用于抑制和/或治疗神经纤维瘤及相关肿瘤的材料和方法
阅读：1022发布：2020-07-17
专利汇可以提供用于抑制和/或治疗神经纤维瘤及相关肿瘤的材料和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于抑制和/或 治疗 神经 纤维 瘤及相关 肿瘤 的材料和方法。NF1肿瘤抑制基因的生殖系突变引起Von Recklinghausen 1型神经纤维瘤病(NF1)，其为一种以发生丛状神经纤维瘤为特征的神经系统常见遗传 疾病 。利用造血细胞的过继转移，我们证实了肿瘤微环境中骨髓源细胞的NF1杂合性足以使得神经纤维瘤在施万细胞零合性情况下进展。进一步地，造血细胞中c?kit 信号 传导通路的遗传或药理性衰减极大地减少了神经纤维瘤的发生和进展。这些研究将单倍体不足的造血细胞和c?kit受体确认为防止丛状神经纤维瘤的治疗靶点，并表明肥大细胞为肿瘤发生的关键介导物。对有此需要的患者施用治疗有效剂量的酪 氨 酸激酶 抑制剂 (如化合物甲磺酸伊 马 替尼)以治疗患有丛状神经纤维瘤之人患者中的肿瘤。，下面是用于抑制和/或治疗神经纤维瘤及相关肿瘤的材料和方法专利的具体信息内容。
1.式1化合物
或具有至少一个成盐基团的该化合物的盐在制备用于治疗丛状神经纤维瘤的药物中的用途，
其中，
R1为4-吡嗪基；1-甲基-1H-吡咯基；氨基取代的或氨基-低级烷基取代的苯基，其中在每种情况下所述氨基为游离的、烷基化的或酰化的；键合在五元环碳原子上的1H-吲哚基或
1H-咪唑基；或者键合在环碳原子上的吡啶基，其未被取代或被低级烷基取代，并且所述氮原子被氧取代或未被取代；
R2和R3各自独立地为氢或低级烷基；
基团R4、R5、R6、R7和R8中的一个或两个各自为硝基、氟取代的低级烷氧基或式II基团-N(R9)-C(＝X)-(Y)n-R10 (II)；
其中，
R9为氢或低级烷基，
X为氧、硫、亚氨、N-低级烷基-亚氨、肟或O-低级烷基-肟，
Y为氧或NH基团，
n为0或1，并且
R10为含至少5个碳原子的脂肪族基团，或芳族、芳族-脂肪族、脂环族、脂环族-脂肪族、杂环或杂环-脂肪族基团，
并且其余基团R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为氢，未取代或被以下基团取代的低级烷基：
游离的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基或吗啉基；或者为低级烷酰基，三氟甲基，游离、醚化或酯化的羟基，游离、烷基化或酰化的氨基，或者游离或酯化的羧基,其中所述式1化合物的治疗有效剂量为约200mg至约500mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
2.权利要求1的用途，其中所述化合物为式1的可药用盐。
3.权利要求2的用途，其中所述式1的可药用盐为甲磺酸盐。
4.权利要求1的用途，其中所述式1化合物的治疗有效剂量为约350mg至约450mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
5.权利要求1的用途，其中所述式1化合物的治疗有效剂量为约400mg，且所述剂量的化合物每日2次施用给患者。
6.式2化合物
在制备用于治疗丛状神经纤维瘤的药物中的用途，
其中所述式2化合物的治疗有效剂量为约200mg至约500mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
7.权利要求6的用途，其中所述化合物为式2的可药用盐。
8.权利要求6的用途，其中所述式2化合物的治疗有效剂量为约350mg至约450mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
9.权利要求6的用途，其中所述式2化合物的治疗有效剂量为约400mg，且所述剂量的化合物每日2次施用给患者。
用于抑制和/或治疗神经纤维瘤及相关肿瘤的材料和方法
[0001] 本申请是申请号为200980123474.2、发明名称为“用于抑制和/或治疗神经纤维瘤及相关肿瘤的材料和方法”的申请的分案申请，该母案申请是2009年6月25日提交的PCT申请PCT/US2009/048554进入中国国家阶段的申请。
[0003] 本发明的部分研发在NIH(资助号NS 052606)和国防部(资助号W81XWH-05-1-0185)给予的政府支持下进行。美国政府享有本发明中的某些权力。
[0004] 优先权声明
[0005] 本申请要求2008年6月27日提交的美国临时专利申请61/076,185和2008年10月8日提交的美国临时专利申请61/103,650的优先权，这两个临时专利申请均通过引用全文并入本文，如同其单独通过引用全文并入本文一样。
技术领域
背景技术
[0007] NF1肿瘤抑制基因的突变引起1型神经纤维瘤病(NF1)，其为一种常见的广泛分布的人遗传疾病，仅在美国、欧洲和日本就影响了约250,000名患者。NF1基因编码神经纤维瘤蛋白(320千道尔顿的蛋白)，其至少部分地起到p21ras的GTP酶激活蛋白(GTPase activating protein,GAP)的功能。神经纤维瘤蛋白在脊椎动物中高度保守，并与其在酵母和果蝇中的对应物有高同源性。
[0008] 患NF1的个体有多种多样的恶性和非恶性表现，包括丛状神经纤维瘤，其总共影响25-40％的NF1患者；这些神经纤维瘤为终生致病和死亡的主要根源。考虑到该病症对携带该突变的人的不利影响以及对该病症和相关病症的有效治疗的缺乏，迫切需要该病症的其它治疗疗法。本文公开的多个方面和实施方案解决这一需要。
发明内容
[0009] 一些实施方案包括治疗患有某形式的神经纤维瘤病(例如丛状神经纤维瘤)的患者的方法，包括以下步骤：提供至少一种治疗有效剂量的式1化合物：
[0010]
[0011] 或具有至少一个成盐基团的该化合物的盐，
[0012] 其中，R1为4-吡嗪基；1-甲基-1H-吡咯基；氨基取代的或氨基-低级烷基取代的苯基，其中在每种情况下所述氨基为游离的、烷基化的或酰化的；在五元环碳原子上键合的1H-吲哚基或1H-咪唑基；或者在环碳原子上键合的吡啶基，其未被取代或被低级烷基取代，并且所述氮原子被氧取代或未被取代；R2和R3各自独立地为氢或低级烷基；
[0013] 基团R4、R5、R6、R7和R8中的一个或两个各自为硝基、氟取代的低级烷氧基或式II基团：N(R9)-C(＝X)-(Y)n-R10 (II)，
[0014] 其中，R9为氢或低级烷基，X为氧、硫、亚氨、N-低级烷基-亚氨、肟或O-低级烷基-肟，Y为氧或NH基团，n为0或1，并且R10为含至少5个碳原子的脂肪族基团，或芳族、芳族-脂肪族、脂环族、脂环族-脂肪族、杂环或杂环-脂肪族基团，并且其余基团R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为氢、未取代或被以下基团取代的低级烷基，所述基团为游离的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基或吗啉基，或者为低级烷酰基，三氟甲基，游离、醚化或酯化的羟基，游离、烷基化或酰化的氨基，或者游离或酯化的羧基。
[0015] 在一些实施方案中，所述化合物为式1的可药用盐，在一些实施方案中，所述式1的可药用盐为甲磺酸盐。
[0017] 在一些实施方案中，所述式1化合物的所述治疗有效剂量为约200mg至约500mg，且所述剂量的所述化合物每日至少一次施用给患者。在另一些实施方案中，所述式1化合物的治疗有效剂量为约350mg至约450mg，且所述剂量的所述化合物每日至少一次施用给患者。在一些实施方案中，每日两次给患者施用治疗有效剂量(约400mg)的式1化合物。
[0018] 一些实施方案包括对患有某种形式的神经纤维瘤(例如，丛状神经纤维瘤)的患者的治疗，包括以下步骤：提供至少一种治疗有效剂量的式2化合物：
[0019]
[0020] 另一些实施方案包括治疗患有某种形式的神经纤维瘤(例如，丛状神经纤维瘤)的患者的方法，包括以下步骤：提供至少一种治疗有效剂量的式3化合物：
[0022] 通过参考以下对于本公开内容实施方案的描述，并结合附图、图、表格、式等，将更好地理解本公开内容的上述方面和获得它们的方式，其中：
[0023] 图1A.用于考察造血微环境之作用的策略的示意图。
[0024] 图1B.利用荧光细胞分析生成的图。在Krox20；Nf1flox/flox和Krox20；Nf1flox/-小鼠中，Nf1+/-骨髓为神经纤维瘤形成所必需的。
[0025] 图2A.显示了存活百分数(y轴)作为时间(x轴)的函数的Kaplan-Meier图。对移植+/- flox/flox flox/-了Nf1 或野生型骨髓的Krox20；Nf1 和Krox20；Nf1 小鼠进行随访直到1岁龄。
[0026] 图2B.移植了野生型骨髓(1)或Nf1+/-骨髓(2-3)的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的照片。
[0027] 图2C.移植了野生型或Nf1+/-骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的背根神经节和外周神经的解剖照片。箭头指示背根神经节和外周神经中的肿瘤。
[0028] 图3A.背根神经节和近端外周神经的苏木精和伊红(H&E)切片。
[0029] 图3B.用Masson三色法染色之切片的200倍放大照片。已标出了供体骨髓和接受者小鼠的基因型。
[0030] 图3C.阿尔新蓝染色之切片的200倍放大。区域2和3中的小箭头指示肥大细胞。区域3中的大箭头指示血管。
[0031] 图3D.显示不同基因型间肥大细胞数目差异的柱形图。所述谱系通过FACS分离自移植了Nf1+/-骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠。
[0032] 图3E.利用荧光细胞分析进行的多种骨髓源谱系之表型评估数据的图示。将骨髓(区域1)与肿瘤细胞(区域2)分离并分选出EGFP+CD45.2阳性群。进一步分离了肿瘤相关的CD45.2细胞以鉴定肥大细胞(区域3)、巨噬细胞(区域4)、B淋巴细胞(区域4)和T淋巴细胞组。标出了肿瘤中各造血细胞群的比例。
[0033] 图3F.显示通过FACS从移植了Nf1+/-骨髓之Krox20；Nf1flox/flox小鼠的肿瘤中分离出的谱系的基因分型的凝胶图。箭头指示来自各表型谱系的所标注等位基因的DNA扩增产物。
[0034] 图4A.显示存活百分数(y轴)作为时间(x轴)之函数的Kaplan-Meier图。
[0035] 图4B.移植了野生型骨髓(区域1)或Nf1+/-骨髓(区域2)之Krox20；Nf1flox/flox小鼠的脊髓和背根的照片。箭头指示近端神经中的肿瘤。
[0036] 图4C.图示针对不同基因型的供体细胞所测量的背根神经节(Dorsal Root Ganglia,DRG)尺寸的图。
[0037] 图4D.移植了Nf1+/-或Nf1+/-；W/W突变骨髓之Krox20；Nf1flox/flox小鼠的背根神经节和近端脊神经的代表性组织切片的照片。
[0039] 图5B.用甲磺酸伊马替尼或PBS处理12周后平均FDG-PET强度的变化的图示总结。
[0040] 图5C.通过解剖某些外周神经而采集的数据的图示。
[0041] 图5D.显示用甲磺酸伊马替尼或安慰剂处理之Krox20；Nf1flox/-小鼠的组织学分析的照片。
[0042] 图5E.显示将肥大细胞数/HPF绘制为甲磺酸伊马替尼处理或未处理之函数的柱形图。
[0043] 图5F.显示将Tunnel阳性细胞数/HPF绘制为甲磺酸伊马替尼处理或未处理的函数的柱形图。
[0044] 图6.患有丛状神经纤维瘤的患者用甲磺酸伊马替尼治疗之前和之后的MRI扫描。
[0045] 图7.用透射电子显微镜法对背根神经节进行的超微结构分析。区域1-4，750倍；区域5-8，1500倍。区域1-2的近端脊神经来自移植了野生型骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠；区域3-8的近端神经来自移植了Nf1+/-骨髓的接受者。(U)无髓的轴突；(S)标示神经内空间扩大。箭头指示胶原束；(M)标示肥大细胞浸润肿瘤。
[0046] 图8.取自小鼠的组织样本的显微照片。这些图片示意用FDG-PET对丛状神经纤维flox/flox flox/-瘤进行鉴定。在9月龄时获取的Krox20；Nf1 小鼠和Krox20；Nf1 小鼠的脊神经解剖和FDG-PET图。
[0047] 图9.用甲苯胺蓝染色的组织样本的显微照片，且以100倍和600倍的放大倍数显示，箭头指示肥大细胞。
[0048] 图10.显示了从移植了Nf1+/-；Wv/Wv骨髓的经辐照的Krox20；Nf1flox/flox接受者的骨髓中分离出的单个骨髓祖细胞的DNA的基因型鉴定的凝胶。
[0049] 图11A.用FDG-PET鉴定丛状神经纤维瘤。在9月龄时获取的Krox20；Nf1flox/flox小鼠和Krox20；Nf1flox/-小鼠的脊神经的FDG-PET解剖图。
[0050] 图11B.显示Krox20；Nf1flox/-和Krox20；Nf1flox/flox小鼠的目标坐骨神经区域的FDG-PET平均强度的图。
[0051] 图11C.Krox20；Nf1flox/flox小鼠(区域1)和患有PET阳性肿瘤的Krox20；Nf1flox/-小鼠(区域2-4)的背根神经节的代表性解剖图。
[0052] 图12.在甲磺酸伊马替尼或安慰剂处理后用TUNEL评估丛状神经纤维瘤的凋亡。用安慰剂对照(左图)或甲磺酸伊马替尼(右图)处理丛状神经纤维瘤而得的代表性切片。箭头指示TUNEL阳性细胞。
[0053] 图13A.MRI图像，头部和颈部。
[0054] 图13B.区域C、D：轴位MRI T2加权序列图像；分别为用甲磺酸伊马替尼处理前和处理6个月后。
[0055] 使用相应的附图标记来标明各图中的相应部分。
具体实施方式
[0056] 以下给出的和/或描述的实施方案并非旨在是穷尽性的或限定到以下详细描述中所公开的精确形式。相反，对实施方案进行选择和描述，使得本领域其他技术人员可领会和理解本文所述的不同方面和实施方案的原则和实施。
[0057] 已证明多种疾病的动物模型是建立对于所述建模疾病(modeled disease)的理解的非常有效的工具，并且也许同样重要的，还是开发和测试用于诊断、治疗和/或预防所述建模疾病的新材料和/或方法的非常有效的工具。旨在能够研究细胞自主性和非细胞自主性促进肿瘤发生的鼠科动物模型已引起大量的关注。当将小鼠肿瘤模型推及人时必须进行严格的考察，并且只有在与人类疾病状态有明确可证实的生理相关性的情况下才能理解这些实验策略的重要性。
[0058] 因此，建立人癌症之小鼠模型的基本原则需要在与人肿瘤相同的组织中产生相关分子途径的突变。进一步地，用于建立人疾病模型的小鼠肿瘤应当以一系列可信的细胞和分子结果来概括重现人的表型。只要在设计实验和解释结果时进行了充分的考虑，小鼠模型就可成功地用于研究人肿瘤的发生。例如，当人肿瘤由可还原成单个基因突变的遗传性基因性状(例如，在Von Recklinghausen神经纤维瘤病的情况下)造成时，建立遗传模型就特别有成效。因此，本发明的一些方面教导了适合模拟一些形式的人神经纤维瘤形成的小鼠模型。或许该动物模型对于给定疾病在开发对于与人相同或相似的疾病的治疗方面有效的最好证据就是证实了与人疾病的许多动物模型不同的是，基于该特定动物模型设计的治疗在治疗人患者时显示出有效作用。
[0059] 神经纤维瘤病小鼠模型的建立
[0060] Von Recklinghausen神经纤维瘤病是单基因病。在绝大多数病例中，其表现为生殖系突变和完全的体细胞杂合，随后是导致该疾病定型表现的细胞类型中罕见的杂合性缺失。在该疾病中几乎不变的是，肿瘤发生在所感染患者的外周神经系统中。人组织研究显示了施万细胞的重要作用，但是这些研究的问题在于根据事后的信息来推断先前的事件。允许组织特异性Nf1缺失的条件性Nf1敲除小鼠模型为该方法提供了希望。在全身杂合的生理相关情况下，这些研究揭示了丛状神经纤维瘤形成的遗传瓶颈可能在于胚胎施万细胞谱系的Nf1杂合性缺失。这些肿瘤的组织病理学分析与自然发生的人肿瘤本质上不可区分。
[0061] 小鼠遗传学揭示了微环境的重要作用，其在不同的遗传配置下，可为肿瘤允许型的或肿瘤抵抗型的。数据表明，施万细胞谱系外的Nf1杂合性是肿瘤形成所需的。例如，在肿瘤出现的数月前，在这些小鼠中出现肥大细胞向外周神经中的浸润，但在非荷瘤的Nf1野生型(flox/flox)基因型中则不然。在人神经纤维瘤中已经观察到了肥大细胞，但是在没有小鼠模型的情况下，不能直接对其在肿瘤发生或维持中的功能性作用进行研究。令人感兴趣的是，注意到Cre转基因(其靶向靶向神经脊施万细胞谱系，包括periostin-Cre、P0-Cre和他莫西芬可诱导的PLP-Cre)重复出Nf1单倍体不足(haploinsulfficiency)的情况。这些发现进一步证实了对施万细胞谱系外的Nf1杂合性的需要。用组织特异性Cre转基因所收集的数据并不排除肿瘤可在人为实验条件下的野生型环境中发生的可能性。事实上，当我们采用神经脊特异性的早期、广泛和强表达的Cre驱动子时，我们甚至在flox/flox小鼠中都观察到外周神经的增生，尽管其比flox/-小鼠的要弱。
[0062] 本文公开的结果说明后面的模型脱离了患有NF1(其中LOH为罕见的随机事件)的人的生理状况，以致独立发生的零合性胚胎施万细胞前体处于相对不利于肿瘤发生的微环境中。这些小鼠模型表明，独立的细胞零合性通过与所募集的杂合肥大细胞的明显协同作用可获得显著的选择性优势。与所述数据一致的这些结果的一个解释是，强Cre介导的重组模型中的增生反映了Nf1的非生理性广泛缺失，不只是在施万细胞中，还在另外的谱系(可越过独立的LOH屏障)中有额外的Nf1缺失。
[0063] 神经纤维瘤的形成与外周神经相关，且包括施万细胞、内皮细胞、成纤维细胞、脱颗粒中的炎性肥大细胞和周细胞/血管平滑肌细胞(VSMC)，并且包含大的胶原蛋白沉降物。Nf1条件性敲除小鼠模型证实了人肿瘤的回顾性研究，证明施万细胞谱系中Nf1杂合性缺失(LOH)似乎是诱发神经纤维瘤的必要但非充分条件。据报道，肿瘤的发展需要肿瘤微环境中施万细胞与Nf1单倍体不足的细胞谱系之间的复杂相互作用。因此，在Nf1野生型背景中，施万细胞的Nf1零合性可能是导致肿瘤形成所必要的，但是并不一定是充分的。肿瘤形成杂合性小鼠的一个已报道的特征为在肿瘤发生相当长时间前，肥大细胞就在外周神经中出现。
此外，混合施万细胞条件培养基和肥大细胞的体外实验证明了Nf1杂合性肥大细胞对于零合性施万细胞的条件培养基的高敏感性。不希望局限于任何特定的理论，我们设想了一个形成这些类型肿瘤的模型，其包含Nf1杂合性肥大细胞对成瘤前外周神经的浸润，并与Nf1零合性施万细胞一起促进肿瘤发生。
此外，混合施万细胞条件培养基和肥大细胞的体外实验证明了Nf1杂合性肥大细胞对于零合性施万细胞的条件培养基的高敏感性。不希望局限于任何特定的理论，我们设想了一个形成这些类型肿瘤的模型，其包含Nf1杂合性肥大细胞对成瘤前外周神经的浸润，并与Nf1零合性施万细胞一起促进肿瘤发生。
[0064] 在野生型环境中，杂合性Nf1+/-来源之骨髓的过继转移足以与固有的特异性敲除的零合性施万细胞谱系共同起作用来诱导肿瘤形成，这一发现提示需要骨髓源性细胞而非这些肿瘤中发现的其他细胞类型中的单倍体缺失。此外，对供体骨髓中c-Kit信号传导和供体杂合肥大细胞浸润接受者外周神经肿瘤的遗传需要强烈支持以下假设：这中间存在着因果联系。
[0065] c-Kit受体在肥大细胞的发育和功能方面有核心作用。施万细胞和成纤维细胞(神经纤维瘤的两种主要组分)响应于多种不同刺激而分泌kit配体。例如，已报道在神经纤维瘤组织中kit配体mRNA转录本升高，并且已经报道NF1患者的血清中有升高水平的kit配体。在甲磺酸伊马替尼(FDA批准的药物制剂)的临床前试验中，认为其通过抑制包括c-Kit在内的几种酪氨酸激酶而发挥作用。
[0066] 当在针对该疾病的小鼠模型中检测对神经纤维瘤的效用时，甲磺酸伊马替尼显示出出乎意料的效力。施用治疗有效剂量的该化合物具有逆转神经纤维瘤病理的显著作用。伊马替尼的处理使肥大细胞从该化合物处理之动物的外周神经中消失。除了证明c-Kit介导的NF1施万细胞与杂合性肥大细胞间相互作用的延伸性体外研究外，体内研究也确定了需要持续施用甲磺酸伊马替尼以应对肿瘤的维持。
[0067] 炎症和肥大细胞在肿瘤发生中的作用是研究的活跃领域。肥大细胞释放炎症介质(包括组胺、血清素、蛋白聚糖和白三烯)，而后激活高亲和力IgE受体(FcεRI)和c-Kit受体。此外，据报道肥大细胞释放VEGF，其为血管生成因子并为施万细胞的强效增殖、存活和趋化因子。已认为VEGF在肿瘤形成中与血管生成“开关”相关联。最后，肥大细胞还释放PDGF-β(促进周细胞和成纤维细胞增殖的生长因子)和TGF-β(促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成的生长因子)。
[0068] 甲磺酸伊马替尼和肿瘤微环境
[0069] 有关神经纤维瘤的一个重要问题是肥大细胞是如何与施万细胞协作而引发肿瘤形成？本文显示的数据表明肿瘤中的其它细胞类型不必然为杂合性的。然而，浸润性Nf1杂合性肥大细胞是否主要与零合性施万细胞相互作用来促进肿瘤形成，或者与在这些肿瘤中也存在的局部基质和其它细胞类型间接相互作用是否是诱导肿瘤的必需中介物，现在对这些进行断言还为时过早。要更好地理解神经纤维瘤中的其他旁分泌相互作用以及其如何可影响肿瘤的形成和维持，还需要进一步的研究。
[0070] 此外，本文所报道的以及之前体外的研究遗传结果证实，甲磺酸伊马替尼抑制多种Nf1+/-周细胞以及抑制成纤维细胞的肿瘤促进功能。再者，在这些另外的肿瘤细胞中不需要杂合性并不能排除以下可能性：即甲磺酸伊马替尼导致肿瘤消退的能力可能单单由于其对肥大细胞的抑制活性所致。以下假说通过举例说明的形式提出，且并不限制以下事实：用诸如甲磺酸伊马替尼的化合物进行的治疗减小肿瘤是本发明的一个方面，其不以任何方式取决于为试图解释该结果所提出的任何特定理论或解释。甲磺酸伊马替尼和相同或类似家族的化合物可出乎意料地抑制其它肿瘤细胞类型中另外和/或其它潜在的关键肿瘤促进活性。例如，除了在肥大细胞中抑制c-Kit外，甲磺酸伊马替尼还可通过PDGFR减少血管生成，并通过c-Abl降低纤维化/胶原蛋白生成。可能需要另外的研究来解决这些关键性的和吸引人的情况，暂时来讲，一个发现是有效剂量的该化合物引起神经纤维瘤小鼠模型和患有诸如丛状神经纤维瘤的人患者中的肿瘤消退。
[0071] 对c-kit的药理学抑制作用减小肿瘤大小和代谢活性
[0072] 可用于实施本发明的化合物包括式1的化合物
[0073]
[0074] 或具有至少一个成盐基团的该化合物的盐，
[0075] 其中，R1为4-吡嗪基；1-甲基-1H-吡咯基；氨基取代的或氨基-低级烷基取代的苯基，其中在每种情况下所述氨基为游离的、烷基化的或酰化的；在五元环碳原子上键合的1H-吲哚基或1H-咪唑基；或者在环碳原子上键合的吡啶基，其未被取代或被低级烷基取代，并且所述氮原子被氧取代或未被取代；R2和R3各自独立地为氢或低级烷基；基团R4、R5、R6、R7和R8中的一个或两个各自为硝基、氟取代的低级烷氧基或式II基团：N(R9)-C(＝X)-(Y)n-R10(II)，其中，R9为氢或低级烷基，X为氧、硫、亚氨、N-低级烷基-亚氨、肟或O-低级烷基-肟，Y为氧或NH基团，n为0或1，并且R10为含至少5个碳原子的脂肪族基团，或芳族、芳族-脂肪族、脂环族、脂环族-脂肪族、杂环或杂环-脂肪族基团，并且其余基团R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为氢、未取代或被以下基团取代的低级烷基，所述基团为游离的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基或吗啉基，或者为低级烷酰基，三氟甲基，游离、醚化或酯化的羟基，游离、烷基化或酰化的氨基，或者游离或酯化的羧基。
[0076] 式1化合物在专利申请US 5,521,184中被一般性和具体地公开(特别是在化合物权利要求中和实施例的终产物中)，该专利申请的主题通过引用全文并入本文。在以上对式1化合物的定义中，基团和符号具有如US 5,521,184中所提供的含义，其全文并入本文。
[0077] 就本发明而言，伊马替尼可以其单甲磺酸盐的形式施用。单甲磺酸伊马替尼可按照US 6,894,051中公开的方法制备，该专利通过引用全文并入本文。还包括相应的多晶型物，例如在上述专利中公开的晶体修饰。
[0078] 成人患者口服施用伊马替尼单甲磺酸盐的每日剂量为约200至约800mg，例如400mg。伊马替尼单甲磺酸盐可以US 5,521,184、US 6,894,051、US 2005/0267125或WO2006/121941中公开的剂型施用，上述所有文件均通过引用全文并入本文，如同其各自被并入本文一样。对这些化合物的进一步讨论请见例如美国专利申请11/815,046(现为美国专利公开2008/00114001 A1(2008年5月15日公开))，其内容通过引用全文并入本文。
[0079] 用于治疗被认为涉及酪氨酸激酶活性之疾病的一个尤其有效的化合物为化合物甲磺酸伊马替尼(4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺)。伊马替尼可以例如按照WO03/066613中公开的方法进行制备。该化合物的一个可药用盐为以下式3所示的甲磺酸伊马替尼
[0080]
[0081] 甲磺酸伊马替尼为c-Kit、PDGF-BB和c-abl酪氨酸激酶的强效抑制剂。该化合物以受商标保护的名称Gleevec进行销售。美国已批准其用于治疗表达Kit(CD117+)的患者。根据国家临床指南交换中心(National Guideline Clearinghouse,www.guidline.gov)，成人患者的初始建议剂量水平为400mg，每日施用两次。实际的治疗有效剂量因患者而异，并且由处方医师根据多种因素(包括患者体重、年龄、性别、总体健康状态和对药物的反应)来确定。
[0082] 小鼠模型的一个限制是该动物的寿命短，由于该原因无法基于小鼠研究预测长期存活的肿瘤可能如何响应。然而，小鼠模型的这些结果强烈提示，用这些化合物进行的治疗可以并且将为患某些肿瘤的人带来有益作用。对该设想的其它支持来自于所获得的以下出乎意料的良好结果：当用甲磺酸伊马替尼治疗人患者时，成功地降低了人患者的肿瘤大小。
[0083] 通过说明而非限制的方式提供以下讨论。近些年来，关于特发性癌症发生的细胞和分子机制的理论有了显著的进展。目前正对之前的观点(即细胞自主性事件赋予单个细胞以摆脱其正常调控而导致恶性疾病的发生，并进一步鉴定了肿瘤来源的细胞类型)进行协同地重新研究。愈发清楚的是，尽管单个细胞中的一系列遗传和表观遗传事件引发了恶性表型，但大多数形式的癌症都包括对允许型微环境(permmissive microenvironment)的共选择，所述微环境允许甚至促进致瘤状态，按照该假设，抵抗性环境将基本上排除肿瘤形成的可能性。已确定的对于肿瘤形成之共选择性允许过程的非细胞自主性促进因素包括：新血管生成、局部基质的参与和其它细胞类型中的炎症。对旁分泌相互作用的精确顺序、相对重要性以及非致瘤环境相互作用的分子基础的理解仍处在初级阶段。然而，本文公开的化合物的治疗用途不以任何方式受任何假设的作用模式或针对不同疾病或病症(其可用本文所述的材料和/或方法有利地治疗或控制)提出的分子病因的限制。
[0084] 这些数据与骨髓源性细胞在丛状神经纤维瘤形成中的作用相一致。这些数据还表明，对c-kit受体的药理性和遗传性抑制可防止或至少延迟Nf1小鼠中丛状神经纤维瘤的形成。这些结果表明，在肿瘤微环境中需要骨髓源性细胞(尤其是依赖于c-kit受体之激活的)的Nf1单倍体不足以允许神经纤维瘤的发展。数据提示，肥大细胞积极参与了肿瘤的形成，并确定了人1-2期临床试验的新治疗靶点。
[0085] 本公开内容提供了与人癌症生理相关的小鼠模型的实例，其提供了对起源肿瘤细胞和微环境之间复杂相互作用的具体洞察。尽管利用小鼠作为人疾病模型的研究提出了通过靶向肿瘤形成的微环境而非致瘤细胞来治疗至今尚不可治疗的肿瘤的潜在治疗方法，但是由于人和小鼠之间相当大的细胞和生理差别，采用诸如甲磺酸伊马替尼的化合物治疗人神经纤维瘤的有效性只能通过用该化合物治疗人来进行有效证明。至少部分地，由于人通常比小鼠寿命长，甲磺酸伊马替尼治疗人的诸如神经纤维瘤病症的能力(不像用该化合物治疗慢性粒细胞白血病的情况)可导致抗药性的产生。认为在CML中，甲磺酸伊马替尼直接作用于白细胞，并靶向突变的组成型活跃酪氨酸激酶癌蛋白(Bcr-abl)。Bcr-abl癌基因可通过获得第二个位点突变来产生抗药性。与之相反，可能抗c-kit药剂(如甲磺酸伊马替尼)对神经纤维瘤的主要活性(如果不是唯一的活性)为针对非肿瘤细胞的作用，例如作用于野生型蛋白质，其可能不存在已有的抗药性选择途径。
[0086] 我们已经鉴定了在体外对Nf1杂合性肥大细胞具有比甲磺酸伊马替尼高10倍之抑制活性的化合物(未公开的结果)。对同时患有Von Recklinghausen神经纤维瘤病和斑驳病的病例的报道数则非常少。这些研究推断斑驳病由c-kit受体的减效突变(hypomorphic mutation)而导致。据报道这些患者无神经显微瘤。不存在神经纤维瘤的另一个看似可能的解释是这些个体缺乏肥大细胞。因此，这些报道可提供对于c-Kit和肥大细胞在人神经纤维瘤形成中的重要性的确认。
[0087] 本文讨论的神经纤维瘤小鼠模型的遗传和细胞可塑性揭示了有关微环境参与肿瘤形成的重要细节，其与除Von Recklinghausen神经纤维瘤之外的人癌症普遍相关。
[0088] 实施例
[0089] 材料和方法
[0090] 动物和试剂
[0091] 之前已经描述了在这些研究中所用的Krox20；Nf1flox/flox小鼠(Zhu等，2002)，“Neurofibroma in NF1:Schwann cell origin and role of tumor environment,”flox/- flox/floxScience 296,920-922。为了产生Krox20；Nf1 小鼠，我们将Krox20；Nf1 小鼠与Nf1+/-小鼠进行了杂交。所有涉及动物使用的方案都经印第安纳大学药学院动物保护和利用协会的批准。除非另外声明，否则化学品均购自Sigma(St.Louis,MO)。
[0092] 造血细胞的过继转移
[0093] 为了评估微环境调节对丛状神经纤维瘤进展的作用，进行了骨髓移植。简而言之，在分两剂施用1100拉德电离辐射对年轻成年Krox20；Nf1flox/flox小鼠和Krox20；Nf1flox/-小鼠进行处理后，将从野生型GFP或Nf1+/-GFP小鼠获得的二百万个(每个接受者)同源野生型或Nf1+/-骨髓细胞过继转移到前述小鼠中。
[0094] PET成像分析
[0095] 为了验证并在解剖学上确定丛状神经纤维瘤的位置，联合进行了[18F]氟脱氧葡萄糖([18F]FDG)PET和x-射线CT成像分析。当采集CT图像时，在区域旁边放置模板以获得标准化的目标体积(volume of interest,VOI)，从而使研究者能够对FDG摄取进行定量。用登记并重叠的CT图像数据来鉴别特定脊椎(例如从L1至S1的标记)。然后操作者沿着脊髓选择点来确定脊髓通过L1和S1之间的途径。而后，沿着脊髓在插入点放置3个圆形目标区域(region-of-interest,ROI)以捕获脊髓和背根神经结区域。最后，将圆形ROI组合以产生针对脊髓、左背根神经节和右背根神经节的VOI。在经尾静脉注射约0.5-1.0mCi的FDG 45分钟后获取FDG图像。所有动物均在清醒状态下注射FDG，并且在注射约40分钟后进行异氟烷麻醉以固定用于动物成像。
[0096] 在非荷瘤Krox20；Nf1flox/flox小鼠和发生了完全外显性神经纤维瘤的Krox20；Nf1flox/-小鼠中进行了初步成像研究。在初步研究中，实验性PET成像以及背根神经节和近端外周神经的解剖分析都未能在小于6月龄的任何小鼠(无论何种基因型)中检测到肿瘤(数据未显示)。类似地，在9月龄的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的腰骶区域几乎没有FDG摄取(图
8A)。与之相反，对9月龄的Krox20；Nf1flox/-小鼠(其中肿瘤在坐骨神经区中很普遍)进行的FDG PET扫描证明了在脊柱的腰椎区域中FDG PET强度有特异性升高(图8A；箭头)。随后对成像动物的尸检提供了对FDG PET成像所确认肿瘤的相应证实(图8B)。在图8C中显示了对flox/- flox/flox
Krox20；Nf1 小鼠群体与相应年龄的Krox20；Nf1 群体的FDG-PET图像数据的总结。这些研究证实了无创FDG-PET成像可用于确定Krox20；Nf1flox/-小鼠中的丛状神经纤维瘤。
8A)。与之相反，对9月龄的Krox20；Nf1flox/-小鼠(其中肿瘤在坐骨神经区中很普遍)进行的FDG PET扫描证明了在脊柱的腰椎区域中FDG PET强度有特异性升高(图8A；箭头)。随后对成像动物的尸检提供了对FDG PET成像所确认肿瘤的相应证实(图8B)。在图8C中显示了对flox/- flox/flox
Krox20；Nf1 小鼠群体与相应年龄的Krox20；Nf1 群体的FDG-PET图像数据的总结。这些研究证实了无创FDG-PET成像可用于确定Krox20；Nf1flox/-小鼠中的丛状神经纤维瘤。
[0097] 背根神经节的解剖
[0098] 在处死小鼠后，立即用4％多聚甲醛灌注并固定死后的小鼠。然后在解剖显微镜下剖离出背根神经节和外周神经。将小鼠用2％多聚甲醛、2.5％戊二醛和0.1M卡可酸盐(pH7.4)灌注固定以通过电子显微镜分析其组织。
[0099] 肿瘤大小的测量
[0100] 为了评估肿瘤的大小，在用卡尺测量近端背根神经节的最大可能宽度和长度后，进行背根神经节的解剖测量。通过确立球体的近似体积来测定肿瘤的体积(例如，0.52×(宽度)2×长度)。
[0101] 背根神经节中供体细胞的表型评估
[0102] 为了检验重构成肿瘤的供体的细胞类型，进行了流式细胞分析。简而言之，剖离出背根神经节，切碎，并用胶原蛋白酶V消化。然后将单细胞悬液与抗CD117、CD31或Col1A和FcεRI抗体混合。而后用荧光激活细胞分选仪(Becton Dickson)分离群体。
[0103] 组织学分析
[0104] 为了检验肿瘤的精细形态，用苏木精和伊红(H&E)染色石蜡切片。考虑到胶原蛋白大约占人丛状神经纤维瘤干重的约60％，还用Masson三色法染色组织切片。为了确定肿瘤中肥大细胞的存在，进行了阿尔新蓝染色。
[0105] 透射电子显微镜观察
[0106] 在灌注固定后，用梯度系列的乙醇和丙酮使组织脱水，并包埋在Epon-Araldite(Electron Microscopy Sciences，Hatfield,PA)中。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色超薄切片(银到金)，并用FEI Tecnai G2电子显微镜(Philips,Eindhoven,Netherlands)检测。
[0107] 实验1
[0108] Nf1杂合性骨髓(BM)的过继转移降低肿瘤相关的接受者存活
[0109] 现在参考图1，该图举例说明了接受者小鼠的基因型、在接受者经电离辐射后过继转移细胞的基因型以及移植后所获得的测量值。为了检测以下假设：即肿瘤微环境中造血细胞的Nf1杂合性造成了神经纤维瘤形成所需的遗传单倍体不足，我们将Nf1杂合性骨髓转移到Nf1等位基因敲除的在约10％的施万细胞中携带两个Kron20-Cre转基因的小鼠(Krox20；Nf1flox/flox)中，其中。Krox20；Nf1flox/flox小鼠的所有细胞谱系均在功能上为野生型，而且未观察到神经纤维瘤。作为补充实验，将野生型骨髓细胞移植入以下小鼠中：其含生殖细胞零合性Nf1等位基因和上述在施万细胞谱系中易于重组的floxed等位基因(Krox20；Nf1flox/-)。如前所述(Zhu等，2002)，Krox20；Nf1flox/-小鼠均发生丛状神经纤维瘤。将一部分Nf1+/-或野生型骨髓在电离辐射后过继转移到接受者中，并监测丛状神经纤维瘤的发生和与这些肿瘤相关的死亡率，直到小鼠1岁龄。
[0110] 现在参考图2A，在每条曲线旁边标示了基因型。一旦小鼠显示出严重病态的明显迹象，就将其处死。Y轴显示存活小鼠的百分数。比较Krox20；Nf1flox/flox+Nf1+/-骨髓(虚线)与Krox20；Nf1flox/flox+野生型骨髓(空心方框)(P<0.002)；Krox20；Nf1flox/flox+Nf1+/-骨髓(虚线)与Krox20；Nf1flox/-(空心圆)，无明显区别。Krox20；Nf1flox/-(空心圆)与Krox20；Nf1flox/-+/-+野生型骨髓(实心方框)(p<0.0.002)。移植6个月后，移植了杂合性Nf1 骨髓的功能性生殖细胞野生型(Krox20；Nf1flox/flox)接受者表现出运动麻痹、体重减轻，并且只有15％的小鼠在整个实验阶段中存活，参见例如图2A和B。该死亡率在很大程度上印证了之前在生殖细胞杂合性Krox20；Nf1flox/-小鼠中所观察到的结果(图2A)。与之相反，约90％的以野生型骨flox/flox
髓重构的Krox20；Nf1 小鼠存活，并且未表现出丛状神经纤维瘤形成的临床特征(图
2A)。对这些数据通过相反的实验进行了确证：其中对生殖细胞杂合性Krox20；Nf1flox/-小鼠移植野生型骨髓细胞可将其存活水平恢复到与含有完好骨髓的非荷瘤Krox20；Nf1flox/flox小鼠可比的水平(图2A)。
髓重构的Krox20；Nf1 小鼠存活，并且未表现出丛状神经纤维瘤形成的临床特征(图
2A)。对这些数据通过相反的实验进行了确证：其中对生殖细胞杂合性Krox20；Nf1flox/-小鼠移植野生型骨髓细胞可将其存活水平恢复到与含有完好骨髓的非荷瘤Krox20；Nf1flox/flox小鼠可比的水平(图2A)。
[0111] 现在参考图2C的移植了野生型或Nf1+/-骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的背根神经节和外周神经的解剖照片。箭头指出了背根神经节和近端外周神经中的肿瘤。对患病小鼠的脑部和脊髓的尸检显示，与移植了野生型骨髓的无症状小鼠的脊髓相比，在22个Nf1+/-骨髓移植接受者中有21个的整体脊髓厚度增大。这一异常形态类似于荷瘤的Krox20；Nf1flox/-小鼠。
[0112] 现在参考图2C的具有不同遗传组成的小鼠的背根神经节的显微照片，箭头指出了+/-支配表现出运动麻痹的肢体的神经节。图2C中区域2和区域3显示了移植有Nf1 骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的背根神经节产生的离散肿瘤，并且这些肿瘤尤其在坐骨神经中占优势。对肿瘤的体积分析显示与未发生肿瘤的小鼠的未感染背根神经节相比，其体积增大了3-6倍。大的体积和浸润坐骨神经和腰骶丛的肿瘤的位置可能导致了所观察到的行为异常：后肢麻痹、肾盂积水以及膀胱增大和缺乏肌张力(图2B)。总之，这些数据表明，在杂合性缺失的施万细胞情形下，NF1杂合性骨髓的存在足以导致在Krox20；Nf1flox/-转基因小鼠中最初观察到的死亡和外周神经增生。
[0113] 实验2
[0114] Nf1+/-骨髓(BM)接受者发生丛状神经纤维瘤
[0115] 现在参考图3A，病理分析证实Nf1杂合性骨髓受体中丛状神经纤维瘤的存在。区域1和6为移植了野生型骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠。区域2、3、7、8为移植了Nf1+/-骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠。区域4、5、9、10为移植了野生型骨髓的Krox20；Nf1flox/-小鼠。上方区域的照片用100倍的光学显微镜拍摄，而下方区域的照片用200倍的光学显微镜拍摄。移植了Nf1+/-骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的背根神经节显示了经典的人丛状神经纤维瘤的组织学特征，包括正常构造的破坏；波浪状施万细胞和细胞核过染色的浸润细胞(图3A，区域7-8)；过度胶原沉积(图3B，区域2、3)；血管生成(图3C，区域3中的大箭头指示血管)；和典型的超微结构异常(图7)。在图7中，区域1-4，750倍；区域5-8，1500倍。区域1-2中的近端脊神经来自移植了野生型骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠；区域3-8为移植了Nf1+/-骨髓的接受者的近端神经。在这些照片中，(U)表示无髓轴突；(S)表示神经内空间扩大；箭头指示胶原束；并且(M)表示肥大细胞浸润肿瘤。相反地，转移了野生型骨髓的Krox20；Nf1flox/flox或Krox20；Nf1flox/-小鼠在背根神经节和近端外周神经的各处切片中均显示了正常外观、均匀分布的细胞核(参见例如图3A，区域1、4-6和9-10)，并且无胶原沉积的迹象。从移植了Nf1+/-骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠中分离出来的肿瘤具有丛状神经纤维瘤的组织学特征。
[0116] 现在参考图3B中区域1、4-5的新血管生成和所保持的正常超微结构形态(图7)。神经纤维瘤为含有多种细胞类型(其中LOH只存在于施万细胞谱系中)的复杂肿瘤(Zhu等，2002)。肥大细胞浸润示人和小鼠丛状神经纤维瘤的特征(Zhu等，2002)。在本文采用的针对该病症的小鼠模型中，我们观察到在肿瘤出现之前肥大细胞浸润外周神经。因此，重构的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的杂合性骨髓也显示出广泛肥大细胞浸润(图3C，区域2-3)。使用荧光细胞分析来纯化移植了Nf1+/-骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的神经纤维瘤中的内皮细胞(CD31)、成纤维细胞(Col1A)和造血细胞(c-kit、CD117)。
[0117] 现在参考图3D，箭头指出了相应的表型谱系中已标示之等位基因的扩增DNA产物。出乎意料的是，随后的基因分型显示仅c-kit细胞群(其也表达FcεRI(未显示))携带Nf1无效等位基因(图3D)。这些数据与重构的Krox20；Nf1flox/flox中真实(bona fide)丛状神经纤维瘤的表现一致，包括移植的杂合性肥大细胞归巢到Nf1零合性Schwall细胞的位置。
[0118] 现在参考图3E，将骨髓(BM)(谱带1-以及肿瘤细胞(区域2))分离并根据EGFP+；CD45.2阳性群体进行分选。进一步分离肿瘤相关CD45.2细胞以确定肥大细胞(区域3)、巨噬细胞(区域4)、B淋巴细胞(区域4)和T淋巴细胞(区域5)。所述图表示肿瘤中的每个造血细胞群。
[0119] 现在参考图3F，通过FACS从移植了Nf1+/-骨髓(BM)的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的肿瘤中分离的谱系的基因型。图3F中的箭头指向凝胶上的条带，其由相同的等位基因(从标示的表型谱系中分离)的DNA扩增产物形成。
[0120] Nf1+/-骨髓介导的肿瘤形成需要c-Kit
[0121] 在所述重构的丛状神经纤维瘤中检测到的唯一Nf1杂合性细胞来自骨髓。该发现与我们之前体内体外的发现相一致，表明肿瘤形成需要肥大细胞的单倍体不足。认为c-kit受体酪氨酸激酶(RTK)控制肥大细胞发育和功能的许多方面。我们已经报道c-Kit的活性似乎支配Nf1+/-骨髓源性肥大细胞的迁移、增殖和存活。我们假设所述病症与所检测到的在被移植进Krox20；Nf1flox/flox小鼠的Nf1+/-骨髓中c-kit活性的遗传破坏对肿瘤进展的作用之间具有关联性。
[0122] 在接受者Krox20；Nf1flox/flox小鼠中，过继转移的Nf1+/-骨髓中c-kit的遗传破坏阻止丛状神经纤维瘤的发生。简单地讲，使Nf1+/-小鼠分别与两个减效小鼠品系交配，通过c-kit受体中的点突变(其分别降低激酶活性85％(W41/W41)至95％(Wv/Wv))抑制肥大细胞的运动。
[0123] 现在参考图4A。将Nf1+/-；Wv/Wv或Nf1+/-；W41/W41双突变小鼠的骨髓分别移植进5只和10只Krox20；Nf1flox/flox小鼠中。与移植了Nf1+/-骨髓的Nf1flox/flox小鼠相比，移植了Nf1+/-；W突变骨髓的小鼠的病变显著降低。对移植了Nf1+/-或Nf1+/-；W突变骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠关注一年。标明基因型和两组间的统计学显著性。因此，与Nf1+/-骨髓的接受者相反，移植了Nf1+/-；W突变骨髓的Krox20；Nf1flox/flox小鼠的背根神经节和近端外周神经有正常的形态，并且未表现出肥大或肿瘤迹象(图4B)。这些结果支持了Nf1的单倍体不足起源于骨髓的假设，并进一步确定了活性成分与c-Kit依赖的细胞类型一致性。现在参考图
4C，其显示了Krox20；Nf1flox/flox小鼠坐骨神经的单个背根神经节(DRG)的体积作为基因型的函数的图。每个单点代表单个DRG的体积，线代表各实验组的平均体积。与用Nf1+/-骨髓(其还含有使c-kit通路失活的c-kit受体突变)重构的小鼠(Nf1+/-；W/W)相比，用Nf1+/-骨髓细胞重构的接受者有显著增高的平均坐骨神经DRG体积。
4C，其显示了Krox20；Nf1flox/flox小鼠坐骨神经的单个背根神经节(DRG)的体积作为基因型的函数的图。每个单点代表单个DRG的体积，线代表各实验组的平均体积。与用Nf1+/-骨髓(其还含有使c-kit通路失活的c-kit受体突变)重构的小鼠(Nf1+/-；W/W)相比，用Nf1+/-骨髓细胞重构的接受者有显著增高的平均坐骨神经DRG体积。
[0124] 现在参考图4D，区域1-3中显示的切片为H&E染色。区域4-6中的切片为阿尔新蓝染色。箭头突出显示了肥大细胞。在各区域图框的的下方显示了过继转移的骨髓的基因型。
[0125] 实验4
[0126] 为了评估甲磺酸伊马替尼和其它潜在的药剂对肿瘤负荷的活性，我们验证了无创氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层成像FDG-PET成像方案，其允许对Krox20；Nf1flox/-小鼠的丛状神经纤维瘤进行鉴定和纵向观察(也参见方法部分和图8)。
[0127] 现在参考图5A，其为用甲磺酸伊马替尼处理12周后平均FDG-PET阳性肿瘤的图像变化。已鉴定了3只单独小鼠中的目标区域、扫描时间顺序和试验处理组。然后我们确认了用250/mg/kg/天的甲磺酸伊马替尼或安慰剂对照(PBS)口服处理8至9月龄的Krox20；Nf1flox/-小鼠(在坐骨神经区域确定为PET摄取阳性)的组。而后进行FDG-PET成像研究以评估肿瘤的进展。显示了在用甲磺酸伊马替尼或PBS处理前或处理3周后成像的3只小鼠的受影响神经的代表性FDG-PET轴向切片。如所预期的一样，在用甲磺酸伊马替尼或PBS处理之前，Krox20；Nf1flox/-动物的脊柱旁边可见FDG摄取的增加(图5A，区域1、3、5)。显著的是，与PBS对照(图5A，区域6)相比，用甲磺酸伊马替尼处理的Krox20；Nf1flox/-小鼠(图5A，区域2-
4)中FDG摄取定性地降低。为了对所有处理动物的FDG-PET强度进行谨慎定量，在每个动物中用标准化目标区域(ROI)来精确定量FDG摄取值(mCi/ml组织)。使用圆柱体形的三维ROI来封闭具有ROI圆柱的脊柱旁区域，并在所有情况下使用从L1至S的特定脊椎位置标记来确保一致性。在区域7-8(图5A)中显示了来自一只实验动物(处理前和后)的代表性结果。这些图像举例说明甲磺酸伊马替尼的处理可降低该动物中的肿瘤大小。现在参考图5B，其以图的形式绘制了12只实验小鼠的一个群体的坐骨神经区域ROI的PET成像结果的总结。总体上，用甲磺酸伊马替尼处理的小鼠在处理后FDG-PET的摄取有平均50％的降低(p<0.035)。
相反地，与Krox20；Nf1flox/-小鼠的丛状神经纤维瘤中观察到的累积FDG摄取(作为时间的函数)相比，用PBS处理的群体的肿瘤的代谢活性在FDG摄取率上具有中度但非显著的增加。
4)中FDG摄取定性地降低。为了对所有处理动物的FDG-PET强度进行谨慎定量，在每个动物中用标准化目标区域(ROI)来精确定量FDG摄取值(mCi/ml组织)。使用圆柱体形的三维ROI来封闭具有ROI圆柱的脊柱旁区域，并在所有情况下使用从L1至S的特定脊椎位置标记来确保一致性。在区域7-8(图5A)中显示了来自一只实验动物(处理前和后)的代表性结果。这些图像举例说明甲磺酸伊马替尼的处理可降低该动物中的肿瘤大小。现在参考图5B，其以图的形式绘制了12只实验小鼠的一个群体的坐骨神经区域ROI的PET成像结果的总结。总体上，用甲磺酸伊马替尼处理的小鼠在处理后FDG-PET的摄取有平均50％的降低(p<0.035)。
相反地，与Krox20；Nf1flox/-小鼠的丛状神经纤维瘤中观察到的累积FDG摄取(作为时间的函数)相比，用PBS处理的群体的肿瘤的代谢活性在FDG摄取率上具有中度但非显著的增加。
[0128] 为了确定代谢活性(FDG摄取)的变化是否直接与肿瘤的组织变化相关，处死已成像的群体，检查脊髓，并制备切片以进行组织学评估。
[0129] 现在参考图5C中用载体安慰剂或甲磺酸伊马替尼处理的Krox20；Nf1flox/-小鼠(在载体对照中n＝28，在gleevec处理组中n＝28)的所有坐骨神经中背根神经节的平均体积。实线表示各组的平均体积。每个符号表示单个神经的体积。在处死后，我们还比较了相当年龄的Krox20；Nf1flox/flox小鼠群体的所有背根神经节的体积。与FDG-PET成像研究一致，与PBS处理组相比，甲磺酸伊马替尼处理组中背根神经节的体积有明显的降低。
[0130] 还进行了甲磺酸伊马替尼或PBS处理的小鼠的背根神经节和近端周围神经的组织学评估。现在参考图5D，显示了在H&E染色、阿尔新蓝染色和Masson三色法染色后的典型切片。在图的左侧标明了实验治疗、制备标本所用的染料。在图的底部显示了每列区域的图片放大倍数。如在列首标明的，区域1-6中显示的样本获取自甲磺酸伊马替尼处理的小鼠；区域7-12中显示的样本获取自仅用安慰剂处理的小鼠。区域10中的箭头指出了在各切片中发现的肥大细胞。定性来看，与甲磺酸伊马替尼处理的小鼠相比，从用安慰剂处理的小鼠中采集的神经存在明显的正常神经构造的破坏和细胞结构的增加。这在显示末端背根和近端神经片段的组织切片中进行了说明(图5D，区域1-6，与区域7-12相比)。进一步地，与PBS处理的对照相比，由用甲磺酸伊马替尼处理的小鼠中剖离的神经中肥大细胞的数目有显著的降低(图5D，区域3、4，与区域9、10比较)。总之，PET、粗略的解剖数据和组织学数据确认了甲磺flox/-酸伊马替尼有降低Krox20；Nf1 小鼠的肿瘤体积的潜力。
[0131] 现在参考图5E，其为说明伊马替尼处理的小鼠和未用该化合物处理的小鼠之间肥大细胞数目的显著差异的柱形图。现在参考图5F，其为说明从甲磺酸伊马替尼处理的小鼠中获取的样本与从未用该化合物处理的小鼠中获取的样本相比，样本中存在更少的Tunnel阳性细胞/HPF的柱形图。
[0132] 我们的小鼠模型的一个限制是动物的寿命短。因此我们不能基于我们的小鼠研究来预测存活肿瘤预计会应答多久。可以相信经过一段时间，肿瘤细胞可自然产生另外的特性，使其不再依赖于特定的早期旁分泌事件(如肥大细胞-施万细胞相互作用)。
[0133] 实验5
[0134] 特别使用甲磺酸伊马替尼治疗患丛状神经纤维瘤的儿童
[0135] 丛状神经纤维瘤主要发生于患NF1的婴儿和幼龄儿童中，所述NF1的常见特征为快速生长和侵入邻近器官(常导致正常器官功能的损伤)。此外，这些肿瘤有很大的可能会发展为无法治愈的恶性肿瘤。甚至当为良性时，这些肿瘤也可威胁生命并带来重大临床挑战，因为手术治疗的作用有限并且没有广泛可接受的替代疗法。具有典型NF1临床特征的3岁儿童，有大的三叉神经丛状神经纤维瘤，因危及生命的气道压迫(airway compression)而送至儿科肿瘤门诊。基于我们目前在该病症和相关病症的小鼠模型中的研究，主治医生对该儿童施用了350mg/m2/剂的甲磺酸伊马替尼用于有限的试验。
[0136] 现在参考图6，在患有丛状神经纤维瘤的代表性患者(index patient)中评价甲磺酸伊马替尼的效力。在两个区域中都用粗深色线描出了肿瘤的边缘。患有丛状神经纤维瘤的NF1患者在利用甲磺酸伊马替尼处理之前(区域1)和处理3个月后(区域2)的头部和口咽的矢面MRI扫描。在处理之前和处理3个月后的MRI扫描显示了肿瘤体积有显著的约70％的减少(图6)。在治疗6个月后并未观察到副作用的情况下，患者6个月未进行治疗且无症状复发。
[0137] 现在参考图13A。A、B行的区域为冠状MRI T1加权STIR序列图像；分别为用甲磺酸伊马替尼处理前(A行)和用甲磺酸伊马替尼处理6个月后(B行)。这些图像显示了处理之前和之后肿瘤大小的显著降低的证据。
[0138] 现在参考图13B，在两个系列的图像中，可注意到相对于甲磺酸伊马替尼处理后(D行中的图像)，在甲磺酸伊马替尼处理前的图像(C行)中上部气道(箭头)因肿瘤明显变窄并向右移动。在用甲磺酸伊马替尼处理后获取的图像中显示，气道显著增大并返回中线。已标明了各图像中肿瘤的区域。
[0139] 有明显证据证明用化合物甲磺酸伊马替尼作为药物介入人中可导致丛状神经纤维瘤大小的显著降低。尽管这只反映了单个患者的过程，但该显著结果与小鼠模型中的临床前研究相符。
[0140] 本发明还具体涉及以下实施方案：
[0141] 1.一种治疗丛状神经纤维瘤的方法，包括以下步骤：
[0142] 提供至少一种治疗有效剂量的式1化合物：
[0143]
[0144] 或具有至少一个成盐基团的该化合物的盐，
[0145] 其中，
[0146] R1为4-吡嗪基；1-甲基-1H-吡咯基；氨基取代的或氨基-低级烷基取代的苯基，其中在每种情况下所述氨基为游离的、烷基化的或酰化的；键合在五元环碳原子上的1H-吲哚基或1H-咪唑基；或者键合在环碳原子上的吡啶基，其未被取代或被低级烷基取代，并且所述氮原子被氧取代或未被取代；
[0147] R2和R3各自独立地为氢或低级烷基；
[0148] 基团R4、R5、R6、R7和R8中的一个或两个各自为硝基、氟取代的低级烷氧基或式II基团
[0149] -N(R9)-C(＝X)-(Y)n-R10 (II)；
[0150] 其中，
[0151] R9为氢或低级烷基，
[0152] X为氧、硫、亚氨、N-低级烷基-亚氨、肟或O-低级烷基-肟，
[0153] Y为氧或NH基团，
[0154] n为0或1，并且
[0155] R10为含至少5个碳原子的脂肪族基团，或芳族、芳族-脂肪族、脂环族、脂环族-脂肪族、杂环或杂环-脂肪族基团，
[0156] 并且其余基团R4、R5、R6、R7和R8各自独立地为氢，未取代或被以下基团取代的低级烷基：游离的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基或吗啉基；或者为低级烷酰基，三氟甲基，游离、醚化或酯化的羟基，游离、烷基化或酰化的氨基，或者游离或酯化的羧基。
[0157] 2.实施方案1的方法，其中所述化合物为式1的可药用盐。
[0158] 3.实施方案2的方法，其中所述式1的可药用盐为甲磺酸盐。
[0159] 4.实施方案1的方法，还包括以下步骤：
[0160] 诊断患有丛状神经纤维瘤或类似病症的患者。
[0161] 5.实施方案1的方法，还包括以下步骤：
[0162] 鉴定有发生丛状神经纤维瘤或类似病症之风险的患者。
[0163] 6.实施方案1的方法，其中所述式1化合物的治疗有效剂量为约200mg至约500mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
[0164] 7.实施方案1的方法，其中所述式1化合物的治疗有效剂量为约350mg至约450mg的，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
[0165] 8.实施方案1的方法，其中所述式1化合物的治疗有效剂量为约400mg，且所述剂量的化合物每日2次施用给患者。
[0166] 9.一种治疗丛状神经纤维瘤的方法，包括以下步骤：
[0167] 提供至少一种治疗有效剂量的式2化合物：
[0168]
[0169] 10.实施方案9的方法，其中所述化合物为式2的可药用盐。
[0170] 11.实施方案9的方法，还包括以下步骤：
[0171] 诊断患有丛状神经纤维瘤或类似病症的患者。
[0172] 12.实施方案9的方法，还包括以下步骤：
[0173] 鉴定有发生丛状神经纤维瘤或类似病症之风险的患者。
[0174] 13.实施方案9的方法，其中所述式2化合物的治疗有效剂量为约200mg至约500mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
[0175] 14.实施方案9的方法，其中所述式2化合物的治疗有效剂量为约350mg至约450mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
[0176] 15.实施方案9的方法，其中所述式2化合物的治疗有效剂量为约400mg，且所述剂量的化合物每日2次施用给患者。
[0177] 16.一种治疗丛状神经纤维瘤的方法，包括以下步骤：
[0178] 提供至少一种治疗有效剂量的式3化合物：
[0179]
[0180] 17.实施方案16的方法，还包括以下步骤：
[0181] 诊断患有丛状神经纤维瘤或类似病症的患者。
[0182] 18.实施方案16的方法，还包括以下步骤：
[0183] 鉴定有发生丛状神经纤维瘤或类似病症之风险的患者。
[0184] 19.实施方案16的方法，其中所述式3化合物的治疗有效剂量为约200mg至约500mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
[0185] 20.实施方案16的方法，其中所述式3化合物的治疗有效剂量为约350mg至约450mg，且所述剂量的化合物每日至少1次施用给患者。
[0186] 21.实施方案16的方法，其中所述式3化合物的治疗有效剂量为约400mg，且所述剂量的化合物每日2次施用给患者。
[0187] 尽管已经在上文中公开了整合有多个方面原则的示例性实施方案，但本发明不受所公开实施方案的限制。相反，本申请旨在涵盖采用本文中所公开的一般原则的公开信息的任何变化形式、用途或改变。进一步地，本申请旨在涵盖与本文公开内容偏移的以下内容：在本发明相关领域内已知或惯常采用的，以及落入所附实施方案及其等价方案的限制之内的。
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