携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗及其应用
阅读：1011发布：2020-08-14
专利汇可以提供携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 疫苗 制备领域，公开了一种携带EB核 抗原 1基因 片段 的重组腺病毒疫苗，该重组腺病毒疫苗是由EB核抗原1基因片段插入到腺病毒载体构建而成；该EB核抗原1基因片段编码EB核抗原1的C端 氨 基酸序列。本发明的疫苗可用于癌症的 预防 和 治疗 。，下面是携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗及其应用专利的具体信息内容。
1.一种携带EB核抗原1基因片段的重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述重组腺病毒疫苗是由EB核抗原1基因片段插入到腺病毒载体构建而成。
2.如权利要求1所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原1基因片段编码EB核抗原1的C端氨基酸序列。
3.如权利要求1-2任其一所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原1基因片段的核苷酸序列为939bp。
4.如权利要求1-3任其一所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原1基因片段的核苷酸序列如序列1所示。
5.如权利要求1-4任其一所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒载体为复制缺陷型。
6.如权利要求5所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒载体是利用Admax系统构建。
7.权利要求1-6所述的重组腺病毒疫苗在制备治疗或预防EBV相关疾病的药物中的应用；所述EBV相关疾病优选鼻咽癌。
8.一种组合物，其中含有权利要求1-6任其一所述的重组腺病毒疫苗和一种或多种药物学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。
9.一种活化的细胞毒性T淋巴细胞，该细胞是利用权利要求1-6任其一所述的重组腺病毒疫苗刺激细胞毒性T淋巴细胞使其活化得到的。
10.权利要求9所述的活化的细胞毒性T淋巴细胞在制备用于过继性治疗药物中的用途。
携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗及其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及疫苗制备领域。具体而言，本发明涉及携带携带EB病毒核抗原1疫苗。更具体地说，本发明涉及经所述的携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗以及与其他疫苗联合应用。
[0003]
背景技术
[0004] 世界卫生组织下属的国际癌症研究机构提供的新数据显示，2012年全球新增约1410万例恶性肿瘤病例，死亡人数达820万。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)在各种恶性肿瘤中具有独特的流行病学特征，在世界上大多数国家很罕见，发病率在1/100
000以下。而在我国南方很常见，严重危害人民的生命和健康，尤其是我国的广东、广西一些地区；大部分鼻咽癌发生在45~54岁年龄组，严重影响劳动力健康。鼻咽癌发病率在肿瘤中位于第一、二位，被称为“广东癌”。
000以下。而在我国南方很常见，严重危害人民的生命和健康，尤其是我国的广东、广西一些地区；大部分鼻咽癌发生在45~54岁年龄组，严重影响劳动力健康。鼻咽癌发病率在肿瘤中位于第一、二位，被称为“广东癌”。
[0005] 鼻咽癌是一种起源于鼻咽部上皮组织的常见恶性肿瘤。目前，放射治疗是鼻咽癌首选的治疗方案，按照分层综合治疗原则，多数早期病例采用单纯放射治疗，少数放射敏感性差的肿瘤和晚期病例可加辅助化疗或增敏剂等，以提高疗效。但中晚期鼻咽癌治疗后常常复发或向远处转移，对于该类患者在临床上尚无有效治疗方案。
[0006] EB病毒和鼻咽癌密切相关，而且有一致性。EB病毒抗体，尤其是IgA/VCA抗体，在鼻咽癌患者中明显高于对照组；肿瘤存在与消退与抗体滴度呈正相关，而与患者所在地理位置和种族差别无关；在未分化和高分化的鼻咽癌中能恒定地发现EB病毒基因组和EB病毒相关抗原；EB病毒含有能使B淋巴细胞、猴肾和人类上皮细胞发生转化和不断增殖的基因；咽部正常细胞膜和鼻咽癌细胞均有EB病毒受体的存在。虽然病毒能进入咽部正常上皮细胞内，而且肿瘤中也存在病毒基因组，但病毒在鼻咽癌发生中的作用机制还未被证实。
[0007] 病毒在活体内的感染是一个复杂的过程，包括病毒的潜伏、活化、转化复制等。鼻咽癌患者的肿瘤组织以及外周血淋巴细胞中存在着EB病毒潜伏感染。在已分化和未分化上皮细胞中可发现EB病毒基因组和潜伏基因产物；所有鼻咽癌都表达EB病毒编码的潜伏蛋白和EBNA1。EB病毒所表达的潜伏抗原中，LMP1被认为在鼻咽癌发生中起关键性作用，它可以诱发细胞增生并影响细胞生长调控机制，被认为是EB病毒的一个致癌基因。NPC患者的血清中存在EBV特异性的IgA/VCA抗体，在NPC组织中存在EBV核酸和基因的表达。在NPC患者血清中发现了EBV DNA 的增殖。这些结果引导人们将EB病毒基因作为EBV相关肿瘤的特异性免疫靶抗原。
[0008] EB病毒主要通过唾液传播，世界上大多数人都感染了EB病毒，一旦感染终身携带。但多数人安然无恙，仅有少数个体发展成为NPC，显然EBV特异性细胞免疫在控制病毒、防止肿瘤发生中起到了重要的作用。同时有特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），它控制EB病毒转化的B淋巴细胞，这种特异性的细胞免疫是受HLA所限制的。并发现具有这种特异活性的T细胞识别表位。近年来，经过研究和详细分析已证明LMP1、LMP2均能诱发特异性CTL反应。细胞免疫在对病毒活化的“监视”和清除转化的B细胞中起着关键性作用。
[0009] NPC细胞的EBV抗原表达主要局限在EBNA1和LMP1、LMP2上。LMP1作为EBV重要的致瘤蛋白，在许多EBV相关疾病中扮演重要的角色，是EB病毒细胞免疫反应的刺激剂和靶抗原，尤其是N段的蛋白区域，提供了EB病毒诱导的特异性细胞毒性杀伤反应的靶抗原，在早前就有证实LMP1蛋白序列中有特异性CTL识别表位，具有激发细胞免疫的能力，但该基因具有潜在的致癌性。LMP2也是在NPC等EBV相关肿瘤中持续表达的病毒蛋白之一。LMP2不引起B淋巴细胞的转化，无致癌性。并且LMP2蛋白序列中存在多个可被人CTL识别的抗原表位，不同的人HLA分型识别不同的抗原表位，而且LMP2也能刺激转基因小鼠细胞系的CTL反应。国际上已经用LMP2作为治疗性疫苗，用于NPC的临床试验。我们科室构建的包含该基因的重组腺病毒疫苗已经完成临床Ⅰ期试验，并申报临床Ⅱ、Ⅲ期试验。构建的痘苗病毒疫苗，正处于临床前的药效学实验阶段。
[0010] EBNA1蛋白中包含一段甘氨酸-丙氨酸重复区(Gly-Ala repeat region)，具有阻+止EBNA1全长蛋白的降解，抑制其递呈给CD8T细胞的作用，这种潜在的免疫抑制作用限制了其在EBV相关肿瘤免疫治疗中的应用，尤其限制了伯尔基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）的CTL治疗。
[0011] EBV核抗原1(EB nuclear antigen1，EBNA1)是在NPC组织细胞中有限表达的几种抗原之一，也是唯一在EBV潜伏感染和活化状态中均表达的抗原。早期研究显示：EBNA1表达产物为DNA结合蛋白，是EB病毒在肿瘤细胞中维持潜伏感染状态及DNA复制的关键因子，是重要的致细胞转化蛋白，同时，可以诱导体液免疫应答，在NPC病人中可以检测到＋IgG/ENBA1和IgA/EBNA1抗体。近年研究发现EBNA1蛋白序列中含有的CD4 T细胞表位，＋
在特异性的CD4 T细胞介导的细胞免疫反应中起重要的调节作用。
在特异性的CD4 T细胞介导的细胞免疫反应中起重要的调节作用。
[0012] EBNA1由EBV BamHIK基因编码，长1923bp，无内含子，编码641个氨基酸。依据EBNA1氨基酸序列特点将其分成3部分，N端(1-89)：由89个氨基酸组成；G-Ar重复序列(90-327)：由多个“甘氨酸和丙氨酸”组成的重复序列；C端(328-641)：含有多个CD4T细胞识别表位。其中1-89位和322-379位氨基酸残基，互相协调共同介导病毒基因组以附加体的形式连接细胞染色体上并持续存在。
[0013] 近年研究发现EBNA1 C-末端(380-641位氨基酸)具有明显特异性CD4＋T细胞表位，对比而言很少能看到针对于潜伏膜蛋白(LMP1、2)表位的反应(EBNA1、EBNA3C＞＞LMP1和LMP2)。在我国鼻咽癌高危人群中EBNA1多肽表位明显集中在EBNA1的C-末端区域，包括DP5-限制性多肽表位，被近一半的检测志愿者所识别，引起DP5-阳性靶细胞对EBNA1的识[27]别 。文献报道，在EBNA1中可能有28条CD4 T细胞识别表位，而目前能够确定的只有10＋
条(DP3，DP5，DQ2，DQ7，DR1，DR7，DR11，DR14，DR15，DR103)。CD4 T细胞主要分为两个亚群辅助性T细胞(Th1和Th2)，是抗病毒抗体和CTL产生过程中所必需的辅助细胞，同时产生细胞因子如IFN-γ和TNF等直接发挥抗病毒作用，参与机体的体液免疫和细胞免疫应答。
+
有研究表明，EBNA1的51个重叠多肽 (aa400-641)刺激CD4 特异性记忆T细胞和IFN-γ的释放, 单独的EBNA1多肽不能检测到CTL应答，但对包含有EBNA1 (aa73-487)或EBNA1 (aa494-508)的多聚抗原表位却呈现较强的应答反应。在14例EBV阳性淋巴组织增生性+ [28]
疾病患者中有9例患者可成功产生EBNA1特异性CD8 效应T细胞 。健康人体优先识别+
EBNA1C-末端部分区域(aa452-548)，患者的CD4T细胞对整个C-末端区域(aa400-641)有较广泛的识别作用，人类白细胞DR限制性EBNA1（aa481-500）表位形成部分C-末端螺旋区域。EBNA1(aa458–641)可被CD4-T细胞表位识别，EBNA1(aa401-641)表位的形成也已[29]
被 报道。人类白细胞DR限制性EBNA1(aa514-527)表位来自EBV游离体，该表位形成部+
分ß-片层结构。EBNA1(aa561-573)对特异性CD4T细胞同时具有很高的亲和力，因此该多肽可用于T细胞识别强有力的刺激物并可被HLA-DR11、-DR12或-DR13分子递呈。数据显+ +
示，该多肽优先诱导CD4 调节性T细胞，EBNA1(aa518-530)多肽优先诱导CD4 效应T细胞；
605-641位氨基酸残基的肽段存在一个酸性激活的结构域，该羧基末端具有较强的免疫原+
性：EBNA1(aa607-619)特异性CD4T细胞对MHC-Ⅰ类多肽具有很强的亲和力，可被常见的HLA-DQ2分子递呈。
条(DP3，DP5，DQ2，DQ7，DR1，DR7，DR11，DR14，DR15，DR103)。CD4 T细胞主要分为两个亚群辅助性T细胞(Th1和Th2)，是抗病毒抗体和CTL产生过程中所必需的辅助细胞，同时产生细胞因子如IFN-γ和TNF等直接发挥抗病毒作用，参与机体的体液免疫和细胞免疫应答。
+
有研究表明，EBNA1的51个重叠多肽 (aa400-641)刺激CD4 特异性记忆T细胞和IFN-γ的释放, 单独的EBNA1多肽不能检测到CTL应答，但对包含有EBNA1 (aa73-487)或EBNA1 (aa494-508)的多聚抗原表位却呈现较强的应答反应。在14例EBV阳性淋巴组织增生性+ [28]
疾病患者中有9例患者可成功产生EBNA1特异性CD8 效应T细胞 。健康人体优先识别+
EBNA1C-末端部分区域(aa452-548)，患者的CD4T细胞对整个C-末端区域(aa400-641)有较广泛的识别作用，人类白细胞DR限制性EBNA1（aa481-500）表位形成部分C-末端螺旋区域。EBNA1(aa458–641)可被CD4-T细胞表位识别，EBNA1(aa401-641)表位的形成也已[29]
被 报道。人类白细胞DR限制性EBNA1(aa514-527)表位来自EBV游离体，该表位形成部+
分ß-片层结构。EBNA1(aa561-573)对特异性CD4T细胞同时具有很高的亲和力，因此该多肽可用于T细胞识别强有力的刺激物并可被HLA-DR11、-DR12或-DR13分子递呈。数据显+ +
示，该多肽优先诱导CD4 调节性T细胞，EBNA1(aa518-530)多肽优先诱导CD4 效应T细胞；
605-641位氨基酸残基的肽段存在一个酸性激活的结构域，该羧基末端具有较强的免疫原+
性：EBNA1(aa607-619)特异性CD4T细胞对MHC-Ⅰ类多肽具有很强的亲和力，可被常见的HLA-DQ2分子递呈。
[0014] EBNA1在特异性细胞免疫应答中起重要的作用。在EB病毒感染导致的伯尔基特淋巴瘤细胞中，EBNA1在以附加体形式存在的细胞中呈现明显负调控效应。EBNA1特异性＋ + +CD4 T细胞系，包括CD4 辅助T细胞和调节T细胞，具有双重效应，既可刺激新生 CD4 和 +
CD8T细胞的增殖反应，也可诱导T细胞免疫抑制。在器官移植者中，循环中的EBV特异性＋ ＋ ＋
的CD8 T细胞功能和数量依赖于CD4 T细胞的数量。绝对低的CD4 T细胞数量，大大增加了移植后淋巴细胞增生性疾病风险。一些报道称EBNA1特异性的CD4T细胞在体外能抑制EBV感染的B细胞生长，EBV特异性的CD4+T细胞在T细胞基础上的治疗可能发挥重要的作用。在EBV相关肿瘤中和细胞系中，EBNA1在细胞核中的定位影响CD4+T细胞表位的+
展示，其转录与表达决定EBV阳性肿瘤细胞生长，EBNA1特异性的CD4T细胞识别EBV转化+
B细胞系，翻译效率影响CD8T细胞识别表位的抗原提呈。对NPC的研究，由于NPC细胞仅＋
选择性的稳定表达EBNA1和LMP1、2，因而EBNA1可能在特异性的CD4 T介导的细胞免疫反应中起重要的调节作用。
CD8T细胞的增殖反应，也可诱导T细胞免疫抑制。在器官移植者中，循环中的EBV特异性＋ ＋ ＋
的CD8 T细胞功能和数量依赖于CD4 T细胞的数量。绝对低的CD4 T细胞数量，大大增加了移植后淋巴细胞增生性疾病风险。一些报道称EBNA1特异性的CD4T细胞在体外能抑制EBV感染的B细胞生长，EBV特异性的CD4+T细胞在T细胞基础上的治疗可能发挥重要的作用。在EBV相关肿瘤中和细胞系中，EBNA1在细胞核中的定位影响CD4+T细胞表位的+
展示，其转录与表达决定EBV阳性肿瘤细胞生长，EBNA1特异性的CD4T细胞识别EBV转化+
B细胞系，翻译效率影响CD8T细胞识别表位的抗原提呈。对NPC的研究，由于NPC细胞仅＋
选择性的稳定表达EBNA1和LMP1、2，因而EBNA1可能在特异性的CD4 T介导的细胞免疫反应中起重要的调节作用。
[0015] 鉴于EBNA1在特异性的CD4＋T介导的细胞免疫反应中起重要的作用，目前已经有把EBNA1作为治疗NPC疫苗的报导。Taylor等将EBV的EBNA1的CD4细胞识别表位集中区域(363-641位氨基酸)基因和LMP2全长的全长基因连接起来创建了EL融合基因，构建+ +了重组安卡拉痘苗病毒疫苗人(rMVA-EL)，表达嵌合抗原，以此激活特异性的CD4 和CD8T +
细胞的免疫应答。结果表明在EBV阳性的白人和华人中，rMVA-EL可以激活记忆性CD4 和CD8+T免疫应答。并且，高的免疫剂量激发更强程度的EBNA1/LMP2应答水平。目前rMVA-EL已经在英国和香港完成了Ⅰ期临床试验，正在进行Ⅱ期临床试验。Lutzky VP等利用非复制型的腺病毒5/F35载体(Ad5F35)将LMP1、LMP2和EBNA1氨基酸序列以30个氨基酸长度为一个肽段依次进行分割，相邻肽段之间有15个氨基酸重叠，然后利用计算机软件将各肽段随机串联，拼接成一个全新的蛋白序列，其中LMP1去除11个氨基酸共5个拷贝的重复区，EBNA1去除283个甘氨酸—丙氨酸重复区。然后，根据新蛋白序列合成的6869bp的cDNA，依据密码子偏爱性选择第一或第二密码子，避免重叠氨基酸的编码相同，插入到Ad5F35载体中构建一个新的抗原拼接疫苗(Ad-SAVINE)。实验表明构建的Ad-SAVINE可以激活健康人和鼻咽癌患者的LMP特异性的细胞免疫应答。Smith等用Ad-SAVINE疫苗对复发和转移的NPC患者进行正规临床试验效果评估。在24个参加试验的病人中，16个病人EBV特异性的CTL水平明显升高(72.7%)，6个仅有微小或没有增加。在过继性免疫治疗后，EBNA1和LMP1、LMP2特异性CTL增加的NPC患者出现一度流感样症状或轻微不适。NPC的生存期38~420d，均值136d，同没有接受T细胞的比较，平均生存期从220~523d。结果表明Ad-SAVINE疫苗进行过继性免疫治疗安全性和耐受性良好，可以使NPC患者临床受益。尽管如此，EBNA1对+
于具有CD8T细胞识别表位的LMP2特异性细胞免疫应答的影响，还不清明确。因此，根据EBNA1本身的特性构建质粒，以EBNA1作为一种T细胞治疗肿瘤的有限靶抗原，也是目前研究的新热点，将为EB病毒相关肿瘤的靶向性基因治疗提供一个更新、更有效的途径。
细胞的免疫应答。结果表明在EBV阳性的白人和华人中，rMVA-EL可以激活记忆性CD4 和CD8+T免疫应答。并且，高的免疫剂量激发更强程度的EBNA1/LMP2应答水平。目前rMVA-EL已经在英国和香港完成了Ⅰ期临床试验，正在进行Ⅱ期临床试验。Lutzky VP等利用非复制型的腺病毒5/F35载体(Ad5F35)将LMP1、LMP2和EBNA1氨基酸序列以30个氨基酸长度为一个肽段依次进行分割，相邻肽段之间有15个氨基酸重叠，然后利用计算机软件将各肽段随机串联，拼接成一个全新的蛋白序列，其中LMP1去除11个氨基酸共5个拷贝的重复区，EBNA1去除283个甘氨酸—丙氨酸重复区。然后，根据新蛋白序列合成的6869bp的cDNA，依据密码子偏爱性选择第一或第二密码子，避免重叠氨基酸的编码相同，插入到Ad5F35载体中构建一个新的抗原拼接疫苗(Ad-SAVINE)。实验表明构建的Ad-SAVINE可以激活健康人和鼻咽癌患者的LMP特异性的细胞免疫应答。Smith等用Ad-SAVINE疫苗对复发和转移的NPC患者进行正规临床试验效果评估。在24个参加试验的病人中，16个病人EBV特异性的CTL水平明显升高(72.7%)，6个仅有微小或没有增加。在过继性免疫治疗后，EBNA1和LMP1、LMP2特异性CTL增加的NPC患者出现一度流感样症状或轻微不适。NPC的生存期38~420d，均值136d，同没有接受T细胞的比较，平均生存期从220~523d。结果表明Ad-SAVINE疫苗进行过继性免疫治疗安全性和耐受性良好，可以使NPC患者临床受益。尽管如此，EBNA1对+
于具有CD8T细胞识别表位的LMP2特异性细胞免疫应答的影响，还不清明确。因此，根据EBNA1本身的特性构建质粒，以EBNA1作为一种T细胞治疗肿瘤的有限靶抗原，也是目前研究的新热点，将为EB病毒相关肿瘤的靶向性基因治疗提供一个更新、更有效的途径。
[0016]
发明内容
[0017] 基于本科室在EB病毒相关重组疫苗的研究基础，依据EBNA1基因特异性及腺病毒的广泛应用，我们将构建EBNA1蛋白羧基末端序列939bp重组腺病毒pDC316-EBNA1质粒，使用AdMax包装系统：其包装系统包括pBHG骨架质粒，穿梭质粒，HEK293细胞，通过Cre/LoxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。具体而言，本发明涉及经所述的携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗和与其疫苗联合的疫苗。本发明还提供了携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗的制备方法。
[0018] EB病毒与许多人类肿瘤相关，其中EBV核抗原1(EB nuclear antigen1，EBNA1)是在NPC组织细胞中有限表达的几种抗原之一，也是唯一在EBV潜伏感染和活化状态中均表达的抗原。EBNA1蛋白中含有CD4+T细胞识别表位，但其中也中包含一段甘氨酸-丙氨酸重+复区(Gly-Ala repeat region)，具有阻止EBNA1全长蛋白的降解，抑制其递呈给CD8T细胞的作用，这种潜在的免疫抑制作用限制了其在EBV相关肿瘤免疫治疗中的应用，因此，结合我们在EBV疫苗研究方面的工作，通过基因工程手段改造的EBNA1(去除重复序列)，同时携带该基因的疫苗对其他携带EBV相关基因疫苗细胞免疫应答的起促进作用的部分。
[0019] 本发明的发明人成功构建了一种复制缺陷型的重组腺病毒，该病毒携带外源基因，所述的外源基因编码的蛋白是一种能够很好的引发CTL反应和增强其他特异性的CTL反应的抗原。本发明的具体实施方案中，所述的外源基因为EB病毒核抗原1编码的基因（EBNA1），这种携带有EB病毒核抗原1编码的基因的复制缺陷型重组腺病毒简称10
“rAd-EBNA1或含有EBNA1基因的重组腺病毒。所述的rAd-EBNA1滴度不小于1×10 VP/mL，可在体内诱导EBNA1特异性的抗体生成反应和细胞毒性淋巴细胞反应。本发明的一个
13
优选实施方案中，该重组病毒的滴度为1×10 VP/mL.
本发明的一个优选实施方案中，所述的rAd-EBNA1是利用Admax系统构建的。
“rAd-EBNA1或含有EBNA1基因的重组腺病毒。所述的rAd-EBNA1滴度不小于1×10 VP/mL，可在体内诱导EBNA1特异性的抗体生成反应和细胞毒性淋巴细胞反应。本发明的一个
13
优选实施方案中，该重组病毒的滴度为1×10 VP/mL.
本发明的一个优选实施方案中，所述的rAd-EBNA1是利用Admax系统构建的。
[0020] 简而言之，为了得到本发明所述的rAd-EBNA1，我们首先PCR法扩增B95-8细胞株中EBV ebna1 基因的C-端部分片段，经EcoR I和Bgl Ⅱ酶切位点插入pDC316穿梭质粒。测序比对正确后，与腺病毒骨架质粒pBHG共转染293细胞。收集病变后细胞，获得的重组病毒颗粒。并进一步在293细胞扩增和纯化，获得高纯度病毒。
[0021] PCR扩增获得939 bp ebna1基因片段，通过EcoR I和Bgl Ⅱ酶切位点插入，获得重组穿梭质粒pDC316-EBNA1，测序结果与标准株序列一致。pDC316-EBNA1和骨架质粒pBHG共转染293细胞后，细胞出现病变，获得含EBV ebna1基因片段的重组腺病毒(rAd-EBNA1)。流式细胞术和Western blot检测结果证实，EBNA1在293细胞中表达，电镜下观察到典型
8
的腺病毒颗粒，病毒二代滴度可达10 TCID50/mL。进一步扩增可获得重组病毒的滴度为
13
1×10 VP/mL.
另一方面，本发明提供了携带EBNA1基因的rAd-EBNA1。在一个具体的实施方案中，本发明提供了经本发明所述的rAd-EBNA1。本发明中所述的重组腺病毒是E1、E3基因缺失的TM
非复制型腺病毒5型载体系统—AdMax 系统。腺病毒载体是基因治疗中发展最为成熟的载体系统。具有安全性高、稳定性好、宿主细胞范围广泛、对人致病性低、规模化和商业化程度高、同时表达多个基因等优点。因而已在基因工程疫苗研制和基因治疗中显示出巨大的TM
应用前景。AdMax 腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr.Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，该系统基本原理是通过Cre-loxP重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒。与其他腺病毒包装系统相比，该系统表现出明显的优势，具有出毒速度快（7-10d）、效率高（高约100倍）、可信度高（序列<7-8kb，外源蛋白对腺病毒没有毒性，可以完全表达）、过程简单（仅需构建穿梭质粒和共转染两步）优势。
8
的腺病毒颗粒，病毒二代滴度可达10 TCID50/mL。进一步扩增可获得重组病毒的滴度为
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1×10 VP/mL.
另一方面，本发明提供了携带EBNA1基因的rAd-EBNA1。在一个具体的实施方案中，本发明提供了经本发明所述的rAd-EBNA1。本发明中所述的重组腺病毒是E1、E3基因缺失的TM
非复制型腺病毒5型载体系统—AdMax 系统。腺病毒载体是基因治疗中发展最为成熟的载体系统。具有安全性高、稳定性好、宿主细胞范围广泛、对人致病性低、规模化和商业化程度高、同时表达多个基因等优点。因而已在基因工程疫苗研制和基因治疗中显示出巨大的TM
应用前景。AdMax 腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr.Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，该系统基本原理是通过Cre-loxP重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒。与其他腺病毒包装系统相比，该系统表现出明显的优势，具有出毒速度快（7-10d）、效率高（高约100倍）、可信度高（序列<7-8kb，外源蛋白对腺病毒没有毒性，可以完全表达）、过程简单（仅需构建穿梭质粒和共转染两步）优势。
[0022] 本文中所述的含EBV EBNA1基因片段的rAd-EBNA1疫苗，表达外源基因编码的蛋白抗原。其中所述的外源基因为EBNA1蛋白基因。
[0023] 本文中所述的rAd-EBNA1，表达外源基因编码蛋白复制缺陷型rAd-EBNA1疫苗。
[0024] 另一方面本发明提供的一种制备rAd-EBNA1疫苗的方法包括：（1） 本实验成功从B95-8细胞中获取EBV EBNA1基因片段；
（2） 构建了重组穿梭质粒pDC316-EBNA1；
（3） 在293细胞内包装出重组腺病毒rAd-EBNA1，并表达了EBNA1蛋白。
（2） 构建了重组穿梭质粒pDC316-EBNA1；
（3） 在293细胞内包装出重组腺病毒rAd-EBNA1，并表达了EBNA1蛋白。
[0025] （4） 用如上方法的到rAd-EBNA1疫苗。
[0026] 在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒穿梭质粒是pDC316。
[0027] 在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒骨架质粒是pBHG。
[0028] 在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。
[0029] 试验证明本发明所述的rAd-EBNA1能够在体外激发EBNA1特异性的CTL，同时对LMP2特异性CTL反应起增强作用。
[0030] 本发明所述的rAd-EBNA1疫苗，用于治疗和预防EBV相关肿瘤的疫苗和药物用途。在一个具体的实施方案中所述的疫苗为rAd-EBNA1疫苗，所述的肿瘤为鼻咽癌。
[0031] 根据给药的途径不同，可将本发明的疫苗组合配置成静脉、肌肉内、体腔内、组织内、皮内或皮下给药的可注射溶液或分散剂。
[0032] 为了制备注射溶剂，例如可以使用无菌蒸馏水、注射用水、磷酸缓冲液、以及含有乙醇、多元醇的溶剂或分散介质作为载体或稀释剂。在任何情况下，所述的可注射制剂均应是无菌和可流动并适合于通过注射器注射给药的。
[0033] 也可用于制药工业中已知的方法和辅助成分，将本发明的疫苗组合制成包裹剂。
[0034] 另一方面，本发明提供了所述的疫苗制备用于预防和治疗EB病毒相关肿瘤，特别是鼻咽癌的疫苗或药物应用。
[0036] 图1：ebna1基因片段扩增及回收电泳图；图2：pDC316-EBNA1双酶切、单酶切、pDC316单酶切鉴定；
图3：质粒在293细胞内的重组示意图；
图4：感染rAd-EBNA1后293细胞出现的典型病变(200×)；
图5：rAd-EBNA1 颗粒电镜负染结果(×97 000)；
图6：Western blot鉴定EBNA1表达；
图7：流式细胞仪检测EBNA1在细胞中表达；
图8：ELISPOT法检测小鼠EBNA1特异性细胞免疫反应；
A：免疫后1周EBNA1特异性细胞免疫反应
B：免疫后2周EBNA1特异性细胞免疫反应
C：免疫后4周EBNA1特异性细胞免疫反应
D：免疫后8周EBNA1特异性细胞免疫反应
图9：EBNA1 CD4+T特异性细胞免疫应答持续时间。
图3：质粒在293细胞内的重组示意图；
图4：感染rAd-EBNA1后293细胞出现的典型病变(200×)；
图5：rAd-EBNA1 颗粒电镜负染结果(×97 000)；
图6：Western blot鉴定EBNA1表达；
图7：流式细胞仪检测EBNA1在细胞中表达；
图8：ELISPOT法检测小鼠EBNA1特异性细胞免疫反应；
A：免疫后1周EBNA1特异性细胞免疫反应
B：免疫后2周EBNA1特异性细胞免疫反应
C：免疫后4周EBNA1特异性细胞免疫反应
D：免疫后8周EBNA1特异性细胞免疫反应
图9：EBNA1 CD4+T特异性细胞免疫应答持续时间。
[0037]
具体实施方式
[0039] 实验材料和方法大肠杆菌DH5α、质粒pDC316、pBHG、B95-8、293细胞细胞株为中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所曾毅院士实验室保存。培养条件为含10% FBS、1%青链霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培养液。其中FBS购自美国GIBCO公司、DMEM购自Hyclone公司，其他培养液均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所配液室提供。
[0040] 质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmidega Kits购自德国QIAGEN公司；常用限制性内切酶EcoR I、bgl Ⅱ、核酸凝胶纯化试剂盒、PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；连接酶购自美国NEB公司；真核转染试剂FuGene HD购自美国Promega公司；RPMI1640细胞培养基、DMEM细胞培养基和无菌PBS购自美国HyClone公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司； PVDF膜MultiScreenHTS购自瑞典MABTECH公司；Tris碱(SERVA公司)，硼酸(上海云岭化工厂，AR)，EDTA(Sigma原装)，胰蛋白胨(OXOID公司)，酵母提取物(OXOID公司)，山羊抗小鼠EBNA1单抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG、流式抗体购自中衫金桥生物技术有限公司。其他分析纯化学试剂由中国疾控中心病毒病所提供。
[0041] 实施例11.1. ebna1基因片段的获取
EBV ebna1片段的PCR扩增引物的设计及合成用Primer5.0、DNAstar软件配合设计，由B95-8标准株为模板扩增939 bp(108937-109875)(aa329-aa641)的ebna1基因，具体序列见SEQ NO:1；
c gaggaggcag tggaggccgg
108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga
109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga
109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg
109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccac cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac
109201 caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc
109261 cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc
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在引物上下游分别插入EcoR I、Bgl II酶切位点，以便于克隆基因插入到腺病毒穿梭质粒pDC316中。(引物序列如下：上游5’CGGAATTCATGCGAGGAGGCAGTG3’下游
5’GAAGATCTTCACTCCTGCCCTT3’其中斜体部分分别为EcoR I、Bgl II酶切位点。) PCR反应体系及反应条件如下：10×PCR buffer2.5 μL，dNTP(10 mmol)2 μL，上下游引物20 μM各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，模板1 μL，ddH2O18 μL，共计25 μL反应体系。95℃×4 min，(94℃×30 s，56℃×30 s，72℃×1 min)×30Cycles，72℃ 8 min，4℃储存。同时做阴性对照(阴性模板为高压灭菌水)。
EBV ebna1片段的PCR扩增引物的设计及合成用Primer5.0、DNAstar软件配合设计，由B95-8标准株为模板扩增939 bp(108937-109875)(aa329-aa641)的ebna1基因，具体序列见SEQ NO:1；
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在引物上下游分别插入EcoR I、Bgl II酶切位点，以便于克隆基因插入到腺病毒穿梭质粒pDC316中。(引物序列如下：上游5’CGGAATTCATGCGAGGAGGCAGTG3’下游
5’GAAGATCTTCACTCCTGCCCTT3’其中斜体部分分别为EcoR I、Bgl II酶切位点。) PCR反应体系及反应条件如下：10×PCR buffer2.5 μL，dNTP(10 mmol)2 μL，上下游引物20 μM各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，模板1 μL，ddH2O18 μL，共计25 μL反应体系。95℃×4 min，(94℃×30 s，56℃×30 s，72℃×1 min)×30Cycles，72℃ 8 min，4℃储存。同时做阴性对照(阴性模板为高压灭菌水)。
[0042] 1.2. ebna1基因片段切胶回收将PCR产物10 μL上样，1%琼脂糖凝胶电泳，充分分离后在紫外灯照射下观察是否出现目的条带，切下目的条带，做切胶回收(用试剂盒)。方法如下：按照0.1 g胶加入300 μL QG的比例，50℃10 min，间断混匀2-3次；上清转入QIA quick spin column，12 000 rpm离心1 min；加入PE Buffer 700 μL, 12 000 rpm离心1 min；12 000 rpm 再次离心
1 min；加15 μL ddH2O于纯化柱介质上，静置1 min ; 12 000 rpm离心1 min，收集DNA溶液；3 μL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶观察扩增产物回收的情况，结果见图1。
1 min；加15 μL ddH2O于纯化柱介质上，静置1 min ; 12 000 rpm离心1 min，收集DNA溶液；3 μL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶观察扩增产物回收的情况，结果见图1。
[0043] 1.3. ebna1基因片段及穿梭质粒pDC316双酶切及回收参照限制性内切酶双酶切使用表用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ分别双酶切pDC316、EBV-ebna1 PCR扩增后胶回收片段。双酶切体系是20 μL(DNA/质粒2 μL；
NEBuffer3 μL；EcoR Ⅰ0.5 μL；Bgl Ⅱ0.5 μL，ddH2O 14 μL)，在建议最适温度37℃培养箱中酶切过夜。将酶切产物10 μL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶电泳，充分分离后在紫外灯照射下观察是否出现目的条带，在紫外灯下切胶并使用Qiagen公司的切胶回收试剂盒回收目的片段，具体操作参见相关说明书。3 μL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶观察酶切产物回收的情况。
NEBuffer3 μL；EcoR Ⅰ0.5 μL；Bgl Ⅱ0.5 μL，ddH2O 14 μL)，在建议最适温度37℃培养箱中酶切过夜。将酶切产物10 μL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶电泳，充分分离后在紫外灯照射下观察是否出现目的条带，在紫外灯下切胶并使用Qiagen公司的切胶回收试剂盒回收目的片段，具体操作参见相关说明书。3 μL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶观察酶切产物回收的情况。
[0044] 1.4. ebna1片段和穿梭质粒pDC316的连接回收产物测浓度，连接比例按照载体：目的片段=1:3~6(摩尔比)的比例进行连接。连接体系如下(20 μL)：pDC316 9 μL；EBV-ebna1 4 μL；连接酶1 μL；Buffer 2 μL；H2O
4 μL，16℃连接过夜。
4 μL，16℃连接过夜。
[0045] 1.5. 连接产物转化大肠杆菌DH5α将连接产物加入200 μL DH5α感受态细胞的Eppendorf管中，轻轻旋转混匀，冰浴30 min。将管移入预热的42℃水浴箱中水浴90 s，然后迅速将试管转移到冰上，使细菌冷却
2~3 min。每管加入800 μL不含抗生素的LB培养基，移至37℃摇床上，温育45 min(转速<150 rpm)。取50 μL已转化的感受态细胞，用一支无菌的弯头玻棒轻轻涂到含AMP (100 μg/mL)的琼脂平板表面，将平板平置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养箱中培养12～16 h(同时做阴性对照)。
2~3 min。每管加入800 μL不含抗生素的LB培养基，移至37℃摇床上，温育45 min(转速<150 rpm)。取50 μL已转化的感受态细胞，用一支无菌的弯头玻棒轻轻涂到含AMP (100 μg/mL)的琼脂平板表面，将平板平置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养箱中培养12～16 h(同时做阴性对照)。
[0046] 1.6. pDC316-EBNA1的提取及鉴定挑琼脂平板上的3个单菌落分别于5 mL含Amp(100 μg/mL)的LB培养基中，37℃，220 rpm摇床过夜。用无菌吸头吸取5 μL做PCR反应模板，反应体系与反应条件同目的片段的获取。将PCR鉴定正确的菌液进行质粒的小量制备(用Qiagen质粒提取Kit)，具体步骤参考试剂盒说明书。对提取的质粒进行浓度测定及单、双酶切鉴定，体系10 μL(质粒3 μL；NEBuffer 1 μL；EcoR Ⅰ0.5 μL；Bgl Ⅱ 0.5 μL；ddH2O 5 μL)，37℃水浴/孵育箱4 h，将酶切产物3 μL上样，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。初步鉴定正确后取5 μL送由北京天一辉远生物科技有限公司测序，用以确定扩增过程中是否出现碱基错配以及读框正确。将测序鉴定正确的质粒命名为pDC316-EBNA1。
[0047] 实施例22.1. 穿梭质粒及骨架质粒的提取
包装腺病毒所用质粒的质量与包装的成功率有密切的关系，为此在包装前用EndoFree Plasmid Maxi Kit 提取所需的骨架质粒pBHGLoxΔE1.3Cre，制备方法依试剂盒的操作说明所述。穿梭质粒为上述构建的pDC316-EBNA1。将制备好的质粒溶于试剂盒附带的无菌TE溶液中，用紫外分光光度计测定260 nm/280 nm的OD值，计算核酸纯度(要求OD260/OD280>1.8)及核酸含量，分装保存于-20℃备用。
包装腺病毒所用质粒的质量与包装的成功率有密切的关系，为此在包装前用EndoFree Plasmid Maxi Kit 提取所需的骨架质粒pBHGLoxΔE1.3Cre，制备方法依试剂盒的操作说明所述。穿梭质粒为上述构建的pDC316-EBNA1。将制备好的质粒溶于试剂盒附带的无菌TE溶液中，用紫外分光光度计测定260 nm/280 nm的OD值，计算核酸纯度(要求OD260/OD280>1.8)及核酸含量，分装保存于-20℃备用。
[0048] 2.2. 重组腺病毒rAd-EBNA1的包装本部分研究采用真核表达系统，将B95-8标准株中的基因与腺病毒穿梭质粒载体pDC316连接，构建重组质粒，与骨架质粒pBHG共转染293细胞，包装重组腺病毒，具体方法参考真核转染试剂说明书。用FuGene HD将质粒pDC316-EBNA1与pBHG共转染293细胞，
5
见图3。具体方法为：按照4×10 细胞/孔的量接293细胞到六孔板中，每孔用含2%FBS的DMEM培养基培养。次日细胞达到80%~90%汇合度，按说明书将构建好的骨架质粒与穿梭质粒按照1:3的比例加入100 uL的无抗生素DMEM中，涡旋混匀后静置5 min，再加入6 μLHD转染试剂注意转染试剂在液面下缓慢加入，吹打混匀1~2次，室温静置25 min。再将转染混合物分散缓慢地滴加到待转染的细胞孔中，边加边摇晃，并做一阴性对照。将板子放于
37℃、5% CO2培养箱中孵育7-14 d，注意每天观察细胞的变化，看有无病变或者细菌污染的情况发生，培养基不足时注意补加，此时期是双质粒在293细胞内重组成腺病毒的过程。
5
见图3。具体方法为：按照4×10 细胞/孔的量接293细胞到六孔板中，每孔用含2%FBS的DMEM培养基培养。次日细胞达到80%~90%汇合度，按说明书将构建好的骨架质粒与穿梭质粒按照1:3的比例加入100 uL的无抗生素DMEM中，涡旋混匀后静置5 min，再加入6 μLHD转染试剂注意转染试剂在液面下缓慢加入，吹打混匀1~2次，室温静置25 min。再将转染混合物分散缓慢地滴加到待转染的细胞孔中，边加边摇晃，并做一阴性对照。将板子放于
37℃、5% CO2培养箱中孵育7-14 d，注意每天观察细胞的变化，看有无病变或者细菌污染的情况发生，培养基不足时注意补加，此时期是双质粒在293细胞内重组成腺病毒的过程。
[0049] 2.3. 原代病毒的收获及扩增大约7 d后，加入质粒的细胞开始出现病变(CPE)，再观察1-2 d，待细胞病变明显时，开始收获病毒。将细胞用1 mL无菌Tip头吹下，连同培养基一起移入15 mL Eppendorf管中，用洗液洗细胞两次。注意细胞吹打后不能脱落要加入2 mL胰酶消化，1~2 min后弃胰酶，轻敲培养瓶侧壁使细胞脱落。在-80℃和37℃(水浴)反复冻融3次(使细胞破碎，释放病毒)；3 000 rpm离心10 min，吸取上清，即为原代病毒，命名为rAd-EBNA1,于-80℃保存。取原代病毒2 mL再次感染T75培养瓶中的293细胞，37℃、5%的CO2培养箱中孵育2 h，后补加8 mL新鲜培养基继续培养，代细胞完全病变后，收获病毒,在-80℃和37℃(水浴)反复冻融3次，此为rAd-EBNA1第一代病毒，于-80℃保存。
[0050] 2.4. rAd-EBNA1 DNA和形态鉴定及滴度测定PCR鉴定 在200 μL病毒上清中加入20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，56℃消化蛋白1 h，煮沸10 min，使蛋白酶K失活，10 000 rpm 离心5 min，除去蛋白，此为病毒DNA模板。PCR引物采用构建pDC316-EBNA1的引物，反应体系及程序同目的片段的获取。取5 μL PCR产物加上1 μL的6×加样缓冲液，进行110 V恒压电泳，紫外灯下观察结果。形态观察收集的病毒上清液,磷钨酸负染后于电镜下观察重组腺病毒形态。
[0051] 50%组织培养感染剂量(TCID50)方法测定rAd-EBNA1的滴度 TCID50实验的基础是应用极限稀释法使293细胞出现病变从而估计滴度。本项检测须做两组重复试验，两组试验可在同一天进行,也可在不同天进行。细胞的准备：取用DMEM+5%FBS 预培养的293细胞1个75 cm2方瓶，待细胞生长至80%，收集细胞并用胰酶消化计数。用5%FBS的DMEM制备细胞悬液，每板需要10 mL浓度为1×105个 /mL的细胞悬液，后按每孔100 μL(即1×104 个细胞)加入2个96孔板。
[0052] 制备感染样品：10-5开始连续8个稀释梯度，稀释液用5%FBS的DMEM。按表2-1接种样品：各加100 μL梯度稀释好的样品溶液，盖上第1个板并在37℃，5%CO2培养箱培养。同步骤操作感染第2板。从第3 d到第10 d观察细胞状况，第10 d分析、记录CPE结果：CPE应在10 d之间出现。第10 d在显微镜下观察每孔CPE情况，并与阴性对照的一排对比，记录每排样品的阳性孔数。(如有一个板被污染，试验必须重做)表1 TCID50法检测重组腺病毒滴度
结果计算：在第10 d，1)至少有一个样品稀释液在10个孔内CPE都是明显的。2)至少有一个样品稀释液最少有3个但不多于9个孔内有明显的CPE。3)至少有一个样品稀释液在10个孔内都是明显无CPE。病毒活性计算公式：
1+d(s-0.5)
对于100 μL样品，滴度T=10 。其中d＝Log10稀释度=1(对于10倍的稀释度而言)，s = 阳性比率之和(从第一个10倍稀释度算起)，将IU(TCID50)/mL转换为PFU/mL：
b b-0.7 0.7
T = a×10 IU(TCID50)/mL = a×10 PFU/mL，两次重复试验得到的滴度值应相差≤10 。
结果计算：在第10 d，1)至少有一个样品稀释液在10个孔内CPE都是明显的。2)至少有一个样品稀释液最少有3个但不多于9个孔内有明显的CPE。3)至少有一个样品稀释液在10个孔内都是明显无CPE。病毒活性计算公式：
1+d(s-0.5)
对于100 μL样品，滴度T=10 。其中d＝Log10稀释度=1(对于10倍的稀释度而言)，s = 阳性比率之和(从第一个10倍稀释度算起)，将IU(TCID50)/mL转换为PFU/mL：
b b-0.7 0.7
T = a×10 IU(TCID50)/mL = a×10 PFU/mL，两次重复试验得到的滴度值应相差≤10 。
[0053] 结果判定：病毒活性(TCID50法)应不低于1.65×1010IU/mL。
[0054] 2.5. EBNA1蛋白表达的鉴定western blotting方法鉴定EBNA1的表达 细胞内可溶性蛋白的提取，具体步骤如下：实验前一天，按照4×105细胞的量接种293细胞到T25培养瓶中，用6 mL含有10%FBS的DMEM培养液培养。次日，细胞达到80%~90%汇合度，弃培养基，加入2 mL新鲜培养基和
75 μL二代病毒，37℃的CO2培养箱中孵育2 h，后补加4 mL新鲜培养基继续培养，代细胞完全病变后，提蛋白。具体步骤为：用1 mL移液器将培养瓶中的细胞吹打，分离，1 500 rpm离心5 min，弃上清；用4 mLPBS将沉淀吹打均匀，再离心，弃上清；将管中加入200 μL细胞裂解液+2 μL蛋白酶抑制剂，冰浴10 min；将离心管置于4℃离心机中12 000 rpm，10 min，取上清(提前打开离心机3 000 rpm，30 min，使离心机降温)，在管中加入5×loading buffer30 uL混匀，100℃加热煮沸10 min，即为细胞粗蛋白。置于-80℃保存备用。
75 μL二代病毒，37℃的CO2培养箱中孵育2 h，后补加4 mL新鲜培养基继续培养，代细胞完全病变后，提蛋白。具体步骤为：用1 mL移液器将培养瓶中的细胞吹打，分离，1 500 rpm离心5 min，弃上清；用4 mLPBS将沉淀吹打均匀，再离心，弃上清；将管中加入200 μL细胞裂解液+2 μL蛋白酶抑制剂，冰浴10 min；将离心管置于4℃离心机中12 000 rpm，10 min，取上清(提前打开离心机3 000 rpm，30 min，使离心机降温)，在管中加入5×loading buffer30 uL混匀，100℃加热煮沸10 min，即为细胞粗蛋白。置于-80℃保存备用。
[0055] Western blot方法检测EBNA1的表达(具体方法详见医学分子病毒学实验技术)：制备分离胶及积层胶、凝胶后加样、80V转至110V电泳分离蛋白，后转移蛋白至PVDF膜、将膜置于5%PBS脱脂奶粉中，4℃封闭过夜。加一抗：次日弃封闭液，用PBST洗3次，每次10 min，后加入5%PBS脱脂奶稀释的抗小鼠EBNA1单抗(1:1 000倍)30 mL，37℃摇2 h。加二抗：弃脱脂奶稀释的一抗，用PBST洗3次，每次10 min，后加入5%PBS脱脂奶稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG二抗(1:20 000倍稀释)50 mL，37℃摇1 h。显色：弃二抗，用PBST洗3次，每次10 min，后加入显色液PBS/ddH2O+DAB粉末+70μLH2O2(DAB为二氨基联苯胺)30 mL显色后，用ddH2O终止显色。取出PVDF膜，风干置于封口膜内保存。
[0056] 2.6. 流式细胞术检测EBNA1在细胞内的表达用移液器将感染病毒3 d后未完全病变的293细胞吹下，收集于1.5 mLEP管中，1 500 rpm，5 min，弃上清；用1 mLPBS洗细胞三次，离心、弃上清，在管中加入200微升固定液，室温避光固定20 min，加入含1%FBS的PBS洗涤一次，离心500 g 5 min，弃上清，后加入500 微升1×穿膜洗液重悬细胞，室温孵育15 min，500g离心5 min，弃上清，再加入500微升
1×穿膜洗液洗涤细胞一次，1)加一抗：按说明书建议的浓度加抗EBNA1一抗，同时设置阴性对照，37℃培养箱中孵育2 h；2)加二抗：弃一抗，用PBST洗3次，每次5 min，后加入PBS稀释的FITC标记羊抗小鼠IgG二抗(按照说明书1:20 000倍稀释)37℃孵育1 h。
1×穿膜洗液洗涤细胞一次，1)加一抗：按说明书建议的浓度加抗EBNA1一抗，同时设置阴性对照，37℃培养箱中孵育2 h；2)加二抗：弃一抗，用PBST洗3次，每次5 min，后加入PBS稀释的FITC标记羊抗小鼠IgG二抗(按照说明书1:20 000倍稀释)37℃孵育1 h。
[0057] 试验结果：1.EBNA1基因片段及穿梭质粒pDC316连接后限制性内切酶电泳图谱
对重组质粒pDC316-EBNA1进行双酶切鉴定，用EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切后应得到939 bp、3903 bp大小的两条片段，实验结果与预期结果一致，说明目的片段成功插入穿梭质粒pDC316中，可进行后续试验。质粒限制性内切酶单、双酶切及空载体双酶切分析结果见图
2。
对重组质粒pDC316-EBNA1进行双酶切鉴定，用EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切后应得到939 bp、3903 bp大小的两条片段，实验结果与预期结果一致，说明目的片段成功插入穿梭质粒pDC316中，可进行后续试验。质粒限制性内切酶单、双酶切及空载体双酶切分析结果见图
2。
[0058] 2.重组质粒pDC316-EBNA1的测序鉴定重组质粒pDC316-EBNA1送由北京天一辉远生物科技有限公司测序，测序结果与B95-8标准株对应序列比对完全正确。
[0059] 3.腺病毒rAd-EBNA1的重组结果穿梭质粒与骨架质粒的提取 pDC316-EBNA1穿梭质粒及骨架质粒pBHG用Qiagen质粒提取试剂盒大提，可获得400 ng/uL的pDC316-EBNA1和180 ng/uL的pBHG各1 mL，可进行后续实验。质粒pDC316-EBNA1及骨架质粒pBHG共转染293细胞，一周后，细胞开始出现病变，先是零星细胞肿胀变圆脱落，形成病变斑块，后逐渐成片，最后细胞全部脱落，培养液颜色由粉红色逐渐变橙黄色。质粒在293细胞中的重组示意图及细胞病变图示，见图4所示。
[0060] 4.病毒颗粒电镜观察负染后在电镜下观察到无包膜的20面体的病毒颗粒，直经约在90 nm左右(图5)。病毒的形态大小与腺病毒的参数相符。TCID50法对重组病毒滴度进行测定，病毒二代滴度可达108 TCID50/mL。
[0061] 5.EBNA1蛋白表达的鉴定用SDS-PAGE电泳来检测293细胞病变后EBNA1蛋白表达的情况 用抗EBNA1的小鼠单抗作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗检测EBNA1蛋白的表达。从结果可见约
40 KD的特异性条带，而对照组细胞在相应位置没有看见特异性的条带，见图6。由此证明重组腺病毒rAd-EBNA1能够在293细胞内成功表达。
40 KD的特异性条带，而对照组细胞在相应位置没有看见特异性的条带，见图6。由此证明重组腺病毒rAd-EBNA1能够在293细胞内成功表达。
[0062] 6.流式细胞术法检测重组腺病毒目的基因的表达通过流式细胞仪在可溶性蛋白中检测到EBNA1的表达(图7，C)，而在不加单抗的阴性对照及细胞空白对照中无表达，见图7，A、B。说明在包装细胞293中rAd-EBNA1能够被成功包装和扩增，且能够翻译出EBNA1蛋白。
[0063] 实施例33.1. 小鼠免疫方案
方法：选择4~6周龄雌性Balb/c小鼠，随机分成7组，每组为20只，肌肉注射分组如下：将重组腺病毒疫苗均稀释至108 VP/mL，在0、2周分别胫前肌肉注射稀释的单独及混合的腺病毒rAd-LMP2、rAd-EBNA1，100 μL/只/次，持续饲养观察免疫后第1、2、4和8周分别取小鼠脾脏淋巴细胞做ELISPOT检测重组腺病毒rAd-EBNA1及联合免疫疫苗在Balb/c小鼠体内的应答情况，同时做PBS对照组和rAd-null空病毒对照组。具体免疫分组见表
3-1(注：其中rAd-LMP2即为两针均免疫rAd-LMP2，rAd-EBNA1即为两针均免疫rAd-EBNA1，rAd-LMP2+rAd-EBNA1即为混合疫苗免疫两针；rAd-LMP2、rAd-EBNA1即为第一针免疫rAd-LMP2，第二针免疫rAd-EBNA1；rAd-EBNA1、rAd-LMP2为第一针免疫rAd-EBNA1，第二针免疫rAd-LMP2)。
方法：选择4~6周龄雌性Balb/c小鼠，随机分成7组，每组为20只，肌肉注射分组如下：将重组腺病毒疫苗均稀释至108 VP/mL，在0、2周分别胫前肌肉注射稀释的单独及混合的腺病毒rAd-LMP2、rAd-EBNA1，100 μL/只/次，持续饲养观察免疫后第1、2、4和8周分别取小鼠脾脏淋巴细胞做ELISPOT检测重组腺病毒rAd-EBNA1及联合免疫疫苗在Balb/c小鼠体内的应答情况，同时做PBS对照组和rAd-null空病毒对照组。具体免疫分组见表
3-1(注：其中rAd-LMP2即为两针均免疫rAd-LMP2，rAd-EBNA1即为两针均免疫rAd-EBNA1，rAd-LMP2+rAd-EBNA1即为混合疫苗免疫两针；rAd-LMP2、rAd-EBNA1即为第一针免疫rAd-LMP2，第二针免疫rAd-EBNA1；rAd-EBNA1、rAd-LMP2为第一针免疫rAd-EBNA1，第二针免疫rAd-LMP2)。
[0064] 表 2 免疫小鼠方案Group Sortofvaccine Immunetime(week) Testingtime(week)
1 PBS 0、2nd 1、2nd、4th、8th
2 rAd-null 0、2nd 1、2nd、4th、8th
3 rAd-EBNA1 0、2nd 1、2nd、4th、8th
淋巴细胞的分离：断颈法处死小鼠，70%酒精浸泡小鼠5 min，侧卧暴露出左侧腹部，用镊子夹起左侧腹部皮肤，用剪刀剪开，暴露出腹壁，可见靠近脊柱处腹壁下方有暗红色脏器，即为脾脏，换眼科镊子夹起腹壁，用眼科剪刀将其剪开，取出脾脏。同时准备一无菌平皿，内置一细胞滤网，将新分离的脾脏置于无菌滤网上，在其中加入3~4 mL小鼠淋巴细胞分离液，用无菌注射器塞子底部充分研磨脾脏分散脾细胞。将分散好的细胞悬液转移到15 mL离心管中，并在其上轻轻匀速覆盖一层(1~2 mL)1640培养液，2 200 rpm水平离心30 min。
离心结束后溶液明显分三层，小心吸出中间淋巴细胞层，加入备好的10 mL 1640培养液混匀，1 500 rpm离心10 min后弃上清。所得沉淀细胞用含10%FBS的1640培养液重悬。细胞计数后，按ELISPOT实验用量及浓度配制，剩余用含10%DMSO，90%FBS的冻存液冻存备用。
1 PBS 0、2nd 1、2nd、4th、8th
2 rAd-null 0、2nd 1、2nd、4th、8th
3 rAd-EBNA1 0、2nd 1、2nd、4th、8th
淋巴细胞的分离：断颈法处死小鼠，70%酒精浸泡小鼠5 min，侧卧暴露出左侧腹部，用镊子夹起左侧腹部皮肤，用剪刀剪开，暴露出腹壁，可见靠近脊柱处腹壁下方有暗红色脏器，即为脾脏，换眼科镊子夹起腹壁，用眼科剪刀将其剪开，取出脾脏。同时准备一无菌平皿，内置一细胞滤网，将新分离的脾脏置于无菌滤网上，在其中加入3~4 mL小鼠淋巴细胞分离液，用无菌注射器塞子底部充分研磨脾脏分散脾细胞。将分散好的细胞悬液转移到15 mL离心管中，并在其上轻轻匀速覆盖一层(1~2 mL)1640培养液，2 200 rpm水平离心30 min。
离心结束后溶液明显分三层，小心吸出中间淋巴细胞层，加入备好的10 mL 1640培养液混匀，1 500 rpm离心10 min后弃上清。所得沉淀细胞用含10%FBS的1640培养液重悬。细胞计数后，按ELISPOT实验用量及浓度配制，剩余用含10%DMSO，90%FBS的冻存液冻存备用。
[0065] ELISPOT实验：在实验前一晚预包被ELISPOT板子，每孔100 μL，4℃包被过夜。实验当天倾倒包被液，每孔加入200 μL含10%FBS、1%PS的1640培养液洗一次，后每孔加入200 μL含10%FBS、1%PS的1640培养液作为封闭液，37度封闭2 h。用含10%FBS的1640培养基稀释多肽至终浓度为10 μg/mL,用含10% FBS、1% PS的1640培养液把已重悬的小鼠脾脏淋巴细胞调制终浓度2×106个/mL。取出封闭好的板子，直接倾倒孔中封闭液，用含
10%FBS、1%PS的1640培养液洗一次，在无菌滤纸上拍干。每组每只小鼠设置6个复孔，三孔对照组、三孔实验组，每孔加入100 uL稀释好的细胞悬液。在实验孔加入100 μL相应的稀释好的多肽，在对照孔加入100 uL含10%FBS、1%PS的1640培养液，阳性对照孔中加入
10 uL稀释好的阳性刺激物。每组一定要更换枪头，以避免交叉污染。置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养过夜后，倾倒孔内液体，用室温放置的去离子水洗涤2次，200 μL/孔，每次3~5 min，然后用含0.5‰ Tween-20的PBST溶液洗涤4次，200 μL/孔/次，洗涤后在吸水纸上拍干。用含1% FBS的PBS稀释检测抗体，每孔加入100 μL生物素标记的检测抗体，室温孵育2 h。弃检测抗体，每孔用200 uL含0.5‰Tween-20的PBST溶液洗涤3次，
200 μL/孔/次，洗涤后在吸水纸上拍干。每孔加入100 μL用1% FBS的PBS稀释的酶标链霉亲和素，室温孵育1 h。弃孔内液体，然后用含0.5‰Tween-20的PBST溶液洗涤4次，
200 μL/孔/次，每次1~2 min，后用PBS洗涤2次，200 μL/孔/次，，最后一次将板子倒扣在吸水纸上拍干。每孔加入100 μL临时配制的BD试剂盒配套显色液，室温静置2~60 min，注意避光，待斑点生长到合适大小后，约10 min，弃显色液，用去离子水洗涤2遍，终止显色反应，并将板子倒扣在吸水纸上拍干，放置通风的地方，自然晾干。将ELISPOT板子置于AID ELISpot Reader自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析（注：在斑点计数中，各组斑点数即为实验组斑点数与细胞对照组差值的平均值，负数计数为零）。
10%FBS、1%PS的1640培养液洗一次，在无菌滤纸上拍干。每组每只小鼠设置6个复孔，三孔对照组、三孔实验组，每孔加入100 uL稀释好的细胞悬液。在实验孔加入100 μL相应的稀释好的多肽，在对照孔加入100 uL含10%FBS、1%PS的1640培养液，阳性对照孔中加入
10 uL稀释好的阳性刺激物。每组一定要更换枪头，以避免交叉污染。置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养过夜后，倾倒孔内液体，用室温放置的去离子水洗涤2次，200 μL/孔，每次3~5 min，然后用含0.5‰ Tween-20的PBST溶液洗涤4次，200 μL/孔/次，洗涤后在吸水纸上拍干。用含1% FBS的PBS稀释检测抗体，每孔加入100 μL生物素标记的检测抗体，室温孵育2 h。弃检测抗体，每孔用200 uL含0.5‰Tween-20的PBST溶液洗涤3次，
200 μL/孔/次，洗涤后在吸水纸上拍干。每孔加入100 μL用1% FBS的PBS稀释的酶标链霉亲和素，室温孵育1 h。弃孔内液体，然后用含0.5‰Tween-20的PBST溶液洗涤4次，
200 μL/孔/次，每次1~2 min，后用PBS洗涤2次，200 μL/孔/次，，最后一次将板子倒扣在吸水纸上拍干。每孔加入100 μL临时配制的BD试剂盒配套显色液，室温静置2~60 min，注意避光，待斑点生长到合适大小后，约10 min，弃显色液，用去离子水洗涤2遍，终止显色反应，并将板子倒扣在吸水纸上拍干，放置通风的地方，自然晾干。将ELISPOT板子置于AID ELISpot Reader自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析（注：在斑点计数中，各组斑点数即为实验组斑点数与细胞对照组差值的平均值，负数计数为零）。
[0066] 结果rAd-EBNA1免疫小鼠后细胞免疫反应
根据免疫方案免疫小鼠后第1、2、4和8周分别检测小鼠EBNA1多肽特异性的细胞免疫反应。用EBNA1混合多肽进行刺激，得到结果（见图8）。
根据免疫方案免疫小鼠后第1、2、4和8周分别检测小鼠EBNA1多肽特异性的细胞免疫反应。用EBNA1混合多肽进行刺激，得到结果（见图8）。
[0067] 图8中我们可以看出，相对于PBS组及rAd-null空载体组，rAd-EBNA1免疫的小鼠在第1、2、4和第8周均能检测到明显的细胞免疫反应，不同时间点检测的实验组所诱导的相应特异性细胞免疫应答水平显著高于对照组，且这种差异具有统计学意义（Newman-Keuls检验，P<0.05）。
[0068] EBNA1特异性的细胞免疫应答持续时间通过EBNA1的CD4 T细胞表位多肽刺激，在两次免疫结束后的第1，2，4和8周均检测到EBNA1特异性的细胞免疫应答，第一周接近300点/100万脾脏淋巴细胞，在第二周轻微下降，随后在第四周与第一周接近，实验对照PBS和rAd-null组则没有出现细胞免疫反应。
在免疫后随着时间的延长而逐渐升高（图9）。统计学分析结果表明：rAd-ebna1组与对照组比较每个检测点都有显著性差异，细胞免疫应答持续的时间与对照组比较也具有显著性差异。
在探讨上述rAd-EBNA1的应用过程中，我们首先使用小鼠的脾脏淋巴细胞，模拟人的
8
疫苗模式，进行了初步试验。以2×10VP/只剂量，将rAd-EBNA1免疫Balb/c小鼠，以PBS组和空病毒(rAd-null)组做为实验对照组。免疫结束后的第1、2、4和8周检测小鼠体内特异性细胞免疫应答的水平。结果：rAd-EBNA1免疫小鼠能激发特异性细胞免疫应答。
在免疫后随着时间的延长而逐渐升高（图9）。统计学分析结果表明：rAd-ebna1组与对照组比较每个检测点都有显著性差异，细胞免疫应答持续的时间与对照组比较也具有显著性差异。
在探讨上述rAd-EBNA1的应用过程中，我们首先使用小鼠的脾脏淋巴细胞，模拟人的
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疫苗模式，进行了初步试验。以2×10VP/只剂量，将rAd-EBNA1免疫Balb/c小鼠，以PBS组和空病毒(rAd-null)组做为实验对照组。免疫结束后的第1、2、4和8周检测小鼠体内特异性细胞免疫应答的水平。结果：rAd-EBNA1免疫小鼠能激发特异性细胞免疫应答。
[0069] 为了探讨EBNA1对LMP2特异性细胞免疫应答的影响，将rAd-EBNA1、rAd-LMP2单联合免疫Balb/c小鼠，以PBS组和空病毒(rAd-null)组做为实验对照组。免疫结束后的第1、2、4和8周检测小鼠体内特异性细胞免疫应答的水平。结果：rAd-EBNA1和rAd-LMP2联合免疫时，不同的免疫顺序所诱导的细胞免疫应答水平不同。第一针免疫rAd-LMP2，第二针免疫rAd-EBNA1组合，诱导的LMP2特异性细胞应答水平高于单独免疫rAd-LMP2和其他联合免疫组合；而同时免疫rAd-LMP2、rAd-EBNA1组合，则低于单独免疫rAd-LMP2。
[0070] 总之，我们的实验结果表明：含EBV EBNA1基因片段的重组腺病毒疫苗rAd-EBNA1被成功构建，与rAd-LMP2单独及联合免疫小鼠，能诱发EBNA1和LMP2特异性细胞免疫反应。rAd-LMP2和rAd-EBNA1联合免疫小鼠后，EBNA1对LMP2细胞免疫应答起着正、负双重调节作用。因此，本发明所述的rAd-EBNA1能够在体外激发EBNA1特异性的CTL，同时对LMP2特异性CTL反应起增强作用。可用于治疗EB病毒相关肿瘤，特别是鼻咽癌。
[0071] 最后我们还通过实验得到如下结论：重组腺病毒疫苗rAd-EBNA1、rAd-LMP2均能诱发抗原特异性细胞免疫反应，但前者介导的CD4+T细胞特异性比后者介导的CD8+T细胞特异性在各个时间点检测均弱。两种疫苗单独及联合免疫小鼠后，不同时间点、不同免疫方式诱导的免疫应答水平及两者之间的相互影响不同。相比较而言，第一针免疫rAd-LMP2第二针免疫rAd-EBNA1时，达到的效果更佳，具体试验数据此处并不列举。
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