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一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗

阅读：476发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗，包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的H蛋白和vp2蛋白。本发明的犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，对犬瘟热强毒GN株攻毒以及犬细小病毒QN株的攻毒具有非常好的保护效果，能够有效的预防犬瘟热与细小病毒的流行和传播，降低这两种病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。，下面是一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗，其特征在于，所述的二联亚单位疫苗包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的H蛋白和vp2蛋白。
2.如权利要求1所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述的vp2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
3.如权利要求1所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述的H蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
4.如权利要求1或2所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述vp2蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
5.如权利要求1所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述的H蛋白与VP2蛋白通过杆状病毒表达制备的。
6.如权利要求1所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述的H蛋白与VP2蛋白的浓度不低于8μg/mL。
7.如权利要求1所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为烯丙基蔗糖交联丙烯酸聚合物溶液和丙三醇溶液混合配制的复合佐剂。

说明书全文

一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗

技术领域

[0001] 本发明属于兽医生物制品制备技术领域，具体涉及一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗的制备方法和应用。

背景技术

[0002] 随着人们物质生活越来越好，宠物饲养随之增加，尤其是犬猫作为伴侣动物，其数量急剧加大，由此也在不经意间也加大了各宠物之间相互接触的几率。而CDV(Canine distemper virus，CDV)和CPV (Canine parvovirus,CPV)作为犬中发病率和致死率最高的传染病病原，对犬类危害极大，并且经过几十年的不断进化，致病性不断增大。

[0003] 犬瘟热(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科的犬瘟热病毒 (Canine distemper virus，CDV)引起的犬科、鼬科和部分浣熊科动物的急性、热性、高度接触性传染病。其主要特征为双相型发热，炎、鼻、消化道等黏膜炎症，以及卡他性肺炎、皮肤湿疹和神经症状。现已有报道证实在患Pagets疾病的病人组织中检出了犬瘟热病毒核酸。可见犬瘟热的宿主范围在不断地扩大，感染谱在日益增多。近年来，随着我国军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，以及异地交流的增多，犬瘟热在我国犬中的发病率和致死率均有升高的趋势，而且临床表现也与以往有所不同。该病是目前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一，因此受到广泛重视。

[0004] 犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是引起犬科或其它食肉目动物细小病毒病(Canine parvovirus infection)的病原。自1978年首次发现以来，很快与犬瘟热病毒(Canine Distemper virus,CDV)成为犬的两种最重要的病原，常引起犬严重地出血性胃肠炎、呕吐及脱水等症状。因为病毒表面无囊膜覆盖，使得CPV具有很强的防御外界干扰的能力。它能够耐受零度低温，而且对普通消毒剂不敏感，患病犬会向周围环境释放大量病毒粒子，对于未免疫的犬，其平均感染剂量为1000个病毒粒子。病犬每盎司粪便大约有350万个病毒粒子，是平均感染剂量的35000倍。犬细小病毒病是所有犬种间流行的一种常见的，急性烈性接触性传染病，对犬类的健康造成极大的威胁。临床上主要以出血性肠炎、呕吐剧烈、白细胞总数下降、脱水、体温升高为主。

[0005] 犬瘟热病没有特效的药物进行治疗，所以早期预防和诊断就显得格外重要。CDV灭活疫苗因所产生的抗体下降较快、抗原性差、诱导体液免疫的时间短等缺点。随着弱毒疫苗的广泛使用，也发现了存在着许多缺陷，它能引起免疫抑制和一定程度上的神经系统损害，此外，由于母源抗体的干扰和病毒基因的突变等因素，免疫犬也未能得到完全保护，许多国家均有免疫群体爆发犬瘟热的报道。研究新的免疫力强的疫苗势在必行。犬细小病毒从出现到目前虽仅有三十多年的历史，但该病毒进化速度快，血清型也不断出现新的变异，该病毒引起的疾病仍然没有得到有效的控制。目前普遍使用的商品化疫苗株为 CPV-2亚型，而国内主要的流行毒株为New CPV-2a亚型，这种流行毒株与疫苗毒株的差异可能是造成疫苗免疫失败原因之一。研究开发以主要抗原基因核苷酸为主的兽用新型疫苗是本世纪的主导方向。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗及其制备方法和应用，具有安全性高和良好的免疫原性的特点，达到预防犬瘟热与犬细小的目的，提高免疫效力，降低疫苗成本。从而解决灭活疫苗免疫效果维持时间短，成本较高等问题。

[0007] 本发明所提供的犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗，包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的H蛋白和vp2 蛋白；

[0008] 所述的vp2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；

[0009] 编码H蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

[0010] 编码vp2蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

[0011] 进一步的，所述的H蛋白与VP2蛋白均通过杆状病毒来表达；

[0012] 作为优选，所述的H蛋白与VP2蛋白的浓度均不低于8μg/mL；

[0013] 本发明所提供的疫苗，其中疫苗佐剂为烯丙基蔗糖交联丙烯酸聚合物溶液和丙三醇溶液混合配制的复合佐剂。

[0014] 本发明的犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，对犬瘟热强毒GN株攻毒以及犬细小病毒QN株的攻毒具有非常好的保护效果，能够有效的预防犬瘟热与细小病毒的流行和传播，降低这两种病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。附图说明

[0015] 图1：CDV QN-1株与CDV3株H基因序列比对结果图；

[0016] 图2：CDV QN-1株与标准株H基因序列核苷酸比对结果图；

[0017] 图3：CDV QN-1株H基因序列比对结果图。

具体实施方式

[0018] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

[0019] 实施例1：犬瘟热病毒H基因的克隆表达

[0020] 本实施例所需要的毒株、菌株、细胞与质粒如下：

[0021] Vero细胞和pFastBac1质粒均由本实验室保存；大肠杆菌E.coli DH5a、购自宝生物工程(大连)有限公司；Sf9昆虫细胞有中国动物卫生与流行病学中心馈赠。

[0022] 本发明所使用的H基因从CDV QN-1株扩增获得的，QN-1株是在山东省诸城市某养殖场的水貂，约60日龄左右；未免疫水貂犬瘟热疫苗产品，水貂群出现疑似犬瘟热症状，眼、鼻有明显分泌物，食欲减退、鼻镜干燥，但未出现水貂死亡病例，怀疑受到水貂犬瘟热病毒弱毒株的感染。对从该养殖场获得的样品进行病毒筛选，最终获得了一株犬瘟热病毒CDV QN-1株Caninedistempervirus CDV QN-1,于 2018年4月11日保藏在位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:V201814；

[0023] 1、H基因与VP2基因的克隆

[0024] 分子生物学鉴定引物序列见表1。引物由北京赛百盛生物工程公司合成，用ddH2O稀释为终浓度为20pmol/μL，置-20℃保存。

[0025] 表1：VP2基因和H基因引物序列

[0026]

[0027] a序列在全基因组中的位置。

[0028] H基因与VP2基因PCR扩增产物用DNA胶回收试剂盒纯化回收，按操作说明书进行。将回收鉴定后的目的基因片段按照10μL连接反应体系与pMD18-T载体连接，操作按试剂盒说明书进行。连接后马上进行转化，转化实验的操作步骤参照分子生物学大实验。采用 TM
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I(质粒小量提取试剂盒I型)提取质粒，按试剂盒说明书进行操作。

[0029] 重组质粒的PCR鉴定：取重组质粒1μL作为模板，利用扩增引物进行PCR扩增。反应结束后，取5μL PCR产物进行凝胶电泳检测。将重组质粒进行PCR鉴定，得到大小与预期大小一致的目的片段。

[0030] 重组质粒的酶切鉴定：利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，将重组质粒用BamHⅠ和HindⅢ酶切得到两个片段与预期大小相一致。

[0031] 3)H基因与VP2基因的测序

[0032] 取菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对确认所测序列的正确性。

[0033] 测序结果表明CDV QN-1病毒株的H基因的氨基酸序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1) 与国内外报道的分离株有较大差异，与CDV3相比有14处发生了变异，P10-A10，P18-A18，Q29-E29，Q215-E215，A269-T269，S295-L295， A436-G436，Q441-E441，A457-G457，Y525-S525，D526-V526， H540-D540，P550-S550，P583-A583，显示了病毒的变化。其中 Y525-S525和D526-V526这两个突变位点发生在宿主细胞结合的受体关键区域，会影响CDV与宿主细胞的结合，这很可能是导致CDV QN-1 毒力降低的原因。

[0034] VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

[0035] 2、重组表达载体pFastBac1-H与pFastBac1-VP2的构建

[0036] 1)设计2对表达引物，在引物5’端引入BamHI和XhoI酶切位点和保护性碱基，预期片段大小分别为为1921bp与1755bp，PCR扩增H基因与VP2基因，目的片段与表达载体pFastBac1的双酶切，将胶回收的基因片段与pFastBac1载体在冰浴中连接，连接体系为 10μL，连接体系混匀后，将其置于16℃过夜。连接后马上进行转化，转化实验的操作步骤参照分子生物学大实验。采用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I(质粒小量提取试剂盒I型)提取质粒，按试剂盒说明书进行操作。

[0037] 2)重组表达载体的鉴定

[0038] 在转化菌培养平板上随机挑取单菌落，进行重组菌鉴定。

[0039] 将重组菌培养并提取质粒后，质粒作10倍稀释，进行PCR鉴定。 PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

[0040] 将提取的重组质粒，用BamHⅠ和XhoI双酶切均匀混合后，于37℃ 水浴4h，1％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，同时用空白质粒载体作为阴性对照。

[0041] 将重组原核表达质粒pFastBac1-H与pFastBac1-VP2经BamHⅠ、 XhoI双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳均出现2条特异性条带，所得条带大小分别为4775bp和1921bp，4775bp和1755bp，与预期大小相符，将鉴定为阳性的重组质粒送华大基因科技股份有限公司测序。
与 GenBank已发表的序列进行同源性比较，将测序确定为阳性的质粒保存备用。

[0042] 3、pFastBac1-H与pFastBac1-VP2在Sf9昆虫细胞中的表达和鉴定 1)重组穿梭杆粒pFastBac1-H与pFastBac1-VP2分别转染Sf9昆虫细胞

[0043] 取生长状态良好的昆虫细胞，进行活细胞计数，计算其成活率(细胞成活率要高于95％)。取2mL生长状态良好的昆虫细胞，细胞计数约为2×106加入到六孔板中，让细胞贴壁生长至少1h，并设立阴性对照。准备两个灭菌的1.5mL离心管，一个离心管加入100μL的无血清培养基和2μL的重组杆粒(约1-2ng)，并将其混匀。另一个离心管中加入100μL无血清培养基和的8μL Cellfectin Reagent脂质体转染试剂，轻轻将其混匀。在两个离心管上分别做好标记，于室温静置 15-20min。将两个离心管中的混合液混在一起，并轻轻混合均匀，于室温温育30min，然后在上述混合液中加入预热的无血清培养基800 μL混合均匀，然后将混合液一滴一滴的轻轻滴在预先贴壁的Sf9昆虫细胞上，此过程一定要缓慢，之后置于27℃培养箱中避光培养5h。培养5h以后，吸掉六孔板中的培养基，加入预热的新鲜Sf-
900TMⅢ SFM(1×)无血清培养基，然后置于27℃培养箱中避光培养3-5d，直至细胞出现病变为止。

[0044] 将鉴定正确的重组穿梭杆粒转染Sf9昆虫细胞以后，转染成功的细胞出现明细的细胞病变：细胞变大、变圆、有的细胞破裂等。而转入空载体的细胞生长良好。

[0045] 2)重组杆状病毒的收获

[0046] 细胞培养3-5d以后，如果转染成功，会看到明显的细胞病变，细胞直径会增大，细胞核充满整个细胞，有的细胞会出现破裂，最后，细胞从平板上脱落下来。此时可以轻轻吹打六孔板中的细胞，收集细胞悬液，转入到无菌的10mL离心管中于4℃保存，如果要长期保存，可将其置于-80℃冰箱中，此毒即为P1代毒。

[0047] 3)重组杆状病毒的扩增

[0048] 收集P1代毒当天，取生长良好的Sf9昆虫细胞2mL，细胞计数约 2x106个细胞，接种到六孔细胞培养板中，让细胞贴壁生长3h，并设立阴性对照，取P1代毒约30uL接种到上述六孔细胞培养板中，置于 27℃细胞培养箱中培养3-5d，期间注意观察细胞的形态变化，当细胞出现细胞病变并且从平板上脱落下来的时候，按照收集P1代毒的方法进行收毒，此时收到的杆状病毒即为P2代毒，依照此方法再接种细胞，即可得到高病毒滴度的P3代毒。

[0049] 4)Western blot检测pFastBac1-H蛋白表达的鉴定

[0050] 将重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分离后进行电转印，然后以兔抗CDV阳性血清为一抗，HRP标记羊抗兔IgG为二抗，进行 Western-blot鉴定，重组蛋白Head Domain相对分子质量约50.8ku，与预期大小相符。表明重组蛋白均能与阳性血清特异性结合，具有良好的抗原性。

[0051] 5)Western blot检测pFastBac1-VP2蛋白表达的鉴定

[0052] 将重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分离后进行电转印，然后以兔抗CPV阳性血清为一抗，HRP标记羊抗兔IgG为二抗，进行 Western-blot鉴定，重组蛋白VP2相对分子质量约64.5ku，与预期大小相符。表明重组蛋白均能与阳性血清特异性结合，具有良好的抗原性[0053] 4、病毒滴度测定

[0054] 对原始毒种进行重组杆状病毒滴度检测，采用间接免疫荧光(IFA)法，采用Reed-Muench方法进行滴度计算，病毒滴度不低于 2×107IFU/ml。

[0055] 实施例3：犬瘟热病毒H基因与犬细小VP2亚单位疫苗实验室试制及产品质量研究[0056] 病毒与细胞

[0057] 制造本品用的毒种为CDV与CPV重组杆状病毒，由青岛农业大学构建、保管和供应，病毒滴度≥107IFU/ml；Sf9生产用细胞第6 代，由青岛农业大学鉴定、保管和供应。

[0058] 1、病毒接种与培养

[0059] 将毒种按0.01％的接种量接种细胞密度达1×106cells/ml的Sf9细胞，27℃条件下连续培养72小时，收获病毒上清液，12000rpm离心 20分钟，收集上清，即为生产用毒，-20℃保存备用。

[0060] 当生物反应器内Sf9细胞密度达1×106cells/ml时，将生产用毒种按 1％的接种量接毒，接毒后27℃继续培养120小时，转速80rpm，溶氧值60％，pH值6.2。培养120小时后，收获病毒培养液，标记产品名称、制备日期和数量。收获的病毒液于2～8℃保存。按相同步骤制备犬细小重组病毒半成品，将收获的病毒液取样，进行间接免疫荧光(IFA) 检测病毒滴度。

[0061] 表2生产用毒病毒含量测定结果

[0062]

[0063] 2、疫苗配制

[0064] 1)过滤将收获的病毒液依次经过1.0μm滤膜系统和0.22μm滤膜系统过滤，滤液分装于无菌容器，注明收获日期，置于2～8℃保存。

[0065] 2)灭活将0.2M灭活剂二乙烯亚胺(BEI)以一定比例加入过滤后的病毒液内，终浓度为5mM，37℃连续搅拌灭活72小时，反应终止后加入终浓度为5mM的硫代硫酸钠中和多余的BEI，2～8℃条件下保存。

[0066] 3)灭活病毒液检验

[0067] 灭活检验取灭活病毒液加入Sf9细胞，27℃培养72小时后盲传，连续盲传3代，每代进行间接免疫荧光(IFA)检测。每代灭活病毒液传代产物均无绿色特异性荧光，阳性对照应出现绿色特异性荧光。

[0068] 无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

[0069] 目的蛋白含量检测取灭活病毒液进行目的蛋白含量检测，每毫升目的蛋白含量≥16μg/ml。

[0070] 4)复合佐剂配制复合佐剂溶液的主要成份是由烯丙基蔗糖交联丙烯酸聚合物溶液A和丙三醇溶液B按5:1的比例混合，最后根据佐剂用量加入适量无菌纯化水混匀配制组成。

[0071] 5)疫苗制备

[0072] 疫苗配制方案疫苗成分主要含犬瘟热H蛋白重组杆状病毒灭活液、犬细小VP2蛋白重组杆状病毒灭活液、复合佐剂成分溶液A和溶液B。疫苗配制按每毫升疫苗终浓度含犬瘟热H蛋白、犬细小VP2 蛋白均不低于8ug，抗原量与佐剂按1:1比例进行配制。

[0073] 疫苗配制过程将检验合格的灭活抗原液调整为目的蛋白含量均 ≥16ug/ml置于无菌配苗罐中，开动搅拌器低速搅拌，按1:1的比例称取复合佐剂溶液缓慢加入配苗罐中，并以200rpm进行搅拌20分钟，其混合均匀。

[0074] 6)分装

[0075] 疫苗充分混合后，20ml/瓶定量分装，加盖密封，贴签。

[0076] 3、成品检验

[0077] 1)性状将疫苗取样于室温自然光充足的条件下观察疫苗颜色，应为无色或微黄色混悬液。

[0078] 2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

[0079] 3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

[0080] 4)安全检验取健康易感比格犬(犬瘟热与犬细小中和抗体均不高于1:4)20只，随机分为4组。1～3组为疫苗免疫组，每组5只，4 组为对照组，5只。1组皮下分5点注射犬瘟热病毒H基因与犬细小 VP2亚单位疫苗(pFastBac1-H+pFastBac1-VP2株)，每只注射1头份 (1ml)，2组皮下分10点注射犬瘟热病毒H基因与犬细小VP2亚单位疫苗(pFastBac1-H+pFastBac1-VP2株)，每只注射2头份(1ml)， 3组皮下分15点注射犬瘟热病毒H基因与犬细小VP2亚单位疫苗 (pFastBac1-H+pFastBac1-VP2株)，每只注射5头份(1ml)，免疫后对试验犬及对照犬连续观察14日，观察记录体温、精神状态、食欲、粪便变化情况及注射局部是否有不良反应，试验开始首日、试验最后一日分别称量试验犬体重，评价犬生长状况，于试验最后一日，每组剖杀3只犬，检查注射部位有无病理变化。在观察期内，三组犬瘟热病毒H基因与犬细小VP2亚单位疫苗 (pFastBac1-H+pFastBac1-VP2株)免疫组和对照组犬在体温、精神状态、食欲、粪便均正常，注射局部无肿胀和炎症等不良反应，注射部位剖检检查未出现异常变化，疫苗接种组犬生长情况与对照组差异不显著。

[0081] 5)效力检验

[0082] 取健康易感犬(犬瘟热与犬细小中和抗体均不高于1:4)30只，随机分为3组。1组为疫苗免疫组，10只，免疫自制的二联亚单位疫苗，皮下分5点注射犬瘟热病毒H基因与犬细小VP2亚单位疫苗 (pFastBac1-H+pFastBac1-VP2株)，每只注射1头份(1ml)。2组为犬瘟热-细小二联疫苗免疫组，10只，3组对照组，每组10只。免疫后21日当天，采血，测定血清犬瘟热与犬细小中和抗体效价。犬瘟热抗体效价通过中和试验测定，犬细小抗体效价通过血凝/血凝抑制试验测定。结果显示，犬瘟热病毒H基因与犬细小VP2亚单位疫苗(pFastBac1-H+pFastBac1-VP2株)组中和抗体效价均高于对照疫苗组。采血结束后，每组随机取5只每只以1ml(含100个ID50)的犬瘟热病毒GN株(脏器毒)攻击，连续观察21日，观察记录试验犬和对照犬的体温变化和临床症状。每组取另外5只每只以1ml(含 100个ID50)的犬细小病毒QN株攻击，连续观察21日，观察记录试验犬和对照犬的体温变化和临床症状。

[0083] 表3抗体检测结果与攻毒保护试验结果

[0084]

[0085]

[0086] 结果显示，三批犬瘟热病毒H基因与犬细小VP2亚单位疫苗 (pFastBac1-H+pFastBac1-VP2株)接种试验犬对犬瘟热病毒GN株 (脏器毒)与犬细小病毒QN株攻击均为5/5保护，对照组5/5发病。具体结果见表3。

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