用于检测单个T细胞受体亲和力和序列的方法和组合物
阅读：575发布：2020-05-17
专利汇可以提供用于检测单个T细胞受体亲和力和序列的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了使用微量移液管粘附试验和成对TCRα/TCRβ测序确定 抗原 特异性T细胞序列和T细胞受体亲和 力 的方法。还提供了通过过继转移高亲和力功能性T细胞 治疗 病毒性感染或癌症的方法。，下面是用于检测单个T细胞受体亲和力和序列的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种测量T细胞受体(TCR)亲和力并获得TCR序列的方法，所述方法包括：
(a)获得抗原特异性T细胞群；
(b)对所述抗原特异性T细胞进行微量移液管粘附试验，从而测量对肽-主要组织相容性复合物(pMHC)的二维(2D)TCR亲和力；和
(c)通过成对TCRα/TCRβ测序对TCR进行测序，从而获得所述TCR的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)包括使用pMHC标签标记的streptamer从T细胞起始群分离抗原特异性T细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述抗原特异性T细胞分离包括：
(a)用pMHC-标签标记的streptamer对所述T细胞起始群进行染色；
(b)对streptamer结合的T细胞进行分选；和
(c)将streptamer从所述T细胞解离，从而获得抗原特异性T细胞群。
4.如权利要求3所述的方法，其中，解离包括在含有生物素的解离缓冲液中孵育
streptamer结合的T细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述生物素的浓度为1mM至15mM。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述解离缓冲液还含有叠氮化钠。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述叠氮化钠的浓度为0.05质量百分比至0.5质量百分比。
8.如权利要求4所述的方法，其中，streptamer结合的T细胞经孵育约15分钟-约90分钟。
9.如权利要求3所述的方法，其中，所述抗原特异性T细胞分离在3℃至5℃进行。
10.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)包括抗原特异性T细胞的体外克隆扩增。
11.如权利要求10所述的方法，其中，体外克隆扩增包括将多克隆T细胞群和载有抗原肽的抗原呈递细胞共培养。
12.如权利要求10所述的方法，其中，体外克隆扩增包括用CD3和CD28激活多克隆T细胞群。
13.如权利要求2所述的方法，其中，所述T细胞起始群获自患者样品或健康血液供体样品。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述患者样品或健康血液供体样品为外周血。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述患者样品包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
16.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗原特异性T细胞群包含CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
17.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗原特异性T细胞群包含少于200个T细胞。
18.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗原特异性T细胞群包含少于100个T细胞。
19.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗原为肿瘤相关自身抗原、肿瘤新抗原或病毒抗原。
20.如权利要求19的方法，其中，所述肿瘤相关自身抗原为tEGFR、Her2、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、FBP、MAGE-A1、MUC1、NY-ESO-1或MART-1。
21.如权利要求19所述的方法，其中，所述病毒抗原为HCV。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述HCV抗原结合HLA-A2KLVALGINAV(SEQ ID NO:
1)。
23.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)之前，所述抗原特异性T细胞群被转移至显微镜腔室。
24.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)包括使所述抗原特异性T细胞与涂覆有激动剂pMHC的血红细胞接触并测量粘附频率。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述接触进行2秒至6秒。
26.如权利要求24所述的方法，其中，所述接触进行3秒至5秒。
27.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括测量TCR和pMHC位点密度。
28.如权利要求27所述的方法，其中，2D亲和力由粘附概率和位点密度计算。
29.如权利要求28所述的方法，还包括估算与2D TCR亲和力测量相关的差异，包括：
(a)通过测量涂覆有抗-TCR抗体的一个血红细胞(RBC)针对多个T细胞的粘附频率来测量T细胞之间TCR位点密度波动的标准偏差；
(b)通过测量一个抗原特异性T细胞针对涂覆有pMHC的多个RBC的粘附频率来测量RBC之间pMHC位点密度波动的标准偏差；和
(c)通过测量涂覆有抗-TCR抗体的一个RBC针对一个T细胞的多个区域的粘附频率，测量一个T细胞的表面上TCR位点密度波动的标准偏差。
30.如权利要求24所述的方法，其中，所述粘附频率介于30％和80％之间。
31.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)包括将所述抗原特异性T细胞通过微量移液管各自单独转移到裂解缓冲液中，用于逆转录、TCRα/TCRβ的PCR扩增和下一代测序。
32.如权利要求31所述的方法，其中，TCRα/TCRβ的PCR扩增包含选自表1和/或表2的引物序列。
33.如权利要求1所述的方法，其中，所述成对TCRα/TCRβ测序对于单个抗原特异性T细胞进行。
34.如权利要求31所述的方法，所述方法还包括根据细胞条码区分读数。
35.如权利要求31所述的方法，所述方法还包括基于序列相似性对读数进行聚类。
36.如权利要求16所述的方法，其中，TCR亲和力和序列与CTL裂解能力关联。
37.如权利要求1所述的方法，其中，在15小时至48小时内获得TCR亲和力并实现TCR序列扩增。
38.如权利要求1所述的方法，其中，在20小时至24小时内获得TCR亲和力经并实现TCR序列扩增。
39.一种监测对象TCR库的方法，所述方法包括根据权利要求1-38任一项所述获得TCR亲和力和序列。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述患者已接受过免疫疗法治疗。
41.如权力要求40所述的方法，其中，所述免疫疗法为单克隆抗体。
42.如权利要求40所述的方法，其中，所述单克隆疗法为伊匹单抗。
43.一种测量对肽-主要组织相容性复合物(pMHC)的二维(2D)TCR亲和力的方法，所述方法包括对抗原特异性T细胞进行微量移液管粘附试验，其中粘附频率介于30％和80％之间。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述粘附频率介于40％和70％之间。
45.如权利要求43所述的方法，其中，所述粘附频率介于60％和70％之间。
46.如权利要求43所述的方法，其中，所述进行包括使所述抗原特异性T细胞与涂覆有激动剂pMHC的血红细胞接触并测量粘附频率。
47.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括测量TCR和pMHC位点密度。
用于检测单个T细胞受体亲和力和序列的方法和组合物
[0003] 创建于2017年4月3日、以“UTFBP1093WO_ST25.txt”命名的32KB(于Microsoft中测量)文件包含序列表，其以电子方式提交并通过引用纳入本文。
背景技术
[0005] 本发明一般涉及免疫学和医学领域。更具体地，其涉及确定T细胞受体亲和力(affinity)和序列的方法。
[0006] 2.背景技术
[0007] 免疫系统产生各自含有独特T细胞受体(TCR)的多种CD8+T细胞库，其识别结合主要组织相容性复合物(pMHC)的特定肽抗原。T细胞受体(TCR)与其配体(结合主要组织相容性复合物(pMHC)的肽)相互作用的亲和力是T细胞区分激动剂配体与部分激动剂和非激动剂配体的重要参数(Davis等,2007)。通过影响TCR信号强度(Huang等,2010)和扩增速率(Zehn等.,2009)，TCR亲和力影响T细胞的功能能力(Aleksic等,2010)和下游命运(King等,+2012)。CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以直接杀灭病原体感染的宿主细胞以及癌症细胞。
因此，在个体内追踪抗原特异性CTL的TCR亲和力的能力可以提供关于免疫应答质量的重要信息，并且为选择用于癌症和持续性病毒感染中过继免疫疗法的最佳T细胞提供重要信息(Restifo等,2012；Heslop等,1996；Nauerth等,2013)。
因此，在个体内追踪抗原特异性CTL的TCR亲和力的能力可以提供关于免疫应答质量的重要信息，并且为选择用于癌症和持续性病毒感染中过继免疫疗法的最佳T细胞提供重要信息(Restifo等,2012；Heslop等,1996；Nauerth等,2013)。
[0008] 尽管TCR亲和力是T细胞概况中重要的参数，但是当前通过等离子体共振(SPR)测量TCR-pMHC亲和力的“金标准”是费力的。SPR需要表达重组可溶TCR蛋白，并且对于分析大的或多克隆TCR库不可行。当前用于原位表征TCR-pMHC动力学的技术对主要人类样品的适应性有限(Nauerth等,2013；Frost等,2015)。这些方法要求高频率(例如，约20％的总T细胞)或高计数(例如，约10,000/μl的抗原特异性CTL)，这两者通常并不可以从人类的单一抽血中获得。这是因为响应大多数表位的抗原特异性CTL以104-107总CTL之一的频率存在(Yu等,2015)。此外，这些方法不能轻易地将TCR生物物理结合参数与其序列联系起来，而这是关于TCR的另一条重要信息。因此，需要用于由少量T细胞分析TCR亲和力和序列的方法。
发明内容
[0009] 本发明的实施方式提供了测量T细胞受体(TCR)亲和力并获得TCR序列的方法，其包括：(a)获得抗原特异性T细胞群；(b)对所述抗原特异性T细胞进行微量移液管粘附试验，从而测量对肽-主要组织相容性复合物(pMHC)的二维(2D)TCR亲和力；和(c)通过成对TCRα/TCRβ测序对所述TCR进行测序，从而获得所述TCR的序列。在某些方面中，抗原特异性T细胞群包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在某些方面中，抗原特异性T细胞群包括少于200个T细胞。在特定方面中，抗原特异性T细胞群包括少于100个T细胞。
[0010] 在一些方面中，步骤(a)包括使用pMHC标签标记的Streptamer由T细胞起始群分离抗原特异性T细胞。在某些方面中，抗原特异性T细胞分离包括：(a)用pMHC-标签标记的Streptamer对所述T细胞起始群染色；(b)分选所述Streptamer结合的T细胞；和(c)将Streptamer从所述T细胞解离，从而获得抗原特异性T细胞群。在一些方面中，分离包括在含有生物素的解离缓冲液中孵育所述Streptamer结合的T细胞。在一些方面中，生物素的浓度为1mM至15mM。在一些方面中，生物素的浓度为1mM至5mM、2mM至7mM、3mM至6mM、4mM至7mM、5mM至9mM、6mM至10mM、7mM至12mM、9mM至11mM、8mM至12mM、10mM至14mM或12mM至15mM。在一些方面中，解离缓冲液还包含叠氮化钠。在一些方面中，叠氮化钠的浓度为0.05质量百分比至0.5质量百分比。在一些方面中，叠氮化钠的浓度为0.05％至0.3％、0.1％至0.4％、0.2％至0.3％、0.3％至0.4％或0.4％至0.5％。在一些方面中，叠氮化钠防止早熟T细胞活化。在某些方面中，孵育T细胞约15分钟至约90分钟。在某些方面中，孵育T细胞15分钟至30分钟、
20分钟至35分钟、40分钟至50分钟、45分钟至60分钟、50分钟至70分钟、60分钟至80分钟或
75分钟至90分钟。在一些方面中，抗原特异性T细胞分离在3℃至5℃进行。在一些方面中，抗原特异性T细胞分离在约4℃。
20分钟至35分钟、40分钟至50分钟、45分钟至60分钟、50分钟至70分钟、60分钟至80分钟或
75分钟至90分钟。在一些方面中，抗原特异性T细胞分离在3℃至5℃进行。在一些方面中，抗原特异性T细胞分离在约4℃。
[0011] 在某些方面中，步骤(a)包括抗原特异性T细胞的体外克隆扩增。在一些方面中，体外克隆扩增包括将多克隆T细胞群和载有抗原肽的抗原呈递细胞共培养。在某些方面中，体外克隆扩增包括用CD3和CD28激活多克隆T细胞群。
[0012] 在一些方面中，所述T细胞起始群获自患者样品或健康血液供体样品。在某些方面中，所述患者样品或健康血液供体样品为外周血。在一些方面中，患者样品包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
[0013] 在某些方面中，所述抗原为肿瘤相关自身抗原、肿瘤新抗原或病毒抗原。例如，所述肿瘤相关自身抗原为tEGFR、Her2、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、FBP、MAGE-A1、MUC1、NY-ESO-1或MART-1。在一些方面中，病毒抗原是HCV。例如，所述HCV抗原结合HLA-A2KLVALGINAV(SEQ ID NO:1)。
[0014] 在一些方面中，在步骤(b)之前，将所述抗原特异性T细胞群转移到显微镜腔室。在某些方面中，步骤(b)包括使所述抗原特异性T细胞与涂覆有激动剂pMHC的血红细胞接触并测量粘附频率。例如，接触为4秒。在一些方面中，粘附频率介于30％至80％之间。在一些方面中，粘附频率介于40％至60％之间。在一些方面中，粘附频率介于50％至70％之间，如介于60％至70％之间。在一些方面中，该方法还包括测量TCR和pMHC位点密度。在某些方面，2D亲和力由粘附概率和位点密度计算。在一些方面中，该方法还包括估算与2D TCR亲和力测量值相关的差异，其包括：(a)通过测量涂覆有抗-TCR抗体的一个血红细胞(RBC)针对多个T细胞的粘附频率来测量T细胞之间TCR位点密度波动的标准偏差；(b)通过测量一个抗原特异性T细胞针对涂覆有pMHC的多个RBC的粘附频率来测量RBC之间pMHC位点密度波动的标准偏差；和(c)通过测量涂覆有抗-TCR抗体的一个RBC针对一个T细胞多个区域的粘附频率来测量一个T细胞的表面上TCR位点密度波动的标准偏差。
[0015] 在某些方面，步骤(c)包括将所述抗原特异性T细胞通过微量移液管各自单独转移到裂解缓冲液中，用于逆转录、PCR扩增TCR和下一代测序。在一些方面中，所述成对TCRα/TCRβ测序对于单个抗原特异性T细胞进行。在一些方面中，该方法还包括根据细胞条码区分读数。在某些方面，方法还包括基于序列相似性对读数进行聚类。在一些方面中，TCR亲和力和序列与CTL裂解能力关联。在一些方面中，在少于48小时内获得TCR亲和力并扩增TCR序列。在某些方面中，在少于24小时内获得TCR亲和力并扩增TCR序列。
[0016] 另一实施方式提供了编码高亲和力功能性TCR的核苷酸，亲和力通过实施方式的方法鉴定。
[0017] 另一实施方式提供了包括实施方式所述的核酸的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是外周血淋巴细胞。在某些方面中，宿主细胞是人细胞。在一些方面中，宿主细胞是T细胞。例如，T细胞为CD4或CD8阳性T细胞。
[0018] 在另一实施方式中，提供了一种包括本文所提供的宿主细胞的药物组合物。
[0019] 其它实施方式提供了一种治疗对象病毒感染的方法，其包括实施方式所述药物组合物的过继T细胞转移。在一些方面中，宿主细胞为HCV-或CMV-特异性T细胞。
[0020] 另一实施方式提供了一种监测对象TCR库的方法，其包括通过本文所提供的方法获得TCR亲和力和序列。在一些方面中，已经用免疫疗法治疗对象。在某些方面中，免疫疗法为单克隆抗体。例如，单克隆疗法为伊匹单抗。
[0021] 在另一实施方式中，本文所提供的是治疗对象癌症的方法，其包括含有本文所提供的宿主细胞的药物组合物的过继T细胞转移。在一些方面，宿主细胞为CTL。在某些实施方式中，宿主细胞对于对象是自体同源的。在一些方面中，该方法还包括过继T细胞转移前对象的淋巴消耗。在一些方面中，该方法包括给予环磷酰胺和/或氟达拉滨。在一些方面，该方法还包括给予至少一种其它治疗剂。例如，该至少一种其它治疗剂为化疗、免疫疗法、手术、放疗或生物疗法。在一些方面中，癌症是膀胱癌，乳腺癌，透明细胞肾癌，头/颈部鳞状细胞癌，肺部鳞状细胞癌，黑色素瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾细胞癌，小-细胞肺癌(SCLC)，三阴性乳腺癌，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性髓性白血病(CML)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，滤泡性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，多发性骨髓瘤(MM)，骨髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)，骨髓增生异常综合征(MDS)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。例如，癌症是黑素瘤。
[0022] 另一实施方式提供了一种测量对肽-主要组织相容性复合物(pMHC)的二维(2D)TCR亲和力的方法，其包括对抗原特异性T细胞进行微量移液管粘附试验，其中粘附频率介于30％和80％之间。在一些方面中，该方法包括使所述抗原特异性T细胞与涂覆有激动剂pMHC血红细胞接触并测量粘附频率。在某些方面中，该方法还包括测量TCR和pMHC位点密度。
[0023] 在一些方面，本公开提供了在对象中评估健康的方法。例如，TCR亲和力分布的测量可以用于评估对象的健康。例如，随着年龄的增加，对HCV肽抗原的TCR亲和力分布偏向于降低T细胞亲和力。因此，在一些方面中，TCR亲和力分布的降低可能表示不健康(例如，老年供体)或针对感染的保护降低。
[0024] 在一些实施方式中，TCR亲和力分布可以用作供体特征。例如，TCR亲和力分布与相同供体内多次血液抽取一致，然而，TCR亲和力分布在不同供体之间可以不同。因此，在一些方面中，TCR亲和力分布可以用作供体的独特特征。
[0025] 本文所述“基本上不含”，就特定成分而言，指所述的特定成分均非有意配制进组合物并且/或者仅作为污染物或以痕量存在。因此，组合物的任何非有意污染所导致的特定成分的总量远小于0.05％，优选小于0.01％。最优选的是其中所述特定成分的量无法使用标准分析方法检测到的组合物。
[0027] 在权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或的定义。”本文中所用的“另一种/个”可指至少第二种/个或更多种/个。
[0028] 在整篇申请中，术语“约”用于表示包括装置，用于测定数值的方法，或存在于研究对象中的差异造成的包括固有误差的固有变动的值。
[0029] 通过以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解的是以下详述和具体实施例以及本发明优选实施方式仅仅是用于举例说明，本领域普通技术人员通过阅读所述详述，可以显而易见地得知本发明精神和范围之内的各种变化和改良。
[0032] 图1A-1C：方法概述。(A)对人血样品富集CD8+streptamer+T细胞，使用流式细胞术分选(B)，然后通过添加过量的生物素进行streptamer解离。(C)使用微量移液管粘附试验对T细胞进行亲和力测试，然后选取T细胞用于成对单细胞TCR测序(D)。
[0033] 图2A-2E：通过iTAST验证单细胞2D亲和力测量。(A)HCV-特异性CTL克隆针对HLA-A2-CD8mut/HCV的粘附曲线。(B)HCV-特异性CTL的TCR表达，及其在streptamer染色和解离后的表达。(C)CTL的TCR表达，所述CTL用表型抗体(CD27、CD45RA、CD57、CXCR3、CD95、CD45RO和CCR7)于室温染色3小时，以模拟单细胞2D亲和力测量的环境。(D)与单细胞2D亲和力测量相关的因子的误差分析。因子I：T细胞之间的TCR位点密度变化，通过使用与针对多个原代CTL的RBC偶联的一个TCR抗体进行评估，各点表示一个T细胞。因子II，TCR位点密度在相同T细胞不同区域的变化，通过使用与针对一个T细胞的不同区域的RBC偶联的一个TCR抗体进行评估，各点表示相同T细胞(两个测试的T细胞)的一个区域。尽管这两个T细胞之间的绝对粘附频率不同，但是一个T细胞的不同区域的变化在这两个T细胞之间相似。因子III，RBC之间的MHC位点密度的变化，通过使用针对涂覆有多个HLA-A2-CD8mut/HCV的RBC的一个HCV-特异性CTL克隆进行评估，各点表示一个RBC。(E)使用从图2D测量的值以不同的粘附频率模拟变化系数。
[0034] 图3A-3C。比较通过iTAST的单细胞2D亲和力与常规2D亲和力和SPR。(A)来自HCV特异性CTL克隆的单细胞2D亲和力与常规2D亲和力的关联(N＝43，线表示log-log线性回归，对斜率进行双尾t-检验)(B)原代CTL和其克隆在被挑选至培养孔中用于体外扩增后的2D亲和力。(C)HLA-A2-CD8mut的6肽变体和天然NY-ESO-1:157-165针对表达于Jurkat细胞系上的1G4TCR的单细胞2D亲和力相对于通过之前公开的SPR研究的3D亲和力(Aleksic等,2010)的关联(N＝7，线表示log-log线性回归，对斜率进行双尾t-检验)。
[0035] 图4A-4D：单细胞2D亲和力与功能性能力的关联。(A)HCV特异性CTL的单细胞2D亲和力相对其裂解能力，以HCV肽脉冲的JY细胞的特异性裂解百分比定义(N＝43，斯皮尔曼(Spearman)双尾检验)。(B)单细胞2D亲和力相对肽功效，以诱导10％细胞裂解所需肽浓度定义(N＝15，线表示log-log线性回归，对斜率进行双尾t-检验)。HLA-A2-CD8mut/HCV四聚体中值荧光强度(MFI)相对(C)裂解能力(斯皮尔曼双尾检验)和(D)肽功效(log-log线性回归，对斜率进行双尾t-检验)。虚线表示四聚体染色中检测的限制。
[0036] 图5A-5D：使用iTAST分析HCV血清反应阴性血液供体中的原代HCV特异性CTL库。(A)来自9个供体的12个HCV血清反应阴性样品内原代多克隆HCV特异性CTL的单细胞2D亲和力分布。数字表示不同的供体，字母表示来自相同供体的不同血液。短线表示中值。2D亲和力通过就4A-B中t-检验的log10转化(N＝63)，5A-C中的ANOVA(N＝54)，和来自供体4和5的合计2D亲和力中的t-检验(N＝117)。在所有情况中使用双尾检验。(B)单细胞2D亲和力与4秒接触形成一个TCR-pMHC键所需pMHC数量之间的关系。(C)图5A各独特供体的中值单细胞2D亲和力。在计算之前将源自相同供体的样品聚集。(N＝9，双尾曼-惠特尼U检测)。(D)图5A中样品4B、5A、6和7的CTL的TCRα和TCRβV-基因使用。
[0037] 图6:原代CD8+T细胞上的非特异性粘附可忽略不计且与pMHC位点密度无关。将具有不同位点密度的HCV-HLA-A*02:01(CD8突变)的血红细胞用于与来自人PBMC的新鲜纯化的CD8+T细胞相互接触以评估背景粘附水平。粘附频率通过平均50个接触以及各接触4秒进行测量。使用HLA-A2抗体测量pMHC位点密度。
[0038] 图7A-B：pMHC的多价性不影响2D亲和力测量。为了排除通过将多个pMHC固定于一个链霉亲和素分子上而引入的多价TCR-pMHC相互作用的可能性，使用通过(A)野生型四价链霉亲和素或(B)突变的二价链霉亲和素捕获的pMHC偶联的血红细胞，将由一个HCV特异性T细胞克隆获得的亲和力测量值进行比较。二价链霉亲和素将代表生物分子相互作用，因为一个结合口袋被血红细胞上的生物素占据，而另一个被pMHC占据。二价和四价链霉亲和素之间的亲和力测量并未观测到区别，这表明野生型链霉亲和素适合用于测量双分子TCR-pMHC相互作用(Huang等,2010)。
[0039] 图8:3个其它CD8+T克隆的2维亲和力动力学曲线。粘附概率(Pa)绘制为接触时间(s)的函数。指示各克隆的TCR亲和力，AcKa。实线为模型拟合。
[0040] 图9:Streptamer染色是完全可逆的。Streptamer可以完全由抗原特异性T细胞表面分离。HCV特异性克隆于4℃在FACS缓冲液(PBS，2％FBS，2mM EDTA，叠氮化钠)中用含有HCV肽的PE标记的streptamer染色(Nauerth等,2013)。然后细胞通过洗涤到含有过量生物素的FACS缓冲液中与streptame分离，并显示与未染色的细胞重叠。
[0041] 图10:与常规四聚体强度相似的streptamer染色。将来自一个样品的CD8富集的细胞一分为二，其中一半用由链霉亲和素制备的常规四聚体染色，而另一半由streptamer染色，两者均针对HCV肽。
[0042] 图11:表型抗原对TCR表达水平没有影响。准确测量2D亲和力的能力需要在亲和力实验期间T细胞受体表达水平维持恒定。尽管在分选后streptamer从T细胞分离，但其它抗体保持连接。为了证明这些抗体的连接不改变TCR表达水平，进行下述实验。将CD8+原代T细胞富集的样品一分为二置于两个条件。对于条件A，用抗体混合物(对CD27、CD45RA、CD57、CXCR3、CD95、CD45RO和CCR7具有特异性)于4℃在FACS缓冲液中对细胞进行30分钟染色，然后将其在室温下置于CTL培养基中3小时以模拟2D亲和力测量，然后用TCR抗体于4℃在FACS缓冲液中进行30分钟染色，然后进行分析。对于条件B，将细胞在4℃下置于FACS缓冲液30分钟，然后将其在室温下置于CTL培养基中3小时，然后在4℃下用条件A中所述抗体混合物和TCR抗体孵育30分钟，然后进行分析。如此，条件A和B在其环境方面以相同的方式处理，除了条件A在CTL培养基中的3小时中具有偶联T细胞的抗体，这代表它们在2D亲和力测试期间的条件。条件A和条件B之间的TCR表达水平并无差异，这意味着给定抗体的染色并不影响2D亲和力测试期间细胞的TCR表达水平。
[0043] 图12A-12D：估算原代T细胞亲和力测量的误差。为了测量原代T细胞2D亲和力计算中的误差，考虑了对测量的粘附频率所有可能的误差来源，Pa：
[0044] σ2＝σ2binom+σ2T细胞-T细胞+σ2T细胞_表面+σ2RBC-RBC
[0045] σbinom表示伯努利(Bernoulli)过程的固有可变性。σT细胞-T细胞表示T细胞之间的TCR位点密度。σT细胞_表面表示跨一个T细胞的表面的TCR位点密度中的变化。σRBC-RBC表示血红细胞(RBC)之间pMHC位点密度中的变化。这些误差为累加的，因为各误差彼此之间相互独立。σT细胞-T细胞变化通过使用涂覆有生物素化TCR抗体的一个RBC分离，并且测量其针对多个原代CD8+T细胞的粘附频率(组A和B中的条件(i))。σT细胞_表面通过测量一个RBC针对一个T细胞在T细胞多个区域的粘附频率而分离，通过在不同位置释放和再吸出T细胞进行(组a和b中的条件(iia,b))。最后，σRBC-RBC通过测量一个HCV特异性T细胞针对涂覆有同源pMHC的多个RBC的粘附频率而分离(组a和b中的条件(iii))。(C)正如TCR-pMHC相互作用，抗-TCR抗体-TCR相互作用也是双分子的。(D)使用测量的差异以各种Pa值模拟2D亲和力变化系数。
[0046] 图13A-13H：分选HCV-streptamer+T细胞的门控策略。由新鲜LRS开始，首先通过ROSETTESEPTM对样品进行CD8+T细胞富集，然后进一步通过磁性富集对抗原特异性T细胞进行富集，然后进行实施例2中列出的过程。该过程处理2个样品；含有大多数抗原特异性CD8+T细胞的富集部分，以及流通物(flow-through)部分。由富集部分开始，首先将门控设为单细胞淋巴细胞(A和B)。在进行分析前添加计数珠以允许计算抗原特异性T细胞频率。尽管富集部分为CD8+T细胞富集样品的亚组，仍然存在少量的其它细胞群。因此，使用利用针对巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、CD4+T细胞和B细胞的标记物的阴性选择对CD8+T细胞进行选择(C)，不添加抗-CD8抗体，因为其倾向于激活T细胞并改变T细胞受体表达水平。在这些实验的大多数中，使用磁性富集过程观察到死细胞的富集，因此，常常使用7-AAD来识别死亡的群体(c)。之后，对抗原特异性T细胞进行门选(D)；门控阈值通过使用来自相同样品的流通物设定，其已经用与富集部分相同的组染色但是不含streptamer标记的细胞(E)。未免疫的抗原特异性T细胞根据CCR7、CD45RA和CD27的阳性表达而分离(F和G)。HCV特异性CD8+T细胞在4种HCV血清反应阴性人样品中的频率(H)如下所示计算：
[0047]
[0048] 总CD8T细胞计数通过使用CD8和TCR抗体测量流通物中的CD8部分确定，并且乘以通过Cellometer的流通物的总活细胞计数。
[0049] 图14A-14B：存在患者年龄和高亲和力T细胞比例的依赖性。(A)根据3名患者的主要2D亲和力，通过对来自年长供体1和2的细胞进行分组并与年轻供体3进行比较来创建列联表。2x105μm4 2D亲和力截止值用于将高和低亲和力分类，因为这代表体外T细胞功能性的阈值(图2C)。在年龄与低和高亲和力T细胞比例之间存在显著的依赖性(p<.005，皮尔森卡方检验(Pearson’s Chi-Squared Test))。(B)4个样品中的HCV特异性CTL频率以及其中未免疫细胞的百分比由CCR7、CD45RA和CD27的阳性表达测定。
[0050] 图15A-15B：来自供体A和B经亲和力测试的细胞的扩增效率。(A)来自供体A和B的TCRα和TCRβ链的扩增效率。(B)在另一实验中，首先将T细胞转移移液管浸入腔室以模拟细胞采集，然后将其浸入裂解培养基(B，左)，或通过转移移液管抽吸2个细胞，注射到一个试管中，然后立即将移液管浸入第二个试管中以测试可能的遗留污染(B，右)。
[0051] 图16A-16C：来自供体A和B的TCRα和TCRβ基因使用。(A、B)TCRα和TCRβ基因在来自具有成功配对的TCRαβ扩增的供体A和B的细胞中的分布。(C)所有CTL和含有TRAV38-2的CTL之间的亲和力范围比较。
[0052] 图17:14个选定的HCV特异性克隆的肽滴定曲线。用CTL培养基(RPMI，10％v/v +FBS，4％v/v人血清，1x盘尼西林-链霉素-两性霉素)洗涤HCV特异性CD8 T细胞克隆3次。JY细胞在CTL培养基中洗涤2次，然后添加10-4-10-12HCV肽，并于37℃孵育4小时，然后在CTL培养基中再洗涤2次。6x104个T细胞在各孔中用6x103个JY细胞孵育，各肽稀释物一式三份。
[0053] 说明性实施方式的描述
[0054] 本公开通过提供用于获得T细胞受体(TCR)对单个T细胞(如CD8+CTL)上肽主要组织相容性复合物(MHC)分子的亲和力的方法克服了当前技术的挑战。本公开还描述了由经亲和力测试的单个T细胞获得成对TCRα/TCRβ序列信息的方法。相应地，本文提及获得抗原特异性T细胞的TCR亲和力和序列的组合方法，作为原位T细胞受体亲和力和序列测试(iTAST)方法。
[0055] 在一方法中，针对CD8+T细胞富集的外周血单核细胞(PBMC)用含有抗原衍生肽的荧光-偶联的MHC I 孵育。MHC I 结合对于给定的抗原具有特异性的T细胞的TCR。使用荧光活化的流式细胞术将经阳性染色的细胞分选进入含有生物素的缓冲液。生物素使streptamer由细胞表面分离，从而允许T细胞的TCR保持游离状和未结合。然后使用微量移液管粘附试验测试分选的T细胞的TCR亲和力，然后使用微量移液管将分选的T细胞转移进入细胞裂解缓冲液中。采集的单个T细胞经裂解并用TCRα/β恒定区域引物逆转录。然后，cDNA通过相同的恒定区域引物和多重可变区域引物扩增。用一对巢式恒定和可变区域引物进一步扩增第一PCR产物，从而提高产物特异性。最后，第三PCR用于连接亿明达(Illumina)测序衔接子，从而构建用于亿明达MiSeq的文库。
[0056] 因此，本公开所提供的方法可以用于探索人对象的抗原特异性T细胞库。已经表明同源MHC的TCR亲和力是T细胞体外和体内功能的强效预测物。此外，本方法可以用于发现TCR亲和力和序列在疾病设定中的免疫应答和克隆选择中亲和力的作用。对于转化研究，本公开的方法可以用于监测健康和患病人患者以及接受药物或生物疗法的人患者中T细胞应答的质量。该方法还可以用于选择具有高亲和力TCR的T细胞用于治疗如过继T细胞转移(ACT)亲和力。
[0057] I.定义
[0058] “治疗”或“处理”指向对象给予或施加治疗剂或在对象上实施方法或疗法以获得疾病的治疗益处或健康相关的状况。例如，治疗可以包括给予T细胞疗法，其包括含有高亲和力TCR的T细胞。
[0060] 本文所述术语“抗体”以最广泛含义使用，并且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要其显示所需的生物活性即可。
[0061] 本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，例如除了可能少量存在的突变如天然产生的突变外，群体包含的单独抗体是相同的。因此，定语"单克隆"表示所述抗体特征为不是离散抗体的混合物。在某些实施方式中，这类单克隆抗体通常包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中结合靶标的多肽序列通过这样的过程获得，所述过程包括从多个多肽序列选择单一靶标结合多肽序列。例如，选择过程可以是从多个克隆(如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库)选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变所选靶标结合序列，例如，改进其对所述靶标的亲和力，将所述靶标结合序列人源化，改进其在细胞培养中的生产，降低其体内的免疫原性，产生多特异性抗体等，并且含有经改变靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。不同于通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制备的优点在于它们通常不被其他免疫球蛋白污染。
[0062] 词组“药学或药理学上可接受的”指分子实体和组合物在恰当地给予动物，例如人时不产生不利、过敏性或其它不良反应。根据本公开，本领域技术人员已知包括抗体或其它活性成分的药物组合物的制备。另外，就动物(如人)给药而言，理解制备应该满足由FDA官方生物学标准要求的无菌性、致热原性、常规安全和纯度标准。
[0063] 本文使用的“药学上可接受载体”包含任何和所有水性溶剂(例如，水，酒精性/水性溶液，盐溶液，肠道外载剂，如氯化钠，林格氏右旋糖等)，非水性溶剂(例如，丙二醇，聚乙二醇，植物油和可注射的有机酯，如乙酸乙酯)，分散介质，包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂或抗真菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，药物，药物稳定剂，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂、甜味剂，调味剂，染料，液体和营养补充剂，诸如此类的物质和其组合，此应为本领域普通技术人员已知。根据已知参数调节药物组合物中各种组分的pH和精确的浓度。
[0064] 本文所用“T细胞”表示这样的淋巴细胞，所述淋巴细胞被维持于胸腺并且具有α:β或γ:δ异二聚体受体。存在Va，νβ，Vy和V8，Ja，Ιβ，Jy和J5，以及 和 基因座。未免疫的T细胞尚未遇到特异性抗原，并且当离开胸腺时T细胞为未免疫的。未免疫的T细胞被鉴定为CD45RO-、CD45RA+和CD62L+。记忆T细胞介导免疫记忆以在其再次暴露于最初诱导其扩增的抗原时快速响应，并且可以是“CD8+”(T细胞毒性细胞)或“CD4+”(T辅助细胞)。记忆CD4T细胞被鉴定为CD4+CD45RO+细胞，而记忆CD8细胞被鉴定为CD8+CD45RO+。
[0065] “T细胞受体”(TCR)指存在于T细胞(或T淋巴细胞)表面的分子(与CD3关联)通常负责识别结合主要组织相溶复合物(MHC)分子的抗原。大部分T细胞中TCR具有高度可变α和β链(也分别称之为TCRα和TCRβ)的二硫键相连异二聚体。在T细胞的一个较小亚组中，TCR由可变γ和δ链(也分别称之为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成。TCR的各链是免疫球蛋超家族的成员，并且具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域，一个免疫球蛋白恒定结构域，跨膜结构域，和在C-末端处的短胞质尾(参见Janeway等,1997)。用于本文的TCR可以从多个动物种类，包括人，小鼠，鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或处于可溶形式。
[0066] 本公开的TCR可以是“免疫特异性的”或能够结合值所需程度，包括“特异性地或选择性地结合”靶标，但不显著地结合存在于测试样品中的其它组分，如果它们以列大于或等3 -1
于约10M 的亲和力或Ka(即，单位为1/M的特定结合相互作用的平衡结合常数)结合靶分子。“高亲和力”TCR指那些具有例如104M-1或更大Ka的TCR。通过iTAST获得的亲和力为2维(2D)亲和力，但是与上述所引用的常规3维(3D)亲和力高度关联(图2F)。因此，2D是3D亲和力的可靠替代。在一些方面，iTAST方法可以用于选择所需亲和力(如高、中或低)的TCR用于过继T细胞疗法。
于约10M 的亲和力或Ka(即，单位为1/M的特定结合相互作用的平衡结合常数)结合靶分子。“高亲和力”TCR指那些具有例如104M-1或更大Ka的TCR。通过iTAST获得的亲和力为2维(2D)亲和力，但是与上述所引用的常规3维(3D)亲和力高度关联(图2F)。因此，2D是3D亲和力的可靠替代。在一些方面，iTAST方法可以用于选择所需亲和力(如高、中或低)的TCR用于过继T细胞疗法。
[0067] “主要组织相容性复合物分子”(MHC分子)指的递送肽抗原至细胞表面的糖蛋白。MHC I型分子未由跨膜a链和非共价结合的β2微球蛋白组成的异二聚体。MHC II型分子包含
2个跨膜糖蛋白α和β，两者都跨膜。各链有2个结构域。MHC I型分子将来源于胞质的肽递送+
至细胞表面，在那里肽:MHC复合物被CD8T细胞识别。MHC II型分子将来源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，在那里它们被CD4+T细胞识别。MHC分子可以来自多个动物种类，包括人，小鼠，大鼠或其他哺乳动物。
2个跨膜糖蛋白α和β，两者都跨膜。各链有2个结构域。MHC I型分子将来源于胞质的肽递送+
至细胞表面，在那里肽:MHC复合物被CD8T细胞识别。MHC II型分子将来源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，在那里它们被CD4+T细胞识别。MHC分子可以来自多个动物种类，包括人，小鼠，大鼠或其他哺乳动物。
[0068] “肽抗原”指被TCR或其结合结构域特异性地识别、长度范围为约7个氨基酸至约25个氨基酸作为抗原的氨基酸序列，并且其可以源自或基于较长靶标生物分子(例如，多肽，蛋白质)或其衍生物的片段。抗原可以表达于细胞表面(在细胞内)或表达为整合膜蛋白。抗原可以是宿主衍生的(例如，肿瘤抗原，自身免疫抗原)或具有外源性来源的(例如，细菌，病毒)。
[0069] “MHC-肽四聚体染色”指用于检测抗原特异性T细胞的试验，其特征是MHC分子的四聚体，各自包括具有这样氨基酸序列的相同的肽，所述氨基酸序列与至少一个抗原同源(例如，相同或相关)，其中复合物能够结合对同源抗原具有特异性的T细胞。每一个MHC分子可以用生物素分子进行标签标记。生物素化MHC/肽通过添加链霉亲和素(其通常是荧光标记的)进行四聚体化。该四聚体可以经由荧光标记通过流式细胞术。
[0070] 本文所用术语“引物”或“寡核苷酸引物”指这样的寡核苷酸，当将其置于引物延伸产物的合成被诱导(即，核苷酸和聚合诱导剂如DNA或RNA聚合物存在的情况)的条件下并处于合适的温度、pH、金属浓度和盐浓度时，所述寡核苷酸与核苷酸的模板链杂交并且开始合成与模板链互补的核酸链。引物通常为在扩增中效率最高的单链，但也可以是双链。如果是双链，引物可以首先经处理以使其链在用于制备延伸产物之前分离。这一变性步骤通常受到热的影响，但是可以任选地使用碱进行，然后中和。因此，“引物”与模板互补，通过氢键或与模板杂交复合形成引物/模板复合物以通过聚合酶启动合成，在DNA或RNA合成过程中在3'端加入与模板互补的共价结合的碱基从而延伸。
[0071] “聚合酶链反应”或“PCR”指通过DNA互补链的同时引物延伸而在体外扩增特定DNA序列的反应。换言之，PCR是用于产生侧接有引物结合位点的靶标核酸的多重拷贝或复制物的反应，所述反应包括如下步骤的一个或多个重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物与引物结合位点退火，和(iii)在三磷酸核苷存在下由核酸聚合酶延伸引物。通常，在热循环仪设备中，通过为各个步骤优化的不同温度循环进行该反应。具体温度、每步持续时间和步骤之间的改变速率取决于本领域普通技术人员熟知的众多因素，例如下述参考文献所述：McPherson等编，PCR:A Practical Approach(《PCR：实践方法》)和PCR2:A Practical Approach(《PCR2：实践方法》)(IRL出版社，牛津，分别出版于1991和1995年)。
[0072] “巢式PCR”指两阶段PCR，其中第一阶段PCR的扩增子成为利用新一组引物进行第二阶段PCR的样品，新引物中至少一个引物结合第一扩增子的内部位置。提到巢式扩增反应时，本文所用的“初始引物”或“第一组引物”指用于产生第一扩增子的引物，而“二级引物”或“第二组引物“指用于产生第二扩增子或巢式扩增子的一种或多种引物。“多重PCR”指在同一反应混合物中同时扩增多种靶序列(或单一靶序列和一种或多种参比序列)的PCR，例如Bernard等，Anal.Biochem.，273:221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，每种待扩增序列使用独特的引物组。
[0073] 术语“条码”指用于鉴定单细胞或细胞亚群的核酸序列。条码序列在扩增期间可以连接感兴趣的靶核酸，并且可以用于将扩增子追溯到靶核酸来源的细胞。条码序列在扩增期间可以通过用引物进行PCR添加至感兴趣的靶核酸，所述引物含有具有条码序列的区域以及与靶核酸互补的区域，从而使得条码序列纳入最终扩增的靶核酸产物(即，扩增子)。条码可以包括在用于PCR以扩增靶核酸的正向引物或反向引物两者之一或两种引物中。
[0074] II.抗原特异性T细胞分离
[0075] 本公开的实施方式涉及获得用于确定TCR亲和力和序列的抗原特异性T细胞群。具体地，本公开涉及具有基本上没有被纯化过程改变的功能状态的基本纯抗原特异性T细胞群，所述纯化过程包括对所需T细胞群进行染色，将染色的T细胞群由含有未染色的T细胞群的样品分离并去除所述染色剂，即纯化前T细胞群的功能状态与纯化后的基本相同。在具体方面，提供这样的T细胞群，所述T细胞群基本上不含用于分离该群体的任何结合试剂，例如，抗体或TCR结合配体如多价TCR结合配体。T细胞可以来自体外培养或生理样品。对于大多数的部分，采用的生理样品将会是血液或淋巴液，但是样品可能也会涉及其它来源的T细胞，特别是其中T细胞可能是侵略性的。因此，感兴趣的其它位点是组织，或相关流体，如在脑、淋巴结、肿瘤、脾、肝、肾、胰腺、扁桃体、胸腺、关节和滑膜中的那些。在先治疗可以涉及去除细胞，其通过各种技术，包括离心，使用Ficoll-Hypaque、淘选、亲和力分离，使用对作为细胞表面上表面膜蛋白存在的一种或多种标记物具有特异性的抗体，或对感兴趣细胞的组或亚组提供富集的任何其他技术。
[0076] A.T细胞起始群
[0077] T细胞的起始群可以获自患者样品或来自健康血液供体。在一些方面，样品为血液样品，如外周血样品。血液样品可以是约1mL至约10mL，如约2mL至8mL，如约5mL。样品可以包括至少500个抗原特异性T细胞，至少250个抗原特异性T细胞，至少100个抗原特异性T细胞或至少50个抗原特异性T细胞。
[0078] 在一些实施方式中，T细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些方面中，细胞是人细胞。细胞一般是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位，和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌概况，和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，如本文所述，并且在冷冻保存前或后将其回输给同一患者。
[0079] T细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群)为未免疫的T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T(TSCM)、中心记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MAIT)细胞、天然产生的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞，和δ/γT细胞。
[0080] 在一些实施方式中，在一种或多种T细胞群中富集或消耗这样的细胞，所述细胞对于特异性标记物如表面标记物呈阳性或对特异性标记物呈阴性。在一些情况中，此类标记物在某些T细胞群(例如，非记忆细胞)上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其它T细胞群(例如，记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些。在一个实施方式中，对所述细胞(例如，CD8+细胞或CD3+细胞)富集(即，正选择)CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L呈阳性或表达高表面水平的CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞，和/或，消耗(例如，负选择)CD45RA阳性或表达高表面水平的CD45RA的细胞。在一些实施方式中，对细胞富集或消耗CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Rα(CD127)阳性细胞或表达高表面水平的CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)的细胞。在一些实例中，对CD8+T细胞富集CD62L和CD45RO阳性(或CD45RA阴性)细胞。
[0081] 在一些实施方式中，通过对非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标记物(例如CD14)进行负选择来从PBMC样品分离T细胞。某些方面，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过针对一种或多种未免疫的、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对高表达的标记物进行正或负选择，可将此类CD4+和CD8+群进一步分选成亚群。
[0082] 在一些实施方式中，T细胞是自体的细胞。在该方法中，肿瘤样品获自患者，并且获得单细胞悬浮液。单细胞悬浮液可以任何合适的方式获得，例如，机械地(使用例如加利福尼亚州奥本的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.)的gentleMACSTM分解剂使肿瘤分解)或酶促地(例如，胶原酶或DNA酶)。将肿瘤酶促消化物的单细胞悬浮液于白细胞介素-2(IL-2)中培养。培养细胞直到铺满(例如，约2×106淋巴细胞)，例如，约10至30天，如约15至约28天。
[0083] 培养的T细胞可以经汇集并快速扩增。快速扩增在约10至约28天的时间段内使抗原特异性T细胞的数量至少增加约50倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90被、100倍、150倍或更大)。具体而言，快速扩增在约10至约28天的时间段内产生至少约200倍(例如，200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更大)的增长。在一些方面中，测量TCR亲和力和/或由T细胞(如经体外扩增或未经体外扩增的瘤浸润淋巴细胞)获得序列。
[0084] B.抗原
[0085] 发现任何合适的抗原可用于本方法。示例性的抗原包括但不限于，来自传染剂、自身抗原(auto-/self-antigen)、肿瘤/癌症相关抗原和肿瘤新抗原的抗原性分子(Linnemann等,2015)。
[0086] 肿瘤相关抗原可以衍生自前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、间皮瘤、卵巢癌或黑色素瘤。示例性的肿瘤相关抗原或肿瘤细胞衍生的抗原包括MAGE 1，3和MAGE 4(或其它MAGE抗原，如国际专利公开号WO99/40188中公开的那些)；PRAME；BAGE；RAGE，Lage(也称之为NY ESO 1)；SAGE；和HAGE或GAGE。肿瘤抗原的这些非限制性示例在广泛的肿瘤类型中表达，如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。参见例如，美国专利号6,544,518。
前列腺癌肿瘤相关抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺酸性磷酸酶，NKX3.1和前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)(Hubert等,1999)；同样参见，例如，Reiter等,1998；Nelson,等,1999)；WO 98/12302；美国专利号5,955,306；5,840,871和5,786,148；国际专利公开号WO 98/20117；WO 00/04149；WO 98/137418)。
前列腺癌肿瘤相关抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺酸性磷酸酶，NKX3.1和前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)(Hubert等,1999)；同样参见，例如，Reiter等,1998；Nelson,等,1999)；WO 98/12302；美国专利号5,955,306；5,840,871和5,786,148；国际专利公开号WO 98/20117；WO 00/04149；WO 98/137418)。
[0087] 其它肿瘤相关抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto和Criptin。此外，肿瘤抗原可以是能够用于治疗许多癌症的自身肽激素，如全长促性腺激素释放激素(GnRH，国际专利公开号WO 95/20600)，其是短的10氨基酸长度肽。
[0088] 肿瘤抗原包括衍生自癌症的肿瘤抗原，所述癌症通过肿瘤相关抗原表达(如HER-2/neu表达)进行表征。感兴趣的肿瘤相关抗原包括谱系特异性肿瘤抗原，如黑素细胞-黑素瘤谱系抗原MART-1/Melan-A，gp100，gp75，mda-7，酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白。说明性的肿瘤相关抗原包括但不限于，衍生自或包括下述任何一种或多种的肿瘤抗原：p53，Ras，c-Myc，胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，A-Raf，B-Raf和C-Raf，周期蛋白依赖性激酶)，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12，MART-1，BAGE，DAM-6、-10，GAGE-1、-2、-8，GAGE-3、-4、-5、-6、-7B，NA88-A，MART-1，MC1R，Gp100，PSA，PSM，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，ART-4，CAMEL，CEA，Cyp-B，hTERT，hTRT，iCE，MUC1，MUC2，磷酸肌醇3-激酶(PI3K)，TRK受体，PRAME，P15，RU1，RU2，SART-1，SART-3，维尔姆斯瘤抗原(WT1)，AFP，-连环蛋白/m，胱天蛋白酶-8/m，CEA，CDK-4/m，ELF2M，GnT-V，G250，HSP70-2M，HST-2，KIAA0205，MUM-1，MUM-2，MUM-3，肌浆球蛋白/m，RAGE，SART-2，TRP-2/INT2，707-AP，膜联蛋白II，CDC27/m，TPI/mbcr-abl，BCR-ABL，干扰素调节因子4(IRF4)，ETV6/AML，LDLR/FUT，Pml/RAR，肿瘤相关钙信号转录蛋白1(TACSTD1)TACSTD2，受体酪氨酸激酶(例如，表皮生长因子受体(EGFR)(具体而言为EGFRvIII)，血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)，血管内皮生长因子受体(VEGFR))，胞质酪氨酸激酶(例如，src-家族，syk-ZAP70家族)，连接整合蛋白的激酶(ILK)，转录STAT3的激活蛋白和信号转导蛋白，STATS，和STATE，低氧诱导因子(例如，HIF-1和HIF-2)，核因子-κB(NF-B)，Notch受体(例如，Notch1-4)，c-Met，雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)，WNT，胞外信号调节激酶(ERK)，和其调节亚基，PMSA，PR-3，MDM2，间皮素，肾细胞癌-
5T4，SM22-α，碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称之为G250)，STEAD，TEL/AML1，GD2，蛋白激酶
3，hTERT，肉瘤易位断裂点，EphA2，ML-IAP，EpCAM，ERG(TMPRSS2ETS融合基因)，NA17，PAX3，ALK，雄激素受体，周期蛋白B1，多聚唾液酸，MYCN，RhoC，GD3，岩藻糖GM1，间皮素(mesothelian)，PSCA，sLe，PLAC1，GM3，BORIS，Tn，GLoboH，NY-BR-1，RGsS，SART3，STn，PAX5，OY-TES1，精子蛋白17，LCK，HMWMAA，AKAP-4，SSX2，XAGE 1，B7H3，豆荚蛋白，TIE2，Page4，MAD-CT-1，FAP，MAD-CT-2，fos相关抗原1，CBX2，CLDN6，SPANX，TPTE，ACTL8，ANKRD30A，CDKN2A，MAD2L1，CTAG1B，SUNC1，LRRN1和个体基因型。
5T4，SM22-α，碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称之为G250)，STEAD，TEL/AML1，GD2，蛋白激酶
3，hTERT，肉瘤易位断裂点，EphA2，ML-IAP，EpCAM，ERG(TMPRSS2ETS融合基因)，NA17，PAX3，ALK，雄激素受体，周期蛋白B1，多聚唾液酸，MYCN，RhoC，GD3，岩藻糖GM1，间皮素(mesothelian)，PSCA，sLe，PLAC1，GM3，BORIS，Tn，GLoboH，NY-BR-1，RGsS，SART3，STn，PAX5，OY-TES1，精子蛋白17，LCK，HMWMAA，AKAP-4，SSX2，XAGE 1，B7H3，豆荚蛋白，TIE2，Page4，MAD-CT-1，FAP，MAD-CT-2，fos相关抗原1，CBX2，CLDN6，SPANX，TPTE，ACTL8，ANKRD30A，CDKN2A，MAD2L1，CTAG1B，SUNC1，LRRN1和个体基因型。
[0089] 抗原可以包括衍生自肿瘤细胞中突变的基因或在肿瘤中以不同于正常细胞的水平转录的基因表位区域或表位肽，如端粒酶，生存素，间皮素，突变的ras，bcr/abl重排，Her2/neu，突变的或野生型p53，细胞色素P450 1B1和异常表达的内含子序列，如N-乙酰葡糖胺基转移酶-V；在骨髓瘤和B细胞淋巴瘤中产生独特的个体基因型的免疫球蛋白基因的克隆重排；包括衍生自致癌病毒(oncoviral)过程的表位肽和表位区域的肿瘤抗原，如人乳头瘤病毒蛋白E6和E7；EB(Epstein bar)病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变的癌胚胎蛋白，如癌胚抗原和甲胎蛋白。还参见Boon等,1994；Renkvist等,2001。
[0090] 在其他实施方式中，抗原获自或衍生自病原微生物或来自机会性病原微生物(本文也称之为传染性疾病微生物)，如病毒、真菌、寄生虫和细菌。在某些实施方式中，衍生自这类微生物的抗原包括全长蛋白质。
[0091] 其抗原已经显示能够用于本文所述的方法的说明性病原生物包括：人免疫缺陷病毒(HIV)，单纯性疱疹病毒(HSV)，呼吸道合胞体病毒(RSV)，巨细胞病毒(CMV)，EB(Epstein-Barr)病毒(EBV)，流感A、B和C，水疱性口炎病毒(VSV)，水泡性口炎病毒(VSV)，葡萄球菌(Staphylococcus)属，包括甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和链球菌(Streptococcus)属，包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)。应当被本领域技术人员所理解的是，衍生自这些和其它病原微生物用作本文所述抗原的蛋白质以及编码这些蛋白质的核苷酸序列可以在出版物以及在公共数据库如和 中找到。
[0092] 衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原包括下述中的任一种：HIV病毒粒子结构蛋白(例如，gp120、gp41、p17、p24)，蛋白酶，逆转录酶或由tat、rev、nef、vif、vpr和vpu编码的HIV蛋白。
[0093] 衍生自单纯性疱疹病毒(例如，HSV 1和HSV2)的抗原包括但不限于由HSV晚期基因表达的蛋白。基因的晚期基团主要编码来自病毒粒子颗粒的蛋白。这类蛋白包括形成病毒衣壳：UL6,UL18,UL35,UL38和主要衣壳蛋白UL19、UL45和UL27的5个蛋白质(UL)，其各自可以被用作本文所述的抗原(参见例如，McGeoch等,2006)。考虑用作本文所述抗原的其它说明性的HSV蛋白包括ICP27(H1、H2)，糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)蛋白。HSV基因组包括至少74个基因，其各自编码可以潜在地被用作抗原的蛋白。
[0094] 衍生自巨细胞病毒(CMV)的抗原包括CMV结构蛋白，病毒复制即刻早期和早期期间表达的病毒抗原，糖蛋白I和III，衣壳蛋白，外壳蛋白，较低基质蛋白pp65(ppUL83)，p52(ppUL44)，IE1和1E2(UL123和UL122)，来自UL128-UL150基因簇的蛋白产物(Rykman,等,2006)，包膜糖蛋白B(gB)，gH，gN和pp150。本领域技术人员应当理解的是，用作本文所述抗原的CMV蛋白可以在公共数据库如 和 中找到(参见
例如Bennekov等,2004；Loewendorf等,2010；Marschall等,2009)。
例如Bennekov等,2004；Loewendorf等,2010；Marschall等,2009)。
[0095] 考虑用于某些实施方式的衍生自EB病毒(EBV)的抗原包括EBV溶解性蛋白gp350和gp110，潜伏周期感染(latent cycle infection)期间产生的EBV蛋白，包括EB核抗原(EBNA)-1，EBNA-2，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA-3C，EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)和潜伏膜蛋白(LMP)-1，LMP-2A和LMP-2B(参见例如Lockey等,2008)。
[0096] 考虑用于本文的衍生自呼吸道合胞体病毒(RSV)的抗原包括通过RSV基因组或其抗原性片段编码的11个蛋白质中的任一种：NS 1，NS2，N(核衣壳蛋白)，M(基质蛋白)SH，G和F(病毒外壳蛋白)，M2(第二基质蛋白)，M2-1(延长因子)，M2-2(转录调节)，RNA聚合酶，磷蛋白P。
[0097] 考虑使用的衍生自水疱性口炎病毒(VSV)的抗原包括由VSV基因组编码的五种主要蛋白质中的任意一种和其抗原性片段：大蛋白(L)，糖蛋白(G)，核蛋白(N)，磷蛋白(P)和基质蛋白(M)(参见例如，Rieder等,1999)。
[0098] 考虑用于某些实施方式中的衍生自流感病毒的抗原包括血细胞凝集素(HA)，神经氨酸苷酶(NA)，核蛋白(NP)，基质蛋白M1和M2，NS1，NS2(NEP)，PA，PB1，PB1-F2和PB2。
[0099] 示例性的病毒抗原还包括但不限于，腺病毒多肽，甲病毒多肽，杯状病毒多肽(例如，杯状病毒衣壳抗原)，冠状病毒多肽，犬瘟热病毒多肽，埃博拉病毒多肽，肠病毒多肽，黄病毒多肽，肝炎病毒(AE)多肽(乙型肝炎核心或表面抗原，丙型肝炎病毒E1或E2糖蛋白、核心或非结构蛋白)，疱疹病毒多肽(包括单纯性疱疹病毒或水痘-带状疱疹病毒糖蛋白)，感染性腹膜炎病毒多肽，白血病病毒多肽，马尔堡病毒多肽，正粘病毒多肽，乳头瘤病毒多肽，副流感病毒病毒多肽(例如，血细胞凝集素和神经氨酸苷酶多肽)，副粘病毒多肽，细小病毒多肽，瘟病毒多肽，小RNA病毒多肽(例如，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽)，痘病毒多肽(例如，痘苗病毒多肽)，狂犬病病毒多肽(例如，狂犬病病毒糖蛋白G)，呼肠孤病毒多肽，逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。
[0100] 在某些实施方式中，抗原可以是细菌抗原。在某些实施方式中，感兴趣的细菌抗原可以是分泌的多肽。在其他某些实施方式中，细菌抗原包括具有暴露于细菌外层细胞表面的多肽的一个或多个部分的抗原。
[0101] 考虑使用的衍生自包括甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)的葡萄球菌(Staphylococcus)属的抗原包括毒力调节物，如Agr系统，Sar和Sae，Arl系统，Sar同系物(Rot，MgrA，SarS，SarR，SarT，SarU，SarV，SarX，SarZ和TcaR)，Srr系统和TRAP。可以用作抗原的其它葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白包括Clp蛋白，HtrA，MsrR，乌头酸酶，CcpA，SvrA，Msa，CfvA和CfvB(参见例如，《葡萄球菌：分子遗传学》(Staphylococcus:Molecular Genetics),2008凯斯特学术出版社(Caister Academic Press),Jodi Lindsay编著)。两种金黄色酿脓葡萄球菌(N315和Mu50)的基因组经测序并且是公众可及的，例如于PATRIC(PATRIC：VBI PathoSystems资源整合中心数据库(The VBI PathoSystems Resource Integration Center)，Snyder等,2007)。本领域技术人员应当理解的是，用作抗原的葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白也可以在其它公共数据库如和 中找到。
[0102] 考虑用于本文所述某些实施方式的衍生自肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)的抗原包括肺炎链球菌溶血素，PspA，胆碱结合蛋白A(CbpA)，NanA，NanB，SpnHL，PavA，LytA，Pht，和菌毛素蛋白(RrgA；RrgB；RrgC)。肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)的抗原蛋白为本领域已知并且可以在一些实施方式中用作抗原(参见例如，Zysk等,2000)。肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)毒性菌株的全基因组序列已经测序，本领域技术人员应当理解，用于本文的肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)蛋白也可以在其它公共数据库如 和 中找到。根据本公开
抗原特别感兴趣的蛋白质包括毒力因子蛋白，并且预计蛋白质将会暴露于肺炎球菌的表面(参见例如，Frolet等,2010)。
抗原特别感兴趣的蛋白质包括毒力因子蛋白，并且预计蛋白质将会暴露于肺炎球菌的表面(参见例如，Frolet等,2010)。
[0103] 可以用作抗原的细菌抗原的示例包括但不限于放线菌(Actinomyces)多肽，芽孢杆菌(Bacillus)多肽，拟杆菌(Bacteroides)多肽，博德特氏菌(Bordetella)多肽，巴尔多氏球菌(Bartonella)多肽，疏螺旋体(Borrelia)多肽(例如，布氏梭菌(B.burgdorferi)OspA)，布鲁氏菌(Brucella)多肽，弯曲杆菌(Campylobacter)多肽，噬二氧化碳胞菌(Capnocytophaga)多肽，衣原体(Chlamydia)多肽，棒状杆菌(Corynebacterium)多肽，柯克斯体(Coxiella)多肽，嗜皮菌(Dermatophilus)多肽，肠球菌(Enterococcus)多肽，埃利希氏菌(Ehrlichia)多肽，埃希氏菌(Escherichia)多肽，弗朗西斯氏菌(Francisella)多肽，梭杆菌(Fusobacterium)多肽，血巴尔通体(Haemobartonella)多肽，嗜血杆菌(Haemophilus)多肽(例如乙型流感嗜血杆菌(H.influenzae)外膜蛋白)，螺杆菌
(Helicobacter)多肽，克雷伯菌(Klebsiella)多肽，L-型细菌多肽，钩端螺旋体
(Leptospira)多肽，李斯特菌(Listeria)多肽，分枝杆菌(Mycobacteria)多肽，支原体(Mycoplasma)多肽，奈瑟氏球菌(Neisseria)多肽，新立克次氏体(Neorickettsia)多肽，诺卡氏菌(Nocardia)多肽，巴氏杆菌(Pasteurella)多肽，消化球菌(Peptococcus)多肽，消化链球菌(Peptostreptococcus)多肽，肺炎球菌(Pneumococcus)多肽(即肺炎链球菌(S.pneumoniae)多肽)(参见本说明书)，变形菌(Proteus)多肽，假单胞菌(Pseudomonas)多肽，立克次氏体(Rickettsia)多肽，罗卡利马体(Rochalimaea)多肽，沙门氏菌
(Salmonella)多肽，志贺氏菌(Shigella)多肽，葡萄球菌(Staphylococcus)多肽，A型链球菌(streptococcus)多肽(例如化脓性链球菌(S.pyogenes)M蛋白)，B型链球菌
(streptococcus)(例如无乳链球菌(S.agalactiae))多肽，密螺旋体(Treponema)多肽和耶尔森氏菌(Yersinia)多肽(例如鼠疫耶尔森氏菌(Y pestis)F1和V抗原)。
(Helicobacter)多肽，克雷伯菌(Klebsiella)多肽，L-型细菌多肽，钩端螺旋体
(Leptospira)多肽，李斯特菌(Listeria)多肽，分枝杆菌(Mycobacteria)多肽，支原体(Mycoplasma)多肽，奈瑟氏球菌(Neisseria)多肽，新立克次氏体(Neorickettsia)多肽，诺卡氏菌(Nocardia)多肽，巴氏杆菌(Pasteurella)多肽，消化球菌(Peptococcus)多肽，消化链球菌(Peptostreptococcus)多肽，肺炎球菌(Pneumococcus)多肽(即肺炎链球菌(S.pneumoniae)多肽)(参见本说明书)，变形菌(Proteus)多肽，假单胞菌(Pseudomonas)多肽，立克次氏体(Rickettsia)多肽，罗卡利马体(Rochalimaea)多肽，沙门氏菌
(Salmonella)多肽，志贺氏菌(Shigella)多肽，葡萄球菌(Staphylococcus)多肽，A型链球菌(streptococcus)多肽(例如化脓性链球菌(S.pyogenes)M蛋白)，B型链球菌
(streptococcus)(例如无乳链球菌(S.agalactiae))多肽，密螺旋体(Treponema)多肽和耶尔森氏菌(Yersinia)多肽(例如鼠疫耶尔森氏菌(Y pestis)F1和V抗原)。
[0104] 真菌抗原的示例包括但不限于：犁头霉菌(Absidia)多肽，支顶孢菌(Acremonium)多肽，链格孢菌(Alternaria)多肽，曲霉菌(Aspergillus)多肽，蛙粪霉菌(Basidiobolus)多肽，离蠕孢菌(Bipolaris)多肽，芽生菌(Blastomyces)多肽，念珠菌(Candida)多肽，孢子菌(Coccidioides)多肽，耳霉菌(Conidiobolus)多肽，隐球菌(Cryptococcus)多肽，弯孢菌(Curvalaria)多肽，表皮癣菌(Epidermophyton)多肽，嗜热菌(Exophiala)多肽，地霉菌(Geotrichum)多肽，组织胞浆菌(Histoplasma)多肽，马杜拉分支菌(Madurella)多肽，马拉色菌(Malassezia)多肽，小孢霉菌(Microsporum)多肽，丛梗孢菌(Moniliella)多肽，被孢霉菌(Mortierella)多肽，毛霉菌(Mucor)多肽，拟青霉菌(Paecilomyces)多肽，青霉菌(Penicillium)多肽，单胞瓶霉菌(Phialemonium)多肽，拟盘孢菌(Phialophora)多肽，原囊藻(Prototheca)多肽，假埃希氏菌(Pseudallescheria)多肽，假微结节菌(Pseudomicrodochium)多肽，腐霉菌(Pythium)多肽，鼻孢子菌(Rhinosporidium)多肽，根霉菌(Rhizopus)多肽，齿梗孢菌(Scolecobasidium)多肽，孢子丝菌(Sporothrix)多肽，匍柄霉菌(Stemphylium)多肽，毛癣菌(Trichophyton)多肽，丝孢酵母菌(Trichosporon)多肽和斑替木丝霉菌(Xylohypha)多肽。
[0105] 原生动物寄生虫抗原的示例包括但不限于，巴贝西虫(Babesia)多肽，肠袋虫(Balantidium)多肽，贝诺孢子虫(Besnoitia)多肽，隐孢子虫(Cryptosporidium)多肽，艾美球虫(Eimeria)多肽，脑胞内原虫(Encephalitozoon)多肽，内阿米巴虫(Entamoeba)多肽，贾第虫(Giardia)多肽，哈蒙虫(Hammondia)多肽，肝簇虫(Hepatozoon)多肽，等孢球虫(Isospora)多肽，利什曼虫(Leishmania)多肽，微孢子虫(Microsporidia)多肽，新孢子虫(Neospora)多肽，龙船草(Nosema)多肽，毛滴科五鞭虫(Pentatrichomonas)多肽，疟原虫多肽.蠕虫寄生虫抗原的示例包括但不限于：棘唇线虫(Acanthocheilonema)多肽，猫圆线虫(Aelurostrongylus)多肽，钩虫(Ancylostoma)多肽，管圆线虫(Angiostrongylus)多肽，蛔虫(Ascaris)多肽，布鲁线虫(Brugia)多肽，仰口线虫(Bunostomum)多肽，毛细线虫(Capillaria)多肽，夏柏特线虫(Chabertia)多肽，古柏线虫(Cooperia)多肽，齿线虫(Crenosoma)多肽，网尾线虫(Dictyocaulus)多肽，膨结线虫(Dioctophyme)多肽，双瓣线虫(Dipetalonema)多肽，裂头绦虫(Diphyllobothrium)多肽，复孔绦虫(Diplydium)多肽，恶丝虫(Dirofilaria)多肽，龙线虫(Dracunculus)多肽，住肠线虫(Enterobius)多肽，肺线虫(Filaroides)多肽，血矛线虫(Haemonchus)多肽，兔唇蛔(Lagochilascaris)多肽，罗阿丝虫(Loa)多肽，曼森线虫(Mansonella)多肽，缪勒线虫(Muellerius)多肽，侏体吸虫(Nanophyetus)多肽，板口线虫(Necator)多肽，细颈线虫(Nematodirus)多肽，结节线虫(Oesophagostomum)多肽，盘尾丝虫(Onchocerca)多肽，后睾吸虫(Opisthorchis)多肽，奥斯特线虫(Ostertagia)多肽，副丝虫(Parafilaria)多肽，并殖吸虫(Paragonimus)多肽，副蛔虫(Parascaris)多肽，泡翼线虫(Physaloptera)多肽，原圆线虫(Protostrongylus)多肽，狗尾草(Setaria)多肽，螺旋体(Spirocerca)多肽，迭宫绦虫(Spirometra)多肽，冠丝虫(Stephanofilaria)多肽，粪线虫(Strongyloides)多肽，圆线虫(Strongylus)多肽，吸吮线虫(Thelazia)多肽，弓蛔虫(Toxascaris)多肽，弓首蛔虫(Toxocara)多肽，旋毛虫(Trichinella)多肽，毛样线虫(Trichostrongylus)多肽，毛首线虫(Trichuris)多肽，钩线虫(Uncinaria)多肽和吴策线虫(Wuchereria)多肽。(例如，卵形疟原虫(falciparum)环子孢子(PfCSP))，子孢子表面蛋白2(PfSSP2)，肝脏状态抗原1的羧基末端(PfLSAI c-末端)和输出蛋白1(PfExp-1)，肺囊原虫(Pneumocystis)多肽，肉孢子虫(Sarcocystis)多肽，血吸虫(Schistosoma)多肽，泰勒虫(Theileria)多肽，弓形虫(Toxoplasma)多肽和锥虫(Trypanosoma)多肽。
[0106] 外寄生虫抗原的示例包括但不限于来自下述的多肽(包括抗原以及过敏原)：跳蚤；蜱，包括硬蜱和软蜱；苍蝇，如蠓，蚊，沙蝇，黑蝇，马蝇，角蝇，鹿蝇，采采蝇，舌蝇，厩蝇，引起蝇蛆病的苍蝇和咬人蠓虫；蚂蚁；蜘蛛，虱子；螨虫；和蝽类，比如臭虫和锥蝽。
[0107] 在一些实施方式中，抗原是自身抗原。在一实施方式中，自身抗原是1型糖尿病自身抗原，包括但不限于PDX1、AnT8、CHGA IAAP、GAD(65)和/或DiaPep277。在一实施方式中，自身抗体是斑秃自身抗原，包括但不限于角蛋白16、K18585、M10510、J01523、022528、D04547、005529、B20572和/或F11552。在一实施方式中，自身抗原是全身性红斑狼疮自身抗原，包括但不限于TRIM21/Ro52/SS-A 1和/或组蛋白H2B。在一实施方式中，自身抗原是贝赛特氏 症自身抗原，包括但不限于，S-抗原，α-烯醇酶，硒结合伴侣和/或Sip1C-ter。在一实施方式中，自身抗原是舍格伦 综合症自身抗原，包括但不限于，La/SSB、KLK11和/或45-kd核蛋白。在一实施方式中，自身抗原是类风湿性关节炎自身抗原，包括但不限于，波形蛋白、凝溶胶蛋白、α2HS糖蛋白(AHSG)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、α1B-糖蛋白(A1BG)、RA33和/或瓜氨酸化31F4G1。在一个实施方式中，自身抗原是格雷夫斯(Grave's)病自身抗原。在一实施方式中，自身抗原是抗磷脂抗体综合症自身抗原，包括但不限于，两性离子型磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂结合血浆蛋白质、磷脂蛋白复合物、阴离子磷脂、心磷脂、f2-糖蛋白I(β2GPI)、磷脂酰丝氨酸、溶血(双)磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、波形蛋白和/或膜联蛋白A5。在一实施方式中，自身抗原是多发性硬化自身抗原，包括但不限于，髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂蛋白脂质蛋白质(PLP)、髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)和/或α-B-晶状体(crytallin)。在一实施方式中，自身抗原是过敏性肠疾病，包括但不限于，核糖核蛋白复合物、小核糖核蛋白A和/或Ro-5,200kDa。在一实施方式中，自身抗原为克罗恩氏病自身抗原，包括但不限于，酶原颗粒膜糖蛋白2(GP2)，CTLA-4AT重复多态性等位基因的84，MRP8，MRP14和/或复合物MRP8/14。在一实施方式中，自身抗原是皮肤炎自身抗原，包括但不限于，氨酰基-tRNA合成酶，Mi-2解旋酶/脱乙酰酶蛋白质复合物，信号识别颗粒(SRP)，T2F1-γ，MDAS，NXP2，SAE和/或HMGCR。在一实施方式中，自身抗原是溃疡性结肠炎自身抗原，包括但不限于，7E12H12和/或M(r)40kD自身抗原。
[0108] 在一些实施方式中，自身抗原是胶原，例如，II型胶原；其他胶原，如IX型胶原，V型胶原，XXVII型胶原，XVIII型胶原，IV型胶原，IX型胶原；聚集蛋白聚糖I；胰腺特异性蛋白二硫化物异构酶A2；光感受器间类视黄醇结合蛋白质(IRBP)；人IRBP肽1-20；蛋白脂蛋白；胰岛素2；谷氨酸脱羧酶(GAD)1(GAD67蛋白)，BAFF，IGF2。自身抗原的其他示例包括ICA69和CYP1A2，Tph和Fabp2，Tgn，Spt1和Spt2和Mater，和来自胶原的CB11肽。
[0109] C.通过streptamer的分离
[0110] 在一些方面中，T细胞通过将T细胞群与四价偶联物(例如，MHC I)接触进行可逆染色，所述四价偶联物包含特异性结合TCR并具有可检
测标记的单一配体(例如，肽-主要主要组织相容性复合物(pMHC))的4个相同亚基。例如，配体可以是pMHC，其中肽可以偶联MHC分子的α和/或β链。结合复合物可以具有各种肽-MHC组合。I型MHC分子的多聚体将通常用于检测CD8+T细胞，而II型多聚体通常用于检测CD4+T细胞。肽通常具有约8至约25个氨基酸的长度，并且可以包含锚固氨基酸残基，所述锚固氨基酸残基能够与预定的MHC分子类型(例如，I型MHC、II型MHC或非经典型MHC)等位基因特异性结合。在特定方面，MHC分子是I型MHC分子。HLA蛋白中所包括的是II型亚基HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ，和I型蛋白HLA-A、HLA-B、HLA-C和β2-微球蛋白。
测标记的单一配体(例如，肽-主要主要组织相容性复合物(pMHC))的4个相同亚基。例如，配体可以是pMHC，其中肽可以偶联MHC分子的α和/或β链。结合复合物可以具有各种肽-MHC组合。I型MHC分子的多聚体将通常用于检测CD8+T细胞，而II型多聚体通常用于检测CD4+T细胞。肽通常具有约8至约25个氨基酸的长度，并且可以包含锚固氨基酸残基，所述锚固氨基酸残基能够与预定的MHC分子类型(例如，I型MHC、II型MHC或非经典型MHC)等位基因特异性结合。在特定方面，MHC分子是I型MHC分子。HLA蛋白中所包括的是II型亚基HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ，和I型蛋白HLA-A、HLA-B、HLA-C和β2-微球蛋白。
[0111] 肽可以具有来自各种蛋白质的序列。本领域已知来自许多抗原的T细胞表位序列。或者，可以凭经验确定表位序列，通过对结合天然MHC蛋白的肽进行分离和测序，通过由靶序列合成一系列肽，然后测试对不同肽的T细胞反应性，或通过用不同的肽产生一系列结合复合物并对T细胞结合进行定量。制备片段、鉴定序列和鉴定最小序列在美国专利号5,019,
384中描述，通过引用纳入本文。肽可以以各种方式制备。通常，它们可以通过采用自动合成仪的常规技术合成，或手动合成。或者，可以制备DNA序列，其编码特定的肽，并且可以经克隆和表达以提供所需的肽。在该实例中，蛋氨酸可以是第一个氨基酸。此外，可以通过重组方法产生肽，作为与特异性结合对之一的蛋白质的融合蛋白，允许通过亲和力试剂纯化融合蛋白，然后进行蛋白水解切割，通常在工程改造的位点以生成所需的肽(参见例如Driscoll等,1993)。肽还可以由天然来源分离并且通过已知技术纯化，所述已知技术包括例如离子交换材料色谱，尺寸分离，免疫亲和力层析和电泳。
384中描述，通过引用纳入本文。肽可以以各种方式制备。通常，它们可以通过采用自动合成仪的常规技术合成，或手动合成。或者，可以制备DNA序列，其编码特定的肽，并且可以经克隆和表达以提供所需的肽。在该实例中，蛋氨酸可以是第一个氨基酸。此外，可以通过重组方法产生肽，作为与特异性结合对之一的蛋白质的融合蛋白，允许通过亲和力试剂纯化融合蛋白，然后进行蛋白水解切割，通常在工程改造的位点以生成所需的肽(参见例如Driscoll等,1993)。肽还可以由天然来源分离并且通过已知技术纯化，所述已知技术包括例如离子交换材料色谱，尺寸分离，免疫亲和力层析和电泳。
[0112] 经标记的结合伴侣可游离在溶液中，或可以连接不可溶支持物。合适的不可溶支持物的实例包括珠，例如，磁性珠、膜和微量滴定板孔。它们通常由玻璃、塑料(例如，聚苯乙烯)、多糖、尼龙或硝化纤维组成。通常，标签将具有可检测光学特征。优选的标签为荧光团，如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。感兴趣的其他标签可以包括染料、酶、化学发光剂、颗粒、放射性同位素或其他直接或间接可检测试剂。
[0113] 本领域已知用于经标记的细胞检测和定量的许多方法。流式细胞术是列举占总细胞群少量细胞的一种常规方法。也可使用荧光显微术。各种免疫试验，例如ELISA、RIA等可以用于结合不可溶支持物后对存在的细胞数量进行定量。在特定方面，流式细胞术用于由细胞复杂混合物分离经标记的T细胞亚组。
[0114] 分离的其他方法利用直接或间接结合不可溶支持物(例如，柱、微滴定板、磁性珠等)的结合复合物。细胞样品添加至结合复合物。复合物可以通过各种常规方法结合支持物。孵育后，洗涤不可溶支持物以去除未结合的组分。可以进行足够体积的1至6次洗涤，以彻底清洗样品中存在的非特异性结合的细胞。然后由结合复合物洗脱所需细胞。具体而言，使用磁性颗粒由复杂混合物分离细胞亚组描述于Miltenyi等,1990。
[0115] 在一些实施方式中，结合特异性pMHC的T细胞之后可以通过针对可检测标签的分选分离。将T细胞从其他样品组分(例如，未染色的T细胞)分离可以通过常规方法进行，例如，细胞分选，优选通过使用市售可得的系统(例如，BD公司(Becton Dickinson)的FACSVantage或通过Cytomation公司的Moflo)的FACS方法，或通过磁性细胞分离(例如，通过美天旎公司(Miltenyi)的MACS)。可以通过破坏可逆键从T细胞去除染色，这导致完全去除结合靶细胞的任何试剂，因为介于受体-结合组分和靶细胞上受体之间的键为低亲和力相互作用。例如，添加生物素可以用于破坏 的Strep-Tactin复合物和Strep-标签。.在一些方面中，Strep-标签和Strep-Tactin通过解离缓冲液分离，所述解离缓冲液包括约1mM至约15mM最终浓度的生物素。在特定方面中，解离缓冲液可以包括叠氮化钠以防止过早的T细胞活化(例如，约0.1％至约0.5％)。streptamer结合的T细胞可以在解离缓冲液中孵育至少约15、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90分钟。
[0116] 其中细胞经标记的培养基可以是本领域已知的任何合适的培养基。如果需要活细胞，那么将会选择维持细胞活力的培养基。优选的培养基是含有0.1至0.5％BSA的磷酸盐缓冲盐水。各种培养基是市售可得的，并且可以根据细胞的性质使用，包括杜尔贝科改良的伊格培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(dMEM)、汉克斯碱性盐溶液(Hank's Basic Salt Solution)(HBSS)、达氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate buffered saline)(dPBS)、RPMI、伊可夫氏培养基(Iscove's medium)、具有5mM EDTA的PBS等，常常补充有胎牛血清、BSA、HAS等。在一些方面中，染色以及染色的后续去除在≦15℃的温度进行，如≦10℃，如在约4℃。
[0117] 肽序列(Strep-标签)如美国专利号5,506,121中所公开的那些证明了链霉亲和素的生物素结合位点的结合亲和力，例如，Kd大约为10-4至10-5M。结合亲和力可以通过在链霉亲和素分子内产生突变进一步改善。优化的链霉亲和素突变体 肽，IBA有限公司(IBA GmbH))于美国专利号6,103,493中描述，其通过引用纳入本文。
[0118] 或者，抗原特异性T细胞群可以通过克隆扩增抗原特异性T细胞获得。例如，T细胞可经工程改造以表达给定的TCR(例如，美国专利公开号20150307585中所述；通过引用纳入本文)并且然后进行体外扩增。例如，使用Heemskerk等,2009中所述转导技术，T细胞可经转导以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。
[0119] III.2维TCR-pMHC亲和力
[0120] 本公开的某些实施方式涉及使用微量移液管粘附试验以确定2D TCR-pMHC亲和力。Huang等,2010中描述了进行微量移液管粘附的一种方法；通过引用纳入本文。简言之，该方法通过使用生物膜探针力和微量移液管来测量2D TCR-pMHC亲和力，血红细胞(RBC)用作粘附传感器。RBC可以通过生物素-链霉亲和素偶联用pMHC涂覆。T细胞经微操作以受控的接触面积和时间接触RBC。具体地，以微量移液管和BFP装置为中心围绕置于防震载物台的倒置显微镜，所述防震载物台配备有压力计系统以通过玻璃移液管施加吸入压力。在两个装置中使用2个相对的移液管以控制T细胞(靶标)与pMHC呈递表面(例如，RBC(微量移液管)或珠(BFP))的接触。TCR-pMHC结合(如果存在)通过RBC伸长观察为了确定粘附的可能性，将细胞在给定的接触时间内反复移入和移出接触以产生粘附频率。在具体方面中，粘附频率介于30％至80％之间。如果粘附频率在10次接触后小于30％，那么将使用具有更高位点密度的新的RBC并再次测量粘附频率直到至少30％达到10次接触。
[0121] 可以通过在多个接触时间于2维表面使用针对可逆双分子相互作用的等式1(等式1)获得粘附概率来确定粘附曲线：
[0122] Pa＝1-exp{-mrmlAcKa[-kofft]} (等式1)
[0123] 其中，Pa是粘附频率，mr是TCR位点密度，ml是pMHC位点密度，Ac是RBC和T细胞的接触接触面积，Ka是2D亲和力，koff是2D解离速率常数，t是接触时间。Ac对于所有测量保持恒2
定，并且根据来自显微镜的长度校准图像，据估计其将在3μm的几个百分点之内。然而，因为不可能知道确切的接触面积，AcKa在所有2D亲和力公开文献中被用作有效的2D亲和力(Huang等,2010)，单位为μm4。
定，并且根据来自显微镜的长度校准图像，据估计其将在3μm的几个百分点之内。然而，因为不可能知道确切的接触面积，AcKa在所有2D亲和力公开文献中被用作有效的2D亲和力(Huang等,2010)，单位为μm4。
[0124] 在等式1中，随着t趋向无穷大，Pa达到平衡值：
[0125] AcKa＝-ln(1-Pa，eq)/mrml (等式2)
[0126] pMHC和TCR的位点密度可以通过流式细胞术测量。在一方面中，将与荧光强度(The fluorescent intensities)孵育的T细胞与标准校准珠(BD Quantibrite PE珠，BD或FITC校准珠，邦斯实验室(Bangs laboratories))比较以确定各细胞/珠的分子总数，通过除以细胞/珠表面积以获得位点密度。将天然(158μm2)和活化的(260μm2)T细胞外表面积计算为在显微镜下测量的半径的平滑球的面积。在某些方面，该试验在4℃、室温(例如25℃)或生理温度(例如37℃)进行。
[0127] 或者，粘附频率Pa可以通过使用平均结合数量计算：
[0128] Pa＝1-exp(-)
[0129] ＝mrmlAcKa
[0130] 然后使用3μm2近似接触面积推导出形成1个平均键数量所需的pMHC数量：
[0131]
[0132] IV.TCR测序
[0133] 本文还提供了用于进行TCR测序的方法。在已经通过使用微量移液管转移T细胞至裂解缓冲液确定2D亲和力后，该测序可以对T细胞进行。在一些实施方式中，提供了这样的方法，其用于TCRα和TCRβ基因同时测序并且在单个T细胞中扩增功能性感兴趣的转录本其能够将TCR特异性与关于T细胞功能的信息联系起来。该方法通常涉及将单个T细胞分选至不同位置(例如，多孔滴定板分开的孔)，然后通过巢式聚合酶链式反应(PCR)扩增编码TCR和T细胞表型标记物的核酸。扩增子经条码化以鉴定它们的来源细胞，经组合，并通过深度测序来分析。
[0134] 在一方法中，巢式PCR方法与诸如Han等,2014(通过引用纳入本文)中所述的深度测序联用。简言之，单个T细胞经分选到分离的孔(例如，96孔PCR板)中，并且使用TCR引物和表型化引物(phenotyping primer)进行逆转录。为了扩增位置TCR序列，可以使用连接锚固PCR。一条扩增引物对TCR恒定区域具有特异性。其他引物连接由TCR编码mRNA合成的cDNA末端。可变区域在恒定区域和连接的引物之间通过PCR扩增。此后，用TCRα/TCRβ引物(例如，表1和2中的序列)进行巢式PCR，并进行第三反应以纳入单独条码。使用亿明达MiSeq平台结合、纯化并测序产物。所得成对末端测序读数使用条码鉴定器在各序列两端通过定制软件流程进行组装并去卷积以将读数由各板中的各孔区分。然后，对于TCR序列，提取并翻译CDR3核苷酸测序。
[0135] 表1：TCRα引物序列
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140] 表2：TCRβ引物序列
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145] 另一方面，本发明提供用于分析单个T细胞的方法，其包括：a)将单个T细胞分选到不同位置；b)使用能够扩增多个核酸编码的T细胞受体的第一组引物由各单个T细胞扩增核酸，以产生第一组扩增子产物；c)用第二组引物进行巢式PCR以产生第二组扩增子产物，其中各引物包括共有序列，从而使得各扩增子产物能够杂交至含有条码序列的引物；d)用第三组引物扩增第二组扩增子产物，其中各引物含有条码序列以鉴定各经扩增的核酸所来源的单个T细胞；和e)对第三组扩增子产物进行测序。该方法可以还包括在扩增靶核酸之前对各单个T细胞进行裂解。如果需要，还可以确定靶核酸的相对表达水平。在某些实施方式中，该方法还包括分析经扩增的核酸序列的剪接变异，体细胞突变或遗传多态性。
[0146] 不同位置可以是不同的反应容器，如多孔板的孔(例如，96孔板、384孔板、1536孔板)或微孔阵列，毛细管或管(例如，0.2mL管、0.5mL管、1.5mL管)或微流体装置中的腔室。或者，不同位置可以是空间上分离细胞的乳液滴。
[0147] 本领域已知用于分离单个细胞的各种方法。在一些实施方式中，使用流式细胞术，样品经分选以获得单个T细胞。制备用于流式细胞术分析的细胞样品的方法述于下述中，例如，美国专利号5,378,633、5,631,165、6,524,858、5,266,269、5,017,497和6,549,876；美国专利申请公开号US20120178098、US20080153170、20010006787、US20080158561、US20100151472、US20100099074、US20100009364、US20090269800、US20080241820、US20080182262、US20070196870和US20080268494；PCT公开WO99/54494；Brown等(Clin Chem.2000 46:1221-9)，McCoy等(Hematol.Oncol.Clin.North Am.2002 16:229-43)和Scheffold J.Clin.Immunol.2000 20:400-7)以及书籍，诸如Carey等(《临床诊断中的流式细胞术(Flow Cytometry in Clinical Diagnosis)》，第四版，ASCP出版社，2007年)，Ormerod《( 流式细胞术实用方法》(Flow Cytometry—A practical approach)第三版，英国的牛津大学出版社，2000年)，Ormerod(《流式细胞术》(Flow Cytometry)第二版，英国牛津的BIOS科学出版社(BIOS Scientific Publishers)，1999年)和Ormerod(《流式细胞术简介》(Flow Cytometry—A basic introduction)2009细胞计数学部分A 75A,2009)，其各自通过引用纳入本文。
[0148] 用于扩增的引物包括对TCRα和β链基因转录的TCR引物以及对多种细胞因子(例如，促炎性或抑制性)的表型化引物以及转录因子，其在T细胞功能中十分重要并且对特定T细胞类型具有特异性。示例性的TCR和T细胞表型标记物引物公开于例如美国专利公开号20150337369中；通过引用纳入本文。引物被用于基于聚合酶链式反应(PCR)的技术(如RT-PCR)以扩增T细胞mRNA。PCR是用于扩增核酸分子或分子混合物中所含的所需靶核酸序列的技术。在PCR中，过量使用一对引物以杂交至靶核酸的互补链。通过聚合酶使用靶核酸作为模板各自延伸引物。在从原始靶标链分离后，延伸产物自身变成靶标链。然后新的引物通过聚合酶杂交并延伸，并且重复该循环以几何学地增加靶序列分子的数量。本领域熟知用于在样品中扩增靶核酸序列的PCR方法并且已经描述于，例如，Innis等(编著)《PCR方案》(PCR Protocols)(纽约的学术出版社(Academic Press)1990年)；Taylor(1991)《PCR中聚合酶链式反应基本原理及自动化使用方法》(Polymerase chain reaction:basic principles and automation,in PCR:A Practical Approach),McPherson等(编著)牛津的IRL出版社；
Saiki等(1986)Nature 324:163；以及美国专利号4,683,195、4,683,202和4,889,818，全部通过引物纳入本文。
Saiki等(1986)Nature 324:163；以及美国专利号4,683,195、4,683,202和4,889,818，全部通过引物纳入本文。
[0149] 具体而言，PCR使用相对短的寡核苷酸引物，其侧接待扩增的靶核苷酸序列，并经取向，以使其3'端彼此面对，各引物朝向彼此延伸。多核苷酸样品经提取和变性(例如，通过热)，并且与以摩尔过量存在的第一和第二引物杂交。在4种脱氧核苷酸三磷酸腺苷(dNTP—dATP、dGTP、dCTP和dTTP)存在的情况下使用引物依赖性和模板依赖性多核苷酸聚合剂催化聚合，所述聚合催化剂为诸如能够产生引物延伸产物的任何酶，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I，DNA聚合酶I的Klenow片段，T4DNA聚合酶，分离自下述的热稳定DNA聚合酶：水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)，可以来自各种来源(例如，帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))，嗜热细菌(Thermus thermophilus)(美国生物化学公司(United States Biochemicals))、立体嗜热杆菌(Bacillus stereothermophilus)(伯乐公司(Bio-Rad))或嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(“Vent”聚合酶，新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))。这产生在其5'端含有相应的引物的两个“长产物”，所述引物共价连接原始链的新合成的互补物。然后将反应混合物返回至聚合条件，例如通过降低温度，灭活变性剂，或添加更多的聚合酶，然后启动第二个循环。第二个循环有两条原始链，来自第一循环的两个长产物，由原始链复制的两个长产物，和由长产物复制的两个“短产物”。短产物具有靶序列的序列以及位于各末端的引物。在其他各循环，生成其他两个长产物，以及与之前循环结束时保留的长和短产物数量相等的短产物。因此，含有靶序列的短产物数量在各循环以指数方式增长。在一些情况中，PCR用市售可及的热循环仪(例如帕金埃尔默公司)进行。
[0150] 通过将RNA逆转录进cDNA可以扩增RNA，并且进行PCR(RT-PCR)，如上所述。或者，如美国专利号5,322,770所述，单一的酶可以用于两个步骤，通过引用将其全部内容纳入本文。RNA还可以逆转录到cDNA中，然后进行不对称间隔连接酶链式反应(RT-AGLCR)，如Marshall等(1994)PCR Meth.App.4:80-84所述。合适的DNA聚合酶包括逆转录酶，如禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶(来自例如Seikagaku美国有限公司(Seikagaku America,Inc.))和莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(来自例如贝塞斯达研究实验室公司(Bethesda Research Laboratories))。
[0151] 适合纳入引物的一种或多种启动子序列为核酸序列(或者是自然存在的，合成产生的，或限制性消化的产物)，其通过RNA聚合酶特异性识别，所述RNA聚合酶识别并结合该序列并启动转录的过程，以此生成RNA转录本。序列可以任选地包括延伸超过RNA聚合酶实际识别位点的核苷酸碱基，其可以赋予降解过程增加的稳定性或易感性或提高转录效率。有用的启动子实例包括通过某些噬菌体聚合酶识别的那些，诸如来自噬菌体T3、T7或SP6，或来自大肠杆菌的启动子。这些RNA聚合酶容易由商业来源获得，如新英格兰生物实验室公司和爱彼森特公司。
[0152] 适合用于本文所述方法中的一些逆转录酶具有RNA酶H活性，如AMV逆转录酶。在一些情况中，添加外源性RNA酶H，如大肠杆菌RNA酶H，甚至当AMV逆转录使用时。RNA酶H可容易地从例如贝塞斯达研究实验室公司获得。
[0153] 本公开的方法可以利用多重巢式RT-PCT方法。对于各T细胞靶核酸，PCR以至少两步进行，其中，来自第一轮PCR的扩增子产物成为使用第二组引物的第二轮PCR的模板，其中至少一个结合来自第一轮PCR的扩增子的内部位置，以生成第二扩增子产物。在某些实施方式中，在第二扩增子产物上使用第三组引物进行第二轮PCR以生成第三扩增子产物。
[0154] 在某些实施方式中，多重巢式PCR以同时在相同反应混合物中的多个T细胞靶序列(例如，编码TCR和其他T细胞表型标记物)进行。如本文所述每种待扩增序列使用独特的引物组。示例性引物述于美国专利公开号20150337369，用于扩增TCR(例如，异二聚体的α和β链)和各种其他T细胞表型标记物，包括细胞因子(例如，促炎性和抑制性)和转录因子(其在T细胞功能中十分重要并且对特定T细胞类型具有特异性)，并且还用于添加条码和对用于成对末端测序的衔接子进行测序。对应特定T细胞中遗传变异，可以引入对这些引物核苷酸序列的改变。
[0155] 在某些情况中，用于扩增靶核酸的第一组引物(例如，编码TCR的核酸或T细胞表型标记物)可以含有这样的引物，所述引物在第一轮PCR期间当与第一组中另一合适引物配对时特异性地杂交至并扩增靶核酸。然后当第二组引物含有下述这样的引物时，第二组引物可以用于进一步扩增靶核酸：所述引物在第二轮PCR期间当与第二组中另一合适引物配对时特异性地杂交至和扩增第一轮PCR的特异性扩增产物。相似地，然后当第三组引物含有下述这样的引物时，该第三组引物可以用于进一步扩增靶核酸：所述引物在第三轮PCR期间当与第三组中另一合适引物配对时特异性地杂交至和扩增第二轮PCR的特异性扩增产物。
[0156] 在一些实施方式中，一组引物内的引物可以包括，杂交靶核酸的序列或其扩增产物，以及共有序列和/或条码序列。共有序列可以是多个引物中的相同序列，当与其他引物、不同的靶核酸或其扩增产物适当配对时以其他方式杂交并扩增。在一些情况中，在一轮PCR中所用引物中的共有序列，通过用作下一轮PCR期间所用引物的退火位点，使得下一轮PCR期间所用引物在与适当引物配对时能够退火至并扩增靶核酸。如此，在一些情况中，在一轮PCR期间所用引物中的共有序列是这样的序列，其杂交靶核酸的靶标特异性序列，或杂交来自前轮PCR的特异性扩增产物。在一些情况中，共有序列是杂交靶核酸的序列，例如如果靶核酸包括不同靶核酸之间共享的序列，例如，编码TCR恒定区域的序列。
[0157] 多重PCR反应可以在一个或多个分开的位置进行，所述分开的位置中已经分选了来自样品的单一T细胞。在一些情况中，将在多个分开的位置进行的多重PCR反应的扩增产物在测序前组合成库(pool)。在这样的情况中，在一轮多重PCR反应中所用条码序列可以用于鉴定特定测序扩增产物所来源的位置(例如，孔)，如下述进一步所述。
[0158] 在某些实施方式中，T细胞表型标记物选自IL2、IL10、IL12A、IL13、IL17A、IFNG、PRF1、GZMB TGFB、TNFA、BCL6、TBET、GATA3、RORC、FOXP3、RUNX1、RUNX3、CD4、CD8、CD11a、CD18、CD25、CD29、CCD30、CD38、CD44、CD45、CD45RA、CD45RO、CD49d、CD62、CD62L、CD69、CD71、CD103、CD137(4-1BB)、CD161、CD294、CCR5、CXCR4、HLA-DR、IL-5、IL-6、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些实施方式中，T细胞表型标记物选自：IL2、IL10、IL12A、IL13、IL17A、IFNG、PRF1、GZMB TGFB、TNFA、BCL6、TBET、GATA3、RORC、FOXP3、RUNX1和RUNX3。
[0159] 此外，条码序列可以添加至扩增子产物以鉴定各扩增的核酸所来源的单个T细胞。条码的使用允许来自不同细胞的核酸分析物汇集于用于测序的单一反应混合物，同时仍然能够将特定靶核酸追踪回其起源的特定细胞。各细胞通过独特的条码序列鉴定，所述独特的条码序列含有至少5个核苷酸。条码序列在扩增期间可以通过用引物进行PCR添加，所述引物含有具有条码序列的区域以及与感兴趣靶核酸互补的区域，从而使得条码序列纳入最终扩增的靶核酸产物。条码序列可以添加于扩增子的一个或两个末端。在某些实施方式中，单个细胞最初经分选至有序的阵列中或多孔板中的分开的位置，其中细胞可以使用条码通过其位置鉴定。例如，条码序列可以添加于扩增子的两端以鉴定细胞在多孔板中的位置，通过使用添加于一末端的第一条码来鉴定多孔板的行以及添加于另一末端的第二条码来鉴定多孔板的列。
[0160] 此外，可以将衔接子序列添加于扩增子以促进高通量扩增或测序。例如，一对衔接子序列可以添加于DNA模板的5'和3'末端以允许多个DNA模板同时通过相同组的引物扩增或测序。
[0161] 引物可以通过标准技术容易地合成，例如，经由亚磷酰胺化学的固相合成，如美国专利号4,458,066和4,415,732所公开，通过引用纳入本文；Beaucage等,Tetrahedron(1992)48:2223-2311；以及引用生物系统公司用户公告号13(Applied Biosystems User Bulletin No.13)(1987年4月1日)。其他化学合成方法包括例如Narang等,Meth.Enzymol.(1979)68:90所述的磷酸三酯方法，以及Brown等.,Meth.Enzymol.(1979)68:109所公开的磷酸二酯方法。聚(A)或聚(C)或其他非互补性核苷酸延伸可以使用这些相同的方法纳入寡核苷酸。氧杂环庚烷延伸可以通过本领域已知的方法偶联寡核苷酸。Cload等,J.Am.Chem.Soc.(1991)113:6324-6326；Levenson等的美国专利号4,914,210；Durand等,Nucleic Acids Res.(1990)18:6353-6359；和Horn等,Tet.Lett.(1986)27:4705-4708。
[0162] 此外，寡核苷酸，特别是用于扩增或测序的引物寡核苷酸可以偶联标签用于检测。众所周知存在数种用于衍生具有反应官能团的寡核苷酸，所述反应官能团允许添加标签。
例如，存在能够用于生物素化探针的数种途径，从而使得放射性标签、荧光性标签、化学发光标签、酶促标签或电子密度标签可以经由亲和素连接。参见，例如Broken等,Nucl.Acids Res.(1978)5:363-384，其公开了铁蛋白-亲和素-生物素标签的使用；和Chollet等,Nucl.Acids Res.(1985)13:1529-1541，其公开了经由氨基烷基磷酰接头臂将寡核苷酸的
5′末端生物素化。
例如，存在能够用于生物素化探针的数种途径，从而使得放射性标签、荧光性标签、化学发光标签、酶促标签或电子密度标签可以经由亲和素连接。参见，例如Broken等,Nucl.Acids Res.(1978)5:363-384，其公开了铁蛋白-亲和素-生物素标签的使用；和Chollet等,Nucl.Acids Res.(1985)13:1529-1541，其公开了经由氨基烷基磷酰接头臂将寡核苷酸的
5′末端生物素化。
[0163] 高通量测序技术可用于本发明实践。DNA测序技术包括：采用经标记的终止子或引物以及平板或毛细管中的凝胶分离的双脱氧测序反应(桑格法)、采用可逆终止的经标记核苷酸的合成测序法、焦磷酸测序、454测序、采用对经标记克隆文库的等位基因特异性杂交随后连接的合成测序，在聚合步骤过程中对经标记的核苷酸掺入的实时监测，重普罗尼(polony)测序、SOLID测序等。因此，这些测序方法可以用于对感兴趣的靶核酸进行测序，包括编码TCR和扩增自单个T细胞的其他T细胞表型标记物的核酸。
[0164] 测序的某些高通量方法包括这样的步骤，其中单独分子在固体表面上空间隔离，在此处它们进行平行测序。这类固体表面可以包括无孔表面(如在Solexa测序中，例如，Bentley等,Nature,456:53-59(2008)或完整因组测序(Complete Genomics sequencing)，例如Drmanac等,Science,327:78-81(2010))，孔阵列，其可以包括珠-或颗粒-结合的模板(如与454，例如，Margulies等,Nature,437:376-380(2005)或离子激流测序，美国专利公开2010/0137143或2010/0304982)，微机械的膜(如与SMRT测序，例如，Eid等,Science,323:
133-138(2009))，或任何珠粒(如与SOLiD测序或polony测序，例如Kim等，316:1481-1414(2007))。.这类方法可以包括扩增分离的分子。先前扩增可以包括基于乳剂的扩增，如PCR或滚环扩增。
133-138(2009))，或任何珠粒(如与SOLiD测序或polony测序，例如Kim等，316:1481-1414(2007))。.这类方法可以包括扩增分离的分子。先前扩增可以包括基于乳剂的扩增，如PCR或滚环扩增。
[0165] 特别感兴趣的是于 MiSe平台上测序，其使用通过合成技术的可逆性终止子测序(参见例如Shen等.(2012)BMC Bioinformatics 13:160；Junemann等.(2013)Nat.Biotechnol.31(4):294-296；Glenn(2011)Mol.Ecol.Resour.11(5):759-769；Thudi等(2012)Brief Funct.Genomics 11(1):3-11；通过引用纳入本文)。
[0166] 本公开还提供了用于分析多重单个细胞测序数据(如使用本文所述分析单个T细胞的方法获得的那些)的方法。在计算机执行的方法的一个实施方式中，用户可以访问计算机系统上的文件，其中该文件通过例如分析单个T细胞的方法对来自多个单个T细胞多重PCR扩增产物进行测序产生，如本文所述。因此，文件可以包括源自多个T细胞的数个核酸的数个测序读数。每个测序读数可以是含有靶核酸核苷酸序列(例如，编码T细胞受体或T细胞表型标记物的核苷酸序列)和一个或多个条码序列的核酸序列读数，所述条码序列鉴定产生核酸(例如，孔中单个T细胞表达的靶核酸的多重巢式PCR后)的单细胞来源(例如，多孔板的孔、毛细管、微流体腔室中的单细胞)。在一些实施方式中，测序读数为成对末端的测序读数。
[0167] 文件中的测序读数可以经组装通过将对应靶核酸核苷酸序列的核苷酸序列和各测序读数中含有的条码序列进行比对以生成靶核酸核苷酸序列的共同序列。源自相同细胞来源(例如，相同的孔)并具有下述这样的靶核苷酸序列的测序读数可以被指定为由单细胞源最初扩增的相同靶核酸，并且可以分组成代表靶核酸的亚组，所述靶核苷酸序列对参照序列具有比阈值相同性水平更高的相同性。亚组内测序读数的数量表明由亚组中测序读数组装的共同序列是存在于单细胞来源的实际核酸分子一部分的可能性。因此，如果亚组中的测序读数高于背景水平，源自亚组的共同序列可以被认为将代表单细胞来源中靶核酸的实际序列。然后，可以输出共同序列，例如至显示器、打印、数据库等。
[0168] V.使用方法
[0169] 在一些实施方式中，本公开的方法提供了具有已知3D亲和力和序列的T细胞。其他实施方式提供了将这些抗原特异性T细胞用于过继细胞转移(ACT)(如用于癌症或感染的治疗)的方法，以及监测包括单克隆抗体和ACT的免疫疗法的方法。为了延长使用过继细胞疗法(ACT)治疗患有更加快速生长肿瘤患者的能力，目标是转移已经针对其配体特异性进行选择的经富集的、肽特异性效应物T细胞(CD4T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞两者)，从而有效地攻击肿瘤细胞，同时避免对正常组织的严重攻击。TCR对特异性抗原的亲和力使其对若干治疗途径有价值。例如，癌症患者如黑素瘤患者可以通过使用过继免疫疗法有效治疗。
[0170] 抗原特异性T细胞的表征与T细胞活化相关的多种病症有关。这类病症包括自身免疫疾病，例如，多发性硬化症，重症肌无力，类风湿性关节炎，1型糖尿病，移植物抗宿主病，格雷夫病等；各种形式的癌症，例如上皮瘤、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病。各种传染性疾病，如由病毒引起的传染病，例如，HIV-1，肝炎，疱疹病毒，肠道病毒，呼吸道病毒，弹状病毒，麻疹(rubeola)，痘病毒，副粘病毒，麻疹病毒等都是感兴趣的。感兴趣的传染性物质还包括细菌，如肺炎球菌，葡萄球菌，杆菌。链球菌，脑膜炎球菌，淋菌，埃希氏菌，克雷伯氏菌，变形杆菌，假单胞菌，沙门氏菌，志贺氏菌，嗜血杆菌，耶尔森氏菌，李斯特菌，棒状杆菌，弧菌，梭菌，衣原体，分枝杆菌，螺杆菌和密螺旋体；原生动物病原体等。还可以监控T细胞相关的过敏性反应，例如，迟发型超敏反应或涉及T细胞的接触性超敏反应。
[0171] 通过本公开方法鉴定的高亲和力功能性抗原特异性T细胞可以用于在对象中通过给予含有该高亲和力抗原特异性T细胞的组合物治疗疾病(例如，癌症、传染性疾病或自身免疫疾病)。
[0172] 相应地，本公开的实施方式涉及获得T细胞以及向对象给予T细胞作为靶向癌症细胞的免疫疗法。本文所述的组合物与方法可用于治疗包括实体肿瘤和白血病在内的多种癌症。可被治疗的癌症类型包括：乳腺、前列腺和结肠腺癌；所有形式的肺支气管癌；骨髓瘤；黑素瘤；肝癌；神经母细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取脱羧细胞瘤；迷芽瘤；分支瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏病；和上皮癌(例如Walker癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌、Ehrlich瘤、Krebs 2癌、默克细胞癌、粘液癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状细胞癌、硬癌、支气管癌、支气管源性癌、鳞状细胞癌和过渡细胞癌)。可以治疗的其他类型的癌症包括：组织细胞疾病；白血病；恶性组织细胞增多病；霍奇金病；免疫增生性小瘤；非霍奇金氏淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑色素瘤；成软骨细胞瘤；软骨瘤；
软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养层肿瘤。此外，下述类型的癌症也被认为适于治疗：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；腺囊瘤；粒层细胞肿瘤；两性母细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺癌；胰岛细胞癌；睾丸间质(Leydig)细胞瘤；乳头状瘤；睾丸支持(Sertoli)细胞瘤；膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑脊膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；非嗜铬性副神经节瘤。可以被治疗的癌症类型还包括：血管角质瘤；伴随嗜酸粒细胞增多的血管淋巴细胞增生；硬化性血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白细胞肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘生物；神经纤维瘤病；和宫颈非典型增生。
软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养层肿瘤。此外，下述类型的癌症也被认为适于治疗：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；腺囊瘤；粒层细胞肿瘤；两性母细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺癌；胰岛细胞癌；睾丸间质(Leydig)细胞瘤；乳头状瘤；睾丸支持(Sertoli)细胞瘤；膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑脊膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；非嗜铬性副神经节瘤。可以被治疗的癌症类型还包括：血管角质瘤；伴随嗜酸粒细胞增多的血管淋巴细胞增生；硬化性血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白细胞肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘生物；神经纤维瘤病；和宫颈非典型增生。
[0173] 在一些实施方式中，可以在T细胞治疗前给予对象非清髓性淋巴细胞消耗化疗。非清髓性淋巴细胞消耗化疗可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径给予。例如，非清髓性淋巴细胞消耗化疗可以包括给予环磷酰胺和氟达拉滨，特别是如果癌症是黑素瘤(其可以是转移性的)。给予环磷酰胺和氟达拉滨的示例性途径是静脉注射。同样的，可以给予任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在具体方面中，给予约60mg/kg环磷酰胺2天，此后给予约25mg/m2氟达拉滨5天。
[0174] 在某些实施方式中，向对象给予促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子伴随着自体T细胞或在自体T细胞之后。T细胞生长因子可以是任何合适的生长因子，其促进自体T细胞的生长和活化。合适的T细胞生长因子的示例包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，其可以单独或在各种组合物中使用，如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2，IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。IL-12是一种优选的T细胞生长因子。
[0175] 在某些实施方式中，本发明实施方式的组合物和方法涉及高亲和力T细胞疗法与至少一种其他疗法组合。该其他疗法可以是放射疗法，手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)，化疗，基因疗法，DNA疗法，病毒疗法，RNA疗法，免疫疗法，骨髓移植，纳米疗法，单克隆抗体疗法或前述组合。该其他疗法可以为辅助或新辅助疗法的形式。
[0176] 传染性疾病包括与感染性物质相关的那些，并且包括任何一种细菌(例如，致病性大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，铜绿假单胞菌，炭疽芽孢杆菌，肉毒杆菌，艰难梭菌，产气荚膜梭菌，幽门螺杆菌，霍乱弧菌，李斯特菌属，立克次氏体属，衣原体属等)，分枝杆菌和寄生虫(包括原生动物的任何已知寄生成员)。传染性病毒包括真核病毒(例如，腺病毒，布尼亚病毒，疱疹病毒，乳多空病毒，副粘病毒，小核糖核酸病毒，弹状病毒(例如狂犬病)，正粘病毒(例如流感)，痘病毒(例如牛痘)，呼肠孤病毒，逆转录病毒，慢病毒(例如HIV)，黄病毒(例如，HCV)等)。
[0177] 其他实施方式提供用于生成用于临床研究、诊断和免疫疗法的人T细胞系或克隆(例如，病原体/肿瘤特异性或自体反应性T细胞)的方法。直接离体分离抗原特异性T细胞群然后立即将细胞转移到受体中(没有任何其他体外繁殖)具有特殊的临床意义。预期直接分离细胞群比培养的细胞对于体内引用更高效。高效过继转移需要极高数量的体外扩增T细胞，最有可能是由于T细胞对体外培养条件的适应导致的一种现象。该过程重要临床应用的一个示例是在[其他]T细胞耗尽的干细胞移植期间EBV和/或CMV特异性T细胞群的平行纯化和过继转移，一种有可能显著降低移植患者中EBV和CMV相关恶性肿瘤的发生率的方案。因此，通过本发明方法鉴定的该抗原特异性T细胞可以用于这些临床应用。
[0178] 本发明的另一实施方式涉及一种方法，其中在表征T细胞亲和力和序列后，对TCR序列进行克隆。在该实施方式中，方法包括下述步骤：(i)由所述T细胞克隆制备cDNA，(ii)扩增所述cDNA，和(iii)将相应的TCR a和β基因克隆到载体中。在特定方面，载体为逆转录病毒载体，用于转导人外周血淋巴细胞。
[0179] 一些实施方式中，本文所提供的方法用于功能性T细胞诊断。iTAST方法允许直接表征活的抗原特异性T细胞。因此，表征的抗原特异性T细胞可以用于肿瘤特异性T细胞群和慢性病毒感染(例如，HIV、CMV、EBV、HBV或HCV)的功能性试验。
[0180] 在一些方面中，本发明提供了药物组合物，其包括高亲和力功能性CTL和药学上可接受的运载体。可注射组合物为药学上可接受的流体组合物，其包括至少一种活性成分，例如表达给定TCR的扩增的T细胞群(例如对于待治疗的患者为自体或同种异体的)。活性成分通常溶解于或悬浮于生理上可接受的运载体中，并且组合物可以额外地包括少量的一种或多种非毒性物质，如乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。能够用于与本公开所述融合蛋白使用的这类可注射组合物为常见的；适当的制剂本领域普通技术人员所熟知。
[0181] 还提供了用于优化治疗的方法，所述方法通过分析样品中的TCR库，并且基于该信息，选择适当疗法、剂量、治疗模式等，其经优化用于刺激或抑制靶向的免疫应答并且使不需要的毒性最小化。该治疗通过选择这样的治疗进行优化，所述治疗使不需要的毒性最小化，同时提供高效的活性。例如，可以评估患者与自身免疫疾病相关的免疫库，并且可以基于该信息选择全身或靶向的免疫抑制方案。
[0182] 在一些方面，本公开提供了在对象中评估健康的方法。例如，TCR亲和力分布的测量可以用于评估对象的健康。例如，随着年龄的增加，对HCV肽抗原的TCR亲和力分布偏向于降低T细胞亲和力。因此，在一些方面中，TCR亲和力分布的降低可能表示不健康(例如，老年供体)或针对感染的保护降低。
[0183] 在一些实施方式中，TCR亲和力分布可以用作供体特征。例如，TCR亲和力分布与相同供体内多次血液抽取一致，然而，TCR亲和力分布在不同供体之间可以不同。因此，在一些方面中，TCR亲和力分布可以用作供体的独特特征。VI.实施例
[0184] 包括以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域的普通技术人员应理解，根据代表本发明人所发现技术的实施例中公开的技术能很好地实施本发明，从而可将其视为实施本发明的优选模式。但是，本领域技术人员根据本公开应理解，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可对所公开的具体实施方式进行许多变化，同时仍能获得相同或类似的结果。
[0185] 实施例1–原位T细胞受体亲和力和序列测试(iTAST)
[0186] 为了解决关于测量TCR亲和力的问题，开发了原位T细胞受体和序列测试(iTAST)，以可以直接从原代CTL测量TCR亲和力及其序列。由血液开始，可以在一天确定对约50个T细胞的TCR亲和力和序列，从少于75个抗原特异性CTL开始。iTAST利用streptamer的优势(Knabel等,2002)以可逆标记抗原特异性T细胞，而近期研发的微量移液管粘附试验(Huang等,2010；Jiang等,2011)用于测量二维(2-D)TCR-pMHC结合亲和力(图2A)，其比获自SPR5的三维(3-D)亲和力更好地关联T细胞功能。该分析集中于CTL，因为其直接杀伤靶细胞的能力以及其在癌症免疫疗法和持续性病毒感染中的广泛应用(Restifo等,2012；Heslop等,1996)。对于给定抗原的CTL特异性，首先使用四聚体富集方案(Yu等,2015)用streptamer分离，使用过量的生物素解离以留下未结合的TCR，然后与涂覆有血红细胞(RBC)的pMHC接触，用于在微量移液管粘附试验中进行2-D亲和力测量。然后将CTL单独地转移到裂解缓冲液中用于TCR序列扩增和下一代测序文库制备。
[0187] 使用在α3结构域中具有突变的HLA-A2单体进行亲和力测量，α3结构域中的突变消除TCR-pMHC结合中的CD8协同性(Jiang等,2011)。与原代CTL的非特异性结合可忽略不计，并且与RBC上大量pMHC位点密度保持相对稳定(图6)。使用一组CTL克隆，确认粘附频率曲线拟合双分子相互作用模型(Chesla等,1998)(图2A和等式1)，并且将野生型链霉亲和素用作将pMHC呈递于RBC膜的方法并不导致经由可能的多价相互作用的2D亲和力的改变(Huang等,2010)(图7)。
[0188] 在iTAST中测量2D结合亲和力需要在平衡接触时间以已知的TCR位点密度和已知的pMHC位点密度测量受体-配体粘附频率(等式2)(Chesla等,1998)。基于CTL克隆，发现4秒为实现一定范围TCR亲和力平衡粘附亲和力足够的接触时间(图2A和8)。尽管使用HLA-A2-和TCR-特异性抗体测量位点密度，TCR位点密度不可以在单个streptamer-阳性T细胞上直接测量，因为TCR抗体将阻碍其2D亲和力的调查。因此，将来自相同患者的大量CTL用作替代。streptamer分选的细胞具有与大量CTL相同的TCR位点密度，因为streptamer从细胞表面完全解离(图9)并且没有改变TCR位点密度(图2B)。streptamer以于常规四聚体相似的方式使用，两种试剂对相同样品产生相似的细胞频率和染色强度(图10)。常见CTL表型抗体CD27、CD45RA、CD45RO和CCR7的连接也没有改变亲和力测量期间的TCR位点密度(图11)。
[0189] 单细胞的2D亲和力测量受限于影响准确性的多个变量。为了估计误差，进行与2D亲和力测量相关因素的差异分析，包括在(i)T细胞之间的TCR位点密度中的差异和(ii)围绕一个T细胞表面的差异，以及(iii)RBC之间pMHC位点密度中的差异(图12)。通过相加所有差异，估计通过将粘附频率维持在高于30％和80％之间，粘附频率在原代T细胞上的变化系数小于0.5。为了评价初级2D亲和力的准确性，将经亲和力测试的原代CTL采集至培养基中用于体外扩增。发现了原代CTL的2D亲和力与其克隆相似，并在估计的差异内(图2D)。
[0190] 实施例2–在HCV特异性CTL中验证iTAST
[0191] 在验证iTAST方法后，接下来将其应用于研究健康HCV血清反应阳性血液供体内的罕见HCV特异性CTL群。抗原特异性T细胞为异质细胞群，所述异质细胞群使用通过VDJ重组生成的不同TCR识别相同的pMHC配体(Yu等,2015；Moon等,2007)。在病原体未免疫个体中，5 6 +
HCV特异性细胞是极其罕见的，并以10 至10CD8T细胞中1个存在，并且被认为是针对感染和疫苗接种的安全保障。然而，由于缺乏适当的技术，尚未研究来自这种异质T细胞群的TCR亲和力分布和克隆谱系。使用结合HLA-A2-ns3:1406-1415的HCV表位(SEQ ID NO:
1KLVALGINAV)(Cerny等.,1995)(此后称之为HCV特异性T细胞)。将分别来自62、49和33岁供体1-3的HCV特异性T细胞分离，并且发现具有介于106个总CD8+T细胞中2-27个的频率(图
13H)，这与之前的研究一致(Yu等,2015)。由一个单位的白血球单采术，将会获得65至1000个HCV特异性T细胞。
HCV特异性细胞是极其罕见的，并以10 至10CD8T细胞中1个存在，并且被认为是针对感染和疫苗接种的安全保障。然而，由于缺乏适当的技术，尚未研究来自这种异质T细胞群的TCR亲和力分布和克隆谱系。使用结合HLA-A2-ns3:1406-1415的HCV表位(SEQ ID NO:
1KLVALGINAV)(Cerny等.,1995)(此后称之为HCV特异性T细胞)。将分别来自62、49和33岁供体1-3的HCV特异性T细胞分离，并且发现具有介于106个总CD8+T细胞中2-27个的频率(图
13H)，这与之前的研究一致(Yu等,2015)。由一个单位的白血球单采术，将会获得65至1000个HCV特异性T细胞。
[0192] 在来自3个测试供体的4个样品中，在该抗原特异性T细胞库中发现了出人意料的超过1000倍的大亲和力范围(图5A)。来自供体1的两次单独抽血的样品1A和1B展现出相似的T细胞亲和力分布，表明iTAST的再现性(图5A)。为了理解该范围，将该亲和力转化成4秒接触下平均与TCR形成一个键所需pMHC的数量(图2B，等式3)。应该注意的是，该值没有考虑在4秒之前断裂的键，也没有考虑键的寿命，因此该计算将高估实际所需pMHC的数量。考虑如此，发现该亲和力范围转化成对于最高亲和力TCR为最多5个所需pMHC和对于最低亲和力TCR为50,000个pMHC，这证明了T细胞对抗原超强的敏感性(Davis等,2007)(图5B)。
[0193] 因此，将TCR序列与2D亲和力关联的能力提供了调查人TCR结合该pMHC的分子机制的方法。选取来自供体A和B经亲和力测试的细胞进行单细胞TCR测序，并且对成对TCRαβ分别实现了69％和53％的成功率。在连续T细胞转移之间未发现RNA污染(图14)。在所有供体中发现TRAV38-2基因的大量富集，但是未在β链使用中发现(图15)。然而，该富集没有在亲和力中反映，因为含有TRAV38-2的TCR重现了约500倍的亲和力范围(图15)。该结果与最近的证据一致，即一个TCR半链(hemichain)可以决定特异性，TCR反链可以在很宽的范围内调节亲合力(avidity)。(Nakatsugawa等,2015)。
[0194] 通常测量TCR亲和力和TCR序列还提供了一种在库中追踪T细胞克隆性的方式。对于来自供体A的24个成功配对的TCR序列，发现具有相同序列的两个TCR。这两个TCR具有类似水平的亲和力，而这进一步证明了iTAST的准确性。由于未免疫表型并不是专门分选的，因此源自相同谱系的两个T细胞有可能由于与另一表位具有交叉反应性的稳态增殖而已经被捕获(Su等,2013)。事实上，供体A含有大比例的结合HCV-streptamer的效应物T细胞，尽管是HCV血清反应阳性的(图10G)。
[0195] 实施例3–细胞功能的iTAST 2D亲和力
[0196] 考虑到iTAST在癌症过继T细胞转移和免疫监测中的潜力，接下来确定通过iTAST测量的2D亲和力是否是细胞功能的预测因子。将43个HCV特异性CTL体外扩增成克隆，并且通过其杀伤用HCV肽脉冲的JY靶细胞的能力评估功能性。所有克隆特异性地结合并且在2D亲和力测量中HCV肽加载的pMHC的上述背景粘附水平。发现2D亲和力与裂解能力显著相关，功能性的阈值起始于约2x105um4的2D亲和力，其转化成对T细胞活化约1200个pMHC的需求(图5B、5C)。有趣的是供体3(年龄为33岁的最年轻供体)比来自供体1和2的细胞含有显著更多高于该亲和力阈值的细胞，供体1和2分别为49岁和62岁，两者含有更多低于该阈值的细胞(图5A和14)。功能性和非功能性细胞之间基于2D亲和力的清晰描绘表明iTAST可以在不诱导其他试验需要的T细胞活化的情况下预测细胞的功能性潜力，并且能够进一步研究不同个体(例如由于年龄而不同的那些)之间的T细胞库差异。
[0197] 除了功能性状态，TCR-pMHC亲和力还影响肽效力，其被定义为效应物CTL诱导10％特异性裂解用HCV肽脉冲的JW细胞所需的最小肽浓度。肽效力是CTL体内功效的重要参数，因为它与激活CTL并引起功能性响应所需的最小抗原加载有关。由HCV特异性CTL克隆看出，单细胞2D亲和力和肽效力之间存在显著的相关性(图4B和11)。一种竞争性且广泛使用的鉴定高效力CTL的原位技术是通过用HLA-A2-CD8mut四聚体的染色强度。四聚体染色与裂解能力或肽效力不存在显著的相关性(图4C和D)。虽然四聚体染色高于背景水平的所有克隆都是功能性的，但是与过往的研究一致，多个克隆并没有染色，尽管具有与阳性染色的细胞相当的裂解能力和效力。单细胞2D亲和力未出现这样的高假阴性率，因此提供了比四聚体染色更高的预测价值。此外，使用单细胞2D亲和力得到的所有相关性与通过在各T细胞克隆中将若干测量值平均而得的常规2D亲和力一致(图12)。
[0198] 除了描绘了细胞功能性，还在功能性克隆的2D亲和力和其功能性亲合力之间观察到显著的相关性，通过其对肽的敏感性定义(图16)。鉴定功能性CTL的另一广泛使用的技术是用含有突变的pMHC的四聚体染色以消除CD8结合。发现这并不是细胞功能性强有力的预测因子，并且忽略了具有高裂解能力的多个克隆(图4)。这证明iTAST提供了快速、可信且无偏见的方法来鉴定用于免疫疗法的高亲和力功能性CTL克隆。
[0199] 为了进一步证明iTAST的实用性以及其与SPR测量的一致性，对之前已经表征的对人肿瘤抗原NY–ESO-1具有特异性的1G4TCR的2D亲和力进行测试(Chen等,2005)。最近，通过SPR测量，工程改造的T细胞的过继转移在患有多发性骨髓瘤的患者中已经显示出成功的临床反应(Rapaport等,2015)，所述工程改造的T细胞含有1G4亲和力增强的变体。通过iTAST测量的2D亲和力和通过SPR测量的3D亲和力(图3C)之间存在显著程度的相关性，使用1G4TCR的一组NY-ESO-1肽变体，不同之处在于iTAST测量在几小时内获得。
[0200] 使用iTAST研究抗原特异性CTL前体在健康个体中的亲和力分布，所述健康个体尚未暴露于其关联抗原。抗原特异性CTL为这样的异质细胞群，其使用通过VDJ重组生成的不同TCR识别相同pMHC。在未暴露的个体中，这些细胞极其稀有并且以约每104至106个CTL中1个的频率存在。作为一个模型系统，在健康HCV血清反应阴性血液供体内分离未免疫的丙型肝炎病毒(HCV)特异性CTL群，该CTL群结合与HLA-A2复合的HCVns3:1406-1415(SEQ ID NO:1KLVALGINAV)表位。
[0201] 发现分离自源于9个独特供体的12个样品的HCV特异性CTL具有106个总CTL中2至18个的频率(图13)，与之前的研究一致。由一个单位的白血球单采术，将会获得50至1000个之间的HCV特异性T细胞。在该抗原特异性T细胞库中出人意料地发现了超过1000倍的大亲和力范围(图5A)。还将2D亲和力转化成4秒时与TCR形成平均一个键所需的pMHC数量(等式2和图5B)；应当注意的是，该值将会高估所需pMHC实际数量，因为其没有考虑早期可能的瞬时结合。考虑如此，2D亲和力范围转化为这样的需求，所述需求为至多约5个pMHC以最高亲和力结合CTL，而对于最低亲和力CTL约为50,000个pMHC(图5B)。
[0202] 供体之间的HCV特异性CTL群亲和力分布存在一致的异质性(图5A)。样品4A-B和5A-C分别表示在7个月的时间跨度内收集的来自供体4和5的重复抽血。来自相同供体的样品在T细胞亲和力中表现出相似的分布，而供体4和5之间的分布显著不同，其中后者含有较低的中值T细胞亲和力。为了研究这种异质性是否与年龄相关，招募了33岁或更年轻和49岁或更老的其他健康HCV血清反应阴性供体以进行iTAST测量。对于9个独特的供体，发现年轻供体内的未免疫HCV特异性CTL相比年长供体具有显著更高的中值2D亲和力(图5C)。由之前-5 4
为体外功能性确定的2D亲和力阈值2x10 μm (图4A)，还发现年长供体含有比年轻供体显著较低分数的功能性HCV特异性CTL。
为体外功能性确定的2D亲和力阈值2x10 μm (图4A)，还发现年长供体含有比年轻供体显著较低分数的功能性HCV特异性CTL。
[0203] 选取来自样品4B、5A、6和7的经亲和力测试的CTL用于单细胞TCR扩增和测序。实现了43-56％的TCRα和44-75％的TCRβ成功率，这相当于其他单细胞TCR扩增方法，并且在连续T细胞转移之间不存在RNA污染(图17)。TCRαV基因(TRAV)的使用惊人的狭窄，其几乎完全由TRAV38-2组成，而TCRβV基因(TRBV)使用更加多样(图5D)；这一趋势在所有四个供体之中一致。含有TRAV38-2的TCR重现了整个亲和力范围，并且与不含TRAV38-2的TCR在2D亲和力中没有区别。
[0204] 此外，观察到两对CTL，其各自含有分离自不同供体的不同的TCRβ序列但相同的TCRα序列。第一TCR对还共享相同的TCRβV基因，仅在CDR3β区域存在差异。尽管有这种相似-4 -6 4性，但是它们的2D亲和力相差50倍(2.2x10 相对4.2x10 μm)。较高亲和力TCR在CDR3β区域含有比较低亲和力TCR(SEQ ID NO:3CASGQGQETQYF，17％疏水性)更大比例的疏水性残基(SEQ ID NO:2CASKMGAEAFF，54％疏水性)。有可能是CDR3β区域内的疏水性残基与疏水性程度较大的HCV肽(SEQ ID NO:1KLVALGINAV，70％疏水性)相互作用以增加TCR亲和力。该观测-5 -6 4
通过第二TCR对支持，其中2.5倍较小的2D亲和力差异(1.1x10 相对4.4x10 μm)与高(SEQ ID NO:4CASSLEREGRGEQFF，27％疏水性)和低(SEQ ID NO:5CATSIDRGREKLFF，36％疏水性)亲和力TCR之间CDRβ疏水性残基比例中的较小差异相关。因此，CDR3β链中疏水性残基是TCR与HCV肽的亲和力的潜在调节剂。
通过第二TCR对支持，其中2.5倍较小的2D亲和力差异(1.1x10 相对4.4x10 μm)与高(SEQ ID NO:4CASSLEREGRGEQFF，27％疏水性)和低(SEQ ID NO:5CATSIDRGREKLFF，36％疏水性)亲和力TCR之间CDRβ疏水性残基比例中的较小差异相关。因此，CDR3β链中疏水性残基是TCR与HCV肽的亲和力的潜在调节剂。
[0205] 因此，本公开提供了用于直接由分离自人血的原代CTL快速原位测量TCR亲和力和序列的技术。癌症的过继免疫疗法需要遗传工程改造患者的T细胞以表达用于癌症抗原的高亲和力TCR。当前依赖于定向进化以改善TCR结合的方法可导致特异性降低并且产生危险的交叉反应性(Zehn等,2009)。藉由iTAST，以给定亲和力分离源自于人的TCR的能力将允许快速选择用于癌症免疫疗法的TCR。此外，已经显示来自CMV血清反应阴性患者的未免疫CMV特异性CTL可以提供用于过继免疫疗法的其他保护性免疫(Hanley等,2015)。iTAST测量低大小样品群(如未免疫细胞)的能力在过继疗法中对持续性病毒感染非常有用。总之，iTAST在对于TCR亲和力的基础研究以及在对癌症、感染和免疫CTL应答概况的临床应用中具有广泛应用。
[0206] 实施例4–材料和方法
[0207] 人CD8+T细胞富集：人白细胞还原系统(LRS)室获自德克萨斯州中部的血液和组织中心，严格遵守德克萨斯大学奥斯汀分校机构审查委员会的指导。.
[0208] CD8+T细胞富集按照之前所述方案完成(Knabel等,2002)。首先将LRS室中的内含物在磷酸缓冲盐水(PBS)中稀释，然后添加ROSETTESEPTM CD8+T细胞富集混合物(干细胞公司(STEMCELL))进行20分钟室温孵育。将细胞以2000rpm离心15分钟，在室温下没有破裂，添加Ficollpaque(GE健康公司(GE Healthcare))。收集富集的CD8+T细胞部分，然后使用ACK裂解缓冲液(隆萨公司(Lonza))裂解RBC。在PBS中用10％FBS洗涤收，细胞混合物通过70um过滤器(康宁公司(Corning))。对于实验的剩余物，将细胞保存于冰上或至于4℃冰箱内。
[0209] Streptamer分选和解离：整个过程在冰上或于4℃进行。用FACS缓冲液(PBS，2mM EDTA，2％v/v FBS，叠氮化钠)洗涤以此富集的CD8+细胞，并用0.5μg PE偶联的streptamer染色1小时。然后在FACS缓冲液中洗涤两次，并用抗-PE微珠(美天旎公司(Miltenyi))染色20分钟。在用FACS缓冲液两次洗涤后，将细胞通过美天旎(Miltenyi)LS柱。收集流通液流用于背景染色和频率计算。
[0210] 将富集的部分从柱洗脱，并在抗体染色前洗涤一次。使用针对非-CD8+T细胞标记物CD56、CD4、CD14、CD16、CD19、CD32以及7AAD活力标记物的抗体对富集的部分和100μl流通液流进行30分钟染色。在一些样品中，还添加了CD45RA和CCR7抗体用于表型分析。将这些富集的部分洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中并对珠计数。使用BD FACS AriaII系统将四聚体阳性CD8+T细胞分选到500μL解离缓冲液(40％v/v FACS缓冲液，40％v/v FBS，过量D-生物素)中。1.0小时孵育后，分选的细胞在CTL培养基(RPMI+10％FBS+4％人血清+1％青霉素/链霉素)中洗涤两次，并储存于4℃至iTAST实验。
[0211] HCV特异性CTL系：HCV特异性CTL系根据之前公开的方案(Knabel等,2002)生成。简言之，使用基于链霉亲和素的常规四聚体以与streptamer相同的分离过程将单细胞分选至96孔圆底板中的100uL CTL培养基中。向各孔添加7.5x104个同种异体经辐射的人PBMC，以及150U/ml IL-2(Preprotech)、60ng/ml抗-CD3(OKT3)和60ng/ml抗-CD28(CD28.2)。每隔2-
3天用150U/ml IL-2中的新鲜CTL培养基交换培养物。14-21天后，将克隆转移至24孔板，并用5μl/ml PHA和7.5x104/ml同种异体经辐射的人PBMC再刺激。再刺激后10-21天分析功能性状态。每隔3天用含有CTL的新鲜培养基交换JY细胞并维持其低于500万细胞/ml，所述JY细胞为功能性研究的靶标。
3天用150U/ml IL-2中的新鲜CTL培养基交换培养物。14-21天后，将克隆转移至24孔板，并用5μl/ml PHA和7.5x104/ml同种异体经辐射的人PBMC再刺激。再刺激后10-21天分析功能性状态。每隔3天用含有CTL的新鲜培养基交换JY细胞并维持其低于500万细胞/ml，所述JY细胞为功能性研究的靶标。
[0212] 微量移液管粘附频率试验：使用前述微量移液管粘附频率试验测量TCR-pMHC亲和力(Davis等,2007)。简言之，涂覆有pMHC的血红细胞(RBC)和T细胞于室温通过两个相对的微量移液管在室温下吸取。两个移液管使用高精度液压显微操作器进行控制。使用线性运动压电致动器首先使RBC与T信标进行受控的接触，所述线性运动压电致动器连接含有RBC的微量移液管。当回缩RBC时，阳性粘附事件对应于在接触的面积拉伸柔性RBC膜。区分无粘附和粘附事件的能力是明确的。每个细胞进行50次接近、接触和回缩循环以获得粘附的可能性。
[0213] 对于CTL克隆，粘附曲线可以通过在多个结束时间获得粘附概率确定。将其与二维表面可逆双分子相互作用的已知模型拟合(Moon等,2007)：
[0214] Pa＝1-exp{-mrmlAcKa[-kofft]} (等式1)。
[0215] 其中，Pa是粘附频率，mr是TCR位点密度，ml是pMHC位点密度，Ac是RBC和T细胞的接触接触面积，Ka是2D亲和力，koff是2D解离速率常数，t是接触时间。Ac对于所有测量保持恒定，并且据估计根据来自显微镜的长度校准图像，其将在3μm2几个百分点之内。然而，因为不可能知道确切的接触面积，AcKa在所有2D亲和力公开文献中被用作有效的2D亲和力5，单位为μm4。
[0216] pMHC和T细胞受体的位点通过流式细胞术测量。对于位点密度，约105个T细胞或RBC分别与5μl PE标记的抗-人αβTCR(拜来及公司(Biolegend)克隆IP26)或5 ul PE标记的抗-HLA-A2抗体(拜来及公司BB7.2)于4℃ FACS缓冲液中孵育1小时。在BD Accuri中进行测量，并且使用BD定量(quantibrite)珠根据生产商说明对位点密度进行定量。
[0217] 测量原代T细胞亲和力和转移用于测序：将Streptamer解离的抗原特异性T细胞添加至显微镜室，以及具有不同位点密度HCV-HLA-A2-CD8突变的5个PBC群。RBC位点密度范围在约5位点/μm2至2000位点/μm2。在等式1中，随着t趋向无穷大，Pa达到平衡值：
[0218] AcKa＝-ln(1-Pa，eq)/mrml (等式2)。
[0219] 对于原代CTL亲和力，使用等式2并通过测量4秒处的粘附频率来确定2D亲和力值。如果粘附频率在10次接触后小于30％，那么将使用具有更高位点密度的新的RBC并再次测量粘附频率直到至少30％达到10次接触。当测量30次接触时，用转移微量移液管吸取细胞，从亲和力测试室取出，然后进入PCR管中的4 uL裂解缓冲液中。
[0220] 使用粘附频率Pa的另一种方式是用于计算平均结合数量：
[0221] Pa＝1-exp(-)
[0222] ＝mrmlAcKa。
[0223] 然后使用3μm2近似接触面积推导出形成1个平均键数量所需的pMHC数量：
[0224]
[0225] LDH细胞毒性试验：JY细胞以1x106/ml悬浮CTL培养基，并用50μM HCVns3:1406-1415肽过夜培养。HCV特异性CD8+T细胞克隆和JY细胞用CTL培养基洗涤3次。对于裂解能力，
4 5
10个JY细胞和10个T细胞悬浮于100μl CTL培养基中，200g离心1分钟，然后与37℃培养4小时。对于肽敏感性，使用6x103个JY细胞和6x104个T细胞。按照生产商说明使用Pierce LDH细胞毒性试验试剂盒(赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific))。简言之，50μl细胞上清液和50μl反应混合物于室温孵育30分钟。添加50μl终止溶液，使用标准酶标仪测量吸光度。按照下述公示计算特异性裂解百分比。
4 5
10个JY细胞和10个T细胞悬浮于100μl CTL培养基中，200g离心1分钟，然后与37℃培养4小时。对于肽敏感性，使用6x103个JY细胞和6x104个T细胞。按照生产商说明使用Pierce LDH细胞毒性试验试剂盒(赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific))。简言之，50μl细胞上清液和50μl反应混合物于室温孵育30分钟。添加50μl终止溶液，使用标准酶标仪测量吸光度。按照下述公示计算特异性裂解百分比。
[0226]
[0227] 其中，α为490nm和680nm之间的吸光度差异，一式三份进行。α特异性表示与HCV脉冲的JY细胞孵育的T细胞。α对照表示与非肽脉冲的JY细胞孵育的T细胞。α最大表示按照Pierce说明裂解的JY细胞。α自发性表示通过其自身孵育的JY细胞。
[0228] 四聚体制备和CTL克隆的染色：如之前所述制备UV交换的四聚体(Knabel等,2002)。将10μg HLA-A2UV可切割单体与100uM肽添加并在冰上UV交换40分钟，然后于4℃复苏过夜。然后将PE标记的链霉亲和素(拜来及公司)以4:1的比例添加至UV交换的HLA-A2。
[0229] 对于四聚体染色，将CTL克隆与0.14μg四聚体化HLA-A2/cd8mut和2ul的CD8抗体(DK25)在50ul FACS缓冲液中以4℃孵育1小时。使用BD Fortessa进行测量。
[0230] 亲和力测量误差的定量：由伯努利(Bernoulli)过程引起的偏差是粘附频率和进行接触数量(n＝50)的函数。为了测量胞间TCR表达变化，涂覆有抗-TCR抗体的RBC用于测量其与数个CTL的粘附频率。为了测量pMHC变化，使用一个CTL克隆细胞来测量其针对数个RBC的粘附频率。最后，为了测量一个细胞上的TCR表达的空间均匀性，在数个位置经由轻柔敲击以使其旋转来测量一个T细胞的粘附频率。
[0231] 单细胞TCR扩增：依照公开方案的修饰版本进行单细胞TCR扩增和测序(Han等,2014)。简言之，将单个CD8+T细胞直接转移至裂解缓冲液中，并且立即进行逆转录或在将冷冻裂解物解冻后进行逆转录。PCR后，将数个细胞汇集，凝胶纯化并在Ilumina Mi-seq V2试剂盒进行测序。.
[0232] TCR序列分析：首先过滤原始读数，并且根据共有序列将其分成α和β链组。对于α和β链组，按照细胞条码进一步将读数区分。在各细胞中，根据序列相似性进一步将读数聚类。对于单独的T细胞有可能具有第二功能性α链和非功能性β链。用于检测第二链的阈值为与第二链相关的读数数量，所述第二链的丰度比第一链小10倍或更多。对于各聚类，根据该位置处通过质量评分加权的共同核苷酸生成一个共同序列。依照该方法，可以生成针对各单个细胞的TCRα和β链序列。MIGEC工具用于V/J分配和CDR3注释。
[0233] ***
[0234] 根据本公开，本文公开和权利要求的所有方法无需过多实验即可进行和执行。虽然以优选实施方式的形式描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员显然了解，可将各种改变施用于本文所述方法以及本文所述方法的各个步骤或各步骤的顺序，而并不背离本发明的概念、精神和范围。更具体说，显然某些化学和生理相关试剂可代替本文所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。认为本领域技术人员了解的所有这些类似的取代物或改进都在所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念内。
[0235] 参考文献
[0236] 下列参考文献都特定通过引用纳入本文，它们对本文陈述的内容提供示例性、程序上或其他细节上的补充。
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