的变化。在56天内监测指示蛋白代谢的多 个值,这些值包括:AST,ALT,T.胆红素(T.bilirubin),Alk Phos, GGT,总蛋白,清蛋白,球蛋白,A/G比率,胆固醇,BUN和肌氨酸酐。 用200mcg,600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射8只狗的组(4雄4 雌)。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)。用200mcg和600mcg质 粒注射的动物体内总蛋白水平有所提高。与对照相比,所有接受了注 射的组尿素都稍有降低,这是蛋白利用有所改善的信号。实施例6
GHRH或生物等同物疗法不能影响健康动物体内的葡萄糖代谢
[0203]图16显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体内 与血液组份相关的各个数值的变化。简写如下:WBC-白细胞;RBC-红 细胞;HGB-血红蛋白;PCV-血细胞比容,或包装细胞的体积;MCV-平 均细胞体积;MCH-平均细胞血红蛋白;MCHC-平均细胞血红蛋白浓度; n%-嗜中性白细胞的%;lym%-淋巴细胞的%;momo%-单核细胞的%;eos%- 嗜曙红细胞的%;Bas%-嗜碱细胞的%;LDH-乳酸脱氢酶;Prothom-凝血 酶原(prothrombine);Qnt-定量;Plat-血小板;BUN-血液尿素氮/ 尿素。
[0204]在56天内监测血液组份的多个值,包括:WBC,RBC,HGB, PCV,MCB,MCH,MCHC,n%,lym%,mono%,eos%,Bas%,LDH,Prothom, Qnt.Plat。用200mcg,600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射8只狗 的组(4雄4雌)。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)。在实验组和 对照组之间没有显著差异。但是,随着质粒剂量的增加循环淋巴细胞 有所减少,标志在淋巴器中的淋巴细胞的多价螯合作用。重要的是, 葡萄糖水平在所有的实验组以及对照中都处于正常范围,这说明我们 的治疗并不损害葡萄糖代谢。实施例7
GHRH或生物等同物疗法能够影响骨重构(bone remodeling)
[0205]图17显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的健康狗体内 与骨代谢相关的各个数值的变化。在注射后56天内监测磷、钙和钙/ 磷比率。用200mcg,600mcg或1000mcg pSP-HV-GHRH注射8只狗的组 (4雄4雌)。将4只狗的组作为对照(2雄2雌)。接受了质粒注射 的狗Ca/PO4比率随治疗剂量成比例地提高,即代表着骨重构。实施例8
GHRH或生物等同物疗法能够延长慢性病个体的预期寿命
[0207]图19显示用各种浓度pSP-HV-GHRH质粒注射的自发性癌症 狗体内与血液组份相关的各个数值的变化。注射后监测血液组份的多 个值,包括:WBC/HPF,RBC/HBF,HGB,%PCV,MCV,MCH,MCHC,n%,lym%, mono%,eos%,Bas%。对自发性癌症狗组注射100-1000mcg/Kg体重的 pSP-HV-GHRH。发现注射后2周,相较于未接受注射的狗而言,所有接 受了pSP-HV-GHRH质粒治疗的狗中RBC血红蛋白和血细胞比容水平都 有所提高。另外,接受治疗的狗中,循环白细胞水平(通常与淋巴器 官中白细胞(WBC)的增长相关)显著降低,而淋巴细胞百分比却有所 提高。接受治疗的动物在注射后早期时间点循环淋巴细胞显著增加 (15.11±2.81vs.12.5±2.41%,p<0.046pst/pri)。在相应时间点也 测定对照动物淋巴细胞值(p=0.32)。实施例10
GHRH或生物等同物疗法对老年健康狗显示出良好效果
[0208]图20显示用1000mcg pSP-HV-GHRH质粒注射的老年健康 狗体内与血液组份相关的各个数值变化。在2周内监测血液组份的多 个值,包括:WBC,RBC,HGB,lym%,总蛋白,白蛋白,球蛋白,胆固 醇,BUN,肌酸酐,磷,钙,葡萄糖。对老年狗进行pSP-HV-GHRH质粒 疗法,在注射后2周RBC血红蛋白和血细胞比容水平都高于注射前的 值。另外,接受治疗的狗的尿素水平显著降低,总蛋白水平提高,葡 萄糖水平正常。Ca/P比率的提高指示骨重构。实施例11
贫血症的治疗
[0210]在接受注射的狗中,早在质粒注射后2星期,就获得了贫 血的快速校正。9-27天红细胞(RBC)增长了8.9%,与注射前(“pri”) 的值相比正常的值一直维持到注射后(“pti”)56天(6.27±0.33, 对5.75±0.39,p<0.027),而对照组在相同时期内RBC水平降低了 6%(6.00±0.2对5.5±0.2)(p<0.006,与注射后对照相比)(图5)。 红细胞水平(图6)提高了6.8%(14.68±0.78对13.74±0.97g/l pti/pri),而对照组在相同时期内降低了5.7%(12.9±0.4对13.7 ±0.4g/l),与注射后对照相比p<0.01。红细胞比容水平(图7)显著 提高了8.26%(42.22±2.16对39±2.62,p<0.032pst/pri)。在相 同时期,对照值降低了7.6%(36.9±1.4对39.9±1.6,与pst相比 p<0.012)。
[0211]在对癌症狗的临床前研究中,早在质粒注射后2星期,就 获得了贫血的快速校正。在研究初期,个体处于分解代谢状态,其血 红蛋白(Hb),红细胞比容(“PVC”)和红细胞(“RBC”)值都显 著低于正常的狗。质粒注射后,狗进入了快速逆转阶段,转变为生化 合成代谢,模仿快速生长过程,如同前面所述的对幼龄大鼠在生长阶 段进行的研究(“生长激素轴和免疫功能”)。Hb,PVC和RBC值增 长了10-25%,数值差异统计上显著,并在治疗开始后两周转为正常。 整个实验所有的值都在正常界限内。尽管不希望被理论束缚,我们的 理论是GHRH-GH-IGF-I轴在分解代谢状态下的刺激作用很可能是通过 刺激促红细胞生成素而促进了红细胞的生成。当个体逆转到正常的合 成代谢状态,天然GH的作用是诱导轻微程度的贫血。但是,这些个体 患有癌症,而该疾病的天然过程是朝向分解代谢的。通过这些对立的 机制来维持个体的平衡,这样,Hb,PVC和RBC值就可校正到正常水 平,但是不可能超越正常水平的上限,如同我们研究所展现的。
[0212]靶基因的表达还可通过结合分子开关技术进行调节,该技 术如图9所示。用于配体-依赖性转基因表达诱导的商业可获得体系具 有已注册的GeneSwitch商标名称。GeneSwitch技术是基于合成的 但不能结合其天然激动剂(如黄体酮)的C末端截短的黄体酮受体。 该截短的黄体酮受体只能被抗黄体酮物质活化,例如米非司酮(“MFP”) (Vegeto等,1992;Xu等,1996)。类似的体系用于GeneSwitch体 系的嵌合调节蛋白,其由截短的人黄体酮受体的配体结合结构域和来 自人NF-kB p65亚基的转录活化域(Abruzzese等,1999)构成,其 中黄体酮受体的配体结合结构域已经融合了酵母GAL4蛋白的DNA结合 结构域(其结合特定的17bp识别序列)。GeneSwitch调节蛋白的基 因被插入到生肌表达载体,命名为pGS1633,其在肌特异性骨骼α-肌 动蛋白(“SK”)启动子的控制下组成型表达。GHRH质粒,命名为 p6xGal4/TATA-GHRH,或pGHRH1633,含有诱导型启动子,该启动子由 融合了最小TATA盒启动子的17-mer Gal4结合位点的6个拷贝构成。 GHRH编码序列是超级猪突变GHRH cDNA的228-bp片段,称为HV-GHRH (Draghia-Akli等,1999)。相较于半衰期只有6-12分钟的天然GHRH, 该HV-GHRH分子显示出高度血浆稳定性,其半衰期为6小时。该肌特 异性GeneSwitch和诱导型GHRH质粒都具有含合成的内含子的5’非 翻译区域以及来自人GH基因的3’非翻译区域/聚(A)位点。实施例12
对正常动物个体施用外源GH的药理学和毒理学作用
[0214]用肿瘤细胞系注射免疫活性的C57/B16小鼠或无免疫应答 的裸鼠(C57/B16移植Lewis肺大鼠腺癌细胞系,而裸鼠移植人肺小 细胞腺癌细胞系)。肿瘤移植后1天,用组成型活性GHRH构建体或诱 导型GHRH构建体治疗小鼠,或用β半乳糖苷酶表达构建体治疗(作为 阴性对照)。在GHRH治疗的动物中肿瘤的产生更缓慢(图10和图14), 发展也较慢。由此,GHRH治疗的动物比对照存活更长(图11),产生 肾衰竭的可能更小(图12)。产生转移的可能也较小(图13)。
[0215]这里描述的本发明涉及几种不同的GHRH或其生物等同物核 酸序列的应用。基于目前对蛋白-蛋白相互作用的理解,精确地推测含 有一个点突变的GHRH序列在体内的参数(如半衰期,疗效,翻译后修 饰等)即非显而易见也不可能,其中所述点突变是指多肽链中单一氨 基酸有所改变。但是,在现有技术和本说明书的教导基础上,本领域 技术人员可以知道在特定组织中如何进行质粒介导补充实验,鉴定变 异和任何独特核酸序列的排列以准确评价对正常或慢性疾病个体的体 内效果。所以,应用编码GHRH或其功能性生物等同物或相应重组蛋白 的不同核酸序列作为质粒介导的方法来治疗贫血;提高总红细胞量; 逆转消瘦;逆转异常体重降低;治疗免疫功能障碍;逆转淋巴细胞生 成的抑制作用;和/或延长慢性病个体的平均寿命,是不能基于推测而 预知的。
[0217]对贫血症,消瘦或免疫功能障碍的治疗;总红细胞量的提 高;异常体重降低的逆转;淋巴细胞生成抑制作用的逆转;和/或慢性 病个体预期寿命的延长都是个体体内循环中存在的GHRH分子带来的 效果,不论递送方式如何。例如,可以通过经典重组蛋白治疗或核酸 转移来递送合适量的GHRH或其类似物,而获得相同的效果。因此,成 功的质粒介导补充需要精确地将编码序列递送到个体细胞,使基因产 物表达达到适于产生生物效果的水平。治疗的过程可延长到贯穿疾病 症状的病程,并可持续下去。由于递送核酸序列到个体细胞的方法高 度依赖于特定疾病和编码基因,所以本领域技术人员未经本说明书的 教导,不能预测何种方法和条件适用。
[0218]本领域技术人员显而易见地意识到:本发明可进行改变, 仍然能够实现发明目的,获得这里提及的结果和优点。这里所述的方 法,过程,技术和
试剂盒是优选实施方式的体现,仅为示范性的,而 不是限制本发明的范围。本领域技术人员可在不背离本发明的精神或 不超出本发明限定的范围情况下,对其进行一些改变和其它应用。 参考文献
下述参考文献提供了实验细节或其它补充细节,特此引用。
美国专利文献:
U.S.Patent No.5,847,066 issued on December 8,1998 with Coy et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,846,936 issued on December 8,1998 with Felix et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,792,747 issued on August 11,1998 with Schally et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,776,901 issued on July 7,1998 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,756,264 issued on May 26,1998 with Schwartz et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,696,089 issued on December 9,1997 with Felix et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,486,505 issued on January 23,1996 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,292,721 issued on March 8,1994 with Boyd et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,137,872 issued on August 11,1992 with Seely et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,134.120 issued on July 28,1992 with Boyd et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,084,442 issued on January 28,1992 with Felix et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,061,690 issued on October 29,1991 with Kann et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,036,045 issued on July 30,1991 with Thorner listed as the inventor.
U.S.Patent No.5,023,322 issued on June 11,1991 with Kovacs et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,839,344 issued on June 13,1989 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,410,512 issued on October 18,1983 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.RE33,699 issued on September 24,1991 with Drengler listed as the inventor.
U.S.Patent No.4,833,166 issued on May 23,1989 with Grosvenor et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,228,158 issued on October 14,1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,228,156 issued on October 14,1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,226,857 issued on October 7,1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,224,316 issued on September 23,1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,223,021 issued on September 16,1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,223,020 issued on September 16,1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,223,019 issued on September 16,1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,956,288 issued on September 11,1990 with Barsoum listed as inventor.
U.S.Patent No.5,704,908 issued on January 6,1998 with Hofmann,et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,702,384 issued on December 30,1997 with Umeyama,et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,439,440 issued on August 8,1995 with Hofmann listed as inventor.
U.S.Patent No.5,874,534 issued on February 23,1999 with Vegeto,et al as inventors.
U.S.Patent No.5,935,934 issued on August 10,1999 with Vegeto,et al as inventors.
U.S.Patent No.5,789,215 issued on August 4,1998 with Berns,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,384,253 issued on January 24,1995 with Krzyzek,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,994,624 issued on November 30,1999 with Trolinder,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,981,274 issued on November 9,1999 with Tyrrell,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,945,100 issued on August 31,1999 with Fick as inventor.
U.S.Patent No.5,780,448 issued on July 14,1998 with Davis as inventor.
U.S.Patent No.5,736,524 issued on April7,1998 with Content,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,702,932 issued on December 30,1997 with Hoy,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,656,610 issued on August 12,1997 with Shuler,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,589,466 issued on December 31,1996 with Felgner,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,580,859 issued on December 3,1996 with Felgner,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,610,042 issued on March 11,1997 with Chang,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,322,783 issued on June 21,1994 with Tomes,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,563,055 issued on October 8,1996 with Townsend,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,550,318 issued on August 27,1996 with Adams,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,538,877 issued on July 23,1996 with Lundquist,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,538,880 issued on July 23,1996 with Lundquist,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,302,523 issued on April 12,1994 with Coffee,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,464,765 issued on November 7,1995 with Coffee,et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,591,616 issued on January 7,1997 with Hiei,et al.as inventors.
U.S.Patent No.4,684,611 issued on August 4,1987 with Schilperoort,et al.as inventors.
U.S.Patent No.4,952,500 issued on August 28,1990 with Finnerty,et al.as inventors.
PCT Patent No.WO 94/09699 published on May 11,1994 with Brown,et al.listed as inventors.
PCT Patent WO 95/06128 published on August 24,1995 with Dams,et al.listed as inventors.
REFERENCE LIST
Abruzzese,R.V.,Godin,D.,Burcin,M.,Mehta,V.,French,M.,Li,Y.,O′Malley,B.W.,and Nordstrom,J.L.(1999).Ligand-dependent regulation of plasmid-based transgene expression in vivo.Hum.Gene Ther.10,1499-1507.
Aihara,H.and Miyazaki,J.(1998).Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nat.Biotechnol.16,867-870.
Al Suwaidi,J.,Reddan,D.N.,Williams,K.,Pieper,K.S.,Harrington,R.A.,Califf,R.M., Granger,C.B.,Ohman,E.M.,and Holmes,D.R.,Jr.(2002).Prognostic implications of abnormalities in renal function in patients with acute coronary syndromes. Circulation 106,974-980.
Almendro,N.,Bellon,T.,Rius,C.,Lastres,P.,Langa,C.,Corbi,A.,and Bernabeu,C.(1996). Cloning of the human platelet endothelial cell adhesion molecule-1 promoter and its tissue-specific expression. Structural and functional characterization.J. Immunol.157,5411-5421.
Aratani,Y.,Okazaki,R.,and Koyama,H.(1992).End extension repair of introduced targeting vectors mediated by homologous recombination in mammalian cells. Nucleic Acids Res.20,4795-4801.
Argente,J.,Pozo,J.,and Chowen,J.A.(1996).The growth hormone axis:control and effects.Hormone Research 45 Suppl 1,9-11.
Barber,M.D.,Ross,J.A.,and Fearon,K.C.(1999).Cancer cachexia.Surg.Oncol.8,133- 141.
Bartlett,D.L.,Charland,S.,and Torosian,M.H.(1994).Growth hormone,insulin,and somatostatin therapy of cancer cachexia.Cancer 73,1499-1504.
Bercu,B.B.,Walker,R.F.,Diagnostic,t.,hormone,G.G.,Growth,h.,peptide,and Growth,h.s.(1997).GROWTH HORMONE SECRETAGOGUES IN CHILDREN WITH ALTERED GROWTH.Acta Paediatrica 86,102-106.
Bettan,M.,Emmanuel,F.,Darteil,R.,Caillaud,J.M.,Soubrier,F.,Delaere,P.,Branelec,D., Mahfoudi,A.,Duverger,N.,and Scherman,D.(2000).High-level protein secretion into blood circulation after electric pulse-medated gene transfer into skeletal muscle.Mol.Ther.2,204-210.
Blethen,S.L.(1995).Complications of growth hormone therapy in childrern.Curr.Opin. Pediatr.7,466-471.
Blethen,S.L.and MacGillivray,M.H.(1997).A risk-benefit assessment of growth hormone use in children. Drug Saf 17,303-316.
Blethen,S.L.and Rundle,A.C.(1996).Slipped capital femoral epiphysis in children treated with growth hormone.A summary of the National Cooperative Growth Study experience.Horm.Res.46,113-116.
Bohlen,P.,Esch,F.,Brazeau,P.,Ling,N.,and Guillemin,R.(1983).Isolation and characterization of the porcine hypothalamic growth hormone releasing factor. Biochem.Biophys.Res.Commun. 116,726-734.
Boshart,M.,Weber,F.,Jahn,G.,Dorsch-Hasler,K.,Fleckenstein,B.,and Schaffner,W. (1985).A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.Cell 41,521-530.
Bureau,M.F.,Gehl,J.,Deleuze,V.,Mir,L.M.,and Scherma.n,D.(2000).Importance of association between permeabilization and electrophoretic forces for intramuscular DNA electrotransfer.Biochim. Biophys.Acta 1474,353-359.
Carbonelli,D.L.,Corley,E.,Seigelchifer,M.,and Zorzopulos,J.(1999).A plasmid vector for isolation of strong promoters in Escherichia coli.FEMS Microbiol.Lett.177, 75-82.
Chandler,S.D.,Mayeda,A.,Yeakley,J.M.,Krainer,A.R.,and Fu,X.D.(1997).RNA splicing specificity determined by the coordinated action of RNA recognition motifs in SR proteins.Poroc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94,3596-3601.
Chen,C.and Okayama,H.(1987).High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.Mol.Cell Biol.7,2745-2752.
Chevalier,R.L.,Goyal,S.,Kim,A.,Chang,A.Y.,Landau,D.,and LeRoith,D.(2000).Renal tubulointerstitial injury from ureteral obstruction in the neonatal rat is attenuated by IGF-1.Kidney Int.57,882-890.
Claustres,M.,Chatelain,P.,and Sultan,C.(1987).Insulin-like growth factor I stimulates human erythroid colony formation in vitro.J Clin.Endocrinol.Metab 65,78-82.
Cocea,L.(1997).Duplication of a region in the multiple cloning site of a plasmid vector to enhance cloning-mediated addition of restriction sites to a DNA fragment. Biotechniques 23,814-816.
Corpas,E.,Harman,S.M.,Pineyro,M.A.,Roberson,R.,and Blackman,M.R.(1993). Continuous subcutaneous infusions of growth hormone(GH)releasing hormone 1- 44 for 14 days increase GH and insulin-like growth factor-I levels in old men. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 76,134-138.
Correa,P.N.,Eskinazi,D.,and Axelrad,A.A.(1994).Circulating erythroid progenitors in polycythemia vera are hypersensitive to insulin-like growth factor-1 in vitro: studies in an improved serum-free medium. Blood 83,99-112.
Cremagnani,L.,Cantalamessa,L.,Orsatti,A.,Vigna,L.,Vallino,F.,and Buccianti,G. (1993).Recombinant human erythropoietin(rhEPO)treatment potentiates growth hormone(GH)response to growth hormone releasing hormone(GHRH) stimulation in hemodialysis patients.Clin.Nephrol.39,282-286.
Crook,E.D.,Washington,D.O.,and Flack,J.M.(2002).Screening and prevention of chronic kidney disease.J.Natl.Med.Assoc.94,55S-62S.
Dai,B.,Wu,H.,Holthuizen,E.,and Singh,P.(2001).Identification of a novel cis element required for cell density-dependent down-regulation of insulin-like growth factor-2 P3 promoter activity in Caco2 cells.J.Biol.Chen. 276,6937-6944.
Danko,I.and Wolff,J.A.(1994).Direct gene tranfer into muscle.[Review].Vaccine 12, 1499-1502.
Darquet,A.M.,Cameron,B.,Wils,P.,Scherman,D.,and Crouzet,J.(1997).A new DNA vehicle for nonviral gene delivery:supercoiled minicircle.Gene Ther.4.1341- 1349.
Darquet,A.M.,Rangara,R.,Kreiss,P.,Schwartz,B.,Naimi,S.,Delaere,P.,Crouzet,J.,and Scherman,D.(1999).Minicircle:an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.Gene Ther.6.209-218.
Davis,H.L.,Whalen,R.G.,and Demeneix,B.A.(1993).Direct gene transfer into skeletal Human Gene Therapy 4,151-159.
Davis,M.P.and Dickerson,D.(2000).Cachexia and anorexia:cancer′s covert killer. Support.Care Cancer 8,180-187.
Demetri,G.D.(2001).Anaemia and its functional consequences in cancer patients:current challenges in management and prospects for improving therapy.Br.J.Cancer 84 Suppl 1:31-7.,31-37.
Diez,J.,Iglesias,P.,Sastre,J.,Mendez,J.,Selgas,R.,and Gomez-Pan,A.(1996).Growth hormone responses to growth hormone-releasing hormone and clonidine before and after erythropoietin therapy in CAPD patients.Nephron 74,548-554.
Dolnik,V.,Novotny,M.,and Chmelik,J.(1993).Electromigration behavior of poly-(L- glutamate)conformers in concentrated polyacrylamide gels.Biopolymers 33, 1299-1306.
Dorsch-Hasler,K.,Keil,G.M.,Weber,F.,Jasin,M.,Schaffner,W.,and Koszinowski,U.H. (1985).A long and complex enhancer activates transcription of the gene coding for the highly abundant immediate early mRNA in murine cytomegalovirus.Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A82,8325-8329.
Draghia-Akli,R.,Fiorotto,M.L.,Hill,L.A.,Malone,P.B.,Deaver,D.R.,and Schwartz,R.J. (1999).Myogenic expression of an injectable protease-resistant growth hormone- releasing hormone augments long-term growth in pigs.Nat.Biotechnol.17,1179- 1183.
Draghia-Akli,R.,Khan,A.S.,Cummings,K.K.,Parghi,D.,Carpenter,R.H.,and Brown,P.A. (2002a).Electrical Enhancement of Formulated Plasmid Delivery in Animals. Technology in Cancer Research & Treatment 1,365 371.
Draghia-Akli,R.,Li,X.G.,and Schwartz,R.J.(1997).Enhanced growth by ectopic expression of growth hormone releasing hormone using an injectable myogenic vector.nature biotechnology 15,1285-1289.
Draghia-Akli,R.,Malone,P.B.,Hill,L.A.,Ellis,K.M.,Schwartz,R.J.,and Nordstrom,J.L. (2002b).Enhanced animal growth via ligand-regulated GHRH myogenic- injectable vectors.FASEB J.16,426-428.
Dubreuil,P.,Petitclerc,D.,Pelletier,G.,Gaudreau,P.,Farmer,C.,Mowles,TF,and Brazeau,P.(1990).Effect of dose and frequency of administration of a potent analog of human growth hormone-releasing factor on hormone secretion and growth in pigs.Journal of Animal Science 68,1254 1268.
Duck,S.C.,Schwarz,H.P.,Costin,G.,Rapaport,R.,Arslanian,S.,Hayek,A.,Connors,M., and Jaramillo,J.(1992).Subcutaneous growth hormone-releasing hormone therapy in growth hormone-deficient children:first year of therapy.Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 75,1115-1120.
Edwards,B.K.,Howe,H.L.,Ries,L.A.,Thun,M.J.,Rosenberg,H.M.,Yancik,R., Wingo,P.A.,Jemal,A.,and Feigal,E.G.(2002).Annual report to the nation on the status of cancer,1973-1999,featuring implications of age and aging on U.S.cancer burden.Cancer 94,2766-2792.
Esch,F.S.,Bohlen,P.,Ling,N.C.,Brazeau,P.E.,Wehrenberg,W.B.,Thorner,M.O., Cronin,M.J.,and Guillemin,R.(1982).Characterization of a 40 residue peptide from a human pancreatic tumor with growth hormone releasing activity. Biochemical & Biophysical Research Communications 109,152-158.
Evans,W.S.,Vance,M.L.,Kaiser,D.L.,Sellers,R.P.,Borges,J.L.,Downs,T.R., Frohman,L.A.,Rivier,J.,Vale,W.,and Thorner,M.O.(1985).Effects of intravenous,subcutaneous,and intranasal administration of growth hormone(GH)- releasing hormone-40 on serum GH concentrations in normal men. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 61,846-850.
Fechheimer,M.,Boylan,J.F.,Parker,S.,Sisken,J.E.,Patel,G.L.,and Zimmer,S.G.(1987). Transfection of mammalian cell.s with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A 84,8463-8467.
Fewell,J.G.,MacLaughlin,F.,Mehta,V.,Gondo,M.,Nicol,F.,Wilson,E.,and Smith,L.C. (2001).Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.Mol.Ther.3,574-583.
Frohman,L.A.,Downs,T.R.,Heimer,E.P.,and Felix,A.M.(1989).Dipeptidylpeptidase IV and trypsin-like enzymatic degradation of human growth hormone-releasing hormone in plasma.J.Clin.Invest.83,1533-1540.
Frohman,L.A.,Thominet,J.L.,Webb,C.B.,Vance,M.L.,Uderman,H.,Rivier,J.,Vale,W., and Thorner,M.O.(1984).Metabolic clearance and plasma disappearance rates of human pancreatic tumor growth hormone releasing factor in man.J.Clin.Invest. 73,1304-1311.
Fryer,A.D.and Jacoby,D.B.(1993).Effect of inflammatory cell mediators on M2 muscarinic receptors in the lungs.Life Sci.52,529-536.
Gehl,J.,Skovsgaard,T.,and Mir,L.M.(1998).Enhancement of cytotoxicity by electropermeabilization:an improved method for screening drugs.Anticancer Drugs 9,319-325.
Gehl,J.,Sorensen,T.H.,Nielsen,K.,Raskmark,P.,Nielsen,S.L.,Skovsgaard,T.,and Mir,L.M.(1999).In vivo electroporation of skeletal muscle:threshold,efficacy and relation to electric field distribution.Biochim Biophys.Acta 14298,233-240.
German,M.,Ashcroft,S.,Docherty,K.,Edlund,H.,Edlund,T.,Goodison,S.,Imura,H., Kennedy,G.,Madsen,O.,Melloul,D.,and.(1995).The insulin gene promoter.A simplified nomenclature.Diabetes 44,1002-1004.
Gilbert,R.A.,Jaroszeski,M.J.,and Heller,R.(1997).Novel electrode designs for electrochemotherapy.Biochim.Biophys.Acta 1334,9-14.
Gopal,T.V.(1985).Gene transfer method for transient gene expression,stable transformation,and cotransformation of suspension cell cultures.Mol. Cell Biol.5, 1188-1190.
Graham,F.L.and van der Eb,A.J.(1973).Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5.Virology 54,536-539.
Guillemin,R.,Brazeau,P.,Bohlen,P.,Esch,F.,Ling,N.,and Wehrenberg,W.B.(1982). Growth hormone-releasing factor from a human pancreatic tumor that caused acromegaly.Science 218,585-587.
Hafez,I.M.,Maurer,N.,and Cullis,P.R.(2001).On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.Gene Ther.8,1188-1196.
Hamm,A.,Krott,N.,Breibach,I.,Blindt,R.,and Bosserhoff,A.K.(2002).Efficient transfection method for primary cells.Tissue Eng 8,235-245.
Harland,R.and Weintraub,H.(1985).Translation of mRNA injected into Xenopus oocytes is specifically inhibited by antisense RNA.J.Cell Biol.101,1094-1099.
Heller,R.,Jaroszeski,M.J.,Glass,L.F.,Messina,J.L.,Rapaport,D.P.,DeConti,R.C., Fenske,N.A.,Gilbert,R.A.,Mir,L.M.,and Reintgen,D.S.(1996).Phase I/II trial for the treatment of cutaneous and subcutaneous tumors using electrochemotherapy. Cancer 77,964-971.
Herzog,R.W.,Mount,J.D.,Arruda,V.R.,High,K.A.,and Lothrop,C.D.,Jr.(2001).Muscle- directed gene transfer and transient immune suppression result in sustained partial correction of canine hemophilia B caused by a null mutation.Mol. Ther.4,192- 200.
Horlick,R.A.and Benfield,P.A.(1989).The upstream muscle-specific enhancer of the rat muscle creatine kinase gene is composed of multiple elements.Mol.Cell Biol.9, 2396-2413.
Hostetter,T.H.and Lising,M.(2002).National Kidney Disease Education Program.J.Natl. Med.Assoc.94,72S-75S.
Inouye,C.,Remondelli,P.,Karin,M.,and Elledge,S.(1994).Isolation of a cDNA encoding a metal responae element binding protein using a novel expression cloning procedure:the one hybrid system DNA Cell Biol.13,731-742.
Inouye,S.,Nakazawa,A.,and Nakazawa,T.(1985).Determination of the transcription initiation site and identification of the protein product of the regulatory gene xylR for xyl operons on the TOL plasmid.J.Bacteriol.163,863-869.
Jardieu,P.,Clark,R.,Mortensen,D.,and Dorshkind,K.(1994).In vivo administration of insulin-like growth factor-I stimulates primary B lymphopoiesis and enhances lymphocyte recovery after bone marrow transplantation.J Immunol.152,4320- 4327.
Jaynes,J.B.,Johnson,J.E.,Buskin,J.N.,Gartside,C.L.,and Hauschka,S.D.(1988).The muscle creatine kinase gene is regulated by multiple upstream elements,including a muscle-specific enhancer.Mol.Cell Biol.8,62-70.
Johnson,N.F.,Hoover,M.D.,Thomassen,D.G.,Cheng,Y.S.,Dalley,A.,and Brooks,A.L. (1992).In vitro activity of silicon carbide whiskers in comparison to other industrial fibers using four cell culture systems.Am.J.Ind.Med.21,807-823.
Kawamoto,T.,Makino,K.,Niwa,H.,Sugiyama,H.,Kimura,S.,Amemura,M.,Nakata,A., and Kakunaga,T.(1988).Identification of the human beta-actin enhancer and its binding factor.Mol.Cell Biol.8,267-272.
Kawamoto,T.,Makino,K.,Orita,S.,Nakata,A.,and Kakunaga,T.(1989).DNA bending and binding factors of the human beta-actin promoter.Nucleic Acids Res.17,523- 537.
Klamut,H.J.,Bosnoyan-Collins,L.O.,Worton,R.G.,Ray,P.N.,and Davis,H.L.(1996). Identification of a transcriptional enhancer within muscle intron 1 of the human dystrophin gene.Hum.Mol.Genet.5,1599-1606.
Klamut,H.J.,Gangopadhyay,S.B.,Worton,R.G.,and Ray,P.N.(1990).Molecular and functional analysis of the muscle-specific promoter region of the Duchenne muscular dystrophy gene.Mol.Cell Biol.10,193-205.
Koo,G.C.,Huang,C.,Camacho,R.,Trainor,C.,Blake,J.T.,Sirotina-Meisher,A., Schleim,K.D.,Wu,T.J.,Cheng,K.,Nargund,R.,and McKissick,G.(2001).Immune enhancing effect of a growth hormone secretagogue.J Immunol.166,4195-4201.
Kraus,J.,Woltje,M.,Schonwetter,N.,and Hollt,V.(1998).Alternative promoter usage and tissue specific expression of the mouse somatostatin receptor 2 gene.FEBS Lett. 428,165-170.
Kurtz,A.,Jelkmann,W.,and Bauer,C.(1982).A new candidate for the regulation of erythropoiesis.Insulin-like growth factor I.FEBS Lett.149,105-108.
Kurtz,A.,Matter,R.,Eckardt,K.U.,and Zapf,J.(1990).Erythropoiesis,serum erythropoietin,and serum IGF-I in rats during accelerated growth.Acta Endocrinol.(Copenh)122,323-328.
Lareyre,J.J.,Thomas,T.Z.,Zheng,W.L.,Kasper,S.,Ong,D.E.,Orgebin-Crist,M.C.,and Matusik,R.J.(1999).A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific,cell- specific,and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice.J.Biol.Chem.274,8282-8290.
Larsen,P.R.,Harney,J.W.,and Moore,D.D.(1986).Sequences required for cell-type specific thyroid hormone regulation of rat growth hormone promoter activity.J. Biol.Chem. 261,14373-14376.
LeBrun,C.J.,Diehl,L.F.,Abbott,K.C.,Welch,P.G.,and Yuan,C.M.(2000).Life expectancy benefits of cancer screening in the end-stage renal disease population. Am. J.Kidney Dis.35,237-243.
Lee,S.H.,Wang,W.,Yajima,S.,Jose,P.A.,and Mouradian,M.M.(1997).Tissue-specific promoter usage in the D1A dopamine receptor gene in brain and kidney.DNA Cell Biol.16,1267-1275.
Lesbordes,J.C.,Bordet,T.,Haase,G.,Castelnau-Ptakhine,L.,Rouhani,S.,Gilgenkrantz,H., and Kahn,A.(2002).In vivo electrotransfer of the cardiotrophin-1 gene into skeletal muscle slows down progression of motor neuron degeneration in pmn mice.Hum.Mol.Genet.11,1615-1625.
Levenson,V.V.,Transue,E.D.,and Roninson,I.B.(1998).Internal ribosomal entry site- containing retroviral vectors with green fluorescent protein and drug resistance markers.Hum. Gene Ther.9,1233-1236.
Li,C.,Ke,S.,Wu,Q.P.,Tansey,W.,Hunter,N.,Buchmiller,L.M.,Milas,L., Charnsangavej,C.,and Wallace,S.(2000).Tumor irradiation enhances the tumor- specific distribution of poly(L-glutamic acid)-conjugated paclitaxel and its antitumor efficacy.Clin.Cancer Res.6.2829-2834.
Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,and Draghia-Akli,R.(1999).Synthetic muscle promoters:activities exceeding naturally occurring regulatory sequences.nature biotechnology 17,241-245.
Lin,H.,Yutzey,K.E.,and Konieczny,S.F.(1991).Muscle-specific expression of the troponin I gene requires interactions between helix-loop-helix muscle regulatory factors and ubiquitous transcription factors.Mol.Cell Biol.11,267-280.
Liu,Y.,Li,H.,Tanaka,K.,Tsumaki,N.,and Yamada,Y.(2000).Identification of an enhancer sequence within the first intron required for cartilage-specific transcription of the alpha2(XI)collagen gene.J.Biol.Chem.275,12712-12718.
Lucas,M.L.,Heller,L.,Coppola,D.,and Heller,R.(2002).IL-12 plasmid delivery by in vivo electroporation for the successful treatment of established subcutaneous B16.F10 melanoma.Mol.Ther.5,668-675.
Lucas,M.L.,Jaroszeski,M.J.,Gilbert,R.,and Heller,R.(2001).In vivo electroporation using an exponentially enhanced pulse:a new waveform.DNA Cell Biol.20,183- 188.
Macejak,D.G.and Sarnow,P.(1991).Internal initiation of translation mediated by the 5′ leader of a cellular mRNA.Nature 353,90-94.
Madry,H.,Reszka,R.,Bohlender,J.,and Wagner,J.(2001).Efficacy of cationic liposome- mediated gene transfer to mesangial cells in vitro and in vivo.J.Mol.Med.79, 184-189.
Makis,A.C.,Chaliasos,N.,Hatzimichael,E.C.,and Bourantas,K.L.(2001).Recombinant human erythropoietin therapy in a transfusion-dependent beta-thalassemia major patient.Ann.Hematol.80,492-495.
Matsubara,H.,Gunji,Y.,Maeda,T.,Tasaki,K.Koide,Y.,Asano,T.,Ochiai,T., Sakiyama,S.,and Tagawa,M.(2001).Electroporation-mediated transfer of cytokine genes into human esophageal tumors produces anti-tumor effects in mice. Anticancer Res.21,2501-2503.
Matsuo,A.,Tooyama,I.,Isobe,S.,Oomura,Y.,Akiguchi,I.,Hanai,K.,Kimura,J.,and Kimura,H.(1994).Immunohistochemical localization in the rat brain of an epitope corresponding to the fibroblast growth factor receptor-1.Neuroscience 60,49-66.
McNally,M.A.,Lebkowski,J.S.,Okarma,T.B.,and Lerch,L.B.(1988).Optimizing electroporation parameters for a variety of human hematopoietic cell lines. Biotechniques 6,882-886.
Miklavcic,D.,Beravs,K.,Semrov,D.,Cemazar,M.,Demsar,F.,and Sersa,G.(1998).The importance of electric field distribution for effective in vivo electroporation of tissues.Biphys.J74,2152-2158.
Miklavcic,D.,Semrov,D.,Mekid,H.,and Mir,L.M.(2000).A validated model of in vivo electric field distribution in tissues for electrochemotherapy and for DNA electrotransfer for gene therapy.Biochim.Biophys.Acta 1523,73-83.
Mirza,A.M.,Ezzat,S.,and Axelrad,A.A.(1997).Insulin-like growth factor binding protein-1 is elevated in patients with polycythemia vera and stimulates erythroid burst formation in vitro.Blood 89,1862-1869.
Morley,J.E.(2001).Anorexia,body composition,and ageing.Curr.Opin.Clin.Nutr. Metab Care 4,9-13.
Mumper,R.J.,Wang,J.,Klakamp,S.L.,Nitta,H.,Anwer,K.,Tagliaferri,F.,and Rolland,A.P.(1998).Protective interactive noncondensing(PINC)polymers for enhanced plasmid distribution and expression in rat skeletal muscle.J.Control Release 52,191-203.
Muramatsu,T.,Arakawa,S.,Fukazawa,K.,Fujiwara,Y.,Yoshida,T.,Sasaki,R.,Masuda,S., and Park,H.M.(2001).In vivo gene electroporation in skeletal muscle with special reference to the duration of gene expression.Int.J Mol.Med.7,37-42.
Murray,R.D.and Shalet,S.M.(2000).Growth hormone:current and future therapeutic applications.Expert.Opin.Pharmacother.1,975-990.
Nabel,E.G.,Plautz,G.,Boyce,F.M.,Stanley,J.C.,and Nabel,G.J.(1989).Recombinant gene expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall.Science 244, 1342-1344.
Nairn,R.S.,Adair,G.M.,Porter,T.,Pennington,S.L.,Smith,D.G.,Wilson,J.H.,and Seidman,M.M.(1993).Targeting vector configuration and method of gene transfer influence targeted correction of the APRT gene in Chinese hamster ovary cells. Somat.Cell Mol.Genet.19,363-375.
Nampoory,M.R.,Johny,K.V.,Costandi,J.N.,Gupta,R.K.,Nair,M.P.,Samhan,M.,al Muzairai,I.A.,and al Mousawi,M.(2002).Inferior long-term outcome of renal transplantation in patients with diabetes mellitus.Med.Princ.Pract.11,29-34.
Narum,D.L.,Kumar,S.,Rogers,W.O.,Fuhrmann,S.R.,Liang,H.,Oakley,M.,Taye,A., Sim,B.K.,and Hoffman,S.L.(2001).Codon optimization of gene fragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccine protein expression and immunogenicity in mice.Infect.Immun.69,7250-7253.
Nelson,K.A.(2000).The cancer anorexia-cachexia syndrome.Semin.Oncol.27,64-68.
Nelson,K.A.(2001).Modern management of the cancer anorexia-cachexia syndrome. Curr.Pain Headache Rep.5,250-256.
Neumann,E.,Schaefer-Ridder,M.,Wang,Y.,and Hofschneider,P.H.(1982).Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high.electric fields.EMBO J.1,841- 845.
Nomoto,S.,Tatematsu,Y.,Takahashi,T.,and Osada,H.(1999).Cloning and characterization of the alternative promoter regions of the human LIMK2 gene responsible for alternative transcripts with tissue-specific expression.Gene 236, 259-271.
Ohlsson,H.,Thor,S.,and Edlund,T.(1991).Novel insulin promoter-and enhancer-binding proteins that discriminate between pancreatic alpha-and beta-cells.Mol. Endocrinol.5,897-904.
Omirulleh,S.,Abraham,M.,Golovkin,M.,Stefanov,I.,Karabaev,M.K.,Mustardy,L., Morocz,S.,and Dudits,D.(1993).Activity of a chimeric promoter with the doubled CaMV 35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants in maize.Plant Mol.Biol.21,415-428.
Otani,Y.,Tabata,Y.,and Ikada,Y.(1996).Rapidly curable biological glue composed of gelatin and poly(L-glutamic acid).Biomaterials 17,1387-1391.
Otani,Y.,Tabata,Y.,and Ikada,Y.(1998).Hemostatic capability of rapidly curable glues from gelatin,poly(L-glutamic acid),and carbodiimide.Biomaterials 19,2091- 2098.
Papassotiriou,I.,Voskaridou,E.,Stamoulakatou,A.,and Loukopoulos,D.(2000).Increased erythropoietin level induced by hydroxyurea treatment of sickle cell patients. Hematol.J.1,295-300.
Payen,E.,Bettan,M.,Rouyer-Fessard,P.,Beuzard,Y.,and Scherman,D.(2001). Improvement of mouse beta-thalassemia by electrotransfer of erytbropoietin cDNA.Exp.Hematol. 29,295-300.
Pech,M.,Rao,C.D.,Robbins,K.C.,and Aaronson,S.A.(1989).Functional identification of regulatory elements within the promoter region of platelet-derived growth factor 2. Mol.Cell Biol.9,396-405.
Pelletier,J.and Sonenberg,N.(1988).Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.Nature 334,320-325.
Pinkert,C.A.,Ornitz,D.M.,Brinster,R.L.,and Palmiter,R.D.(1987).An albumin enhancer located 10 kb upstream functions along with its promoter to direct efficient,liver- specific expression in transgenic mice.Genes Dev.1,268-276.
Potrykus,I.,Paszkowski,J.,Saul,M.W.,Petruska,J.,and Shillito,R.D.(1985).Molecular and general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer.Mol.Gen.Genet.199,169-177.
Porter,H.,Weir,L.,and Leder,P.(1984).Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 81,7161-7165.
Prahalada,S.,Stabinski,L.G.,Chen,H.Y.,Morrissey,R.E.,De Burlet,G.,Holder,D., Patrick,D.H.,Peter,C.P.,and van Zwieten,M.J.(1998).Pharmacological and toxicological effects of chronic porcine growth hormone administration in dogs [see comments].Toxicol.Pathol. 26,185-200.
Prentice,H.,Kloner,R.A.,Prigozy,T.,Christensen,T.,Newman,L.,Li,Y.,and Kedes,L. (1994).Tissue restricted gene expression assayed by direct DNA injection into cardiac and skeletal muscle.Journal of Molecular & Cellular Cardiology 26,1393- 1401.
Raghavachari,N.and Fahl,W.E.(2002).Targeted gene delivery to skin cells in vivo:a comparative study of liposomes and polymers as delivery vehicles.J.Pharm.Sci. 91,615-622.
Rippe,R.A.,Brenner,D.A.,and Leffert,H.L.(1990).DNA-mediated gene transfer into adult rat hepatocytes in primary culture.Mol.Cell Biol.10,689-695.
Robbins,K.,McCabe,S.,Scheiner,T.,Strasser,J.,Clark,R.,and Jardieu,P.(1994). Immunological effects of insulin-like growth factor-I--enhancement of immunoglobulin synthesis.Clin.Exp.Immunol.95,337-342.
Sakhuja,V.,Jha,V.,Varma,S.,Joshi,K.,Gupta,K.L.,Sud,K.,and Kohli,H.S.(2000).Renal involvement in multiple myeloma:a 10-year study.Ren Fail.22,465-477.
Satozawa,N.,Takezawa,K.,Miwa,T.,Takahashi,S.,Hayakawa,M.,and Ooka,H.(2000). Differences in the effects of 20 K-and 22 K-hGH on water retention in rats[In Process Citation].Growth Horm.IGF.Res.10,187-192.
Skroch,P.,Buchman,C.,and Karin,M.(1993).Regulation of human and yeast metallothionein gene transcription by heavy metal ions.Prog.Clin.Biol.Res. 380:113-28.,113-128.
Smith,L.C.and Nordstrom,J.L.(2000).Advances in plasmid gene delivery and expression in skeletal muscle.Curr.Opin.Mol.Ther.2,150-154.
Sohmiya M.and Kato,Y.(2000).Effect of long-term treatment with recombinant human growth hormone on erythropoietin secretion in an anemic patient with panhypopituitarism.J Endocrinol.Invest 23,31-36.
Somiari,S.,Glasspool-Malone,J.,Drabick,J.J.,Gilbert,R.A.,Heller,R.,Jaroszeski,M.J., and Malone,R.W.(2000).Theory and in vivo application of electroporative gene delivery.Mol.Ther.2,178-187.
Song,S.,Embury,J.,Laipis,P.J.,Berns,K.I.,Crawford,J.M.,and Flotte,T.R.(2001).Stable therapeutic serum levels of human alpha-1 antitrypsin(AAT)after portal vein injection of recombinant adeno-associated virus(rAAV)vectors.Gene Ther.8, 1299-1306.
Soubrier,F.,Cameron,B.,Manse,B.,Somarriba,S.,Dubertret,C.,Jaslin,G.,Jung,G., Caer,C.L.,Dang,D.,Mouvault,J.M.,Scherman,D.,Mayaux,J.F.,and Crouzet,J. (1999).pCOR:a new design of plasmid vectors for nonviral gene therapy.Gene Ther.6,1482-1488.
Sowade,B.,Sowade,O.,Mocks,J.,Franke,W.,and Warnke,H.(1998).The safety of treatment with recombinant human erythropoietin in clinical use:a review of controlled studies.Int.J.Mol.Med.1,303-314.
Terada,Y.,Tanaka,H.,Okado,T.,Inoshita,S.,Kuwahara,M.,Akiba T.,Sasaki,S.,and Marumo,F.(2001).Efficient and ligand-dependent regulated erythropoietin production by naked dna injection and in vivo electroporation.Am.J Kidney Dis. 38,S50-S53.
Thorner,M.O.,Frohman,L.A.,Leong,D.A.,Thominet,J.,Downs,T.,Hellmann,P., Chitwood,J.,Vaughan,J.M.,and Vale,W.(1984).Extrahypothalamic growth- hormone-releasing factor(GRF)secretion is a rare cause of acromegaly:plasma GRF levels in 177 acromegalic patients.Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 59,846-849.
Thorner,M.O.,Hartman,M.L.,Vance,M.L.,Pezzoli,S.S.,and Ampleford,E.J.(1995). Neuroendocrine regulation of growth hormone secretion.[Review].Neuroscience & Biobehavioral Reviews 19,465-468.
Thorner,M.O.,Vance,M.L.,Evans,W.S.,Rogol,A.D.,Rivier,J.,Vale,W.,Blizzard,and RM.(1986).CLINICAL STUDIES WITH GHRH IN MAN.Hormone Research 24,91-98.
Toneguzzo,F.,Keating,A.,Glynn,S.,and McDonald,K.(1988).Electric field-mediated gene transfer:characterization of DNA transfer and patterns of integration in lymphoid cells.Nucleic Acids Res.16,5515-5532.
Tripathy,S.K.,Svensson,E.C.,Black,H.B.,Goldwasser,E.,Margalith,M.,Hobart,PM,and Leiden,J.M.(1996).Long-term expression of erythropoietin in the systemic circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector.Proc. Natl.Acad.Sci.USA 93,10876-10880.
Tronche,F.,Rollier,A.,Bach,I.,Weiss,M.C.,and Yaniv,M.(1989).The rat albumin promoter:cooperation with upstream elements is required when binding of APF/HNF1 to the proximal element is partially impaired by mutation or bacterial methylation Mol.Cell Biol.9,4759-4766.
Tronche,F.,Rollier,A.,Herbomel,P.,Bach,I.,Cereghini,S.,Weiss,M.,and Yaniv,M. (1990).Anatomy of the rat albumin promoter.Mol.Biol.Med.7,173-185.
Trudel,M.and Costantini,F.(1987).A 3′enhancer contributes to the stage-specific expression of the human beta globin gene.Genes Dev.1,954-961.
Tsumaki,N.,Kimura,T.,Tanaka,K.,Kimura,J.H.,Ochi,T.,and Yamada,Y.(1998). Modular arrangement of cartilage-and neural tissue-specific cis-elements in the mouse alpha2(XI)collagen promoter.J.Biol.Chem.273,22861-22864.
Tsunekawa,B.,Wada,M.,Ikeda,M.,Uchida,H.,Naito,N.,and Honjo,M.(1999).The 20- kilodalton(kDa)human growth hormone(hGH)differs from the 22-kDa hGH in the effect on the human prolactin receptor.Endocrinology 140,3909-3918.
Tsurumi,Y.,Takeshita,S.,Chen,D.,Kearney,M.,Rossow,S.T.,Passeri,J.,Horowitz,J.R., Symes,J.F.,and Isner,J.M.(1996).Direct intramuscular gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor augments collateral development and tissue perfusion[see comments].Circulation 94,3281-3290.
Tur-Kaspa,R.,Teicher,L.,Levine,B.J.,Skoultchi,A.I.,and Shafritz,D.A.(1986).Use of electroporation to introduce biologically active foreign genes into primary rat hepatocytes.Mol.Cell Biol.6,716-718.
Urena,P.,Bonnardeaux,A.,Eckardt,K.U.,Kurtz,A.,and Drueke,T.B.(1992).Insulin-like growth factor I:a modulator of erythropoiesis in uraemic patients?Nephrol. Dial. Transplant.7,40-44.
Vance,M.L.(1990).Growth-hormone-releasing hormone.[Review][52 refs].Clinical Chemistry 36,415-420.
Vance,M.L.,Kaiser,D.L.,Evans,W.S.,Furlanetto,R.,Vale,W.,Rivier,J.,and Thorner,M.O.(1985).Pulsatile growth hormone secretion in normal man during a continuous 24-hour infusion of human growth hormone releasing factor(1-40). Evidence for intermittent somatostatin secretion.J.Clin.Invest.75,1584-1590.
Vansteenkiste,J.,Pirker,R.,Massuti,B.,Barata,F.,Font,A.,Fiegl,M.,Siena,S.,Gateley,J., Tomita,D.,Colowick,A.B.,and Musil,J.(2002).Double-blind,placebo-controlled, randomized phase III trial of darbepoetin alfa in lung cancer patients receiving chemotherapy.J.Natl.Cancer Inst.94,1211-1220.
Vegeto,E.,Allan,G.F.,Schrader,W.T.,Tsai,M.J.,McDonnell,D.P.,and O′Malley,B.W. (1992).The mechanism of RU486 antagonism is dependent on the conformation of the carboxy-terminal tail of the human progesterone receptor.Cell 69,703-713.
Verhelst,J.,Abs,R,Vandeweghe,M.,Mockel,J.,Legros,J.J.,Copinschi,G.,Mahler,C., Velkeniers,B.,Vanhaelst,L.,Van Aelst,A.,De Rijdt,D.,Stevenaert,A.,and Beckers,A.(1997).Two years of replacement therapy in adults with growth hormone deftciency.Clin.Endocrinol.(Oxf)47,485-44.
Vilquin,J.T.,Kennel,P.F.,Paturneau-Jouas,M.,Chapdelaine,P.,Boissel,N.,Delaere,P., Tremblay,J.P.,Scherman,D.,Fiszman,M.Y.,and Schwartz,K.(2001). Electrotransfer of naked DNA in the skeletal muscles of animal models of muscular dystrophies.Gene Ther.8,1097-1107.
Vittone,J.,Blackman,M.R.,Busby-Whitehead,J.,Tsiao,C.,Stewart,K.J.,Tobin,J., Stevens,T.,Bellantoni,M.F.,Rogers,M.A.,Baumann,G.,Roth,J.,Harman,S.M., and Spencer,R.G.S.(1997).Effects of single nightly injections of growth hormone- releasing hormone(GHRH 1-29)in healthy elderly men.Metabolism:Clinical and Experimental 46,89-96.
Wada,M.,Uchida,H.,Ikeda,M.,Tsunekawa,B.,Naito,N.,Banba,S.,Tanaka,E., Hashimoto,Y.,and Honjo,M.(1998).The 20-kilodalton(kDa)human growth hormone(hGH)differs from the 22-kDa hGH in the complex formation with cell surface hGH receptor and hGH-binding protein circulating in human plasma.Mol. Endocrinol.12,146-156.
Weinroth,S.E.,Parenti,D.M.,and Simon,G.L.(1995).Wasting syndrome in AIDS: pathophysiologic mechanisms and therapeutic approaches.Infect.Agents Dis.4, 76-94.
Wells,K.E.,Maule,J.,Kingston,R.,Foster,K.,McMahon,J.,Damien,E.,Poole,A.,and Wells,D.J.(1997).Immune responses,not promoter inactivation,are responsible for decreased long-term expression following plasmid gene transfer into skeletal muscle.FEBS Lett.407,164-168.
Wiethoff,C.M.,Smith,J.G.,Koe,G.S.,and Middaugh,C.R.(2001).The potential role of proteoglycans in cationic lipid-mediated gene delivery.Studies of the interaction of cationic lipid-DNA complexes with model glycosaminoglycans.J.Biol.Chem. 276,32806-32813.
Wilson,J.M.,Birinyi,L.K.,Salomon,R.N.,Libby,P.,Callow,A.D.,and Mulligan,R.C. (1989).Implantation of vascular grafts lined with genetically modified endothelial cells.Science 244,1344-1346.
Wolff,J.A.,Malone,R.W.,Williams,P.,Chong,W.,Acsadi,G.,Jani,A.,Felgner,and PL. (1990).Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science 247,1465-1468.
Wu,G.Y.and Wu,C.H.(1988a).Evidence for targeted gene delivery to Hep G2 hepatoma cells in vitro.Biochemistry 27,887-892.
Wu,G.Y.and Wu,C.H.(1988b).Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo. J.Biol.Chem.263,14621-14624.
Wu,H.K.,Squire,J.A.,Song,Q.,and Weksberg,R.(1997).Promoter-dependent tissue- specific expressive nature of imprinting gene,insulin-like growth factor II,in human tissues.Biochem.Biophys.Res.Commun.233,221-226.
Xie,T.D.and Tsong,T.Y.(1993).Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection.V.Effects of DNA topology on surface binding,cell uptake, expression,and integration into host chromosomes of DNA in the mammalian cell. Biophys.J.65,1684-1689.
Xu,J.,Nawaz,Z.,Tsai,S.Y.,Tsai,M.J.,and O′Malley,B.W.(1996).The extreme C terminus of progesterone receptor contains a transcriptional repressor domain that fuuctions through a putative corepressor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,12195-12199.
Yasui,A.,Oda,K.,Usunomiya,H.,Kakudo,K.,Suzuki,T.,Yoshida,T.,Park,H.M., Fukazawa,K.,and Muramatsu,T.(2001).Elevated gastrin secretion by in vivo gene electroporation in skeletal muscle.Int.J Mol.Med.8,489-494.
Yeh,S.S.and Schuster,M.W.(1999).Geriatric cachexia:the role of cytokines.Am.J Clin. Nutr.70,183-197.
Yin,D.and Tang,J.G.(2001).Gene therapy for streptozotocin-induced diabetic mice by electroporational transfer of naked human insulin precursor DNA into skeletal muscle in vivo.FEBS Lett.495,16-20.
Yorifuji,T.and Mikawa,H.(1990).Co-transfer of restriction endonucleases and plasmid DNA into mammalian cells by electroporation:effects on stable transformation. Mutat.Res.243,121-126.
Yutzey,K.E.and Konieczny,S.F.(1992).Different E-box regulatory sequences are functionally distinct when placed within the context of the troponin I enhancer. Nucleic Acids Res.20,5105-5113.
Zhao-Emonet,J.C.,Boyer,O.,Cohen,J.L.,and Klatzmann,D.(1998).Deletional and mutational analyses of the human CD4 gene promoter:characterization of a minimal tissue-specific promoter.Biochim.Biophys.Acta 1442,109-119.
序列表<110>Advisys
<120>
用于治疗慢性病个体的质粒介导的补充<130>108328.00073-AVSI-0007
<160>25
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是生长激素释放激素(GHRH),其以His1和Va12替代了Tyr1和Ala2,以Ala15
替代Gly15,以及用Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。
<400>1
His Val Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys val Leu Ala Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
35 40
<210>2
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是修饰的生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列。通过将Gly15替换成Ala15
增加了α-螺旋构象。这是TI-GHRH序列,所以它以Ile代替Ala2,用Ala15
代替Gly15,并且用Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。
<400>2
Tyr Ile Asp Ala Ile Phe Thr Ash Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
35 40
<210>3
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是生长激素释放激素,其以Val2替代了Ala2,以Ala15替代Gly15,以及用
Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。
<400>3
Tyr val Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
35 40
<210>4
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是猪生长激素释放激素(GHRH),其以Ala15替代Gly15,以及用Leu27和Asn28
替代了Met27和Ser28。
<400>4
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
35 40
<210>5
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是(1-44)NH2的人工序列
<400>5
Thr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
<210>6
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是GHRH(1-40)OH的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>位置1的Xaa可以是Tyr或His。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa可以是Ala,Val或Ile。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>位置15的Xaa可以是Ala,Val或Ile。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>位置27的Xaa可以是Met或Leu。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>位置28的Xaa可以是Ser或Asp。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>ARG可以是SER
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>Gln也可以是Arg
<400>6
Xaa Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Xaa Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Xaa Xaa Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
35 40
<210>7
<211>323
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是真核启动子c5-12的核酸序列
<400>7
cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg 60
gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta 120
aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga 180
cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg 240
ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga 300
gctacccgga ggagcgggag gcg 323
<210>8
<211>190
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是人生长激素(hGH)聚腺苷尾的核酸序列
<400>8
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180
acctgtaggg 190
<210>9
<211>219
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是猪生长激素释放激素的cDNA
<400>9
atggtgctct gggtgttctt ctttgtgatc ctcaccctca gcaacagctc ccactgctcc 60
ccacctcccc ctttgaccct caggatgcgg cggcacgtag atgccatctt caccaacagc 120
taccggaagg tgctggccca gctgtccgcc cgcaagctgc tccaggacat cctgaacagg 180
cagcagggag agaggaacca agagcaagga gcataatga 219
<210>10
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是猪生长激素释放激素的氨基酸序列
<400>10
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
35 40
<210>11
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接HV-GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>11
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggcacgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534
<210>12
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接TI-GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>12
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534
<210>13
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接TV-GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>13
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534
<210>14
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接15/27/28 GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>14
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534
<210>15
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是野生型GHRH的全部质粒序列
<400>15
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgc agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600
ggtgctgggc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcatgagca ggcagcaggg 660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534
<210>16
<211>4260
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是pSP-SEAP cDNA构建体的序列
<400>16
ggccgtccgc cttcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg 60
tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt ggcgctctaa 120
aaataactcc cgggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac 180
ggttcctcac ccgtcgccat atttgggtgt ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg 240
gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag 300
ctacccggag gagcgggagg cgccaagctc tagaactagt ggatcccccg ggctgcagga 360
attcgatatc aagcttcgaa tcgcgaattc gcccaccatg ctgctgctgc tgctgctgct 420
gggcctgagg ctacagctct ccctgggcat catcccagtt gaggaggaga acccggactt 480
ctggaaccgc gaggcagccg aggccctggg tgccgccaag aagctgcagc ctgcacagac 540
agccgccaag aacctcatca tcttcctggg cgatgggatg ggggtgtcta cggtgacagc 600
tgccaggatc ctaaaagggc agaagaagga caaactgggg cctgagatac ccctggccat 660
ggaccgcttc ccatatgtgg ctctgtccaa gacatacaat gtagacaaac atgtgccaga 720
cagtggagcc acagccacgg cctacctgtg cggggtcaag ggcaacttcc agaccattgg 780
cttgagtgca gccgcccgct ttaaccagtg caacacgaca cgcggcaacg aggtcatctc 840
cgtgatgaat cgggccaaga aagcagggaa gtcagtggga gtggtaacca ccacacgagt 900
gcagcacgcc tcgccagccg gcacctacgc ccacacggtg aaccgcaact ggtactcgga 960
cgccgacgtg cctgcctcgg cccgccagga ggggtgccag gacatcgcta cgcagctcat 1020
ctccaacatg gacattgacg tgatcctagg tggaggccga aagtacatgt ttcgcatggg 1080
aaccccagac cctgagtacc cagatgacta cagccaaggt gggaccaggc tggacgggaa 1140
gaatctggtg caggaatggc tggcgaagcg ccagggtgcc cggtatgtgt ggaaccgcac 1200
tgagctcatg caggcttccc tggacccgtc tgtgacccat ctcatgggtc tctttgagcc 1260
tggagacatg aaatacgaga tccaccgaga ctccacactg gacccctccc tgatggagat 1320
gacagaggct gccctgcgcc tgctgagcag gaacccccgc ggcttcttcc tcttcgtgga 1380
gggtggtcgc atcgaccatg gtcatcatga aagcagggct taccgggcac tgactgagac 1440
gatcatgttc gacgacgcca ttgagagggc gggccagctc accagcgagg aggacacgct 1500
gagcctcgtc actgccgacc actcccacgt cttctccttc ggaggctacc ccctgcgagg 1560
gagctccatc ttcgggctgg cccctggcaa ggcccgggac aggaaggcct acacggtcct 1620
cctatacgga aacggtccag gctatgtgct caaggacggc gcccggccgg atgttaccga 1680
gagcgagagc gggagccccg agtatcggca gcagtcagca gtgcccctgg acgaagagac 1740
ccacgcaggc gaggacgtgg cggtgttcgc gcgcggcccg caggcgcacc tggttcacgg 1800
cgtgcaggag cagaccttca tagcgcacgt catggccttc gccgcctgcc tggagcccta 1860
caccgcctgc gacctggcgc cccccgccgg caccaccgac gccgcgcacc cgggttactc 1920
tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga 1980
caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt 2040
gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat 2100
tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac 2160
aaatgtggta aaatcgataa ggatccgtcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt 2220
cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt 2280
tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 2340
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 2400
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 2460
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 2520
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 2580
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 2640
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 2700
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 2760
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 2820
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 2880
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 2940
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 3000
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 3060
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 3120
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<213>人工序列
<220>
<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体,该序列经针对小鼠的密码
子优化
<400>17
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<210>18
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体,该序列经针对大鼠的密码
子优化
<400>18
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<210>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体,该序列经针对牛的密码子
优化
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<213>人工序列
<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体,该序列经针对羊的密码子
优化
tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct 60
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<210>21
<211>2713
<212>DNA
<213>人工序列
<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体,该序列经针对鸡的密码子
优化
<400>21
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cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 1500
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 1560
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 1620
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 1680
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc 1740
cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag 1800
gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat 1860
gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc 1920
attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc 1980
atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc 2040
ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat 2100
acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg 2160
cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc 2220
ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag 2280
aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agacgagctg cttcatcctg 2340
cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc 2400
agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc 2460
aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat 2520
gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct 2580
tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc 2640
cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg 2700
ggaagggcga tcg 2713
<210>22
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是人生长激素5’非翻译区的核酸序列
<400>22
caaggcccaa ctccccgaac cactcagggt cctgtggaca gctcacctag ctgcc 55
<210>23
<211>782
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是质粒pUC-18复制起点的核酸序列
<400>23
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
tt 782
<210>24
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是NEO核糖体结合位点
<400>24
tcctc 5
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是原核PNEO启动子的核酸序列
<400>25
accttaccag agggcgcccc agctggcaa 29
6
3272758v1