本发明涉及异源基因的表达方法及其所用的重组媒介物。更具体地说， 本发明涉及用基因工程技术在细胞中表达异源基因时，与现有的异源基因表 达法相比较更能促进异源基因表达的方法以及涉及其所用的媒介物。

促进异源基因的表达是在基因工程中、特别是在将基因工程的技术用于 植物中时最必要的技术之一。

作为该方法之一，已知将来自内含子(intron)的DNA片段插入异源基因 上游的方法，例如在特开平3-103182号公报中所述，通过将蓖麻过氧化氢 酶(catalase)(CAT-1)的来自内含子的DNA片段插入异源基因上游，使该异 源基因表达，促进该异源基因的表达。报导了有关来自各种内含子的DNA 片段的相同现象。

为了促进异源基因的表达，一直使用内含子，但一般不用多个内含子， 所以也看不出它的效果。例如：玉蜀黍的醇脱氢酶的第一内含子和第六内含 子分别单独地呈显基因表达的促进效果，但是两者结合时的效果还不及单独 使用第六内含子的效果(Mascarenhas等，Plant Mol Biol，15，913- 920)(1990))。又，结合两个玉蜀黍的肌动蛋白的第三内含子时，其效果也不 如单独使用的效果(Luehrsen等人Mol.Gen.Genet.，225，81-93(1991))。

将来自内含子的DNA片段插入的现有方法是有效的，但其促进表达的 效果大多不充分，人们期望可能有更强地表达的方法。

因此，本发明的目的是提供一种比现有方法更强烈地表达异源基因的异 源基因表达的方法及为此所用的重组媒介物。

经努力研究的结果，本发明人等发现，在插入异源基因上游时，通过将 具有促进异源基因表达效果的相同或不同多个来自内含子的DNA片段插入 异源基因的上游的方法比将一个来自内含子的DNA片段插入的现有方法能 更明显地提高异源基因的表达。

也就是，本发明提供一种有以下特征的异源基因的表达方法，将异源基 因插入启动子(promoter)下游并在该细胞中表达异源基因的异源基因表达方 法中，将多个具有促进异源基因表达效果的、相同或不相同的来自内含子的 DNA片段插入该异源基因的上游，以表达该异源基因。

又，本发明还提供重组媒介物，该媒介物含有：启动子；在其下游所插 入的异源基因；以及在该异源基因的上游所插入的、具有促进异源基因表达 效果的相同或不相同的多个来自内含子的DNA片段。

本申请人等发现：在具有示于序列表中的序列号3中所示的碱基序列的 玉蜀黍泛有素(ユビキチン)的内含子序列单独地被插入异源基因的上游时， 也具有促进该异源基因表达的效果，从而完成本申请的第二个目的。

也就是，本发明还提供具有以下特征的异源基因的表达方法，在将异源 基因插入启动子下游，并在细胞中表达该异源基因的异源基因表达方法中， 将序列表中的序列号3所示的序列或其功能性变异体插入该异源基因的上 游，以表达上述异源基因。

通过本发明可提供与现有表达异源基因的方法相比的具有明显促进异 源基因的表达方法以及为其所用的重组媒介物。按照本发明，能促进以基因 工程方法导入的异源基因的表达，因此，在基因工程领域中，本发明将作出 大的贡献。

本发明方法的特征在于，通过将二个以上的具有促进异源基因表达效果 的、来自内含子的DNA片段插入要表达的异源基因的上游，以促进异源基 因的表达。

这里，所谓“具有促进异源基因表达效果的、来自内含子的DNA片段” 是指，和不插入时表达异源基因的情况相比，具有在能检出异源基因表达的 程度中增加效果的、来自内含子的DNA片段。已知有多种这种来自内含子 的DNA片段，例如有：蓖麻的过氧化氢酶(Catalase)基因(CAT-1)的第一内 含子(特开平3-103182号公报、田中等人，Nucleic Acids Res.18，6767- 6770(1990))、玉蜀黍的UDP-葡萄糖：黄酮醇糖基转移酶的内含子(Callis 等人，Genes & Develop.1，1183-1200(1987))、玉蜀黍的醇脱氢酶-1第 一内含子(Callis等人，Genes & Develop.1，1183-1200(1987))。玉蜀黍的 醇脱氢酶-1第二和第六内含子(Mascarenhas等人，Plant Mol.Biol，15，913 -920(1990))、玉蜀黍的舒兰肯-1(シユランケン-1)第一内含子(Vasil等 人，Plant Physiol.91，1575-1579(1989))、拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)的翻译延伸因子(translation elongation factor)EF-1α第一内含子 (Curie等人，Nucleic Acids Res.19，1305-1310(1991))以及稻的肌动蛋白的 第一内含子(McEloy等人，Plant Cell 2，163-171(1990))等。但是，本发明 所用的来自内含子的DNA片段并不限于上述这些，任何能促进这种位于其 下游的异源基因表达的都可以使用。

又，本发明人等人首先通过将稻的磷脂酶D(PLD)基因的cDNA和基因 组的碱基序列进行比较而发现稻PLD基因的内含子；而且发现在这些内含子 中之一具有明显促进其下游基因表达的效果，因此申请专利 (PCT/JP96/00812)。将此内含子的碱基序列示于序列表的序列号1中。在本发 明中，可使用这序列号1所示的来自内含子的DAN片段。又，也可令人满 意地使用在序列表的序列号2所表示的蓖麻过氧化氢酶内含子序列和序列号 3所示的玉蜀黍泛有素(Ubiquittin)基因的内含子序列。

再者，本领域专业人员往往认为，一般在具有生理作用的DNA序列中， 加入、插入、缺失或置换一个或多个核苷酸时还能维持其生理活性。在本发 明中，上述公知的来自内含子的DNA片段以及在序列号1所示的来自内含 子的DNA片段上在进行这种修饰的同时具有促进下游基因的表达的DNA片 段也包含在本发明中的所谓“来自内含子的DNA片段”中。也就是，在上 述公知的来自内含子的DNA片段和来自序列表的序列号1所示的内含子的 DNA片段上，添加、缺失或置换一个或多个核苷酸并又具有促进其下游存在 的基因的表达的DNA片段也包含在本发明中的“来自内含子的DNA片段” 中。这里，经这样修饰的来自内含子的DNA片段最好与原来的来自内含子 的DNA片段有70％以上，更好有90％以上的相同性。同样，在本申请权 利要求中所述的“功能性的变异体”也是在原来的序列上添加、缺失或置换 一个或多个核苷酸、而且又具有促进其下游存在的基因表达的序列，与原来 的序列较好的有70％以上，更好的有90％以上的相同性。例如：所谓“序 列号1所示序列的功能性变异体”就是：序列号1所示序列中添加、缺失或 置换一个或多个核苷酸，而且又具有促进其下游存在的基因表达的序列，这 意味着它是与原来序列，较好的有70％以上、更好的有90％以上的相同性 的序列。

上述的各个来自内含子的DNA片段其碱基序列和其来历都是公知的， 因此，通过常规方法的PCR方法就能容易地制备。又，长度为2000bp程度 以下的用化学合成也有可能。又，上述来自修饰内含子的DNA片段也能用 常规法的部位特异性变异法或化学合成法而容易制备。

在本发明方法中，将多个上述来自内含子的DNA片段插入要表达异源 基因的上游、也就是插入该异源基因的复制领域，更好是插入该复制领域的 5′末端侧上。来自内含子的DNA片段最好插入启动子和异源基因之间。将上 述来自内含子的DNA片段也可插入靠近要表达的异源基因的上游；来自内 含子的DNA片段和异源基因之间介入其它序列也可以。这种介入的序列长 度并不受限制，通常约为0～1000bp。又，启动子和来自内含子的DNA片 段直接连接也可以；在它们之间有其它序列介入也可以。这些介入的序列长 度并不特别受限制，通常约为0～1000bp。

在本发明方法中，将多个、较好是2～5个，更好是2或3个的上述来 自内含子的DNA片段插入。插入的来自内含子的DNA片段可以是相同序 列，也可以是不相同的序列。插入的多个来自内含子的DNA片段也可相互 直接连接，在它们之间也可介入其它序列。该介入的序列的长度不特别受限 制，通常约为0～1000bp。

再者，作为启动子也可用能使下游的异源基因表达的任何启动子，作为 较好的实例可以是35S启动子，但也不限于此。

本发明还提供适用于上述本发明方法的重组媒介物。也就是，本发明所 提供的重组媒介物，它包含，启动子；在其下游连接的要表达的异源基因； 插入于该异源基因上游的、具有促进异源基因表达效果的相同或不相同的多 个来自内含子的DNA片段。这样的重组媒介物可通过将上述多个来自内含 子的DNA片段和异源基因插入适当的表达媒介物中而获得。由于表达媒介 物的克隆部位的碱基序列为已知，所以通过使用适当的抑制酶和必要时使用 衔接物就容易地进行这种插入操作。

再者，各种这样的表达媒介物在本领域是众所周知的，并有市售。这些 表达媒介物至少含有：为在宿主细胞内复制的复制开始点；启动子；提供为 将异源基因插入的限制酶部位的克隆部位以及耐药性基因等的选择标记，通 常，含有使复制稳定终结的终止区和当宿主为细菌时的SD序列。在本发明 方法中，可采用这些公知的表达媒介物中的任何一种。

本申请发明人等发现，当将具有序列表的序列号3所示的碱基序列的、 玉蜀黍的泛有素基因的内含子序列单独地插入在异源基因的上游时，也能具 有促进该异源基因表达的效果。因此，代替上述多个来自内含子的序列，而 只将一个序列号3所示序列或其功能性的衍生物插入的场合下包含于本发明 范围内。但是，即使是以序列3所示的序列，插入多个的情况下，其效果大， 特别是与以序列号1所示的稻PLD的内含子序列一起插入时呈大的效果。

以下，基于实施例对本发明进行具体说明，只是，本发明并不限于下述 实施例。

实施例1

在稻PLD的基因中，在与mRNA的5′末端非翻译领域相对应的位置上 存在有173bp的第一内含子(序列号1.WO 95/09234)。就该内含子研究了它对 植物细胞中基因表达的影响。合成每10个碱基含外显子(エキソン)部分的20 碱基的引物(primer)(5′-TCAC-CACCCGGTAAGCCCAG-3′，3′- CCCCCGCGTCCATCCCGCTC-5′)，以稻基因组纯株(クロ-ン)作为铸型而 进行PCR。使用50pmol的各引物的混合物，200μM的dATP、dCTP、 dGTP和dTTP、1×PCR缓冲液(宝酒造公司制)和2.5UAmpli Taq DNA聚合 酶(宝酒造公司制)，在总容积为50μl中进行PCR反应。反应按下述的温度 条件反复进行30周期，在DNA热循环器(帕金、唉尔马、西塔斯(パ-キン， ユルマ-シ-タス)公司制)中，在94℃一分钟、在40℃一分钟和在72℃为 二分三十秒。

将PCR产物在PCR 11媒介物(インビトロジエン公司制)中进行亚克 隆，将从该处切出的ECoR1片段进行平滑末端处理后，制备在东洋纺公司制 备的质体pBl221[在35S启动子(以下称为“35Spro”)的下游插入β-葡糖 醛酸酶基因(以下称为“GUS”)的媒介物质体]的Smal位点上嵌入的媒介物 pBl221P(35S pro，PLD intron，GUS)。再将质体用BanHI消化，并进行平滑末 端处理后，将上述片段嵌入，制备媒介物pBl221PP(35S pro.PLD intron×2， GUS)。

再用Xbal将特开平03-103182号公报上所述的plG221[在35S pro的 下游有蓖麻过氧化氢酶内含子(序列表中的序列号2)和GUS按此顺序存在] 进行消化，在平滑末端处理后，将具有上述PLD内含子的序列的DNA片段 插入，制成媒介物plG221P(35S pro，PLD内含子，过氧化氢酶内含子， GUS)。

通过日本稻“日本巴雷”品种的未成熟胚体制成稻培养细胞(Hiei等人， The Plant Journal，6，271-282(1994)]，按照现有报道[岛本等人，Nature，338， 274-276(1989)]导入上述基因后，测定β-葡糖醛酸酶(GUS)活性，结果示 于表1。

如表1所示那样，可以看出：与单独使用相比，由于导入二个同种或异 种的内含子，有明显增大的GUS的活性。同时，很明显，有PLD内含子的 碱基序列的DNA片段是，在使用多个具有内含子的碱基序列的DNA片段时 可获得基因表达促进效果的DNA片段。 表1     质体   GUS活性 无 pBl221 (35S pro，GUS) pBl221P(35S pro，PLD内含子，GUS) pBl22PP(35S pro，PLD内含子×2，GUS) plG221 (35S pro，过氧化氢酶内含子，GUS) plG221P(35S pro，PLD内含子，过氧化氢酶内含子，GUS)     7.2     14     180     430     160     680

实施例2

就玉蜀黍的泛有素基因(Ubi-1：Christensen A.H.等人，Plant Mol.Biol.， 18，675-689(1982))的内含子，研究其对异源基因表达的促进效果，所用媒 介物有两种。

首先，用以下方法制备用于研究单独使用时效果的媒介物。用Pst1切出 泛有素基因的启动子和内含子(序列号3)，插入pUC 18媒介物的Pst1位点。 用Bgl II和BamH I切出内含子部分，将其插入pBI221媒介物的BamH I位点， 制成媒介物pBI221U(35S pro、泛有素内含子、GUS)。

其次，用以下方法制备用于研究多个使用时效果的媒介物。用Bgl II和 BamH I切出内含子部分，在平滑末端处理后，将其插入pBI221媒介物的Sma I位点。又在该媒介物的BamH I位点进行平滑末端处理，将所述PLD内含 子插入，从而制成媒介物pBI221PU(35S pro，PLD内含子，泛有素内含子， GUS)。用上述方法将这些媒介物导入原生质体，测定GUS活性。

正如表2所示，可看出由于单独使用泛有素内含子(Ubiquitm intron)有表 达的促进效果。又，可看出由于并用PLD内含子和泛有素内含子使所得的比 单独使用各内含子具有更强的促进效果。 表2     质体     GUS活性 (pmol MU/min./mg 蛋白质) 无 pBI221(35S pro，GUS) pBI221(35S pro，PLD内含子，GUS) pBI221(35S pro，泛有素内含子，GUS) pBI221(35S pro，PLD内含子，泛有素，内含子，GUS)     3.3     13     100     360     780

以下是序列表： 序列表 序列号：  1 序列长度：173 序列类型：核酸 序列种类：基因组的DNA 来源

生物名：稻(Oryza Sativa) 拓朴学：直链状 链数：双链 序列

GTAAGCCCAG  TGTGCTTAGG  CTAAGCGCAC   TAGAGCTTCT  TGCTCGCTTG  CTTCTTCTCC       60

GCTCAGATCT  GCTTGCTTGC  TTGCTTCGCT   AGAACCCTAC  TCTGTGCTGC  GAGTGTCGCT      120

GCTTCGTCTT  CCTTCCTCAA  GTTCGATCTG   ATTGTGTGTG  TGGGGGGGCG  CAG             173 序列号：2 序列长度：217 序列类型：核酸 序列种类：基因组的DNA 来源

生物名：蓖麻 拓朴学：直链状 链数：双链 序列

ACATGGATCC  CTACAGGGTA  AATTTCTAGT   TTTTCTCCTT  CATTTTCTTG  GTTAGGACCC      60

TTTTCTCTTT  TTATTTTTTT  GAGCTTTGAT   CTTTCTTTAA  ACTGATCTAT  TTTTTAATTG     120

ATTGGTTATG  GTGTAAATAT  TACATAGCTT   TAACTGATAA  TCTGATTACT  TTATTTCGTG     180

TGTCTATGAT  GATGATGATA  GTTACAGAAC   CGTCGAC                                217 序列号：3 序列长度：1010 序列类型：核酸 序列种类：基因组的DNA 来源

生物名：玉蜀黍 拓朴学：直链状 链数：双链 序列： GTACGCCGCT  CGTCCTCCCC  CCCCCCCCCT  CTCTACCTTC  TCTAGATCGG  CGTTCCGGTC     60 CATGGTTAGG  GCCCGGTAGT  TCTACTTCTG  TTCATGTTTG  TGTTAGATCC  GTGTTTGTGT    120 TAGATCCGTG  CTGCTAGCGT  TCGTACACGG  ATGCGACCTG  TACGTCAGAC  ACGTTCTGAT    180 TGCTAACTTG  CCAGTGTTTC  TCTTTGGGGA  ATCCTGGGAT  GGCTCTAGCC  GTTCCGCAGA    240 CGGGATCGAT  TTCATGATTT  TTTTTGTTTC  GTTGCATAGG  GTTTGGTTTG  CCCTTTTCCT    300 TTATTTCAAT  ATATGCCGTG  CACTTGTTTG  TCGGGTCATC  TTTTCATGCT  TTTTTTTGTC    360 TTGGTTGTGA  TGATGTGGTC  TGGTTGGGCG  GTCGTTCTAG  ATCGGAGTAG  AATTCTGTTT    420 CAAACTACCT  GGTGGATTTA  TTAATTTTGG  ATCTGTATGT  GTGTGCCATA  CATATTCATA    480 GTTACGAATT  GAAGATGATG  GATGGAAATA  TCGATCTAGG  ATAGGTATAC  ATGTTGATGC    540 GGGTTTTACT  GATGCATATA  CAGAGATGCT  TTTTGTTCGC  TTGGTTGTGA  TGATGTGGTG    600 TGGTTGGGCG  GTCGTTCATT  CGTTCTAGAT  CGGAGTAGAA  TACTGTTTCA  AACTACCTGG    660 TGTATTTATT  AATTTTGGAA  CTGTATGTGT  GTGTCATACA  TCTTCATAGT  TACGAGTTTA    720 AGATGGATGG  AAATATCGAT  CTAGGATAGG  TATACATGTT  GATGTGGGTT  TTACTGATGC    780 ATATACATGA  TGGCATATGC  AGCATCTATT  CATATGCTCT  AACCTTGAGT  ACCTATCTAT    840 TATAATAAAC  AAGTATGTTT  TATAATTATT  TTGATCTTGA  TATACTTGGA  TGATGGCATA    900 TGCAGCAGCT  ATATGTGGAT  TTTTTTAGCC  CTGCCTTCAT  ACGCTATTTA  TTTGCTTGGT    960 ACTGTTTCTT  TTGTCGATGC  TCACCCTGTT  GTTTGGTGTT  ACTTCTGCAG                1010