包含Duddingtonia flagrans的组合物
阅读：836发布：2021-05-27
专利汇可以提供包含Duddingtonia flagrans的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 学纯的培养物，所述培养物包含分离的Duddingtonia flagrans(D.flagrans)菌株IAH 1297和/或所述分离的D.flagrans菌株的孢子，包含其的组合物，其方法及用途，所述菌株D.flagrans菌株IAH 1297于2016年8月2日保藏在澳大利亚维多利亚3207墨尔本港1/153伯蒂街道的国家计量研究院(National Measurement InStitute，1/153Bertie Street，Port Melbourne，Victoria 3207，Australia)，保藏号是V16/019156。，下面是包含Duddingtonia flagrans的组合物专利的具体信息内容。
1.微生物Duddingtonia flagrans(D.flagrans)的生物学纯的分离株，其具有在澳大利亚，维多利亚3207，墨尔本港，1/153伯蒂街道的国家计量研究院(National Measurement Institute，1/153Bertie Street，Port Melbourne，Victoria 3207，Australia)以保藏号V16/019156保藏的在本文中被称为“IAH1297”的菌株的所有鉴定特征。
2.组合物，其包含权利要求1的分离株。
3.权利要求2所述的组合物，其中菌株IAH 1297以孢子的形式，优选为厚垣孢子的形式存在于所述组合物中，并且其中所述组合物干扰寄生线虫的生活史，控制所述线虫向食草动物的传播，并且适合商业应用。
4.组合物，其包含分离的D.flagrans菌株和/或所述分离的D.flagrans菌株的孢子，其中优选所述孢子是厚垣孢子，其中所述组合物干扰寄生线虫的生活史，控制线虫向食草动物的传播，并且适合商业应用。
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5.权利要求2-4中任一项所述的组合物，其包含至少约1 x 10个活孢子/克组合物的活D.flagrans孢子计数。
6.权利要求2-5中任一项所述的组合物，其包含1 x 102至1 x 1010个活孢子/克组合物的活D.flagrans孢子计数。
7.权利要求6所述的组合物，其包含1 x 103至1 x 108个活孢子/克组合物的活D.flagrans孢子计数。
8.权利要求2-7中任一项所述的组合物，其中所述组合物是包括所述D.flagrans的菌丝体和/或所述D.flagrans的孢子的孢子浓缩物的形式，其中优选所述孢子是厚垣孢子。
9.权利要求2-8中任一项所述的组合物，其中所述D.flagrans菌株和/或所述分离的D.flagrans菌株的孢子通过固体基质发酵方法产生，其中优选所述固体基质是湿润的谷物，豆类或油料种子。
10.权利要求9所述的组合物，其中所述谷物选 自黑麦、粟、稻、大麦、小麦、高粱、黑小麦和燕麦。
11.权利要求9所述的组合物，其中所述豆类选 自小扁豆和羽扇豆。
12.权利要求9所述的组合物，其中所述油料种子选自大豆、油菜、红花、向日葵和芝麻。
13.权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中发酵的基质被干燥以产生所述组合物，其中所述发酵的基质包括所述D.flagrans的菌丝体和/或所述D.flagrans的孢子，优选所述孢子是厚垣孢子。
14.权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中将所述组合物与赋形剂和/或载体混合。
15.权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于口服递送至食草动物。
16.权利要求2-15中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于施用给食草动物，并且其中所述组合物包含的D.flagrans的量为1 x 102至1 x 1010个活孢子/克组合物。
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17.权利要求16所述的组合物，其中所述组合物包含的D.flagrans孢子的量为1 x 10至1x 108个活孢子/克组合物。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述组合物包含的D.flagrans孢子的量为约
5x105个活孢子/克组合物。
19.权利要求17所述的组合物，其中所述组合物包含的D.flagrans孢子的量为约3x104个活孢子/克组合物。
20.权利要求16-19中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于施用给食草动物，并且其山所述组合物是单位剂型形式，所述单位剂型形式提供D.flagrans活孢子量/Kg食草动物体重/天。
21.权利要求2至20中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含氧化铜线颗粒(COWP)。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述组合物提供的元素铜的量为0.05-0.15g/Kg食草动物体重/天。
23.权利要求22所述的组合物，其中所述组合物提供的元素铜的量为约0.085g/Kg食草动物体重/天。
24.权利要求2-23中任一项的组合物，其还包含任何一种或多种有用于减少食草动物的寄生线虫(蠕虫负荷)的材料。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述一种或多种材料各自选自由以下组成的组：单宁，一种或多种驱肠虫剂，一种或多种其他食线虫真菌，氧化铜线颗粒(COWP)矿物质，硅藻土，草药，农业副产品，一种或多种细菌和疫苗。
26.权利要求2-25中任一项所述的组合物，其中所述组合物与饲料、饲料补充剂或兽药组合物或其组合混合，或是饲料、饲料补充剂或兽药组合物或其组合的形式。
27.权利要求26所述的组合物，其中所述饲料，饲料补充剂或兽药组合物为松散混合物、液体饲料、小丸、舔块、矿物质补充剂、惰性补充剂或大丸剂的形式。
28.权利要求2-27中任一项所述的组合物在制备用于控制寄生线虫向食草动物传播的饲料，饲料补充剂或兽药组合物中的用途。
29.权利要求2-27中任一项所述的组合物在控制寄生线虫向食草动物的传播中的用途。
30.控制寄生线虫传播的方法，其包括向食草动物施用权利要求2至27中任一项所述的组合物，所述施用的量和时间足以使牧场上食草动物粪便中寄生线虫(蠕虫)幼虫的出现减少至少30％，优选50-100％，更优选70-100％。
31.权利要求30所述的方法，其中将所述组合物向食草动物施用至少一周。
32.权利要求31所述的方法，其中将所述组合物施用2至8周，或8周以上。
33.权利要求30所述的方法，其中施用持续动物的一生。
34.权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述组合物每日施用一至四次。
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35.权利要求29-34中任一项所述的方法，其中施用的量包含包含1 x 10 至5 x 10 个活D.flagrans孢子/Kg体重/天。
36.权利要求35所述的方法，其中施用的量包含1 x 104至1 x 106个活D.flagrans孢子/Kg食草动物体重/天。
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37.权利要求36所述的方法，其中施用的量包含约3 x 10个活D.flagrans孢子/Kg体重/天。
38.用于控制寄生线虫向食草动物传播的综合寄生虫管理程序(IPM)，其中所述IPM程序包括以下：
a)用针对所述寄生线虫有效的驱肠虫剂处理食草动物；
b)任选地将所述食草动物转移到清洁牧场，所述牧场最低限度地被所述寄生线虫的幼虫感染或没有所述寄生线虫的幼虫；和
c)进行权利要求30-37中任一项的方法。
39.权利要求38所述的IPM程序，其中b)中的清洁牧场是通过不在所述牧场放牧达6周或6周以上的时间或通过在所述牧场与另一动物物种交叉放牧来产生。
40.权利要求3-27中任一项所述的组合物，或权利要求28或29所述的用途；或权利要求
30-37中任一项所述的方法；或权利要求38或39所述的IPM程序，其中所述食草动物是家养或非家养动物。
41.权利要求40所述的组合物，或用途，或方法，或IPM程序，其中所述食草动物选自由以下组成的组：马、牛、绵羊、山羊、鹿、羊驼、美洲驼和动物园里的动物。
42.权利要求3-27中任一项所述的组合物，或权利要求28或29中任一项所述的用途，或权利要求30-37中任一项所述的方法，或权利要求38或39山任一项所述的IPM程序，其山所述寄生线虫是以下的线虫中的任何一种或多种：Stronglyus spp.，杯口属(Cyathostomum spp.)，Triodontophorous spp.，毛线属(Trichonema spp.)，食道齿属(Oesophagodontus spp.)，辐首属(Gyalocephalus spp.)，Cylicocylus spp.，Cylicodonotophorus spp.，杯冠线虫属(Cylicostephanus spp.)，筒线属(Gongylonema spp.)，丽线虫属(Habronema spp.)，长刺属(Mecistocirrus spp.)，尖尾线虫属(Oxyuris spp.)，副蛔虫属(Parascaris spp.)，斯氏虫属(Skrjabinema spp.)，类圆线虫属(Strongyloides spp.)，Toxocara spp.，Dictyocaulis spp.，缪勒线虫属(Muellerius spp.)，原圆线虫属(Protostrongylus spp.)，盘尾线虫属(Onchocerca spp.)，副丝虫属(Parafilaria spp.)，腹腔丝虫属(Setaria spp.)，冠丝虫属(Stephanofilaria spp.)，吸吮线虫属(Thelazia spp.)，毛圆线虫属(Trichostrongylus spp.)，古柏线虫属(Cooperia spp.)，仰口线虫属(Bunostomum spp.)，背带线虫属(Teladosagia spp.)，结节线虫属(Oesophagostomum spp.)，细颈线虫属(Nematodirus spp.)，血矛线虫属(Haemonchus spp.)，夏柏线虫属(Chabertia spp.)，鞭虫属(Trichuris spp.)和/或胃线虫属(Ostertagia spp.)。
43.权利要求3-27中任一项所述的组合物，或权利要求28或29中任一项所述的用途，或权利要求30-37中任一项所述的方法，或权利要求38或39中任一项所述的IPM程序，其中所述寄生线虫是以下的一种或多种：捻转胃虫或扭转线虫(血矛线虫属)，毛细线虫或胃毛细线虫(毛圆线虫属)，肠蠕虫或小肠蠕虫(古柏线虫属)和钩虫(仰口线虫属)，黑色泄泻蠕虫(毛圆线虫属)，小和中等棕色胃蠕虫(背带线虫属(胃线虫属))，结节蠕虫(结节线虫属)，胃毛细线虫(毛圆线虫属)，螺纹蠕虫(类圆线虫属)，大口肠蠕虫(夏柏线虫属)，鞭虫(鞭虫属)，细颈肠蠕虫或螺纹颈蠕虫(细颈线虫属)，红蠕虫或大圆线虫(包括圆线虫属(Strongylus spp.)，三齿属(Triodontophorus spp.)和食道齿属)和/或盅口线虫/小圆线虫(包括杯口属，毛线属，辐首属，杯环属(Cylicocyclus spp.)，圆齿属(Cylicodontophorus spp.)和杯冠线虫属)，蛔虫(副蛔虫属)和蛲虫(尖尾线虫属)。
44.权利要求3-27或权利要求40-43中任一项所述的组合物，或权利要求28或29中任一项所述的用途，或权利要求30-37中任一项所述的方法，或权利要求38或39中任一项所述的IPM程序，其中所述寄生线虫对一种或多种驱肠虫剂具有抗性或多重化学抗性。
包含Duddingtonia flagrans的组合物
发明领域
[0001] 本发明涉及一种生物纯的培养物，所述生物纯的培养物包含分离的Duddingtonia flagrans(D.flagrans)菌株IAH 1297(2016年8月2日保藏于澳大利亚，维多利亚3207，墨尔本港，1/153伯蒂街道的国家计量研究院(National Measurement Institute，1/153 Bertie Street，Port Melbourne，Victoria3207，Australia)(保藏号V16/019156))和/或所述分离的D.flagrans菌株的孢子，包含其的组合物，其方法和用途。
[0002] 发明背景
[0003] 寄生线虫(肠蠕虫)仍然是全世界食草动物(具有高度适应草食的消化系统)的健康和福祉的主要威胁。特别是，食草动物以非常高的频率暴露于寄生虫。食草动物在治疗后会再次感染，因为它们由于在感染了蠕虫幼虫的牧场上食草而感染线虫。这些幼虫来自由携蠕虫动物排下的含有大量线虫卵的粪便堆。
[0004] 更具体地，如图1所示，胃肠线虫(GIN)的基本生活史涉及宿主胃肠道中好发部位的成虫，其产生大量卵，所述卵由宿主通过，即在粪便中排出。在粪便块中或在牧场上，卵通常通过两个摄食阶段进一步发育(这种发育期在不同寄生虫物种之间变化并且取决于环境条件)。第一阶段幼虫(L1)蜕皮成第二阶段幼虫(L2)，然后进入非摄食感染性第三阶段幼虫(L3)。L1和L2幼虫以粪便中的有机物为食，而L3幼虫由于从L2阶段保留角质层而无法摄食。角质层作为极端环境条件下的保护鞘，可以延长幼虫的存活期，直到出现进一步发育的最佳条件(Pugh，D.G.等.，Comp Cont Educ Pract Vet 20(1998)：S112)。感染性L3随后从粪便迁移到周围的牧场，在那里它们被其他食草动物摄取，从而传播寄生虫感染。一旦进入宿主，L3外鞘就会响应CO2浓度，温度和pH值的变化，然后到达感染部位。它们经历另外两次蜕皮(L4和L5)并对于大多数常见物种在15-21天内在它们的偏好部位完成至成虫的发育(Vlassoff，A.等.，(2001)New Zealand Veterinary Journal 49：p213-221)。
[0005] 在迁移和建立幼虫/成虫期间，可能对消化道造成直接损害。当宿主对入侵的寄生虫作出反应时，感染部位的炎症也可能造成损害。世界范围内的若干报告表明，这种寄生虫病会给畜牧业带来严重的经济损失，并对动物的健康产生不利影响。腹泻，贫血，体重减轻，繁殖减少，产量下降(例如羊毛质量，奶产量等)，以及增加的发病率和死亡率只是胃肠线虫(GIN)可以造成的破坏性损失中的一部分。全球范围内仅在小型家养反刍动物行业，估计每年的生产损失就达数百万美元。由于影响损失的因素很多，包括管理，营养，环境因素，压力，遗传和并发疾病，很难获得准确的数值(Vlassoff，A.等.，(2001)New Zealand Veterinary Journal 49：p213-221)。仅在澳大利亚，羊和牛的估计损失就达到了10亿澳元，而在全世界范围内则达到了数百亿美元(Roeber等.，(2013)Parasite&Vectors 6：p153)。由Meat&Livestock Australia Limited(Lane等.，(2015)Report B.AHE.0010 ISBN9781741918946)公布的另一项研究估计澳大利亚因体内寄生虫而每年的总损失为：
[0006] 牛9360万澳元(7000万美元/6600万欧元)，每只动物的产量损失为0.44美元至3.59美元
[0007] 绵羊4.36亿澳元(3.27亿美元/3.05亿欧元)，每只动物的产量损失为1.29美元至28.29美元
[0008] 山羊254万澳元(约合190万美元/180万欧元)，每只动物的产量损失为0美元至5.34美元。
[0009] 外来或非家养反刍动物物种，例如长颈鹿，羚羊，鹿，大羚羊，黑貂，印度黑羚，紫羚羊，俄卡皮鹿(okapi)和角马是也表现出GIN感染许多偶蹄动物物种中的一些。GIN感染在自然栖息地中的野生偶蹄动物中并不像在动物园中的圈养偶蹄动物中那样严重和数量众多。圈养的偶蹄动物中GIN数量增加和感染严重程度的原因是由于压力，围栏内缺乏嫩枝叶，增加的载畜率，灌溉和无法关闭展览。由圈养引起的压力条件会降低免疫系统的功能并增加身体对寄生虫和疾病的暴露(Fagiolini，M.(2010)等.，Journal of Zoo and Wildlife Medicine，41(4)：p662-670)。在动物园中，客人必须能够观看围栏内的动物。出于这个原因，嫩枝叶的可用性降低，这使得作为野外天然食枝叶者的动物(例如长颈鹿)代而食草。然而，与家养食草动物相比，难以预测这种被迫“食草动物”的感染程度，因为与在这种条件下提供的食枝叶相比，它将取决于实际食草的程度。
[0010] 在全球范围内，家畜中最重要的胃肠线虫(GIN)寄生虫包括属于以下属的那些：血矛线虫属(Haemonchus)，胃线虫属(Ostertagia)，背带线虫属(Teladorsagia)，毛圆线虫属(Trichostrongylus)，蛔虫属(Ascaris)，细颈线虫属(Nematodirus)，类圆线虫属(Strongyloides)，鞭虫属(Trichuris)，夏柏线虫属(Chabertia)，结节线虫属(Oesophagostomum)，古柏线虫属(Cooperia)和仰口线虫属(Bunostomum)(Yong，W.K.1992.In：Yong，W.K(Ed.)Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology.pp.115-134.CRC Press，Florida，USA)。对于反刍动物，主要物种是血矛线虫属(Haemonchus spp.)，背带线虫属(胃线虫属)(Teladorsagia(Ostertagia)spp.)，古柏线虫属(Cooperia spp.)，和毛圆线虫属(Trichostrongylus spp.)，对于马主要物种是盅口线虫(cyathostomes)，圆线虫属(Strongylus spp.)，韦氏类圆线虫(Strongyloides westeri)，Parascarus equorum，艾氏毛圆线虫(Trichostrongylus axei)和Dictyocaulis arnfeldi。成体线虫将优先栖息于宿主胃肠道的特定区段(参见表1)。
[0011] 表1澳大利亚食草动物的重要线虫，其常用名称及其所在的解剖位置
[0012]
[0013] 在这些寄生物种中，捻转血矛线虫(反刍动物皱胃的寄生虫)在全球经济影响和临床疾病方面非常重要，因为它是一种可以引起动物严重贫血的血液寄生寄生虫并且在全世界在月平均气温为18℃，降雨量为50毫米的地方普遍存在。例如，这种特殊的寄生虫是美国东南部，欧洲和澳大拉西亚以及其他具有高温和高湿度气候的地区的特有寄生虫。https://www.researchgate.net/publication/6904034_Haemonchus_contortus_pa rasite_problem_No_1_from_tropics_-_Polar_Circle_Problems_and_prospects_for_control_based_on_epidemiology。
[0014] 目前，管理食草动物肠道寄生虫的常规方法是化学疗法，即施用旨在杀死引起疾病的寄生线虫的化学试剂。这些化学物质被称为驱肠虫剂。这种方法在世界范围内取得了巨大的成功，但却导致过度依赖这些药物，这反过来又导致耐药性的发展，其正在破坏治疗范式。
[0015] 20世纪60年代和70年代(当化学治疗方案建立时)是药物的普遍可用性和新药物的出现蓬勃发展的时期。然而，该途径已经枯竭，药物治疗的进一步创新前景黯淡(Ihler，C.F.，(2010)Acta Veterinaria Scandinavica，52(Suppl 1)：S24)。通常，在使用5-10年后，对新化学品的耐受性变得明显，如图2所示。最近有抗性以更快的速度发展的案例。例如，在2013年，据报道，在新西兰山羊农场使用两年后，莫奈太尔(monepantel，一种新的驱肠虫剂)对环纹背带线虫(Teladorsagia circumcincta)和蛇形毛圆线虫(Trichostrongylus colubriformis)已经完全无效(Scott，I.等，(2013)Veterinary Parasitology 198(1-2)166-171。由于口服药物的依从性不同，估计的体重以及未知的药代动力学数据导致使用亚治疗剂量。这与过度使用和糟糕的牧场管理一起导致了当前全球的驱肠虫剂抗性问题。
[0016] 化学品的施用还在从受体动物获得的肉和奶制品中产生化学残留物。其还会通过尿液和粪便中的溢出和排泄导致非故意的环境污染。尽管寄生虫的抗性正在增加，但商业化养殖仍然依赖于使用驱肠虫剂。
[0017] 鉴于驱肠虫剂使用的上述问题，在商业环境中，例如在农场和/或动物园中，仍然迫切需要其他防治方法。生物防治方法通过利用具有适合于该目的的生物学特性的微生物剂的能力，提供了无化学防治寄生线虫的手段。近年来出现了食线虫真菌作为家畜寄生线虫的有希望的生物防治剂(Larsen等.，(1997)Veterinary Parasitology72：p479-85；Waller和Faedo，(1996)International Journal for Parasitology 26：p915-925)。许多研究表明，Duddingtonia flagrans(D.flagrans)具有作为防治剂的潜力。D.flagrans是食线虫真菌，适用于捕获和消化寄生于食草动物的线虫(蠕虫)物种的感染性幼虫。真菌的孢子的壁特别厚，因此当喂给食草动物时，它们可以完整地通过其消化道并沉积在它们的粪中。特别地，D.flagrans产生大的在肠道中存活的厚垣孢子(大约20μm)。如上所述，动物也将寄生虫的卵排入其粪中。在粪块中，真菌增殖，捕获和消耗从虫卵中孵出的感染性幼虫，如图3所示。这会干扰蠕虫的生活史，因此，D.flagrans被认为可能用作食草动物寄生虫的生物防治。
[0018] 尽管在过去的20年中已经对D.flagrans在寄生虫的生物防治中的使用进行了大量研究，但是该领域的结果已经证明是令人失望的，以至于没有出现商业产品。特别是，使用各种剂量的D.flagrans的过多饲喂研究突显了与包含适用于食草动物的D.flagrans的商业产品的开发相关的许多问题。2005年进行的一项研究突显了田间试验结果的不一致性，描述了自发摄取获得的功效差异很大，尽管仅在某些群体中观察到功效，但这可能会加重剂量之间的功效差异并且这是环境使用的主要缺陷(Paraud等.，Vet.Res.(2005)36：p157-166)。Waller等.Acta.Vet.Scand.(2006)47：p23-32)描述了在瑞典的三个商业绵羊养殖场进行的试验，以评估在一系列商业养殖操作中对D.flagrans的施用以及商业应用包含D.flagrans的生物产品是否可行。这些试验表明，对于本研究中使用的所有三个农场，在真菌处理中在羔羊的表现方面没有显著的益处。
[0019] Terrill等(Veterinary Parasitology 186(2012)：p28-37)进一步报道了，由于缺乏孢子的商业来源，在一个令人鼓舞的开始之后，南方小反刍动物寄生虫协会(Southern Consortium for Small Ruminant Parasite，SCSRPC)停止了研究诱捕线虫的真菌的工作。此外，在放牧条件下使用D.flagrans是否可行且具有一致的可再现功效，以及长期使用以减少牧场上的胃肠线虫幼虫数量(从而降低感染率和改善动物性能)仍有待观察。实际上，Kumar等发表的进一步评论(J.Parasit.Dis.(2013)37(2)：p151-157)表明迫切需要设计可持续的寄生虫防治策略。此外，虽然最近的实验研究将D.flagrans描述为食草动物中线虫寄生虫的“最有希望的”生物防治剂，但研究人员已经开始研究D.flagrans与其他食线虫真菌的组合(例如，参见Da Silva等.Biomed Res.Intl.(2015)Article ID 474879)。然而，这种组合尚未在商业农场环境和/或动物园中进行测试，并且与单独使用一种生物制剂相比，在不同的野外条件下可能存在更大的再现性和功效问题。
[0020] 如上所述，显示一致的可再现功效地使用D.flagrans来防治牧场上的感染性幼虫遇到了由于在实验条件下获得的结果，在野外试验中和在商业农场环境下获得的结果之间的高度差异而产生的许多困难，以及与发酵和扩大规模以产生商业量的可用产品(即孢子)相关的困难。因此，尽管存在许多描述使用D.flagrans作为生物防治剂的潜力的研究，但所用的菌株都没有成功地产生商业上可获得的产品。仍然需要包含D.flagrans的组合物，其提供对寄生线虫传播和寄生线虫对家畜和牧场感染性的可重复控制，并且适于商业化和/或适用于可持续商业寄生虫防治策略。
[0022] 本发明的目的是克服或改善现有技术治疗的至少一个缺点，或提供有用的备选方案。
[0023] 发明概述
[0024] 尽管本领域在尝试生产包含D.flagrans的生物防治产品方面缺乏成功，但在本发明的工作中，发明人试图鉴定用于适用于商业应用的生物防治组合物的D.flagrans菌株的分离株。本发明人出人意料地发现了分离的D.flagrans菌株，在本申请中称为“IAH 1297”，其具有适合商业应用的特征。本申请的D.flagrans菌株提供了相对于已知菌株的许多优点，如下所述。
[0025] 因此，在第一方面，本发明提供了微生物Duddingtonia flagrans(D.flagrans)的生物学纯的分离株，其具有2016年8月2日在澳大利亚，维多利亚3207，墨尔本港，1/153伯蒂街道的国家计量研究院(National Measurement Institute，1/153 Bertie Street，Port Melbourne，Victoria 3207，Australia)以保藏号V16/019156保藏的菌株(此处称为“菌株IAH 1297”)的所有鉴定特征。
[0026] 对于本领域技术人员显而易见的是，本文所用的术语“生物学纯的分离株”是指分离株与其在自然中发现的或以其他方式相关联的一种或多种成分的环境分离。如本文所用的术语“生物学纯的”或“分离的”不表示微生物的纯化程度。在一个实施方案中，菌株IAH 1297是分离株中存在的唯一的D.flagrans菌株，而在另一个实施方案中，菌株IAH 1297是分离株中存在的唯一微生物。
[0027] 本领域技术人员将清楚，本发明涉及菌株IAH 1297的任何生命形式(参见上文关于D.flagrans的各种生活史阶段的讨论)。优选地，菌株IAH1297呈孢子形式，更优选地，其是厚垣孢子的形式。
[0028] 在第二方面，本发明提供了包含根据第一方面的分离株的组合物。根据本发明的组合物可包含如本文所述的D.flagrans微生物菌株IAH 1297的任何功能部分，包括孢子。优选地，组合物包含所述菌株IAH 1297的孢子，更优选地，孢子是厚垣孢子的形式。
[0029] 另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含分离的D.flagrans菌株和/或所述分离的D.flagrans菌株的孢子(优选所述分离的D.flagrans菌株的厚垣孢子)，其中所述组合物干扰食草动物寄生线虫的生活史，控制线虫的传播，并且适合商业应用。
[0030] 本发明的组合物可用作生物防治组合物，以干扰感染食草动物的寄生线虫的生活史。所述生物防治组合物控制线虫的传播并且适用于商业应用。
[0031] 不受任何特定理论的束缚，认为当将本发明的组合物喂给食草动物时，D.flagrans的厚壁孢子(优选厚垣孢子)保持惰性，抵抗消化并且通过消化道，最终排入粪便。组合物的D.flagrans孢子在粪便中萌发并形成捕获寄生线虫的幼虫的捕获器官并杀死它们从而干扰食草动物中寄生线虫的生活史。这通过减少粪便中出现的幼虫数量来控制来自牧场上粪便的线虫的传播。通过控制粪便中幼虫的出现，本发明的组合物控制食草动物的寄生线虫的传播，从而降低寄生线虫的感染性。幼虫包括例如L1，L2和/或L3幼虫。优选地，该组合物减少从粪肥和/或牧场出现的L3幼虫。因此，本领域技术人员显而易见的是，术语“控制线虫的传播”包括控制食草动物的寄生线虫的传播。还应理解，控制食草动物中寄生虫的传播意味着降低寄生线虫的感染性，由此病原体的群体低于阈值水平，其中临床问题和/或牲畜(食草动物)的经济损失减少。
[0032] 例如，根据本发明的组合物干扰食草动物中寄生线虫的生活史，并且当粪便和/或牧场上的幼虫减少30％至100％，或35％至100％，或40％至100％，或45％至100％，或50％至100％，或55％至100％，或60％至100％，或65％至100％，或70％至100％，或75％至100％，或80％至100％，或85％至100％，或90％至100％，或95％至100％，或约100％时，控制线虫的传播。优选地，根据本发明的组合物干扰食草动物中寄生线虫的生活史，并且当粪便和/或牧场上的幼虫的减少50％至100，更优选70至100％，甚至更优选80至100％时，控制线虫的传播。在一个实例中，根据本发明的组合物干扰食草动物中寄生线虫的生活史，并且当粪便和/或牧场上的幼虫减少约50％，或55％，或60％，或65％，或70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或95％，或100％时，控制线虫的传播。
[0033] 本发明的组合物也是适用于商业应用的组合物，即适用于饲养在农场包括大型商业农场中的动物，和/或饲养在围栏和/或动物园环境中的动物。因此，应当理解，本发明的组合物适合于商业应用，并且可以直接喂给食草动物和/或通过混合到饲料中和/或以饲料补充剂提供，或者本发明的组合物可以是进一步配制并作为饲料，饲料补充剂，大丸剂或兽药组合物提供。饲料或饲料补充剂可以是适于饲喂食草动物的任何形式，包括但不限于松散的混合物，液体饲料/补充剂，小丸或舔块。
[0034] 优选地，本发明的组合物是具有至少一种或多种以下特征的商业产品：
[0035] 特征1：能够以足够大的数量生产以允许部署到商业放牧系统中
[0037] 特点3：受体动物及其人类处理者的安全性。
[0038] 特点4：稳定性和保质期。优选地，生物防治产品在室温(高达30℃)具有至少12个月，或至少18个月或更长的保质期。
[0039] 特征5：合适的物理形式。产品的物理形式应适合其预期的最终用途，即自由流动并易于与动物饲料混合。
[0040] 特征6：适口性-由于该产品用于常规口服施用，其味道和质地是受体动物可接受的。
[0041] 特点7：包装/包装尺寸-希望具有易于在农场处理的和适合最终用途的包装尺寸的坚固包装。
[0042] 特征8：纯度-微生物制剂应以足够纯的形式生产，以便安全地施用给动物。
[0043] 特征9：适用于个体饲喂或分组饲喂情况。有时，食草动物将以个体为基础饲喂。更一般地，食草动物以群体饲喂情况饲喂，例如共用槽。这可能导致胆小动物的采食量受到抑制，而更具攻击性的动物可以消耗超过其份额的情况。
[0044] 尽管对D.flagrans进行了大量研究，但在本发明之前，尚未提供至少具有上述特征1和2的商业产品。在一个实施方案中，所述组合物包含上述特征1至9中的至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种，或至少七种，或至少八种或至少九种。
[0045] 优选地，组合物包含上述特征1，2，3，6和7中的每一个。甚至更优选地，组合物包含上述特征1至9中的每一个。
[0046] 根据标签声明，在大规模生产之后的功效和对农场和/或围栏和/或动物园环境中的动物的性能部分地涉及组合物中D.flagrans的活孢子的量。因此，根据本发明的组合物包含的D.flagrans孢子的活菌计数是至少约1x102个活孢子/克组合物。
[0047] 在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含的D.flagrans孢子的活菌计数是1x 102至1x 1010个活孢子/克组合物。例如，根据本发明的组合物包含的D.flagrans孢子的活菌计数是
[0048] 1x 102至1x 103个活孢子/克组合物，或
[0049] 1x 103至1x 104个活孢子/克组合物，或
[0050] 1x104至1x 105个活孢子/克组合物，或
[0051] 1x 105至1x 106个活孢子/克组合物，或
[0052] 1x 106至1x 107个活孢子/克组合物，或
[0053] 1x 107至1x 108个活孢子/克组合物，或
[0054] 1x 108至1x 109个活孢子/克组合物，或
[0055] 1x 109至1x 1010个活孢子/克组合物。
[0056] 优选地，根据本发明的组合物包含的D.flagrans孢子的活菌计数是1x102至1x 108个活孢子/克组合物。
[0057] 在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含D.flagrans孢子的活菌计数的是[0058] (a)1x 102至5x 106个活孢子/克组合物，或
[0059] 1x 102至1x 106个活孢子/克组合物，或
[0060] 1x 103至1x 106个活孢子/克组合物，或
[0061] 1x 103至5x 105个活孢子/克组合物，或
[0062] 1x 104至5x 105个活孢子/克组合物，或
[0063] 1x 104至1x 105个活孢子/克组合物，或
[0064] (b)1x 104至1x 108个活孢子/克组合物，或
[0065] 1x 104至5x 107个活孢子/克组合物，或
[0066] 1x 104至1x 107个活孢子/克组合物，或
[0067] 1x 105至5x 106个活孢子/克组合物，或
[0068] 1x 105至1x 106个活孢子/克组合物，或
[0069] (c)1x 105至1x 108个活孢子/克组合物，或
[0070] 1x 105至1x 107个活孢子/克组合物，或
[0071] 1x 106至1x 107个活孢子/克组合物。
[0072] 在另一个实例中，根据本发明的组合物包含的D.flagrans孢子的活菌计数是[0073] (a)约1x 102，或约1.5x 102，或约2x 102，或约2.5x 102，或约3x102，或约3.5x 102，或约4x 102，或约4.5x 102，或约5x 102，或约5.5x102，或约6x 102，或约6.5x 102，或约
7x 102，或约7.5x 102，或约8x 102，或约8.5x 102，或约9x 102，或约9.5x 102；或[0074] (b)约1x 103，或约1.5x 103，或约2x 103，或约2.5x 103，或约3x103，或约3.5x
103，或约4x 103，或约4.5x 103，或约5x 103，或约5.5x103，或约6x 103，或约6.5x 103，或约
7x 103，或约7.5x 103，或约8x 103，或约8.5x 103，或约9x 103，或约9.5x 103；或[0075] (c)约1x 104，或约1.5x 104，或约2x 104，或约2.5x 104，或约3x104，或约3.5x
104，或约4x 104，或约4.5x 104，或约5x 104，或约5.5x104，或约6x 104，或约6.5x 104，或约
7x 104，或约7.5x 104，或约8x 104，或约8.5x 104，或约9x 104，或约9.5x 104；或[0076] (d)约1x 105，或约1.5x 105，或约2x 105，或约2.5x 105，或约3x105，或约3.5x
105，或约4x 105，或约4.5x 105，或约5x 105，或约5.5x105，或约6x 105，或约6.5x 105，或约
7x 105，或约7.5x 105，或约8x 105，或约8.5x 105，或约9x 105，或约9.5x 105；或[0077] (e)约1x 106，或约1.5x 106，或约2x 106，或约2.5x 106，或约3x106，或约3.5x
106，或约4x 106，或约4.5x 106，或约5x 106，或约5.5x106，或约6x 106，或约6.5x 106，或约
7x 106，或约7.5x 106，或约8x 106，或约8.5x 106，或约9x 106，或约9.5x 106，或[0078] (f)约1x 107，或约1.5x 107，或约2x 107，或约2.5x 107，或约3x 107，或约3.5x
107，或约4x 107，或约4.5x 107，或约5x 107，或约5.5x 107，或约6x 107，或约6.5x 107，或
7 7 7 7 7 7
约7x 10，或约7.5x 10，或约8x 10，或约8.5x 10，或约9x 10，或约9.5x 10，或[0079] (g)约1x 108，或约1.5x 108，或约2x 108，或约2.5x 108，或约3x108，或约3.5x
108，或约4x 108，或约4.5x 108，或约5x 108，或约5.5x108，或约6x 108，或约6.5x 108，或约
7x 108，或约7.5x 108，或约8x 108，或约8.5x 108，或约9x 108，或约9.5x 108，或[0080] (h)约1x 109，或约1.5x 109，或约2x 109，或约2.5x 109，或约3x109，或约3.5x
109，或约4x 109，或约4.5x 109，或约5x 109，或约5.5x109，或约6x 109，或约6.5x 109，或约
7x 109，或约7.5x 109，或约8x 109，或约8.5x 109，或约9x 109，或约9.5x 109，或约1x 1010个活孢子/克组合物。
7x 102，或约7.5x 102，或约8x 102，或约8.5x 102，或约9x 102，或约9.5x 102；或[0074] (b)约1x 103，或约1.5x 103，或约2x 103，或约2.5x 103，或约3x103，或约3.5x
103，或约4x 103，或约4.5x 103，或约5x 103，或约5.5x103，或约6x 103，或约6.5x 103，或约
7x 103，或约7.5x 103，或约8x 103，或约8.5x 103，或约9x 103，或约9.5x 103；或[0075] (c)约1x 104，或约1.5x 104，或约2x 104，或约2.5x 104，或约3x104，或约3.5x
104，或约4x 104，或约4.5x 104，或约5x 104，或约5.5x104，或约6x 104，或约6.5x 104，或约
7x 104，或约7.5x 104，或约8x 104，或约8.5x 104，或约9x 104，或约9.5x 104；或[0076] (d)约1x 105，或约1.5x 105，或约2x 105，或约2.5x 105，或约3x105，或约3.5x
105，或约4x 105，或约4.5x 105，或约5x 105，或约5.5x105，或约6x 105，或约6.5x 105，或约
7x 105，或约7.5x 105，或约8x 105，或约8.5x 105，或约9x 105，或约9.5x 105；或[0077] (e)约1x 106，或约1.5x 106，或约2x 106，或约2.5x 106，或约3x106，或约3.5x
106，或约4x 106，或约4.5x 106，或约5x 106，或约5.5x106，或约6x 106，或约6.5x 106，或约
7x 106，或约7.5x 106，或约8x 106，或约8.5x 106，或约9x 106，或约9.5x 106，或[0078] (f)约1x 107，或约1.5x 107，或约2x 107，或约2.5x 107，或约3x 107，或约3.5x
107，或约4x 107，或约4.5x 107，或约5x 107，或约5.5x 107，或约6x 107，或约6.5x 107，或
7 7 7 7 7 7
约7x 10，或约7.5x 10，或约8x 10，或约8.5x 10，或约9x 10，或约9.5x 10，或[0079] (g)约1x 108，或约1.5x 108，或约2x 108，或约2.5x 108，或约3x108，或约3.5x
108，或约4x 108，或约4.5x 108，或约5x 108，或约5.5x108，或约6x 108，或约6.5x 108，或约
7x 108，或约7.5x 108，或约8x 108，或约8.5x 108，或约9x 108，或约9.5x 108，或[0080] (h)约1x 109，或约1.5x 109，或约2x 109，或约2.5x 109，或约3x109，或约3.5x
109，或约4x 109，或约4.5x 109，或约5x 109，或约5.5x109，或约6x 109，或约6.5x 109，或约
7x 109，或约7.5x 109，或约8x 109，或约8.5x 109，或约9x 109，或约9.5x 109，或约1x 1010个活孢子/克组合物。
[0081] 更优选地，根据本发明的组合物包含的D.flagrans孢子的活菌计数是
[0082] (a)约1x 104，约3x 104，或约1x 105个活孢子/克组合物；或
[0083] (b)约1x 105，约5x 105，或约1x 106个活孢子/克组合物；或
[0084] (c)约1x 106，约3x 106，或约1x 107个活孢子/克组合物；或
[0085] (d)约3x 106，约1x 107，或约1x 108个活孢子/克组合物。
[0086] 根据适于产生D.flagrans菌株和/或所述分离的D.flagrans菌株的孢子的任何方法制备组合物。优选地，孢子是厚垣孢子。优选地，该方法是一种发酵方法，其提供根据本发明的D.flagrans活孢子/克组合物。在一个实例中，D.flagrans菌株和/或所述分离的D.flagrans菌株的孢子通过固体基质发酵方法产生。优选地，固体基质是润湿的全谷物，豆类(legume)或油料种子。使用的全谷物可以是用于此目的的任何合适的全谷物，包括但不限于大麦，黑麦，粟，稻，小麦，高粱，黑小麦，燕麦，荞麦，苋菜，玉米，藜麦，画眉草(teff)或羽扇豆。固体基质还可包括润湿的豆类，包括但不限于鹰嘴豆，蚕豆(faba/broadbean)，豌豆，小扁豆，羽扇豆或绿豆；或者基质可以是油料种子，包括但不限于大豆，油菜(canola)，红花，向日葵和芝麻种子。例如，该方法可以是实施例2和3中描述的方法。
[0087] 还应理解，组合物可以是任何形式，使得该组合物适合于如本文所述的商业应用。例如，组合物可以是包括D.flagrans的菌丝体和/或D.flagrans的孢子的孢子浓缩物的形式，其中优选孢子是厚垣孢子。例如，当使用固体基质发酵时，可以将全谷物干燥并研磨以产生本发明的组合物，其中所述全谷物包括D.flagrans的菌丝体和/或D.flagrans的孢子，其中优选孢子是厚垣孢子。
[0088] 还预期包括本文所述的孢子浓缩物的根据本文任何方面，实施方案或实施例的组合物可以与饲料，饲料补充剂，大丸剂或兽药组合物混合或被制备成饲料，饲料补充剂，大丸剂或兽药组合物。饲料或饲料补充剂可以是适于饲喂食草动物的任何形式，包括但不限于松散的混合物，液体饲料/补充剂，小丸或舔块(lick block)。
[0089] 另一方面，本发明提供了根据本文任何方面，实施方案或实施例的组合物在制备用于控制寄生线虫在食草动物中的传播的任何形式的饲料，饲料补充剂，大丸剂或兽药组合物中的用途。
[0090] 另一方面，本发明提供了根据本文任何方面，实施方案或实施例的组合物在控制寄生线虫在食草动物中传播中的用途。
[0091] 根据本文任何方面，实施方案或实施例的组合物还可以配制成用于施用以容易地提供D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天的量。在一个实施方案中，将组合物配制成用于施用以提供1x 103个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。在另一个实施方案中，将组合物配制成用于施用以提供
[0092] 1x 103至5x 108个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0093] 1x 103至2.5x 108个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0094] 1x 103至1x 108个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0095] 1x 103至5x 107个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0096] 1x 103至2.5x 107个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0097] 1x 103至1x 107个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0098] 1x 103至5x 106个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0099] 1x 103至2.5x 106个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0100] 1x 103至1x 106个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0101] 1x 103至5x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0102] 1x 103至2.5x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0103] 1x 103至1x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0104] 1x 103至5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0105] 1x 103至2.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0106] 1x 103至1x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0107] 1x 103至9x 103个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。
[0108] 优选地，将组合物配制成用于施用以提供1x 104至1x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。
[0109] 例如，将组合物配制成用于施用以提供：
[0110] 约1x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0111] 约1.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0112] 约2x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0113] 约2.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0114] 约3x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0115] 约3.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0116] 约4x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0117] 约4.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0118] 约5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0119] 约5.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0120] 约6x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0121] 约6.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0122] 约7x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0123] 约7.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0124] 约8x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0125] 约8.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0126] 约9x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0127] 约1x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。
[0128] 更优选地，将组合物或生物防治产品配制成用于施用以提供约1x104，约3x 104或5
约1x 10个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。最优选地，将组合物或生物防治产品配制成用于施用以提供约3x 104个活孢子/Kg食草动物体重/天的D.flagrans活孢子量。还应理解，可以将本发明的组合物配制成用于施用以提供如期望的组合物的标准量，其中每天提供上述量的活孢子。
约1x 10个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。最优选地，将组合物或生物防治产品配制成用于施用以提供约3x 104个活孢子/Kg食草动物体重/天的D.flagrans活孢子量。还应理解，可以将本发明的组合物配制成用于施用以提供如期望的组合物的标准量，其中每天提供上述量的活孢子。
[0129] 还预期可以将“另外的组分”添加到本发明的组合物中，其也控制寄生动物在食草动物中的传播，例如，提供“双击”效应的组分。这些另外的组分包括但不限于对线虫有效的驱肠虫剂(例如阿巴克丁(abamectin)，伊维菌素(ivermectin)，双羟萘酸噻嘧啶，硫酸石榴皮碱)；或例如苯并咪唑类(benzimidazoles，BZ)，其也是杀卵的(具有针对肠线虫和绦虫传递的卵的活性)，大环内酯类(macrocyclic lactones，ML)，咪唑并噻唑类(imidazothiazoles)和四氢嘧啶类(tetrahydropyrimidines，LV)，水杨酰苯胺(salicylanilides)，硝唑尼特(nitazoxanide)，吡喹酮(praziquantel)，octadesipeptide(例如emodepside)，得曲恩特(derquantel)(螺吲哚)和氨基乙腈衍生物(AAD)(其有效对抗其他蠕虫)，其他食线虫真菌(如Purpureocillium lilacinum，Stopharia rugosoannulata或Coprinus comatus)，单宁，矿物质，硅藻土，草药，农业副产品，疫苗或氧化铜线颗粒(copper oxide wire particle，COWP)或其组合。根据另一方面，本发明提供根据本文任何方面，实施方案或实施例的组合物，其进一步包含来自以下组的一种或多种组分：一种或多种驱肠虫剂，一种或多种其他食线虫真菌，氧化铜线颗粒(COWP)，单宁，矿物质，硅藻土，草药，农业副产品，一种或多种细菌或疫苗。基于可获得的科学和商业(产品特异性)文献以及技术人员自己的普通常识，技术人员将清楚这些其他组分的合适剂量。在一个实施方案中，组合物还包含COWP。例如，COWP可以以适于以约10g/100Kg待处理动物体重的剂量施用给动物的量存在于本发明的组合物中。
[0130] 另一方面，本发明提供了控制寄生线虫在食草动物中的传播的方法，其包括以足以将牧场的寄生线虫(蠕虫)负担降低至少约30％的量和时间施用本文任何方面，实施方案或实施例的组合物。例如，施用组合物的量和时间足以将牧场的寄生线虫(蠕虫)的负担降低30％至100％，或35％至100％，40％至100％，或45％至100％，或50％至100％，或55％至100％，或60％至100％，65％至100％，或70％至100％，或75％至100％，或80％至100％，或
85％至100％，或90％至100％，95％至100％，或约100％。优选地，施用组合物的量和时间足以将牧场的寄生线虫(蠕虫)负荷降低50％至100％，更优选60％至100％。
85％至100％，或90％至100％，95％至100％，或约100％。优选地，施用组合物的量和时间足以将牧场的寄生线虫(蠕虫)负荷降低50％至100％，更优选60％至100％。
[0131] 本领域技术人员显而易见的是足以降低牧场的寄生线虫(蠕虫)负担的时间可根据食草动物的类型，动物的健康状况和/或体重和/或牧场条件，一年中的时间，温度和/或气候而变化并且将由用户或其技术顾问确定。
[0132] 由于对化学驱肠虫剂的抗性和多重抗性的发展，全世界的科学家建议使用粪便卵数(FEC)来指示哪些食草动物需要驱虫以及何时需要驱虫。还建议不时进行粪便卵数减少试验(FECRT)，以检查使用的驱肠虫剂是否有效和/或通过使用粪便幼虫培养物(FLC)鉴定蠕虫种类。
[0133] http://journals.plos.org/plosone/article？id＝10.1371/journal.pone.0037327。
[0134] 例如，足以降低牧场的寄生线虫(蠕虫)负担的时间为至少一周，或至少2周，或至少3周，或至少4周，或至少5周，或至少6周，或至少7周，或至少8周，或至少9周，或至少10周，或1至26周，或1至15周，或1至10周，或1至8周，或1至6周，或1至5周，或1至4周，或1至3周，或2至15周，或2至10周，或2至8周，或2至6周，或2至5周，或2至4周，或2至3周。优选地，足以降低牧场的寄生线虫(蠕虫)负担的时间在2至26周。在本发明的一个实施方案中，时间为12至
20周，特别是12至16周。
20周，特别是12至16周。
[0135] 预期根据本文任何方面，实施方案或实施例的本发明组合物可以施用任何时间长度，甚至在牧场的寄生线虫(蠕虫)负荷降低之后。例如，组合物可以施用至少一周，或者可以无限期地施用。
[0136] 本领域技术人员还显而易见的是，根据本发明的方法，足以降低牧场的寄生线虫(蠕虫)负担的量是施用给食草动物的组合物中包含的D.flagrans活孢子的量并且将根据动物的体重而变化，并由用户或其技术顾问确定。
[0137] 在一个实施方案中，根据本发明的方法，施用的量包含至少约1x 103个活孢子/Kg食草动物体重/天的D.flagrans活孢子。在另一个实施方案中，根据本发明的方法，施用的量包含以下范围的D.flagrans活孢子
[0138] 1x 103至5x 108个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0139] 1x 103至2.5x 108个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0140] 1x 103至1x 108个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0141] 1x 103至5x 107个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0142] 1x 103至2.5x 107个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0143] 1x 103至1x 107个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0144] 1x 103至5x 106个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0145] 1x 103至2.5x 106个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0146] 1x 103至1x 106个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0147] 1x 103至5x 105个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0148] 1x 103至2.5x 105个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0149] 1x 103至1x 105个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0150] 1x 103至5x 104个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0151] 1x 103至2.5x 104个活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0152] 1x 103至1x 104个活孢子/Kg食草动物体重/天。
[0153] 例如，根据本发明的方法，施用的量包含以下的D.flagrans活孢子
[0154] 约1x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0155] 约1.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0156] 约2x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0157] 约2.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0158] 约3x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0159] 约3.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0160] 约4x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0161] 约4.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0162] 约5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0163] 约5.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0164] 约6x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0165] 约6.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0166] 约7x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0167] 约7.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0168] 约8x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0169] 约8.5x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0170] 约9x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天，或
[0171] 约1x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。
[0172] 优选地，根据本发明的方法，施用的量包含约1x 104至1x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。更优选地，施用量包含约1x 104，约3x 104或约1x 105个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。最优选地，施用量包含约3x 104个D.flagrans活孢子/Kg食草动物体重/天。I
[0173] 在另一方面，本发明提供了用于控制食草动物寄生线虫传播的综合寄生虫管理程序(IPM)，其中所述IPM程序包括以下：
[0174] a)用对寄生线虫有效的驱肠虫剂处理食草动物；
[0175] b)如果可能的话，将食草动物转移到清洁的牧场，这种牧场最低限度地被寄生线虫的幼虫感染或没有寄生线虫的幼虫；和
[0176] c)通过执行根据本文任何方面，实施方案或实施例的方法来施用组合物。
[0177] 本领域技术人员清楚的是，任何可用于治疗寄生线虫的驱肠虫剂都可用于治疗食草动物。特别地，例如，阿巴克丁(abamectin)，伊维菌素(ivermectin)，双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)和硫酸石榴皮碱(pelletierine sulphate)在本发明中是有用的驱肠虫剂。在20世纪50年代引入吩噻嗪之后，使用化学驱肠虫剂实现了对胃肠道寄生虫的控制，并且主要依赖于用属于三种主要化学类别的广谱杀寄生虫剂治疗：苯并咪唑类(BZ)，大环内酯类(ML)和咪唑并噻唑类/四氢嘧啶类(LV)。虽然已经开发了一些驱肠虫剂，包括得曲恩特(derquantel)(螺吲哚)和莫奈太尔(monepantel)(氨基乙腈衍生物，AAD)，但在过去二十年中，成功发现新型驱肠虫剂受到限制。上述驱肠虫剂可以作为其一种或多种的组合施用。合适的驱肠虫剂剂量对于本领域技术人员来说是清楚的，并且取决于通常的参数，例如驱肠虫剂的性质，动物物种，动物的体重，动物或群体的化学抗性状态和气候条件等。
[0178] 对于本领域技术人员显而易见的是，可以根据任何方法产生前一方面的b)中的清洁牧场。优选地，如果可能的话，b)中的清洁牧场是通过不用同一物种在牧场放牧达约6周或更长的时间来产生的。
[0179] 本领域技术人员将理解，“生物防治”是指通过引入天敌或捕食者来控制害虫。
[0181] 与本申请的实施例和文本一致，本领域技术人员将理解，在本发明的上下文中，当提及名词(例如，孢子)的单数形式时，复数也被考虑。具体地，例如，包含孢子的组合物包括含有许多孢子的组合物。作为另一个例子，提及动物的治疗包括治疗一群动物或任何其他集体组。
[0182] 根据本文的任何方面，实施例或实施方案的术语“食草动物”包括任何外来(非家养)或家养的食草动物，并且包括但不限于外来(非家养)和家养反刍动物。例如，家养的食草动物选自但不限于马，山羊，绵羊，牛，鹿和骆驼科动物(例如羊驼和美洲驼)。在另一个实例中，非家养或外来动物选自偶蹄动物物种，包括但不限于长颈鹿，羚羊，鹿，大羚羊，黑貂，印度黑羚，紫羚羊，俄卡皮鹿和角马。优选地，根据本发明的外来动物是圈养在围栏(例如动物园)内。在另一个实例中，食草动物选自动物，包括但不限于单胃动物，反刍动物，骆驼科动物和假反刍动物(家养或非家养或外来动物)。在另一个实例中，食草动物选自家养或野生动物。
[0183] 还应理解，根据本文任何方面，实施例或实施方案的术语“寄生线虫”包括已知或随后发现感染食草动物的任何寄生线虫。例如，寄生线虫是Stronglyus spp.，杯口属(Cyathostomum spp.)，Triodontophorous spp.，毛线属(Trichonema spp.)，食道齿属(Oesophagodontus spp.)，辐首属(Gyalocephalus spp.)，Cylicocylus spp.，Cylicodonotophorus spp.，杯冠线虫属(Cylicostephanus spp.)，筒线属(Gongylonema spp.)，丽线虫属(Habronema spp.)，长刺属(Mecistocirrus spp.)，尖尾线虫属(Oxyuris spp.)，副蛔虫属(Parascaris spp.)，斯氏虫属(Skrjabinema spp.)，类圆线虫属(Strongyloides spp.)，Toxocara spp.，Dictyocaulis spp.，缪勒线虫属(Muellerius spp.)，原圆线虫属(Protostrongylus spp.)，盘尾线虫属(Onchocerca spp.)，副丝虫属(Parafilaria spp.)，腹腔丝虫属(Setaria spp.)，冠丝虫属(Stephanofilaria spp.)，吸吮线虫属(Thelazia spp.)，毛圆线虫属(Trichostrongylus spp.)，古柏线虫属(Cooperia spp.)，仰口线虫属(Bunostomum spp.)，背带线虫属(Teladosagia spp.)，结节线虫属(Oesophagostomum spp.)，细颈线虫属(Nematodirus spp.)，血矛线虫属(Haemonchus spp.)，夏柏线虫属(Chabertia spp.)，鞭虫属(Trichuris spp.)和/或胃线虫属(Ostertagia spp)的线虫中的任何一种或多种。
[0184] 优选地，根据本文任何方面，实施例或实施方案的寄生线虫是捻转胃虫(Barber’s Pole Worm)或扭转线虫(Wire Worm)(血矛线虫属)，毛细线虫(Hairworm)或胃毛细线虫(Stomach Hairworm)(毛圆线虫属)，肠蠕虫(Intestinal Worm)或小肠蠕虫(Small Intestinal Worm)(古柏线虫属)和钩虫(Hookworm)(仰口线虫属)，黑色泄泻蠕虫(Black Scour Worm)(毛圆线虫属)，小和中等棕色胃蠕虫(Small and Medium Brown Stomach Worm)(背带线虫属(胃线虫属)物种)，结节蠕虫(Nodule Worm)(结节线虫属)，胃毛细线虫(Stomach Hair Worm)(毛圆线虫属)，螺纹蠕虫(Thread Worm)(类圆线虫属)，大口肠蠕虫(Large Mouthed Bowel Worm)(夏柏线虫属)，鞭虫(Whipworm)(鞭虫属)，细颈肠蠕虫(Thin Necked Intestinal Worm)或螺纹颈蠕虫(Thread Necked Worm)(细颈线虫属)，红蠕虫(Redworms)或大圆线虫(Large Strongyles)(包括圆线虫属(Strongylus spp.)，三齿属(Triodontophorus spp.)和食道齿属)和/或盅口线虫(Cyathostomes)/小圆线虫(Small Strongyles)(包括杯口属，毛线属，辐首属，杯环属(Cylicocyclus spp.)，圆齿属(Cylicodontophorus spp.)和杯冠线虫属)，蛔虫(Ascarids)(副蛔虫属)和蛲虫(Pinworm)(尖尾线虫属)中的一种或多种。
[0185] 在一个或多个实施方案中，本发明提供以下优点：
[0186] ·D.flagrans，特别是D.flagrans IAH 1297，不被宿主动物吸收。
[0187] ·D.flagrans，特别是D.flagrans IAH 1297，活着通过肠道并进入粪便。
[0188] ·D.flagrans，特别是D.flagrans IAH 1297，保持孢子形式(作为厚垣孢子)直到环境条件适合于线虫变得活跃，然后在粪便中萌发，在粪便中蠕虫幼虫被捕获，丧失活动能力和被消耗。
[0189] ·D.flagrans IAH 1297含有少量或不含不期望的代谢物。它具有非常低水平的flagranone A，不可检测水平的flagranone B和不可检测水平的flagranone C。因此该生物体落在当前欧洲的这些物质的安全阈值之下。
[0190] ·根据本发明使用，D.flagrans，特别是D.flagrans IAH 1297，有效地破坏蠕虫的生活史。
[0191] ·根据本发明使用，D.flagrans，特别是D.flagrans IAH 1297对具有抗驱肠虫剂抗性和多抗性的蠕虫是有效的。
[0193] 在整个说明书中，除非另外特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤，物质组合物，步骤组或物质组合物组应包括一个和多个(即一个或多个)这些步骤，物质组合物，步骤组或物质组合物组。
[0195] 本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文描述的发明易于进行变化和修改。应理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤，特征，组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。
[0196] 本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围，这些实施方案仅用于举例说明的目的。如本文所述，功能等同的产品，组合物和方法显然在本发明的范围内。
[0197] 缩写列表：
[0198] GIN-胃肠线虫
[0199] EP-最终用户产品
[0200] MP-碾磨产品
[0201] TGAI-技术级活性成分
[0202] LOQ-定量限
[0203] LOD-检测限
[0204] HPLC-高效液相色谱
[0205] UV-紫外线
[0206] IPM-综合害虫管理
[0207] FEC-粪便卵计数
[0208] FECRT-粪便卵计数减少试验
[0209] FLC-粪便幼虫培养物
[0211] 图1：显示食草动物中胃肠线虫基本生活史的示意图。
[0212] 图2：显示化学抗性的发展的示意图。该图指示各种化学物质的引入年份，R表示第一次记录到抗性的年份Waller，P.J.，Acta Tropica56(1994)233-243。抗微生物剂：SULHPA；磺胺类，PEN，青霉素；STREP，链霉素。杀昆虫剂：DDT，二氯二苯三氯乙烷(dicophane)；CYCLO，环二烯类；OP，有机磷酸酯；SP，合成拟除虫菊酯。杀真菌剂：AH，芳烃；
DOD，多果定(dodine)；BZ，苯并咪唑类；DCB，二酰胺类。驱肠虫剂：BZ，苯并咪唑类；LEV，左旋咪唑；AVM，阿弗菌素(avermectins)。
DOD，多果定(dodine)；BZ，苯并咪唑类；DCB，二酰胺类。驱肠虫剂：BZ，苯并咪唑类；LEV，左旋咪唑；AVM，阿弗菌素(avermectins)。
[0213] 图3：显示由D.flagrans捕获的线虫幼虫的示意图。幼虫被捕获在由许多强弧组成的粘网中。在接触部分，寄生虫体被穿透，由此真菌菌丝延伸出来生长并填充线虫体以有效杀死线虫。内部器官最终溶解和吸收。虚线显示寄生虫内的真菌菌丝体。
[0214] 图4a：测量粪便卵计数(FEC)的方法。
[0215] 图4b：粪便卵计数减少测试(FECRT)的方法
[0216] 图5： 的产品信息
[0217] 图6：使用如实施例7和表3中所述的本发明组合物的牛野外试验结果(牛试验1)的图形表示。
[0218] 图7：使用如实施例7和表3中所述的本发明组合物的牛野外试验结果(牛试验2)的图形表示。
[0219] 图8：使用如实施例7和表3中所述的本发明组合物的山羊野外试验结果(山羊试验1)的图形表示。
[0220] 图9：使用如实施例7和表3中所述的本发明组合物的山羊野外试验结果(山羊试验2)的图形表示。
[0221] 图10：使用如实施例7和表3中所述的本发明组合物的山羊野外试验结果(山羊试验3)的图形表示。
[0222] 图11：使用如实施例7和表3中所述的本发明组合物的马野外试验结果(马试验1)的图形表示。
[0223] 图12：使用如实施例7和表3中所述的本发明组合物的马野外试验结果(马试验2)的图形表示。
[0224] 图13：使用如实施例7和表4中所述的本发明组合物的马野外试验结果(马试验3)的图形表示。
[0225] 图14：使用如实施例7和表4中所述的本发明组合物的绵羊野外试验结果(绵羊试验1)的图形表示。
[0226] 图15：使用如实施例7和表4中所述的本发明组合物的绵羊田间试验结果(绵羊试验2)的图形表示。
[0227] 图16：使用如实施例7和表4中所述的本发明组合物的绵羊野外试验结果(绵羊试验3)的图形表示。
[0228] 图17：使用如实施例7和表4中所述的本发明组合物的绵羊野外试验结果(绵羊试验4)的图形表示。
[0229] 优选实施方案详述
[0230] 现在将参考描述具体组合物和使用方法的具体但非限制性实施例更详细地描述本发明。然而，应理解的是包括具体程序，组合物和方法的详细描述仅用于举例说明本发明。不应以任何方式理解为对如上所述的发明构思的广泛描述的限制。
[0231] 实施例1
[0232] D.flagrans的分离，培养和表征
[0233] 发明人试图鉴定有用于开发组合物或生物防治产品的进一步工作的D.flagrans分离株。不受任何特定理论的束缚，理想的是合适的分离株表现出相对快速和丰富的生长，产生大量的厚垣孢子以便于扩大规模，具有高的捕获能力以最有效释放，易于监测作为生物防治剂的释放，对非靶标生物没有负面影响。
[0234] 检测了二十五个分离株，发现D.flagrans IAH 1297与其他分离株相比具有良好的生长速率和厚垣孢子产量，高捕获效率和在谷物基质上的良好生长。基于这些特征，将D.flagrans IAH 1297分离株命名为根据本发明的分离的D.flagrans IAH 1297菌株，并根据布达佩斯条约的要求于2016年8月2日保藏于澳大利亚，维多利亚3207，墨尔本港，1/153伯蒂街道的国家计量研究院(National Measurement Institute，1/153 Bertie Street，Port Melbourne，Victoria 3207，Australia)。
[0235] 仅作为非限制性实施例，使用以下测定来确定这些参数。
[0236] 真菌分离株
[0237] 从源自野外调查的原始培养物中获得真菌分离株，以根据Larsen等.，1994(Veterinary Parasitology 53：275-281)中描述的方法检测粪便，堆肥和土壤样品中的食线虫真菌的存在，并且随后添加到CSIRO培养物保藏。使用下文概述的程序从亲本储料中取亚培养物并保持在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上以获得纯度和生存力。
[0238] 培养程序
[0239] 将长期培养物保持在100％PDA McCartney瓶斜面中。这些是使用市售的PDA DifcoTM根据制造商的说明制备的。然后将10mL PDA混合物分配到McCartney瓶中。将盖子松散地放在瓶子上并在121℃高压灭菌21分钟。在仍然很热的时候，将盖子拧紧，将瓶子以45°角放置，然后让其冷却并固化。然后使用无菌细菌环将孢子接种物从亲本培养物转移到McCartney瓶琼脂表面。McCartney瓶根据培养基类型，真菌培养物ID和接种日期进行标记，并储存在4℃的冰箱中以备将来使用。
[0240] 将源自长期培养物的短期培养物保持在PDA平板(直径6cm)上。如上制备马铃薯葡萄糖琼脂，并在1L pyrex瓶中在121℃高压灭菌21分钟。在仍然热的同时，将2mL抗细菌剂(其含有100mg/mL盐酸土霉素)加入琼脂中并通过倒置混合。然后在层流柜中倒板，确保完全覆盖培养皿约6mm的深度。然后将它们冷却并固化，然后在4℃储存直至使用。使用无菌手术刀片，切割含有真菌培养物的3mm×3mm琼脂切片并置于新PDA平板的中心。然后用 密封平板以防止干燥，并在27℃孵育7-10天。平板用真菌ID标记并标注日期。
[0241] 温度
[0242] 评估D.flagrans分离株。测试了五种恒温方案：12℃，17℃，22℃，27℃和32℃。每个处理的三个重复的1％马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)板(直径6cm)用2mm×2mm琼脂塞接种，所述琼脂塞用无菌手术刀片从1％PDA上生长的1-2周龄真菌培养物的菌落边缘切割，并置于测试琼脂平板的中心。将每个处理在已经校准至所期望温度的Gallenkamp温控培养箱中孵育14天(或下文中另外指出的天数)。在整个实验中，每个柜内的温度变化+/-2℃。每天计算径向生长测量和厚垣孢子计数。
[0243] 径向生长
[0244] 每天在立体解剖显微镜下以10X放大率测量径向生长。通过测量从琼脂塞边缘到菌丝体生长边缘的距离(mm)(以相反方向测量两次)来计算径向生长。其中一个方向是随机选择的。生长速率计算为菌丝体到达平板外周所用的天数。
[0245] 厚垣孢子计数
[0246] 通过在立体解剖显微镜下以10X放大率在琼脂板下方放置分成2mm2正方形的6cm2网格来测定厚垣孢子数。网格包含5个随机标记的2mm2正方形，距离中心塞大约12-14mm，计算这五个区域中的厚垣孢子数，并计算每cm2的厚垣孢子数。
[0247] 统计分析
[0248] 在每个温度使用Statgraphic软件(Statgraphics Centurion XV，2006)进行Tukey事后检验的方差分析，以评估到达培养皿周所花费的天数之间的差异，并且还确定分离株之间的生长速度之间的差异。除了第一次孢子产生所用的天数之外，使用相同的过程来确定分离株之间孢子产生速率之间的差异。
[0249] 捕获效率
[0250] 用于测量捕获效率的真菌接种物
[0251] 由来源于野外调查(Larsen等.，1994 Veterinary Parasitology 53：275-281)的原始培养物获得D.flagrans的真菌分离株，并随后添加到CSIRO。使用上述方法从亲本储料中取亚培养物并保持在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上。使用的孢子材料在如下文实施例2中所6
述的大麦基质上生长，并以1x 10厚垣孢子/g粪便的浓度添加到粪便培养物中。
述的大麦基质上生长，并以1x 10厚垣孢子/g粪便的浓度添加到粪便培养物中。
[0252] 粪便培养物
[0253] 从F.D.McMaster Laboratory-Chiswick，Armidale，NSW的CSIRO畜舍中的无蠕虫感染和蛇形毛圆线虫(Trichostrongylus colubriformis)感染的绵羊收集粪便材料，目的是维持蠕虫库存。将粪便收集在通过粪便收集带连接到绵羊臀部的袋子中并放置过夜。给绵羊喂食800g/天的饲料小丸，其组成为(g/kg)：苜蓿500，小麦100，糠200，麸皮175，盐20和氯化铵5。用单次口服剂量的20,000个第三阶段蛇形毛圆线虫幼虫感染蠕虫感染的绵羊。通过肌内注射每周向感染的绵羊施用0.25-0.5mg/10kg皮质类固醇“IliumTroy Troy Laboratories Pty Ltd”，以部分抑制免疫系统以帮助维持蠕虫感染。
[0254] 使用改良的McMaster技术(Whitlock，1948 Journal of the Council for Scientific and Industrial Research 21：177-180)估算粪便卵计数。将含有蠕虫卵的粪便与无蠕虫粪便混合，形成粪便混合物，其卵计数约为2,500个卵/g。
[0255] 将二十五克粪便在聚苯乙烯泡沫塑料(Styrofoam)杯中与约7-10g蛭石混合(取决于最初的粪便稠度)以产生湿润的疏松结构，然后将该绵羊粪便混合物转移至500g培养罐(M.R.Knox pers.comm.)中。对于每种分离株，使用五个重复的培养罐，并将分离株的厚垣孢子加入到含有绵羊粪便混合物的每个重复培养罐中。彻底混合后，轻轻压缩粪便混合物以产生均匀的稠度。然后向每个罐中加入约10mL蒸馏水以保持湿度。类似地制备五个重复对照培养物，不添加孢子材料。然后将培养罐在20℃孵育10天。
[0256] 孵育后，将培养罐装满蒸馏水，并将20cm直径的培养皿置于罐的顶部。然后将罐倒置，将培养皿中的一半充满蒸馏水并在室温下放置48小时。然后通过将水从培养皿滗析入50mL收集管中并使其达到50mL的体积来收集所有第三阶段幼虫(L3)。加入福尔马林，终浓度为1-2％，然后将50mL幼虫溶液在55-57℃加热约1分钟以杀死幼虫(Van Wyk等.2004Veterinary Parasitology 119：277-306)。通过在显微镜载玻片上取每个样品的5个重复100μL等分试样并在100x放大倍数下计数来计数幼虫。如果计数的幼虫小于10个/100μL等分试样，则将幼虫静置至少3小时，然后吸去多余的液体，浓缩至5mL的体积，然后如所述重复计数。
[0257] 实施例2
[0258] 固体基质发酵方法/分析
[0259] 仅作为非限制性实施例，可以使用以下固体基质发酵方法生产D.flagrans。
[0260] 用于谷物基质的液体接种物的制备
[0261] 使用1％酵母提取物，0.5％KH2PO4，0.1％NaNO3，0.05％MgSO4.7H2O和2％可溶性淀粉制备液体培养基。使用0.1M HCl将pH调节至6.5，并在标准液体条件下在高压釜中灭菌。然后将液体培养基冷却至约25℃。冷却后，在1.5L锥形瓶中的250mL液体培养基中接种8片相同的1/4(直径10cm)平板的D.flagrans的7天PDA培养物，并在轨道振荡器上在28℃以
200rpm孵育7天。
200rpm孵育7天。
[0262] 固体基质制备和发酵
[0263] 对于每种基质，将三份50g谷物样品称重到250mL锥形瓶中。然后将样品用水以所需总体积的1/3的速率润湿以达到40％的基质水分(参见图3.1，3.2和3.3)并充分混合。将样品在室温静置过夜(16小时)。16小时后，将烧瓶用脱脂棉塞住并用箔覆盖。然后将烧瓶在标准液体条件下高压灭菌。然后将烧瓶转移到层流柜中并冷却至室温。冷却后，使用灭菌的量筒用最终体积的液体接种物接种烧瓶，获得40％的基质水分。在粟的情况下，这是24mL的液体接种物；对于羽扇豆，它是24mL液体接种物加1mL无菌水；对于大麦，它是24mL液体接种物加4mL无菌水。向羽扇豆和大麦的接种物中加入无菌H2O是为了确保每个烧瓶中加入等量的真菌接种物，同时保持基质水分为40％。将接种的培养物静置，然后在24小时后轻轻混合，以确保所有游离水分都被谷物吸收。孵育一周后，通过剧烈摇动烧瓶打散基质。将其在20℃进一步孵育25天。
[0264] 干燥程序
[0265] 孵育后，通过在烧瓶中充分摇动打散发酵的谷物。在层流柜中，然后将发酵的谷物转移到小的浅的聚苯乙烯泡沫塑料(Styrofoam)托盘中，一旦确定没有污染，将重复培养物组合。剩余的基质团块在无菌条件下打散。将培养物在控制温度设定为22℃的室内干燥10天，以获得＜10％的水分含量(通过烘箱水分分析测定，5g子样品在130℃干燥2小时后)。在该干燥期间定期轻柔地搅动托盘确保快速且均匀的干燥。将干燥的样品储存在20℃的紧密封盖的250mL螺旋盖容器中用于后续分析。
[0266] 厚垣孢子计数
[0267] 干燥后，使用预先清洁的咖啡研磨机研磨样品。将干燥并研磨的培养物的一式三份的0.1g样品称重到50mL消化管中。将样品在含有1％胃蛋白酶(1∶2500胃蛋白酶A；Sigma chemicals，Sydney)和1.7％盐酸(AR级)的等渗盐水溶液中持续振荡消化72小时。使用Spencer BrightlineTM血细胞计数器计数厚垣孢子，并将孢子产量计算为厚垣孢子/克干燥并研磨的培养物材料。
[0268] 生存力评估-MTT染色程序
[0269] 从上述样品中，将5g研磨的孢子材料悬浮在50mL无菌10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.9)中。该悬浮液用于平板分析。将稀释的孢子悬浮液的一式三份的1.0mL等分试样分配到5mL小瓶中。向每个小瓶中加入1.0mL过滤灭菌的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-四唑溴化物(MTT)(2mg/mL)和2μL 2.5mM氯化钴溶液。将小瓶盖紧并在27℃孵育24-36小时。孵育后，使用血细胞计数器计数活孢子。活孢子通过蓝色/黑色染成红色或蓝色，非活孢子不染色。只有显示完全细胞质染色的孢子被计为活的(Meier和Charvat，1993 American Journal of Botany 80：1007-1015)。
[0270] 统计分析
[0271] 使用ANOVA和Tukey的事后检验(Statgraphics Centurion XV.，2006)估计活孢子/g的差异。
[0272] 实施例3
[0273] 生产规模扩大用于商业应用
[0274] 仅作为非限制性实施例，根据本文任何方面，实施方案或实施例的组合物的D.flagrans如下所述可规模扩大用于商业应用。下面，在本非限制性实施例的上下文中，使用以下术语：
[0275] 技术级活性成分(TGAI)：这是指包含D.flagrans菌株IAH 1297的厚垣孢子的干燥原材料，其是本实施例(实施例3)中描述的方法的产物。通常，该产物每克含有1x 106或更多的活孢子。
[0276] 最终用户产品(EP)：这是指包含与饲料成分混合的TGAI的产品，所述饲料成分包括但不限于蛋白粉，油，脂肪，碳水化合物，抗氧化剂，防腐剂，维生素，矿物质和着色剂。EP旨在供农场工作人员用作动物饲料补充剂或混合到动物饲料中。
[0277] 碾磨产品(MP)：这是指包含与饲料成分混合的TGAI的产品，所述饲料成分包括但不限于蛋白粉，油，脂肪，碳水化合物，抗氧化剂，防腐剂，维生素，矿物质和着色剂。MP旨在出售给第三方制造商，例如但不限于饲料厂，兽医或其他可能将其用作其自有品牌产品(包括动物饲料补充剂和饲料)的成分的制造商。在本非限制性实施例的上下文中，MP包含比EP多约15倍的TGAI。
[0278] 纯化的TGAI：这是指来源于TGAI的产物，其中D.flagrans厚垣孢子的密度相对于其所来源于的TGAI增加。
[0279] 制备干燥的孢子浓缩物。如上所述，干燥的孢子浓缩物被称为技术级活性成分(TGAI)。TGAT的制备如下：
[0280] 方案1制备D.flagrans
[0281] DUDDINGTONIA FLAGRANS的制备
[0282]
[0283] a.使用如实施例2中的标准固体基质发酵方法培养D.flagrans。D.flagrans在润湿的全谷物上生长；添加了额外的生长培养基，所述培养基含有能量源，氮源以及营养物质；
[0284] b.制备方法是两步法，包括通过加热或γ辐射对湿润的谷物进行灭菌，用含有真菌并且可能包括(a)中列出的一些或所有成分的液体培养基接种湿润的谷物。接种在无菌条件下进行，并允许发酵持续数周，通常约4周。发酵步骤在20-28摄氏度的受控温度进行，水分含量从低至20％至约40-60％的水分变化。在发酵步骤期间，孢子自然发育，在该阶段不使用用于诱导孢子形成的特定起始方法。
[0285] c.目前使用两种类型的发酵方法。在一种方法中，不锈钢托盘用于容纳生长基质，并且空气或氧气在发酵过程中在顶部空间循环。在另一种方法中，生长基质包含在枕形包中，该枕形包包括具有通气带的塑料袋，并且允许发酵过程在架子上进行，因此不使用空气或氧气的强制循环。发酵过程被设计成排除外来生物的引入，并允许二氧化碳逸出和空气进入。
[0286] d.第二步包括通过暴露于空气来干燥发酵的谷物。这在低温下尽可能快地完成至水分含量小于10％。D.flagrans的孢子没有与谷物分离，因为D.flagrans产生作为谷粒的组成部分的孢子。一旦干燥，包含孢子的谷物就产生孢子浓缩物的原材料。孢子浓缩物含有5 10
干燥的菌丝体，所述菌丝体包含孢子。获得的活孢子/克的活菌计数范围为1x 10至1x 10个孢子/g。
干燥的菌丝体，所述菌丝体包含孢子。获得的活孢子/克的活菌计数范围为1x 10至1x 10个孢子/g。
[0287] e.干燥完成后，将产物(TGAI)装入密封袋中，包装并运输以供进一步加工。
[0288] 实施例4
[0289] 最终用户产品(EP)和碾磨产品(MP)
[0290] 仅作为非限制性实施例，如实施例3中所述制备TGAI并配制以提供根据本发明的组合物。如上所述制备两种产品，最终用户产品(EP)和碾磨产品(MP)。
[0291] 如上所述，为了产生EP和MP，将TGAI与饲料成分混合，所述饲料成分包括但不限于包含蛋白粉，油，脂肪，碳水化合物，抗氧化剂，防腐剂，维生素，矿物质和着色剂。在本非限制性实施例中，MP包含比EP多约15倍或更高的TGAI。混合后，将混合物碾磨以打散孢子颗粒以确保均匀性。成品包装在袋子或散装容器中。通常，产品(EP和MP)在使用时提供至少3x 104个活孢子/Kg体重/天(例如在实施例5的生存力方法中测量的)。
[0292] 实施例5
[0293] 粪便卵计数试验(FEC)试验
[0294] 用于粪便卵计数(FEC)的方法是本领域熟知的。技术的实例广泛可用。图4a中提供了FEC用法说明的实例。本领域技术人员将了解许多其他方法来源。
[0295] 实施例6
[0296] 粪便卵计数减少试验(FECRT)
[0297] 用于粪便卵计数减少试验(FECRT)的方法是本领域熟知的。技术的实例广泛可用。图4b中提供了FECRT用法说明的实例。本领域技术人员将了解许多其他方法来源。
[0298] 实施例7
[0299] 仅作为非限制性实施例，使用本发明的组合物进行功效试验。例如，根据实施例3制备本发明的组合物，并进一步配制以制备根据实施例4的EP。
[0300] 根据VICH(国际合作协调兽医药品注册技术要求(International Cooperation on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products))良好临床实践(Good Clinical Practice，GCP)在不同的澳大利亚区域位置和季节在牛，绵羊，山羊和马中进行一系列安慰剂对照试验以评估EP减少幼虫发育和从粪便迁移到牧草上的能力。
[0301] 简而言之，对于牛，山羊和马的短期试验，在处理之前从试验动物收集粪便并将其置于牧场位点(对照粪便)。然后用EP处理相同的动物，并在约1周后再次收集粪便(经处理的粪便)。然后将这些粪便放在牧场位点。以2周间隔(处理后2至8周)，收集随机选择的粪便块((处理和对照)粪便样品)周围的牧草的样品并检查线虫幼虫。然后将发现的幼虫区分物种(作为所涉及宿主物种的寄生幼虫)，并计算每个样品的总寄生虫幼虫数。通过比较两组(处理相比于对照)的牧草幼虫计数来测量处理效果。
[0302] 对于绵羊的长期放牧研究，在分开的围场上放牧两组蠕虫感染的绵羊，一组接受EP，另一组接受安慰剂。通过与无蠕虫示踪羊羔群共同放牧来测量处理对牧草幼虫感染性的影响，并通过比较两示踪组的总蠕虫数来测量处理效果。
[0303] 在这些研究中遇到的蠕虫物种包括下表2中所示的那些。
[0304] 表2在EP(含有D.flagrans菌株IAH 1297的厚垣孢子)功效试验中遇到的蠕虫物种[0305]蠕虫类型 牛 绵羊 山羊 马
古柏线虫属 X X
盅口线虫 X
血矛线虫属 X X X
细颈线虫属 X X
结节线虫属 X X
胃线虫属 X
圆线虫属 X
背带线虫属 X X
毛圆线虫属 X X X X
古柏线虫属 X X
盅口线虫 X
血矛线虫属 X X X
细颈线虫属 X X
结节线虫属 X X
胃线虫属 X
圆线虫属 X
背带线虫属 X X
毛圆线虫属 X X X X
[0306] 在各绵羊试验中获得示踪羔羊中总蠕虫计数的统计学显著降低(P＜0.05)。对于牛，山羊和马研究，分析每种动物物种的汇总数据，表明在每种情况下处理效果是显著的(P≤0.01)，如下所示。
[0307] 以下概述的利用EP的研究是根据VICH GL9 GCP(2000年6月)和世界兽医寄生虫学进展协会(World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology，WAAVP)的用于评估反刍动物中的驱肠虫剂功效的指南进行。
[0308] 利用饲料补充剂(EP)(牛，马和山羊)的短期功效研究
[0309] 进行一系列安慰剂对照试验以评估EP在牛，马和山羊中减少幼虫发育和从粪便迁移到牧草上的能力。
[0310] 在这些试验中，使用以下产品：
[0311] 1. 安慰剂产品(参见图5的产品描述)-由International Animal Health Products Pty Ltd制造的营养动物饲料补充剂，下面称为
[0312] 2.EP-包含分散在 中的TGAI，下面称为“EP”。
[0313] 简而言之，所选择的试验动物携带多种寄生线虫，包括驱肠虫剂抗性株，在一些情况下，这些通过人工感染增强。在收集动物粪便之前给所述动物喂食 约1周，然后将其手动放置在牧场的试验位点(对照粪便)。然后用EP(提供最少3x 104个活D.flagrans厚垣孢子/kg体重/天，持续约1周)处理相同的动物并再次收集粪便(经处理的粪便)并如上所述放置在牧场的相同位点。以2周间隔(处理后2至8周)收集随机选择的粪便样品周围的牧草样品并检查线虫幼虫。然后将发现的幼虫区分物种(作为所涉及宿主物种的寄生幼虫)，并计算每个样品的总寄生虫幼虫数。D.flagrans在EP处理的粪便的粪便块中的作用可以通过在周围牧草上发现的幼虫数量减少来证明。
[0314] 根据VICH GL9 GCP(2000年6月)和WAAVP用于评估反刍动物中的驱肠虫剂功效的指南进行以下概述的研究。结果总结在表3和图6至13中。
[0315] 表3补充EP以在牛，山羊和马中减少幼虫发育和从粪便向牧草的迁移的功效试验概述。
[0316]
[0317] *在粪便沉积后不久受到冷冻条件影响的试验位点。
[0318] 统计分析(Groves，P 2015)显示所有物种的治疗效果具有统计学显著性(p≤0.01)(参见实施例7)。
[0319] 在牛试验中，遇到的线虫类型是古柏线虫属，毛圆线虫属，结节线虫属，胃线虫属和血矛线虫属，包括多重抗性株。
[0320] 在山羊中，线虫是背带线虫属，毛圆线虫属，细颈线虫属，血矛线虫属和古柏线虫属，包括多重抗性株。山羊也受到胃肠圆线虫幼虫(包括捻转血矛线虫，蛇形毛圆线虫和环纹背带线虫的已知的多重抗性株以及古柏线虫属和细颈线虫属的近期野外分离株)的混合群体的攻击。
[0321] 在马中，优势物种是盅口线虫，但是一些Strongylyus spp和艾氏毛圆线虫也存在。
[0322] 尽管由于气候差异而具有流行和丰度的差异，但驯养家畜的胃肠线虫寄生虫的致病属在其分布方面是世界性的。澳大利亚的优势属出现在世界各地进行牲畜生产的大多数地理位置。
[0323] 利用EP的长期功效研究(绵羊)
[0324] 在如下所述的一系列地理位置和季节在绵羊中进行一系列安慰剂对照试验以评估EP减少幼虫发育和从粪便迁移到牧草上的能力。
[0325] 1. 安慰剂产品-由International Animal Health Products Pty Ltd制造的营养动物饲料补充剂，下面称为
[0326] 2.EP-包含分散在 中的TGAI，下面称为“EP”或“测试组合物”。
[0327] 在这些研究的每个中，使用的绵羊组具有不同的作用：
[0328] (1)“播种”绵羊(其具有代表该地区的一系列寄生虫(包括多重抗性株)的自然感染)用于通过排下带有虫卵的粪便污染牧场。
[0329] (2)“示踪”绵羊(其是没有任何蠕虫负荷的易受幼虫感染的动物)用于评估其放牧的牧场的蠕虫污染程度。
[0330] 在每个试验中，使用一对匹配的围场，其中一个围场用一组每日补充安慰剂的播种绵羊放牧(对照组)，另一个用每日补充EP(提供每日最小剂量3x 104个孢子/kg体重)的匹配组(治疗组)放牧。
[0331] 在围场中放牧播种绵羊两个月后，通过用蠕虫易感的示踪绵羊放牧围场3周的时间来评估感染性线虫幼虫对牧场的污染程度。一组示踪绵羊在对照围场上放牧以及匹配组在EP围场上放牧。然后将示踪动物移到饲养圈中以使其蠕虫负荷成熟并通过在处死和肠道洗涤后进行总蠕虫计数(Total Worm Count，TWC)来确定其感染程度。在三次试验中，播种绵羊继续在试验牧场放牧另外两个月，此时引入了另一组示踪绵羊并确定其TWC。
[0332] 两组示踪绵羊之间TWC的差异证明了EP防止感染性幼虫从播种绵羊的粪便出现到牧场上的能力。
[0333] 结果总结于表4和图14-17中。通过自然地降低牧场的幼虫感染性，EP的使用导致试验中遇到的大多数临床上重要的蠕虫物种(包括多重抗性株)的蠕虫负荷显著降低。
[0334] 表4补充EP以在绵羊中减少幼虫发育和从粪便迁移到牧草上的功效试验概述[0335]
[0336] *对照/经处理动物的数量，§算术平均#在测试围场上的处理天数
[0337] 在这些试验中遇到的蠕虫属包括血矛线虫属(Haemonchus)，毛圆线虫属(Trichostrongylus)，背带线虫属(Teladorsagia)和细颈线虫属(Nematodirus)。
[0338] 已经测试的其他食草动物(其中EP提供了总蠕虫数量的大幅减少)包括长颈鹿，羚羊，斑马和印度黑羚(blackbuck)。
[0339] 这些研究证实，本发明的D.flagrans活着通过肠道并有效地捕获食草动物(包括牛，绵羊，马，山羊和动物园动物)的各种商业上重要的线虫寄生虫。这些野外研究已经证实，本发明的组合物适用于商业应用减少牧场上的蠕虫感染，从而控制动物自身的感染水平，以及显示经济效益，例如减少的疾病和死亡率，减少的使用化学蠕虫剂的需求和改善的性能。
[0340] D.flagrans菌株IAH 1297的所需日剂量比使用其他D.flagrans菌株的研究低约10倍。这代表了比其他D.flagrans菌株显著的优势。
[0341] 实施例8
[0342] 实施例7的短期研究的统计分析
[0343] 在每个试验位点在每个时间点，计算所有对照和测试组合物样品的寄生虫幼虫的平均数量。为了确定测试组合物处理对试验中牧场幼虫数量的影响，对多位点试验的每个位点的数据进行平均，然后对于动物的每个物种，根据在牧场上的时间(2，4，6，8周和第2-8周的总计)汇集所有研究的数据以供分析。由此计算每个时间点的总平均幼虫数(对照和测试组合物)和第2-8周的总数。
[0344] 各时间间隔的幼虫测定不是独立的，因为对于每个试验样品都来自相同实验动物的汇集的组合物。因此，考虑这些并非完全独立并且使用重复测量分析(ANOVA)来比较结果是合适的。因此，使用重复测量ANOVA分析数据，其中未经处理的粪便(对照)相比于经处理的粪便(测试组合物)，并且试验数量作为主效应变量。所有相互作用都包括在分析中。
[0345] 马试验
[0346] 比较了三个试验，所述试验在2个季节中使用5个地理位点在马中使用EP进行。这些位点在试验之间存在差异，因此在分析中仅使用试验数量作为变量。ANOVA结果如表5所示。
[0347] 表5组合物处理后牧场上的马幼虫的ANOVA输出
[0348]
[0349] 高亮的值是显著不同的(P＜0.05)
[0350] 表5显示，在8周的观察期利用EP的处理的效果与处理后采样周一样具有统计学显著性。处理后的时间和试验之间以及时间，试验和处理之间存在显著的相互作用。
[0351] 表6显示了3次试验的在8周试验期牧场样品中马寄生虫幼虫的平均数量以及相应的总体值。对照样品的总平均幼虫计数为2248只幼虫，与之相比的是测试组合物处理的样品仅为363只幼虫(P＝0.004)。
[0352] 表6马八周的处理效果比较
[0353]
[0354] A，B—相同列中的平均值，不同的上标不同(P＜0.05)
[0355] 图11-13显示，在将粪便放置在牧场上后，牧场上的马寄生虫幼虫负荷随时间增加，并且与测试组合物处理的粪便相比，对于对照粪便，这增加得更快并且维持在更高的水平。在各试验中显示出可变性，但在处理后6周观察到显著差异(表6)。总体而言，在8周观察期，与对照粪便相比，测试组合物处理的粪便中出现的幼虫总数显著减少(表5和6)。
[0356] 该响应在三个试验间具有变化(图11-13)，在试验#2529中处理后4周，在试验#1955中处理后6周发现更多幼虫，并且在试验#2633中观察到较慢增加至8周时的峰值。这可能是由于每个位点的气候和当地条件不同。
[0357] 马实验的结论
[0358] 总体而言，在处理期后8周向马施用EP显著(P＝0.004)减少检测到的粪便周围牧草上的马寄生虫幼虫。
[0359] 牛试验
[0360] 比较了两个试验，所述试验在2个季节中在4个地理位点在牛中使用测试组合物进行。这些位点在试验之间存在差异，因此在分析中仅使用试验数量作为变量。ANOVA结果如表7所示。
[0361] 表7.测试组合物处理后牧场上牛幼虫的ANOVA输出。
[0362]牛幼虫ANOVA 自由度 F P
截距 1 18.02177 0.000111
处理 1 8.32387 0.006039
试验数量 1 0.12639 0.723905
处理x试验数量 1 0.20544 0.652595
误差 44
周 3 2.87000 0.038915
周x处理 3 1.80555 0.149268
周x试验数量 3 3.52724 0.016808
周x处理x试验数量 3 1.79432 0.151365
误差 132
截距 1 18.02177 0.000111
处理 1 8.32387 0.006039
试验数量 1 0.12639 0.723905
处理x试验数量 1 0.20544 0.652595
误差 44
周 3 2.87000 0.038915
周x处理 3 1.80555 0.149268
周x试验数量 3 3.52724 0.016808
周x处理x试验数量 3 1.79432 0.151365
误差 132
[0363] 高亮的值是统计学显著的(P＜0.05)
[0364] 表7显示在8周研究期EP处理的粪便和对照粪便之间存在显著差异并且这随时间变化。随着时间的推移，各试验之间存在显著的相互作用。
[0365] 表8显示2次试验的在8周试验期牧场样品中牛寄生虫幼虫的平均数量以及相应的总体值。对照样品的总平均幼虫计数为16,038只幼虫，与之相比的是测试组合物处理的样品为3,059只幼虫(P＝0.006)。
[0366] 表8.牛八周的处理效果比较
[0367]
[0368] A，B—相同列中的平均值，其中不同的上标不同(P＜0.05)
[0369] 图6-7显示来自对照粪便的幼虫到4周时快速增加，然后保持高水平至处理后8周。相比之下，发现的从经测试组合物处理的粪便中出现的幼虫在整个观察期内仅有最小上升。在各试验中显示出可变性，但在处理后8周观察到显著差异。总体而言，与对照粪便相比，在8周观察期从EP处理的粪便中出现的幼虫总数显著减少(表7和8)。
[0370] 这种响应在两个试验之间具有变化(图6-7)，试验#2528中幼虫值在4周达到最大值，而在试验#2634中较慢增加至8周的峰值。这可能是由于每个位点的气候和当地条件不同。
[0371] 牛实验的结论
[0372] 总体而言，用EP处理牛在处理后8周的时间显著(P＝0.006)减少检测到的粪便周围牧草的牛寄生虫幼虫。
[0373] 山羊试验
[0374] 比较了三个试验，所述试验在3个季节在6个地理位点在山羊中使用EP进行。由于山羊相对较低的粪便输出，因此对于两个山羊试验(#2635和#2719)，粪便样品收集自成对的山羊。这些位点在试验之间存在差异，因此在分析中仅使用试验数量作为变量。ANOVA结果如表9所示。
[0375] 表9.测试组合物处理后牧场上山羊寄生虫幼虫的ANOVA输出。
[0376]山羊幼虫ANOVA 自由度 F P
截距 1 12.45730 0.000770
处理 1 7.01586 0.010130
试验 2 0.91756 0.404603
处理x试验 2 0.28991 0.749294
误差 65
周 3 2.35840 0.072938
周x处理 3 1.03807 0.376834
周x试验 6 3.39721 0.003284
周x处理x试验 6 1.65194 0.134841
误差 195
截距 1 12.45730 0.000770
处理 1 7.01586 0.010130
试验 2 0.91756 0.404603
处理x试验 2 0.28991 0.749294
误差 65
周 3 2.35840 0.072938
周x处理 3 1.03807 0.376834
周x试验 6 3.39721 0.003284
周x处理x试验 6 1.65194 0.134841
误差 195
[0377] 高亮的值是统计上显著的(P＜0.05)
[0378] 表9显示在8周观察期利用EP处理的效果在统计学上是显著的。时间和试验之间也存在显著的相互作用。
[0379] 表10显示3次试验的在8周试验期牧场样品中山羊寄生虫幼虫的平均数量以及相应的总体值。对照粪便的总平均幼虫计数为12,866只幼虫，而测试组合物处理后只有1,834只幼虫(P＝0.01)。
[0380] 表10.山羊八周处理效果比较
[0381]
[0382] A，B—相同列中的平均值，其中不同的上标不同(P＜0.05)
[0383] 图8-10显示在山羊粪便中所看到的幼虫出现与在马和牛研究中的模式不同，寄生幼虫的出现在处理后的前2周更大，然后下降。通过周来标记可变性，总体而言，与对照粪便相比，在8周观察期从组合物处理的粪便中出现的幼虫总数显著减少(表5和6)。
[0384] 该响应在三个试验间具有变化，在#2719中处理后2周，在#2527中4周，在#2635中6周发现更多幼虫。
[0385] 结论
[0386] 总体而言，向山羊施用EP在处理期后8周显著(p＝0.01)减少检测到的粪便周围牧草上的山羊寄生虫幼虫。
[0387] 总体结论
[0388] 用EP处理马，牛和山羊导致在处理期后8周在其粪便周围的牧草上所有三种动物物种的寄生虫幼虫显著(p≤0.01)减少。
[0389] 实施例9
[0390] 仅作为非限制性实施例，下表提供了在建立本发明的商业生物防治产品的安全性和获得监管批准时遇到的问题的概述。
[0391] 表11安全问题概述
[0392]
[0393]
[0394]
[0395]
[0396] 实施例10
[0397] 毒理学研究
[0398] 仅作为非限制性实施例，使用本发明的组合物进行毒理学测试。该组合物也是生物防治产品。例如，根据实施例3制备本发明的组合物，并进一步配制以制备根据实施例4的EP和/或MP。
[0399] 选择测试项目
[0400] 根据测试的目的和背景选择用于这些研究的测试项目。用纯化的TGAI(即D.flagrans菌株IAH 1297(活性成分)的孢子的浓缩制剂)进行急性口服毒性和急性肺毒性和感染性研究，以确保在每种情况下施用尽可能高的孢子剂量。其他研究如眼和皮肤刺激试验使用EP进行，EP被认为与产品的使用者更相关。
[0401] 数据总结和概述
[0402] 进行的一套国际标准良好实验室规范(Good Laboratory Practice)毒理学研究总结如下；这些研究都没有表明任何令人担忧的原因。
[0403] 急性口服毒性研究显示纯化的TGAI中的D.flagrans孢子无毒。大鼠中的5,000mg/kg B.W.的剂量没有引起任何临床体征，因此口服LD50剂量大于5,000mg/kg体重。
[0404] 在急性肺毒性和感染性研究中，将纯化的TGAI的孢子直接滴注到肺中，因为孢子直径在20-24微米之间意味着它们太大而不能被吸入肺部。将孢子滴注进入肺部不会引起毒性或感染性的体征，除了解决的在3-4天内呼吸困难(使用减毒产品获得相同的结果)。孢子最终从肺部清除。
[0405] 通过将EP应用于的皮肤贴剂(极限剂量为5,000mg/kg体重)进行的急性皮肤毒性研究也表明没有毒理学作用。
[0406] 急性皮肤刺激测试得出结论，当施用于兔皮肤时，EP被分类为无刺激性的。根据CIPAC测试方法TM171测试饲料补充剂EP的含尘量，表明该产品被定义为无尘，这将有助于产品的安全性。
[0407] 使用EP的急性眼刺激研究得出结论：1小时后发生结膜刺激作用，但这些作用在72小时内完全可逆。没有观察到角膜作用。该信息得到了用分离的鸡眼进行的体外眼刺激研究的支持，其中该产品未被分类为严重刺激性或非刺激性。
[0408] 在绵羊中5倍建议剂量以及牛和马中10倍建议剂量的长期高剂量安全性研究证实了TGAI的安全性。其他研究人员的研究支持这一发现。
[0409] 所提供的数据支持对本发明的组合物或生物防治产品的监管批准。
[0410] 还测定了MP的许多相关物理特征，特别是根据CIPAC测试方法TM171的含尘量和根据CIPAC TM170的筛分析。使用CIPAC标准测试含尘量，MP被发现“几乎无尘”；并且干筛分析显示没有材料保留在或通过50微米筛网。此外，提供了D.flagrans孢子大小的确定，因为任何尘颗粒的空气动力学大小与其吸入或呼吸的能力之间存在关系。所有这些测试结果都提供了产品低风险性的证据。
[0411] 还关注到D.flagrans菌株IAH 1297的次级代谢产物。该菌株产生单一主要代谢物，即flagranone A，并且分析表明该物质的含量太低而不具有毒理学担忧。
[0412] 欧洲注册毒理学家(European Registered Toxicologist)已经提供了D.flagrans菌株IAH1297的毒理学概述。其结论是：
[0413] D.flagrans在经处理的动物的粪便中起作用，不被吸收到体循环中；因此，预计没有由真菌引起的全身毒性。这通过实验室动物的一系列毒理学研究和目标动物的长期高剂量安全性研究得到证实。
[0414] 结论是，对实验室动物和目标物种的研究并未表明任何毒理学作用，并且flagranone A(次级代谢产物)对消费者造成的风险可以忽略不计。鉴于活性成分的性质，对产品或这些物质的进一步毒理学测试是不实用或不必要的。
[0415] 活性成分研究
[0416] 感染性和致病性：
[0417] 通过下文提到的GLP急性肺毒性和感染性研究评估这些性质。肺被认为是评价D.flagrans的感染性和致病性的理想器官，因为已经证明孢子萌发需要氧气并且不同于备选测试部位(胃肠道或腹膜腔)，肺提供有氧环境。
[0418] 测试物的选择取决于最大化可施加的孢子剂量的需要。使用的测试物是纯化的TGAI，因为通过小规模实验室试验证明不可能达到更高的浓度。由于孢子的直径约为20微米，因此决定通过直接滴注进入气管来应用它们，绕过鼻子和喉咙，否则在这些地方孢子可能会被捕获。
[0419] 急性肺毒性&感染性研究。
[0420] 使用滴注方法在大鼠中进行急性肺毒性和感染性研究，其中动物用单剂量的干孢子粉末(纯化的TGAI)形式的D.flagrans孢子IAH 1297或等量的灭活孢子处理。
[0421] 尸检观察证实，如本研究所需要的，孢子沉积物在吸入后在肺内扩散。在所有动物中观察到的仅有的重要临床体征是呼吸困难，呼吸噪声和呼吸率增加。这些症状在头3-4天内逐渐减退。
[0422] 基于该研究的结果，当作为单一气管内剂量施用给大鼠时，测试物不诱导毒性，感染性或致病性的体征。结果表明，最大剂量取决于孢子的大小和物理表面，而不是其毒力。随着用活性或灭活孢子处理的动物中临床体征减少(约7天后)，体重增加进一步证实了这一点。还注意到，在42天后，在经处理的动物的肺中检测不到活孢子。肺部孢子的缓慢清除被认为与测试材料的物理性质有关，特别是大的孢子尺寸。
[0423] 急性口服毒性
[0424] 在大鼠中用D.flagrans菌株IAH 1297孢子进行急性口服毒性研究。在该研究中，给予3只大鼠单次口服(强饲法)剂量的D.flagrans菌株IAH1297孢子(纯化的TGAI)，其限制剂量为5,000mg/kg体重(BW)。在处理前将动物禁食过夜，并在给药后3小时再喂食。
[0425] 最初，以5,000mg/kg BW的剂量水平处理一只雌鼠。没有观察到死亡，因此另外两只大鼠(确认组)以5,000mg/kg BW处理。确认组未观察到死亡。
[0426] 在给药后达处理后6小时观察各个动物，之后每天观察一次，观察14天。在第-1天，在即将给药前(第0天)和之后每周测量体重。在观察期结束时肉眼检查所有动物。没有进行特异性致病性评估，但是针对任何不良作用对动物进行了仔细检查。
[0427] 该研究得出结论：
[0428] ·没有观察到死亡。
[0429] ·在5,000mg/kg体重的剂量水平用D.flagrans孢子(菌株IAH 1297)处理没有引起任何临床体征。
[0430] ·没有治疗相关的体重变化。体重在该菌株和年龄通常记录的范围内。
[0431] ·在剂量水平为5,000mg/kg BW时进行肉眼观察没有明显迹象
[0432] 在该研究的条件下，测试物D.flagrans孢子菌株IAH 1297(纯化的TGAI)的急性口服半致死剂量(LD50)在雌性CRL：(WI)大鼠中大于5,000mg/kg BW(极限剂量)。
[0433] 在该研究中，喂食给动物的孢子量大于建议的MP或EP中的TGAI商业剂量的600倍，如下：
[0434] 研究剂量比：5g活性成分(纯化的TGAI)/kg BW(3.8x 106个孢子/g)(基于试验中使用的特定批次的测定结果)等于1.9x 107个孢子/kg BW
[0435] 建议的剂量比：6g MP/100kg Bw或100g EP/100kg体重等于30,000个孢子/kg BW[0436] 另外，在2006年，欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)公布了其对D.flagrans作为小牛饲料添加剂的安全性的意见。所考虑的数据包括使用5只雌性Sprague-Dawley衍生的11周龄大鼠(给予单次剂量2,000mg/kg B.W.)的急性口服毒性研究。动物被监测14天，通过吸入二氧化碳被杀死并进行解剖。该研究得出结论：在给药后和在检查的器官的死后检查中没有观察到毒性作用，除了肺具有正常的宏观外观(观察到的肺异常归因于使用二氧化碳杀死大鼠)。
[0437] EFSA得出结论：该产品具有低口服毒性，LD50大于2,000mg/kg BW或2×107个孢子/kg BW。EFSA得出结论，该真菌具有非常低的口服毒性。
[0438] D.flagrans孢子大小
[0439] 孢子大小的测定得到19微米和24微米的结果。这是相关的，因为这种孢子大小太大而不能被吸入肺中，这减轻了由于吸入孢子而导致的任何风险。此外，由于这个原因，肺和感染性研究使用分离的孢子作为测试物，其通过直接气管内滴注来应用。
[0440] 暴露评估
[0441] 消费者没有D.flagrans暴露，因为真菌不会被受体动物吸收。
[0443] 一组毒理学和长期安全性研究表明，D.flagrans菌株IAH 1297是低风险物质，[0444] D.flagrans的次级代谢产物
[0445] Flagranone是由D.flagrans产生的次级代谢产物，并且已经报道了Flagranone A，B和C。如实施例11所示，已发现D.flagrans菌株IAH 1297(TGAI)不产生flagranone B和C，并且已经确定了制造工人，农场工作人员和消费者在制造和使用TAGI，MP和EP以及消费来自经处理的动物时对flagranone A的暴露。结果发现，人体暴露量低于欧洲毒理学关注阈值(European Threshold of Toxicological Concern，TTC)1.5μg/kg BW/天，动物暴露量低于这样的水平，在所述水平之上需要考虑残留物研究(4μg/kg BW/天)。
[0446] 产品研究
[0447] 急性皮肤毒性
[0448] 使用EP进行皮肤毒性试验，因为认为赋形剂可能有助于对皮肤的作用。在该研究中，单一半闭合皮肤应用5,000mg/kg BW的极限剂量的EP来处理大鼠。使用足够的水来润湿测试材料以确保与皮肤的良好接触。接触时间为24小时，然后进行14天的观察。在给药后1小时和5小时对所有动物进行临床观察以及生存力和死亡率检查，之后每天检查进行14天。在第0天，第7天和第14天给药之前测量体重。在观察期结束时，在尸检时肉眼检查所有动物。
[0449] 结果包括：
[0450] ·在研究期间未观察到死亡。
[0451] ·在用测试物处理后或在14天观察期内没有观察到不良临床体征，并且在施用部位没有观察到影响。
[0452] ·没有治疗相关的体重变化。
[0453] ·体重在该菌株和年龄通常记录的范围内。
[0454] ·在尸检时在5,000mg/kg BW的剂量水平没有明显的不良作用。
[0455] 结论是单次皮肤施用后的半致死剂量(LD50)EP大于5,000mg/kg体重大鼠。
[0456] 使用EP进行急性眼刺激测试，因为其被认为是代表最真实的暴露模型。使用分离的鸡眼以EP作为测试物进行体外眼刺激测试。该过程涉及将测试物以单剂量施加到从屠宰动物获得的分离的眼睛的角膜上。
[0457] 在零参考测量之后，将眼保持在水平位置，并将测试物施加到角膜的中心，使得覆盖角膜的整个表面。10秒后，用盐水冲洗表面。阳性对照眼用30mg咪唑处理。用30μL生理盐水处理阴性对照眼。在该研究中，检查了测试物处理的三个眼，阳性对照处理的三个眼和阴性对照处理的一个眼。
[0458] 在4小时观察期间未观察到显著的角膜肿胀。在测试物处理的所有眼上注意到角膜混浊度变化(严重性0.5或1)和荧光素保留变化(严重性0.5或1)；此外，测试物的颗粒粘在角膜上，在研究期间洗不掉。总体而言，作用明显大于阴性作用，但不足以将其归类为严重。粘在角膜上的颗粒可能会在体内导致机械角膜损伤。
[0459] 体外眼刺激表明EP未被分类为严重刺激性或非刺激性。结论是，分类需要进一步的信息。
[0460] 体内眼睛刺激
[0461] 在该试验中使用三只年轻成年雄性新西兰白兔，并将测试物(EP)作为单次剂量施用到左眼的结膜囊中，未处理的右眼作为对照。在将测试物滴注到眼中之后，如下所示，在不同时间对刺激作用进行评分直至72小时。
[0462] 在所有动物中在处理前约24小时，然后在处理后24，48和72小时，用荧光素染色进行观察。根据监管指南，用镇痛药和麻醉药处理兔。从这三只动物获得的结果用于针对刺激可能性对测试物分类。没有进行特异性致病性评估，但是针对任何不良作用对动物进行了仔细检查。对结膜，虹膜和角膜的刺激被赋予数字评分。
[0463] 获得以下数据：
[0464] 第一动物(No：1393)临床观察：
[0465] 应用后1小时，在兔中注意到结膜发红(评分2)，结膜水肿(评分1)和分泌(评分2)。在兔中在1小时观察时间点，测试物保留在眼囊中。应用后24小时，在兔中注意到结膜发红(评分2)，结膜水肿(评分1)和分泌(评分1)。
[0466] 应用后48小时，在兔中注意到结膜发红(评分1)。应用后72小时，未观察到临床体征并且没有结膜或角膜作用。
[0467] 第二动物(No：1398)临床观察：
[0468] 应用后1小时，在兔中注意到结膜发红(评分2)，结膜水肿(评分1)和分泌(评分2)。在兔中在1小时观察时间点，测试物保留在眼囊中。应用后24小时，在兔中注意到结膜发红(评分2)和分泌(评分1)。
[0469] 应用后48小时，在兔中注意到结膜发红(评分1)。应用后72小时，未观察到临床体征并且没有结膜或角膜作用。
[0470] 第三动物(No：1390)临床观察：
[0471] 应用后1小时，在兔中注意到结膜发红(评分2)，结膜水肿(评分1)和分泌(评分2)。在兔中在1小时观察时间点，测试物保留在眼囊中。应用后24小时，在兔中注意到结膜发红(评分2)和分泌(评分1)。
[0472] 应用后48小时，在兔中注意到结膜发红(评分1)。应用后72小时，未观察到临床体征并且没有结膜或角膜作用。
[0473] 在观察期间，所有动物中的荧光素染色均为阴性。由于未观察到临床体征，观察72小时后终止实验。
[0474] 在研究期间，每只动物的对照眼无症状。在整个实验期间，动物的一般状态和行为是正常的。所有兔的体重都被认为在正常变化范围内。然而，在观察期间，在一只动物(No.1393)中注意到轻微的体重减轻。
[0475] 结论是应用于兔眼的EP在处理后1小时引起结膜刺激作用，其在72小时内完全可逆。在该研究中没有观察到角膜作用。
[0476] 急性皮肤刺激
[0477] 使用EP进行急性皮肤刺激研究。通过将测试组合物(EP)局部，半闭合地应用于完整的剃毛侧腹来处理三(3)只年轻成年新西兰白兔。将测试物用水润湿以确保良好的皮肤接触。处理持续时间为4小时。
[0478] 在去除敷料后1，24，48和72小时进行皮肤反应评分。通过在24，48和72小时总计平均累积评分然后除以数据点的数量来计算主要刺激指数(P.I.I.)。没有进行特异性致病性评估，但是针对任何不良作用对动物进行了仔细检查。
[0479] 在本研究中，获得了以下结果：
[0480] ·主要刺激指数为0.00。
[0481] ·在整个研究中，在经处理的动物中未观察到局部皮肤体征。
[0482] ·在研究期间中动物中没有观察到全身毒性的临床体征，并且没有发生死亡。由于在去除贴剂后72小时未观察到临床体征，因此在观察72小时后终止研究。
[0483] ·所有兔的体重都被认为在正常变化范围内。
[0484] 根据Draize分类标准，EP被认为对兔皮肤“无刺激性”(P.I.I.＝0.00)。
[0485] 观察到体重减轻，但动物在约7天后恢复其原始体重。在此期间之后，对体重或体重增加没有与处理相关的影响，并且体重在该菌株和大鼠年龄通常观察到的范围内。
[0486] 其他研究
[0487] 含尘量研究
[0488] 根据CIPAC测试方法MT171用MP进行的GLP含尘量研究表明其“几乎无尘”。
[0489] 筛分析
[0490] 此外，根据CIPAC TM170进行MP的GLP干筛分析研究。干筛分析显示没有材料保留在或通过50微米筛网。
[0491] 此外，以上D.flagrans菌株IAH 1297的孢子直径显示为约20微米。
[0492] 这些结果是重要的，因为这些特征将降低暴露于眼和皮肤以及通过吸入暴露的可能性。
[0493] EP中TGAI的长期高剂量安全性研究
[0494] 以下概述了牛，绵羊和马的长期高剂量安全性研究。
[0495] 牛的长期安全性研究(10x剂量)
[0496] 在牛中进行GCP研究以证实当以高剂量比(正常剂量的十倍)给牛施用八周TGAI的安全性。
[0497] 从相同的动物池中募集20只Angus牛(雌性牛和雄性阉割牛，年龄小于12个月)并适应消耗安慰剂产品( 125g/100kg体重/天)。在此之后，根据性别和体重将它们分成两组，每组10只动物。在接下来的56天内，第1组(对照组)继续接受安慰剂产品，而第
2组(试验组)给予125g/100kg体重/天的EP(其含有通常量的10倍的TGAI(相当于最低3x
105个孢子/kg体重/天)。该剂量是用于控制牛肠线虫(3×104个孢子/kg体重/天)的10倍。
2组(试验组)给予125g/100kg体重/天的EP(其含有通常量的10倍的TGAI(相当于最低3x
105个孢子/kg体重/天)。该剂量是用于控制牛肠线虫(3×104个孢子/kg体重/天)的10倍。
[0498] 经由兽医的重复临床检查，体重随时间的变化以及血清生物化学和血液学，与未处理的牛相比，证实TGAI的安全性。在第-10天，第3天，第7天，第14天，第28天和第56天进行详细的临床检查，在第-10天，第7天，第14天，第28天和第56天测量体重，在第-10天，第14天和第56天采集血液样品用于血清生物化学和血液学。
[0499] 在研究过程中没有观察到急性或慢性毒性或感染的证据(除了对照组中两只牛的泰勒虫病(theileriosis))。总体而言，在研究期间没有观察到可能与长时间(56天)饲喂TGAI(TGAI剂量包括控制牛的肠道线虫所需的D.flagrans孢子数量的10倍)有关的不利的临床，体重增加，生化或血液学体征。
[0500] 马的长期安全性研究(10x剂量)
[0501] 在马中进行GCP研究以证实当以高剂量比(正常剂量的十倍)给马施用八周TGAI的安全性。
[0502] 从相同的动物池中募集二十匹马(温血马(Warmblood)，纯血马(Thoroughbred)和澳洲种马(Australian Stock Horse)；雌性马，雄性阉割马和雄性马，年龄为3至12岁)并适应消耗安慰剂产品( 125g/100kg体重/天)。在此之后，根据体重将它们分配到两组各10只动物。在接下来的56天内，第1组(对照组)继续接受安慰剂产品，而第2组(试验组)给予125g/100kg体重/天的EP(其含有通常剂量的10倍的TGAI(相当于最低3x 105个孢子/kg体重/天)。该剂量是用于控制马肠道线虫(3×104个孢子/kg体重/天)的10倍。
[0503] 通过兽医的重复临床检查，体重随时间的变化以及血清生物化学和血液学，与未处理的马相比，证实TGAI的安全性。在第-1天，第3天，第7天，第14天，第27天和第56天进行详细的临床检查，在第-1天，第7天，第14天，第27天和第56天测量体重，在第-1天，第14天和第56天采集血液样品用于血清生物化学和血液学。
[0504] 在研究过程中没有观察到急性或慢性毒性或感染的证据。总体而言，在研究期间没有观察到可能与长时间(56天)饲喂TGAI(TGAI剂量包括控制肠道线虫所需的D.flagrans孢子数量的10倍)有关的不利的临床，生化或血液学体征。
[0505] 绵羊的长期安全性研究(5x剂量)
[0506] 在绵羊中进行GCP研究以证实当以高剂量比(正常剂量的五倍)给绵羊施用六周TGAI的安全性。
[0507] 大约12-13月龄且体重在24.0至32.0kg的二十(20)只美利奴(Merino)母羊适应消耗安慰剂产品( 100g/100kg/天)。在此之后根据体重将它们分配到两组各10只动物。在接下来的43天内，第5组(对照组)继续接受安慰剂产品，而第6组(试验组)给予
100g/头/天的EP(其含有通常量的5倍的TGAI(相当于最低1.5x 105个厚垣孢子/kg体重/
4
天)。该剂量是控制绵羊肠道线虫的建议使用比(3x 10个孢子/kg体重/天)的五倍。
100g/头/天的EP(其含有通常量的5倍的TGAI(相当于最低1.5x 105个厚垣孢子/kg体重/
4
天)。该剂量是控制绵羊肠道线虫的建议使用比(3x 10个孢子/kg体重/天)的五倍。
[0508] 通过兽医的重复临床检查，体重随时间的变化以及血清生物化学和血液学，与安慰剂处理的绵羊相比，证实TGAI的安全性。在第-1，7，15，29和43天进行详细的临床检查，测量体重，并采集血液样品用于血清生物化学和血液学。
[0509] 在研究过程中没有观察到急性或慢性毒性或感染的证据。总体而言，在研究期间没有观察到可能与长时间(43天)饲喂EP(EP剂量包括控制肠道线虫所需的D.flagrans孢子数量的5倍)有关的不利的临床，生化或血液学体征。
[0510] 亚慢性重复剂量口服毒性研究
[0511] 使用小鼠模型筛选D.flagrans的印度分离株的可能的短期毒理学作用。在每头每6
天喂食1x 10个孢子一个月后，没有小鼠死亡，并且在真菌饲喂小鼠和对照小鼠之间没有体重显著差异。真菌饲喂和未饲喂的小鼠具有相似的总体外观，颜色和反射运动。在真菌饲喂小鼠和对照小鼠中并且在肝，肺和肾的组织切片上未观察到内部真菌病的证据。
天喂食1x 10个孢子一个月后，没有小鼠死亡，并且在真菌饲喂小鼠和对照小鼠之间没有体重显著差异。真菌饲喂和未饲喂的小鼠具有相似的总体外观，颜色和反射运动。在真菌饲喂小鼠和对照小鼠中并且在肝，肺和肾的组织切片上未观察到内部真菌病的证据。
[0512] 确定无观察到的不良作用水平(NOAEL)
[0513] 在实验动物的任何急性毒性研究中或在TGAI的预期剂量水平或在牛和马中TGAI的预期剂量水平的10倍和在绵羊中预期剂量的5倍的任何中期或慢性饲喂研究中均未观察到不良作用。这些研究得到了牛，绵羊，山羊和马的公共领域的大量研究的支持。
[0514] 在此基础上得出结论：NOAEL大于60g饲料补充剂(MP)/100kg BW/天，对应于超过35
×10个孢子/kg BW/天的D.flagrans菌株IAH 1297。
×10个孢子/kg BW/天的D.flagrans菌株IAH 1297。
[0515] 生殖研究(包括产前发育毒性)。
[0516] 由于D.flagrans不从经处理的生物体或人的胃肠道中再吸收，并且此外孢子不在37℃或没有氧气的情况下萌发，因此没有生殖毒性的迹象。
[0517] 实施例11
[0518] 仅作为非限制性实施例，使用本发明的组合物进行残留物测试。例如，根据实施例3制备本发明的组合物，并进一步配制以制备根据实施例4的EP和/或MP。
[0519] 残留物数据概要
[0520] 作为天然微生物，D.flagrans IAH 1297例如作为本发明组合物中的孢子而口服施用，其不被吸收，因此不能在可食用组织中形成残留物。
[0521] Anderson等.(1999)报道了D.flagrans产生的次级微生物产物flagranone A，B和C的鉴定。本发明人进一步研究了独特菌株D.flagrans IAH 1297。对D.flagrans菌株IAH 1297的次级代谢产物的研究发现，它产生了被鉴定为flagranone A的单一主要代谢产物。
发现其他次要代谢产物的含量低于flagranone A的5％，值得注意的是flagranone B和C无法检测到。本研究检测了flagranone A的化学性质，并报道了flagranone A在实验室条件下降解的速度意味着代谢物不太可能在体内或环境条件下长时间存在。
发现其他次要代谢产物的含量低于flagranone A的5％，值得注意的是flagranone B和C无法检测到。本研究检测了flagranone A的化学性质，并报道了flagranone A在实验室条件下降解的速度意味着代谢物不太可能在体内或环境条件下长时间存在。
[0522] 由于缺乏关于flagranone的毒理学性质的可用文献，使用Derek Nexus和Leadscope对一系列端点并且在许多哺乳动物和细菌物种中进行对flagranone A，B和C的计算机模拟(in-silico)毒理学分析。这是表征flagranoneA，B和C的潜在毒性并评估其可能存在于食品中的可能性以便评估对消费者的任何风险所需的。D.flagrans菌株IAH 1297不产生flagranone B和C，但为了完整性而包括在内。此外，对所有三种flagranone进行了完整的Derek Nexus分析。Leadscope的遗传毒性和啮齿动物致癌性套件用于所有三种flagranone；此外，使用生殖毒性套件分析flagranone A。
[0523] 预测flagranone A具有刺激性并且可能致敏，但预测其不具有诱变性，致癌性或生殖毒性。没有遗传毒性的结构性警报。
[0524] 在使用Derek Nexus和Leadscope软件进行计算机模拟分析之后，得出结论：MP或EP中可能存在的flagranone不会对消费者造成任何不适当的毒理学危害或风险。这基于以下：
[0525] -尽管预测具有遗传毒性和/或诱变性，但是flagranone B和C在TGAI，MP或EP中不存在。
[0526] -结论是flagranone A不太可能具有诱变性，致癌性或生殖毒性。
[0527] -尽管预测其具有刺激性并且可能致敏，但有待消费的组织或动物产品中的flagranone A的浓度可能显著低于可能在消费者中表现这种作用的浓度。
[0528] -对结构和计算的物理性质的回顾表明，所有三种flagranone都会在吸收后经历快速代谢和消除，这意味着被消费的组织极不可能具有这些化合物的任何残留物。
[0529] 残留物数据
[0530] 已经针对flagranone A使用经验证的分析方法分析了一系列商业批次的D.flagrans菌株IAH 1297(TGAI)，结果在4.4mg/kg和73.6mg/kg之间变化，如下所示[0531] 表12：D.flagrans(TGAI)孢子批次中的flagranone A结果
[0532]
[0533] 基于上表，选择100μg/g的水平作为保守的最大浓度，其约为平均值的三倍。
[0534] 当考虑MP和EP的建议剂量时，Flagranone A的计算如下所示：
[0535] 动物中的残留物
[0536] 在MP中
[0537] D.flagrans IAH 1297内的Flagranone A含量：TGAI中的最大水平：100mg/kg或100μg/g(保守值)MP的剂量比：6g/100kg Bw/天或0.06g/kg BW/天。因此，这给予动物每日最大量的flagranone A摄入量：34.6μg/g x0.06g/kg Bw/天＝2.1μg/kg BW/天。
[0538] 在EP中
[0539] D.flagrans IAH 1297中的Flagranone A含量：100mg/kg或100μg/g(保守的最大值)。Ep的剂量比：100g/100kg Bw/天或1g/kg BW/天。因此，这给予动物每日最大量的flagranone A摄入量：2.2μg/g x 1g/kg BW/天＝2.2μg/kg BW/天。
[0540] 在关于欧盟杀虫剂数据要求的法规(EU)No 283/2013的第6.4章中，动物组织(肌肉，肝脏和乳汁)中残留物分析要求的触发值为动物饲料中该物质是4μg/kg BW/天：
[0541] “饲喂研究的目的是确定由饲料中残留物产生的动物源性产品中的残留物。如果摄入量低于0.004mg/kg bw/天，则不需要进行饲喂研究”。
[0542] 因此，经处理的动物的暴露水平远低于杀虫剂法规(EU)No 283/2013中规定的残留物分析的触发值。因此，不需要进行残留物研究。
[0543] Flagranone A被描述为是易于降解的，并且化学结构表明其在哺乳动物生物体中易于快速代谢降解，因此不存在积累的可能性。
[0544] 消费者中的残留物
[0545] 考虑到上述计算的MP和EP处理的动物的flagranone A的最大摄入量2.2μg/kg BW/天被分配到可食用的动物组织(忽略flagranone的代谢降解和化学不稳定性)。考虑到保守估计每天每kg体重消耗12.74克肉类，暴露量为：
[0546] 2.2μg/kg动物组织/天×0.0127kg动物组织/kg BW/天＝0.0279μg/kg BW/天。
[0547] 基于下面概述的Cramer分类系统，该结果远低于毒理学关注阈值(TTC)，即使是对于最关键的化学结构(EFSA，2012)。
[0548] 以下人类暴露阈值是EFSA工作中使用的保守估计值：
[0549] ·对于具有遗传毒性结构性警报的物质，0.0025μg/kg B.W，
[0550] ·对于有机磷酸酯和具有抗胆碱酯酶活性的氨基甲酸酯物质，0.3μg/kg B.W[0551] ·对于Cramer III类和Cramer II类物质，1.5μg/kg B.W，
[0552] ·对于Cramer I类物质，30μg/kg B.W。
[0553] 考虑到对flagranone A的计算机模拟分析表明没有遗传毒性结构性警报，保守估计的最大摄入量0.0279μg/kg BW/天比相关的TTC值1.5μg/kg BW/天低53倍以上。可以得出结论：在EP或MP情况下暴露于flagranone对于消费者而言没有毒理学问题。
[0554] 除了flagranone以外的未知代谢产物的残留物
[0555] 除了flagranone之外，在D.flagrans菌株IAH 1297中检测到未知的次要代谢产18
物，其水平低于flagranone水平的5％。这些次要代谢产物的以下最大残留水平计算为flagranone A的5％(最大值)：
物，其水平低于flagranone水平的5％。这些次要代谢产物的以下最大残留水平计算为flagranone A的5％(最大值)：
[0556] 动物中：
[0557] ·当饲喂MP时，2.1x 5％＝0.105μg/kg BW/天
[0558] ·当饲喂EP时，2.2x 5％＝0.11μg/kg BW/天
[0559] 两种结果都远低于4μg/kg BW/天触发水平，因此，不需要进行残留物研究。
[0560] 消费者中：
[0561] ·0.0279x 5％＝0.001395μg/kg BW/天
[0562] 即使对于具有遗传毒性结构性警报的物质，这低于0.0025μg/kg BW/天的TTC值。
[0563] 消费者通过消费来自经处理的动物的产品的flagranone A暴露量小于0.0279μg/kg Bw/天，这比1.5μg/kg BW/天的相关TTC值低53倍以上。由于暴露量比TTC低53至625倍，因此可以推测flagranone A没有明显的人类健康风险。
[0564] 制造业和农场工人的残留物暴露
[0565] 以下提供了概要：
[0566] 确定农场工人/用户的次级代谢产物flagranone A暴露量小于0.0135μg/kg BW/天，其比1.5μg/kg BW/天的相关TTC值低111倍。
[0567] 制造工人的flagranone A暴露量被确定为小于0.0024μg/kg Bw/天，这比1.5μg/kg BW/天的相关TTC值低625倍。
[0568] 分析方法
[0569] 真菌浓缩物(TGAI)
[0570] TGAI中flagranone A的方法开发，验证和结果总结如下。
[0571] 该方法已在GLP研究中根据SANCO/3030/99 rev.4 11/07/00，APVMA活性成分分析方法验证指南(APVMA Guidelines for the Validation of Analytical Methods for Active Constituent)和US EPA测试指南(U.S.EPA Test Guidelines)，OPPTS 830.1800开发和验证。
[0572] 范围：该方法适用于测定TGAI中的flagranone A。该方法在TGAI中0-1000mg/kg flagranone A的线性范围内进行验证，恢复水平在10-600mg/kg范围内。
[0573] Flagranone A的参比标准品具有99.5％的纯度。将参比材料储存在冰箱中在干冰上直至制备成溶液。
[0574] 分析方法：从10g混合且均匀的TGAI(经发酵谷物)样品中提取flagranone A的残留物。将样品离心，取出等份的上清液，稀释，过滤并使用具有UV检测的高效液相色谱(HPLC)分析flagranone A。
[0575] 选择性/干扰：通过比较来自对照样品和试剂空白的分析的结果与LOQ标准来评估干扰量(如果有的话)。如果对照提取物和试剂空白中存在的可能干扰分析的组分不以大于定量限的3％的水平存在，则认为色谱是可接受的。没有观察到干扰物质大于定量限(LOQ)的3％。
[0576] 线性：为了建立分析色谱系统对测试物质的响应的线性，制备浓度增加的十个flagranone A标准品。浓缩范围跨恢复样品中预期浓度的至少80-120％。用以下浓度的flagranone A构建标准曲线：0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50和100mg/L。接受系统2 2
线性，其中统计分析显示r ＞0.99的显著线性。每条校准曲线的相关系数(r)≥0.99，从而显示出足够的线性。
线性，其中统计分析显示r ＞0.99的显著线性。每条校准曲线的相关系数(r)≥0.99，从而显示出足够的线性。
[0577] 精确度和准确度(恢复率)：通过将等份的flagranone A储备溶液加入到每种对照谷物的10g部分中来制备10，50和150mg/kg恢复样品。通过将约6mg的flagranone A称重到每种对照谷物的10g部分上来制备600mg/kg恢复样品。当转化为％w/w时，10，50，150和600mg/kg浓度水平分别为0.001％，0.005％，0.015％和0.06％。因此，该方法验证研究中数据的可接受平均恢复范围为75-125％。
[0578] 取等份的提取物，过滤到LC小瓶中并根据该方法分析。恢复样品的真菌浓缩物以10，50，150和600mg/kg增加。结果在98-105％的范围内。
[0579] 通过在真菌浓缩物中以10，50和150mg/kg验证水平分析五个重复来证明该方法的精确度。相对标准偏差(RSD)在10，50和150mg/kg增加水平测定。如果RSD≤20％，则认为精确度可接受。本研究的恢复数据的精确度符合验收标准。
[0580] 定量限(LOQ)：通过分析估计的LOQ浓度至少6次来确定LOQ。计算平均响应(X)和标准偏差(SD)。标准偏差应＜20％。LOQ计算如下：X+(10x SD)。估计的LOQ为1.1mg/L，相当于样品中的11mg/kg。
[0581] 检测限(LOD)：通过分析产生峰的最低校准标准(最少6个重复)来确定LOD。计算平均响应(X)和标准偏差(SD)。LOD计算如下：X+(3x SD)。估计的LOD为0.005mg/L，相当于样品中的0.04mg/kg。
[0582] 系统精确度：将1mg/L flagranone A标准溶液注射十次以评估系统精确度。如果保留时间的RSD≤1％且对于峰面积≤20％，则系统精确度被认为是可接受的。发现保留时间的RSD为0.1％，峰面积的RSD为6.9％。
[0583] 方法精确度：对于每个分析，通过分析用新鲜制备的标准品以10mg/kg强化两天的至少五个新鲜制备的恢复样品来评估方法精确度。如果10mg/kg强化水平≤20％，则认为运行内相对标准偏差和运行间相对标准偏差是可接受的。发现运行内相对标准偏差在第1天为2.7％，在第2天为0.8％，并且发现运行间相对标准偏差为1.9％。
[0584] 溶液稳定性：未处理对照谷物的最终提取物的等分试样用浓度为1mg/L和15mg/L(相当于最终提取物中10mg/kg和150mg/kg恢复水平)的flagranone A强化。等分试样还用flagranone A以1mg/L和15mg/L的浓度强化。在约-20℃在黑暗中储存7天后，将分析物的浓度相对于新鲜制备的纯标准物进行定量。以相当的浓度强化新鲜制备的最终提取物以与7天稳定性样品进行比较。结果在101-107％的范围内。
[0585] 方法稳健性：通过重新分析先前制备的标准品和恢复样品组并改变流动相的组成来测试方法的稳健性。剩余的HPLC-UV条件保持不变。调整流动相组成对对flagranone A的响应没有重大影响
[0586] 结论是该方法适合于分析TGAI中的flagranone A。本研究中验证的参数符合SANCO/3030/99 rev.4 11/07/00 APVMA活性成分分析方法验证指南和U.S.EPA测试指南OPPTS 830.1800的验收标准。
[0587] MP和EP
[0588] MP和EP中flagranone A的方法开发，验证和结果总结如下。
[0589] 该方法已在GLP研究中根据SANCO/3030/99 rev.4 11/07/00，APVMA活性成分分析方法验证指南和US EPA测试指南OPPTS 830.1800开发和验证。
[0590] 范围：该方法适用于测定MP和EP中的flagranone A。该方法在真菌浓缩物中0-100mg/kg flagranone A的线性范围内进行验证，恢复水平在1-60mg/kg范围内。
[0591] Flagranone A的参比标准品具有99.5％的纯度。将参比材料储存在冰箱中在干冰上直至制备成溶液。
[0592] 分析方法：通过tissumising和摇动从10g均匀样品中提取flagranone A的残留物。将样品离心并取出等份的上清液并稀释，过滤并分析flagranone A。
[0593] 选择性/干扰：通过比较来自对照样品和试剂空白的分析的结果与LOQ标准来评估干扰量(如果有的话)。如果对照提取物和试剂空白中存在的可能干扰分析的组分不以大于定量限的3％的水平存在，则认为色谱是可接受的。对照样品中的干扰物质为LOQ的0.3％-0.4％。
[0594] 线性：为了建立分析色谱系统对测试物质的响应的线性，制备浓度增加的十个flagranone A标准品。浓缩范围跨恢复样品中预期浓度的至少80％-120％。用以下浓度的flagranone A构建标准曲线：0.0005，0.001，0.0025，0.005，0.01，0.025，0.05，0.1，0.25和2
0.5mg/L。接受系统线性，其中统计分析显示r ＞0.99的显著线性。每条校准曲线的相关系数(r2)≥0.99，从而显示出足够的线性。
0.5mg/L。接受系统线性，其中统计分析显示r ＞0.99的显著线性。每条校准曲线的相关系数(r2)≥0.99，从而显示出足够的线性。
[0595] 精确度和准确度(恢复率)：通过将由flagranone A的参比标准品制备的溶液的等分试样加入到每种对照动物饲料的10g部分上来制备恢复样品。取等份的提取物，稀释并过滤到LC小瓶中并根据该方法分析。恢复样品在MP和EP中以1，5，20和60mg/kg强化。该方法验证研究中数据的可接受平均恢复范围为75-125％，平均值为105％。
[0596] 通过在MP和EP中在每个验证水平分析五个重复来证明该方法的精确度。在每个强化水平确定相对标准偏差(RSD)。如果RSD≤20％，则认为精确度可接受。本研究的恢复数据的精确度符合验收标准。
[0597] 定量限(LOQ)：通过分析估计的LOQ浓度至少6次来确定LOQ。计算平均响应(X)和标准偏差(SD)。标准偏差应<20％。LOQ计算如下：X+(10x SD)。估计的LOQ为0.005mg/L。
[0598] 检测限(LOD)：通过分析产生峰的最低校准标准(最少6个重复)来确定LOD。计算平均响应(X)和标准偏差(SD)。LOD计算如下：X+(3x SD)。估计的LOD为0.0005mg/L。
[0599] 系统精确度：将1mg/L flagranone A标准物注射十次以评估系统精确度。仪器条件在第3.5节中列出。如果保留时间的RSD≤1％且对于峰面积≤20％，则系统精确度被认为是可接受的。发现保留时间的相对标准偏差为0.18％，峰面积的相对标准偏差为3.8％。
[0600] 方法精确度：对于每个分析，通过分析用新鲜制备的标准品以1mg/kg强化两天的至少五个新鲜制备的恢复样品来评估方法精确度。如果1mg/kg强化水平≤20％，则认为运行内相对标准偏差和运行间相对标准偏差是可接受的。发现运行内相对标准偏差在第1天为6.4％，在第2天为5.4％，并且发现运行间相对标准偏差为6.0％。
[0601] 溶液稳定性：未处理的动物饲料的最终提取物的等分试样用浓度为0.005mg/L和0.1mg/L(相当于最终提取物中1mg/kg和20mg/kg恢复水平)的flagranone A强化。等分试样还用flagranone A以0.005mg/L和0.1mg/L的浓度强化。在约-20℃下在黑暗中储存7天后，将分析物的浓度相对于新鲜制备的纯标准物进行定量。以相当的浓度强化新鲜制备的最终提取物以与7天稳定性样品进行比较。使用上面列出的条件分析样品。结果在95％-102％的范围内。
[0602] 方法稳健性：通过重新分析先前制备的标准品和恢复样品组并改变流动相‘A’的组成来测试方法的稳健性。剩余的HPLC-UV条件保持不变。调整流动相组成对对flagranone A的响应没有重大影响，并且该方法被认为是稳健的。
[0603] 结论是该方法适合于分析MP和EP中的flagranone A。本研究中验证的参数符合SANCO/3030/99 rev.4 11/07/00 APVMA活性成分分析方法验证指南和U.S.EPA测试指南OPPTS 830.1800的验收标准。
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