专利汇可以提供鸡干扰素γ及其制备方法和用途专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及基因工程技术领域中功能基因的克隆、重组表达和纯化等技术,特别是鸡干扰素γ及其制备方法和用途。它采用鸡重组干扰素的重组载体构建与筛选、表达产物的分离纯化等制备方法制备鸡干扰素γ。本发明解决了 现有技术 存在的鸡干扰素γ生产成本昂贵的问题,具有采用该方法能够获得高纯度体外表达的鸡干扰素γ基因,所制备的产品可用于制备病害防治药物、免疫增强剂、饵料添加剂等,也可用于禽类免疫机制的理论研究。,下面是鸡干扰素γ及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.鸡干扰素γ,其特征在于它的cDNA序列为:1 CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGT1 L N L V Q L Q D D I D K L K A D F N S S61 CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21 H S D V A D G G P I I V E K L K N W T E121 AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41 R N E K R I I L S Q I V S M Y L E M L E181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61 N T D K S K P H I K H I S E E L Y T L K241 AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81 N N L P D G V K K V K D I M D L A K P P301 ATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG101 M N D L R I Q R K A A N E L F S I L Q K361 CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121 L V D P P S F K R K R S Q S Q R R C N C以上序列为鸡干扰素γ的核苷酸序列和氨基酸序列,其中第1、3、5、7、9、11、13行为核苷酸序列,第2、4、6、8、10、12、14行为氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于它由如下工艺步骤组成:A、鸡重组干扰素的重组载体构建、转化与筛选,其中包括:a、重组载体的构建:根据鸡干扰素基因成熟肽的cDNA序列,利用一对特异性引物,并在这对引物的两端引入两个不同的限制性内切酶位点如(SphI,KpnI,PstI,XhoI)和(KpnI,PstI,HindIII),以下以SphI和HindIII为例进行说明,引物rCIFF 5’-CAG CAT GCC TAA ATC TTG TTC AAC TTC-3’和引物rCIFR 5’-CCA AGC TTA GCA ATT GCA TCT CCT CT-3’的两端分别含有SphI和HindIII限制性内切酶识别位点为G CAT GC和A AGC TT,在经聚肌胞(polyI:C)或病毒感染的鸡内脏cDNA文库中进行PCR扩增反应,扩增产物经两个不同的限制性内切酶SphI和HindIII消化后,亚克隆到含6个组氨酸(6His)标记的表达质粒载体,表达质粒载体选用pQE系列(Qiagen)、pET系列或pMET系列等;b、转化和筛选利用化学转化或电转化的方法,将a步骤中已构建的原核或真核表达载体,转化或转染到原核或真核宿主体内,分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选;获得的阳性克隆进行质粒纯化,限制性内切酶消化验证;并经序列测定等鉴定后,所筛选得到的阳性克隆作为工程菌株;B、表达产物的分离纯化,其中:采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或甲醇为诱导剂对b步骤中所获得的工程菌种进行诱导与表达,经裂解液裂解后用金属亲和层析和单克隆抗体纯化;C、终止和保存。
3.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于PCR扩增反应的反应液应包括如下单位体积的组份:cDNA 1-5ul10×PCR buffer 2.5ul25mM Mg2+1.5ul2.5mM DNTP 1ul10pM rCIFF/rCIFR 各1ulTaq polymerase 5u/ul 0.2ul加水至 25ul
4.根据权利要求2或3所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于PCR扩增反应包括25-35个循环,每个循环包括cDNA变性,退火和延伸三个反应过程,其中:cDNA变性的反应条件是:反应温度92-98℃,孵育时间0.5-1分钟;退火:降低温度,使引物与模板退火结合,反应温度为55-64℃、反应时间为0.5-1分钟;延伸:当模板与引物退火后,提高温度使退火引物延模板方向延伸,使目的基因充分扩增,反应温度为68℃-72℃,反应时间为45秒-3分钟。
5.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于所述的终止和保存步骤中,终止是反应完成后,将新合成样品暂时保存于4-10℃的低温环境下;长期保存是将扩增产物保存于-20℃--80℃备用。
6.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于所述的亚克隆是用限制性内切酶SphI和HindIII对获得的PCR产物或克隆的质粒及表达载体进行限制性消化,将消化后的含特异性限制性内切酶位点的基因扩增产物和表达载体经纯化后,用T4 DNA连接酶连接,并转化到原核或真核表达载体中。
7.根据权利要求2或6所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于所述的扩增产物经两个特定的限制性内切酶SphI和HindIII消化反应中,反应液包括如下组份:PCR产物或质粒DNA 0.1ug-2ug10X buffer 2ul限制性内切酶Sph I 1ul限制性内切酶Hind III 1ul将上述组份加水至20ul,于37℃孵育0.5-6小时。
8.根据权利要求6所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于所述的连接是将消化后的目的基因和表达载体纯化后,按照1-8∶1-8的比例混合,加T4 DNA连接酶,于温度为4-16℃、时间为0.5-24小时进行连接,连接反应中各组份的用量为:2X含T4 DNA连接酶快速连接缓冲液 5μl经消化后的表达载体 150ng经消化后的目的基因片断 50ng将上述组份加水至10μl
9.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法,其特征在于所述的B步骤中金属亲和层析选用Ni-NTA(Qiagen)金属亲和纯化胶体,单克隆抗体选用6His单克隆抗体或纯化后鸡干扰素的单克隆抗体。
10.根据权利要求1所述的鸡干扰素γ的用途,其特征在于它用于制备疫苗的免疫增强剂、病害防治药物、饲料添加剂、医药制剂等。
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