用于治疗成胶质细胞瘤的组合疗法
阅读：558发布：2020-05-14
专利汇可以提供用于治疗成胶质细胞瘤的组合疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 关注 治疗 诊断有成胶质细胞瘤的患者的方法，其包括对所述患者施用包含有效量的抗VEGF 抗体 和化疗剂的疗法。，下面是用于治疗成胶质细胞瘤的组合疗法专利的具体信息内容。
1.一种治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的方法，其包括对所述患者施用包含有效量的抗VEGF抗体，有效量的化疗剂，和有效量的放疗的疗法，其中与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，所述治疗延长所述患者的中值总体存活时间。
2.权利要求1的方法，其中所述患者具有≤2的WHO性能状态。
3.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为替莫唑胺(temozolomide)(TMZ)。
4.权利要求3的方法，其中TMZ以150mg/m2施用。
5.权利要求3的方法，其中TMZ以200mg/m2施用。
6.权利要求1的方法，其中放疗以2Gy施用。
7.权利要求1的方法，其中所述抗VEGF抗体结合A4.6.1表位。
8.权利要求1的方法，其中所述抗VEGF抗体为贝伐珠单抗(bevacizumab)。
9.权利要求1的方法，其中所述抗VEGF抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述VL具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
10.权利要求1的方法，其中所述抗VEGF抗体的所述有效量为每两周静脉内10mg/kg。
11.权利要求1的方法，其中所述抗VEGF抗体的所述有效量为每三周静脉内15mg/kg。
12.权利要求1的方法，其中所述有效量的所述抗VEGF抗体最初在90分钟里静脉内施用，后续输注在60分钟里，然后在30分钟里。
13.权利要求1的方法，其中所述抗VEGF抗体在第一个周期第一个施用于所述患者。
14.权利要求10的方法，其中所述抗VEGF抗体的后续施用或是在所述化疗剂之前或是在所述化疗剂之后。
15.权利要求1的方法，其中所述成胶质细胞瘤是前神经(proneural)亚型的。
16.权利要求1的方法，其中所述成胶质细胞瘤是新诊断的成胶质细胞瘤。
17.权利要求1的方法，其中所述抗VEGF抗体与所述化疗剂并行施用。
18.权利要求1的方法，其中与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，所述中值总体存活时间延长约4.9个月，危害比(HR)等于0.42。
19.权利要求1的方法，其中与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，所述中值总体存活时间延长约4.9个月，危害比(HR)为约0.24至约0.72。
20.权利要求18或19的方法，其中所述患者小于65岁。
21.权利要求18或19的方法，其中所述患者等于或大于65岁。
22.有效量的抗VEGF抗体，化疗剂，和放疗在制备药物中的用途，该药物用于与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比延长诊断有成胶质细胞瘤的患者的中值总体存活时间。
23.一种组合物，其包含有效量的抗VEGF抗体，化疗剂，和放疗，供与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比延长诊断有成胶质细胞瘤的患者的中值总体存活时间的方法中使用。
24.一种试剂盒，其包含本质上结合表位A4.6.1的抗VEGF抗体，化疗剂，和印有治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的说明书的包装插页或标签，包括对所述患者施用有效量的抗VEGF抗体和化疗剂，其中所述患者接受过两种或少数在先抗癌方案，其中与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，所述治疗延长所述患者的中值总体存活时间。
25.权利要求24的试剂盒，其中所述抗VEGF抗体为贝伐珠单抗。
26.权利要求24的试剂盒，其中所述成胶质细胞瘤是前神经亚型的。
27.权利要求24的试剂盒，其中所述成胶质细胞瘤是新诊断的成胶质细胞瘤。
用于治疗成胶质细胞瘤的组合疗法
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 胶质瘤占所有恶性脑和CNS肿瘤的81％。特别地，成胶质细胞瘤(多形性成胶质细胞瘤(GBM)；世界卫生组织(WHO)IV级星形细胞瘤)占恶性胶质瘤的60％至70％，而且仍然是胶质瘤中最具攻击性的亚型。它大多在成人中发生(诊断时的中值年龄：64岁)，而且它在美国的发病率估算是3.05/100,000。鉴于1年和5年总体存活分别为29％和3％，成胶质细胞瘤的预后仍然是特别差的(美国中枢脑肿瘤登记(2005)(CBTRUS；http://www.cbtrus.org))。
[0004] 虽然成胶质细胞瘤的治疗取得了一些进展，但是这种疾病呈现高度未满足的医疗需求，只有有限的治疗选项。特别地，贝伐珠单抗 (一种靶向促血管发生性血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体)具有显著的治疗潜力。
[0005] 发明概述
[0007] 在一个方面，本发明提供治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的方法，其包括对该患者施用包括有效量的抗VEGF抗体，有效量的化疗剂，和有效量的放疗的疗法，其中与在没有抗VEGF抗体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，该治疗延长患者的中值总体存活(OS)时间。
[0008] 在另一个方面，本发明特征在于有效量的抗VEGF抗体，化疗剂，和放疗在制备药物中的用途，该药物用于与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比延长诊断有成胶质细胞瘤的患者的中值总体存活时间。
[0009] 在另一个方面，本发明特征在于一种组合物，其包含有效量的抗VEGF抗体，化疗剂，和放疗，供与在没有抗VEGF抗体的情况下接受所述化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比延长诊断有成胶质细胞瘤的患者的中值总体存活时间的方法中使用。
[0010] 在任一上述方面的一些实施方案中，患者可以具有≤2的WHO性能状态。在一些实施方案中，化疗剂可以是替莫唑胺(temozolomide)(TMZ)。在一些实施方案中，TMZ的有效量可以是150mg/m2，任选口服施用。在一些实施方案中，TMZ的有效量可以是200mg/m2，任选口服施用。在一些实施方案中，放疗可以以2Gy施用。在一些实施方案中，抗VEGF抗体可以结合A4.6.1表位。在一些实施方案中，抗VEGF抗体可以是贝伐珠单抗(bevacizumab)。在一些实施方案中，抗VEGF抗体可以包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中VH可以具有氨基酸序列
[0011] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADF
[0012] KRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS
[0013] (SEQ ID NO：2)且VL可以具有氨基酸序列
[0014] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHS
[0015] GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR
[0016] (SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，抗VEGF抗体的有效量可以是约10mg/kg(例如10mg/kg)，任选每两周静脉内施用，而且可以是例如最初在90分钟里静脉内施用，后续输注在60分钟里，然后在30分钟里。在一些实施方案中，抗VEGF抗体的有效量可以是约15mg/kg(例如15mg/kg)，任选每两周静脉内施用，而且可以是例如最初在90分钟里静脉内施用，后续输注在60分钟里，然后在30分钟里。在一些实施方案中，可以在第一个周期第一个对患者施用抗VEGF抗体，而且任选地，抗VEGF抗体的任何后续施用可以在化疗剂之前或之后。在另一个实施方案中，可以与化疗剂和任选的放疗并行施用抗VEGF抗体。在一些实施方案中，可以中止对患者施用类固醇。在一些实施方案中，成胶质细胞瘤是前神经(proneural)亚型的。在一些实施方案中，成胶质细胞瘤是新诊断的成胶质细胞瘤。
[0017] 在上文所述方法，用途，和组合物中，与在没有抗VEGF抗体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，中值OS时间可以延长约4.9个月，危害比(HR)等于约0.42。在另一个实施方案中，与在没有抗VEGF抗体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，中值OS时间可以延长约4.9个月，HR为约0.24至约0.72。在另一个实施方案中，与在没有抗VEGF抗体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，中值OS时间可以延长至少5个月或更多，HR为约0.24至约0.72。在上文所述方法的一些实施方案中，患者可以小于65岁。在上文所述方法的其它实施方案中，患者可以等于或大于65岁。
[0018] 在另一个方面，本发明提供试剂盒，其包括本质上结合表位A4.6.1的抗VEGF抗体，化疗剂，和印有治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的说明书的包装插页或标签，包括对患者施用有效量的抗VEGF抗体和化疗剂，其中与在没有抗VEGF抗体的情况下接受化疗剂的成胶质细胞瘤患者相比，治疗延长患者的中值OS时间。在这个方面的一些实施方案中，患者可以已经接受过两种或少数在先抗癌方案。在这个方面的一些实施方案中，抗VEGF抗体可以是贝伐珠单抗。在这个方面的一些实施方案中，成胶质细胞瘤是前神经亚型的。在这个方面的一些实施方案中，成胶质细胞瘤是新诊断的成胶质细胞瘤。
[0020] 图1是一幅图，显示实施例1中更为详细公开的两分支III期研究设计治疗顺序。研究治疗始于成胶质细胞瘤削体手术或活检之后4至7周且包括3个不同阶段：并行阶段，期间与替莫唑胺(TMZ)和放疗组合每两周施用10mg/kg贝伐珠单抗或安慰剂，继以28天治疗休息；维持阶段，期间与TMZ组合每两周施用10mg/kg贝伐珠单抗或安慰剂；和单一疗法阶段，期间每三周施用15mg/kg贝伐珠单抗或安慰剂直至疾病进展。
[0021] 图2A是一幅图，显示具有前神经(PN)型成胶质细胞瘤的评估患者的无进展存活(PFS)的Kaplan Meier曲线，所述患者来自图1中概述的III期AvaGlio试验中的安慰剂和贝伐珠单抗治疗分支。n＝99。
[0022] 图2B是一幅图，显示具有前神经(PN)型成胶质细胞瘤的评估患者的总体存活(OS)的Kaplan Meier曲线，所述患者来自图1中概述的III期AvaGlio试验中的安慰剂和贝伐珠单抗治疗分支。n＝99。
[0023] 图3是一幅图，显示来自III期AvaGlio试验的治疗分支的具有PN(n＝95)和非PN(n＝235)型成胶质细胞瘤的患者的OS，通过多变量分析为已知的临床预后因子进行了调整。对于具有IDH1野生型PN成胶质细胞瘤的患者，将贝伐珠单抗添加至RT和化疗治疗在延长OS方面赋予统计学显著的受益(HR：0.42，95％CI：0.24-0.72，p＝0.002；PN亚型和贝伐珠单抗治疗之间的相互作用：p＝0.012)。n＝10位IDH1突变阳性患者和n＝9位协变量信息缺失患者排除在多变量Cox比例风险分析之外。图3是基于图4A和4B中所示相同多变量分析的汇总。
[0024] 图4A是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有Phillips分类的PN亚型成胶质细胞瘤的患者的显著OS受益。*p<0.5，**p<0.05。
[0025] 图4B是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有Phillips分类的非PN亚型成胶质细胞瘤的患者没有显示显著OS受益。*p<0.5，**p<0.05。
[0026] 图5A是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有TCGA分类的PN亚型成胶质细胞瘤的患者的显著OS受益。*p<0.5，**p<0.05。
[0027] 图5B是一幅图，显示在考虑已知的预后协变量时，贝伐珠单抗治疗的具有TCGA分类的非PN亚型成胶质细胞瘤的患者没有显示显著OS受益。*p<0.5，**p<0.05。
[0028] 发明详述
[0029] I.定义
[0030] 术语“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或是直接或是间接抑制血管发生(angiogenesis)，血管生成(vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物质，多核苷酸，多肽，分离的蛋白质，重组蛋白，抗体，或其缀合物或融合蛋白。应当理解，抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生性因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如，抗血管发生剂是说明书全文定义的或本领域已知的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如但不限于VEGF-A的抗体，VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体，VEGF陷阱，抗PDGFR抑制剂诸如GleevecTM(Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)，内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D'Amore,Annu.Rev.Physiol.,53:217-39(1991)；Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中的抗血管发生疗法的表3)；Ferrara&Alitalo,Nature
Medicine 5:1359-1364(1999)；Tonini et al.,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如列举已知的抗血管发生性因子的表2)；及Sato.Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
Medicine 5:1359-1364(1999)；Tonini et al.,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如列举已知的抗血管发生性因子的表2)；及Sato.Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
[0032] 术语“VEGF”或“VEGF-A”用于指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个，145个，189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如例如Leung et al.,Science,246:1306(1989)；及Houck et al.,Mol.Endocrin.,5:1806(1991)所述，及其天然存在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和PlGF在内的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外，神经毡蛋白-1已经被鉴定为肝素结合VEGF-A同种型(isoform)的受体，而且可在血管发育中发挥作用。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种诸如小鼠，大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF。通常，VEGF指人VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8-109或1-109的多肽的截短形式或片段。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”，“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF的提述。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。
[0033] “抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。所选择的抗体通常会具有对VEGF的结合亲和力，例如，该抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，本发明的抗VEGF抗体可用作治疗剂，用于靶向和干扰其中涉及VEGF活性的疾病或疾患。还有，可对该抗体进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力所进行的生物学活性测定法。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。例子包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO 89/06692中所记载的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利No.5,500,362)；及激动活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF，PDGF或bFGF。
[0034] 抗VEGF抗体“贝伐珠单抗”(Bevacizumab；BV或Bev)是依照Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，也称作“rhuMAb VEGF”或它包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。贝伐珠单抗大约93％的氨基酸序列(包括大部分框架区)衍生自人IgG1，而约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐珠单抗具有约
149,000道尔顿的分子量且是糖基化的。其它抗VEGF抗体包括美国专利No.6,884,879和WO
2005/044853中记载的抗体。
149,000道尔顿的分子量且是糖基化的。其它抗VEGF抗体包括美国专利No.6,884,879和WO
2005/044853中记载的抗体。
[0035] “表位A4.6.1”指受抗VEGF抗体贝伐珠单抗 (参见Muller et al.,Structure 6:1153-1167,1998)识别的表位。在本发明的某些实施方案中，抗VEGF抗体包括但不限于与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；依照Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599,1997生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。
[0036] 依照本发明的“功能性表位”指抗原中有力地促进抗体结合的氨基酸残基。抗原中贡献巨大的残基中任一个的突变(例如，丙氨酸对野生型VEGF的突变或同系物突变)会破坏抗体的结合，使得抗体的相对亲和力比(IC50突变型VEGF/IC50野生型VEGF)会大于5(参见WO2005/012359的实施例2)。在一个实施方案中，相对亲和力比是通过溶液结合噬菌体展示ELISA测定的。简言之，将96孔Maxisorp免疫板(NUNC)用Fab形式的待测试抗体以PBS中2μg/ml的浓度于4℃包被过夜，并用PBS，0.5％BSA，和0.05％Tween20(PBT)于室温封闭2小时。首先将展示hVEGF丙氨酸点突变体(残基8-109形式)或野生型hVEGF(8-109)的噬菌体在PBT中的连续稀释液在Fab包被的板上于室温温育15分钟，并用PBS，0.05％Tween20(PBST)清洗板。用在PBT中1:5000稀释的抗M13单克隆抗体辣根过氧化物酶(Amersham Pharmacia)缀合物检测所结合的噬菌体，用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Kirkegaard&Perry Labs,Gaithersburg,MD)底物显色大约5分钟，用1.0M H3PO4淬灭，并以分光光度法于450nm读数。IC50值的比(IC50,ala/IC50,wt)代表了结合亲和力的降低倍数(相对结合亲和力)。
[0037] 抗VEGF抗体雷尼珠单抗(Ranibizumab)或 抗体或rhuFab V2是一种人源化的亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。雷尼珠单抗是通过大肠杆菌表达载体中的标准重组技术方法和细菌发酵生成的。雷尼珠单抗不是糖基化的且具有约48,000道尔顿的分子量。参见WO 98/45331及US 2003/0190317。
[0038] “分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的研究，诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在有些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染剂，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。
[0039] “天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫化物连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。
[0040] 抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
[0041] 术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-片层构象，通过三个HVR连接，HVR形成连接β-片层结构的环且在有些情况中形成β-片层结构一部分的。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的毒性中的参与。
[0042] 根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
[0043] 根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价联合而形成的更大融合分子的一部分。
[0044] 术语“全长抗体”，“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非下文定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
[0045] “抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0046] 用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
[0047] “Fv”是包含完整抗原结合位点的最小限度抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密，非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以与双链Fv种类类似的“二聚体”结构联合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
[0048] Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
[0049] “单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthün，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315页。
[0050] 术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger et al.,PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
[0051] 如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型地包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆，噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力，将靶物结合序列人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体制备物的优势还在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
[0052] 修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature,256:495-497(1975)；Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory nd
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2 ed.(1988)；Hammerling et al.,In:
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee et al.,
J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO
1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,PNAS USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,
625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；
Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；
Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature
Biotechnol.14:826(1996)；及Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93
(1995))。
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2 ed.(1988)；Hammerling et al.,In:
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee et al.,
J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO
1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,PNAS USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,
625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；
Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；
Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature
Biotechnol.14:826(1996)；及Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93
(1995))。
[0053] 单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(例如美国专利No.4,816,567；Morrison et al.,PNAS USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括 抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如给猕猴免疫接种感兴趣抗原而生成的抗体。
[0054] 非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性，亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，家兔，或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,
Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,
Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions
23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,
Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions
23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
[0055] “人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；及Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77
(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-374(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性攻击而生成人抗体但其内源基因座已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠
(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,PNAS USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-374(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性攻击而生成人抗体但其内源基因座已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠
(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,PNAS USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
[0056] 术语“高变区”，“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson and Wu,In:Methods in Molecular Biology,248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼(camelid)抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；及Sheriff et al.,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
[0057] 本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk,
J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
[0058]
[0059]
[0060] HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102，94-102或95-102(H3)。对于这些延伸的HVR定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。
[0061] “框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。
[0062] 表述“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat et al.,见上文中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含或多或少的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a，82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
[0063] “亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变，导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。例如，Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变，例如Barbas et al.,Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier et al.,Gene 169:147-155(1995)；Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-3319(1995)；及Hawkins et al.,
J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
[0064] 术语“抗肿瘤组合物”或“抗癌组合物”或“抗癌剂”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，放射疗法中所使用的药剂，抗血管发生剂，凋亡剂，抗微管蛋白剂，和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体，抗CD20抗体，表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)，HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼(TarcevaTM)，血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(Imatinib Mesylate))，COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))，干扰素，细胞因子，能与ErbB2，ErbB3，ErbB4，PDGFR-β，BlyS，APRIL，BCMA，VEGF或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)，TRAIL/Apo2，及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。
[0065] “化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如例如替莫唑胺(TMZ)，即烷化剂达卡巴嗪的咪唑四嗪衍生物。化疗剂的别的例子包括例如帕利他赛或托泊替康或PEG化脂质体多柔比星(PLD)。化疗剂的其它例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和 环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类
(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺
(triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛
(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)；苔藓抑素
(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新
(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素
(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇
(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew,
Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；
以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(anthramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(caminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D
(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸， 多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多
柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星
(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素类
(mitomycins)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic acid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素
(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素
(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司
(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和
5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷
(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特
(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide
glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类
(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙
(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶
(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；
洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；
丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；
雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；
细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素
(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；
环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如
帕利他赛(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，
不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型的帕利他赛
(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和 多西他塞
(docetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤
(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；
长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；
依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达
(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨
(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂
(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib) 降
低细胞增殖的PKC-α，Raf，H-Ras，EGFR(例如厄洛替尼(erlotinib) )和VEGF-A
抑制剂；及任何上述物质的药学可接受盐，酸或衍生物。
(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺
(triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛
(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)；苔藓抑素
(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新
(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素
(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇
(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew,
Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；
以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(anthramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(caminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D
(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸， 多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多
柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星
(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素类
(mitomycins)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic acid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素
(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素
(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司
(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和
5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷
(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特
(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide
glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类
(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙
(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶
(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；
洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；
丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；
雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；
细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素
(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；
环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如
帕利他赛(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，
不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型的帕利他赛
(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和 多西他塞
(docetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤
(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；
长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；
依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达
(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨
(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂
(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib) 降
低细胞增殖的PKC-α，Raf，H-Ras，EGFR(例如厄洛替尼(erlotinib) )和VEGF-A
抑制剂；及任何上述物质的药学可接受盐，酸或衍生物。
[0066] 如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamycin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤剂引起肿瘤细胞的破坏。
[0067] “生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(例如表达Robo4的细胞)生长和/或增殖的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达Robo4的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))，紫杉烷类(taxanes)，和拓扑异构酶II抑制剂诸如蒽环类抗生素多柔比星(doxorubicin)((8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮，即(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-
7,8,9,10-tetra hydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-
naphthacenedione)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷
(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)，泼尼松(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn and Israel编,Chapter 1,题为"Cell cycle regulation,oncogenes,and anti-
neoplastic drugs",Murakami et al.(W.B.Saunders:Philadelphia,1995)，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。
衍生自欧洲紫杉的多西他赛( Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他赛(
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。帕利他赛和多西他赛促进由微管蛋
白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
7,8,9,10-tetra hydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-
naphthacenedione)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷
(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)，泼尼松(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn and Israel编,Chapter 1,题为"Cell cycle regulation,oncogenes,and anti-
neoplastic drugs",Murakami et al.(W.B.Saunders:Philadelphia,1995)，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。
衍生自欧洲紫杉的多西他赛( Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他赛(
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。帕利他赛和多西他赛促进由微管蛋
白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
[0068] 术语“样品”和“生物学样品”可互换使用，指任何自个体获得的生物学样品，包括体液，身体组织(例如肿瘤组织)，细胞，或其它来源。体液是例如淋巴，血清，新鲜全血，外周血单个核细胞，冷冻的全血，血浆(包括新鲜的或冷冻的)，尿液，唾液，精液，滑液和脊髓液。样品还包括乳房组织，肾组织，结肠组织，脑组织，肌肉组织，滑膜组织，皮肤，毛囊，骨髓，和肿瘤组织。用于自哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域公知的。
[0069] 如本文中使用的，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，延长总体存活(OS)，延长无进展存活(PFS)，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及消退或改善预后。
[0070] “单一疗法”意指如下的治疗方案，其在治疗期的过程期间只包括单一治疗剂来治疗癌症或肿瘤。使用VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体，例如贝伐珠单抗)的单一疗法意味着在治疗期期间在没有别的抗癌疗法的情况中施用所述VEGF拮抗剂。
[0071] 术语“有效量”指在受试者或患者(诸如哺乳动物，例如人)中有效治疗疾病或病症(诸如成胶质细胞瘤)的药物量。在癌症(诸如成胶质细胞瘤)的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与癌症(例如成胶质细胞瘤)有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，可以例如通过评估存活持续时间，无进展存活(PFS)持续时间，总体存活(OS)，响应率(RR)，响应持续时间，和/或生活质量来测量体内功效。
[0072] “存活”指患者保持活着，包括无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。存活可通过Kaplan-Meier方法来评估，而且存活的任何差异可使用分层时序检验(stratified log-rank test)来计算。
[0073] “总体存活”或“OS”指患者自治疗启动或自初始诊断起保持限定时间段活着，诸如约1年，约2年，约3年，约4年，约5年，约10年，等。在本发明根本的研究中，用于存活分析的事件是任何原因的死亡。
[0074] “无进展存活”或“PFS”指自治疗(或随机化)至第一次疾病进展或死亡的时间。例如，它指如下的时间，即自治疗启动或自初始诊断起，例如限定的时间段，诸如约1个月，约2个月，约3个月，约4个月，约5个月，约6个月，约7个月，约8个月，约9个月，约1年，约2年，约3年，等，受试者仍然活着且癌症没有复发。在本发明的一个方面，可以通过MacDonald等人描述的MacDonald响应标准(MacDonald et al.,J.Clin.Oncol.8:1277-80,1990)来评估PFS。
[0075] “总体响应率”或“客观响应率”(ORR)指经历癌(例如成胶质细胞瘤)的尺寸或量降低达最小时间量的人的百分百，而且ORR可以由完全和部分响应率的和来代表。
[0076] “延长存活”或“提高存活可能性”意味着使接受治疗的受试者(例如用抗VEGF抗体，例如贝伐珠单抗治疗的受试者)或接受治疗的受试者群体的PFS和/或OS分别相对于未接受治疗的受试者(例如未用抗VEGF抗体，例如贝伐珠单抗治疗的受试者)或未接受治疗的受试者群体，或者相对于对照治疗方案(诸如只用化疗剂的治疗，诸如成胶质细胞瘤的标准护理中使用的那些，诸如例如有或无放疗的替莫唑胺(TMZ))有延长。存活在治疗启动之后或在初始诊断之后监测至少约1个月，约2个月，约4个月，约6个月，约9个月，或至少约1年，或至少约2年，或至少约3年，或至少约4年，或至少约5年，或至少约10年，等。
[0077] 危害比(HR)是事件比率的统计定义。为了本发明的目的，危害比定义为代表任何特定时间点时实验分支中的事件概率除以对照分支中的事件概率。无进展存活分析中的“危害比”是两条无进展存活曲线之间的差异的汇总，代表随访期里与对照相比治疗的死亡风险降低。
[0078] 本文中的“患者”或“受试者”指适于接受治疗的任何单一动物(包括例如哺乳动物，诸如犬，猫，马，家兔，动物园动物，牛，猪，绵羊，非人灵长动物，和人)，诸如人，他/它正经受或者已经经受疾病或病症(诸如成胶质细胞瘤(GBM))的一种或多种体征，症状，或其它指标。意图包括作为患者的是参与临床研究试验且未显示疾病的任何临床体征的任何患者，或参与流行病学研究的患者，或曾经用作对照的患者。所述患者可以先前用抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)或另一种药物治疗过，或者没有这样治疗过。患者可以是在开始本文中的治疗时未接触所用别的药物的，即该患者在“基线”(即在本文中治疗方法中施用第一剂抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)之前的一个设定点，诸如开始治疗之前筛选受试者的日子)时可以没有用例如除抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)以外的疗法治疗过。此类“未接触(药物)”患者或受试者一般认为是用别的药物进行治疗的候选。
[0079] 术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，和白血病。此类癌症的更具体例子包括但不限于成胶质细胞瘤(GBM)，包括例如前神经GBM，神经GBM，经典GBM，和间充质GBM。GBM可以是新诊断的，诊断的，或复发的。其它癌症包括例如乳腺癌，鳞状细胞癌，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)，胰腺癌，卵巢癌，宫颈癌，肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌(kidney or renal cancer)，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞性NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级小无核裂细胞性NHL，贮积病(bulky disease)NHL，套细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖。
[0080] 如本文中使用的，“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
[0081] 术语“药物配制剂”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。
[0082] “药学可接受载剂”指药物配制剂中除活性组分以外的组分，它对受试者是无毒的。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
[0083] “试剂盒”指包含至少一种试剂(例如用于治疗具有成胶质细胞瘤的患者的药物，或用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白的探针)的任何制品(例如包装或容器)。所述制品优选以用于实施本发明方法的单元来宣传，分发，或销售。
[0084] II.治疗用途和用于治疗成胶质细胞瘤的组合物
[0085] 本发明涵盖抗血管发生疗法，它是一种瞄准抑制提供营养来支持肿瘤生长所需要的肿瘤血管发育的癌症治疗策略。因为血管发生牵涉原发性肿瘤生长和转移二者，所以本发明提供的抗血管发生治疗能够抑制肿瘤在原发性部位的赘生物生长以及阻止肿瘤在继发性部位的转移，由此容许其它治疗剂攻击肿瘤。
[0086] 具体地，本文中提供治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的方法，其包括对患者施用组合有效量的化疗剂和抗VEGF抗体的治疗方案。组合化疗和抗VEGF抗体施用的治疗方案延长受试者的总体存活(OS)和/或无进展存活(PFS)。
[0087] A.治疗方法
[0088] 本发明提供治疗诊断有成胶质细胞瘤的患者的方法，其包括对患者施用包括有效量的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)和有效量的化疗剂(例如替莫唑胺(TMZ))的疗法。受试者还可以进行放射疗法(放疗)。此类治疗可导致接受治疗的患者中与在没有抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的情况下接受相同化疗剂(例如TMZ)的患者相比延长的中值OS时间和/或PFS时间。
[0089] 组合疗法可以包括一种或多种抗VEGF抗体(例如1，2，3，4，或5或更多种抗VEGF抗体)，与一种或多种别的抗癌剂和/或抗癌疗法(例如1，2，3，4，或5或更多种别的抗癌剂和/或抗癌疗法)组合使用。抗癌疗法的例子包括但不限于手术，放射疗法(放疗)，生物疗法，免疫疗法，化疗(例如用化疗剂，TMZ)，或者这些药剂和/或疗法的组合。另外，可以与抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)组合使用细胞毒剂，抗血管发生剂，和抗增殖剂。一种或多种别的抗癌剂或抗癌疗法优选具有与VEGF拮抗剂互补的活性，使得它们彼此没有不利影响。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
[0090] 一种或多种别的抗癌剂可以是化疗剂，细胞毒剂，细胞因子，生长抑制剂，抗激素剂，及其组合。此类分子恰当地以对于预定目的(即治疗具有成胶质细胞瘤的患者)有效的量组合存在。例如，含有抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的药物组合物还可以包含治疗有效量的抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，或其组合。
[0091] 依照本发明的其它治疗方案可以包括施用抗癌剂和(包括但不限于)放射疗法和/或骨髓和外周血移植，和/或细胞毒剂，化疗剂，或生长抑制剂。在一个此类实施方案中，化疗剂是一种药剂或药剂组合，诸如例如环磷酰胺，羟基柔红霉素，阿霉素，多柔吡星，长春新碱(ONCOVINTM)，泼尼松龙，CHOP，CVP，或COP，或免疫治疗剂诸如抗PSCA，抗HER2(例如OMNITARGTM)。在另一个实施方案中，组合包括多西他赛，多柔吡星，和环磷酰胺。组合疗法可以作为同时或顺序方案施用。在顺序施用时，组合可以在两次或更多次施用中施用。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
[0092] 在一个实施方案中，抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的治疗牵涉本文中鉴定的抗癌剂，和一种或多种化疗剂(例如TMZ)或生长抑制剂的组合施用，包括不同化疗剂的混合物的共施用。化疗剂包括紫杉烷(诸如帕利他赛和多西他赛)和/或蒽环类抗生素。可以依照制造商的说明书或由熟练从业人员凭经验确定来使用此类化疗剂的制备和剂量给药日程表。此类化疗的制备和剂量给药日程表还记载于“Chemotherapy Service”(1992)M.C.Perry编,Williams&Wilkins,Baltimore,Md。
[0093] 任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的，而且可以由于抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)和其它化疗剂或治疗的联合作用(协同)而降低。
[0094] 组合疗法可以提供“协同作用”及证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或在组合的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在顺序施用或投递化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般地，在交替疗法期间，顺序即连续施用有效剂量的每种活性组分，而在组合疗法中，一起施用有效剂量的两种或更多种活性组分。
[0095] 一般地，对于疾病的预防或治疗，别的治疗剂的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重程度和进程，施用抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)和别的药剂和/或疗法(例如TMZ和/或放疗)是出于预防还是治疗目的，先前的疗法，患者的临床史和对抗VEGF抗体和别的药剂和/或疗法的响应，及主治医师的斟酌。以一次或在一系列治疗里将抗VEGF抗体和别的药剂和/或疗法恰当地施用于患者。抗VEGF抗体通常如下文所述施用。根据疾病的类型和严重程度，约20mg/m2至600mg/m2别的药剂是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约20mg/m2，85mg/m2，90mg/m2，125mg/m2，200mg/m2，400mg/m2，500mg/m2或更多。对于持续数天或更久的重复施用，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。
如此，可以对患者施用约20mg/m2，85mg/m2，90mg/m2，125mg/m2，200mg/m2，400mg/m2，500mg/m2，600mg/m2(或其任意组合)的一剂或多剂。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每两，三，四，五，或六周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂别的药剂)。可施用一剂较高的初始加载剂量，接着是一剂或多剂较低剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
如此，可以对患者施用约20mg/m2，85mg/m2，90mg/m2，125mg/m2，200mg/m2，400mg/m2，500mg/m2，600mg/m2(或其任意组合)的一剂或多剂。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每两，三，四，五，或六周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂别的药剂)。可施用一剂较高的初始加载剂量，接着是一剂或多剂较低剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
[0096] 在一个实施方案中，受试者先前从未施用任何药物来治疗成胶质细胞瘤。在另一个实施方案中，受试者或患者先前曾经施用一种或多种药物来治疗成胶质细胞瘤。在又一个实施方案中，受试者或患者对先前施用的一种或多种药物没有响应。受试者对其可没有响应的此类药物包括例如单独的或彼此组合的抗肿瘤剂，化疗剂，细胞毒剂，和/或生长抑制剂，但是在与抗VEGF抗体(诸如贝伐珠单抗)的组合治疗缺失下。受试者对其可没有响应的其它疗法包括例如VEGF拮抗剂单一疗法，诸如抗VEGF抗体单一疗法。
[0097] 本发明进一步提供一种宣传方法，包括宣传施用抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)和一种或多种其它治疗剂来在人患者/受试者中治疗成胶质细胞瘤(例如新诊断的成胶质细胞瘤和/或前神经型成胶质细胞瘤)。在一些实施方案中，该方法进一步包括宣传施用至少一种化疗剂。抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的施用可以与化疗剂(例如TMZ)的施用并行或顺序进行。宣传可以通过任何可得手段来进行。在一些实施方案中，宣传通过伴随抗VEGF抗体之商业性配制剂的包装插页来进行。宣传也可以通过伴随化疗剂之商业性配制剂的包装插页来进行。宣传可以通过书面或口头告知内科医师或健康护理提供者来进行。在一些实施方案中，宣传通过包装插页来进行，其中包装插页提供说明书来接受抗VEGF抗体与一种或多种其它化疗剂和/或疗法组合的成胶质细胞瘤疗法。在又一个实施方案中，包装插页包括实施例4下的一些或所有结果。在一些实施方案中，宣传之后是用抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)及化疗剂(例如TMZ)和任选的另一种疗法(例如放疗)治疗受试者。
[0098] 本发明提供一种商业方法，包括销售抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)，与一种或多种其它治疗剂(诸如化疗剂(例如TMZ))和/或疗法(例如放疗)组合，用于在人患者/受试者中治疗成胶质细胞瘤，从而延长受试者的OS和/或PFS时间，降低受试者成胶质细胞瘤复发的可能性，和/或提高受试者存活的可能性。在一些实施方案中，该方法进一步包括销售化疗剂，用于与抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)组合使用。在一些实施方案中，销售之后是用抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)及化疗剂治疗受试者。
[0099] 1.剂量和施用
[0100] 本发明的治疗方法可导致例如与在没有抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的情况下接受化疗剂(例如TMZ)的患者相比接受治疗的患者中肿瘤尺寸(例如成胶质细胞瘤肿瘤尺寸)缩小，中值总体存活(OS)时间，和/或无进展存活(PFS)时间延长。如上所述，抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)和至少一种别的药物/疗法(例如化疗剂，诸如TMZ，和/或放疗)组合的治疗可以对患者导致叠加或协同(大于叠加)的治疗受益。
[0101] 本文中别的药物/疗法(例如化疗剂，诸如TMZ，和/或例如放疗)的至少一次施用和抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的至少一次施用之间的时机是约1个月或更少，约2周或更少，约1周或更少，同一天内，同一小时内，或大致相同(并行施用)。在一些情况中，至少一种抗VEGF抗体可以在至少一种别的药物/疗法之前施用。在一些情况中，至少一种抗VEGF抗体可以在至少一种别的药物/疗法之后施用。在一些情况中，至少一种抗VEGF抗体和/或至少一种药物/疗法在一个或多个周期(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，或更多个周期)里施用于患者。
[0102] 医学领域技术人员会领会，在诊断成胶质细胞瘤后对患者施用治疗有效量的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的确切方式会由主治医师斟酌。例如，成胶质细胞瘤可以是新诊断的或不是新诊断的，而且成胶质细胞瘤可以是复发的成胶质细胞瘤。
[0103] 施用的模式(包括剂量，与其它药剂的组合，施用的时机和频率，等等)可以受到患者对此类抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的可能响应性的诊断以及患者的状况和历史影响。如此，甚至预测对单独的抗VEGF抗体相对不敏感的成胶质细胞瘤患者仍可受益于其治疗，特别是在与可改变患者对抗VEGF抗体的响应性的其它药剂和/或疗法(例如化疗剂，诸如TMZ，和/或例如放疗)的组合中。
[0104] 会以与优良医学实践一致的方式配制，定剂量，和施用包含抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的成胶质细胞瘤的具体类型(例如新诊断的成胶质细胞瘤或复发的成胶质细胞瘤，前神经型的成胶质细胞瘤，间充质型的成胶质细胞瘤，或增殖型的成胶质细胞瘤)，所治疗的具体哺乳动物(例如人)，患者个体的临床状况，成胶质细胞瘤的起因，投递药剂的部位，可能的副作用，具体的抗VEGF抗体，施用的方法，施用的日程安排，和医学从业人员知道的其它因素。要施用的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)的有效量会取决于此类考量。
[0105] 根据诸如具体的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)等因素，具有本领域普通技能的内科医师能容易地确定所需要的药物组合物的有效量及开出这样的处方。例如，内科医师能以多剂如下抗VEGF抗体开始，其在药物组合物中以比实现期望的治疗效果所需水平要低的水平使用，并逐渐提高剂量，直至实现期望的效果。拮抗剂的给定剂量或治疗方案的有效性可以例如通过使用标准功效度量评估患者中的体征和症状来测定。
[0106] 在某些例子中，至少两次用相同的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)治疗患者。如此，初始和第二次抗VEGF抗体暴露用相同的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)，而且，在一些情况中，所有抗VEGF抗体暴露用相同的抗VEGF抗体，即头两次暴露，优选所有暴露的治疗用一种类型的抗VEGF抗体，例如都用贝伐珠单抗。
[0107] 作为一般建议，胃肠外施用的抗VEGF抗体的每剂有效量会在约20mg至约5000mg的范围里，通过一个或多个剂量来实现。用于抗体(诸如抗VEGF抗体，例如贝伐珠单抗)的例示性剂量方案包括每1，2，3，或4周100或400mg，或者每1，2，3，或4周施用约1，3，5，10，15，或20mg/kg的一剂。例如，可以每两周以10mg/kg施用有效量的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)，任选通过静脉内(i.v.)施用。又例如，可以每三周以15mg/kg施用有效量的抗VEGF抗体，任选通过i.v.施用。该剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3剂)施用，诸如输注。
[0108] 在一些情况中，根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至100mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)作为初始候选剂量施用于患者，无论例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注。在一个实施方案中，期望的剂量包括例如6mg/kg，8mg/kg，10mg/kg，和15mg/kg。对于持续数天或更久的重复施用或周期，根据状况，持续治疗直至癌症得到治疗，如通过上文所述或本领域已知方法测量的。然而，其它剂量方案可能也是有用的。在一个例子中，每周，每两周，或每三周一次施用抗VEGF抗体，剂量范围为约6mg/kg至约15mg/kg，包括但不限于6mg/kg，8mg/kg，10mg/kg或15mg/kg。本发明疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。在其它实施方案中，此类剂量给药方案与化疗方案在成胶质细胞瘤中组合使用。下文实施例中提供关于合适剂量的进一步信息。
[0109] 疗法的持续时间会持续像医嘱指示的那样长时间或直到实现期望的治疗效果(例如本文所述那些)。在某些实施方案中，疗法持续1个月，2个月，4个月，6个月，8个月，10个月，1年，2年，3年，4年，5年，或长至受试者终身的时段。
[0110] 如果提供多次抗VEGF抗体暴露，那么每次暴露可以使用相同的或不同的施用手段来提供。在一个实施方案中，每次暴露通过静脉内(i.v.)施用。在另一个实施方案中，每次暴露通过皮下(s.c.)施用给予。在还有另一个实施方案中，所述暴露通过i.v.和s.c.施用二者给予。
[0111] 在一个实施方案中，以缓慢的静脉内输注而非静脉内推注或快速注射来施用抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)。例如，在抗VEGF抗体的任何输注之前约30分钟施用类固醇诸如泼尼松龙或甲泼尼龙(例如静脉内约80-120毫克，更具体地，静脉内约100毫克)。例如，抗VEGF抗体(诸如贝伐珠单抗)可以经由专用线路来输注。例如，抗VEGF抗体(诸如贝伐珠单抗)可以最初在约90分钟里静脉内施用，后续输注在约60分钟里，然后在约30分钟里。
[0112] 对于多剂抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)暴露的初始剂，或者对于暴露只包括一剂的情况中的单剂，此类输注优选以约50毫克/小时的速率开始。这可以例如以每约30分钟增加约50毫克/小时的速率逐步提高至约400毫克/小时的最大值。然而，如果受试者正经历输注相关反应，那么输注速率优选降低至例如当前速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。例如，抗VEGF抗体的此类剂量(例如约1000毫克总剂量)的输注用约255分钟(4小时15分钟)完成。任选地，受试者在开始输注前约30至60分钟通过口接受醋氨酚/对乙酰氨基酚(例如约1克)和盐酸苯海拉明(例如约50毫克或相似药剂的等效剂量)的预防性处理。
[0113] 如果给予超过一次的抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)输注(剂)以实现整个暴露，那么在此实施方案中以比初始输注要高的速率开始第二或后续抗VEGF抗体输注，例如以约100毫克/小时。此速率可以例如以每约30分钟增加约100毫克/小时的速率逐步提高至约
400毫克/小时的最大值。经历输注相关反应的受试者优选将输注速率降低至该速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。优选地，抗VEGF抗体的此类第二或后续剂量(例如约1000毫克总剂量)的输注用约195分钟(3小时15分钟)完成。
400毫克/小时的最大值。经历输注相关反应的受试者优选将输注速率降低至该速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。优选地，抗VEGF抗体的此类第二或后续剂量(例如约1000毫克总剂量)的输注用约195分钟(3小时15分钟)完成。
[0114] 在一个实施方案中，抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)以约0.4至4克的剂量施用，而且更优选的是，该抗体以约0.4至1.3克的剂量，以约1个月的时段内1至4剂的频率施用。仍然更加优选的是，剂量是约500mg至1.2g，而且在其它实施方案中，是约750mg至1.1g。在此类方面，抗VEGF抗体优选以2至3剂施用，和/或在约2至3周的时段内施用。
[0115] 然而，如上所述，对于抗VEGF抗体的这些建议量要加以诸多治疗上的考量。在选择适宜剂量和日程安排中，关键的因素是获得的结果，如上文指示的。在一些实施方案中，尽可能接近成胶质细胞瘤的首次体征，诊断，表现，或出现，施用抗VEGF抗体。
[0116] 2.施用的路径
[0117] 抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)可以通过任何合适手段来施用，包括胃肠外，表面，皮下，腹膜内，肺内，鼻内，和/或损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。还涵盖鞘内施用。另外，可合适地通过脉冲输注来施用抗VEGF抗体，例如用剂量逐渐减少的抗VEGF抗体。最优选地，通过静脉内(i.v.)注射/输注来给予剂量给药。
[0118] 除了通过上文所述传统路径将抗VEGF抗体施用于患者，本发明还包括通过基因疗法进行的施用。参见例如WO 1996/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体，诸如抗VEGF抗体。
[0119] 主要有两种办法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要拮抗剂的部位将核酸直接注射入患者。对于回体治疗，取出患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞直接施用于患者，或者例如封装入多孔膜再植入患者(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移入体外培养的细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适合于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体，电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-右旋糖苷，磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的一种载体是逆转录病毒。
[0120] 目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒，I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(例如，可用于脂质介导的基因转移的脂质有DOTMA，DOPE和DC-Chol)进行转染。在一些情况中，希望与对靶细胞特异性的药剂(诸如对靶细胞上的细胞表面膜蛋白特异性的抗体，针对靶细胞上受体的配体，等)一起提供核酸来源。在采用脂质体的情况中，可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段，针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体，和靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu et al.,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)；及Wagner et al.,PNAS USA 87:3410-3414(1990)。基因标记和基因疗法方案记载于例如Anderson et al.,Science 256:
808-813(1992)及WO 1993/25673。
808-813(1992)及WO 1993/25673。
[0121] B.抗VEGF抗体
[0122] 在本文所列所有治疗方法中，抗VEGF抗体以足够特异性和亲和力结合VEGF，而且可以是嵌合的，人源化的，人的，或文库衍生的抗体，或其抗体片段。
[0123] 1.嵌合的和人源化的抗体
[0124] 在某些实施方案中，抗VEGF抗体可以是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567及Morrison等,PNAS USA,81:6851-6855,1984。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0125] 在某些实施方案中，抗VEGF抗体可以是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033
(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods
36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods
36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
[0126] 2.人抗体
[0127] 在某些实施方案中，抗VEGF抗体可以是人抗体。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；
Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,
Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等,
Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,
Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等,
Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
[0128] 可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等PNAS USA,89:4285(1992)；及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
[0129] 可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。人抗体一般性记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。例如，可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见
Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,
584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了 技术；美国
专利No.7,041,870，其描述了 技术，和美国专利申请公开文本No.US
2007/0061900，其描述了 技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合
进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,
584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了 技术；美国
专利No.7,041,870，其描述了 技术，和美国专利申请公开文本No.US
2007/0061900，其描述了 技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合
进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
[0130] 也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,PNAS USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,Histology and
Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
[0131] 在一些情况中，也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。
[0132] 3.文库衍生的抗体
[0133] 在某些实施方案中，抗VEGF抗体可以是或已经是通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体而分离的。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等,于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature
352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；
Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093
(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods
284(1-2):119-132(2004)。
352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；
Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093
(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods
284(1-2):119-132(2004)。
[0134] 在一些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373，和美国专利公开文本No.2005/
0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,
2007/0292936和2009/0002360。
0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,
2007/0292936和2009/0002360。
[0135] 4.抗体生成和特性
[0136] 在本发明的方法中有用的抗VEGF抗体可以包括任何以足够亲和力和特异性结合VEGF且/或能降低或抑制VEGF的生物学活性的抗体或其抗原结合片段。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF，PDGF，或bFGF。
[0137] 在一些情况中，要用于生成VEGF抗体的VEGF抗原可以是例如VEGF165分子以及VEGF的其它同等型或其含有期望表位的片段。在一个实施方案中，期望表位是受到贝伐珠单抗识别的表位，贝伐珠单抗与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位(称作本文中定义的“A.4.6.1表位”)。可用于生成本发明的抗VEGF抗体的其它形式的VEGF对于本领域技术人员会是显而易见的。
[0138] 人VEGF首先是使用牛VEGF cDNA作为杂交探针筛选自人细胞制备的cDNA文库而获得的。Leung等(1989)Science，246：1306。一种由此鉴定出的cDNA编码一种165个氨基酸的蛋白质，其与牛VEGF具有超过95％的同源性；此165个氨基酸的蛋白质通常称作人VEGF(hVEGF)或VEGF165。人VEGF的促有丝分裂活性通过在哺乳动物宿主细胞中表达人VEGF cDNA得到了验证。由经人VEGF cDNA转染的细胞条件化的培养基促进毛细血管内皮细胞增殖，而对照细胞不然。Leung等(1989)Science，见上文。进行进一步努力来经重组DNA技术克隆和表达VEGF。(参见例如Ferrara，Laboratory Investigation 72：615-618(1995)及其中引用的参考文献)。
[0139] 源自可变RNA剪接，VEGF在多种组织中作为多种同二聚体形式(每个单体121，145，165，189，和206个氨基酸)表达。VEGF121是一种可溶性丝裂原，不结合肝素；更长形式的VEGF以越来越高的亲和力结合肝素。肝素结合形式的VEGF可以在羧基末端被纤溶酶切割以释放可扩散形式的VEGF。纤溶酶切割后鉴定出的羧基末端肽的氨基酸测序是Arg110-Ala111。作为同二聚体分离到的氨基末端“核心”蛋白，VEGF(1-110)以与完整VEGF165同二聚体相比相似的亲和力结合中和性单克隆抗体(诸如称作4.6.1和3.2E3.1.1的抗体)和可溶性形式的
VEGF受体。
VEGF受体。
[0140] 最近还鉴定出数种在结构上与VEGF有关的分子，包括胎盘生长因子(PlGF)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E。Ferrara和Davis-Smyth(1987)Endocr.Rev.，见上文；Ogawa等J.Biological Chem.273：31273-31281(1998)；Meyer等EMBO J.，18：363-374(1999)。受体酪氨酸激酶Flt-4(VEGFR-3)鉴定为VEGF-C和VEGF-D的受体。Joukov等EMBO.J.15：1751(1996)；Lee等PNAS USA 93：1988-1992(1996)；Achen等(1998)PNAS USA 95：548-553。VEGF-C显示出涉及对淋巴管发生的调节。Jeltsch等Science 276：1423-1425(1997)。
[0141] 已经鉴定出两种VEGF受体，即Flt-1(也称作VEGFR-1)和KDR(也称作VEGFR-2)。Shibuya等(1990)Oncogene 8：519-527；de Vries等(1992)Science 255：989-991；Terman等(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.187：1579-1586。神经毡蛋白-1显示为选择性VEGF受体，能够结合肝素结合性VEGF同等型(Soker等(1998)Cell 92：735-45)。
[0142] 在本发明的某些实施方案中，抗VEGF抗体包括但不限于与由杂交瘤ATCC HB 10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1；依照Presta等(1997)Cancer Res.57：4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体结合相同表位的单克隆抗体。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是贝伐珠单抗(BV或Bev)，也称作“rhuMAb VEGF”或 它包含经过
突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐珠单抗大约93％的氨基酸序列(包括大部分框架区)是自人IgG1衍生，而且约7％的序列是自鼠抗体A4.6.1衍生的。
突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐珠单抗大约93％的氨基酸序列(包括大部分框架区)是自人IgG1衍生，而且约7％的序列是自鼠抗体A4.6.1衍生的。
[0143] 贝伐珠单抗 是第一种得到FDA批准的抗血管发生疗法，而且批准用于治疗转移性结肠直肠癌(一线和二线治疗，与基于静脉内5-FU的化疗组合)，晚期非鳞状，非小细胞肺癌(NSCLC)(不可切除的，局部晚期，复发性或转移性NSCLC的一线治疗，与卡铂和帕利他赛组合)和转移性HER2阴性乳腺癌(先前未治疗的，转移性HER2阴性乳腺癌，与帕利他赛组合)。
[0144] 贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF抗体记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-31，B20-4.1)，如记载于PCT公开号WO2005/012359，PCT公开号WO2005/044853，和美国专利申请60/991,302，通过述及明确将这些专利申请的内容收入本文。
[0145] 依照本发明的G6系列抗体指自G6抗体的序列衍生的抗VEGF抗体或依照PCT公开文本No.WO2005/012359的图7，24-26，和34-35之任一的G6衍生抗体，通过述及将其整个公开内容收入本文。还可参见PCT公开文本No.WO2005/044853，通过述及将其完整内容明确收入本文。在一个实施方案中，G6系列抗体结合人VEGF上的功能性表位，其包含残基F17，Y21，Q22，Y25，D63，I83和Q89。
[0146] 依照本发明的B20系列抗体指自B20抗体的序列衍生的抗VEGF抗体或依照PCT公开文本No.WO2005/012359的图27-29之任一的B20衍生抗体，通过述及将其整个公开内容收入本文。还可参见PCT公开文本No.WO2005/044853和美国专利申请60/991,302，通过述及将这些专利申请的内容明确收入本文。在一个实施方案中，B20系列抗体结合人VEGF上如上定义的功能性表位，其包含残基F17，M18，D19，Y21，Y25，Q89，I91，K101，E103，和C104。
[0147] 在其它实施方案中，在上文所述组合疗法中使用其它抗VEGF抗体，或是作为唯一的抗VEGF抗体或是作为上文所述抗VEGF抗体的使用的补充。此类抗体记载于例如美国专利No.7,060,269，6,582,959，6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；WO 94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请公开文本No.2006009360，20050186208，20030206899，
20030190317，20030203409，和20050112126；和Popkov等，Joumal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。这些其它抗体可以包括那些结合人VEGF上包含残基F17，M18，D19，Y21，Y25，Q89，I91，K101，E103，和C104或者包含残基F17，Y21，Q22，Y25，D63，I83和Q89的如上定义的功能性表位的。
20030190317，20030203409，和20050112126；和Popkov等，Joumal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。这些其它抗体可以包括那些结合人VEGF上包含残基F17，M18，D19，Y21，Y25，Q89，I91，K101，E103，和C104或者包含残基F17，Y21，Q22，Y25，D63，I83和Q89的如上定义的功能性表位的。
[0148] 在一些实施方案中，在本文所述任一方法中有用的抗VEGF抗体可以具有轻链可变区，其包含下述氨基酸序列：
[0149] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS
[0150] RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR
[0151] (SEQ ID NO：1)和重链可变区，其包含下述氨基酸序列：
[0152] EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY
[0153] AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAFD TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS[0154] (SEQ ID NO:2)。
[0155] 在还有其它实施方案中，抗VEGF抗体可以是未缀合的，诸如裸的抗VEGF抗体，或者可以为进一步的有效性与另一分子缀合，诸如例如为了改善半衰期。在任何方法和用途中，缀合的抗体和/或它结合的抗原被细胞内在化，导致缀合物在杀伤它结合的癌细胞(例如成胶质细胞瘤癌细胞)方面升高的治疗功效。例如，细胞毒剂可以靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱，加利车霉素，核酸核酸酶和DNA内切核酸酶。
[0156] IV.药物配制剂
[0157] 要依照本发明使用的本文所述抗体的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载剂，赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。关于配制剂的一般信息参见例如Gilman et al.,(eds.)(1990),The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press；A.Gennaro(ed.),Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,(1990),Mack Publishing Co.,Eastori,
Pennsylvania；Avis et al.,(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990)Pharmaceutical
Dosage Forms:Tablets Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990),
Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,New York；及Kenneth
A.Walters(ed.)(2002)Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),Vol 119,Marcel Dekker。
Pennsylvania；Avis et al.,(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990)Pharmaceutical
Dosage Forms:Tablets Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990),
Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,New York；及Kenneth
A.Walters(ed.)(2002)Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),Vol 119,Marcel Dekker。
[0158] 可接受的载剂，赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
[0159] 例示性的抗VEGF抗体配制剂记载于美国专利No.6,884,879。在某些实施方案中，抗VEGF抗体在单次使用管形瓶中以25mg/mL配制。在某些实施方案中，在240mgα,α-海藻糖二水合物，23.2mg钠的磷酸盐(一碱基的，一水合物)，4.8mg钠的磷酸盐(二碱基的，无水的)，1.6mg聚山梨酯20，和注射用水(USP)中配制100mg抗VEGF抗体。在某些实施方案中，在960mgα,α-海藻糖二水合物，92.8mg钠的磷酸盐(单碱基的，一水合物)，19.2mg钠的磷酸盐(二碱基的，无水的)，6.4mg聚山梨酯20，和注射用水(USP)中配制400mg抗VEGF抗体。
[0160] 适于皮下施用的冻干配制剂记载于例如美国专利No.6,267,958(Andya等人)。此类冻干配制剂可以用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中要治疗的哺乳动物。
[0161] 还涵盖拮抗剂的结晶形式。参见例如US 2002/0136719A1。
[0162] 本文中的配制剂还可含有超过一种活性化合物(上文提到的第二药物)，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类药物的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体，例如贝伐珠单抗)的量和类型，以及受试者的临床参数。优选的此类第二药物如上所述。
[0163] 活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.Ed.(1980)。
[0164] 可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有所述拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
[0165] 用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
[0166] V.试剂盒
[0167] 在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗诊断有成胶质细胞瘤(例如新诊断的成胶质细胞瘤和/或前神经型成胶质细胞瘤)的患者的材料的制品。制品包括容器，标签和包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，等。容器可以自各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器装有有效治疗疾患的组合物，而且可以具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)。容器上的或与容器相关的标签指明该组合物用于治疗选择的疾患。制品可以进一步包括第二容器，其中装有药学可接受缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水，林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场看需要的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针头，和注射器。另外，制品包括包装插页，印有使用说明书，包括例如指导该组合物的使用者对患者/受试者施用抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)组合物和化疗剂(例如TMZ)。包装插页可以任选包括实施例4中找到的一些或所有结果。
[0168] 抗VEGF抗体可以单独或与其它抗癌治疗性化合物组合包装成试剂盒。试剂盒可以包括帮助对受试者施用单位剂量的任选成分，诸如用于粉剂形式重建的管形瓶，用于注射的注射器，定制IV投递系统，吸入器，等。另外，单位剂量试剂盒可以包括关于制备和施用组合物的说明书。试剂盒可以作为用于一位受试者的单次使用单位剂量或用于特定受试者的多次使用(以恒定的剂量或其中各种化合物的效力可随治疗进展而变化)制造。试剂盒可以包括适合于对多位受试者施用的多剂(“大量包装”)。试剂盒成分可以在纸盒，泡罩包，瓶，管，等等中装配。
[0169] 在一些实施方案中，试剂盒用于对已经接受过两种或少数(例如两种，一种，或零种)在先抗癌方案的患者的意图使用。实施例
[0170] 提供下述实施例以例示但非限制当前要求保护的发明。
[0171] 实施例1：AvaGlio研究
[0172] AvaGlio试验评估贝伐珠单抗与替莫唑胺和放疗组合用于新诊断的成胶质细胞瘤的功效和安全性。这项研究设计为一项贝伐珠单抗加化疗较之单独的化疗的前瞻性，随机化，双盲，安慰剂对照的III期评估。要成为合格，患者必须具有新诊断的成胶质细胞瘤，有手术切除或活检后建立的组织诊断。通过将贝伐珠单抗添加至化疗和放疗，AvaGlio试验的目标是改善具有有限的治疗选项且面对特别差的预后的这群患者的总体存活(OS)和无进展存活(PFS)。主要目的是比较随机化至仅替莫唑胺(TMZ)和放疗或替莫唑胺和放疗加贝伐珠单抗的患者的OS和PFS。
[0173] AvaGlio研究的概览
[0174] 这项试验由三个阶段(并行，维持，和单一疗法)和两个治疗分支(TMZ和放疗(RT)(分支1)，和TMZ和RT加贝伐珠单抗(分支2))组成。患者随机指派(1:1)至任一分支。见图1。
[0175] 分支1(单独的化疗和放疗)：合格患者接受一周5天的2Gy RT持续6周和每天的口服75mg/m2TMZ持续6周(自RT的第一天至最后一天)，与每2周的i.v.10mg/kg安慰剂组合。4周治疗休息后，合格患者接受6个周期每个四周日程表的第1-5天的150-200mg/m2TMZ，与每2周的i.v.10mg/kg安慰剂组合。口服施用TMZ，始于150mg/m2剂量，可以扩大。然后继续安慰剂单一疗法(每3周15mg/kg)直至疾病进展。在疾病进展时，根据调查人员的斟酌治疗患者。
[0176] 分支2(化疗和放疗加贝伐珠单抗)：合格患者接受一周5天的2Gy RT持续6周和每天的口服75mg/m2TMZ持续6周(自RT的第一天至最后一天)，与每2周的i.v.10mg/kg贝伐珠单抗组合。4周治疗休息后，合格患者接受6个周期每个四周日程表的第1-5天的150-200mg/m2TMZ，与每2周的i.v.10mg/kg贝伐珠单抗组合。口服施用TMZ，始于150mg/m2剂量，可以扩大。然后继续贝伐珠单抗单一疗法(每3周15mg/kg)直至疾病进展。在疾病进展时，根据调查人员的斟酌治疗患者。
[0177] 初始贝伐珠单抗输注在90分钟里，后续输注在60分钟里，然后在30分钟里，视耐受情况而定。在RT和TMZ治疗的最后一天，即TMZ治疗休息开始前那天施用贝伐珠单抗。
[0178] PFS分析基于使用脑MRI的肿瘤评估MacDonald响应标准(改良WHO标准)和Macdonald et al.，J.Clin.Oncol.8:1277-80，1990)记载的神经学评估。在基线时，在4周治疗休息结束时，然后每8周实施肿瘤评估。
[0179] 研究群体–纳入标准
[0180] 纳入年龄≥18岁且具有新诊断的幕上成胶质细胞瘤(GBM)(具有手术切除或活检后确立的组织诊断)的患者。这包括具有较低级星形细胞瘤的在先诊断且已经升级至组织学验证的GBM的未治疗的化疗和放疗患者。患者必须具有≤2的WHO性能状态。
[0181] 研究群体–排除标准
[0182] 术后脑MRI上最近出血的证据排除候选患者。然而，允许具有含铁血黄素的临床无症状存在，正在解决中的涉及手术的出血变化，和肿瘤中点状出血的存在的患者进入研究。先前为登入一项临床试验针对MGMT状态的集中筛选；用于成胶质细胞瘤和低级星形细胞瘤的任何在先化疗(包括含有卡莫司汀的华夫饼 或免疫疗法(包括疫苗疗法)；任
何在先的对脑的放疗或在先的导致照射场潜在交叠的放疗；在先的高血压危象或高血压脑病的历史；随机化之前1个月内依照NCI-CTC标准的≥2级咳血的历史；出血素质或凝血病(在治疗性抗凝缺失下)的证据；随机化之前28天内的重大手术规程，开放式活检，颅内活检，脑室腹膜分流术或显著外伤性损伤；随机化之前7天内的芯活检(排除颅内活检)或其它微小手术规程也排除患者。中央血管通路装置(CVAD)的安置，如果在贝伐珠单抗/安慰剂施用之前2天内实施的话；随机化之前6个月内腹瘘或胃肠穿孔的历史；随机化之前6个月内颅内脓肿的历史；严重非愈合伤口，活动性溃疡，或未治疗的骨折也排除患者。就妊娠或哺乳女性而言，在研究治疗开始之前7天内或在14天内(在研究治疗开始之前7天内有确认性尿妊娠试验)评估血清妊娠试验。还排除生育女性(定义为最后一次月经后<2年且未手术绝育)和不使用高度有效的激素或非激素的避孕手段(即子宫内避孕装置)的男性；具有吸烟的历史或随机化之前≤6个月内短暂性脑缺血发作(TIA)，随机化之前≤6个月内的控制不当的高血压(持续的收缩>150mmHg和/或舒张>100mmHg)或重大血管病(包括需要手术修复的主动脉瘤或最近的周围动脉血栓形成)的患者。还排除具有随机化之前≤6个月内的心肌梗死或不稳定心绞痛，纽约心脏协会(NYHA)II级或更高级充血性心力衰竭(CHF)，或已知的对任何研究药物或赋形剂的超敏感性的患者。
何在先的对脑的放疗或在先的导致照射场潜在交叠的放疗；在先的高血压危象或高血压脑病的历史；随机化之前1个月内依照NCI-CTC标准的≥2级咳血的历史；出血素质或凝血病(在治疗性抗凝缺失下)的证据；随机化之前28天内的重大手术规程，开放式活检，颅内活检，脑室腹膜分流术或显著外伤性损伤；随机化之前7天内的芯活检(排除颅内活检)或其它微小手术规程也排除患者。中央血管通路装置(CVAD)的安置，如果在贝伐珠单抗/安慰剂施用之前2天内实施的话；随机化之前6个月内腹瘘或胃肠穿孔的历史；随机化之前6个月内颅内脓肿的历史；严重非愈合伤口，活动性溃疡，或未治疗的骨折也排除患者。就妊娠或哺乳女性而言，在研究治疗开始之前7天内或在14天内(在研究治疗开始之前7天内有确认性尿妊娠试验)评估血清妊娠试验。还排除生育女性(定义为最后一次月经后<2年且未手术绝育)和不使用高度有效的激素或非激素的避孕手段(即子宫内避孕装置)的男性；具有吸烟的历史或随机化之前≤6个月内短暂性脑缺血发作(TIA)，随机化之前≤6个月内的控制不当的高血压(持续的收缩>150mmHg和/或舒张>100mmHg)或重大血管病(包括需要手术修复的主动脉瘤或最近的周围动脉血栓形成)的患者。还排除具有随机化之前≤6个月内的心肌梗死或不稳定心绞痛，纽约心脏协会(NYHA)II级或更高级充血性心力衰竭(CHF)，或已知的对任何研究药物或赋形剂的超敏感性的患者。
[0183] 实施例2：使用Nanostring基因表达数据对FFPE固定样品分类
[0184] 临床样品对于基因表达亚型的分层是通过如下事实实现的，即标准样品制备(例如使用福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)技术进行的固定)降低了可供使用标准方法(例如微阵列)进行的分析所用的RNA的质和量。最近，单分子分析技术已经可用于测定FFPE固定材料中的基因表达，例如Nanostring nCounter(Geiss et al.,Biotechnol.26(3):317-325,2008)。
[0185] 为了将患者衍生样品指派入最初自在微阵列上分析的新鲜冷冻样品定义的基因表达亚型，我们应用了一种四步骤办法。具体而言，我们：
[0186] 1.将由Lai等人分类的98份样品的已发表微阵列数据再标准化，并计算35种分类器基因的基因表达形心(参照数据)。
[0187] 2.应用形心将在相同Affymetrix微阵列平台上分析的一组新的47份成胶质细胞瘤样品分类(针对与参照数据相同的参照分布进行标准化)(练习样品)。
[0188] 3.在Nanostring nCounter系统上对相同47份练习样品中的分类器基因表达进行概况分析。
[0189] 4.使用基于Affymetrix微阵列数据为47份练习样品指派的亚型标签为Nanostring平台再校准形心。
[0190] 我们为Nanostring平台获得了三个形心，每种亚型一个，它们可应用于直接对只在此技术平台上测定的新样品进行分类。
[0191] 为Affymetrix微阵列数据获得基因表达形心
[0192] 我们自Genentech的研究数据库获得了由Lai等人(Lai et al.,Clin.Oncol.29(34):4482-4490,2011)在hgu133plus2Affymetrix微阵列上分析并分类的98份样品的原始表达数据，将数据标准化(使之在阵列间相容)并保存参照分布(Harbron et al.,
Bioinformatics 23(18):2493-2494,2007)。
Bioinformatics 23(18):2493-2494,2007)。
[0193] 如下文表1所示，我们将数据分子集(subset)至35种微阵列分类器探针(其中30种在撰写时与有注解的基因有关)，并将每份样品与由Lai等人指派的亚型标签联系起来。
[0194] 表1：由Phillips等人定义的表达亚型的形心，自标准化的由Lai等人发表的Affymetrix表达数据确定
[0195]
[0196]
[0197]
[0198] 为了获得三种亚型特异性形心，我们通过计算均值就指派至给定亚型的所有样品为每种基因的表达单独取平均(表1)。另外，我们还为跨越整个数据集观察到的每种分类器探针保存均值和标准偏差。此参照数据集含有按照Lai等人分类的38份间充质样品，30份前神经样品，和30份增殖性样品(表2)。
[0199] 表2：参照数据集中可得的每种亚型的样品数目
[0200] 样品数目
间充质 38
前神经 30
增殖性 30
间充质 38
前神经 30
增殖性 30
[0201] 在Affymetrix微阵列和Nanostring nCounter上交叉分析的成胶质细胞瘤样品的分类
[0202] 接下来，我们自Genentech的研究数据库获得了47份新成胶质细胞瘤样品(练习样品)的原始微阵列数据，它们也已经在Nanostring nCounter系统上进行了分析。如上文进行的那样，将每个微阵列针对相同参照分布标准化以确保研究间的相容性。
[0203] 为了将练习样品与由Phillips等人定义的亚型(Phillips et al.,Cancer Cell.9(3):157-173,2006)联系起来，我们将表达数据分子集至相同35种分类器探针(对应于30种有注解的蛋白质编码基因)，并将每种探针的表达定标以匹配在参照数据集中对相同探针观察到的均值和标准偏差。
[0204] 对于每份样品，我们确定了与上文定义的三个表达形心中每一个的Pearson相关系数，并将它指派至具有最高非负相关系数的亚型。与任何形心没有正相关的样品留着不指派。
[0205] 在47份样品中，26份分类为间充质，14份分类为前神经，7份分类为增殖性(表3)。
[0206] 表3：练习数据集中可得的每种亚型的样品数目
[0207] 样品数目
间充质 26
前神经 14
增殖性 7
间充质 26
前神经 14
增殖性 7
[0208] 为Nanostring nCounter平台获得亚型特异性形心
[0209] 还在Nanostring nCounter上分析了相同47份练习样品，表征靶向下述30种分类器基因的探针，它们代表当前与下述蛋白质编码基因座匹配的所有初始35种微阵列探针：ANGPTL4，ATP6V1G2，CENPK，CHI3Ll，COL4Al，COL4A2，CSDC2，DLL3，DTL，E2F7，FOSL2，GABBR1，GALNT13，HMMR，KLRC3，LIF，MYL9，NCAM1，NDRG2，PDLIM4，PDPN，PLA2G5，RASL10A，SCG3，SERPINE1，SNAP91，SOX8，SPOCDl，TAGLN和TIMP1。
[0210] 将自nCounter分析软件获得的原始Nanostring计数进行log2换算，并通过将所有测定探针间的表达均值和标准偏差调整至相同参照值在样品间标准化。为了为三种亚型定义Nanostring特异性形心，我们再次为三种亚型中的每一种计算了每种分类器基因的均值表达(表4)。
[0211] 表4：Phillips表达亚型的Nanostring特异性形心
[0212]
[0213]
[0214] 如上文，将样品指派至显示最高Pearson相关的亚型。为了校准(benchmark)基于Nanostring的亚型指派的精确性，我们比较了原始的基于微阵列的类别标签的再呼叫(recall)。我们对38/47(80.1％)份样品观察到一致的指派(表5)。
[0215] 表5：基于Nanostring的亚型指派对于练习数据集的再呼叫
[0216] 间充质 前神经 增殖性
间充质 20 1 0
前神经 4 12 1
增殖性 2 1 6
间充质 20 1 0
前神经 4 12 1
增殖性 2 1 6
[0217] 为了减少伪指派的数目，可以加入关于亚型指派更加严格的滤器，例如要求最小正Pearson相关来将样品分类。
[0218] 实施例3：来自AvaGlio试验的样品基于Nanostring的分类
[0219] 接下来，我们将来自AvaGlio试验的可以评估生物标志物的349份样品分类入由Phillips定义的基因表达亚型(Phillips,Cancer Cell.9(3):157-173,2006)。每个治疗分支内的349位生物标志物可评估患者的选定基线特征显示于表6。
[0220] 表6：生物标志物可评估患者的选定基线特征
[0221]
[0222]
[0223] 用用于推导亚型特异性形心的相同Nanostring探针集分析样品，并使用相同技术和探针序列获得相同基因的表达得分。在349份样品中，来自携带已知与较好预后有关的异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因突变的患者的10份样品排除在此分析之外。在剩余339份IDH1野生型样品中，对原始Nanostring计数进行log2换算，并将所有样品间的表达均值和标准偏差调整至应用于上文实施例2的练习集的相同参照数值。
[0224] 对于分类，只考虑30种分类器探针的表达值，而且，对于每份样品，确定就三种Nanonstring特异性形心中每一种而言的Pearson相关系数。将样品指派至具有最高正相关系数的亚型。42份(12.3％)样品未显示与任何形心的任何正相关，标记为“未分类”(表7)。
[0225] 表7：AvaGlio试验样品的亚型指派
[0226] AvaGlio样品数目
间充质 141
前神经 99
增殖性 57
未分类 42
间充质 141
前神经 99
增殖性 57
未分类 42
[0227] 上文所述基于30种分类器基因的Phillips亚型分类和基于95种分类器基因的TCGA亚型分类(Verhaak et al.,Cancer Cell.17(1):98-110,2010)之间的比较显示于下文表8。
[0228] 表8：基于Phillips和TCGA分类的亚型指派的比较
[0229]
[0230] 在分类为具有Phillips等人定义的前神经亚型成胶质细胞瘤的99位患者中，以治疗分支分开的选定基线特征显示于下文表9。
[0231] 表9：前神经亚型患者的选定基线特征
[0232]
[0233]
[0234] 为了调查AvaGlio样品是多么稳健地分类入三种基因表达亚型中，我们还使用相同30种分类器基因实施了无监督分析(在中心点(medoids)附近划分)(Kaufman&Rousseeuw,Clustering by Means of Medoids.Reports of the Faculty of
Mathematics and Informatics,Delft University of Technology,1987)，将样品分选入三个簇中(k＝3)。重要的是，簇的性质不是事先规定的，而是由算法自动确定的。具有负Silhouette宽度(指示它们的表达与最终的簇指派不匹配)的样品标记为“未分类”。
Mathematics and Informatics,Delft University of Technology,1987)，将样品分选入三个簇中(k＝3)。重要的是，簇的性质不是事先规定的，而是由算法自动确定的。具有负Silhouette宽度(指示它们的表达与最终的簇指派不匹配)的样品标记为“未分类”。
[0235] 我们观察到有监督和无监督分析之间很高的一致性，例如自动确定的样品簇很大程度上与形心衍生亚型交叠(表10)。
[0236] 表10：AvaGlio样品的有监督和无监督分层
[0237]
[0238] 实施例4：在AvaGlio试验中具有前神经(PN)型成胶质细胞瘤的患者在贝伐珠单抗治疗后显示无进展存活(PFS)和总体存活(OS)延长
[0239] 在III期AvaGlio试验中，在治疗分支中添加抗VEGF抗体疗法导致中值无进展存活(PFS)与安慰剂分支相比总体升高约4.4个月，但是中值总体存活(OS)在两个分支之间没有显著差异。因此，我们测定使用Phillips分类根据他们的成胶质细胞瘤的肿瘤基因表达亚型定义的任何患者是否自对RT和化疗治疗添加抗VEGF疗法得到OS受益。
[0240] 在将PFS和OS数据二者依照使用Phillips分类定义的成胶质细胞瘤亚型分层后，我们对具有PN亚型的成胶质细胞瘤的患者(n＝99位患者，占AvaGlio研究中所有患者的大约28.3％)观察到AvaGlio试验的治疗分支中的PFS和OS与安慰剂分支相比升高。
[0241] 就PN患者(他们在标准护理下具有最差的OS预后)的PFS而言，治疗分支相对于安慰剂分支，我们观察到中值PFS延长约4.3个月，危害比(HR)等于0.58(95％置信区间(CI)＝0.37-0.9；p＝0.015)(见图2A)。就PN患者的OS而言，治疗分支相对于安慰剂分支，我们观察到中值OS延长约4.9个月，HR等于0.63(95％CI＝0.4-0.99；p＝0.043)(见图2B)。
[0242] 我们还关于抗VEGF疗法(例如抗VEGF抗体疗法，例如贝伐珠单抗疗法)与RT和化疗组合对OS的影响进行了一项多变量分析，考虑了已知的临床预后协变量(例如年龄，皮质类固醇，切除程度，性别，Karnofsky性能得分(KPS)，O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子的甲基化状态，迷你精神状态检查得分(MMSE)，递归分割分析(RPA)类别，和WHO性能得分)。这项分析是使用多变量Cox比例风险(PH)模型实施的，其中该模型拟合具有由Phillips定义的PN和非PN亚型成胶质细胞瘤肿瘤的患者的OS。多变量Cox PH指示抗VEGF疗法对于具有PN亚型成胶质细胞瘤的患者导致显著的OS受益，但是对于具有非PN亚型成胶质细胞瘤的患者不然(图3)。具体而言，对于具有PN亚型成胶质细胞瘤的患者，与安慰剂分支中的12.2个月相比，治疗分支中的中值OS为17.1个月，HR等于0.42(95％CI＝0.24-0.72；p＝0.002)(图4A)。对于具有非PN亚型成胶质细胞瘤的患者，HR等于1.03(95％CI＝0.76-
1.39；p＝0.863)(图4B)。
1.39；p＝0.863)(图4B)。
[0243] 关于抗VEGF疗法(例如抗VEGF抗体疗法，例如贝伐珠单抗疗法)对具有根据TCGA(Verhaak et al.,Cancer Cell.17(1):98-110,2010)分类的PN和非PN亚型成胶质细胞瘤的患者的OS的影响的多变量分析也指示具有PN亚型成胶质细胞瘤的患者中显著的OS受益(图5A和5B)。
[0244] 这些数据显示在具有PN型的成胶质细胞瘤的患者中抗VEGF抗体疗法(例如贝伐珠单抗疗法)与显著的PFS和OS改善(即PFS和OS时间延长)有关。
[0245] 虽然为了清楚理解的目的已经经由例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过述及明确完整收录本文中引用的所有专利，专利申请，科学参考文献，和Genbank登录号的公开内容用于所有目的，就像通过述及具体和个别收录每一篇专利，专利申请，科学参考文献，和Genbank登录号。此类专利申请具体包括分别于2013年8月30日和2014年5月29日提交的美国临时专利申请No.61/872,165和No.62/004,687，本申请要求它们的权益。
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