改进的用于过继细胞治疗的细胞培养方法
阅读：996发布：2020-05-13
专利汇可以提供改进的用于过继细胞治疗的细胞培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种改进的培养用于细胞 治疗 应用之细胞的方法，其包括在 抗原 呈递细胞和/或饲养细胞的存在下并且以最高1ml/cm2的培养基体积与表面面积比(如果生长表面不含透气性材料)和以最高2ml/cm2的培养基体积与表面面积比(如果生长表面包含透气性材料)来培养期望细胞。在生产循环开始时，期望细胞的表面 密度 为低于0.5×106个细胞/cm2，并且期望细胞的表面密度加抗原呈递细胞和/或饲养细胞的表面密度为至少约1.25×105个细胞/cm2。，下面是改进的用于过继细胞治疗的细胞培养方法专利的具体信息内容。
1.一种静态动物细胞培养和细胞回收装置，其包含：
内部体积；以及
生长表面，其包含透气性材料；
上挡边，其定义出所述内部体积的最上位置；
细胞移出导管，其包含细胞移出开口；
培养基移出导管，其包含培养基移出开口；其中
所述培养基移出开口与所述生长表面之间的距离大于所述细胞移出开口与所述生长表面之间的距离；并且
所述装置不包含用于驱使气体通过所述生长表面之所述透气性材料的泵或其他机械。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述透气性材料是液体不可透过的。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述透气性材料不是多孔的。
4.根据权利要求1所述的装置，其不包含用于混合细胞和/或培养基的搅拌机械或任何其他机械。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述上挡边与所述生长表面之间的距离为2.0cm或更大。
6.根据权利要求1所述的装置，其中生长支持表面与所述生长表面接触，所述生长表面处于水平位置并且当所述装置培养细胞时气体与所述生长表面接触。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述培养基移出导管与所述生长表面之间的距离是所述上挡边与所述生长表面之间的距离的50％或更小。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述培养基移出导管与所述生长表面之间的距离为0.2cm或更大。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述培养基移出导管与所述生长表面之间的距离为2.0cm或更小。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述细胞移出导管与所述生长表面之间的距离为0.2cm或更小。
11.根据权利要求1所述的装置，其包含至少一个连接所述上挡边与所述生长表面的壁，其中至少一个壁与所述生长表面垂直。
12.根据权利要求10所述的装置，其中所述细胞移出开口定位于至少一个壁与所述生长表面接触的位置附近。
13.根据权利要求1所述的装置，其包含多于一个培养基移出导管，各个培养基移出导管与所述生长表面之间的距离不同。
14.根据权利要求11所述的装置，其中至少一个所述培养基移出导管与所述生长表面之间的距离为所述生长表面与所述上挡边之间的距离的50％或更小。
15.根据权利要求1所述的装置，其包含排出过滤器。
改进的用于过继细胞治疗的细胞培养方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请是于2010年12月8日提交的题为“IMPROVED METHODS OF CELL CULTURE FOR ADOPTIVE CELL THERAPY”的美国专利No.12/963,597(下文中称为“母案”)的部分继续申请，所述母案要求于2009年12月8日提交的标题也为“IMPROVED METHODS OF CELLCULTURE FOR ADOPTIVE CELL THERAPY”的美国临时申请No.61/267,761的权益，这些申请通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明一般地涉及培养细胞的方法，并且更具体地，涉及培养用于细胞治疗的细胞。
背景技术
[0004] 细胞培养是细胞治疗的成本和复杂性的主要贡献者。使用现有方法，培养细胞的方法既耗时间又昂贵。通常，为了产生大量细胞，采取分阶段进行的体外培养方法。在最早阶段，期望细胞是放入细胞培养装置中的细胞组合物内的相对小的群体。在该阶段，细胞组合物通常包含期望细胞的来源(例如外周血单核细胞)、刺激期望细胞生长和/或抗原呈递的饲养细胞。使细胞所处的培养基处于一般非扰动状态的培养装置和方法是受欢迎的，因为细胞保持相对非扰动。这样的装置包括标准组织培养板、培养瓶和培养袋。分阶段的培养方法一般由以下组成：使细胞组合物消耗(deplete)培养基的生长底物(例如葡萄糖)，去除经消耗的培养基，用新鲜培养基更换经消耗的培养基，以及重复以上过程直至得到期望量的期望细胞。当期望细胞群体增加并且需要额外的生长表面时，经常将细胞组合物移至另一些装置中以起始新的生产阶段。然而，使用常规方法，当生长表面上的细胞群体增大时，期望细胞的群体生长速率降低。最终结果是，生产出可观的期望细胞群体是非常耗时并且复杂的。
[0005] 本领域现有的用于产生对埃巴病毒具有抗原特异性的T淋巴细胞(T lymphocytes with antigen specificity to Epstein Barr virus，EBV-CTL)的生产方法提供了生产复杂性的一个实例。用于EBV-CTL之最优扩增的常规方法使用标准24-孔组织培养板，2
每个孔中具有用于细胞处于其上的2cm 表面积，并且由于气体传递的需要而将培养基
2
体积限制为1ml/cm。该培养方法开始是，使包含外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的细胞组合物处于经辐照的抗原呈递细胞系(其可为类淋巴母
2
细胞系(lymphoblastoid cell line，LCL)的存在下，表面密度(即，每cm 生长表面的细
6 2 4 2
胞)比为约40∶1，具有约1×10PBMC/cm 和2.5×10 经辐照的抗原呈递细胞/cm。这激起细胞组合物中的EBV-CTL群体在量上扩增。9天后，在以4∶1的新表面密度比存在经辐
5 2
照的抗原呈递LCL并且最小表面密度为约2.5×10EBV-CTL/cm 的情况下，再次选择性扩增
2
EBV-CTL。使培养基体积限制在最大比率为1ml/cm 生长表面面积，以使氧能够达到细胞，这
6 2
限制了诸如葡萄糖等生长溶质。结果，可实现的最大表面密度为约2×10EBV-CTL/cm。因
6 2 5 2
此，每周最大的细胞扩增是约8倍(即，2×10EBV-CTL/cm 除以2.5×10EBV-CTL/cm)或更低。EBV-CTL的持续扩增需要每周将EBV-CTL转移至具有抗原再刺激的其他24-孔板中，并且每周更换两次24-孔板每个孔中的培养基和生长因子。因为常规方法在EBV-CTL表面密度接近每个孔可能的最大量时导致EBV-CTL群体的扩增速率减慢，所以必需在长的生产时间(经常长达4周至8周)中重复这些操作，以得到用于细胞输注和质量控制测量(例如无菌度、一致度和效力测定)的足够量的EBV-CTL。
每个孔中具有用于细胞处于其上的2cm 表面积，并且由于气体传递的需要而将培养基
2
体积限制为1ml/cm。该培养方法开始是，使包含外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的细胞组合物处于经辐照的抗原呈递细胞系(其可为类淋巴母
2
细胞系(lymphoblastoid cell line，LCL)的存在下，表面密度(即，每cm 生长表面的细
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胞)比为约40∶1，具有约1×10PBMC/cm 和2.5×10 经辐照的抗原呈递细胞/cm。这激起细胞组合物中的EBV-CTL群体在量上扩增。9天后，在以4∶1的新表面密度比存在经辐
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照的抗原呈递LCL并且最小表面密度为约2.5×10EBV-CTL/cm 的情况下，再次选择性扩增
2
EBV-CTL。使培养基体积限制在最大比率为1ml/cm 生长表面面积，以使氧能够达到细胞，这
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限制了诸如葡萄糖等生长溶质。结果，可实现的最大表面密度为约2×10EBV-CTL/cm。因
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此，每周最大的细胞扩增是约8倍(即，2×10EBV-CTL/cm 除以2.5×10EBV-CTL/cm)或更低。EBV-CTL的持续扩增需要每周将EBV-CTL转移至具有抗原再刺激的其他24-孔板中，并且每周更换两次24-孔板每个孔中的培养基和生长因子。因为常规方法在EBV-CTL表面密度接近每个孔可能的最大量时导致EBV-CTL群体的扩增速率减慢，所以必需在长的生产时间(经常长达4周至8周)中重复这些操作，以得到用于细胞输注和质量控制测量(例如无菌度、一致度和效力测定)的足够量的EBV-CTL。
[0006] EBV-CTL的培养只不过是细胞治疗固有的复杂细胞生产方法的一个实例。需要更实际的用于细胞治疗的可缩短生产时间同时降低生产成本和复杂性的培养细胞之方法。
[0007] 我们建立了在整个生产过程中提高群体生长速率的新方法，并且通过这样做降低了生产细胞所需的复杂性和时间。
[0008] 主要的非粘附细胞，例如抗原特异性T细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、骨髓浸润淋巴细胞(marrow infiltrating lymphocyte，TIL)以及胰岛，通常是生产的焦点。旨在增加期望细胞(常常被称为效应细胞)之群体的许多生产方法常常在共培养条件下依靠其他细胞类型来刺激期望细胞的生长和/或抗原特异性。在共培养中使用的细胞常常称为饲养细胞和/或抗原呈递细胞。在一些情况下，共培养物转变成在没有饲养细胞和/或抗原呈递细胞的情况下扩增期望的细胞群体，例如TIL生产。在没有效应细胞的情况下生产抗原呈递细胞和/或饲养细胞也是普遍的。此外，有时培养旨在维持细胞群体的健康而不是增加群体本身，例如用于糖尿病治疗的胰岛培养。因此，用于过继细胞治疗(Adoptive Cell Therapy)的细胞培养的培养装置和生产方法必须处理多种可能的生产应用。
[0009] 为了能够宽范围地使用过继细胞治疗，需要大大地简化细胞生产方法，并使之更便宜。然而，本领域现有的用于生产的装置和方法不能实现这一点。以下简略地解释为什么情况会如此。
[0010] 过继细胞治疗领域现有的广泛依靠的装置是静态细胞培养装置，即，细胞培养板、细胞培养瓶和透气性袋。这些静态装置旨在使细胞在培养期间彼此靠近地存在，以促进共培养物之间的通信和/或使非共培养物保持物理静止。出于熟练的技术人员所公知的多种生物学原因，这种物理非扰动状态是有益的。此外，静态细胞培养装置不复杂，并且在其运行过程中不需要持续使用辅助设备来灌注培养基或使气体通过装置、例如通过鼓泡、搅拌或震荡设备来搅拌培养基和/或使细胞不沉淀至装置的底部。因此，静态装置与标准实验室和细胞培养设备(例如孵育器)是相容的，并且对辅助设备具有最小的依赖性，或没有依赖性。虽然静态装置具有所描述的优点，但是它们也存在固有的问题，妨碍了有效的和实用的生产用于过继细胞治疗的细胞。
[0011] 这些固有问题之一是培养基可在生长表面以上存在的高度受限，根据制造商的建议，范围从在板和瓶中的约0.3cm的上限至透气性袋中的2.0cm。因此，板和瓶具有不2
高于0.3ml/cm 的受限的培养基体积与生长表面面积之比，并且透气性袋被限制为不高于
2
2.0ml/cm。将板、瓶和袋的设计限制与其在过继细胞治疗领域中使用的现有方案相结合，
6 6
使细胞密度狭窄地限制在0.5×10 至2.0×10 细胞/ml的范围，并且这固有地依靠以至
6 2
少0.5×10 细胞/cm 的表面密度启始培养。这些限制导致了多种问题使得用于过继细胞治疗的细胞生产无法实施，所述问题包括，在方法中的装置量过多、维持培养物的过度劳动量、高的污染风险和/或生产细胞的长持续时间。培养袋具有的独有问题是，培养袋的日常处理导致细胞从它们所存在的位置受到扰动，并散布于培养基中。
高于0.3ml/cm 的受限的培养基体积与生长表面面积之比，并且透气性袋被限制为不高于
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2.0ml/cm。将板、瓶和袋的设计限制与其在过继细胞治疗领域中使用的现有方案相结合，
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使细胞密度狭窄地限制在0.5×10 至2.0×10 细胞/ml的范围，并且这固有地依靠以至
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少0.5×10 细胞/cm 的表面密度启始培养。这些限制导致了多种问题使得用于过继细胞治疗的细胞生产无法实施，所述问题包括，在方法中的装置量过多、维持培养物的过度劳动量、高的污染风险和/或生产细胞的长持续时间。培养袋具有的独有问题是，培养袋的日常处理导致细胞从它们所存在的位置受到扰动，并散布于培养基中。
[0012] 在Wilson等的共同未决美国公开No.2005/0106717 A1(以下称为Wilson’717)和Wilson的2008/0227176 A1(以下称为Wilson’176)中已经介绍了板、瓶和袋的替代装置，并且在母案中介绍了用于培养的替代方法，所述母案公开了用于过继细胞治疗领域之细胞生产方法的特别强力的改进。Wilson’717描述了多种新的透气装置，其使得培养方法能够在垂直方向上进行扩展，越过了板、瓶和袋的培养基高度限制和培养基体积与生长表面面积之比的限制，使得能够更有效地利用物理空间。Wilson’176基于Wilson’717建立，使得能够在指定量的物理空间中存在甚至更大的生长面积。母案公开了使得能够对过继细胞治疗领域中常用的细胞进行更有效的共培养的发现，包括教导避开本领域现有的关于细胞表面密度的限制以提供宽范围的意想不到的益处。
[0013] 本发明基于母案和进一步改进了(特别是用于过继细胞治疗领域的)细胞生产之效率和实用性的新发现建立，并且基于Wilson’717和Wilson’176建立以使本文公开的多种新方法得以实施。
发明内容
[0014] 已发现，通过使用在整个生产过程中允许周期性地重建非常规条件的分阶段生产方法使得用于细胞治疗的细胞生产比当前的可能以更短时间和更经济的方式来进行。所述2
非常规的条件包括期望细胞的表面密度(即，细胞/cm)降低、期望细胞与抗原呈递细胞和/或饲养细胞的新的比，和/或使用包含具有增加培养基体积与表面面积之比的透气材料的生长表面。
非常规的条件包括期望细胞的表面密度(即，细胞/cm)降低、期望细胞与抗原呈递细胞和/或饲养细胞的新的比，和/或使用包含具有增加培养基体积与表面面积之比的透气材料的生长表面。
[0015] 本发明的实施方案涉及改进的培养用于细胞治疗应用之细胞的方法。它们包括通过使用使期望细胞群体在整个生产过程中保持比常规方法更高之生长速率的多种新方法来减少生产期望数量的期望细胞所需的时间、成本和复杂性的方法。
[0016] 本发明的一个方面依靠分阶段进行培养过程和在一个或更多个阶段的开始时建立允许期望细胞群体的生长速率超过当前可能的生长速率的条件。在培养的至少一个阶段，并且优选几乎所有阶段，建立包括以下的初始条件：期望细胞以非常规地低表面密度和非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/期望细胞的比存在于非透气性或透气性生长表面上。通过使用本发明该方面的新实施方案，期望细胞群体可在更短的时间内经历比常规方法允许的更多次翻倍，从而缩短生产时间。
[0017] 本发明的另一个方面依靠分阶段进行培养过程和在一个或更多个阶段的开始时建立使得期望细胞群体的生长速率超过当前可能之生长速率的条件。在培养的至少一个阶段，并且优选几乎所有阶段，建立包括以下的条件：期望细胞以非常规地高培养基体积与生长表面面积之比存在于包含透气性材料的生长表面上。通过使用本发明该方面的新实施方案，期望细胞群体可在更短的时间内经历比常规方法允许的更多次翻倍，从而缩短生产时间。
[0018] 本发明的另一个方面依靠分阶段进行培养方法和在每个阶段建立使得期望细胞群体的生长速率超过当前可能的生长速率的条件。在培养的至少一个阶段，并且优选几乎2
所有阶段，建立包括以下的初始条件：期望细胞以非常规地低表面密度(即，细胞/cm)和非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/期望细胞比存在于包含透气性材料的生长表面上，并且存在非常规地高培养基体积与生长表面面积之比。通过使用本发明该方面的新实施方案，期望细胞群体可在更短的时间内经历比常规方法允许的更多次翻倍，从而缩短生产时间。
所有阶段，建立包括以下的初始条件：期望细胞以非常规地低表面密度(即，细胞/cm)和非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/期望细胞比存在于包含透气性材料的生长表面上，并且存在非常规地高培养基体积与生长表面面积之比。通过使用本发明该方面的新实施方案，期望细胞群体可在更短的时间内经历比常规方法允许的更多次翻倍，从而缩短生产时间。
[0019] 我们发现了另外的细胞培养方法，其教导避开过继细胞治疗领域中的现有方法并基于母案的公开内容建立以使得所述培养和/或制备细胞的方法比现有的方法学更实用并且更有成本效率。
[0020] 在本发明使用透气性细胞培养装置来培养细胞的一个实施方案中，当从表面密度2
(细胞/cm)和细胞密度(细胞/ml)比常规方法低之状态处于透气性装置中时，细胞能够启始生长(outgrowth)。
(细胞/cm)和细胞密度(细胞/ml)比常规方法低之状态处于透气性装置中时，细胞能够启始生长(outgrowth)。
[0021] 在本发明的使用透气性细胞培养装置来培养细胞的另一个实施方案中，在任意指定时间测定培养物中有多少细胞所需的细胞计数可替换为在任意指定的时间在培养基中取溶质样品并使用其来预测培养物中的群体。
[0022] 在本发明的使用透气性细胞培养装置来培养细胞的另一个实施方案中，提高培养基体积比生长表面面积以相对于本领域现有方法降低进给频率，或甚至完全消除在培养开始后对进给培养物的需要。
[0023] 在本发明的使用透气性细胞培养装置来培养细胞的另一个实施方案中，进一步提高培养基体积比生长表面面积以使细胞群体在达到其最大群体后可以高生存力存在的时间更长。
[0024] 在本发明的另一个实施方案中，公开了透气性细胞培养和细胞回收装置，其能够降低培养物中的培养基体积而无细胞损失、浓缩细胞而无需使用离心并且在从装置中移出细胞之前提高细胞密度。
[0025] 在本发明的另一个实施方案中，公开了用于新透气性细胞培养和细胞回收装置的方法，其能够降低培养物中的培养基体积而无细胞损失以使培养过程中操作者应当选择进给培养物时对装置数量之增加的需要最小化。
[0026] 在本发明的使用透气性细胞培养装置来培养细胞的另一个实施方案中，公开了通过在培养过程中使用APC来快速生产CAR T细胞并改进杀伤能力的方法。
[0028] 考虑结合附图详细描述的本发明的多个实施方案时，本发明可更完整的理解，其中：
[0029] 图1A示出实施例1中的抗原特异性T细胞群体在初始刺激后的第一个七天中经历至少7次细胞翻倍。
[0030] 图1B示出显示通过实施例1的四聚物分析确定的细胞组合物内T细胞群体随着时间的扩增量级。
[0031] 图1C，实施例1中经过23天的时间段内抗原特异性T细胞的群体生长速率逐渐降低。
[0032] 图2示出了描述实施例1中抗原特异性T细胞的潜在扩增与观察到的扩增倍数之间的差异的表格。
[0033] 图3A示出实施例2中在刺激后抗原特异性T细胞的存在。
[0034] 图3B示出实施例2中当表面密度从1×106/cm2降低至3.1×104/cm2同时保持4∶1的抗原特异性T细胞与抗原呈递细胞比时抗原特异性T细胞群体的扩增。
[0035] 图3C示出实施例2中当表面密度从1×106/cm2降低至3.1×104/cm2同时存在固定数量的抗原呈递细胞时抗原特异性T细胞群体的扩增。
[0036] 图4示出当继续进行图3中描述的工作时得到的结果的实例，其进一步证明，当期望细胞需要其他细胞的支持时，只要期望细胞存在充分的饲养细胞和/或抗原呈递细胞供应，非常规地低期望细胞表面密度就可起始群体扩增。
[0037] 图5示出直方图，其通过以三种不同的细胞密度(CTL/cm2)起始培养证明重复期望细胞群体扩增量级的能力。
[0038] 图6示出了用于生成数据的透气性受试装置(fixture)的截面图。
[0039] 图7A示出与实施例5中采取的常规方法相比根据本发明产生的抗原特异性T细胞的生长曲线。
[0040] 图7B示出，对于实施例5，如通过流式细胞正向比侧向散射分析测定的，根据本发明产生的抗原特异性T细胞的细胞生存力比常规方法显著更高。
[0041] 图7C示出，对于实施例5，如通过膜联蛋白-PI 7AAD(Annexin-PI 7AAD)测定的，根据本发明产生的抗原特异性T细胞的细胞生存力比常规方法显著更高。
[0042] 图7D示出，对于实施例5，如通过CFSE标记细胞的每日流式细胞分析所测定的，在本发明的新方法中产生的细胞的优异生长表现出与使用常规方法培养的细胞相同的细胞特异性生长速率，证实降低的细胞死亡导致提高的细胞扩增速率。
[0043] 图8A示出在无需更换培养基的情况下如何能够扩增EVB-CTL超越常规方法中可能的扩增。
[0044] 图8B示出，如通过对EBER的Q-PCR评价的，实施例6的培养条件如何不改变最终细胞制品。
[0045] 图8C示出，如通过对B细胞标志物CD20的Q-PCR评价的，实施例6的培养条件如何不改变最终细胞制品。
[0046] 图9示出了一个示例性实例，其中我们通过实验证明非常低的期望细胞和抗原呈递细胞的累积表面密度(在该情况下，AL-CTL细胞和LCL细胞组合以产生表面密度为2
30,000细胞/cm 的细胞组合物)不能起始AL-CTL群体的生长。
30,000细胞/cm 的细胞组合物)不能起始AL-CTL群体的生长。
[0047] 图10A呈现了实施例8的数据，其示出了两种培养细胞的新方法如何在23天时间内比常规方法生产更多细胞。
[0048] 图10B示出了在实施例8的受试装置中培养的细胞的照片。
[0049] 图10C示出，在实施例8中，两种新培养方法和常规方法都产生具有相同表型的细胞。
[0050] 图10D示出，对于实施例8，其中用来自EBV的LMP1、LMP2、BZLF 1和EBNA1的EBV肽表位刺激T细胞并且经HLA-A2-LMP2肽五聚体染色法染色的代表性培养物示出相似的肽特异性T细胞频率。
[0051] 图10E示出，如通过51Cr释放测定评价的，对于实施例8中的新方法和常规方法，细胞保持它们的溶细胞活性和特异性并杀伤自体EBV-LCL，并且对与EBV-LCL错配的EBV-LCL杀伤低。
[0052] 图11示出了在常规情况下期望细胞群体在生长表面上的扩增与使用本发明之一个方面的期望细胞类型的群体扩增相比较的图示。
[0053] 图12示出了可通过利用包含透气性材料和超过1ml/cm2或2ml/cm2的非常规地高培养基体积与生长表面面积之比的生长表面得到的优点的实例。
[0054] 图13示出了新方法的图示，在常规情况下在生长表面上的扩增期望细胞群体的新方法与在本发明的一个实施方案下期望细胞类型的群体扩增相比较，在该实施方案中，完成时的细胞表面密度比常规的表面密度大得多。
[0055] 图14示出了还提供超过常规方法之另外的优点的另一种细胞生产的新方法。
[0056] 图15示出图14中描述的每种生产方法的比较以证明新方法的强大，以及为什么其可用于在多个阶段调节生产方案从而充分地获得效率。
[0057] 图16示出了在新方法中操作者如何调节生产方案以在生产过程中增进效率的实例。
[0058] 图17A示出了在1.0E+06细胞/cm2下的实验条件和结果的代表性电子表格。
[0059] 图17B示出了在0.5E+06细胞/cm2下的实验条件和结果的代表性电子表格。
[0060] 图17C示出了在0.25E+06细胞/cm2下的实验条件和结果的代表性电子表格。
[0061] 图17D示出了在0.125E+06细胞/cm2下的实验条件和结果的代表性电子表格。
[0062] 图17E示出了在0.0625E+06细胞/cm2下的实验条件和结果的代表性电子表格。
[0063] 图18比较了群体增加相对于图17A至图17E中详述的每种实验条件之表面密度的扩增倍数。
[0064] 图19A示出在相同的起始条件(除了葡萄糖浓度之外)下培养K562细胞的实验条件和典型结果的代表性电子表格。
[0065] 图19B示出了在两种起始葡萄糖条件下在11天的时间阶段内细胞群体的扩增。
[0066] 图19C示出了每种培养条件的葡萄糖消耗速率。
[0067] 图19D示出了每种培养条件的葡萄糖消耗速率。
[0068] 图19E示出了使用公式计算预测的群体中的细胞数量与通过对培养物进行手动计数来测定的细胞数量的重叠图，起始葡萄糖浓度为240mg/dl。
[0069] 图19F示出了对于在葡萄糖浓度为240mg/dl起始的培养物，使用公式计算预测的群体中的细胞数量与通过手动计数测定的细胞数量的重叠图。
[0070] 图20示出了在多种培养基进给条件下群体生长的图示(对生长表面面积归一化)。
[0071] 图21示出了总结了证明使用葡萄糖消耗作为细胞群体替代检测之能力的实验在第0天、第9天和第16天之条件的电子表格。
[0072] 图22A示出本发明之细胞培养和细胞回收装置1000的一个实施方案的一个实例之截面图，所述装置1000配置成实施所公开的新细胞培养方法和/或新细胞回收方法。
[0073] 图22B示出了在培养的任何指定细胞生产阶段起始时的静态培养之初始状态的细胞培养和细胞回收装置1000。
[0074] 图22C示出了准备在减小的培养基体积中回收细胞的细胞培养和细胞回收装置1000。
[0076] 图23A示出了在培养开始时和在培养进行中评价A的条件。
[0077] 图23B示出了在培养开始时和在培养进行中评价B的条件。
[0078] 图23C示出了在培养开始时和在培养进行中评价C的条件。
[0079] 图23D示出了培养过程中多个时间点的培养物中的总活细胞。
[0080] 图23E示出在培养开始时和培养结束时CAR T细胞表达的百分比。
[0081] 图23F示出培养过程中CAR T细胞的总扩增倍数。
[0082] 图23G证明在评价A中预测的活细胞群体代表了手动技术测定的细胞群体。
[0083] 图23H示出了由条件A和条件B得到的细胞杀伤表达PSCA之肿瘤细胞的能力。
[0084] 图23I总结了对PSCA具有特异性的CAR T细胞群体扩增的并排比较。
[0085] 图24A示出了具有不同生长面积的三种透气性培养装置的群体生长曲线。
[0086] 图24B示出了归一化为表面密度后的图24A的群体生长曲线。
具体实施方式
[0087] 定义
[0088] 粘附细胞：贴附至生长表面的细胞
[0089] 抗原呈递细胞(APC)：起触发期望细胞对特定抗原进行应答之作用的细胞。
[0090] CTL：细胞毒性T细胞
[0091] 细胞密度：细胞数目/单位体积培养基的比(细胞/ml)
[0092] 期望细胞：生产方法旨在在量上进行扩增和/或回收的特定类型的细胞。一般而言，期望细胞是非粘附的，并且实例包括，调节性T细胞(Treg)、天然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、原代T淋巴细胞(primary T lymphocyte)和多种抗原特异性细胞，以及许多其他细胞(所有这些细胞还都可进行遗传改造以改进其功能、体内持久性或安全性)。临床用途所需的细胞可与饲养细胞和/或抗原呈递细胞一起扩增，所述饲养细胞和/或抗原呈递细胞可包括PBMC、PHA母细胞、OKT3T、B母细胞、LCL和K562，(天然的或经遗传改造以表达抗原和/或表位以及共刺激分子，例如41BBL、OX40、CD80、CD86、HLA以及许多其他分子)，这些细胞可用肽或其他相关抗原刺激(pulse)，或不进行刺激。
[0093] EBV：埃巴病毒
[0094] EBV-CTL：特异性识别EBV感染的细胞或者表达或通过其T细胞表面受体呈递来源于EBV之肽的T细胞。
[0095] EBV-LCL：埃巴病毒转化的B淋巴母细胞样细胞系(B lymphoblastoid cell line)。
[0096] 饲养细胞：作用为引起期望细胞在量上扩增的细胞。抗原呈递细胞也可在一些环境中充当饲养细胞。
[0097] 生长表面：培养装置内细胞处于其上的区域。
[0098] 起始培养：一般是指在培养过程开始时和/或在生产循环开始时的条件。
[0099] 培养基更换：与饲喂细胞同义，并且一般是通过其用新鲜培养基补充旧培养基的过程。
[0100] PBMC：来源于外周血的外周血单核细胞，其是一些期望细胞的来源，并且其可充当饲养细胞。
[0101] 效应细胞(R)：会对刺激细胞产生反应的细胞。
[0102] 静态细胞培养：一种在培养基中培养细胞的方法，其中除非当为了日常处理将培养装置从一处移动至另一处时和/或当周期性地进给新鲜培养基等时的情况之外，不搅拌或不混合所述培养基。一般而言，静态培养中的培养基通常是处于静止状态的。其不经历例如在以下系统中发生的受迫运动，灌注系统(其中培养基持续地移动通过容器)、振荡系统(其中物理地振荡培养装置以使培养基运动)、搅拌系统(其中搅拌棒在装置内运动以搅拌培养基和细胞)，或用于在整个培养持续时间中迫使培养基运动或混合的任何其他机械或设备。细胞沉降至装置中的生长表面，这里细胞以非扰动状态存在(偶然的进给时间除外)，此时通过以下方式向培养物提供新鲜培养基：首先移出培养基，然后添加培养基，通过添加培养基而不移出培养基，或者通过移出培养基和细胞并将培养基和细胞分配于新装置中并向这些装置中添加新鲜培养基。通常不用泵来辅助供给过程。例如，透气性细胞培养袋通常依靠重力或泵以封闭系统的方式使流体运动到培养袋中和从培养袋中流出。绝大部分的培养持续时间是其中细胞和培养基处于静止和非搅拌状态的时间。本发明涉及静态细胞培养方法。
[0103] 经刺激的：抗原呈递细胞和/或饲养细胞对期望细胞具有的作用。
[0104] 刺激细胞：会影响效应细胞的细胞。
[0105] 表面密度：装置中细胞依靠在其上的生长表面之每单位面积的细胞量。
[0106] 悬浮细胞：不需要贴附至生长表面的细胞，与非粘附细胞同义
[0107] 为了尝试找到新方法来简化用于过继T细胞治疗的期望细胞群体的生产，进行的一系列实验已经打开了更高效的用于细胞治疗应用的细胞培养的大门。描述了本发明的许多示例性实例和多个方面以指示如何能实现相对于常规方法缩短生产时间并降低复杂性的能力。
[0108] 实施例1：证明常规方法的限制。
[0109] 本实施例的数据证明了用于在标准24孔组织培养板(即，2cm2表面面积每孔)中2
使用每孔2ml培养基体积(即，1.0cm的培养基高度和1mi/cm 的培养基体积与表面面积之比)来生产EBV-CTL的常规培养方法的限制。
使用每孔2ml培养基体积(即，1.0cm的培养基高度和1mi/cm 的培养基体积与表面面积之比)来生产EBV-CTL的常规培养方法的限制。
[0110] 培养的阶段1，第0天：通过以下起始EBV-CTL群体的扩增：将来自正常供体的6
PBMC的细胞组合物(约1×10 细胞/ml)与经γ-辐照(40Gy)的抗原呈递自体EBV-LCL
2
以40∶1的比(PBMC∶LCL)以及1ml/cm 的培养基体积与生长表面比培养，从而在添加有
45％Click培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)和2mM GlutaMAX-I以及10％FBS
6 2
的RPMI1640中建立表面密度为约1×10 细胞/cm 的细胞组合物。
PBMC的细胞组合物(约1×10 细胞/ml)与经γ-辐照(40Gy)的抗原呈递自体EBV-LCL
2
以40∶1的比(PBMC∶LCL)以及1ml/cm 的培养基体积与生长表面比培养，从而在添加有
45％Click培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)和2mM GlutaMAX-I以及10％FBS
6 2
的RPMI1640中建立表面密度为约1×10 细胞/cm 的细胞组合物。
[0111] 培养的阶段2，第9至16天：在第9天，从阶段1产生的细胞组合物中收集6 2
EBV-CTL，以0.5×10EBV-CTL/cm 的表面密度将其重悬于新鲜培养基中，并且用经辐照的
6 2 5
自体EBV-LCL再刺激，CTL∶LCL比为4∶1(表面密度0.5×10CTL/cm ：1.25×10LCL/
2
cm)。在第13天，移出24-孔板每个孔的2ml培养基体积中的1ml，并用1ml含有重组人IL-2(IL-2)(50U/mL)(Proleukin；Chiron，Emeryville，CA)的新鲜培养基替换。
EBV-CTL，以0.5×10EBV-CTL/cm 的表面密度将其重悬于新鲜培养基中，并且用经辐照的
6 2 5
自体EBV-LCL再刺激，CTL∶LCL比为4∶1(表面密度0.5×10CTL/cm ：1.25×10LCL/
2
cm)。在第13天，移出24-孔板每个孔的2ml培养基体积中的1ml，并用1ml含有重组人IL-2(IL-2)(50U/mL)(Proleukin；Chiron，Emeryville，CA)的新鲜培养基替换。
[0112] 培养的阶段3，第17至23天：每周两次添加IL-2来重复阶段2的条件，并在第23天终止培养。虽然终止了培养，但是可能已经继续进行类似(mimicked)阶段2和3的额外培养阶段。
[0113] 用作细胞毒性测定之靶细胞的细胞系和肿瘤细胞：BJAB(B细胞淋巴瘤)和K562(慢性红细胞系白血病(chronic erythroid leukemia))得自美国典型培养物保藏中心(Amcrican Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD，USA)。将所有细胞用含有10％热灭活的胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、25IU/mL青霉素和25mg/mL链霉素(都来自BioWhittaker，Walkersville，MD)的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)中维持培养。将细胞保持在37℃包含5％CO2的湿润气氛下。
[0114] 免疫表型：
[0115] 细胞表面：用以下物质对细胞表面染色：来自Becton-Dickinson(Mountain View，CA，USA)的藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(periodin chlorophyll protein，PerCP)以及与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD3、CD4、CD8、CD56、CD16、CD62L、CD45RO、CD45RA、CD27、CD28、CD25、CD44之单克隆抗体(MAb)。使用与PE缀合的四聚体(Baylor College of Medicine)和与APC缀合的五聚体(Proimmune Ltd，Oxford，UK)来定量EBV-CTL前体频率。对于细胞表面染色和五聚体染色，我们在FACSCalibur流式细胞仪上分别获得了10,000和100,000个活的事件，并使用Cell Quest软件(Becton Dickinson)分析数据。
[0116] CFSE标记以测量细胞分裂：为了评估翻倍速率，将2×107PBMC或EBV特异性的CTL(EBV-CTL)洗涤两次，并重悬于850μl含有0.1％小牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)的1×磷酸缓冲盐水(PBS)中。在染色之前，将一份羧基-荧光素二乙酸，琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein diacetate，succinimidyl ester，CFSE)(10mM，于二甲亚砜中)(Celltracetm CFSE细胞增殖试剂盒(C34554)Invitrogen)解冻，用1×PBS以1∶1000稀释，将150μl稀释液添加至细胞悬浮液(标记浓度为1μM)中。在室温用CFSE孵育细胞10分钟。随后向细胞悬浮液中添加1ml FBS，接着在37℃孵育10分钟。然后，用1×PBS洗涤细胞两次，计数并用所述抗原刺激。
[0117] 膜联蛋白V-7-AAD染色：为了确定我们的培养物中凋亡细胞和坏死细胞的百分tm比，我们根据制造商的使用说明(BD Pharmingen #559763，San Diego，CA)进行了膜联蛋
6
白V-7-AAD染色。简言之，用冷PBS洗涤来自24-孔板或G-Rex的EBV-CTL，将其以1×10细胞/ml的浓度重悬于1×结合缓冲液中，用膜联蛋白V-PE和7-AAD在室温(25℃)于黑暗中染色15分钟。在孵育细胞后立即通过流式细胞术分析细胞。
6
白V-7-AAD染色。简言之，用冷PBS洗涤来自24-孔板或G-Rex的EBV-CTL，将其以1×10细胞/ml的浓度重悬于1×结合缓冲液中，用膜联蛋白V-PE和7-AAD在室温(25℃)于黑暗中染色15分钟。在孵育细胞后立即通过流式细胞术分析细胞。
[0118] 铬释放测定：如前文所述，我们在标准的4-小时51Cr释放测定中评价EBV-CT的细胞毒活性。对于期望细胞，我们使用了自体的和HLA I类和II类错配的EBV转化的类淋巴母细胞系(EBV-LCL)以测量MHC限制性杀伤和MHC非限制性杀伤，还使用了K562细胞系以测量自然杀伤细胞活性。分别使用在培养基中单独孵育的或在1％Triton X-100孵育的铬51 51
标记的期望细胞来测定自发的 Cr释放和最大 Cr释放。一式三份孔的平均特异性裂解百分比如下计算：[(测试计数-自发计数)/(最大计数-自发计数)]×100。
标记的期望细胞来测定自发的 Cr释放和最大 Cr释放。一式三份孔的平均特异性裂解百分比如下计算：[(测试计数-自发计数)/(最大计数-自发计数)]×100。
[0119] 酶联免疫斑点(ELIspot)测定：使用ELIspot分析来定量响应抗原刺激分泌IFNγ之T细胞的频率和功能。用经辐照的LCL(40Gy)或LMP1、LMP2、BZLF1和EBNA1pepmixes(稀释至1μg/ml)(JPT Technologies GmbH，Berlin，Germany)，或稀释至2μM终浓度的EBV肽HLA-A2GLCTLVAML＝GLC、HLA-A2CLGGLLTMV＝CLG、HLA-A2-FLYALALLL＝FLY和HLA-A29llLLARLFLY＝ILL(Genemed Synthesis，Inc.San Antonio，Texas)来刺
6
激在24孔板或G-Rex中扩增的CTL系，并且单独的CTL充当阴性对照。将CTL以1×10/ml重悬于ELIspot培养基[(补充了5％人血清(Valley Biomedical，Inc.，Winchester，Virginia) 和2-mM L- 谷 氨 酰 胺 (GlutaMAX-I，Invitrogen，Carlsbad，CA) 的 RPMI
1640(Hyclone，Logan，UT)]中。
6
激在24孔板或G-Rex中扩增的CTL系，并且单独的CTL充当阴性对照。将CTL以1×10/ml重悬于ELIspot培养基[(补充了5％人血清(Valley Biomedical，Inc.，Winchester，Virginia) 和2-mM L- 谷 氨 酰 胺 (GlutaMAX-I，Invitrogen，Carlsbad，CA) 的 RPMI
1640(Hyclone，Logan，UT)]中。
[0120] 用10μg/mL抗-IFN-γ抗体(Catcher-mAB91-DIK，Mabtech，Cincinnati，OH)包被96孔筛选板(MultiScreen，#MAHAS4510，Millipore，Bedford，MA)，于4℃过夜，然后洗涤并用ELIspot培养基于37℃封闭1小时)。在所述板上孵育效应细胞和刺激细胞20小时，然后洗涤所述板并用与生物素缀合的抗-IFN-γ单克隆抗体(Detector-mAB(7-B6-1-生物素，Mabtech)二次孵育，接着用抗生物素蛋白：生物素化的辣根过氧化物酶复合物(Vectastain Elite ABC Kit(标准))，#PK6100，Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育，然后用AEC底物(Sigma，St.Louis，MO)显色。每种培养条件一式三份进行。将所述板送至Zellnet Consulting，New York，NY用于评价。对形成斑点的单元(SFC)和输入细胞数进行作图。
[0121] 统计学分析：体外数据以平均值±1SD示出。使用学生t检验来测定样品间差异的统计学显著性，并且将P＜.05接受为指示显著性差异。
[0122] 如图1A所示，在这些培养条件下，抗原特异性T细胞群体在初始刺激后的第一个七天中经历至少7次细胞翻倍。因此，我们预期T细胞每周扩增128倍(如通过抗原特异性T细胞频率乘以细胞组合物中的总细胞数所测量的)。图1B中示出了第一、第二和第三次刺激后四聚体阳性细胞的频率。在第0天，对两种EBV四聚体RAK和QAK有反应的T细胞频率分别为0.02％和0.01％。在第0天进行单次刺激后，到第9天，细胞组合物中四聚体阳性的T细胞频率分别从0.02％和0.01％升高至2.7％和1.25％。因此，如由RAK和QAK所测量的，得到了存在于细胞组合物中的抗原特异性四聚体阳性的T细胞的百分比升高1356
倍和125倍。此外，在培养阶段1的第0天进行单次刺激后，到第9天(存在约1.1×10
2
细胞/cm)在细胞组合物中观察到细胞的表面密度提高1.1倍(数据未示出)。因为PBMC组合物中的大多数细胞对刺激性抗原不具有特异性，所以观察到总细胞数总体上几乎没有增加，但是组合物中的抗原特异性细胞群体在培养第一阶段过程中的扩增倍数约280，如图
1C所示。遗憾的是，虽然通过CSFE测得在培养的第二阶段和第三阶段中具有同样的细胞翻倍数，但是在培养的第二和第三阶段中抗原特异性T细胞扩增的这种速率不能保持，在第二阶段中仅为5.7并且在第三阶段中仅为4.3。图2示出了举例说明抗原特异性T细胞的潜在扩增与观察到的扩增倍数之间的差异的表格(n＝3)。
倍和125倍。此外，在培养阶段1的第0天进行单次刺激后，到第9天(存在约1.1×10
2
细胞/cm)在细胞组合物中观察到细胞的表面密度提高1.1倍(数据未示出)。因为PBMC组合物中的大多数细胞对刺激性抗原不具有特异性，所以观察到总细胞数总体上几乎没有增加，但是组合物中的抗原特异性细胞群体在培养第一阶段过程中的扩增倍数约280，如图
1C所示。遗憾的是，虽然通过CSFE测得在培养的第二阶段和第三阶段中具有同样的细胞翻倍数，但是在培养的第二和第三阶段中抗原特异性T细胞扩增的这种速率不能保持，在第二阶段中仅为5.7并且在第三阶段中仅为4.3。图2示出了举例说明抗原特异性T细胞的潜在扩增与观察到的扩增倍数之间的差异的表格(n＝3)。
[0123] 实施例1证明，在第一周的迅猛生产之后，生产期望细胞所花的时间量通常被延长，因为在后续的培养阶段中期望细胞的群体扩增速率降低。
[0124] 实施例2：缩短增加期望细胞群体所需的时间量可通过在任意指定的一个或更多个培养阶段的开始降低期望细胞群体的细胞表面密度来实现。
[0125] 我们假定，与第一次刺激后相比，第二次T细胞刺激后期望细胞的群体扩增速率降低是由于受限的细胞培养条件导致活化诱导的细胞死亡(activation induced cell death，AICD)。例如，参照图3A，在第一次刺激时，PBMC的EBV抗原特异性T细胞组成最多4 2
占到群体的2％，因此抗原特异性T细胞的接种密度小于2×10/cm，剩余的PBMC充当非增殖饲养细胞(视作图3A中的CFSE阳性细胞)，其维持最优的细胞-细胞接触以允许抗原特异性CTL增殖。相比之下，在第9天的第二次刺激时，大多数T细胞是抗原特异性的，并且虽然组合物的总细胞大约相同，但是增殖细胞的密度高了50倍至100倍。结果，在再刺激时，大多数细胞增殖，并且可因此快速消耗和耗尽其养分和O2供给。
占到群体的2％，因此抗原特异性T细胞的接种密度小于2×10/cm，剩余的PBMC充当非增殖饲养细胞(视作图3A中的CFSE阳性细胞)，其维持最优的细胞-细胞接触以允许抗原特异性CTL增殖。相比之下，在第9天的第二次刺激时，大多数T细胞是抗原特异性的，并且虽然组合物的总细胞大约相同，但是增殖细胞的密度高了50倍至100倍。结果，在再刺激时，大多数细胞增殖，并且可因此快速消耗和耗尽其养分和O2供给。
[0126] 为了确定限制培养条件是否对次优的T细胞生长速率负责，我们测量了以较低细胞密度铺板的经活化T细胞的扩增。方法如先前的实施例1所述。
[0127] 我们将经活化EBV特异性T细胞接种于标准24孔板的孔中(每个孔具有2cm2生6 2 4 2
长表面面积)，以翻倍稀释来产生范围从1×10/cm 至3.1×10/cm 的降低的表面密度，同
5 2
时保持效应细胞和刺激细胞的比(R∶S)为4∶1，如图3B所示。用1.25×10/cm 的起始CTL表面密度达到了最大CTL扩增(4.7±1.1倍)，但是进一步稀释降低扩增速率，如图
3B所示。我们推测，该受限的稀释效果可能由于缺乏细胞-细胞接触所致，因此我们用固
5 2 6
定数量的饲养细胞(以1.25×10/cm 的表面密度铺板的EBV-LCL)培养表面密度从1×10
4
至3.1×10 翻倍稀释的EBV-CTL，并且在7天周期中评价细胞扩增。我们观察到CTL扩增
6 2
从用表面密度为1×10/cm 的EBV-CTL时全程仅2.9±0.8倍大幅升高至用表面密度为
4 2
3.1×10/cm 的EBV-CTL时的34.7±11倍扩增，如图3C所示。重要的是，培养条件的这种改变没有使细胞的功能或抗原特异性发生变化(数据未示出)。因此，经活化抗原特异性T细胞群体能够进行比常规培养方法所允许的更大的扩增。注意，无论起始表面密度是多少，
6 2 6 2
刺激后所达到的最大表面密度(1.7×10/cm 至2.5×10/cm)都相同。
长表面面积)，以翻倍稀释来产生范围从1×10/cm 至3.1×10/cm 的降低的表面密度，同
5 2
时保持效应细胞和刺激细胞的比(R∶S)为4∶1，如图3B所示。用1.25×10/cm 的起始CTL表面密度达到了最大CTL扩增(4.7±1.1倍)，但是进一步稀释降低扩增速率，如图
3B所示。我们推测，该受限的稀释效果可能由于缺乏细胞-细胞接触所致，因此我们用固
5 2 6
定数量的饲养细胞(以1.25×10/cm 的表面密度铺板的EBV-LCL)培养表面密度从1×10
4
至3.1×10 翻倍稀释的EBV-CTL，并且在7天周期中评价细胞扩增。我们观察到CTL扩增
6 2
从用表面密度为1×10/cm 的EBV-CTL时全程仅2.9±0.8倍大幅升高至用表面密度为
4 2
3.1×10/cm 的EBV-CTL时的34.7±11倍扩增，如图3C所示。重要的是，培养条件的这种改变没有使细胞的功能或抗原特异性发生变化(数据未示出)。因此，经活化抗原特异性T细胞群体能够进行比常规培养方法所允许的更大的扩增。注意，无论起始表面密度是多少，
6 2 6 2
刺激后所达到的最大表面密度(1.7×10/cm 至2.5×10/cm)都相同。
[0128] 因此，常规培养条件是限制性的，指示需要将培养基体积与生长表面面积之比提2
高至超过常规的1ml/cm 以使期望细胞群体能够超过常规方法的表面密度限制。此外，通过在任何培养阶段开始时使期望细胞群体的表面密度降低至低于常规方法可得到抗原特异性CTL扩增提高约34倍。这在细胞治疗中具有重大影响，因为(where)生产开始时的细胞量常常是十分受限的。例如，通过将受限量的期望细胞以降低的表面密度分布于增加的表面面积上，因为群体生长速率相对于常规表面密度大幅提高，所以可在更短的时间内得到更大的期望细胞群体。
高至超过常规的1ml/cm 以使期望细胞群体能够超过常规方法的表面密度限制。此外，通过在任何培养阶段开始时使期望细胞群体的表面密度降低至低于常规方法可得到抗原特异性CTL扩增提高约34倍。这在细胞治疗中具有重大影响，因为(where)生产开始时的细胞量常常是十分受限的。例如，通过将受限量的期望细胞以降低的表面密度分布于增加的表面面积上，因为群体生长速率相对于常规表面密度大幅提高，所以可在更短的时间内得到更大的期望细胞群体。
[0129] 实施例3：包含期望细胞和/或抗原呈递细胞的细胞群体的最小表面密度可允许以非常低表面密度接种的期望细胞群体生长。
[0130] 图4示出当继续进行图3中描述的工作时我们获得的结果的实例，其进一步证明当期望细胞需要其他细胞的支持时，只要期望细胞存在充分的饲养细胞和/或抗原呈递细胞供应，非常规地低期望细胞表面密度就可起始扩增。在这些实验中，我们继续证明具有从6 2
R∶S比为8∶1的约1.0×10 期望细胞/cm 至R∶S比为1∶32的仅约3900期望细胞
2
/cm 之间的表面密度和R∶S比的总细胞组合物如何可使期望细胞在我们中断测试时极大地扩增至超过起始表面密度的50倍。
R∶S比为8∶1的约1.0×10 期望细胞/cm 至R∶S比为1∶32的仅约3900期望细胞
2
/cm 之间的表面密度和R∶S比的总细胞组合物如何可使期望细胞在我们中断测试时极大地扩增至超过起始表面密度的50倍。
[0131] 实施例4：证明允许通过以非常规地低的期望细胞表面密度起始、使群体扩增、结束阶段以及重复条件来分阶段重复生产过程的能力来提供了可重复的结果。
[0132] 我们以如图5所示的三种期望细胞表面密度(CTL/cm2)继续实施例3所述的评估。每种特异性接种密度能够一致地达到相同的扩增倍数。将对推断继续进行更详细的的描述，因为它们涉及大大缩短期望细胞群体的生产时间的能力。
[0133] 实施例5：在包含透气性材料的生长表面培养期望细胞，而且同时提高培养基体积与生长表面面积之比使期望细胞群体在指定的培养阶段可翻倍之次数的数值相对于常规方法增加，并且使可达到的表面密度升高。
[0134] 细胞系和肿瘤细胞、免疫表型、CFSE标记、膜联蛋白V-7-AAD染色、铬释放测定、酶联免疫斑点(ELIspot)测定、逆转录病毒生产和T淋巴细胞的转导以及统计学分析如实施例1中所述。
[0135] 受试装置(以下一般称为“G-Rex”)如图6所示来构造。每个G-Rex10的底20包含约0.005英寸至0.007英寸厚的透气性硅酮膜。Wilson的未决美国公开No.2005/0106717 A1是与使用的替代透气性材料有关的许多其他信息来源之一，并且其可用于教导熟练的技术人员关于透气性培养装置的形状、特征以及对本发明的许多实施方案有益处的其他有益2
性质。在实施例3中，G-Rex(称为“G-Rex40”)具有10cm 的生长表面面积，细胞组合物(项30所示)处于所述生长表面上，细胞组合物的性质在整个实验中按照其中所述的变化。
除非另有说明，否则培养基体积(项40所示)为30mL，从而建立培养基体积与生长表面面
2
积之比为3ml/cm。
性质。在实施例3中，G-Rex(称为“G-Rex40”)具有10cm 的生长表面面积，细胞组合物(项30所示)处于所述生长表面上，细胞组合物的性质在整个实验中按照其中所述的变化。
除非另有说明，否则培养基体积(项40所示)为30mL，从而建立培养基体积与生长表面面
2
积之比为3ml/cm。
[0136] 以4∶1的常规CTL∶LCL比在G-Rex40装置中培养活化EBV特异性CTL和经5 2
辐照的自体EBV-LCL。将EBV-CTL以5×10 细胞/cm 的表面密度接种在G-Rex40中，并且将EBV-CTL群体扩增的速率与以同样的表面密度接种于标准24孔板中的EBV-CTL进行比
2
较，所述24孔板具有的培养基体积与生长表面面积之比为1ml/cm。3天后，如图7A(p＝
5 2
0.005)中所示，在没有任何培养基更换的情况下，G-Rex40中的EBV-CTL从5×10/cm 增加
6 2 6 2 6 2
至7.9×10/cm 的中位数(范围从5.7×10/cm 至8.1×10/cm)。相比之下，在常规24
5 2 6 2
孔板中培养了3天的EBV-CTL到第3天仅从5×10/cm 的表面密度增加至1.8×10/cm 的
6 2 6 2
中位数(范围从1.7×10/cm 至2.5×10/cm)。在G-Rex40中，通过补充培养基可进一步提高表面密度，但是在24孔板中通过补充培养基或IL2不能使表面密度提高。例如，在第
6
7天补充培养基和IL-2后，G-Rex40中的EBV-CTL表面密度进一步提高至9.5×10 细胞/
2 6 2 6 2
cm(范围从8.5×10/cm 至11.0×10/cm)(数据未示出)。
辐照的自体EBV-LCL。将EBV-CTL以5×10 细胞/cm 的表面密度接种在G-Rex40中，并且将EBV-CTL群体扩增的速率与以同样的表面密度接种于标准24孔板中的EBV-CTL进行比
2
较，所述24孔板具有的培养基体积与生长表面面积之比为1ml/cm。3天后，如图7A(p＝
5 2
0.005)中所示，在没有任何培养基更换的情况下，G-Rex40中的EBV-CTL从5×10/cm 增加
6 2 6 2 6 2
至7.9×10/cm 的中位数(范围从5.7×10/cm 至8.1×10/cm)。相比之下，在常规24
5 2 6 2
孔板中培养了3天的EBV-CTL到第3天仅从5×10/cm 的表面密度增加至1.8×10/cm 的
6 2 6 2
中位数(范围从1.7×10/cm 至2.5×10/cm)。在G-Rex40中，通过补充培养基可进一步提高表面密度，但是在24孔板中通过补充培养基或IL2不能使表面密度提高。例如，在第
6
7天补充培养基和IL-2后，G-Rex40中的EBV-CTL表面密度进一步提高至9.5×10 细胞/
2 6 2 6 2
cm(范围从8.5×10/cm 至11.0×10/cm)(数据未示出)。
[0137] 为了理解在G-Rex装置中的优异细胞扩增背后的机制，我们在培养的第5天使用流式细胞正向比侧向散射分析来评估OKT3刺激的外周血T细胞的生存力。由于培养物中存在可能会干扰分析的残余的经辐照EBV-LCL，所以在该测定中不能评估EBV-CTL。如图7B所示，G-Rex40培养物中的细胞生存力显著更高(G-Rex40中89.2％生存对24孔板中49.9％生存)。然后，我们使用膜联蛋白-PI 7AAD来分析每天的培养物，持续7天，以对活细胞和凋亡/坏死细胞进行区分，并且一致地观察到与G-Rex中的T细胞相比，24孔板中扩增的T细胞的生存力更低，如图7C所示。这些数据指示，增殖细胞存活的积累提高对G-Rex装置中相对于24孔板增加有贡献。
[0138] 为了确定在G-Rex对24-孔板中是否有来自细胞分裂数增加的贡献，在第0天用CFSE标记T细胞，并将其分配至具有40ml培养基体积的G-Rex40装置中以及每个孔具有2ml培养基体积的24孔板中。每天的流式细胞分析证明从第1天至第3天的细胞分裂数没有差异。但是，从第三天开始，培养于G-Rex40中的期望细胞群体继续以超过逐渐降低之
2ml孔速率的速率增加，指示培养条件已经变得受限制，如图7D所示。因此，在G-Rex40受试装置中期望细胞的大群体是由相对于常规方法的细胞死亡降低和保持的增殖造成的。
2ml孔速率的速率增加，指示培养条件已经变得受限制，如图7D所示。因此，在G-Rex40受试装置中期望细胞的大群体是由相对于常规方法的细胞死亡降低和保持的增殖造成的。
[0139] 实施例6：通过使用非常规高的培养基体积与生长表面面积之比以及使用包含透气性材料的生长表面，可在生产过程中降低对进给培养物的需要，而且同时得到非常规高的期望细胞表面密度。
[0140] 通过使用用于EBV∶LCL之起始和扩增的G-Rex受试装置证实了这一点。为了2
本实施例的目的，G-Rex2000是指图8所描述的装置，不同之处在于底部包含100cm 生长表面面积，并且有2000ml培养基体积容量可供使用。使EBV-LCL在不改变细胞表型的情
5 2
况下在G-Rex2000中进行培养和扩增。将EBV-LCL以1×10 细胞/cm 的表面密度铺板于
2
G-Rex2000中，同时添加1000ml完全RPMI培养基以产生10ml/cm 的培养基体积与表面面
5 2
积之比。为了进行对比，将EBV-LCL以5×10 细胞/cm 的表面密度铺板于T175瓶中，同时
2
添加30ml完全RPMI培养基以产生约0.18ml/cm 的培养基体积与表面面积之比。如图8A所示，在不需要任何操作或培养基更换的情况下，培养于G-Rex2000中的EBV-LCL比培养于T175瓶中的EBV-LCL扩增更多。如图8B和图8C所示，如通过对EBER和B细胞标记CD20的Q-PCR所评价的，该培养条件不改变最终的细胞制品。
本实施例的目的，G-Rex2000是指图8所描述的装置，不同之处在于底部包含100cm 生长表面面积，并且有2000ml培养基体积容量可供使用。使EBV-LCL在不改变细胞表型的情
5 2
况下在G-Rex2000中进行培养和扩增。将EBV-LCL以1×10 细胞/cm 的表面密度铺板于
2
G-Rex2000中，同时添加1000ml完全RPMI培养基以产生10ml/cm 的培养基体积与表面面
5 2
积之比。为了进行对比，将EBV-LCL以5×10 细胞/cm 的表面密度铺板于T175瓶中，同时
2
添加30ml完全RPMI培养基以产生约0.18ml/cm 的培养基体积与表面面积之比。如图8A所示，在不需要任何操作或培养基更换的情况下，培养于G-Rex2000中的EBV-LCL比培养于T175瓶中的EBV-LCL扩增更多。如图8B和图8C所示，如通过对EBER和B细胞标记CD20的Q-PCR所评价的，该培养条件不改变最终的细胞制品。
[0141] 实施例7：当在培养开始时没有足够的饲养细胞和/或抗原细胞存在时，期望细胞可不发生扩增。但是，可改变细胞组合物以包括另外的细胞类型来充当饲养细胞和/或抗原呈递细胞从而允许扩增。
[0142] 图9示出了一个示例性实例，其中我们通过实验证明非常低的期望细胞和抗原呈递细胞的累积表面密度(在该情况下，AL-CTL细胞和LCL细胞组合以产生表面密度为2
30,000细胞/cm 的细胞组合物)不能起始AL-CTL群体的生长。然而，通过改变组合物以包含另一种细胞类型来充当饲养细胞可使该相同的细胞组合物生长。在这种情况下，我们
6 2
评价了三个各种形式的表面密度为约0.5×10 细胞/cm 的经辐照K562细胞的饲养层，并且在所有情况下，从直方图第一圆柱描述的初始细胞组合物扩增AL-CTL群体，在14天中，
2 6 2
从仅15,000细胞/cm 的表面密度变成4.0×10 细胞/cm 的表面密度。我们还证明，相对于添加第三种细胞类型，增加LCL群体实现了相似的有利结果。任意选择用于LCL或K562的高表面密度以证实当细胞组合物包含充分数量的饲养细胞和/或抗原特异性细胞时可使用非常低的期望细胞群体来起始生长。当饲养细胞短缺、昂贵或制备麻烦时，建议将其表
6 2
面密度降低至低于0.5×10 细胞/cm。一般而言，并且如我们已经证明的，当抗原呈递细胞和/或饲养细胞处于细胞组合物中时，添加的抗原呈递细胞和/或饲养细胞以及期望细
6 2
胞的表面密度应当优选为至少约0.125×10 细胞/cm 以在细胞组合物中产生足够的表面密度从而起始期望细胞群体的扩增。此外，为了获得超过标准表面密度限制的持续扩增，同
2
时使用在本实施例中使用包含透气性材料的生长表面和4ml/cm 的培养基体积与表面面积之比。
30,000细胞/cm 的细胞组合物)不能起始AL-CTL群体的生长。然而，通过改变组合物以包含另一种细胞类型来充当饲养细胞可使该相同的细胞组合物生长。在这种情况下，我们
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评价了三个各种形式的表面密度为约0.5×10 细胞/cm 的经辐照K562细胞的饲养层，并且在所有情况下，从直方图第一圆柱描述的初始细胞组合物扩增AL-CTL群体，在14天中，
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从仅15,000细胞/cm 的表面密度变成4.0×10 细胞/cm 的表面密度。我们还证明，相对于添加第三种细胞类型，增加LCL群体实现了相似的有利结果。任意选择用于LCL或K562的高表面密度以证实当细胞组合物包含充分数量的饲养细胞和/或抗原特异性细胞时可使用非常低的期望细胞群体来起始生长。当饲养细胞短缺、昂贵或制备麻烦时，建议将其表
6 2
面密度降低至低于0.5×10 细胞/cm。一般而言，并且如我们已经证明的，当抗原呈递细胞和/或饲养细胞处于细胞组合物中时，添加的抗原呈递细胞和/或饲养细胞以及期望细
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胞的表面密度应当优选为至少约0.125×10 细胞/cm 以在细胞组合物中产生足够的表面密度从而起始期望细胞群体的扩增。此外，为了获得超过标准表面密度限制的持续扩增，同
2
时使用在本实施例中使用包含透气性材料的生长表面和4ml/cm 的培养基体积与表面面积之比。
[0143] 实施例8：降低期望细胞表面密度、改变效应细胞与刺激细胞之比、提高培养基与生长表面面积之比以及周期性地以低表面密度培养物将细胞分布于包含透气性材料的生长表面上，使得与其他方法相比，能够在更短的时间周期内生产更多的期望细胞并简化生产过程。
[0144] 为了进一步评价我们简化和缩短期望细胞之生产的能力，我们使用用于EBV-CTL起始和扩增的G-Rex受试装置。为了本实施例的目的，G-Rex500是指图6所描述的装置，2
不同之处在于底部包含100cm 生长表面面积并且有500ml培养基体积容量可供使用。
不同之处在于底部包含100cm 生长表面面积并且有500ml培养基体积容量可供使用。
[0145] 对于EBV-CTL生产的起始阶段，我们将PBMC以1×106/cm2的表面密度接种于7 2
G-Rex40(总量＝10 的PBMC分布于G-Rex40的10cm 生长表面面积上)中，并以40∶1的PBMC∶EBV-LCL比用EBV-LCL刺激它们。对于CTL的生产，在第一刺激中优选该40∶1比来维持效应T细胞的抗原特异性。在培养的起始阶段后，在第9天起始第二阶段，其中将
7
1×10 效应T细胞从G-Rex40转移至G-Rex500受试装置。为了起始培养的阶段2，将200ml的CTL培养基放置于G-Rex500中，从在阶段2开始时建立培养基体积与表面面积之比为
2 5
2ml/cm，生长表面上2.0cm的培养基高度。阶段2开始时的期望细胞表面密度为1×10CTL/
2 5 2
cm，并且抗原呈递细胞的表面密度为5×10LCL/cm，从而产生非常规的1∶5的期望细胞与抗原呈递细胞比。该阶段二的细胞密度以及R∶S比在所有经筛选的供体中产生了一致的EBV-CTL扩增。四天后(第13天)，将IL-2(50U/ml终浓度)直接添加至培养物(如为
2
200ml的新鲜培养基)中，使培养基体积与表面面积之比为4ml/cm。在第16天，收集细胞
6 2 6 7
并计数。获得的CTL的中位数表面密度为6.5×10/cm(范围从2.4×10 至3.5×10)。
G-Rex40(总量＝10 的PBMC分布于G-Rex40的10cm 生长表面面积上)中，并以40∶1的PBMC∶EBV-LCL比用EBV-LCL刺激它们。对于CTL的生产，在第一刺激中优选该40∶1比来维持效应T细胞的抗原特异性。在培养的起始阶段后，在第9天起始第二阶段，其中将
7
1×10 效应T细胞从G-Rex40转移至G-Rex500受试装置。为了起始培养的阶段2，将200ml的CTL培养基放置于G-Rex500中，从在阶段2开始时建立培养基体积与表面面积之比为
2 5
2ml/cm，生长表面上2.0cm的培养基高度。阶段2开始时的期望细胞表面密度为1×10CTL/
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cm，并且抗原呈递细胞的表面密度为5×10LCL/cm，从而产生非常规的1∶5的期望细胞与抗原呈递细胞比。该阶段二的细胞密度以及R∶S比在所有经筛选的供体中产生了一致的EBV-CTL扩增。四天后(第13天)，将IL-2(50U/ml终浓度)直接添加至培养物(如为
2
200ml的新鲜培养基)中，使培养基体积与表面面积之比为4ml/cm。在第16天，收集细胞
6 2 6 7
并计数。获得的CTL的中位数表面密度为6.5×10/cm(范围从2.4×10 至3.5×10)。
[0146] 与常规方案相比，使用允许提高培养基体积与表面面积之比(即，高于1ml/cm2)6 2
的包含透气性材料的生长表面、较低的细胞表面密度(即，低于0.5×10/cm)以及改变的效应细胞与刺激细胞比(低于4∶1)缩短生产时间。图10A示出了实施例8的该G-Rex方法与使用实施例1中的常规方法和实施例5中所述之G-Rex方法的比较。如所示的，常规方法需要23天来提供与任意一种G-Rex在约10天中所能提供的一样多的期望细胞。在
23天后，实施例8的G-Rex方法能够生产比实施例G-Rex方法多23.7倍的期望细胞，以及比实施例1的常规方法多68.4倍的期望细胞。此外，在不需要额外抗原呈递细胞刺激的情
6 2
况下，期望细胞直至第27至30天还在继续分裂，前提在于当细胞表面密度高于7×10/cm时将培养物分开。
的包含透气性材料的生长表面、较低的细胞表面密度(即，低于0.5×10/cm)以及改变的效应细胞与刺激细胞比(低于4∶1)缩短生产时间。图10A示出了实施例8的该G-Rex方法与使用实施例1中的常规方法和实施例5中所述之G-Rex方法的比较。如所示的，常规方法需要23天来提供与任意一种G-Rex在约10天中所能提供的一样多的期望细胞。在
23天后，实施例8的G-Rex方法能够生产比实施例G-Rex方法多23.7倍的期望细胞，以及比实施例1的常规方法多68.4倍的期望细胞。此外，在不需要额外抗原呈递细胞刺激的情
6 2
况下，期望细胞直至第27至30天还在继续分裂，前提在于当细胞表面密度高于7×10/cm时将培养物分开。
[0147] 虽然不能使用光学显微镜清楚地查看G-Rex中的CTL，但是可通过眼或倒置显微镜观察CTL的簇，并且细胞在培养的第9、16和23天的外观在图10B中示出。如图10C所示，G-Rex中的培养不改变扩增的细胞的表型，细胞组合物中高于90％是CD3+细胞(96.7±1.7对92.8±5.6；G-Rex对24孔板)，其主要为CD8+(62.2％±38.3对75％±21.7)。对活化标志物CD25和CD27以及记忆标志物CD45RO、CD45RA和CD62L的评价证明在各培养条件下扩增的EBV-CTL之间不具有实质性差异。抗原特异性也未受培养条件的影响，如通过ELIspot和五聚体分析所测量的。图10D示出，其中用来自EBV的LMP1、LMP2、BZLF1和EBNA1肽表位刺激T细胞并且经HLA-A2-LMP2肽五聚体染色法染色的代表性培养物示出相似的肽特51
异性T细胞频率。此外，如图10E所示，如通过 Cr释放测定评价的，经扩增的细胞保持了它们的溶细胞活性和特异性并且杀伤自体EBV-LCL(在20∶1的E∶T比时62％±12对
57％±8；G-Rex对24孔板)，而对HLA错配的EBV-LCL具有低杀伤(20∶1比时15％±5对12％±7)。
异性T细胞频率。此外，如图10E所示，如通过 Cr释放测定评价的，经扩增的细胞保持了它们的溶细胞活性和特异性并且杀伤自体EBV-LCL(在20∶1的E∶T比时62％±12对
57％±8；G-Rex对24孔板)，而对HLA错配的EBV-LCL具有低杀伤(20∶1比时15％±5对12％±7)。
[0148] 对改进的用于细胞治疗之细胞生产的多种新方法的讨论：已经呈现了实施例1至8以向熟练的技术人员证明可怎样使用多种条件来加快和简化用于细胞治疗的研究应用和临床应用的细胞生产，所述多种条件包括在生产循环开始时降低期望细胞群体的表面密度、降低效应细胞和刺激细胞之间的表面密度比、生长表面包含透气性材料和/或提高培养基体积与生长表面面积之比。虽然实施例1至8涉及抗原特异性T细胞的生产，但是这些新培养条件可应用于与临床有关的(或者概念小鼠模型的临床前证据所需的)多种重要的悬浮细胞，其包括：调节性T细胞(Treg)、天然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、原代T淋巴细胞、广泛种类的抗原特异性细胞，以及许多其他细胞(所有这些细胞还都可进行遗传改造以改进其功能、体内持久性或安全性)。细胞可与饲养细胞和/或抗原呈递细胞一起扩增，所述饲养细胞和/或抗原呈递细胞可包括PBMC、PHA母细胞、OKT3T、B母细胞、LCL和K562，(天然表达或经遗传改造以表达抗原和/或表位以及共刺激分子，例如41BBL、OX40L、CD80、CD86、HLA以及许多其他分子)，这些细胞可用肽和/或相关抗原进行刺激，或不进行刺激。
[0149] 非常规地低起始表面密度：本发明的一个方面是发现了可通过使用更低的期望细胞表面密度来相对于常规方法缩短生产时间。在该方式中，期望细胞能够在其最小细胞表面密度和最大细胞表面密度之间具有比常规方法所允许的更大数值差。优选地，当期望细胞群体生长的数量开始降低，但是期望细胞的量尚不足够多来终止生产时，再次以低起始表面密度将期望细胞重新分布(redistribute)于包含透气性材料的另外的生长表面上。
[0150] 现在描述一个实施例，以解释如何应用我们的新细胞生产方法，所述方法依赖于在任意指定培养阶段开始时较低的表面密度。图11示出了在常规情况下期望细胞群体在生长表面上的扩增与使用本发明之一个方面的期望细胞类型的群体扩增相比较的图示。在该新方法中，生产阶段开始时期望细胞的表面密度低于常规表面密度。为了着重于该新方法的优点，该解释不描述最初得到期望细胞群体的过程。培养的“天”从“0”开始，以使熟练的技术人员更容易地确定该新方法的相对时间优点。在本实施例中，常规方法的各生产6 2
循环都以0.5×10 期望细胞/cm 的常规表面密度开始，而本实施例的各生产循环都以低
6 2
得多的0.125×10 期望细胞/cm 的非常规表面密度开始。因此，在本实施例中需要常规方法所需的4(即，500,000/125,000)倍的表面面积来起始培养。在本实施例中，常规方法
6 2 2
的期望细胞在第14天达到2×10 细胞/cm 的最大表面密度。因此，1cm 的生长面积提供
6 2 6 2
了2×10 细胞/cm，然后使用0.5×10 细胞/cm 的常规起始密度将所述细胞重新分布于
2 2 6 6
4cm 生长面积上(即，4cm 乘以0.5×10 细胞＝2×10 细胞)，使得生产可继续进行。该
2
循环重复另一个14天，这时再次达到最大细胞表面密度，4cm 生长表面的单位面积提供了
6 6 2
2.0×10 细胞，总计为8.0×10 细胞，然后将这些细胞分布于16cm 的生长面积上，并且重
6
复生长循环以经过42天提供总计32×10 细胞。
循环都以0.5×10 期望细胞/cm 的常规表面密度开始，而本实施例的各生产循环都以低
6 2
得多的0.125×10 期望细胞/cm 的非常规表面密度开始。因此，在本实施例中需要常规方法所需的4(即，500,000/125,000)倍的表面面积来起始培养。在本实施例中，常规方法
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的期望细胞在第14天达到2×10 细胞/cm 的最大表面密度。因此，1cm 的生长面积提供
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了2×10 细胞/cm，然后使用0.5×10 细胞/cm 的常规起始密度将所述细胞重新分布于
2 2 6 6
4cm 生长面积上(即，4cm 乘以0.5×10 细胞＝2×10 细胞)，使得生产可继续进行。该
2
循环重复另一个14天，这时再次达到最大细胞表面密度，4cm 生长表面的单位面积提供了
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2.0×10 细胞，总计为8.0×10 细胞，然后将这些细胞分布于16cm 的生长面积上，并且重
6
复生长循环以经过42天提供总计32×10 细胞。
[0151] 图11中描述的新方法，与使用在生产开始时将500,000期望细胞沉积于1cm2的常2
规方法不同，将这500,000细胞均匀地分布于4cm 生长面积上，以在第0天产生125,000期
2
望细胞/cm 的非常规地低起始表面密度。在该实施例中，和常规方法一样，该新方法的生长
6 2
速率在第7天将要降低。本新方法中的细胞具有1×10 细胞/cm 的表面密度。因此，在生
6 6
长速率将要降低的时间点，该培养阶段已经生产了4×10 细胞，然后使用0.125×10 细胞/
2 2 2 6
cm 的起始表面密度将所述细胞重新分布于32cm 的生长面积上(即，32cm 乘以0.125×10
6
细胞＝4×10 细胞)，使得阶段2的生产可继续进行。该生产循环或阶段重复另一个7天
2 6
至14天，此时再次达到最大细胞表面密度，32cm 生长表面的单位面积包含1.0×10 期望
6
细胞，从而在仅14天中产生了总计32×10 细胞。注意，每个生产循环结束时，该新方法如何提供了和常规方法一样的终表面密度除以起始表面密度的倍数。然而，通过在细胞进入生长之前降低起始细胞表面密度以及完成各生产阶段，极大缩短了生产时间。该实施例描
6
述了如何通过相对于常规细胞表面密度降低期望细胞密度(在该情况下降低至0.125×10
2
细胞/cm)在常规方法的仅33％的时间内(14天对42天)提供相同量的期望细胞。
规方法不同，将这500,000细胞均匀地分布于4cm 生长面积上，以在第0天产生125,000期
2
望细胞/cm 的非常规地低起始表面密度。在该实施例中，和常规方法一样，该新方法的生长
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速率在第7天将要降低。本新方法中的细胞具有1×10 细胞/cm 的表面密度。因此，在生
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长速率将要降低的时间点，该培养阶段已经生产了4×10 细胞，然后使用0.125×10 细胞/
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cm 的起始表面密度将所述细胞重新分布于32cm 的生长面积上(即，32cm 乘以0.125×10
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细胞＝4×10 细胞)，使得阶段2的生产可继续进行。该生产循环或阶段重复另一个7天
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至14天，此时再次达到最大细胞表面密度，32cm 生长表面的单位面积包含1.0×10 期望
6
细胞，从而在仅14天中产生了总计32×10 细胞。注意，每个生产循环结束时，该新方法如何提供了和常规方法一样的终表面密度除以起始表面密度的倍数。然而，通过在细胞进入生长之前降低起始细胞表面密度以及完成各生产阶段，极大缩短了生产时间。该实施例描
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述了如何通过相对于常规细胞表面密度降低期望细胞密度(在该情况下降低至0.125×10
2
细胞/cm)在常规方法的仅33％的时间内(14天对42天)提供相同量的期望细胞。
[0152] 虽然我们使用0.125×106细胞/cm2来定量该优点，但是熟练的技术人员应当清楚本发明的该实施例证明任何低于常规细胞表面密度的降低都将缩短生产持续时间。此外，熟练的技术人员将意识到，在本文呈现的该新方法和其他新方法中，所描述的细胞生长速率以及细胞生长降低发生的时间点仅用于举例说明的目的，并且实际速率将基于多种条件(例如培养基组合物、细胞类型等)在各个应用中不同。此外，对于指定的应用，熟练的技术人员将意识到，本发明该方面的优点是，在任何具体应用中使细胞表面密度降低至低于常规细胞表面密度导致生产时间缩短，其中在该例证性的实例中使用的具体常规表面密度可在不同应用之间不同。
[0153] 因此，现在描述了本发明方法的一个方面，当有需要通过使用降低细胞表面密度来使生产存在于细胞组合物中的指定量的期望细胞的生产时间最小化时。期望细胞应当以非常规低的细胞表面密度沉积在生长表面上，以使得：
[0154] a.期望细胞在抗原呈递细胞和/或饲养细胞的存在下，并且如果生长表面不包含2
透气性材料则培养基体积与表面面积之比小于1ml/cm，如果生长表面包含透气性材料则
2
培养基体积与表面面积之比小于2ml/cm，并且
透气性材料则培养基体积与表面面积之比小于1ml/cm，如果生长表面包含透气性材料则
2
培养基体积与表面面积之比小于2ml/cm，并且
[0155] b.在生产循环开始时优选的表面密度条件使得靶细胞表面密度优选低于6 2
0.5×10 细胞/cm 并且更优选如图4所述降低，并且
0.5×10 细胞/cm 并且更优选如图4所述降低，并且
[0156] c.期望细胞的表面密度加抗原呈递细胞和/或饲养细胞的表面密度优选为至少5 2
约1.25×10 细胞/cm。
约1.25×10 细胞/cm。
[0157] 基于以上实例，建议技术人员验证，如果尝试将抗原呈递细胞和/或饲养细胞的5 2
表面密度进一步降低至低于1.25×10 细胞/cm，则期望细胞群体的扩增不受到限制。我
5 2
们选择1.25×10 细胞/cm 是基于证明当通过充分供应抗原呈递细胞和/或饲养细胞进行扩增时可实现密度非常规低的期望细胞群体生长的目标。
表面密度进一步降低至低于1.25×10 细胞/cm，则期望细胞群体的扩增不受到限制。我
5 2
们选择1.25×10 细胞/cm 是基于证明当通过充分供应抗原呈递细胞和/或饲养细胞进行扩增时可实现密度非常规低的期望细胞群体生长的目标。
[0158] 使用包含透气性材料的生长表面和更高的培养基体积与生长表面面积之比可简化并缩短生产。本发明的另一个方面是发现使用包含透气性材料的生长表面和超过常规比的培养基体积与生长表面面积之比，以及重复随着时间的推移而使用提高生长表面面积之量的生产循环将缩短生产时间。
[0159] 现在呈现了一个示例性的实施例以示出这些条件如何能缩短生产的持续时间。图2 2
12补充了讨论以示出可通过利用包含透气性材料的生长表面和超过1ml/cm 或2ml/cm 的非常规地高培养基体积与生长表面面积之比得到的优点的一个实例。接下来的讨论旨在向熟练的技术人员证明如何通过使用这样的方法使包括以下的数种选项变得可用：缩短生产时间、降低所用的生长表面面积的量和/或降低劳动和污染风险。熟练的技术人员意识到，图12和相关讨论仅仅是一个实例，并且不限制本发明的范围。
12补充了讨论以示出可通过利用包含透气性材料的生长表面和超过1ml/cm 或2ml/cm 的非常规地高培养基体积与生长表面面积之比得到的优点的一个实例。接下来的讨论旨在向熟练的技术人员证明如何通过使用这样的方法使包括以下的数种选项变得可用：缩短生产时间、降低所用的生长表面面积的量和/或降低劳动和污染风险。熟练的技术人员意识到，图12和相关讨论仅仅是一个实例，并且不限制本发明的范围。
[0160] 假定该示例性实施例的包含期望细胞群体的细胞组合物消耗约1ml每“X”时间周期。图12示出了两种生产方法，标为“常规方法”和“新方法”。在生长开始时，每种方法都6 2
以表面密度为0.5×10/cm 的期望细胞开始。但是，新方法中的生长表面包含透气性材料，
2 2
并且培养基体积与表面面积之比为2ml/cm，相比之下，常规方法为1ml/cm。在时间周期
6 2
“X”中，常规方法的期望细胞群体达到了2×10/cm 的表面密度平台并且耗尽了养分，而新
6 2
方法的额外培养基体积允许生长继续，并且期望细胞表面密度为3×10/cm。如果新方法继
6 2
续进行，则其达到4×10/cm 的表面密度。因此，产生了许多有益的选择。新方法可在“X”时间之前终止并生产比常规方法更多的细胞，可在“X”时间处终止并生产常规方法1.5倍的细胞，或者可继续进行直至耗尽培养基的养分并在两倍的时间内产生2倍于常规方法的期望细胞，但无需控制装置来进给。对于常规方法，为了得到同样多的细胞，必须收获细胞并且重起所述过程，增加了劳动和可能的污染风险。因为细胞治疗应用通常仅能够用固定数量的细胞开始，所以常规方法不允许简单增加生产开始时的表面面积的选择。
以表面密度为0.5×10/cm 的期望细胞开始。但是，新方法中的生长表面包含透气性材料，
2 2
并且培养基体积与表面面积之比为2ml/cm，相比之下，常规方法为1ml/cm。在时间周期
6 2
“X”中，常规方法的期望细胞群体达到了2×10/cm 的表面密度平台并且耗尽了养分，而新
6 2
方法的额外培养基体积允许生长继续，并且期望细胞表面密度为3×10/cm。如果新方法继
6 2
续进行，则其达到4×10/cm 的表面密度。因此，产生了许多有益的选择。新方法可在“X”时间之前终止并生产比常规方法更多的细胞，可在“X”时间处终止并生产常规方法1.5倍的细胞，或者可继续进行直至耗尽培养基的养分并在两倍的时间内产生2倍于常规方法的期望细胞，但无需控制装置来进给。对于常规方法，为了得到同样多的细胞，必须收获细胞并且重起所述过程，增加了劳动和可能的污染风险。因为细胞治疗应用通常仅能够用固定数量的细胞开始，所以常规方法不允许简单增加生产开始时的表面面积的选择。
[0161] 图13继续了图12的实施例以显示多于一个生产循环如何可成为进一步的益处。图13示出了在常规方法下期望细胞群体在生长表面上的扩增与在本发明的一种新方法下期望细胞类型的群体扩增相比较的图示，其中新方法的表面密度超过了常规方法的表面密度。为了着重于进行该实施方案，该解释不描述得到期望细胞群体的方法。培养的“天”从“0”开始，以使熟练的技术人员更容易地确定本发明该方面的相对时间优点。在该实施例
5 2
中，两种培养物都在“第0天”使用0.5×10 细胞/cm 的常规期望细胞表面密度起始。在该示例性实例中，常规方法的生长表面也包含透气性材料。但是，常规方法的培养基体积与
2 2
生长表面之比为1ml/cm，相比之下，新方法的为4ml/cm。如图13所示，当在约4天中表面
6 2
密度为约1.5×10 细胞/cm 时，常规方法中的期望细胞群体的生长速率开始降低，并且在
6 2 6 2
14天内达到2×10 细胞/cm 的最大表面密度。此时，以0.5×10/cm 的表面密度将期望
2 2 6
细胞群体分布于1.0ml/cm 新鲜培养基中的4cm 生长面积上，在另一个14天中达到2×10
2 6
细胞/cm，并且在28天内提供8×10 期望细胞。相比之下，当在大概约10至11天中表面
6 2
密度为约3×10 细胞/cm 时，新方法中的期望细胞群体的生长速率开始降低，并且在28天
6 2
中可达到4×10 细胞/cm 的最大表面密度。但是，为了加快生产，当期望细胞群体仍然处
6 2 6
于高速率生长时即结束循环。因此，在约10至11天以0.5×10/cm 的表面密度将3×10
2 2
细胞重新分布于4.0ml/cm 新鲜培养基中的6cm 生长表面面积上，在大概另一个10至11
6 2 6
天中期望细胞群体达到3×10 细胞/cm 的表面密度，并且在约21天中提供18×10 期望细胞。因此，与常规方法相比，新方法在约75％的时间中生产了超过2倍数量的期望细胞。
5 2
中，两种培养物都在“第0天”使用0.5×10 细胞/cm 的常规期望细胞表面密度起始。在该示例性实例中，常规方法的生长表面也包含透气性材料。但是，常规方法的培养基体积与
2 2
生长表面之比为1ml/cm，相比之下，新方法的为4ml/cm。如图13所示，当在约4天中表面
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密度为约1.5×10 细胞/cm 时，常规方法中的期望细胞群体的生长速率开始降低，并且在
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14天内达到2×10 细胞/cm 的最大表面密度。此时，以0.5×10/cm 的表面密度将期望
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细胞群体分布于1.0ml/cm 新鲜培养基中的4cm 生长面积上，在另一个14天中达到2×10
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细胞/cm，并且在28天内提供8×10 期望细胞。相比之下，当在大概约10至11天中表面
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密度为约3×10 细胞/cm 时，新方法中的期望细胞群体的生长速率开始降低，并且在28天
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中可达到4×10 细胞/cm 的最大表面密度。但是，为了加快生产，当期望细胞群体仍然处
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于高速率生长时即结束循环。因此，在约10至11天以0.5×10/cm 的表面密度将3×10
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细胞重新分布于4.0ml/cm 新鲜培养基中的6cm 生长表面面积上，在大概另一个10至11
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天中期望细胞群体达到3×10 细胞/cm 的表面密度，并且在约21天中提供18×10 期望细胞。因此，与常规方法相比，新方法在约75％的时间中生产了超过2倍数量的期望细胞。
[0162] 我们已经能够在包含透气性材料的生长表面上得到超过10×106细胞/cm2的细胞表面密度，这证实我们的发明使用的高表面密度方面未受到该实施例中描述的密度的限制。
[0163] 因此，现在描述了本发明的另一个实施例，当需要通过使用降低细胞表面密度来使生产存在于细胞组合物中的指定量的期望细胞的生产时间最小化时：
[0164] a.将期望细胞接种于包含透气性材料的生长表面面积(growth surface area)上，并且在抗原呈递细胞和/或饲养细胞存在下，且培养基体积与表面面积之比为至少2
2ml/cm，并且
2ml/cm，并且
[0165] b.在生产循环开始时建立优选表面密度条件以使得靶细胞表面密度处于约6 2
0.5×10 细胞/cm 的常规密度以内，并且
0.5×10 细胞/cm 的常规密度以内，并且
[0166] c.使期望细胞群体扩增超过约2×106细胞/cm2的常规表面密度，并且[0167] d.如果想要更多的期望细胞，则将期望细胞重新分布于另外的包含透气性材料的生长表面上，并重复步骤a至d直至得到足够的期望细胞。
[0168] 当使用这些新方法时，可通过将起始培养的以下特征进行组合获得进一步的益处：使用非常规地低表面面积、使用期望细胞和/或饲养细胞的新表面密度比、利用包含透气性材料的生长表面面积、利用非常规地高培养基体积与生长表面面积之比，以及按循环进行生产。在任意的生产循环中这些条件可不同以达到期望的结果，例如在生产时间的缩短、表面面积的利用和进给频率之间取得平衡。
[0169] 图14示出了另一种新方法，其中相对于常规方法仍得到进一步的优点。与本文所述的其他示例性实例一样，熟练的技术人员将意识到，此处的描述并不限制本发明的范围，而是用于描述如何得到改进生产效率的优点。
[0170] 在该实施例中，期望细胞在常规条件下每周翻倍。培养的“天”从“0”开始，以使熟练的技术人员更容易地确定该实施方案的相对时间优点。此外，不重复之前描述的与饲养细胞和/或抗原呈递细胞表面密度比有关的问题以简化该实施例。出于举例说明目的，假定常规条件中在“第0天”生产时存在期望细胞起始群体为500,000，并且翻倍时间为76 2 2
天。常规方法以0.5×10 细胞/cm 的表面密度和1ml/cm 的培养基体积与表面面积之比
6 2 6
开始。如所示的，当期望细胞的群体达到2×10 细胞/cm 的表面密度时，以0.5×10 细胞
2
/cm 的表面密度将所述细胞分布于另外的表面面积上，并重新开始生产循环。该实例的新
6 2 2
方法以0.06×10 细胞/cm 的表面密度、包含透气性材料的生长表面面积和6ml/cm 培养基体积与表面面积之比开始。如所示的，当群体接近生长平台的开始时，将细胞重新分布于更大的生长表面面积。在这种情况下，通过注意常规方法中平台期(plateau)的起始来确定
6
群体到达平台，此时细胞表面密度为培养基体积与表面面积之比的1.5倍(即，约1.5×10
6 2 2
细胞/ml)。因此，在约第9天表面密度为约4.5×10 细胞/cm 时，将细胞分布于36cm 的生长表面面积上，并重新开始生产循环。
天。常规方法以0.5×10 细胞/cm 的表面密度和1ml/cm 的培养基体积与表面面积之比
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开始。如所示的，当期望细胞的群体达到2×10 细胞/cm 的表面密度时，以0.5×10 细胞
2
/cm 的表面密度将所述细胞分布于另外的表面面积上，并重新开始生产循环。该实例的新
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方法以0.06×10 细胞/cm 的表面密度、包含透气性材料的生长表面面积和6ml/cm 培养基体积与表面面积之比开始。如所示的，当群体接近生长平台的开始时，将细胞重新分布于更大的生长表面面积。在这种情况下，通过注意常规方法中平台期(plateau)的起始来确定
6
群体到达平台，此时细胞表面密度为培养基体积与表面面积之比的1.5倍(即，约1.5×10
6 2 2
细胞/ml)。因此，在约第9天表面密度为约4.5×10 细胞/cm 时，将细胞分布于36cm 的生长表面面积上，并重新开始生产循环。
[0171] 图15对图14中描述的每种生产方法的比较进行制表，并延伸至各阶段，以显示新方法的强大，以及为什么在多个阶段调节生产方案从而充分地获得效率是明智的。注意，在仅完成生产循环的第二阶段后，新方法就胜过了常规方法，在仅约一半的时间内就能提供接近1.37倍的细胞，且仅需要61％的表面面积。然而，注意生产循环的第三阶段如何创造了相应于表面面积增加的大幅细胞增加。因此，应当以该生产循环为模式，以预期如何在该过程的各循环中调节初始的细胞表面密度和/或最终细胞表面密度从而为任意指定的方法获得优化的效率水平。
[0172] 例如，图16示出了在新方法中技术人员可以如何改变变量以在生产过程中获得2
效率的实例。例如，可进行将循环3的起始(starting)表面密度从0.06细胞/cm 提高至
2 2 2
0.70细胞/cm 以及将最终表面密度从4.5细胞/cm 变化为7.5细胞/cm。提高最终表面
2
密度的实质是将培养基体积与表面面积之比从初始的6ml/cm 提高至更大的数字。培养基体积比表面面积越大，循环保持在快速生长期(即，平台期前的群体扩增)中越长。在这种情况下，我们已经允许了额外5天来完成快速生长期，并且将培养基体积与表面面积之比
2
提高至约8ml/cm。在该实施例中，这样做允许在34天中用合理的表面面积生产超过3万
2
亿细胞。例如，我们已经制造并测试了具有625cm 包含透气性材料之生长表面的装置。很明显，这是比常规方法更优异的生产细胞的方法。
效率的实例。例如，可进行将循环3的起始(starting)表面密度从0.06细胞/cm 提高至
2 2 2
0.70细胞/cm 以及将最终表面密度从4.5细胞/cm 变化为7.5细胞/cm。提高最终表面
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密度的实质是将培养基体积与表面面积之比从初始的6ml/cm 提高至更大的数字。培养基体积比表面面积越大，循环保持在快速生长期(即，平台期前的群体扩增)中越长。在这种情况下，我们已经允许了额外5天来完成快速生长期，并且将培养基体积与表面面积之比
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提高至约8ml/cm。在该实施例中，这样做允许在34天中用合理的表面面积生产超过3万
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亿细胞。例如，我们已经制造并测试了具有625cm 包含透气性材料之生长表面的装置。很明显，这是比常规方法更优异的生产细胞的方法。
[0173] 因此，现在描述了本发明的另一个优选实施方案，当需要通过使用降低细胞表面密度来使生产存在于细胞组合物中的指定量之期望细胞的生产时间最小化时：
[0174] a.将期望细胞接种于包含透气性材料的生长表面面积上，并且在抗原呈递细胞和2
/或饲养细胞存在下，且培养基体积与表面面积之比为至少2ml/cm，并且
/或饲养细胞存在下，且培养基体积与表面面积之比为至少2ml/cm，并且
[0175] b.在生产循环开始时建立优选的表面密度条件以使得靶细胞表面密度低于常规6 2 2
密度，优选为约0.5×10 期望细胞/cm 至约3900期望细胞/cm 并且期望细胞与抗原呈递
5 2
细胞和/或饲养细胞的总数为至少约1.25×10 细胞/cm，并且
密度，优选为约0.5×10 期望细胞/cm 至约3900期望细胞/cm 并且期望细胞与抗原呈递
5 2
细胞和/或饲养细胞的总数为至少约1.25×10 细胞/cm，并且
[0176] c.允许期望细胞群体扩增超过约2×106细胞/cm2的常规表面密度，并且[0177] d.如果想要更多的期望细胞，则将期望细胞重新分布于另外的包含透气性材料的生长表面上，并重复步骤a至d直至获得足够的期望细胞。
[0178] 本发明提供了细胞培养装置和方法，所述装置和方法允许优异得多的细胞生产，特别是对于过继细胞治疗领域。其允许相对于本领域现有装置和方法的多种益处，所述益处包括：缩短提供指定数量的细胞所需的时间、期望细胞群体从初始细胞量扩增更大的倍数、减少和甚至消除培养基更换频繁的能力、简化添加细胞因子的方法、减少甚至消除需要计数细胞以测定其量的能力、大大减少培养后需要与细胞分离的培养基的量的能力、产生更高效的抗原特异性细胞群体的能力，以及线性放大的能力。
[0179] 实施例9：通过在培养方法开始时建立新培养条件以在静态透气性培养装置中产生细胞的更有效的方法。
[0180] 进行静态细胞培养实验，其中在受试装置中培养K562细胞，所述装置配置成具有包含透气性硅酮材料的生长表面并且具有允许在生长表面上存在10cm培养基的壁高度。如在Wilson’717中更完整描述的，用生长表面支持物使生长表面保持在基本水平的位置。
2
以超过生长表面10cm的培养基高度将培养基放入受试装置中，建立10ml/cm 的培养基体积与生长面积比。将K562细胞引入受试装置，并将该装置放在37℃、5％CO2和95％R.H的细胞培养箱中，借此，使细胞能够沉降至生长表面。不对培养基进行灌注或受迫搅拌，并且不驱使气体流过生长表面，而是通过环境气氛的随机运动来进行与生长表面的接触。
2
以超过生长表面10cm的培养基高度将培养基放入受试装置中，建立10ml/cm 的培养基体积与生长面积比。将K562细胞引入受试装置，并将该装置放在37℃、5％CO2和95％R.H的细胞培养箱中，借此，使细胞能够沉降至生长表面。不对培养基进行灌注或受迫搅拌，并且不驱使气体流过生长表面，而是通过环境气氛的随机运动来进行与生长表面的接触。
[0181] 出于举例说明的目的，图17A、图17B、图17C、图17D和图17E示出了实验条件和典型结果的代表性电子表格。建立以下初始静态培养条件，表面密度范围从1.0E+06细胞2 2
/cm 至6.25E+04细胞/cm，细胞密度范围从1.0E+05细胞/ml至6.25E+03细胞/ml，并且所有条件中生长表面上存在的培养基具有恒定的10cm高度，并且所有培养基是葡萄糖浓度为240mg/dl的相同制剂。静态培养的初始状态是第0天，并且在第4天、第8天、第11天评估细胞计数和葡萄糖浓度。
/cm 至6.25E+04细胞/cm，细胞密度范围从1.0E+05细胞/ml至6.25E+03细胞/ml，并且所有条件中生长表面上存在的培养基具有恒定的10cm高度，并且所有培养基是葡萄糖浓度为240mg/dl的相同制剂。静态培养的初始状态是第0天，并且在第4天、第8天、第11天评估细胞计数和葡萄糖浓度。
[0182] 图18比较了相对于图17A至图17E中详述的每种实验条件之表面密度增加的群体扩增倍数。通过用第11天的细胞表面密度除以第0天的细胞表面密度来确定各条件的2
扩增倍数。在表面密度下限为5.0E+05细胞/cm 和培养基高度上限为2.0cm的一系列评价中，我们得出结论，K562在透气性袋中最佳的扩增倍数是约4.8倍。因此，虚线6示出了本领域现有的使用透气性袋的K562生产方法的典型扩增倍数。我们的实验中建立的各表面密度条件产生了超过本领域现有的群体扩增的群体扩增。注意，由于初始静态培养表面密度降低至0.125E+06，增加细胞群体扩增倍数的能力极大地提高，随后进一步的降低不那么有利，尽管仍然远比本领域现有方法优异。
扩增倍数。在表面密度下限为5.0E+05细胞/cm 和培养基高度上限为2.0cm的一系列评价中，我们得出结论，K562在透气性袋中最佳的扩增倍数是约4.8倍。因此，虚线6示出了本领域现有的使用透气性袋的K562生产方法的典型扩增倍数。我们的实验中建立的各表面密度条件产生了超过本领域现有的群体扩增的群体扩增。注意，由于初始静态培养表面密度降低至0.125E+06，增加细胞群体扩增倍数的能力极大地提高，随后进一步的降低不那么有利，尽管仍然远比本领域现有方法优异。
[0183] 进行了另一些观察，其中我们还探索了特别地涉及将葡萄糖作为在任何指定时间存在之细胞数的潜在替代量度，以及在不进给的情况下进行延长培养的能力。
[0184] 实施例10：无需细胞计数测定存在于静态透气性培养装置中的群体之细胞量的新方法。
[0185] 我们观察到，尽管培养基以静态状态存在，并且在取样之前(仅除了装置的日常处理)不进行机械受迫混合，例如灌注、震荡或搅拌，葡萄糖消耗速率始终指示培养物中的细胞数。该发现为进一步简化过继细胞治疗领域打开了大门。例如，计数细胞以测定培养进展如何的操作是使用于过继细胞治疗的细胞生产无法实施的许多因素之一。使用替测量来代替细胞计数结合本文的本发明，给细胞生产带来了更多简化。
[0186] 我们发现，可使用培养物的葡萄糖浓度作为培养物之群体的替代指示(indicator)。对于其中细胞存在于包含指定类型之透气性材料的生长表面上的培养物，知晓培养物达到最大表面所需的最小总培养基体积以及培养物达到最大表面密度所需的葡萄糖浓度的总降低，为对培养物之群体中的细胞数的替代预测打好了基础。具有了这些知识后，起始培养(或培养阶段)的技术人员(one)应确定培养基的基线葡萄糖浓度、培养基的基线体积，并且应追踪在群体估计时间进行葡萄糖浓度测量之前添加至培养物中的培养基体积。估计的群体中的细胞数是与达到最大细胞密度所需的葡萄糖浓度之总降低的比例乘以与达到最大表面密度乘以所需的最小培养基体积的比例并且乘以在生长表面上可能的最大表面密度的函数。
[0187] 我们向本发明多个公开内容中描述的培养物应用该方法，其中实验装置的生长表面包含约0.006英寸至0.0012英寸厚的二甲基硅酮。进行了一系列实验以确定细胞达到最大表面密度所需的最小培养基体积，以及相应的葡萄糖浓度的总降低。对于具有包括K562、LCL和T细胞等多种细胞类型的培养，葡萄糖浓度的总降低为约250mg/dl。我们能够建立预测培养物中细胞数的关系式，如下所示，其中：
[0188] A＝培养基的基线葡萄糖浓度
[0189] B＝在群体估计时测量的葡萄糖浓度
[0190] C＝达到最大表面密度所需的葡萄糖浓度的总降低
[0191] D＝培养基的基线体积
[0192] E＝基线后添加的培养基体积
[0193] F＝达到最大表面密度所需的最小总培养基体积
[0194] G＝最大表面密度
[0195] E＝生长表面的表面积
[0196] [(A-B)/C]×[(D+E)/F]×G×E＝估计的装置中培养群体的细胞数。注意，与最小培养基体积的比例不能大于100％，因为额外的培养基不会使表面密度提高至超过最大容积。例如，如果培养需要10ml达到最大表面密度，并且培养基的基线体积+添加的培养基体积大于10ml，技术人员应使用100％作为与最小培养基体积的比例。
[0197] 注意，该预测式需要细胞培养应用的知识，细胞存在于包含熟练的技术人员选择之透气性材料的生长表面的条件下的最大细胞密度(和/或最大表面密度)。可进行实验来做出测定。例如，为了测定我们实验装置的包含透气性材料(如前文所述的二甲基硅酮)的生长表面上K562细胞的最大细胞表面密度，我们增加培养基高度直至表面密度不能再2
升高。支持K562的最大可达到表面密度(约12.0E+06细胞/cm)所需的最小培养基体积确定为10ml，并且相应的葡萄糖浓度的总降低为250mg/ml。
升高。支持K562的最大可达到表面密度(约12.0E+06细胞/cm)所需的最小培养基体积确定为10ml，并且相应的葡萄糖浓度的总降低为250mg/ml。
[0198] 以下是关于如何使用该信息以评估K562培养物中细胞数的示例性实例。对于第一个实例，假定在培养开始后不添加培养基并且存在这些条件：
[0199] 基线培养基体积＝10ml
[0200] 基线葡萄糖浓度＝475mg/dl
[0201] 添加的培养基＝0ml
[0202] 葡萄糖样品＝300mg/dl
[0203] 生长表面的表面积＝100cm2
[0204] 然后将按照以下进行计算：
[0205] [(475mg/dl-300mg/dl)/250mg/dl)×(10ml+0ml)/10ml]×12E+06 细 胞 /2 2 6
cm×100cm ＝840×10 细胞。
cm×100cm ＝840×10 细胞。
[0206] 对于另一个实施例，假定在培养开始后不添加培养基并且存在这些条件：
[0207] 基线培养基体积＝6ml
[0208] 基线葡萄糖浓度＝475mg/dl
[0209] 添加的培养基＝2ml
[0210] 葡萄糖样品＝300mg/dl
[0211] 生长表面的表面积＝100cm2
[0212] 然后将按照以下进行计算：
[0213] [((475mg/dl-300mg/dl)/250mg/dl)×(6ml+2ml)/10ml]×12E+06 细 胞 /2 2 6
cm×100cm ＝672×10 细胞。
cm×100cm ＝672×10 细胞。
[0214] 对于又一个实施例，假定在培养开始后不添加培养基并且存在这些条件：
[0215] 基线培养基体积＝6ml
[0216] 基线葡萄糖浓度＝475mg/dl
[0217] 添加的培养基＝7ml
[0218] 葡萄糖样品＝300mg/dl
[0219] 生长表面的表面积＝100cm2
[0220] 然后，因为添加到培养物的总培养基体积超过了达到最大表面密度所需的最小总培养基体积，所以与最小培养基体积的比例变成100％，因此，比值等于1，并且将按照以下进行计算：
[0221] [((475mg/dl-300mg/dl)/250mg/dl)×(1)]×12E+06 细 胞 /cm2×100cm2 ＝6
840×10 细胞。
840×10 细胞。
[0222] 熟练的技术人员应当清楚，通过预先确定当存在于包含特定透气性材料的生长表面上时特定的细胞类型在培养基中可达到的最大细胞密度(细胞/cm2)，可使用替代的关系式来估计培养物中的细胞数。在这种情况下，该关系式应为以下的函数：(与达到最大细胞密度所需的葡萄糖浓度之总降低的比例)×(培养开始时的培养基体积+向培养物中添加的培养基体积)×(最大细胞密度)。建议，在累积的培养基体积大于达到最大表面密度所需的最小培养基体积的情况下，应当用最小培养基体积代替累积体积(因为额外的培养基体积不会使表面密度增加至超过其最大值)。
[0223] 为了帮助理解该式的预测能力，我们将培养物的细胞数预测包括于图17A至图1E示出之条件的每个电子表格的第10行(通过生长表面面积归一化)。将第10行与第12行的计数之细胞进行对比，示出如何能够通过使用葡萄糖而非细胞计数以合理的可信度在指定时间测定培养物中的细胞数量。事实上，由于不能确保在计数之前使细胞均匀混合到培养基中，细胞计数可能不那么准确。因此，基于葡萄糖的测量可更加有益。在一个优选实施方案中，在至少4天内，更优选5天内，更优选6天内，更优选7天内，更优选8天内不进行细胞计数，并且甚至更优选直至培养终止时才进行细胞计数。
[0224] 进行了更多实验来确定，当培养开始时的葡萄糖浓度不同时指示装置中葡萄糖消耗与活细胞之间的关系的式是否准确。受试装置与前文的那些描述一致。出于举例说明的目的，图19A示出在除了葡萄糖浓度之外相同的起始条件下培养K562细胞的实验条件和典型结果的代表性电子表格，所述葡萄糖浓度为培养开始时240mg/dl对475mg/dl。将结果以图表的方式描述于图19B、图19C、图19D、图19E和图19F中。将通过细胞计数得到的群体生长和通过葡萄糖消耗预测的群体生长对表面密度归一化。
[0225] 图19B示出了在各条件下在11天的时间周期内群体的扩增。群体生长速率稍有不同，但是在11天内达到了约相同的数量。图19C示出了每种培养条件下葡萄糖消耗速率。图19D示出了每种培养条件下葡萄糖消耗速率。图19E示出了对起始葡萄糖浓度为240mg/dl之培养物使用细胞数量之计算公式预测的值与通过手动计数测定的细胞数量的重叠图。
图19F示出了对起始葡萄糖浓度为475mg/dl之培养物使用细胞数量之计算公式预测的值与通过手动计数测定的细胞数量的重叠图。注意到公式的预测能力与手动细胞计数相近。
这还证明，本发明的多种实施方案可用于与用培养基中溶质浓度的替代测量来代替细胞计数频率并减少甚至消除细胞计数频率的方法进行组合。
图19F示出了对起始葡萄糖浓度为475mg/dl之培养物使用细胞数量之计算公式预测的值与通过手动计数测定的细胞数量的重叠图。注意到公式的预测能力与手动细胞计数相近。
这还证明，本发明的多种实施方案可用于与用培养基中溶质浓度的替代测量来代替细胞计数频率并减少甚至消除细胞计数频率的方法进行组合。
[0226] 当技术人员希望使用Wilson’717或Wilson’176中描述的透气性装置时，这是相对于细胞计数的特别强大的优点。熟练的技术人员将意识到在这样的装置中得到准确的细胞分布的困难，以及潜在的由于细胞在培养基中的不良分布导致的错误计数。因此，仅依靠培养基样品的替代测量代替实际的细胞计数在过继细胞治疗领域中具有极大的益处。
[0227] 具备了该知识后，包括Wilson’717或Wilson’176所描述的那些在内的透气性装置的制造商可提供简化的细胞生产方法，其可通过提供包含含有透气性材料之生长表面的透气性培养装置以及提供使用说明和/或传播涉及本发明公开内容的信息来无需细胞计数而容易地测定透气性装置内培养物中的活细胞数。
[0228] 实施例11：通过在培养过程开始时建立新条件以限制静态培养物中的进给频率从而提供在静态透气性培养装置中复杂性更低产生细胞的方法。
[0229] 我们进行了一系列实验以确定通过使用本文公开的新方法相对于本领域现有的需要每两至三天进行进给的培养方法降低进给频率的能力。
[0230] 在包含具有含透气性材料之表面面积的生长表面和容积因培养基高度可变的的装置中进行实验。以下描述了比较培养基体积和进给频率的实验来举例说明我们的发现。将K562细胞和培养基引入装置，并将它们放在37C、5％CO2和95％R.H的细胞培养箱中，
2
由此使细胞能够以前文描述确定的有利于优异群体扩增倍数的0.125E+06细胞/cm 之表面密度沉降至生长表面。
2
由此使细胞能够以前文描述确定的有利于优异群体扩增倍数的0.125E+06细胞/cm 之表面密度沉降至生长表面。
[0231] 培养基以2.5cm、5.0cm、10.0cm或15.0cm的高度存在于包含硅酮并且具有100cm2表面面积的生长表面上方。如在Wilson’717中更完整描述的，用生长表面支持物使生2 2 2
长表面保持在基本水平的位置。因此，实验条件包括2.5ml/cm、5.0ml/cm、10.0ml/cm
2
和15.0ml/cm 的培养基体积与生长表面之表面面积的比。因此，初始细胞密度分别为
0.05E+06细胞/ml、0.025E+06细胞/ml、0.0125E+06细胞/ml和0.008E+06细胞/ml。
长表面保持在基本水平的位置。因此，实验条件包括2.5ml/cm、5.0ml/cm、10.0ml/cm
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和15.0ml/cm 的培养基体积与生长表面之表面面积的比。因此，初始细胞密度分别为
0.05E+06细胞/ml、0.025E+06细胞/ml、0.0125E+06细胞/ml和0.008E+06细胞/ml。
[0232] 不向10.0ml/cm2或15.0ml/cm2条件中添加另外的培养基。2.5ml/cm2条件的初始2
培养基体积，通过在第11天添加2.5ml/cm 的新鲜培养基而翻倍，通过在第14天添加另一
2 2
份2.5ml/cm 的新鲜培养基而成为三倍，并且通过在第17天添加另一份2.5ml/cm 的新鲜
2 2
培养基而成为四倍。5.0ml/cm 条件的初始培养基体积通过在第11天添加5.0ml/cm 的新
2 2 2
鲜培养基而翻倍。最终，2.5ml/cm 和5.0ml/cm 条件保持为10.0ml/cm 的新鲜培养基。
培养基体积，通过在第11天添加2.5ml/cm 的新鲜培养基而翻倍，通过在第14天添加另一
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培养基而成为四倍。5.0ml/cm 条件的初始培养基体积通过在第11天添加5.0ml/cm 的新
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鲜培养基而翻倍。最终，2.5ml/cm 和5.0ml/cm 条件保持为10.0ml/cm 的新鲜培养基。
[0233] 图20示出了在多种培养基进给条件下对生长表面面积归一化的群体生长图解。
[0234] 注意到所有条件最终都达到大约相同的活细胞数量。然而，不依赖于在培养期间2
添加培养基的条件比其他条件更快到达最大活细胞数量。例如，2.5ml/cm 条件花了20天到达最大密度，而在培养开始后不接收新鲜培养基的条件到达相同的最大活细胞数量仅花了11天。此外，在不进给的条件中群体的生长速率优异得多。此外重要的是，以15.0cm高度的培养基起始培养的条件相对于10.0cm条件示出了将细胞的高生存力持续时间延长的能力。例如，在15.0cm中，相对高的生存力在达到最大细胞群体后保持约4天的时间，而在
10.0cm的条件下，其在约1至2天后即迅速降低。此处创造的实际益处是具有更长的一段时间来回收细胞的生产方法。过继细胞治疗领域的普通技术人员将意识到这一点的价值，因为存在许多原因使技术人员从更长的细胞回收时间窗得出价值，从获得质量控质测量结果的延迟到改变患者的病症。
添加培养基的条件比其他条件更快到达最大活细胞数量。例如，2.5ml/cm 条件花了20天到达最大密度，而在培养开始后不接收新鲜培养基的条件到达相同的最大活细胞数量仅花了11天。此外，在不进给的条件中群体的生长速率优异得多。此外重要的是，以15.0cm高度的培养基起始培养的条件相对于10.0cm条件示出了将细胞的高生存力持续时间延长的能力。例如，在15.0cm中，相对高的生存力在达到最大细胞群体后保持约4天的时间，而在
10.0cm的条件下，其在约1至2天后即迅速降低。此处创造的实际益处是具有更长的一段时间来回收细胞的生产方法。过继细胞治疗领域的普通技术人员将意识到这一点的价值，因为存在许多原因使技术人员从更长的细胞回收时间窗得出价值，从获得质量控质测量结果的延迟到改变患者的病症。
[0235] 熟练的技术人员将意识到，与用于本领域现有的用于过继细胞治疗的方法相比，所有实验培养条件都表现出优异的细胞群体扩增速率，但是应清楚，不仅在开始培养时相对于本领域现有方法降低表面密度是有益的，还可能通过增加培养基高度和/或提高培养基与生长面积比来缩短用于生产期望细胞数所需的持续时间。熟练的技术人员应当意识到，由于采用了更低的表面密度和更大的培养基高度和/或提高的培养基体积与生长表面面积之比，在群体扩增速率方面将得到改进，并且促使在培养基的使用和应用的需要之间取得平衡。如果寻求更长的收获细胞时间窗同时使细胞保持高生存力，可在培养开始时可提供更多培养基。注意，即使技术人员以本领域现有的表面密度或更高的表面密度(例如2.0E+06或更高)来起始，所述方法仍然可为优异的，因为本发明的实施方案可降低进给频率并且降低对细胞群体快速失去生存力的担心。总的来说，已经证明了广泛的选择。为了用最小的进给频率和缩短的生产持续时间来生产细胞群体，用于生产的最优选初始培养条
2 2
件是，细胞密度低于0.5E+06细胞/cm 并且最优选约0.125E+06细胞/cm，以及培养基高度为约5.0cm或更高并且更优选10.0cm至15.0cm，和/或培养基体积比生长表面面积为约
2 2 2
5.0ml/cm 或更高并且更优选10.0ml/cm 至15.0ml/cm，和/或初始细胞密度约0.025E+06细胞/ml或更低并且更优选约0.0125E+06细胞/ml至约0.008E+06细胞/ml。
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件是，细胞密度低于0.5E+06细胞/cm 并且最优选约0.125E+06细胞/cm，以及培养基高度为约5.0cm或更高并且更优选10.0cm至15.0cm，和/或培养基体积比生长表面面积为约
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5.0ml/cm 或更高并且更优选10.0ml/cm 至15.0ml/cm，和/或初始细胞密度约0.025E+06细胞/ml或更低并且更优选约0.0125E+06细胞/ml至约0.008E+06细胞/ml。
[0236] 实施例12：限制存在于静态透气性培养装置中的共培养物的进给频率并且测定细胞群体大小而无需计数细胞(即使部分细胞正在死亡亦如此)的新方法。
[0237] 过继细胞治疗经常依靠与因为其受过辐照正在死亡的细胞(例如APC)或者由于离开身体而导致正在死亡的细胞(例如PBMC)的共培养。共培养应用的一个好实例是在对来自PBMC群体的CMV-CTL(巨细胞病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞)的培养。初始地，CMV-CTL群体相对于总PBMC群体是非常小的百分比。随着培养进行，PBMC开始死亡，并且CMV-CTL开始生长。在培养结束时，细胞组合物中CMV-CTL的频率已经极大地提高了。前文公开的本发明的性质(包括与本领域现有方法相抵触的那些性质，例如降低细胞密度)可用于降低应用(例如这些)的进给频率。
[0238] 我们进行了静态细胞培养实验以评估在共培养物中存在正在死亡细胞的情况下2
葡萄糖测量预测细胞群体的能力。实验装置包含含有透气性硅酮并且表面面积为100cm 的生长表面。如在Wilson’717中更完整描述的，生长表面包含硅酮并且被生长表面支持物保持在基本水平的位置。图21示出了总结第0天、第9天和第16天至条件的电子表格。将PBMC培养基引入实验装置，并将该装置放在37C、5％CO2和95％R.H的细胞培养箱中，借
2
此，使细胞能够以5.0E+05细胞/cm 的表面密度沉降至生长表面。培养基以10.0cm的高度存在，并且细胞密度为5.0E+04。在第0天、第9天和第16天进行葡萄糖测量。除了日常处理之外，培养培养基和细胞不通过用机械设备辅助的受迫混合(例如灌注、振荡或搅拌等)进行混合。第3行示出抗原特异性T细胞(CMV-CTL)的百分比提高至细胞组合物群体的约
27.9％，并且第4行示出CMV-CTL扩增倍数(按照总群体的百分比)如何在第9天后降低。
这是因为PBMC在死亡。
葡萄糖测量预测细胞群体的能力。实验装置包含含有透气性硅酮并且表面面积为100cm 的生长表面。如在Wilson’717中更完整描述的，生长表面包含硅酮并且被生长表面支持物保持在基本水平的位置。图21示出了总结第0天、第9天和第16天至条件的电子表格。将PBMC培养基引入实验装置，并将该装置放在37C、5％CO2和95％R.H的细胞培养箱中，借
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此，使细胞能够以5.0E+05细胞/cm 的表面密度沉降至生长表面。培养基以10.0cm的高度存在，并且细胞密度为5.0E+04。在第0天、第9天和第16天进行葡萄糖测量。除了日常处理之外，培养培养基和细胞不通过用机械设备辅助的受迫混合(例如灌注、振荡或搅拌等)进行混合。第3行示出抗原特异性T细胞(CMV-CTL)的百分比提高至细胞组合物群体的约
27.9％，并且第4行示出CMV-CTL扩增倍数(按照总群体的百分比)如何在第9天后降低。
这是因为PBMC在死亡。
[0239] 第19行证实了培养基中溶质的替代测量预测培养物中细胞数量的能力。注意到该预测值几乎与通过计数评估的细胞群体相同。因此，使用替代测量来定量细胞群体的能力即使在细胞组合物中的组成正在死亡的细胞组合物中也是可用的。
[0240] 实施例13：能够简化培养基更换方法的新静态透气性细胞培养和细胞回收装置以及用于在细胞生产过程完成后极大降低从培养基中分离细胞所需之努力的新方法。
[0241] 图22A示出本发明之细胞培养和细胞回收装置1000的一个实施方案的一个实例的截面图，所述装置1000配置成实施所公开的新细胞培养方法和/或新细胞回收方法。细胞移出导管1004的细胞移出开口1002存在于生长表面1006的附近。培养基移出导管1010的培养基移出开口1008接近生长表面1006存在。生长表面1006包含透气性材料。对于熟练的技术人员，存在许多信息来源去了解合适的包括Wilson’717的透气性材料。优选地，生长表面1006是不渗透液体的并且不是多孔的(non-porous)。从生长表面1006到内部体积1014的上挡边(confine)1012的距离定义出了培养基可存在的空间体积。虽然培养基可在可延伸至超过上挡边1012之高度的培养基移出导管1010和细胞移出导管1004中存在，但是出于描述该实施方案的目的，熟练的技术人员应认为最大培养基高度是从内部体积1014的底部至上挡边1012的最远距离。细胞培养和细胞回收装置不需要搅拌机械或任何其他机械来混合细胞和/或培养基。
[0242] 图22B示出了在培养的任何指定细胞生产阶段起始时处于静态培养之初始状态的细胞培养和细胞回收装置1000。细胞培养和细胞回收装置1000以这样的位置存在，其中生长表面1006定向为水平位置并且细胞沉降于生长表面1006。在该示例性实施方案中，生长表面支持物1018用于将生长表面保持在水平位置同时允许环境气体与生长表面1006接触而无需泵或其他机械以驱使气体通过生长表面1006。熟练的技术人员可参考Wilson’717关于如何配置生长表面支持物1018的信息，熟练的技术人员。虽然培养基1020可以任意水平存在于内部体积1014的挡边以内，但是优选地，整个培养基的最高位置1022与生长表面1006平行，如所示出的。细胞培养和细胞回收装置1000存在于适于细胞培养的气氛中，并且处于适于细胞培养的温度下。环境气体通过随机运动与生长表面1006的透气性材料接触，并且无需使用泵或其他机械来迫使气体去向生长表面l006或离开生长表面1006。
[0243] 由从最低培养基位置到最高培养基位置的距离确定培养基高度，在这种情况下，在培养开始时从生长表面1006到培养基最高培养基位置1022的距离成为了初始静态培养培养基高度。已经沉降于生长表面1006的细胞1016的数量与培养基1020之体积的比是初始静态培养细胞密度。生长表面1006上的细胞1016的数量与生长表面1006表面面积的比是初始静态培养表面密度。培养基1020体积与生长表面1006之表面面积的比是初始静态培养培养基体积与生长表面面积之比。细胞以静态培养的状态存在，并且培养持续一段时间。如纵贯本公开内容所描述的，所述时间段可包括或不包括基于包括以下变量的培养基补充步骤：初始静态培养培养基高度、初始静态培养细胞密度、初始静态培养表面密度和/或初始静态培养培养基体积与生长表面面积之比。
[0244] 图22C示出了另一些步骤以从细胞培养和细胞回收装置1000中回收减少体积之培养基中的细胞。通过培养基移出导管1010中的培养基移出开口1008移出培养基，同时不抽出细胞1016。在该步骤后，示出的剩余培养基作为细胞回收培养基1024。所剩余的细胞回收培养基越少，从培养基分离细胞的过程将变得越不复杂，该过程是用于过继细胞治疗的本领域现有方法所固有的并且目前依靠大量的离心。然而，关键是技术人员注意不损失显著量的细胞同时减小培养基体积。优选地，损失少于10％的细胞，并且更优选几乎不损失细胞。为了进一步指导，我们描述了一个我们使用本发明该方面的实施例。在与图22A所示2
相似的具有包含透气性硅酮并且表面面积为100cm 的生长表面的透气性装置中，培养培养基体积为2000ml，并且在培养基体积减少时以20cm的高度存在，从而形成培养基体积比生
2
长表面面积为200(ml/cm)，并且在培养基减少时生长表面上存在的培养细胞群体为约10亿细胞，我们已经证明了避免明显的细胞损失同时得到100倍的培养基体积减少和建立细胞回收时的一系列条件的能力，其特征在于细胞回收培养基高度仅为0.2cm(当生长表面
2
处于水平位置时测定)并且细胞回收培养基体积与生长表面面积之比仅为0.2ml/em。然后，我们混合培养基(在这种情况下通过在装置中漩动(swirl)培养基)，这容易的使细胞从生长表面升起，并且将细胞分布到细胞回收培养基中。接着，我们通过细胞移出导管中的细胞移出开口移出细胞。细胞移出开口位于沿着装置的边缘，我们使装置倾斜以能够在细胞移出开口的位置处收集培养基。收集细胞和细胞回收培养基后，我们检测细胞回收培养基中的细胞浓度，并且其为惊人的约5000万细胞/ml。因此，我们能够在没有本领域现有的过继细胞治疗之静态细胞培养方法所使用的任何离心设备的情况下从50万细胞/ml的初始细胞密度以100的系数浓缩细胞，仅留下将经历用于细胞回收的进一步过程的级分。大体上，我们能够将需要进行离心的培养基体积从2000ml减少至仅20ml，并且整个过程花费小于约1分钟。
相似的具有包含透气性硅酮并且表面面积为100cm 的生长表面的透气性装置中，培养培养基体积为2000ml，并且在培养基体积减少时以20cm的高度存在，从而形成培养基体积比生
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长表面面积为200(ml/cm)，并且在培养基减少时生长表面上存在的培养细胞群体为约10亿细胞，我们已经证明了避免明显的细胞损失同时得到100倍的培养基体积减少和建立细胞回收时的一系列条件的能力，其特征在于细胞回收培养基高度仅为0.2cm(当生长表面
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处于水平位置时测定)并且细胞回收培养基体积与生长表面面积之比仅为0.2ml/em。然后，我们混合培养基(在这种情况下通过在装置中漩动(swirl)培养基)，这容易的使细胞从生长表面升起，并且将细胞分布到细胞回收培养基中。接着，我们通过细胞移出导管中的细胞移出开口移出细胞。细胞移出开口位于沿着装置的边缘，我们使装置倾斜以能够在细胞移出开口的位置处收集培养基。收集细胞和细胞回收培养基后，我们检测细胞回收培养基中的细胞浓度，并且其为惊人的约5000万细胞/ml。因此，我们能够在没有本领域现有的过继细胞治疗之静态细胞培养方法所使用的任何离心设备的情况下从50万细胞/ml的初始细胞密度以100的系数浓缩细胞，仅留下将经历用于细胞回收的进一步过程的级分。大体上，我们能够将需要进行离心的培养基体积从2000ml减少至仅20ml，并且整个过程花费小于约1分钟。
[0245] 培养基移出导管的培养基移出开口的位置优选位于当生长表面处于水平位置时距生长表面0.2cm或更远。例如，对于本发明的许多细胞培养方法中来说，当生长表面处于水平位置时，距生长表面0.2cm至2.0cm允许显著的体积减少。当生长表面处于水平位置时，培养基移出开口与生长表面之间的距离上限优选为把将减少培养基以进行细胞回收时培养基的典型培养基高度考虑在内的距离。例如，如果技术人员希望相对于本领域现有的静态细胞培养方法将需要离心的培养基体积减少50％，则培养基移出导管的培养基移出开口应位于培养基高度的50％处(假定该装置设计成使得培养基完全存在于生长表面以上。由于实验室空间的使用非常宝贵，装置高度应与期望培养基存在于其中的高度差不多。因此，为了提供相对于本领域现有方法处理的培养基体积至少降低至二分之一的选择，一个好的经验法则是将装置设计成在使用期间具有等于一般培养基高度或刚刚超过一般培养基高度的高度，并且将培养基移出导管的培养基移出开口定位于距生长表面约0.2cm(当生长表面处于水平位置时)至按照从装置内部测量的从装置顶部到生长表面约一半的地方(halfway point)。例如，如果从装置中生长培养基的上挡边至生长表面的距离代表装置中培养基的潜在高度，当生长表面处于水平位置时，培养基移出开口应优选位于生长表面上方0.2cm或更高，并且位于潜在的培养基高度的50％或更低。在不确定培养基高度将位于哪里的情况下，可在装置中存在多于一个培养基移出导管。
[0246] 细胞移出导管的细胞移出开口优选位于沿着装置的下边缘，并且可收集细胞回收培养基而无需重新定向装置。但是，如果期望的话，可重新定向装置。图22D示出了将细胞培养和细胞回收装置1000重新定向到从初始的水平细胞培养位置偏离角1026的位置，以相对于细胞移出导管1004的细胞移出开口1002重新定位回收培养基1024(具有细胞1016分布于其中)，由此随后可抽出细胞回收培养基1024。
[0247] 但是，细胞移出导管的细胞移出开口不需要位于沿着装置的下边缘。一旦完成了使细胞混合于细胞回收培养基中的步骤后，可通过以下方法从装置的任何位置移出细胞回收培养基：简单地旋转装置直至细胞回收培养基位于细胞移出开口，然后通过细胞移出导管取出细胞回收培养基。熟练的技术人员应意识到，该导管无需按照所示而是可为任何配置。关键设计特征是如前文所述的将培养基移出开口放置在相对于生长表面的优选位置的能力。因此，该导管可以是简单的如位于装置侧壁中的隔板(septum)或复杂的如伸缩管。熟练的技术人员还应清楚，所述细胞培养和细胞回收方法不需要依赖于封闭系统配置，但是还可通过开放系统配置中的简单方法来实施。例如，我们用在Wilson’717中描述的开放系统类型，使用移液管作为培养基移出导管且作为细胞移出导管进行了所述方法并充重复了上文描述的步骤，同时达到了上文描述的浓度。
[0248] 为了获得在本发明多个实施方案中描述的提高细胞培养培养基体积与生长表面面积之比的优点，细胞培养和细胞回收装置的内部高度应当优选为在任何具体应用中至少大于2.0cm。此外，为了促进细胞培养和细胞回收，细胞培养和细胞回收装置优选使用生物相容性材料构造，透明的以允许肉眼评估，并且刚性的以允许容易地处理。
[0249] 用于从本发明的细胞培养和细胞回收装置中移出培养基而不移出细胞的方法的发现创造了相对于本领域现有的用于过继细胞治疗的静态细胞培养方法的另外的优点，并且涉及培养基更换方法。虽然本公开内容描述了避免移出或更换培养基以补充培养基的新方法，但是可存在技术人员希望进行那种过程的情况。本领域现有方法导致当移出和更换培养基时移出了细胞，因此，习惯做法是移出基质，将其分布于一个或更多个新装置中，然后向所有装置添加培养基。因此，每当进行进给时，就存在越来越多的装置。这在我们的新方法中不会发生，因为当通过可如移液管般简单的导管去移出培养基时，我们本发明的细胞回收方法把细胞留在装置中。不需要使用任何筛、过滤器或离心装置来减少培养基体积而不损失细胞。可简单地移出培养基并向同一装置中添加培养基直至细胞群体达到最大表面密度。
[0250] 在培养基移出和更换的情况下，以及描述了技术人员可如何在不损失细胞的情况下移出培养基至高度为仅0.2cm，现在容易见到通过培养基移出导管的培养基移出开口的简单地移出培养基至期望高度进行培养基更换，而不移出细胞，然后添加培养基至任何期望的体积或高度。
[0251] 因此，基于本公开内容，熟练的技术人员应当寻求创立静态透气性细胞培养和细胞回收装置的优选实施方案，其包含：
[0252] a.包含透气性材料的生长表面，以及
[0253] b.当装置运行时处于水平位置的生长表面，以及
[0254] c.包含培养基移出开口的培养基移出导管，以及
[0255] d.包含细胞移出开口的细胞移出导管，以及
[0256] e.内部的体积，以及
[0257] f.定义出内部体积最高位置的上挡边
[0258] g.从上挡边到生长表面的距离为潜在培养基高度，并且上挡边与生长表面的距为超过2.0cm，以及
[0259] h.当生长表面处于水平位置时，存在于生长表面上方的培养基移出导管在生长表面上方的距离为至少0.2cm，并且不超过50％的潜在培养基高度。
[0260] 所述装置应当优选地包括Wilson’717中描述的装置的相关方面。此外，基于该知识，包括Wilson’717中描述的那些在内的透气性装置的制造商可通过向使用者提供包含含有透气性材料的生长表面、培养基移出导管、培养基移出开口、细胞移出导管、细胞移出开口的细胞培养和细胞回收装置并且提供使用说明和/或传播信息来促进更有效的细胞培养方法：
[0261] a.向装置中添加细胞和培养基，以及
[0263] c.将细胞培养和细胞回收装置放置在适于细胞培养的气氛中以及适于细胞培养的温度下，并且是生长表面定向为水平位置，并且细胞存在于生长表面上，以及[0264] d.使细胞沉降于所述生长表面上，以及
[0265] e.已经沉降于生长表面的细胞数量与培养基体积的比是初始静态培养细胞密度，以及
[0266] f.沉降于生长表面的细胞的数量与生长表面之表面面积的比是初始静态培养表面密度，以及
[0267] g.培养基体积与生长表面之表面积的比是初始静态培养培养基体积与生长表面面积之比，以及
[0268] h.从最低培养基位置到最高培养基位置的距离为初始静态培养基高度，以及[0269] i.使细胞处于静态培养状态一段时间，并且还包括用于从细胞培养和细胞回收装置回收细胞的步骤，所述步骤包括：
[0270] j.预细胞回收步骤，其包括通过培养基移出导管中的培养基移出开口移出部分培养基并且不取出细胞，装置中剩余的培养基体积是细胞回收培养基体积，以及[0271] k.当生长表面处于水平位置时从细胞回收培养基的最高位置至细胞回收培养基的最低位置的距离是细胞回收培养基高度，以及
[0272] 1.细胞回收培养基体积与生长表面之表面积的比是细胞回收培养基体积与生长表面面积之比，以及
[0273] m.细胞回收培养基体积与培养基体积之比为培养基减少百分比，并且细胞回收步骤包括：
[0274] n.使细胞混合于细胞回收培养基中，以及
[0275] o.回收培养基中的细胞数量与细胞回收培养基之体积的比是回收的细胞密度，以及
[0276] p.通过所述细胞移出导管中的细胞移出开口从细胞培养和细胞回收装置移出细胞和细胞回收培养基。
[0277] 优选地，细胞回收培养基体积与生长表面面积之比为至少0.2ml/cm2，并且培养基减少百分比为至少50％。对熟练的技术人员建议，该方法能够利用本发明的任何实施方案(包括期望的初始静态培养细胞密度、初始静态培养表面密度、初始静态培养培养基体积与表面面积之比和/或初始静态培养培养基高度)以提供本文所描述的优点。此外，促进(encouraged)熟练的技术人员意识到，所述方法包括用于胰岛。
[0278] 实施例14：使用静态透气性培养装置来优异生产CAR T细胞的新方法。
[0279] 在包含具有含透气性材料之表面面积的生长表面和容积因培养基高度可变的实验装置中进行实验。如在Wilson’717中更完整描述的，生长表面包含硅酮且表面面积为2
100cm，并且被生长表面支持物保持在基本水平的位置。
100cm，并且被生长表面支持物保持在基本水平的位置。
[0280] 评价了用于扩增经转导的抗原特异性T细胞(CAR T细胞)的三种条件。评价A包括存在K652APC细胞的CAR T细胞，并且包括10cm高度的培养基。评价B包括不存在K652APC细胞的CAR T细胞，并且包括10cm高度的培养基。评价C根据本领域现有方法培养CAR T细胞。
[0281] 图23A示出了在培养开始时和培养进程中评价A的条件。注意，培养开始时APC与CAR T细胞的比为2∶1，并且培养基以10cm的高度存在。图23B示出了在培养开始时和培养进程中评价B的条件。注意，在培养开始时不存在APC，并且培养基以10cm的高度存在。图23C示出了在培养开始时和培养进程中评价C的条件。注意，培养开始时APC与CAR T细胞的比为2∶1，并且培养基以2cm的高度存在。
[0282] 与过继细胞治疗领域中现有技术的培养不同，在培养基更换期间通过向新鲜培养基中添加细胞因子(例如IL2)来进行细胞因子刺激。因此，细胞因子刺激与培养基更换同时进行。但是，如本发明多个实施方案所公开的，大大地降低了进给频率，甚至消除了进给。因此，我们还使用了条件A和条件B来评价在没有培养基更换的情况下添加细胞因子的能力。我们简单地以相同的频率并且以使培养基具有与本领域现有方法每ml相同的量添加IL2来代替培养基更换，并且不使培养基经历任意种类的受迫混合来使IL2分布于培养基中的。
[0283] 图.23D示出了在培养的多个时间点培养物中的总活细胞。如所能见到的，条件A的总活细胞数量远比任意替代条件中的优异。23E示出在培养开始时和培养终止时CAR T细胞表达的百分比。直方图A表示条件A，直方图B表示条件B，并且直方图C表示条件C。条件B证明了在培养开始时在培养物中不提供APC的缺点。如果在培养开始时提供APC，则CAR表达从初始的约40％状态提高至培养结束时的约80％状态。图23F示出培养期间CAR T细胞的总扩增倍数。清楚的是条件A能够比条件C中示出的本领域现有方法产生大得多的扩增倍数。
[0284] 还注意到，如图23G所示，评价A中预测的活细胞群代表了通过手动计数测定的细胞群体。此外，用于评价A和评价B的装置能够在培养结束时使用前文公开的方法抽出培养基，从1000ml的状态到20ml的状态而不损失细胞。
[0285] 另一个重要的发现涉及培养中APC的存在。显而易见的，从条件A回收的T细胞由于更多强化的T细胞产物而具有更大的杀伤表达相关抗原(PSCA)之肿瘤细胞的能力，在培养结束时，所述T细胞产物相对于其在培养开始时的状态在群体中具有更高的表达CAR之T细胞(CAR-PSCA)百分比。通过比较，由于其在培养开始时不含APC，条件B不能在所有的培养周期内提高细胞群体中表达CAR之T细胞(CAR-PSCA)的百分比。
[0286] 图23H示出了从条件A和条件B得到的细胞杀伤表达PSCA之肿瘤细胞并且避免杀伤不表达PSCA抗原之细胞的能力。效应细胞与表达PSCA抗原之细胞(Du145和Capan1)或不表达PSCA抗原之细胞(293T)的比为40∶1。效应细胞(即，CAR T细胞)得自培养之第11天的条件A和条件B的培养物。
[0287] 图23I并排总结了使用为条件A描述的初始培养条件(不同之处是APC的抗原表达分别为PSCA和Muc1)，对PSCA和Muc1具有特异性的CAR T细胞群体扩增的对比。可见到，本发明的新初始条件能够在比本领域现有条件更短时间内在常规培养器皿(ware)中生产大得多的CART细胞数量。熟练的技术人员将意识到，所述优点不限于识别PSCA或Muc1抗原的CAR T细胞，而是可以用于识别任何抗原的CAR T细胞。
[0288] 在更短时间内生产更多细胞、增加细胞因子而不需要进行培养基更换或对培养基进行受迫混合、消除向培养物进给新鲜培养基的需要、避免手动计数细胞的需要、以及在细胞回收时将细胞存在于其中的培养基之量减少至培养结束时存在之体积的仅2％的能力证实了本发明的能量克服了本领域现有的用于过继细胞治疗之细胞生产方法中固有的许多问题。
[0289] 实施例15：本发明的方法能够相对于生长表面的表面面积进行正比例放大。
[0290] 我们进行了实验以评估本文以及母案中所描述的培养方法的可放大性。从小的生长面积移动到大的生长面积而无需重建方案来优化培养过程是强力的优点。为了确定情况2 2 2
是否如此，我们比较了在包含透气性硅酮的表面面积为10cm、100cm 以及640cm 的生长表
2
面上起始的K562培养结果。初始条件包括0.125E+06细胞/cm 的表面密度和10cm的培养基高度。培养开始后不补充培养基。
是否如此，我们比较了在包含透气性硅酮的表面面积为10cm、100cm 以及640cm 的生长表
2
面上起始的K562培养结果。初始条件包括0.125E+06细胞/cm 的表面密度和10cm的培养基高度。培养开始后不补充培养基。
[0291] 图24A示出具有不同生长面积的三种透气性培养装置的群体生长曲线。系列1表2 2
示在640cm 装置中培养物的活细胞扩增，系列2表示在100cm 装置中的扩增，并且系列3
2
表示10cm 装置中的扩增。图24B示出了曲线归一化为表面密度的图24A的群体生长曲线，并且清楚地证明线性的可放大性。
示在640cm 装置中培养物的活细胞扩增，系列2表示在100cm 装置中的扩增，并且系列3
2
表示10cm 装置中的扩增。图24B示出了曲线归一化为表面密度的图24A的群体生长曲线，并且清楚地证明线性的可放大性。
[0292] 在熟练的技术人员寻求通过在垂直方向放大培养来增加生长表面面积的情况下，鼓励他们回顾Wilson’176，并将意识到可使用Wilson’176中描述的装置来进行本发明的多个实施方案。
[0293] 优选实施方案的一般描述：出于该公开内容的目的，生长表面是装置中细胞处于其上并且包含透气性材料的区域。透气性材料可为细胞培养领域中技术人员知晓的任何材料，并且优选为液体不可透过的并且为无孔的。本发明的装置和培养方法可在不驱使气体通过包含透气性材料之生长表面的情况下发生作用。这些方法适于静态细胞培养。
[0294] 优选的细胞类型：在本发明的一些实施方案中，如果培养物包含单一的细胞类型，则细胞优选为抗原呈递细胞，并且更优选LCL或K562。如果培养物包含共培养物，优选地，其包含与APC或饲养细胞组合的效应细胞(即期望细胞或靶细胞)，并且可包括或不包括珠(bead)。珠可成为APC或饲养细胞的替代物。如果存在APC，则它们优选是专职性抗原呈递细胞，并且更优选K562或LCL类型，并甚至更优选是经辐照的。如果存在的话，除非它们是胰岛，否则效应细胞优选来源于外周血或骨髓，并且更优选是T细胞、NK、Treg、TIL或MIL。如果效应细胞是T细胞，则它们优选地是天然存在的抗原特异性T细胞或经转导的抗原特异性T细胞。
[0295] 优选的表面密度：在本发明的一些实施方案中，细胞存在于包含透气性材料的生长表面上并且优选表面密度低于0.5E+06。熟练的技术人员将意识到，本公开内容表面密度从允许低于0.5E+06的类似降低以相对于过继细胞治疗领域的现有方法提高群体扩增速率，降的越低越优选。因此，例如，我们已经证明表面密度为0.25E+06、0.125E+06和0.0625E+06的群体扩增速率超过本领域现有方法。因此，促使熟练的技术人员意识到，表面密度不需要限制在仅我们的实施例所记载的值，该可能性不是离散值，而是类似值。例如，对本领域的那些技术人员建议了，以0.49E+06的表面密度起始培养将允许相对于以
0.5E+06的表面密度起始培养改进群体的“扩增倍数”，尽管我们没有提供使用该特定表面密度的实施例。因此，建议熟练的技术人员采用本发明的实施例中和母案中所示出表面密度的类似理解，并且不限于本文所呈现的离散值。
0.5E+06的表面密度起始培养改进群体的“扩增倍数”，尽管我们没有提供使用该特定表面密度的实施例。因此，建议熟练的技术人员采用本发明的实施例中和母案中所示出表面密度的类似理解，并且不限于本文所呈现的离散值。
[0296] 优选的细胞密度：在本发明的一些实施方案中，细胞存在于包含透气性材料的生长表面上并且优选细胞比培养基密度为低于0.5E+06。熟练的技术人员将意识到，本公开内容允许细胞比培养基密度从低于0.5E+06的类似降低以相对于过继细胞治疗领域现有方法降低培养基补充频率，降的越低越优选。因此，例如，我们已证实如何通过从本领域现有方法的下限0.5E+06细胞/ml降低细胞比培养基密度来降低培养基补充频率，同时能够保持细胞群体能够以超过本领域现有方法的速率扩增。促使熟练的技术人员意识到，表面密度不需要限制在仅我们的实施例所记载的值，可能的值不是离散值而是类似值。优选地，熟练的技术人员应当寻求根据他们希望得到的属性将细胞比培养基密度降低至低于0.5E+06至他们认为合适的任何特定值。因此，虽然我们用本文和母案中的多个实施例中鉴定的离散的细胞比培养基密度描述了降低细胞比培养基密度的优点，但是本发明不限于本文所呈现的离散数值。
[0297] 提高的培养基体积与生长表面面积之比：在本发明的一些实施方案中，细胞存在于包含透气性材料的生长表面上，并且通过提高培养基体积与生长表面的表面积的比来得到优点。熟练的技术人员将意识到，本公开内容允许培养基体积与生长表面之表面面积之比的类似提高，以当与本发明的诸如降低表面密度等其他要素组合时提供许多优点。因此，虽然我们通过使用具有本文和母案中具有离散值的实施例来描述这些相关优点，但是本发明不限于本文呈现的离散数值，并且促使熟练的技术人员意识到，所呈现的值以及值的组合正通过所述值的类似诠释来引导他们获得所述优点。因此，本发明不限于本文呈现的离散数值。
[0298] 增加的培养基高度：在本发明的一些实施方案中，细胞存在于包含透气性材料的生长表面上，并且通过相对于本领域现有方法增加培养基高度来得到优点。熟练的技术人员将意识到，本公开内容允许在培养基高度上的类似增加，以当与本发明的诸如降低表面密度等其他要素组合时提供许多优点。因此，虽然我们通过使用本文和母案中的具有离散值的实例来描述这些相关优点，但是本发明不限于本文呈现的离散数值，并且促使本领域的那些技术人员意识到，所呈现的值以及值的组合正通过所述值的类似诠释来引导他们获得所述优点。因此，本发明不限于本文呈现的离散数值。
[0299] 培养基中溶质变化速率代替计数细胞的替代测量：在本发明的一些实施方案中，细胞存在于包含透气性材料的生长表面上，并且通过不必进行计数细胞的情况下确定培养物中有多少细胞来得到优点。熟练的技术人员将意识到，本公开内容示出了葡萄糖浓度的降低(decay)如何提供培养物中细胞数量的量度的实例。熟练的技术人员还将意识到，葡萄糖仅是培养基中被细胞利用的的一种可测量底物，并且根据本发明的公开内容，熟练的技术人员可依靠培养基中诸如乳酸盐等其他底物的浓度消耗和/或提高来指示细胞数量。因此，本发明的该实施方案的发明方面是这样的发现，在以任何新表面密度、细胞密度、培养基高度和/或培养基体积比生长面积条件起始的静态培养中测量底物是确定细胞群体的扩增进展的好方法。因此，本发明不限于葡萄糖底物。因此，本发明不限于本文提供的离散数值。
[0300] 移出培养基而不损失细胞：在本发明的一些实施方案中，细胞以多种有利的表面密度存在于包含透气性材料的生长表面上，并且存在于相对于本领域现有方法增加的培养基高度(和/或提高的培养基体积与生长表面面积之比)下。随后通过相对于本领域现有方法降低培养基高度(和/或降低培养基体积与生长表面面积之比)而不损失细胞来得到优点。熟练的技术人员将意识到，本公开内容允许改进的培养基更换方法(其中不需要在过程中添加更多的装置)和/或改进的细胞回收方法(其中需要处理更小的培养基体积来回收细胞)。虽然我们通过使用具有离散值的实例来描述这些相关优点，但是本发明不限于本文呈现的离散数值，并且促使本领域的那些普通技术人员意识到，所呈现的值以及值的组合正通过这些值的类似诠释来引导他们得到所述优点。例如，培养基可以任何高度存在，优选大于2.0cm(例如2.1cm、2.5cm、6.08cm、10.0cm及以上)。优选培养基移出导管的培养基移出开口处于生长表面上方0.2cm或更高的因此可优选以0.2cm及以上的任意高度存在(只要其在移出培养基时时低于培养基高度且不损失细胞)，从而减少从培养基分离细胞和/或不迫使使用者在培养基更换期间将细胞移动到其他装置。因此，本发明不限于本文呈现的离散数值。
[0301] 透气性培养装置：在本发明的一些实施方案中，我们描述了一些发现，包括以低于常规知识之极限的表面密度起始培养物、使提供细胞因子的操作最小化、相对于本领域现有方法提高细胞群体生长速率的培养基提供策略以及缩短新细胞培养装置的生产时间(包括对Wilson’717和Wilson’176的方法的改进)的能力。此外，装置制造商和供应商应当意识到，包括Wilson’717和Wilso’176中描述的那些在内的透气性装置的提供应当包括通过无论任何形式(纸质、电子、网站等)的使用说明、方案等向此类装置的使用者传播本发明和/或母案的新方法。因此，本发明的范围包括由透气性装置的制造商和/或供应商提供的使用说明和/或本发明方法的宣传。
[0302] 虽然这样描述本发明，但是，显而易见的是，本领域技术人员可通过许多方式改变本发明以拥有本公开内容的益处。这样的变化不应视为脱离本发明的精神和范围，并且对本领域的技术人员显而易见的这样的改造旨在包含于以下权利要求及其等同物的范围内。
[0303] 在本文中引用的每个申请、专利和论文以及在每个所述申请、专利和论文(包括在每个公布专利的答复期间；“申请引用的文件”)中引用的每个文件或参考文献、未决的美国公开No.2005/0106717 A1和2008/0227176 A1，以及每个与这些申请和专利相应的和/或从这些申请和专利要求优先权的PCT和外国申请或专利，以及在文件中引用的每个申请中引用或参考的每个文件都明确地并入本文。
[0304] 以上文件通过引用的任何并入限制为使得不并入与本文明确的公开内容相违背的主题事项。以上文件通过引用的任何并入还限制为使得文件中包括的权利要求不通过引用并入本文。以上文件通过引用的任何并入还限制为使得，除非清楚地包括于本文中否则文件中提供的任何限定都不通过引用并入本文。
[0305] 出于诠释本发明的权利要求的目的，明确指出，除非在权利要求中记载了特定术语“用于......的方法”或“用于......的步骤”，否则不援引U.S.C.第112节第6段的条款。
[0306] 本领域技术人员将意识到可对本公开内容进行许多改造而不脱离本文所述发明的精神。因此，并非旨在将本发明的范围限制于所描述的实施方案和实施例。相反，本发明的范围应当通过所附权利要求及其等同物来诠释。
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