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小细胞肺癌的靶向疗法

阅读：859发布：2020-05-11

专利汇可以提供小细胞肺癌的靶向疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了治疗肺癌的方法，尤其是通过靶向疗法治疗小细胞肺癌。该疗法靶向一种或多种细胞表面抗原，包含CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165和EpCAM，其任选地包含选择性阻断CD47结合至SIRPα的试剂。，下面是小细胞肺癌的靶向疗法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种治疗患者中肺癌的方法，所述方法包括：
给予所述患者有效剂量的靶向治疗剂，所述靶向治疗剂特异性结合至一种或多种细胞表面抗原，包括CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、和EpCAM。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予选择性阻断CD47结合至SIRPα的第二靶向试剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二靶向试剂包括可溶性SIRPα多肽。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一试剂是细胞表面标记物选择性抗体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺癌是小细胞肺癌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述标记物选自CD56、CD99、CD44和EpCam。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一和第二试剂包含在针对CD47和第二癌症相关细胞标记物的选择性双特异性抗体内。

说明书全文

小细胞肺癌的靶向疗法

[0001] 背景

[0002] 靶向疗法，如抗体和特异性配体已经证明在对抗癌症，尤其是常规疗法失败的情况中有效。更为令人振奋的是，癌症抗体通常以与常规化疗或放疗不同的机制作用，因此它们通常与常规疗法组合以产生叠加或协同效果。

[0003] 抗体可通过各种机制来实现它们的治疗效果。它们可在产生凋亡或程序性细胞死亡中有直接作用。它们可阻断生长因子受体，有效阻滞肿瘤细胞增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，它们可引导抗独特型抗体的形成。间接作用包括募集有细胞毒性的细胞，如单核细胞和巨噬细胞。这种类型的抗体介导的细胞杀伤被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。单克隆抗体也结合补体，导致直接细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。

[0004] CD47是抗癌疗法的有价值靶标，因为其作用是巨噬细胞吞噬作用的抑制物以及其在多种人肿瘤上的广泛表达。通过结合示信号调节蛋白α(SIRPα)，一种在巨噬细胞表面上表达的受体，CD47能够转导防止吞噬作用的抑制性信号。用抗体阻断CD47和SIRPα之间的相互作用不仅刺激巨噬细胞在体内吞噬癌细胞，也在体内引发强烈的抗癌作用。其他CD47阻断剂包括以非常高的亲和性结合并阻断人CD47的“下一代”CD47拮抗剂。

[0005] 通过使由SIRPα转导的抑制性信号无效，高亲和性SIRPα变体可降低巨噬细胞活化的阈值并且促进由肿瘤特异性抗体驱动的吞噬响应。给定的治疗性抗体通过CD47阻断强化了抗癌活性的程度可能取决于多种因素，包括恶性细胞表面上的抗原表达水平、其重链同种型、和抗体结合后由抗体假定的方向，其影响其结合免疫效应物上的Fc受体的能力。高亲和性SIRPα 单体因此代表多种其他方法的快速、安全和有效替代，包括已经在这一方向上追求的药物/毒素偶联策略。

[0006] 有效靶标的鉴定和靶向疗法的组合仍然是令人高度感兴趣的。本发明解决该需求。

发明内容

[0007] 提供了用靶向疗法治疗肺癌的方法和组合物。在一些实施方式中，所述肺癌是小细胞肺癌。在一些实施方式中，所述疗法靶向一种或多种细胞表面抗原，包括CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAM等。在一些实施方式中，靶向疗法包括向患有肺癌的个体给予治疗剂量抗体，所述抗体特异性结合至选自以下的细胞表面标记物：CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165和EpCAM。

[0008] 在一些实施方式中，靶向疗法与CD47阻断剂组合。癌细胞通过CD47表达上调逃避巨噬细胞监视。给予患者掩蔽CD47蛋白的试剂，例如结合至CD47或SIRPα并且防止CD47和SIRPα相互作用的抗体或小分子，其增加了通过吞噬作用清除癌细胞。阻断CD47的试剂与针对一种或多种肺癌细胞标记物的单克隆抗体组合，与使用单一试剂相比，该组合物在增强吞噬作用和消除癌细胞上可以有协同性。

[0009] 用于疗法的感兴趣的特异性试剂的组合包括抗-CD47和抗-CD56，抗-CD47和抗-CD44，抗-CD47和抗-CD99，抗-CD47和抗-EpCam。在一些这类实施方式中，抗-CD47试剂是高亲和性SIRPα多肽，其可以单体或多聚体的方式提供，例如，以与IgG Fc多肽的融合蛋白提供。

[0010] 在其他实施方式中，疗法提供靶向CD47和第二癌细胞标记物的多特异性抗体，包括靶向CD47和CD56，CD47和CD44，CD47和EpCam等的多特异性抗体。还提供这类多特异性抗体的组合物，其中多特异性抗体理想地是人或人源化的；并且可经修饰以延长血液半衰期，例如，通过PEG化等。

[0011] 附图简要说明

[0012] 图1：CD47-阻断疗法刺激巨噬细胞吞噬小细胞肺癌。通过使用CD14+选择的磁性激活的细胞分选(MACS)来纯化来自匿名血液供体的人单核细胞。单核细胞在10％AB人血清存在下培养一周，在该时间点上显示的形态变化是分化成巨噬细胞的特征。巨噬细胞与用绿色荧光染料标记的原代人小细胞肺癌细胞(SCLC样品“H29”)共同培养。用载剂对照(磷酸盐缓冲盐水，PBS)、抗-CD56抗体(克隆MEM-188)、或人源化的抗-CD47抗体(克隆5F9-G4)来处理细胞。通过高通量流式细胞术以已经吞噬绿色荧光SCLC细胞的巨噬细胞的百分比来评价吞噬作用。用抗-CD47抗体处理能够以单一试剂诱导升高水平的吞噬作用。

[0013] 图2：使用小鼠异种移植模型，CD47-阻断产生了针对小细胞肺癌细胞的体内治疗响应。原代小细胞肺癌细胞(样品H29)移入免疫缺陷型NSG小鼠中。在大约三周的生长后，小鼠随机分成2个处理组。第一组用载剂对照(磷酸盐缓冲盐水，PBS；红色)处理，并且第二组通过每天注射250μg抗-CD47抗体(克隆5F9-G4，蓝色)处理。随时间监测肿瘤生长。各点表示个体小鼠中生长的肿瘤。黑色柱表示中值肿瘤体积。左：随整个研究时间过程的肿瘤体积测量。右：研究第89天的肿瘤体积测量。标注对数刻度。

[0014] 图3：在小细胞肺癌细胞表面上高度表达的新治疗靶标。原代人小细胞肺癌细胞(样品H29)使用LEGENDScreen试验(白乐津公司(Biolegend))经过综合流式细胞免疫表型
分析。基于它们的几何平均荧光强度(Geo.MFI)来对表面抗原进行排序。这些抗原是与
CD47-阻断试剂结合的抗体的治疗靶标。

[0015] 图4：可通过与CD47-阻断疗法组合增强SCLC-靶向抗体诱导巨噬细胞吞噬作用的能力。用绿色荧光染料标记2种人小细胞肺癌细胞系(H82和H69)，然后在所述的抗体与载剂对照(磷酸盐缓冲盐水，PBS；灰色)或高亲和性SIRPα变体CV1单体(黑色)存在下与原代NSG小鼠巨噬细胞共培养。通过高通量流式细胞术以已经吞噬绿色荧光SCLC细胞的巨噬细胞的百分比来评价吞噬作用。由于直接竞争，抗-CD47试剂5F9-G4和CV1-G4不与CV1单体组合测试。

[0016] 图5.CD47-阻断诱导SCLC细胞的体外巨噬细胞吞噬作用。通过流式细胞术评价一组人SCLC细胞系的表面上的CD47表达。黑色虚线表示未染色的NCI-H82细胞。B原代人SCLC样品H29表面上的CD47表达。C显示使用人巨噬细胞和荧光肿瘤细胞的体外吞噬试验的图。D用人巨噬细胞和钙荧光素AM-标记的SCLC细胞进行的吞噬试验的代表性流式细胞图。E荧光激活的细胞分选后的细胞群的代表图。分选的双阳性群含有吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞。
标尺条代表20μm。F通过流式细胞术分析的使用人巨噬细胞和钙荧光素AM-标记的SCLC细胞的吞噬试验的总结。用载剂对照(PBS)或抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)处理SCLC细胞。钙荧光素AM+巨噬细胞的百分比标准化至各巨噬细胞供体的最大响应。G在用载剂对照(PBS)或抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)处理后人巨噬细胞对原代H29 SCLC细胞的吞噬作用。F-G用来自4个独立血液供体的巨噬细胞进行吞噬试验。数据表示为平均数±SD，对于通过双尾t检验(G)或Sidak校正(F)的变量双向分析进行的所示比较，ns不显著；**P＜0.01；****P＜
0.0001。

[0017] 图6.CD47-阻断抗体抑制体内人SCLC肿瘤生长。A NCI-H82细胞在NSG小鼠的皮下组织中的生长。小鼠随机分组，并用载剂对照(PBS)或抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)处理。通过测量肿瘤体积评价生长。每组处理7-8只小鼠，并且每个点代表独立动物的肿瘤体积。B通过生物荧光成像评价的GFP-荧光素酶+患者-衍生的异种移植H29肿瘤在NSG小鼠的皮下组
织中的生长。小鼠随机分组，并用载剂对照(PBS)或抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)处理。C在移植后第85天的H29肿瘤的代表性生物荧光图像。D通过肿瘤体积测量评价的H29肿瘤的生长。E用所示疗法处理的含患者-衍生的异种移植H29肿瘤的小鼠的存活。MC检验P＝0.0004。
A-E黑色箭头表示处理开始。点表示独立动物的测量值，条表示中值。组由最少7-8只小鼠组成。为清楚起见，各时间点的测量值错开，对于曼-惠特尼检验所示的比较，ns，不显著；*P＜
0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

[0018] 图7.MCP-3是预测对CD47-阻断疗法的响应的血清生物标记物。A用单剂量的抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)注射的未处理的NGS小鼠(无肿瘤)或带皮下NCI-H82细胞的NSG小鼠。处理前或处理后24小鼠收集血清样品。通过Luminex多重试验来测量MCP-3水平。B如A所示评价带患者-衍生的异种移植H29肿瘤的小鼠的MCP-3水平。点表示单个小鼠的测量值，条表示平均值±SD。每种情况评价5只小鼠。Sidak校正的变量双向分析，ns＝不显著；****P＜
0.0001。

[0019] 图8.综合FACS-基抗体筛选鉴定SCLC上的新和成熟治疗靶标。使用LEGENDScreen人细胞筛选试剂盒(白乐津公司(Biolegend))，332种靶向细胞表面抗原的抗体的集合来评价4种SCLC细胞系和原代患者样品H29表面上的抗原表达。通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析来检测抗体结合。显示针对SCLC表面结合筛选的所有抗体的几何平均荧光强度(MFI)的柱形图。数据表示所有5个SCLC样品之间各抗体的中值。数据拟合至高斯分布(黑色曲
线)，并且阴性抗原(灰色)由小于中值以上2个标准偏差的中值MFI所限定。低抗原(红色)定义为小于阴性阈值以上1个数量级的MFI。高抗原(蓝色)定义为大于阴性阈值1个数量级。B基于所有5个SCLC样品之间的中值MFA鉴定为“高”的39个抗原的排列表。

[0020] 图9.高亲和性SIRPα变体响应肿瘤结合抗体增强SCLC的巨噬细胞吞噬作用。响应单独肿瘤结合抗体(红色)或与高亲和性SIRPα变体CV1单体组合(蓝色)的CI-H82细胞(A)和NCI-H524细胞(B)吞噬作用。点表示单个供体的测量值，条表示中值。测试了抗-CD56(NCAM)抗体的3个克隆，以及针对CD24、CD29、CD99、和CD47(克隆Hu5F9-G4)的抗体。C响应变化浓度的单独抗-CD56抗体lorvotuzumab(红色)或与高亲和性SIRPα变体CV1单体组合(蓝色)的NCI-H82 SCLC细胞吞噬作用。数据表示为平均值±SD。A-C用来自最少4个独立血液供体的人巨噬细胞进行吞噬试验。测量值标准化至各巨噬细胞供体的最大响应。对于Sidak校正的变量双向分析进行的所示比较，ns不显著；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜
0.0001。

具体实施方式

[0021] 提供用治疗剂，例如靶向肺癌标记物，例如靶向一个或多个细胞表面抗原，包括CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAM等的抗体治疗肺癌的方法和组合物。在一些实施方式中，提供了试剂的组合，例如协同性组合，其中一种试剂是抗-CD47阻断剂，并且第二试剂靶向肺癌标记物，例如，CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAM等。

[0022] 在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所述的具体实施方式，因为它们当然可能变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

[0023] 应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、到下限单位的十分之一的各中间值，以及所述范围的任何其它标注或中间值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，受到所述范围明确排除的限值制约。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。

[0024] 可以逻辑上可能的所提及事件的任意顺序，以及所提及事件顺序进行本文所述的方法。

[0025] 除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但以下描述优选的方法和材料。

[0026] 本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，与所引用出版物相关联来公开和描述这些方法和/或材料。

[0027] 应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。还应注意到，权利要求书可撰写成排除任何任选要素。同样，这种说明应用作引用权利要求元素相关地使用这类排除性术语，如“只有”、“仅仅”等，或使用“负”限制的前提基础。

[0028] 提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。

[0029] 定义

[0030] 协同性组合协同性组合可提供与单一疗法(即组合的单个组分)的效果相当的治疗性效果，同时降低不良副作用，例如对非靶向组织、免疫状态和其他临床标记的破坏。或者，当与单一疗法即组合的单个组分的效果比较时，协同性组合可提供改善的效果，该效果可通过总肿瘤细胞数、复发时间长度、和患者健康的标记测量。

[0031] 本发明的协同性组合将靶向以抑制或阻断CD47功能的试剂，和靶向以抑制或阻断第二肺癌细胞标记物，通常是细胞表面标记物的试剂组合。该组合可以试剂的组合提供，例如以各自对不同的标记物有特异性的2种不同蛋白质的组合提供；或者可作为合并针对2种或更多种不同标记物的特异性的多特异性试剂(例如抗体)提供。

[0032] 组合治疗：本文所用术语“组合治疗”是指其中对象同时接触2种或更多种治疗方案(例如，2种或更多种治疗剂)的情况。在一些实施方式中，2种或更多种试剂可同时给予；在一些实施方式中，这些试剂可依次给予；在一些实施方式中，这些试剂可以重叠给药方案给予。

[0033] 剂型：本文所用术语“剂型”是指用于给予对象的活性试剂(例如，治疗性或诊断性试剂)的物理离散单位。各单位含预订量的活性试剂。在一些实施方式中，该量是对于按照给药方案适于给药的单位剂量(或其全组分)，当给予相关群体(即，用治疗性给药方案)时，该给药方案已经确定与所需或有益结果相关。本领域普通技术人员理解，由一个或多个主治医师确定给予特定对象的治疗性组合物或试剂的总量并且可包括给予多个剂型。

[0034] 给药方案：本文所用术语“给药方案”是指通常由一段时间间隔的单独给予对象的一组单位剂量(通常超过一个)。在一些实施方式中，给定的治疗试剂有推荐的给药方案，其可包括一剂或多剂。在一些实施方式中，给药方案包括多剂，其各自互相间隔相同的时间段；在一些实施方式中，给药方案包括多剂和间隔单独剂量的至少2种不同的时间段。在一些实施方式中，给药方案内的所有剂量都是相同的单位剂量。在一些实施方式中，给药方案内的不同剂量是不同量。在一些实施方式中，给药方案包括第一剂量的第一剂，之后是与第一剂量不同的第二剂量的一个或多个其他剂。在一些实施方式中，给药方案包括第一剂量的第一剂，之后是与第一剂量相同的第二剂量的一个或多个其他剂。在一些实施方式中，当在相关群之间给予时，给药方案与所需或有益的结果相关(即，是治疗性给药方案)。

[0035] CD47多肽。人CD 47的3个转录变体(变体1，NM 001777；变体2，NM 198793；和变体3，NM 001025079)编码CD47多肽的3个同种型。3个同种型中最长的CD47同种型1(NP
001768)长度为323个氨基酸。CD47同种型2(NP 942088)长度为305个氨基酸。CD47同种型3长度为312个氨基酸。这3个同种型的前303个氨基酸序列相同。氨基酸1-8包含信号肽，氨基酸9-142包含CD47免疫球蛋白样结构域，其是可溶性片段，并且氨基酸143-300是跨膜结构域。

[0036] 天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有与天然序列多肽共同的定性生物性质的化合物。“功能性衍生物”包括，但不限于，天然序列的片段或天然序列多肽的衍生物及其片段，前提是它们具有与相应的天然序列多肽共同的生物活性。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体及其共价修饰。发现可溶性CD47的衍生物和融合用作CD47模拟分子。

[0037] CD47多肽的前142个氨基酸包含CD47的胞外区(SEQ ID NO：1)。3种同种型在胞外区上有相同的氨基酸序列，并且因此任意同种型可用于生成可溶性CD47。“可溶性CD47”是缺少跨膜结构域的CD47蛋白。可溶性CD47分泌到表达其的细胞以外而不是位于细胞表面。

[0038] CD47生物活性的体外试验包括，例如，对人巨噬细胞吞噬猪细胞的抑制、结合至SIRPα受体、SIRPα酪氨酸磷酸化等。CD47生物活性的示例性试验在候选试剂存在下接触人巨噬细胞组合物。细胞用候选试剂孵育约30分钟并裂解。细胞裂解液与抗-人SIRPα抗体混合以使SIRPα免疫沉淀。通过SDS-PAGE解析沉淀的蛋白质，然后转移至硝酸纤维素上并用针对磷酸酪氨酸特异性的抗体进行探测。与在没有候选试剂的情况下观察到的磷酸化水平相比，可用作CD47模拟物的候选试剂增加酪氨酸磷酸化至少10％，或高至20％，或50％，或70％或80％或高至约90％。CD47生物活性的另一个示例性试验测量人巨噬细胞对造血细胞的吞噬作用。与在没有候选试剂的情况下观察到的吞噬水平相比，可用作CD47模拟物的候选试剂导致吞噬作用下调至少约10％，至少约20％，至少约50％，至少约70％，至少约80％，或高至约90％。

[0039] “操控吞噬作用”表示与在没有介入的情况下观察到的吞噬水平相比，吞噬作用上调或下调至少约10％，或高至20％，或50％，或70％或80％或高至约90％。因此，在降低循环造血细胞的吞噬作用的情况中，尤其是在移植的情况中，操纵吞噬作用表示与在没有介入的情况下观察到的吞噬水平相比，吞噬作用下调至少约10％，或高至20％，或50％，或70％或80％或高至约90％。

[0040] 抗-CD47试剂。本文所用术语“抗-CD47试剂”是指降低CD47(例如，靶细胞上)对SIRPα(例如，吞噬细胞上)的结合的任意试剂。合适的抗-CD47试剂的非限制性示例包括SIRPα试剂，包括但不限于高亲和性SIRPα多肽、抗-SIRPα抗体、可溶性CD47多肽、和抗-CD47抗体或抗体片段。在一些实施方式中，合适的抗-CD47试剂(例如，抗-CD47抗体，SIRPα试剂等)特异性结合CD47以减少CD47对SIRPα的结合。在一些实施方式中，合适的抗-CD47试剂(例如，抗-SIRPα抗体，可溶性CD47多肽等)特异性结合SIRPα以减少CD47对SIRPα的结合。结合SIRPα的合适抗-CD47试剂并不激活SIRPα(例如，在SIRPα-表达吞噬细胞中)。

[0041] 可通过测试试剂来评价合适的抗-CD47试剂的功效(如下文所述)。在一个示例性试验中，在候选试剂存在或缺少下孵育靶细胞。与缺少试剂的情况中的吞噬作用相比，用于本发明的方法的试剂将上调吞噬作用至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少
50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少120％、至少140％、至少
160％、至少180％、或至少200％)。类似地，与没有候选试剂的情况中观察到的磷酸化相比，SIRPα的酪氨酸磷酸化水平的体内试验将显示磷酸化降低至少5％(例如，至少10％、至少
15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％)。

[0042] 在一些实施方式中，抗-CD47试剂在结合后不激活CD47。当CD47被激活时，可能发生与凋亡类似的过程(即，程序性细胞死亡)(Manna和Frazier，Cancer Research，64，1026-1036，2004年2月1日)。因此，在一些实施方式中，抗-CD47试剂并不直接通过凋亡诱导CD47-表达细胞的细胞死亡。

[0043] SIRPα试剂。SIRPα试剂包含足够以可识别的亲和性结合CD47的SIRPα部分，其通常在信号序列和跨膜结构域之间，或其保留结合活性的片段。合适的SIRPα试剂减少(例如，阻断、防止等)天然蛋白SIRPα与CD47之间的相互作用。SIRPα试剂将通常包含至少SIRPα的d1结构域。在一些实施方式中，SIRPα试剂是融合蛋白，例如，在构架区中与第二多肽融合。在一些实施方式中，第二多肽能够增加融合蛋白的尺寸，例如，使得融合蛋白不会从循环中被快速清除。在一些实施方式中，第二多肽是免疫球蛋白Fc区的部分或全部。Fc区通过提供“吃我”信号辅助吞噬作用，该信号强化了对由高亲和性SIRPα试剂提供的“不吃我”信号的阻断。在其他实施方式中，第二多肽是与Fc基本相似的任意合适多肽，例如，提供增加的尺寸、多聚化结构域、和/或其他结合或与Ig分子的相互作用。

[0044] 在一些实施方式中，对象抗-CD47试剂是“高亲和性SIRPα试剂”，其包括SIRPα-衍生的多肽及其类似物。国际申请PCT/US13/21937中描述了高亲和性SIRPα试剂，其在此通过引用具体纳入。高亲和性SIRPα试剂是天然SIRPα蛋白的变体。在一些实施方式中，高亲和性SIRPα是可溶的，其中该多肽缺少SIRPα跨膜结构域并且包含与野生型SIRPα序列相关的至少一个氨基酸变化，并且其中该氨基酸变化增加了SIRPα多肽对CD47的结合亲和性，例如，通过降低解离速率至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更多。

[0045] 高亲和性SIRPα试剂包含足够以可识别的亲和性，例如高亲和性结合CD47的SIRPα部分，其通常在信号序列和跨膜结构域之间，或其保留结合活性的片段。高亲和性SIRPα试剂将通常包含至少SIRPα的d1结构域，其带有修饰的氨基酸以增加亲和性。

[0046] SIRPα试剂可用作“单体”，其中使用SIRPα的结合结构域，但是该结合结构域以可溶性单体蛋白质提供。在其他实施方式中，本发明的SIRPα变体是融合蛋白，例如，在构架区中与第二多肽融合，尤其在第二多肽提供多聚化的情况中。在一些实施方式中，第二多肽是免疫球蛋白Fc区的部分或全部。Fc区通过提供“吃我”信号辅助吞噬作用，该信号强化了对由高亲和性SIRPα试剂提供的“不吃我”信号的阻断。在其他实施方式中，第二多肽是与Fc基本相似的任意合适多肽，例如，提供增加的尺寸、多聚化结构域、和/或其他结合或与Ig分子的相互作用。

[0047] 提供增加的亲和性的氨基酸变化位于d1结构域，并且因此高亲和性SIRPα试剂包含人SIRPα的d1结构域，带有在d1结构域内至少一个相对于野生型序列的氨基酸变化。这类高亲和性SIRPα试剂任选地包含其他氨基酸序列，例如抗体Fc序列；除d1结构域以外的野生型人SIRPα的部分，包括但不限于天然蛋白的残基150-374或其片段，通常片段与d1结构域连续；等。高亲和性SIRPα试剂可以是单体或多聚体，例如，二聚体、三聚体、四聚体等。

[0048] 抗-CD47抗体。在一些实施方式中，对象抗-CD47试剂是特异性结合CD47(即，抗-CD47抗体)并降低细胞(例如，感染的细胞上)上的CD47与另一个细胞(例如，吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用的抗体。在一些实施方式中，合适的抗-CD47抗体并不在结合后激活CD47，例如不在结合后诱导凋亡的抗体。合适的抗体的非限制性示例包括克隆B6H12、5F9、8B6、和C3(例如，国际专利公开号WO 2011/143624中所述，其通过引用具体纳入本文)。合适的抗-CD47抗体包括这类抗体的全人、人源化或嵌合版本。由于它们的低抗原性，人源化抗体(例如，hu5F9-G4)可特别用于人的体内应用。类似地，犬源化、猫源化抗体等分别特别用于狗、猫和其他物种中的应用。感兴趣的抗体包括人源化抗体，或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化抗体等及其变体。

[0049] 抗-SIRPα抗体。在一些实施方式中，对象抗-CD47试剂是特异性结合SIRPα(即，抗-SIRPα抗体)并降低细胞(例如，感染的细胞上)上的CD47与另一个细胞(例如，吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用的抗体。合适的抗-SIRPα抗体可结合SIRPα而不激活或刺激通过SIRPα的信号转导，因为SIRPα的活化将抑制吞噬作用。相反，合适的抗-SIRPα抗体促进受损害细胞相比正常细胞的优先吞噬。表达较高水平CD47的这些细胞(例如，感染的细胞)相对于其他细胞(非感染的细胞)将优先被吞噬。因此，合适的抗-SIRPα抗体特异性结合SIRPα(没有活化/刺激足够的信号转导应答以抑制吞噬作用)并且阻断SIRPα和CD47之间的相互作用。合适的抗-SIRPα抗体包括这类抗体的全人、人源化或嵌合版本。由于它们的低抗原性，人源化抗体可特别用于人的体内应用。类似地，犬源化、猫源化抗体等分别特别用于狗、猫和其他物种中的用用。感兴趣的抗体包括人源化抗体，或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化抗体等及其变体。

[0050] 可溶性CD47多肽。在一些实施方式中，对象抗-CD47试剂是特异性结合SIRPα并降低细胞(例如，感染的细胞上)上的CD47与另一个细胞(例如，吞噬细胞)上的SIRPα之间的相互作用的可溶性CD47多肽。合适的可溶性CD47多肽可结合SIRPα而不激活或刺激通过SIRPα的信号转导，因为SIRPα的活化将抑制吞噬作用。相反，合适可溶性CD47多肽促进感染的细胞相比非感染的细胞的优先吞噬。表达较高水平CD47的这些细胞(例如，感染的细胞)相对于正常非靶细胞(正常细胞)将优先被吞噬。因此，合适的可溶性CD47多肽特异性结合SIRPα而不活化/刺激足够的信号转导信号以抑制吞噬作用。

[0051] 在一些情况中，合适的可溶性CD47多肽可以是融合蛋白(例如，结构如美国专利公开号US20100239579所述，在此通过引用具体纳入)。然而，只有不活化/刺激SIRPα的融合蛋白适用于本文所述的方法。合适的可溶性CD47多肽还包括包含变体或天然存在的CD47序列(例如，胞外结构域序列或胞外结构域变体)的任意多肽或多肽片段，其可特异性结合SIRPα并且抑制CD47和SIRPα之间的相互作用而不刺激足够的SIRPα活性以抑制吞噬作用。

[0052] 在某些实施方式中，可溶性CD47多肽包含CD47的胞外结构域，包括信号肽，使得CD47的胞外部分长度一般为142个氨基酸，并且具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。本文所述的可溶性CD47多肽也包括CD47胞外结构域变体，其包含至少65％-75％、75％-80％、80-85％、85％-90％、或95％-99％(或65％至100％之间不具体的任何百分比)的氨基酸序列，其变体保留对SIRPα的结合能力而不刺激SIRPα信号转导。

[0053] 在某些实施方式中，信号肽氨基酸可被来自另一个多肽(例如，免疫球蛋白或CTLA4)的信号肽氨基酸序列所替代。例如，与全长CD47(穿过细胞外膜的细胞表面多肽)不同，可溶性CD47多肽被分泌；因此，编码可溶性CD47多肽的多核苷酸可包括编码与通常从细胞分泌的多肽相关的信号肽的核苷酸序列。

[0054] 在其他实施方式中，可溶性CD47多肽包含缺少信号肽的CD47胞外结构域。在一个示例性实施方式中，缺少信号肽的CD47胞外结构域具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列(124个氨基酸)。如本文所述，分泌或跨膜蛋白质的信号肽并不在细胞表面上暴露，因为信号肽不是在蛋白质的移位期间被切割就是锚定在细胞外膜上(这种信号肽也被称为信号
锚)。CD47的信号肽序列被认为在体内从前体CD47多肽上切下。

[0055] 在其他实施方式中，可溶性CD47多肽包含CD47胞外结构域变体。这种可溶性CD47多肽保留结合SIRPα而不刺激SIRPα信号转导的能力。CD47胞外结构域变体可具有与参照人CD47序列至少65％-75％、75％-80％、80-85％、85％-90％、或95％-99％相同(包括所述范围任意之间的任一百分比)的氨基酸序列。

[0056] 术语“抗体”或“抗体部分”旨在包括任意含多肽链的分子结构，其具有特定形状以契合并识别表位，其中一个或多个非共价结合相互作用使得分子结构和表位之间的复合物稳定化。用于本发明的抗体可以是多克隆抗体，虽然优选单克隆抗体，因为它们可以通过细胞培养或重组复制，并且可经修饰以降低它们的抗原性。

[0057] 可通过用抗原性组合物注射生产动物的标准方案来产生多克隆抗体。参见例如，Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1988。当使用完整蛋白质，或蛋白质的较大部分时，可通过用蛋白质和合适佐剂(例如，弗氏、弗氏完全、水包油乳液等)免疫生产动物来产生抗体。当使用较小的肽时，优选将肽与较大分子偶联以产生免疫刺激性偶联物。针对这类用途的市售常用偶联蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)和钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。为了产生针对特定表位的抗体，可使用衍生自完整序列的肽。或者，为了产生针对蛋白质靶标的较短肽部分的抗体，可引发优势免疫应答，如果多肽连接至运载体蛋白质，如卵清蛋白、BSA或KLH。或者，对于单克隆抗体，可通过分离刺激的免疫细胞，如来自接种的动物的脾脏的那些来形成杂交瘤。这些细胞然后融合至永生化细胞，如骨髓瘤细胞或转化的细胞，其能够在细胞培养中无限复制，从而产生永生的免疫球蛋白分泌细胞系。另外，可通过遗传工程产生抗体或其抗原结合片段。当给予人时产生较少免疫应答的人源化、嵌合或异种人抗体优选用于本发明。

[0058] 除了完整的免疫球蛋白(或其重组对应物)以外，包含表位结合位点(例如，Fab’、F(ab’)2、或其他片段)的免疫球蛋白片段可用作本发明的抗体部分。可通过蓖麻毒素、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其他蛋白酶切割从整个免疫球蛋白中生成抗体片段。可使用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或小免疫球蛋白。例如，用于本发明的“Fv”免疫球蛋白可通过将可变轻链区通过肽接头(例如，多甘氨酸或其他序列，其不形成α螺旋或β折叠基序)连接至可变重链区来产生。

[0059] 抗体包括游离抗体及其衍生的抗原结合片段，以及偶联物，例如PEG化的抗体、药物、放射性同位素或毒素偶联物等。针对特定表位，或表位组合的单克隆抗体将允许对表达该标记物的细胞群的靶向和/或消除。可采用各种技术，使用单克隆抗体来筛选表达标记物的细胞群，并且包括使用抗体包被的磁珠的磁性分离，“淘选”附连至固体基质(例如，平板)的抗体，和流式细胞术(参见，例如，美国专利号5,985,660；和Morrison等，Cell，96：737-49(1999))。这些技术允许在活检样品的免疫组化中；在检测由癌细胞脱落到血液和其他生物流体中的标记物的存在等中筛选特性细胞群。

[0060] 这类抗体的人源化版本也在本发明的范围内。由于它们的低抗原性，人源化抗体可特别用于人的体内应用。

[0061] 术语“多特异性”或“双特异性抗体”是指识别超过一种蛋白质的合成或重组抗体。针对表位组合的双特异性抗体将允许对表达该表位组合的细胞群的靶向和/或消除。示例性的双特异性抗体包括靶向CD47和SCLC癌细胞标记物的组合的那些。双特异性抗体的生成在文献，例如在USPN 5989830，USPN 5798229中描述，其通过引用纳入本文。Holliger和Hudson(2005)Nature Biotechnology 23：1126-1136描述了更高级的特异性，例如三特异性抗体。

[0062] 可通过测试CD47活性来评价CD47抑制剂的功效。使用上述试验或其修饰版本。在一个示例性试验中，SCLC在候选试剂存在或缺失下与骨髓衍生的巨噬细胞孵育。与在缺少候选试剂的情况中的吞噬作用相比，细胞表面CD47的抑制剂将上调吞噬作用至少约10％，或高至20％，或50％，或70％或80％或高至约90％。类似地，SIRPα的酪氨酸磷酸化水平的体外试验将显示与在缺少候选试剂的情况中观察到的磷酸化相比，磷酸化降低至少约10％，或高至20％，或50％，或70％或80％或高至约90％。

[0063] 在本发明的一个实施方式中，以可检测地抑制CD47对吞噬细胞表面上存在的SIRPα受体的结合的有效量提供试剂，或包含该试剂的药物组合物。通过本领域的经验型测试途径来确定有效量。有效量可根据移植的细胞数量、移植部位和抑制物受体的特定因素变化。

[0064] 术语“吞噬细胞”和“吞噬性细胞”在本文中可互换使用以指代能够吞噬的细胞。有四种主要类型的吞噬细胞：巨噬细胞、单核细胞(组织细胞和单核细胞)；多形核白细胞(嗜中性粒细胞)和树突细胞。

[0065] 术语“生物样品”包括从生物体获得的各种样品类型，并可用于诊断或监测实验。该术语包括生物来源的血液和其它液体样品，固体组织样品如活检样品或组织培养物或由其衍生的细胞，以及它们的后代。该术语包含获得后经任何方式处理的样品，如试剂处理、溶解、或对某些组分的富集。该术语包括临床样品，也包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品。

[0066] 本文所用术语“疗法”、“治疗”、“处理”等通常指获得所需的药理学和/或生理学作用。从完全或部分防止疾病或其症状方面来说，这种作用可以是预防性的，和/或从部分或完全稳定或治愈疾病和/或由该疾病产生的不良影响来说，这种作用可以是治疗性的。本文所用“治疗”覆盖对哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、灵长类包括人和其他猿类，尤其是人的疾病的任意治疗，并包括：(a)防止疾病或症状在可能有针对该疾病或症状倾向但尚未诊断患有该疾病或症状的对象中发生；(b)抑制疾病症状，即，阻滞其发展；或(c)减轻疾病症状，即导致疾病或症状消退。

[0067] 术语“受体”、“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中互换使用，指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，尤其是人。

[0068] 本文所用“宿主”是指单细胞实体培养的微生物或真核细胞或细胞系，其可以，或已经用作重组载体或其他转移多核苷酸的受体，并且包括已经转染的原始细胞的后代。应理解，由于天然、意外或有意突变，单细胞的后代可能不必在形态上或基因组或总DNA互补上与原始母体完全相同。

[0069] 术语“癌症”、“瘤”、“肿瘤”和“癌”在本文中可互换使用，指具有相当高的自主生长活性的细胞，因此它们具有异常的生长表型，特征是明显丧失对细胞增殖的控制。一般而言，用于本申请中的检测或治疗的感兴趣细胞包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移和非转移细胞。癌细胞的检测是特别令人感兴趣的。“正常细胞”内容中使用的术语“正常”是指未转化表型的细胞或显示出所检测组织类型的未转化细胞的形态的细胞。“癌症表型”通常指以癌细胞为特征的各种生物学现象，这些现象视癌症类型而不同。通常通过以下现象来鉴定癌症表型，例如，细胞生长或增殖异常(如生长或增殖不受控制)、细胞周期调节异常、细胞运动异常、细胞-细胞相互作用异常或转移等。

[0070] “治疗靶标”是指基因或基因产物，在调节其活性(例如，通过调节表达、生物活性等)之后，可提供对癌症表型的调节。本文所用的“调节”是指所示表型的增加或减少(例如，调节生物活性是指生物活性增加或生物活性减少)。

[0071] 肺癌

[0072] 肺癌是全球癌症相关死亡的头号原因。大约85％的病例与吸烟相关。症状可包括咳嗽、胸部不适或疼痛、体重下降，以及较不常见的，咳血；然而，许多患者存在转移性疾病而没有任何临床症状。一般通过胸部x-射线或CT来进行诊断并通过活检来确认。根据疾病的阶段，治疗包括手术、化疗、放疗或组合。在过去的几十年中，肺癌患者的预后较差，尤其是对于四期(转移性)疾病的患者而言。

[0073] 在变为癌性之前(称为区域性致癌的效果)，呼吸道上皮细胞需要延长接触癌症促进剂并且积累多种遗传突变。在一些肺癌患者中，基因中刺激细胞生长(K-ras，MYC)、导致生长因子信号转导异常(EGFR，HER2/neu)、并抑制凋亡的二次或其他突变导致异常细胞的增殖。另外，抑制肿瘤抑制基因(p53，APC)的突变可导致癌症。其他可能负责的突变包括EML-4-ALK移位以及ROS-1、BRAF和PI3KCA中的突变。像这些主要导致肺癌的基因被称为驱动突变。虽然驱动突变在吸烟者中可导致或造成肺癌，这些突变特别可能是非吸烟者中的肺癌病因。

[0074] 胸部x-射线通常是初始图像测试。其可显示清楚限定的异常，如单一质量或多灶性质量或孤立性肺结节，放大的种脐、变宽的纵隔，气管支气管变窄、肺不张、分解析实质移入、空洞性病变、或不明原因的胸膜增厚或积液。这些发现是启发性的，但不能诊断肺癌并且需要用CT扫描或组合PET-CT扫描跟踪和细胞病理学标准。

[0075] CT显示许多可能强烈表明诊断的特征性解剖学特征和外观。CT也可引导可及损伤的核针活检并可用于分期。如果在平面x-射线上发现的损伤非常可能是肺癌，可进行PET-CT。该研究将来自CT的解剖学成像与来自PET的功能性成像结合。PET图像可辅助区分炎性和恶性过程。

[0076] SCLC具有2个阶段：受限和扩张。受限阶段的SCLC疾病是局限于一个半胸(包括同侧淋巴结)的癌症，其可包括在一个可容忍放疗部分内，除非有胸腔积液或心包积液。扩张阶段的疾病是在单个半胸以外的癌症或者在胸腔积液或心包积液中检测到存在恶性细胞。不到三分之一的SCLC患者将处于受限阶段的疾病；其余的患者通常具有扩张的远端转移。
SCLC的总体预后较差。受限阶段的SCLC的中值存活时间是20个月，5年存活率是20％。患有扩张阶段的SCLC的患者特别差，5年存活率不到1％。

[0077] NSCLC具有一期到四期的4个阶段(使用TNM系统)。TNM分期是基于肿瘤尺寸、肿瘤和淋巴结位置、以及是否存在远端转移。NSCLC患者的5年存活率随着阶段变化，从一期患者的60-70％到四期患者的不到1％。

[0078] 根据细胞类型和疾病阶段改变常规治疗。许多与肿瘤不相关的患者因素影响治疗选择。弱心肺恢复，营养不良，虚弱或差的生理功能状态，包括血细胞减少症，和精神或认知疾病都可能导致缓解性治疗优于治愈性治疗或完全不治疗的决定，即使用进取性疗法治愈在技术上可能的情况下。

[0079] 任何阶段的SCLC一般初始对治疗有响应，但是响应通常是短期的。根据疾病阶段给予化疗，伴随或不伴随放疗。在许多患者中，化疗延长了存活并改善了生活质量，足以有理由对其进行使用。手术一般在SCLC治疗中不起作用，虽然其可能在具有小的没有扩散的局灶性肿瘤(如孤立性肺结节)的少数患者中可有治愈效果，该患者在肿瘤被鉴定为SCLC之前进行手术切除。通常使用依托泊甙和铂化合物(顺铂或卡铂)的化疗方案，以及其他药物，如伊立替康、拓扑替康、长春花生物碱(长春花碱、长春新碱、长春瑞滨)、烷化剂(环磷酰胺、异环磷酰胺)、多柔比星、紫杉烷(多西他赛、紫杉醇)、和吉西他滨。当疾病限于一个半胸时，放疗还改善了临床结果；这种对放疗的响应是受限阶段疾病的限定基础。在某些病例中还主张使用颅辐射来防止脑部转移；微转移在SCLC中常见，并且化疗几乎无法穿过血脑屏障。

[0080] 在扩张阶段的疾病中，治疗是基于化疗而不是放疗，虽然放疗通常用作对骨骼或脑部转移的缓解性治疗。在对化疗有强烈响应的患者中，预防性脑部辐射有时用于受限阶段的SCLC以防止SCLC在脑部生长。

[0081] NSCLC的治疗一般包括根据肿瘤类型和阶段评价手术的适格性，之后选择手术、化疗、放疗或合适形式的组合。

[0082] 癌症治疗

[0083] 本发明提供了通过导入针对肺癌细胞表面标记物，包括但不限于CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAM等的有效剂量的靶向治疗剂来降低肺癌细胞生长的方法。在一些实施方式中，标记物是CD56、CD44、CD99和EpCam之一。在优选的实施方式中，靶向治疗剂与CD47阻断剂，例如，可溶性SIRPα单体或多聚体，抗-CD47抗体，小分子等组合。在某些实施方式中，所述癌症是SCLC。通过阻断CD47的活性，防止了某些肿瘤细胞中发现的吞噬作用下调。

[0084] “降低癌细胞生长”包括但不限于，降低癌细胞增殖，并降低非癌细胞变成癌细胞的发生率。可使用任意已知试验来容易地确定是否已经实现了降低癌细胞生长，包括但不限于[3H]-胸苷掺入；随时间计算细胞数量；检测和/或测量与SCLC相关的标记物等。

[0085] 可使用多种已知的癌症诊断试验中的任一种评价一种物质(或特定量的该物质)是否有效治疗癌症，包括但不限于活检、比较影像研究、CAT扫描、和检测个体血液中与癌症相关的肿瘤标记物。物质可全身或局部给予，通常全身给予。

[0086] 作为替代性实施方式，试剂，例如降低癌细胞生长的化疗药物可通过偶联至CD47特异性抗体靶向癌细胞。因此，在一些实施方式中，本发明提供了一种向癌细胞递送药物的方法，包括向对象给予药物-抗体复合物，其中所述抗体对癌症相关多肽有特异性，并且所述药物是降低癌细胞生长的药物，多种这类药物为本领域所知。可通过将药物偶联至对癌症相关多肽有特异性的抗体(例如，连接，直接或通过接头分子，共价或非共价，以形成药物-抗体复合物)来完成靶向。将药物偶联至抗体的方法为本领域所熟知并且不需要在此详述。

[0087] 在某些实施方式中，可使用双特异性抗体。例如，可使用其中一个抗原结合结构域针对CD47并且另一个抗原结合结构域针对癌细胞标记物如CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAM等的双特异性抗体。

[0088] 通常，在说明书中使用的术语“抗体”或“抗体部分”旨在包括任意含多肽链的分子结构，其具有特定形状以契合并识别表位，其中一个或多个非共价结合相互作用使得分子结构和表位之间的复合物稳定化。对于单克隆抗体，可通过分离刺激的免疫细胞，如来自接种的动物的脾脏的那些来形成杂交瘤。这些细胞然后融合至永生化细胞，如骨髓瘤细胞或转化的细胞，其能够在细胞培养中无限复制，从而产生永生的免疫球蛋白分泌细胞系。所用永生细胞系优选选择成缺乏利用某些营养素所必需酶的细胞系。许多这类细胞系(如骨髓瘤)是本领域技术人员已知的，并且包括例如：胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)。这些缺陷使得能够选择融合细胞，例如，按细胞在次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷(HAT)培养基中生长的能力选择。

[0089] 本发明优选使用具有降低的诱导人中剧烈或有害免疫应答倾向(如过敏性休克)，以及还显示出降低的引发免疫应答(其将阻止抗体治疗性或成像剂的重复给药(例如，人-抗-小鼠-抗体“HAMA”响应))的倾向的抗体。这些抗体对于所有给药途径而言都是优选的。因此，当给予人时产生较少免疫应答的人源化、嵌合或异种人抗体优选用于本发明。

[0090] 可通过重组方式通过将单独获自鼠(或其他动物来源)的杂交瘤的鼠可变轻链区和重链区(VK和VH)与人恒定轻链区和重链区组合来制备嵌合抗体，以产生具有预定的人结构域的抗体。这类嵌合蛋白的生产是本领域已知的且可通过标准方法实现(描述于例如美国专利号5,624,659，其通过引用全文纳入本文)。人源化抗体经工程改造以含有更多人-样免疫球蛋白结构域，并且仅纳入动物来源抗体的互补决定区。这通过仔细检查单克隆抗体的可变区的高变环序列并将它们与人抗体链的结构拟合来实现。虽然表面上很复杂，该过程在实践中是简单易行的。参见美国专利号6,187,287，其通过引用全文纳入本文。

[0091] 或者，可从已经遗传改变以产生人免疫球蛋白的动物中产生多克隆抗体或单克隆抗体。可通过初始产生不产生动物的天然抗体的“敲除”动物，并且用人抗体基因座来稳定转化该动物(例如，通过使用人的人工染色体)来产生转基因动物。然后该动物仅产生人抗体。生成这类动物以及从中衍生抗体的技术描述于美国专利号6,162,963和6,150,584，其通过引用全文纳入本文。这类完全人异种抗体是用于本发明的方法和组合物的优选抗体。或者，可从含人可变区的噬菌体文库中产生单链抗体。参见美国专利号6,174,708，其通过引用全文纳入本文。

[0092] 除了完整的免疫球蛋白(或其重组对应物)以外，包含表位结合位点(例如，Fab’、F(ab’)2、或其他片段)的免疫球蛋白片段可用作本发明的抗体部分。可通过蓖麻毒素、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其他蛋白酶切割从整个免疫球蛋白中生成抗体片段。可使用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或小免疫球蛋白。例如，用于本发明的“Fv”免疫球蛋白可通过将可变轻链区通过肽接头(例如，多甘氨酸或其他序列，其不形成α螺旋或β折叠基序)连接至可变重链区来产生。

[0093] Fv片段是可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的异二聚体。在全IgG中出现的重链结构域和轻链结构域的异二聚体，例如，通过二硫键连接。其中VH和VL通过肽接头连接的重组Fv一般是稳定的，参见例如，Huston等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 85：58795883(1988)和Bird等，Science 242：423 426(1988)，两者通过引用全文纳入本文。这些是单链Fv，其已经发现保留特异性和亲和性并且已经显示可用于肿瘤成像并制备用于肿瘤治疗的重组免疫毒素。然而，研究人员已经发现单链Fv中的一些抗原亲和性降低，并且肽接头可干扰结合。也已经制备改善的Fv，其包括稳定化VH和VL区之间的二硫键，如美国专利号6,147,203所述，其通过引用全文纳入本文。本发明可使用这些小抗体中的任意，并且经人源化以避免HAMA反应的那些抗体优选用于本发明的实施方式。

[0094] 带添加的化学接头，可检测的部分如荧光染料、酶、底物、化学发光部分、特异性结合部分如链霉亲和素、亲和素或生物素，或药物偶联物的衍生的多肽可用于本发明的方法和组合物中。

[0095] 在本发明的一些实施方式中，本发明的多肽试剂偶联或耦合至一种或多种治疗性、细胞毒性或成像部分。本文所用的“细胞毒性部分”(C)简单地表示在靠近细胞或被细胞吸附时抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分。在这一方面，合适的细胞毒性部分包括放射性同位素(放射性核素)、化学毒剂如分化诱导剂以及小化学毒性药物、毒性蛋白质及其衍生物。在适当考虑药物动力学稳定性和降低对患者的总体毒性的需要的情况下，试剂可通过任意合适的技术偶联至本发明的多肽试剂。治疗剂可直接或间接(例如，通过接头基团)偶联至合适的部分。当各自具有能够互相反应的功能性基团时，直接反应是可能的。例如，亲核性基团，如氨基或巯基基团能够与含羰基的基团，如酸酐或酰基卤，或含良好离去基团(例如，卤素)的烷基反应。或者，可使用合适的化学接头基团。接头基团可发挥间隔子的功能以使本发明的多肽试剂与试剂远离以避免结合功能的干扰。接头基团也可用于增加本发明的部分或多肽试剂上的取代基的化学反应性，并因此提高偶联效率。化学反应性的增加可促进部分或部分上的功能性基团的使用，这在其他情况下是不可能的。

[0096] 合适的连接化学物包括马来酰亚胺基接头和烷基卤接头(其与抗体部分上的巯基反应)和琥珀酰亚胺基接头(其与抗体部分上的伯胺反应)。免疫球蛋白上存在多个伯胺和巯基基团，并且其他基团可被设计到重组免疫球蛋白分子中。对本领域技术人员显而易见的是，同官能和异官能的多种双官能或多官能试剂(如皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)，Rockford，Ill的目录中所述的那些)可用作接头基团。偶联可通过，例如，氨基、羧基、巯基或氧化的糖残基来实现。有多个描述该方法的参考文献，例如，美国专利号4,671,958。
作为替代性偶联方法，细胞毒性部分可通过在糖基化位点处氧化的糖基团偶联至本发明的多肽试剂，如美国专利号5,057,313和5,156,840所述。将本发明的多肽试剂偶联至细胞毒性或治疗性部分的另一种替代性方法是通过使用非共价结合对，如链霉亲和素/生物素，或亲和素/生物素。在这些实施方式中，所述对的一个成员与抗-CD47，CV1等共价偶联，并且所述结合对的另一个成员共价偶联至治疗性、细胞毒性或成像部分。

[0097] 在细胞毒性部分从本发明的多肽试剂的结合部分游离时更强效的情况中，可能需要使用在内化到细胞中期间或之后可切割，或者在胞外环境中可随时间逐渐切割的接头基团。已经描述了多种不同的可切割接头基团。细胞毒性部分试剂从这些接头基团胞内释放的机制包括通过还原二硫键(例如，美国专利号4,489,710)、通过辐射光不稳定键(例如，美国专利号4,625,014)、通过衍生的氨基酸侧链的水解(例如，美国专利号4,638,045)、通过血清补体介导的水解(例如，美国专利号4,671,958)和酸催化的水解(例如，美国专利号4，569，789)进行切割。

[0098] 可能需要将超过一个部分偶联至本发明的多肽试剂。通过使试剂多衍生化，可同时实施几种策略，例如可标记治疗性抗体用于通过可视化技术进行追踪。与特定实施方式无关，可通过多种方式制备具有超过一个部分的偶联物。例如，超过一个部分可直接偶联至多肽分子，或者可使用提供用于接合的多个位点的接头(例如，枝状聚合物)。或者，可使用具有容纳超过一个细胞毒性或成像部分的容量的运载体。

[0099] 运载体可以多种方式包含试剂，包括直接或通过接头基团的共价成键，和非共价结合。合适的共价结合运载体包括蛋白质如白蛋白(例如，美国专利号4,507,234)、肽、和多糖如氨基葡聚糖(例如，美国专利号4,699,784)，其各自具有用于部分接合的多个位点。运载体也可通过非共价结合，如非共价成键或通过包封，如在脂质体载剂内(例如，美国专利号4,429,008和4,873,088)含有试剂。包封运载体可特别用于用于本发明的成像部分偶联至抗体部分，因为足量的用于检测的成像部分(染料、磁共振造影剂等)可更容易地与抗体部分结合。另外，包封运载体也可用于细胞毒性治疗性实施方式，因为它们使得治疗性组合物随时间逐渐释放化学毒性部分，同时使其在肿瘤细胞附近浓缩。

[0100] 用作细胞毒性部分的优选放射性核素是适用于药物给予的放射性核素。这类核素包括123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb、和212Bi。碘和砹同位素是用于本发明的治疗性组合物的更优选放射性核素，因为关于它们的使用已经积累了大量文献。

[0101] 优选的化学毒性试剂包括小分子药物，如卡铂，顺铂，长春新碱，紫杉烷如紫杉醇和多西紫杉醇，羟基脲，吉西他滨，长春瑞滨，伊立替康，替拉扎明，基质溶解因子，氨甲蝶呤，嘧啶和嘌呤类似物，以及本领域抑制的其他合适小细胞毒素。优选的化学毒素分化诱导剂包括佛波醇酯和丁酸。化学毒性部分可通过化学接头直接偶联至抗体部分，或者可以包埋在运载体中，其进而偶联至抗体。用作细胞毒性部分的优选毒素蛋白包括蓖麻毒蛋白A和B，相思豆毒蛋白，白喉毒素，异株泻根毒蛋白1和2，苦瓜定，括楼素，霍乱毒素，白树毒素，假单胞菌外毒素，志贺毒素，美洲商陆抗病毒蛋白，以及医药生物化学领域已知的其他毒素蛋白。由于这些毒素试剂可在患者中引发不希望的免疫应答，尤其是如果在血管内注射时，优选将它们包埋在运载体中用于偶联至抗体。

[0102] 对于给药，靶向治疗剂，或靶向治疗剂的组合可分开或一起给予；并且一般将在相同的一般时间框架内给予，例如互相在一周内，在3-4天内，在1天内或同时给予。

[0103] 试剂可在给药之前与非毒性的药物可接受的运载体物质混合。通常，这将会是水溶液，如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液、乳酸盐-林格氏溶液、或对于通过所选方式给药而言任何等渗的生理上可接受的溶液。优选地，该溶液无菌且无热源，并且在由FDA批准的现行良好生产过程规范下生产并包装。本领域普通临床医师熟悉配制用于通过直接注射到淋巴结、腹膜内的血管内注射或通过其他途径给予的药物组合物时pH、张力和添加剂或防腐剂的合适范围。除了调节pH或张力的添加剂以外，可用氨基酸和非离子型去污剂、聚山梨酯和聚乙二醇来使试剂针对聚集和聚合稳定化。任选地，其他稳定剂可包括各种生理上可接受的糖和盐。同样，除了氨基酸以外，可加入聚乙烯基吡咯烷酮。经稳定用于储存和向人给予的合适治疗性免疫球蛋白溶液描述于美国专利号5,945,098，其通过引用全文纳入本文。可向治疗性或成像组合物中加入其他试剂，如人血清白蛋白(HSA)以使抗体偶联物稳定化。

[0104] 可使用任意医药上合适的过程，例如，血管内(静脉内、动脉内、微血管内)给予、注射到肿瘤中等来给予本发明的组合物。血管内注射可通过静脉注射或动脉注射。待给予特定患者的治疗性组合物的有效量将取决于多种因素，其中的几种可能在患者间不同。称职的临床医师将能够确定待给予患者的延缓肿瘤细胞生长并促进肿瘤细胞死亡的治疗性组合物的有效量。试剂的剂量将取决于肿瘤治疗、给药途径、治疗剂的性质、肿瘤对治疗剂的敏感性等。使用LD50动物数据，和偶联的细胞毒性或成像部分的其他可得信息，临床医师能根据给药途径确定个体的最大安全剂量。例如，静脉内给予的剂量可能超过口服给予的剂量，考虑到给予治疗性组合物的流体的更大体量。类似地，从身体快速清除的组合物可以更高剂量给予，或重复剂量给予，以保持治疗性浓度。采用普通技术，称职的临床医师将能够在常规临床试验的过程中优化特定治疗性或成像组合物的剂量。

[0105] 一般而言，有效剂量将会是0.001-100毫克抗体/千克对象体重。抗-CD47与第二试剂的比率范围可以是1∶100、1∶50、1∶10、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1。该试剂可通过超过一次给药的一系列给药给予对象。对于治疗性组合物，有时将需要常规周期性给药(例如，每2-3天)，或者可能需要降低毒性。对于将以重复给药方案使用的治疗性组合物，优选不激起HAMA或其他免疫应答的抗体部分。

[0106] 实施例1

[0107] 高亲和性SIRPα变体增强对小细胞肺癌的巨噬细胞破坏。

[0108] CD47允许癌细胞通过经由SIRPα(巨噬细胞上的抑制性受体)的信号转导来侵入免疫系统。我们最近通过对SIRPα的N-末端免疫球蛋白结构域进行工程改造开发了新一代CD47拮抗剂。这些“高亲和性SIRPα变体”具有低至11.1pM对人CD47的亲和性(KD)，其大约相对于野生型SIRPα改善50000倍。当与肿瘤特异性抗体结合时，高亲和性SIRPα变体用作免疫治疗性佐剂以最大化对癌细胞的巨噬细胞破坏。

[0109] 我们现在已经将这些试剂应用于小细胞肺癌(SCLC)，一种具有较差预后的癌症，还不存在针对其的临床批准抗体。我们发现SCLC细胞系和原代样品在它们的表面上表达高水平的CD47。使用人巨噬细胞，我们发现CD47-阻断疗法能够诱导对SCLC细胞的巨噬细胞吞噬。用CD47-阻断抗体治疗携带原代人SCLC肿瘤的小鼠能够抑制肿瘤生长并显著延长存活。为了鉴定可与高亲和性SIRPα变体一起被靶向的新型SCLC抗原，使用综合抗体阵列通过流式细胞术来筛选SCLC样品。

[0110] 我们验证了SCLC细胞表面上的肿瘤特异性抗原，并且鉴定能够在体外引发吞噬作用的针对这些抗原的抗体。当与高亲和性SIRPα单体组合时，这些抗体刺激吞噬作用的能力显著增强。

[0111] 实施例2

[0112] CD47-阻断疗法刺激对小细胞肺癌的巨噬细胞破坏。

[0113] 小细胞肺癌(SCLC)是具有不良预后的高侵袭性肺癌亚型。没有针对该疾病的临床批准抗体、靶向疗法或免疫疗法。我们发现SCLC样品表达高水平的CD47，一种使癌细胞逃避免疫系统的细胞表面分子。具体地，CD47通过经由SIRPα(巨噬细胞上的抑制性受体)的信号转导促进免疫逃逸。我们假设CD47-阻断疗法可应用于SCLC的治疗。我们发现，CD47-阻断疗法能够诱导体外对SCLC样品的巨噬细胞吞噬。CD47-阻断疗法也抑制肿瘤生长并显著延长携带SCLC肿瘤的小鼠的存活。此外，使用综合抗体阵列，我们在SCLC细胞表面上鉴定到几种新且成熟的治疗靶标。针对这些靶标的抗体可引发巨噬细胞吞噬并且在于CD47-阻断疗法组合时被强化。这些发现表明，破坏CD47-SIRPα的疗法可使SCLC患者受益，尤其是在与肿瘤特异性抗体组合时。

[0114] 衍生自肺的神经内分泌细胞的小细胞肺癌(SCLC)是人类最致命的癌症亚型之一。每年，仅在美国就有超过25000名患者确证患有SCLC，并且患者一般在诊断后仅存活6-12个月。5年存活率仍然渺茫，从二十世纪七十年代以来徘徊在5％附近。除了放疗和化疗的组合以外，在过去的30年内没有实施新的治疗方法。尽管有许多临床试验，还没有靶向疗法被批准用于SCLC。SCLC与重度吸烟强关联，并且发展中国家中增加的吸烟率将持续增加SCLC在世界上的普遍性。出于这些原因，针对SCLC患者，需要鉴定新的治疗靶标并生成新的治疗。

[0115] 肿瘤学领域中最有前景的进展之一是免疫疗法，其目标在于刺激患者自身的免疫系统来攻击并消除癌症。随着肿瘤发展，它们需要机制来避免被免疫系统破坏。通过理解这些机制，我们可开发新的策略来诱导免疫系统将癌症识别为外来物。之前的研究已经鉴定CD47，一种细胞表面分子为防止天然免疫系统细胞攻击血液恶性肿瘤和某些类型的实体瘤的“自身标记物”。CD47通过经由SIRPα递送抑制性信号来发挥作用，SIRPα是一种在巨噬细胞和其他骨髓细胞表面上表达的受体。在此意义上，CD47-SIRPα相互作用代表了骨髓特异性免疫检验点。已经生成了多种试剂来破坏通过CD47-SIRPα的信号转导，包括抗-CD47抗体及其受体SIRPα的工程改造变体。最近的研究已经显示，CD47的阻断降低了巨噬细胞对癌细胞吞噬的阈值。我们假设SCLC细胞也表达CD47并且CD47-阻断疗法可用于刺激SCLC细胞的巨噬细胞吞噬并抑制SCLC肿瘤的体内生长。

[0116] 此外，CD47-阻断疗法已经显示增强巨噬细胞对单克隆抗体的响应。单克隆抗体-如针对淋巴瘤的利妥昔单抗或针对Her2+乳腺癌的曲妥珠单抗-具有已证明的对癌症治疗的极大成功。没有单克隆抗体被临床批准用于治疗SCLC，因此，我们的目标在于鉴定可用单克隆抗体靶向的新SCLC表面抗原。虽然用单克隆抗体治疗可产生强抗肿瘤效果，它们通常在以单一试剂使用时无法引发治愈，这突出了改善这些方法功效的需要。因此，我们的目标在于将CD47-阻断疗法与其他抗体组合来实现针对SCLC的最大抗肿瘤应答。

[0117] 作为我们方法中的第一步骤，我们研究了CD47是否在SCLC样品的表面上表达。接着，我们检查CD47-阻断疗法是否能够在体外刺激对SCLC的巨噬细胞吞噬。使用人类癌症的小鼠模型来估计SCLC样品在体内对CD47-阻断疗法的响应。为了鉴定SCLC样品表面上的新治疗靶标，我们使用综合抗体阵列来进行高通量流式细胞术。最后，我们的目标是证明针对鉴定的抗原的抗体可与CD47-阻断疗法组合以进一步增加吞噬作用。该研究的总体目的是验证针对SCLC的CD47-阻断疗法并鉴定可用于靶向SCLC的其他抗体。在这种方式中，我们的目标是鉴定可针对SCLC患者的益处使用的新免疫疗法组合。

[0118] 结果

[0119] CD47在SCLC表面上表达。为了评价CD47-阻断疗法是否可应用于SCLC，我们首先检验SCLC细胞表面上的CD47表达。我们获得了6个SCLC细胞系并使它们经过流式细胞术以评价细胞表面上的CD47表达。所有6个细胞系都显示出高CD47表达(图5A)。我们也评价了从原代SCLC患者样品上获得的SCLC患者衍生的异种抑制物上的CD47表面表达。与细胞系类似，H29患者样品也在其表面上表达高水平的CD47(图5B)。这些发现表明CD47是SCLC上的免疫治疗靶标。

[0120] CD47-阻断抗体诱导人巨噬细胞对SCLC的吞噬作用。为了验证CD47是SCLC上的真正治疗靶标，我们进行使用人巨噬细胞和SCLC样品的体外吞噬试验。在载剂对照或抗-CD47抗体存在下，巨噬细胞与SCLC细胞共培养。我们测试抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4，一种阻断CD47与SIRPa之间的相互作用并且处于针对实体瘤的临床一期试验研究中的人源化的抗-
CD47抗体(ClinicalTrials.gov编号：NCT02216409)。使用高通量流式细胞术来测量吞噬作用，其通过吞噬钙荧光素AM-标记的SCLC细胞的巨噬细胞的百分比来评价(图5C和D)。使用荧光激活的细胞分选来确认含具有吞噬的肿瘤细胞的巨噬细胞的双阳性群(图5E)。4个
SCLC样品经过在吞噬试验中评价。当用CD47-阻断抗体处理时，3个细胞系(NCI-H524、NCI-
1688、和NCI-H82)显示出吞噬作用的显著增加(图5F)。一个细胞系NCI-H196显示出对吞噬作用的抗性，表明其他机制改变了该细胞系对巨噬细胞攻击的易感性。来自患者的异种移植物H29也经过用人巨噬细胞的吞噬试验。用抗-CD47抗体处理该样品也导致吞噬作用的显著增加(图5G)。

[0121] CD47-阻断抗体抑制体内SCLC肿瘤生长。为了评价CD47-阻断试剂在以针对人SCLC的疗法给予时的潜力，我们建立了人SCLC的异种移植模型。我们将NCI-H82细胞移入NSG小鼠的左下胁部，该小鼠缺少功能性T细胞、B细胞和NK细胞，但是保留功能性巨噬细胞。移入后大约一周，将小鼠随机分成每隔一天用载剂对照或250μg抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4处理。使用肿瘤体积测量来评价小鼠对疗法的响应。在处理后2周，观察到中值肿瘤体积的显著差异，这种差异在其余的实验中保持(图6A)。在处理后大约一个月，载剂对照组的中值肿瘤体积为837.8mm3，对于用抗-CD47抗体处理的组的160.2mm3(P＝0.0281)。因此，CD47-阻断抗体能够产生对肿瘤生长的显著抑制。

[0122] 我们产生了GFP-荧光素酶+NCI-H82细胞系来监测体内生长和扩散。作为人SCLC的原位模型，我们将GFP-荧光素酶+NCI-H82移入左胸廓空间中。注射后4天，通过生物免疫荧光成像来确认移入。然后，我们将小鼠随机分成每隔一天用载剂对照或250μg抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4处理的2组。我们通过生物发光成像监测肿瘤随时间的生长。同样，CD47-阻断抗体产生对肿瘤生长的显著抑制。另外，我们观察到在用CD47-阻断抗体处理的组中存活的明显益处。死后分析显示在胸腔内或胸廓区中形成肿瘤。载剂对照组中的小鼠也显示明显转移至肝脏，这在用抗-CD47抗体处理的组中没有观察到。

[0123] 由于细胞系一般代表细胞的克隆群，我们接着测试了CD47-阻断抗体对来自患者的异种移植物的体内功效，其更接近地模拟了患者中的治疗，因为其保持了肿瘤内癌细胞群的异质性。原代SCLC样品H29经转导表达GFP-荧光素酶以能够对体内肿瘤生长进行动态测量。然后肿瘤移入小鼠的左下胁部并且建立约2周。然后，将小鼠随机分成每隔一天给予载剂对照或250μg抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4处理的2个处理组。我们发现抗-CD47抗体显著抑制肿瘤生长，如通过肿瘤体积测量和生物发光成像所评估(图6B-D)。用CD47-阻断疗法治疗也在存活上产生明显益处。在移入后第125天，对照组中的所有小鼠已经死亡，而抗-CD47抗体组中大多数小鼠仅有小的肿瘤，这些肿瘤甚至在移入后225天后无法发展(图6E)。这些模型证明CD47-阻断疗法对于SCLC患者可以是有效的。

[0124] 血清MCP-3是对CD47-阻断疗法响应的生物标记物。为了鉴定对CD47-阻断疗法响应的潜在生物标记物，我们再次用NCI-H82细胞移入小鼠。我们让肿瘤生长至大约1.5cm的直径，然后我们用单剂的载剂对照或抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4来处理小鼠。我们在将要处理前和处理后24小时收集血清样品。我们使血清样品经过38种细胞因子的多重分析。从该分析中，我们发现在用抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4处理后巨噬细胞趋化蛋白3(MCP-3)全身增加(图7A)。在没有肿瘤的小鼠中没有观察到MCP-3的明显增加，该小鼠用抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4处理(图7A)。我们也使用患者来源的异种移植物H29进行类似实验。同样，携带肿瘤的小鼠经单剂的抗-CD47抗体克隆Hu5F9-G4。血清细胞因子分析再次显示，MCP-3在用CD47-阻断抗体处理后显著增加(图7B)。因此，MCP-3可用作患者中对CD47-阻断疗法响应的生物标记物。MCP-3的分泌可能是阳性反馈机制，其将更多的巨噬细胞招募至肿瘤并且可部分解释体内CD47-阻断疗法的强大效果。

[0125] 综合抗体阵列鉴定SCLC上的治疗靶标。单克隆抗体已经证明是癌症的最有效治疗中的一些。然而，在SCLC上几乎没有已知的抗体靶标。出于该原因，我们的目标在于使用综合抗体阵列来表征SCLC细胞的表面抗原概况。我们使4个SCLC细胞系和原代SCLC样品H29经过使用BioLegend LEGENDScreen阵列的分析，该阵列是针对人细胞表面抗原的332种抗体的综合集合。***对柱形图进行讨论以鉴定阴性、低和高抗原(图8A)。我们鉴定了在SCLC样品的表面上高表达的39种抗原，使得它们称为治疗性抗体的可能靶标。在我们根据它们的中值染色强度对这些抗原进行排名时，我们发现CD47是最强染色表面抗原(图8B)。另一种在所有样品之间都高表达的抗原是CD56(NCAM)，这是一种神经内分泌肿瘤的已知标记物和对SCLC评价的现有治疗性靶标，因此验证了我们的方法。也鉴定了多种其他高表达的表面抗原，其可潜在地被单克隆抗体疗法所靶向，包括CD24、CD29和CD99(图8B)。有趣的是，其他免疫检验点配体如CD80、CD86、PD-L1、或PD-L2并不在SCLC样品的表面上明显表达。

[0126] 将抗体与CD47-阻断组合强化了SCLC的吞噬作用。为了评价通过LEGENDScreen阵列鉴定的抗原的治疗潜力，我们接着评价了它们在体外被抗体靶向并诱导吞噬作用的能
力。我们获得了针对多种高度表达的表面抗原的抗体，包括CD56(克隆HCD56和MEM-188)、CD24、CD29、和CD99。另外，我们获得了罗瓦妥珠单抗(lorvotuzumab)的序列，一种正在临床试验中评价的抗体-药物偶联物的抗-CD56抗体，并且我们重组产生其裸抗体。我们测试了单独这些抗体及其与高亲和性CD47拮抗剂CV1的组合，该拮抗剂阻断CD47并不导致额外的Fc刺激(图9A和B)。我们测试了这些抗体诱导针对2种不同SCLC细胞系，NCI-H82(图9A)和NCI-H524(图9B)的人巨噬细胞吞噬。在测试的三种抗-CD56抗体中，我们发现罗瓦妥珠单抗能够产生吞噬作用的最大增加，并且通过与CV1组合显著强化了该效果。针对CD24或CD99的抗体也能够诱导与用抗-CD47克隆Hu5F9-G4处理相当或超过其的吞噬作用。正如预期的那样，Hu5F9-G4的吞噬作用在于CV1组合时被完全阻断，因为CV1竞争相同的结合表面并且以极高的亲和性结合。有趣的是，抗-CD29抗体甚至在于CV1组合中不能诱导吞噬作用，这一重要证明表明其他因素，如表面结合几何形状或紧密结合Fc受体的能力可能改变巨噬细胞对治疗性抗体的响应。

[0127] 由于罗瓦妥珠单抗正处于针对SCLC的治疗剂的评价中，我们在不同的浓度范围上研究了其诱导吞噬作用的能力。单独用罗瓦妥珠单抗处理产生了针对诱导巨噬细胞吞噬作用的剂量响应关系。重要的是，我们发现在测试的各罗瓦妥珠单抗浓度上，加入CV1产生了更大程度的吞噬作用(图9C)。这些发现证明CV1可能增加了罗瓦妥珠单抗的最大功效和效力，如之前CV1与利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗组合时所观察到的那样。

[0128] 由于其预后差和缺少有效治疗选项，迫切需要鉴定针对SCLC的新治疗。出现了作为最有前景的新癌症疗法中的一些的免疫疗法，并且在此我们显示CD47，骨髓特异性免疫检验点，是SCLC的真正免疫治疗靶标。CD47在所有测试的SCLC样品的表面上高度表达，并且我们发现阻断CD47使得能够在体外实现SCLC样品的巨噬细胞吞噬。使用多重异种移植模型，CD47-阻断抗体Hu5F9-G4能够抑制肿瘤生长并且延长携带SCLC肿瘤的小鼠的存活。重要的是，我们观察到SCLC的来自患者的异种移植模型中的抗肿瘤效力，该模型保持了肿瘤引发细胞群的复杂性并且因此用作人治疗的更精确模型。另外，我们鉴定MCP-3为血清标记物，其与针对CD47-阻断疗法的响应相关联。由于抗-CD47抗体Hu5F9-G4在人实体恶性肿瘤的一期临床试验研究下(ClinicalTrials.gov编号：NCT02216409)，我们的发现提供了在SCLC患者亚组中对抗-CD47抗体进行进一步评价的科学判断。

[0129] 此外，使用综合抗体阵列，我们鉴定了可用单克隆抗体疗法靶向的SCLC样品表面上的多种抗原。使用高亲和性SIRPα变体CV1(下一代CD47拮抗剂)，我们发现CD47-阻断加强了针对SCLC的抗肿瘤抗体的功效，如针对其他癌症已经证明的那样。高亲和性SIRPα变体与独立肿瘤结合抗体的组合提供了靶向SCLC中CD47的最优策略。SCLC表面上CD47的阻断并不足以诱导巨噬细胞吞噬，但是相反，其在SCLC-结合抗体存在时加强巨噬细胞吞噬。针对CD56、CD24和CD99的抗体被证明在诱导SCLC吞噬作用中有效，尤其是在与CV1组合时。

[0130] 另外，我们发现CD47-阻断能够强化罗瓦妥珠单抗的功效，其是一种作为与细胞毒性剂美登木素(mertansine)的抗体药物偶联物(ADC)进行针对SCLC的临床试验的抗体。将治疗性抗体与CD47-阻断疗法组合代表了增强治疗性抗体的功效的替代性方法。CV1对于ADC的一个益处在于，其可与任意抗体组合而不需要另外工程改造。ADC通常依赖于内化来递送它们的细胞毒性荷载，并且这种依赖性可能限制功效并增加副作用。由于CD47阻断刺激了巨噬细胞对要去除细胞的鉴定，除了ADC所实现的以外，可能存在由细胞-细胞相互作用赋予的另一层特异性。无论如何，如果保留了紧密结合Fc受体的能力，罗瓦妥珠单抗-美登木素可能从与CV1组合中受益。

[0131] 我们鉴定新SCLC表面抗原的方法可应用于其他类型的癌症，并且在未来可用于组装抗体的寡克隆混合物，该混合物可用于刺激针对外来病原体或细胞的天然体液免疫应答。这些混合物可与CD47-阻断疗法和其他免疫疗法组合以增加针对SCLC细胞的有效免疫应答。这些研究显示，SCLC可响应CD47-阻断疗法。

[0132] 材料和方法

[0133] 细胞系与培养：NCI-H82、NCI-524、NCI-H69、和NCI-1688获自ATCC。细胞在补充了10％牛血清白蛋白(海克隆公司(Hyclone))、1x Glutamax(英杰公司(Invitrogen))、和
100U/mL青霉素和100ug/mL 链霉素(英杰公司)的RPMI-1640中培养。细胞系悬浮生长(NCI-H82，NCI-524，NCI-H69)并且通过温和吹打或与1x TrypLE(英杰公司)简单孵育来分离。
NCI-1688以粘附单层生长和/或通过与1x TrypLE简单孵育来去除。细胞系在含5％二氧化碳的潮湿孵育器中培养。

[0134] 人巨噬细胞分化：从位于斯坦福血液中心的匿名血液供体中获得白细胞还原系统室。按照生产商的说明，使用CD14+微珠或CD14+全血微珠(美天旎公司(Miltenyi))在AutoMACS(美天旎公司)上纯化单核细胞。经纯化的CD14+单核细胞以每盘1000万单核细胞的密度接种在15cm组织培养盘上。单核细胞通过在补充10％人AB血清(英杰公司
(Invitrogen))、1x GlutaMax(英杰公司)、以及100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的IMDM中培养大约7-10天来分化成单核细胞。

[0135] 体外吞噬试验：如前所述进行体外吞噬试验。简言之，SCLC癌细胞从平板去除并用无血清IMDM洗涤。使用GFP-荧光素酶+细胞或用钙荧光素AM(英杰公司)标记的细胞作为靶细胞。巨噬细胞用HBSS洗涤2次，然后在37℃下潮湿孵育器中用1x TrypLE孵育大约20分钟。使用细胞过滤器(康宁公司(Corning))从平板去除巨噬细胞，然后用无血清IMDM洗涤2次。
使用50000个巨噬细胞和100000个肿瘤细胞进行吞噬反应。在抗体疗法存在下，细胞在37℃下共孵育2小时。共孵育后，用autoMACS运行缓冲液(美天旎公司)洗涤细胞并制备用于通过流式细胞术分析。在100μg/mL小鼠IgG(Lampire公司)存在下，使用荧光团-偶联的针对CD54的抗体(白乐津公司)对巨噬细胞进行染色。通过用DAPI(西格玛公司(Sigma))染色从分析中排除死亡细胞。通过使用配备高通量取样器的LSRFortessa(BD生物科学公司(BD
Biosciences))的流式细胞术来分析样品。吞噬作用使用FlowJo v9.4.10(树星公司(Tree Star))评价为钙黄绿素-AM+巨噬细胞的百分比并且标准化至所示的各独立供体的最大响
应。确定统计学显著性并且数据使用Prism 5(Graphpad公司)拟合至S形剂量反应曲线。

[0136] 吞噬中使用的其他试剂包括高亲和性SIRPα变体CV1单体，其如之前所述产生并且以1μM的浓度使用用于阻断。针对鉴定的SCLC抗原的抗体以10μg/mL的浓度用于吞噬试验中，包括抗-CD56(NCAM)克隆HCD56(白乐津公司)、抗-CD56(NCAM)克隆MEM-188(白乐津公司)、抗-CD24克隆ML5(白乐津公司)、抗-CD29克隆TS2/16(白乐津公司)、抗-CD99克隆12E7(阿柏堪穆公司(Abcam))。另外，使用KEGG数据库(药物：D09927)中可得的重链和轻链可变区序列来重组制备lorvotuzumab。将罗瓦妥珠单抗可变区克隆到pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE2-CLIg-hK(英杰公司)用于表达。通过使用293fectin(英杰公司)瞬时转染293F细胞(英杰公司)，之后在HiTrap蛋白A珠(GE医疗公司)上纯化来重组产生罗瓦妥珠单抗。经纯化的抗体用100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱并且用1/10体积的Tris缓冲液(pH 8.0)中
和。使用PD-10柱(GE医疗公司)对抗体进行脱盐。

[0137] 在吞噬后分选巨噬细胞群：250万人巨噬细胞与500万GFP+NCI-H82细胞和10μg/mL抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)在无血清培养基中混合并孵育2小时。通过用抗-CD45染色来鉴定巨噬细胞，并且巨噬细胞群在FACSAria II细胞分选器(BD生物科学公司)上分选。来自经分选群的细胞离心到显微镜载片上，然后根据生产商的说明用改良瑞氏-吉姆萨染色(西格玛-奥德里奇公司)染色并在DM5500B立光显微镜(莱卡公司(Leica))上成像。

[0138] 小鼠：所有体内实验使用Nod.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1wj1/SzJ(NSG)小鼠。在约6-10周龄时将肿瘤移入小鼠，并且用年龄和性别匹配的组来进行实验。在斯坦福兽医服务中心的护理下，小鼠保持在屏障设施中并且根据由斯坦福大学实验动物监管组批转的方案操作。

[0139] 体内SCLC处理模型：1.25×106NCI-H82个细胞皮下移入NSG小鼠的肋部。肿瘤生长8天，然后将小鼠随机分成用PBS或250μg抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)的处理组。每隔一天通过腹膜内注射给予处理。通过肿瘤尺寸测量来监测肿瘤生长，该测量用于根据椭圆公式
2 6
(π/6×长度×宽度)来计算肿瘤体积。对于患者来源的SCLC异种移植模型，3×10GFP-荧光
素酶+H29细胞与25％Matrigel(BD生物科学公司)皮下移入NSG小鼠的肋部。肿瘤生长15天，然后将小鼠随机分成用PBS或250μg抗-CD47抗体(克隆Hu5F9-G4)的处理组。每隔一天通过腹膜内注射给予处理。通过上述的生物发光成像和肿瘤体积测量来监测肿瘤生长。通过曼-惠特尼检验来确定肿瘤生长的统计学显著性。通过MC检验来分析存活。用H82细胞和H29细胞的试验性体内实验用较小组的小鼠进行，得到类似结果。

[0140] 来自肿瘤结节的GFP-荧光在安装了DFC 500相机(莱卡公司)的M205FA荧光解剖显微镜(莱卡公司)上可视化。

[0141] 生物发光成像：如前所述，对携带GFP-荧光素酶+肿瘤的小鼠进行成像。简言之，用200μL以16.67mg/mL在无菌PBS中重建的D-荧光素(萤火虫)钾盐(Biosynth公司)注射麻醉的小鼠。使用IVIS光谱(卡钳生命科学公司(Caliper Life Sciences))在20分钟内进行生物发光成像以记录最大发光。使用Living Image 4.0(卡钳生命科学公司(Caliper Life Sciences))评价来自感兴趣解剖区的峰值总通量值并用于分析。

[0142] 综合FACS-基抗体筛选：按照生产商的方案和以下修改，使用LEGENDScreen人细胞筛选试剂盒(白乐津公司)对SCLC样品表面上的抗原进行分析。简言之，冻干的抗体在分子生物级的水中重建并以1∶8稀释加至细胞样品。每个SCLC样品使用大约总共20-40×106个细胞进行分析。用钙荧光素-AM标记NCI-H82并且同时用NCI-H524分析。用钙荧光素-AM标记NCI-H69并且同时用NCI-H1688分析。独立分析原代患者样品H69。其从低传代的异种移植物中新鲜剥离并且通过用太平洋蓝抗-小鼠H-2kd(白乐津公司)染色来从分析中排除小鼠种系细胞。在冰上样品与抗体避光孵育30分钟。对于所有样品，通过用DAPI染色从分析中排除死亡细胞。

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小细胞肺癌的靶向疗法

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