IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌(IRTCA)抗体及其应用
阅读：195发布：2021-11-30
专利汇可以提供IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌(IRTCA)抗体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在此提供IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌(IRTCA) 抗体 及其 抗原 结合 片段 ，所述抗体及片段结合活化诱导型TNFR(AITR)多肽。还提供了与本文所述IRTCA抗体相关的各种体外和体内方法以及组合物。方法包括例如采用IRTCA抗体或其片段在体内或体外改变T细胞的细胞因子分泌，以及 预防 和/或 治疗 癌症。，下面是IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌(IRTCA)抗体及其应用专利的具体信息内容。
1.一种IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌(IRTCA)抗体或其抗原结合片段，包含：
(a)含序列SEQ ID NO:8或24的重链CDR1，含序列SEQ ID NO:9或25的重链CDR2和含有选自SEQ ID NO:14、15、16和17至少其一所示序列的重链CDR3；和
(b)含序列SEQ ID NO:11的轻链CDR1、含序列SEQ ID NO:12的轻链CDR2和含序列SEQ ID NO:13或18的轻链CDR3；
其中，所述IRTCA抗体或其抗原结合片段不含以下各项：含序列SEQ ID NO:8的重链CDR1、含序列SEQ ID NO:9的重链CDR2、含序列SEQ ID NO:10的重链CDR3、含序列SEQ ID NO:11的轻链CDR1、含序列SEQ ID NO:12的轻链CDR2和含序列SEQ ID NO:13的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含以下所述任一项：
(a)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少90％相同的序列的重链可变域；
(b)包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少90％相同的序列的轻链可变域；或者
(c)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少90％相同的序列的重链可变域和包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少90％相同的序列的轻链可变域。
3.如权利要求1所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含以下所述任一项：
(a)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少98％相同的序列的重链可变域；
(b)包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少98％相同的序列的轻链可变域；或者(c)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少98％相同的序列的重链可变域和包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少98％相同的序列的轻链可变域。
4.如权利要求1-3中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含以下所述任一项：
(a)包含选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列的重链可变域；
(b)包含选自SEQ ID NO:7、22和23的序列的轻链可变域；或者
(c)包含选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列的重链可变域和包含选自SEQ ID NO:
7、22和23的序列的轻链可变域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段对人活化诱导型肿瘤坏死因子受体(AITR)分子具有1x10-7至1x10-12M的结合亲和力(KD)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段结合人AITR多肽胞外域内的表位。
7.如权利要求6所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述人AITR多肽胞外域内的表位包含SEQ ID NO:19。
8.如权利要求1-7中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体具有免疫球蛋白恒定域，其中，所述恒定域选自IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG4或其变体、IgA或其变体、IgE或其变体、IgM或其变体和IgD或其变体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是或含人IgG1。
10.如权利要求9所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述IgG1是或含与SEQ ID NO:26至少95％相同的序列。
11.如权利要求1-10中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。
12.如权利要求1-8中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键结合的Fv片段、scFv片段、单域抗体、Humabody、纳米抗体或双功能抗体。
13.一种核酸分子，其编码权利要求1-12中任一项所述的IRTCA抗体或抗原结合片段。
14.一种重组载体，包含权利要求13所述的核酸分子。
15.一种宿主细胞，包含权利要求15所述的重组载体和/或权利要求13所述的核酸分子。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
17.如权利要求16所述的宿主细胞，所述宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、Sf9、COS、HEK293、Expi293、CHO-S、CHO-DG44、CHO-K1和哺乳动物淋巴细胞。
18.一种药物组合物，包含：
(a)权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段、权利要求14所述核酸分子、权利要求14所述重组载体或权利要求15所述宿主细胞；和
(b)药学上可接受的运载体。
19.一种对有此需要的对象进行处置的方法，所述方法包括以下步骤：
给予所述对象一种组合物，所述组合物包含或递送权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段、权利要求13所述核酸分子或权利要求14所述重组载体。
20.一种在有此需要的对象中诱导免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：
给予所述对象一种组合物，所述组合物包含或递送权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段、权利要求13所述核酸分子或权利要求14所述重组载体。
21.一种在有此需要的对象中增强免疫反应或提高免疫细胞活性的方法，所述方法包括以下步骤：
给予所述对象一种组合物，所述组合物包含或递送权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段、权利要求13所述核酸分子或权利要求14所述重组载体。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，所述对象有罹患癌症的风险或正处于所述风险中。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠癌、头颈癌、血液癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。
24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中，所述对象曾接受或将要接受一种或多种其他抗癌治疗从而使得所述对象接受两方面治疗，所述其他抗癌治疗选自：电离辐射、化学治疗剂、抗体类药物和细胞疗法。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述一种或多种其他抗癌治疗包括免疫哨点抑制剂、IL-12、GM-CSF、抗CD4药物、顺铂、氟尿嘧啶、多柔比星、伊立替康、紫杉醇、吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)抑制剂或环磷酰胺。
26.一种确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，包括：
(a)提供或获取所述对象生物样品中分泌IFN-γ的测量值，其中，所述对象接受过包含或递送一定量权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物；和(b)将分泌IFN-γ的测量值与参比值相比，
如果分泌IFN-γ的测量值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。
27.一种确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，包括：
(a)提供或获取所述对象生物样品中Treg细胞群测量值，其中，所述对象接受过包含或递送一定量权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物；和(b)将Treg细胞群测量值与参比值相比，
如果Treg细胞群测量值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中，所述参比值包括指数值，所述指数值包括来自一名或多名健康对象的值或来自一名或多名癌症确诊对象的值。
29.如权利要求26、27或28中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是全血样品、血浆样品、肿瘤组织样品或血清样品。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中，所述对象有罹患癌症的风险或正处于所述风险中。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠癌、头颈癌、血液癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。
32.一种体内或体外提高T细胞IFN-γ分泌的方法，所述方法包括：令所述细胞接触权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段。
33.一种体内或体外降低T细胞TGF-β分泌的方法，所述方法包括：令所述细胞接触权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段。
34.一种令T细胞转换为1型辅助T(TH1)细胞的方法，所述方法包括：令所述细胞接触权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段。
35.一种确认抗体或其抗原结合片段对AITR亲和力的方法，所述方法包括：
令所述细胞接触权利要求1-12中任一项所述IRTCA抗体或抗原结合片段；以及
测定T细胞的细胞因子分泌；
其中，细胞因子分泌关联IRTCA抗体的免疫反应增强、抗癌效果和/或抗肿瘤效果。
36.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，所述T细胞表达AITR蛋白。
37.如权利要求32-36中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是调节性T细胞(Treg细胞)。
38.如权利要求32-36中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是效应T细胞(Teff细胞)。
IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌(IRTCA)抗体及其
应用
相关申请的交叉引用
[0002] 本说明书会援引序列表(已于2018年2月9日以.txt文件的电子形式提交，文件名为“2012994-0030_SL.txt”)。该后缀名为“.txt”的文件生成于2018年2月9日，共19,405字节。该序列表的全部内容通过引用纳入本文。技术背景
[0003] 癌症至今仍是世界上主要的死亡原因之一。最近的统计数据报道称全球人口有13％死于癌症。根据国际癌症研究机构(IARC)的估计，2012年全球新发癌症病例1410万例，癌症死亡人数820万例。到2030年，由于人口增长和老龄化以及接触诸如吸烟、不健康饮食和缺乏身体活动等风险因素，全球负担预计将增加至2170万新癌症病例和1300万癌症死亡人数。此外，癌症治疗的痛苦和医疗开支导致癌症患者及其家人生活品质降低。显而易见，癌症是一种亟需寻求更好治疗方法的疾病。
发明内容
发明内容
[0004] 本文提供的内容包括结合人活化诱导型TNFR家族受体(AITR)多肽的抗体及其片段。某些实施方式中，本发明提供IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌(IFN-γ-Inducible Regulatory T Cell Convertible Anti-Cancer，IRTCA)抗体和/或其抗原结合片段，所述抗体和/或其抗原结合片段包含：(a)含序列SEQ ID NO:8或24的重链CDR1，含序列SEQ ID NO:9或25的重链CDR2和含有选自SEQ ID NO:14、15、16和17至少其一所示序列的重链CDR3；和(b)含序列SEQ ID NO:11的轻链CDR1、含序列SEQ ID NO:12的轻链CDR2和含序列SEQ ID NO:13或18的轻链CDR3；其中，所述IRTCA抗体或其抗原结合片段不含以下各项：
含序列SEQ ID NO:8的重链CDR1、含序列SEQ ID NO:9的重链CDR2、含序列SEQ ID NO:10的重链CDR3、含序列SEQ ID NO:11的轻链CDR1、含序列SEQ ID NO:12的轻链CDR2和含序列SEQ ID NO:13的轻链CDR3。
含序列SEQ ID NO:8的重链CDR1、含序列SEQ ID NO:9的重链CDR2、含序列SEQ ID NO:10的重链CDR3、含序列SEQ ID NO:11的轻链CDR1、含序列SEQ ID NO:12的轻链CDR2和含序列SEQ ID NO:13的轻链CDR3。
[0005] 某些实施方式中，本发明还提供包含以下任一项的IRTCA抗体或抗原结合片段：(a)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少90％相同的序列的重链可变域；(b)包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少90％相同的序列的轻链可变域；或(c)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少90％相同的序列的重链可变域和包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少90％相同的序列的轻链可变域。
[0006] 某些实施方式中，本发明还提供包含以下任一项的IRTCA抗体或抗原结合片段：(a)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少98％相同的序列的重链可变域；(b)包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少98％相同的序列的轻链可变域；或(c)包含与选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列至少98％相同的序列的重链可变域和包含与选自SEQ ID NO:7、22和23的序列至少98％相同的序列的轻链可变域。
[0007] 某些实施方式中，提供的IRTCA抗体或抗原结合片段包含以下任一项：(a)包含选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列的重链可变域；(b)包含选自SEQ ID NO:7、22和23的序列的轻链可变域；或者(c)包含选自SEQ ID NO:3、4、5、6、20和21的序列的重链可变域和包含选自SEQ ID NO:7、22和23的序列的轻链可变域。
[0008] 某些实施方式中，所述IRTCA抗体或其抗原结合片段不含以下各项：含序列SEQ ID NO:8的重链CDR1、含序列SEQ ID NO:9的重链CDR2、含序列SEQ ID NO:10的重链CDR3、含序列SEQ ID NO:11的轻链CDR1、含序列SEQ ID NO:12的轻链CDR2和含序列SEQ ID NO:13的轻链CDR3。
[0009] 根据多种实施方案中的任一种，提供的IRTCA抗体或其抗原结合片段，和/或提供的组合物可以表现出广泛的结合亲和力。例如，某些实施方式中，提供的IRTCA抗体或抗原结合片段对人活化诱导型肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族受体(AITR)分子具有1x10-7至1x10-12M的结合亲和力(KD)。某些实施方式中，提供的IRTCA抗体或抗原结合片段结合人AITR多肽胞外域内的表位。某些实施方式中，人AITR多肽胞外域内的表位包含SEQ ID NO:
19。
19。
[0010] 某些实施方式中，提供的抗体或抗原结合片段是或包含人源化抗体。某些实施方式中，提供的IRTCA抗体或其抗原结合片段是或包含单克隆抗体。某些实施方式中，提供的IRTCA抗体或其抗原结合片段具有免疫球蛋白恒定域，所述恒定域选自IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG4或其变体、IgA或其变体、IgE或其变体、IgM或其变体和IgD或其变体。某些实施方式中，提供的IRTCA抗体或其抗原结合片段是或包含人IgG1。某些实施方式中，所述IgG1是或含与SEQ ID NO:26至少95％相同的序列。某些实施方式中，提供的IRTCA抗体或其抗原结合片段是或包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键结合的Fv片段、scFv片段、单域抗体、Humabody、纳米抗体或双功能抗体。
[0011] 根据各种实施方案，本发明提供多种分子和组合物，所述分子和组合物用于促进本文所提供组合物的递送和/或表达，所述本文提供的组合物包含一定量的本文IRTCA抗体或其抗原结合片段。例如，某些实施方式中，本发明提供编码IRTCA抗体或其抗原结合片段的核酸分子。某些实施方式中，本发明还提供包含所述核酸分子的重组载体。某些实施方式中，本发明还提供包含所述重组载体和/或所述核酸分子的宿主细胞。某些实施方式中，宿主细胞可选自细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。某些实施方式中，宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)、毕赤酵母(P.pastoris)、Sf9、COS、HEK293、Expi293、CHO-S、CHO-DG44、CHO-K1和哺乳动物淋巴细胞。
[0012] 某些实施方式中，本发明提供药物组合物，其中包含：(a)一种或多种所述IRTCA抗体或其抗原结合片段、一种或多种所述核酸分子、一种或多种重组载体和/或一种或多种所述宿主细胞，和(b)药学上可接受的运载体。多种药学上可接受的运载体均可用于各种实施方式。
[0013] 除了本文提供的各种强效新抗体、其抗原结合片段和组合物之外，本发明还在各种实施方案中提供了多种新的治疗方法。例如，据多种实施方式，本发明提供对有此需要的对象进行治疗的方法，所述方法包括以下步骤：给予该对象包含或递送所述IRTCA抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子和/或所述重组载体的组合物。
[0014] 另外举例来说，某些实施方式中，本发明还在某些实施方式中提供了在有此需要的对象中诱导免疫反应的方法，所述方法包括：给予对象包含或递送所述IRTCA抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子和/或所述重组载体的组合物。
[0015] 进一步举例来说，某些实施方式中，本发明还提供了在有此需要的对象中增强免疫反应或提高免疫细胞活性的方法，所述方法包括：给予对象包含或递送所述IRTCA抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子和/或所述重组载体的组合物。
[0016] 某些实施方式，本发明还提供体内或体外提高T细胞IFN-γ分泌的方法，所述方法包括：令所述细胞接触包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物。某些实施方式，本发明还提供体内或体外提高T细胞TGF-β分泌的方法，所述方法包括：令所述细胞接触包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物。某些实施方式中，本发明还提供令T细胞转换为1型辅助T(TH1)细胞的方法，所述方法包括：令所述细胞接触包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物。
[0017] 某些实施方式中，所述对象有罹患癌症的风险或正处于所述风险中。某些实施方式中，所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠癌、头颈癌、血液癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。
[0018] 本文特别考虑，各种实施方式适合用于一种或多种联合治疗方案。例如，某些实施方式中，对象曾经或将要接受一种或多种其他抗癌治疗。某些实施方式中，所述一种或多种其他抗癌治疗选自电离辐射、化学治疗剂、抗体类药物和细胞疗法，从而使得对象接受两种治疗。某些实施方式中，所述一种或多种其他抗癌治疗包括免疫哨点抑制剂、IL-12、GM-CSF、抗CD4药物、顺铂、氟尿嘧啶、多柔比星、伊立替康、紫杉醇、吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)抑制剂或环磷酰胺。
[0019] 本发明的各种实施方案还可用于确定一种或多种本文提供的IRTCA抗体和/或其抗原结合片段、核酸分子、重组载体和/或宿主细胞的有利给药方案。例如，某些实施方式中，本发明提供确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，所述方法包括：(a)提供或获取对象生物样品中分泌IFN-γ的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物，并(b)将分泌IFN-γ的测量值与参比值相比，如果分泌IFN-γ的测量值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。
[0020] 某些实施方式中，参比值可以是所述IRTCA抗体或其抗原结合片段给药前对象生物样品中的IFN-γ水平。某些实施方式中，如果对象生物样品中的分泌IFN-γ测量值高于参比值，则将治疗或者维持先前水平或者中断一段时间。
[0021] 另外举例来说，某些实施方式中，本发明提供确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，所述方法包括：(a)提供或获取对象生物样品中Treg细胞群的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物，并(b)将Treg细胞群的测量值与参比值相比，如果Treg细胞群的测量值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。某些实施方式中，参比值可以是所述IRTCA抗体或其抗原结合片段给药前对象生物样品中的Treg细胞群水平。某些实施方式中，如果对象生物样品中的Treg细胞群测量值低于参比值，则将治疗或者维持先前水平或者中断一段时间。
[0022] 另外举例来说，某些实施方式中，本发明提供确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，所述方法包括：(a)提供或获取所述对象生物样品中IFN-γ分泌性T细胞群的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物；(b)提供或获取所述对象生物样品中Treg细胞群的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物；(c)计算IFN-γ分泌性T细胞群的测量值与Treg细胞群的测量值之比；和(d)将该比值与参比值相比，如果该比值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。某些实施方式中，参比值可以是所述IRTCA抗体或其抗原结合片段给药前对象生物样品中IFN-γ分泌性T细胞群水平与同一生物样品中Treg细胞群水平之比。某些实施方式中，如果对象生物样品中的算得比值高于参比值，则将治疗或者维持先前水平或者中断一段时间。
[0024] 某些实施方式中，本发明还提供确认(validating)抗体或其抗原结合片段对AITR亲和力的方法，所述方法包括：令所述细胞接触包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物，并测定T细胞的细胞因子分泌，其中，细胞因子分泌关联IRTCA抗体的免疫反应增强、抗癌效果和/或抗肿瘤效果。某些实施方式中，所述T细胞表达AITR蛋白。某些实施方式中，T细胞是调节性T细胞(Treg细胞)。某些实施方式中，T细胞是效应T细胞(Teff细胞)。
[0025] 本申请中，术语“约”和“大致”同义。文中引用的公开文献、专利或专利申请均通过援引全文纳入。本申请中，所有数值，不论有无“约”/“大致”等约略表示，都涵盖本领域技术人员所能认可的任何正常波动。
[0026] 由以下详细描述可见本发明的其他特征、目的和优势。但应理解，详细描述虽然指示了本发明实施方式但仅仅是说明性的，不构成限定。通过详细的说明，本领域技术人员可以看出本发明范围内的各种改换。附图简要说明
[0027] 如下所述的本文附图仅用于说明而非限定。后文描述结合附图有助于更清楚、更好地理解本发明如前文所述及其他目的、内容、特征和优点。
[0028] 图1：IRTCA-A的Fab型氨基酸序列，其中a和b分别代表IRTCA-A Fab型的氨基酸序列和插入终止密码子的IRTCA-A氨基酸序列(星号表示终止密码子)。
[0029] 图2：IRTCA-A的氨基酸区域，其中有诱导的随机PCR构型和突变。分图a显示IRTCA-A轻链，分图b显示IRTCA-A重链。采用随机引物在CDR3区诱导突变并构建突变集中于CDR3区的噬菌体展示文库。
[0030] 图3：IRTCA-A系列中16个重链突变体和9个轻链突变体对AITR抗原的解离曲线重叠图。
[0031] 图4：IRTCA-A系列中22个轻链突变体对AITR抗原的解离曲线重叠图。
[0032] 图5：IRTCA-A诱导的CD4+T细胞的细胞因子IFN-γ分泌。IRTCA-A以剂量依赖性方式诱导IFN-γ分泌。
[0033] 图6A：IRTCA-A处理后Treg细胞IFN-γ分泌剂量依赖性改变的量化显示。图6B：IRTCA-A处理后Treg细胞TGF-β分泌剂量依赖性改变的量化显示。
[0034] 图7A：几种IRTCA-A突变体处理后CD4T细胞IFN-γ分泌剂量依赖性改变的量化显示。图7B：几种IRTCA-A突变体处理后Treg细胞IFN-γ分泌剂量依赖性改变的量化显示。图7C：几种IRTCA-A突变体处理后Treg细胞TGF-β分泌剂量依赖性改变的量化显示。
[0035] 图8：Hu-PBL-SCID小鼠(注射了结直肠癌细胞)接受IRTCA抗体处理后肿瘤体积剂量依赖性缩小。
[0036] 图9：量化显示对照hIgG、H1F1抗体、MK4166和Keytruda对肿瘤大小的作用。箭头指示治疗或对照抗体的注射天数。
[0037] 图10A：量化显示H1F1或对照抗体在三剂次(箭头)抗体处理后对肿瘤(三阴性乳腺癌)大小的作用。图10B：量化显示H1F1或对照抗体在三剂次(箭头)抗体处理后对肿瘤(结肠癌)大小的作用。图10C：量化显示H1F1或对照抗体在三剂次(箭头)抗体处理后对肿瘤(黑色素瘤)大小的作用。图10D：量化显示H1F1或对照抗体在三剂次(箭头)抗体处理后对肿瘤(黑色素瘤)大小的作用。
[0038] 图11：量化显示H1F1对食蟹猴(Macaca fascicularis)CD4+CD25高Foxp3+T细胞的细胞因子分泌的作用。
[0039] 图12：量化显示猕猴体内H1F1介导的调节性T细胞向TH1细胞转换。不同于hIgG处理的对照组(A)，22mg/kg H1F1(B)、45mg/kg H1F1(C)和90mg/kg H1F1(D)处理的细胞显示IFN-γ阳性CD4+T细胞在三周过程中升高。
[0040] 图13：H1F1对细胞因子的差异性诱导。H1F1处理的细胞中，细胞因子IL-4(B)和IL-5(C)的分泌不受影响，而IL-2(A)和IFN-γ(D)分泌在H1F1处理后增加。
[0041] 图14：量化显示H1F1对CD4+CD25+Foxp3高(A)、TGF-β(B)、CD4+IFN-γ(C)和CD4+T-bet+(D)表达细胞群的剂量依赖性作用。
[0042] 图15：EBV阳性胃癌细胞和AML患者骨髓中的H1F1特异性染色。
[0043] 图16A：H1F1在10、5、2.5和1.25μg/mL浓度与AITR-5的结合，与不结合AITR-5的阴性对照mAb EU101相比。图16B：H1F1M69和H1F1M74以剂量依赖性方式与AITR-5结合。
[0044] 图17：H1F1M69(B)和H1F1M74(C)刺激后nTreg细胞向TH1样细胞转换，与hIgG对照(A)相比。各分图中的数字是阳性细胞的百分比。
[0045] 图18：量化显示H1F1M69和H1F1M74对nTreg细胞中TGF-β和IFN-γ的剂量依赖性作用。
[0046] 图19：抗CD3/CD28珠、IL-2和TGF-β处理6天后来自CD4+T细胞的iTreg细胞生成。
[0047] 图20：H1F1M69和H1F1M74与iTreg细胞上AITR的结合效率。分图A和B显示门控参数。分图C显示同型对照。分图D-G显示：相比竞争对手的抗AITR抗体TRX518(F)和MK4166(G)，H1F1M69(D)和H1F1M74(E)检测到表面AITR的频率更高。
[0048] 图21：抗AITR抗体刺激后的iTreg细胞向TH1样细胞转换。分图A显示hIgG对照。分图B-E显示H1F1M69(B)、H1F1M74(C)、TRX518(D)和MK4166(E)对iTreg细胞的作用。
[0049] 图22：量化显示H1F1M69和H1F1M74对iTreg细胞中TGF-β和IFN-γ的剂量依赖性作用。
[0050] 图23：固定化单克隆抗体hIgG(A)、H1F1M69(B)、H1F1M74(C)、TRX518(D)和MK4166(E)对iTreg细胞中Foxp3的作用。
[0051] 图24：加入IL-2与H1F1M69(A)或与H1F1M74(B)包被孔内后，iTreg细胞向TH1样细胞转换。各分图中的数字是阳性细胞的百分比。
[0052] 图25：抗体处理后Teff细胞向TH1的极化。分图A显示对照hIgG的效果。分图B显示H1F1M69和H1F1M74的效果。分图C显示抗体TRX518和MK4166的效果。
[0053] 图26：量化显示H1F1M69和H1F1M74对Teff细胞中IFN-γ的剂量依赖性作用。定义
[0055] 约：本文中，术语“约”用于某值时表示该值的近似值。一般而言，熟悉相关内容的本领域技术人员将理解就所述相关内容而言“约”所涵盖的差异程度。例如，某些实施方式中，术语“约”表示与参比值相差25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少范围内的值。
[0056] 给药(给予)：本文中，“给药(给予)”通常是指将组合物给予对象或系统以实现物质的递送，所述物质即所述组合物或包含于所述组合物中。本领域普通技术人员知道适当情形下用于对象(如人)给药的各种途径。例如，某些实施方式中，给药可以是眼部、口服、胃肠外、局部给药等。某些具体实施方案中，给药可以是支气管(如通过支气管灌注)、口颊、皮肤(其可以是或包括例如局部至真皮、真皮内(intradermal)、皮内(interdermal)、透皮等中的一种或多种)、肠内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(如肝内)、黏膜、鼻腔、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(如通过气管内灌注)、阴道、玻璃体等。某些实施方式中，给药仅包括一个剂次。某些实施方式中，给药可包括施用固定数目的剂次。某些实施方式中，给药可包括间歇给药(例如在时间上分开的多个剂次)和/或定期给药(例如各剂次间隔相同)。某些实施方式中，给药可以包括连续给药(如输液)至少选定的一段时间。
[0057] 亲和力：如本领域所知，“亲和力”是特定配体与其配偶体(partner)结合紧密度的量度。亲和力可用不同方法来测定。某些实施方式中，亲和力是用定量试验测定的。某些实施方式中，可以将结合配偶体浓度固定为超过配体浓度，以此模拟生理条件。或者或另外，某些实施方式中，可改变结合配偶体的浓度和/或配体浓度。某些实施方式中，可在可比条件(例如浓度)下将亲和力与参照进行比较。
[0058] 激动剂：本领域技术人员知道，术语“激动剂”可用于指代物质状况或事件，其存在、水平、程度、类型或形式与另一物质(即被激动物质)活性水平的升高相关联。通常，激动剂可以是或包括任何化学类别的物质，包括例如小分子、多肽、核酸、碳水化合物、脂类、金属和/或显示相关活化活性的任何其他实体。某些实施方式中，激动剂可以是直接的(此时，它直接对其靶标施加影响)；某些实施方式中，激动剂可以是间接的(此时，它通过与其靶标结合以外的其他方式发挥其影响；例如，通过与靶标的调节物相互作用来改变靶标的水平或活性)。
[0059] 动物：在此指动物界内任何成员。某些实施方式中，“动物”指任一性别、任意发育阶段的人。某些实施方式中，“动物”指任一性别、任意发育阶段的非人动物。某些实施方式中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。某些实施方式中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类、昆虫和蠕虫。某些实施方式中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆。
[0060] 拮抗剂：本领域技术人员知道，“拮抗剂”可用于指代物质状况或事件，其存在、水平、程度、类型或形式与另一物质(即被抑制物质或靶标)活性或水平的降低相关联。通常，拮抗剂可以是或包括任何化学类别的物质，包括例如小分子、多肽、核酸、碳水化合物、脂类、金属和/或显示相关抑制活性的任何其他实体。某些实施方式中，拮抗剂可以是直接的(此时，它直接对其靶标施加影响)；某些实施方式中，拮抗剂可以是间接的(此时，它通过与其靶标结合以外的其他方式发挥其影响；例如，通过与靶标的调节物相互作用来改变靶标的水平或活性)。
[0061] 抗体：本文中，术语“抗体”指这样的多肽，其包含足以令其与特定靶抗原特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件。如本领域所知，天然产生的完整抗体是约150kD的四聚体，其包含两条相同重链多肽(各约50 kD)和两条相同轻链多肽(各约25 kD)，它们彼此缔合成常说的“Y型”结构。各重链包含至少四个结构域(各长约110个氨基酸)—氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的两个顶端)，其后的三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端的CH3(位于Y的干底部)。称为“转换岔(switch)”的短区域将重链可变区与恒定区相连。“铰链”将CH2和CH3结构域与抗体其余部分相连。完整抗体中，铰链区内的两个二硫键将两条重链多肽彼此相连。各轻链包含两个结构域—氨基末端可变(VL)结构域，其后的羧基末端恒定(CL)结构域，它们通过另一“转换岔(switch)”彼此分开。完整抗体四聚体包含两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过一个二硫键彼此相连；另两个二硫键将重链铰链区域彼此相连，从而使得所述二聚体彼此连接形成所述四聚体。天然产生的抗体还是糖基化的，通常在CH2结构域上糖基化。天然抗体中的各结构域具有以“免疫球蛋白折叠”为特征的结构，该结构由压扁的反向平行β桶内两个β折叠(例如3-、4-或5-股折叠)相叠而成。各可变域包含三个称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个某种程度上不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成β折叠提供结构域的结构框架，重链和轻链的CDR环区在三维空间上相互聚拢，从而形成位于Y结构顶端的一个高变抗原结合位点。天然抗体的Fc区结合补体系统的元件，还结合效应细胞上的受体，效应细胞包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域所知，Fc区对于Fc受体的亲和性和/或其它结合属性可通过糖基化或其它修饰来调节。某些实施方式中，据本发明生成和/或使用的抗体包含糖基化的Fc结构域，包括具有经修饰或工程改造的所述糖基化的Fc结构域。就本发明而言，某些实施方式中，包括足够的天然抗体中所见免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽的复合物都可称作和/或用作“抗体”，不论这些多肽是天然产生(例如由生物体对抗原的反应而产生)还是重组工程法产生、化学合成或由其它人工系统或方法产生。某些实施方式中，抗体是多克隆抗体；某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。某些实施方式中，抗体的恒定区序列具有小鼠、兔、灵长类或人抗体特性。某些实施方式中，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等，如本领域所知。此外，本文中术语“抗体”在合适的实施方式中指任何本领域已知的或已有的以其它表现形式利用抗体结构和功能特征的构建体或形式(除非另有说明或基于上下文可以明确)。例如，作为实施方式，本发明所用抗体可以是选自以下所述但不限于以下所述的形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双或多特异性抗体(如 等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段和分离的CDR或CDR组；单链Fvs；多肽-Fc融合体；单域抗体(如鲨鱼单域抗体，如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；掩蔽抗体(如)；小模块免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双功能抗体 Humabody抗
体 ，V H H ； 微 型 抗 体 ； 锚 蛋白 重 复 蛋白 或
D A R T ；T CR 样 抗 体 ； T ra n s -
M ic roP ro tei ns ； 和
某些实施方式中，抗体可缺失天然形式中的共价修饰(例如接装聚糖)。某些
实施方式中，抗体可包含共价修饰(例如接装聚糖、负载物[如可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其它附属基团[例如聚乙二醇等]。
体 ，V H H ； 微 型 抗 体 ； 锚 蛋白 重 复 蛋白 或
D A R T ；T CR 样 抗 体 ； T ra n s -
M ic roP ro tei ns ； 和
某些实施方式中，抗体可缺失天然形式中的共价修饰(例如接装聚糖)。某些
实施方式中，抗体可包含共价修饰(例如接装聚糖、负载物[如可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其它附属基团[例如聚乙二醇等]。
[0062] 抗体片段：本文中，“抗体片段”指如本文所述抗体或抗体类物质的一部分，通常是指包括抗原结合部分或其可变区的部分。抗体片段可用任何方式来制造。例如，某些实施方式中，抗体片段可以通过将完整抗体或抗体类物质通过酶促或化学方法片段化来产生。或者，某些实施方式中，抗体片段可用重组技术产生(即通过工程化核酸序列的表达)。某些实施方式中，抗体片段可以全部或部分合成产生。某些实施方式中，抗体片段(尤其抗原结合性抗体片段)的长度可为至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190个氨基酸或更长，某些实施方式中至少约200个氨基酸。
[0063] 结合：本文中，术语“结合”应理解为通常指两个或更多实体间的非共价结合。“直接”结合包括实体或部分之间的物理接触；间接结合包括通过与一个或多个中间实体的物理接触发生的物理相互作用。通常可在各种情形下评估两个或更多实体之间的结合—包括对相互作用的实体或部分单独进行研究或在更复杂系统背景中(例如，与载体共价或以其他方式相关联和/或在生物系统或细胞内)进行研究。
[0064] 癌症：术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中指表现出相对异常、失控和/或自主性生长的细胞，它们因此表现出以细胞繁殖明显失控为特征的异常生长表型。某些实施方式中，肿瘤可以是或包含癌前(如良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。本文具体提示了某些可能特别相关的癌症。某些实施方式中，相关癌症可以实体瘤为特征。某些实施方式中，相关癌症可以血液肿瘤为特征。总体来说，本领域已知的不同类型癌症例子包括例如：包括白血病、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病的造血系统癌症；肉瘤，黑色素瘤，腺瘤，实体组织癌，口腔、喉咙、喉和肺的鳞状细胞癌，肝癌，泌尿生殖系统癌如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌、子宫内膜癌和肾细胞癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，皮肤或眼内黑素瘤，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，头颈癌，乳腺癌，胃肠癌和神经系统癌症，良性病变如乳头状瘤，等等。
[0065] CDR：指抗体可变区内的互补决定区。重链和轻链的可变区各自有三个CDR，它们是各可变区的CDR1、CDR2和CDR3。“CDR组”或“成组CDR”指一组三个或六个CDR，它们或者是能够结合抗原的单个可变区内的CDR，或者是能够结合抗原的相互关联的重链和轻链可变区的CDR。本领域已确立了用于定义CDR边界的某些系统(例如Kabat、Chothia等)；本领域技术人员知道这些系统之间的差异，并且能够理解CDR的边界即能够理解和实践权利要求所要求保护的本发明所需的边界。
[0066] 化学治疗剂：本文中，术语“化学治疗剂”具有其本领域公知的含义，指一种或多种促细胞凋亡、细胞抑制性和/或细胞毒性物质，例如具体包括用于和/或推荐用于治疗一种或多种与恶性细胞增殖有关的疾病、紊乱或病症。许多实施方式中，化学治疗剂能用于治疗癌症。某些实施方式中，化学治疗剂可以是或包含一种或多种烷化剂，一种或多种蒽环类物质，一种或多种细胞骨架破坏剂(如微管靶向剂，如紫杉烷、美登素及其类似物)，一种或多种埃坡霉素，一种或多种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC)，一种或多种拓扑异构酶抑制剂(如拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的抑制剂)，一种或多种激酶抑制剂，一种或多种核苷酸类似物或核苷酸前体类似物，一种或多种肽抗生素，一种或多种铂基药物，一种或多种类视黄醇，一种或多种长春花生物碱，和/或一种或多种下列物质的一种或多种类似物(即同样具有相关的抗增殖活性)。某些具体实施方式中，化学治疗剂可以是或包含一种或多种以下所述：放线菌素，全反式视黄酸，奥瑞他汀，阿扎胞苷，硫唑嘌呤，博来霉素，硼替佐米，卡铂，卡培他滨，顺铂，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，姜黄素，阿糖胞苷，柔红霉素，多西紫杉醇，多西氟尿苷，多柔比星，表柔比星，埃坡霉素，依托泊苷，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，伊达比星，伊马替尼，伊立替康，美登素和/或其类似物(例如DM1)，二氯甲基二乙胺(氮芥，Mechlorethamine)，巯嘌呤，甲氨蝶呤，米托蒽醌，美坦生类化合物，奥沙利铂，紫杉醇，培美曲塞，替尼泊苷，硫鸟嘌呤(Tioguanine)，拓扑替康，戊柔比星(valrubicin)，长春碱，长春新碱，长春地辛，长春瑞滨及其组合。某些实施方式中，化学治疗剂可以用于抗体-药物缀合物。某些实施方式中，化学治疗剂是选自以下所述抗体-药物辍合物中的化学治疗剂：hLL1-多柔比星、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLL1-SN-
38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉妥珠单抗-奥佐米星
(gemtuzumab ozogamicin)、本妥昔单抗-维多汀(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗-美坦新(trastuzumab emtansine)、依托珠单抗-奥佐米星(inotuzumab ozogamicin,)格巴妥莫单抗-维多汀(glembatumomab vedotin)、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗-PSMAADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、伏司妥珠单抗-马弗多汀(vorsetuzumab
mafodotin)和罗瓦妥珠单抗-美登木素DM1(lorvotuzumab mertansine)。
38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉妥珠单抗-奥佐米星
(gemtuzumab ozogamicin)、本妥昔单抗-维多汀(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗-美坦新(trastuzumab emtansine)、依托珠单抗-奥佐米星(inotuzumab ozogamicin,)格巴妥莫单抗-维多汀(glembatumomab vedotin)、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗-PSMAADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、伏司妥珠单抗-马弗多汀(vorsetuzumab
mafodotin)和罗瓦妥珠单抗-美登木素DM1(lorvotuzumab mertansine)。
[0067] 对应于：本文中，术语“对应于”可用来通过与适当的参照化合物或组合物比较来指示化合物或组合物中结构元素的位置/个性特征(identity)。例如，某些实施方式中，聚合物中的单体残基(如多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)可用“对应于”适当参照聚合物中某残基来表示。例如，本领域普通技术人员知道，简单起见，多肽中的残基通常用标准编号系统基于相关参照多肽来编号，这样，举例来说，“对应于”第190位残基的氨基酸不必真地是特定氨基酸链的第190个氨基酸，而是对应于参照多肽中第190位的残基；本领域普通技术人员容易理解如何确定“相应的”氨基酸。例如，本领域技术人员知晓各种序列比对策略，包括软件测序，例如BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/Hhsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、Parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE，它们可原来例如确定本文所述多肽和/或核酸中“相应的”残基。
[0068] 工程化的：一般来说，“工程化的”指经人工操作。例如，当多肽序列经人工处理过则将多肽认为是“工程(化)的”。例如，本发明某些实施方式中，工程化多肽包含的序列中含有人工引入参照多肽序列的一处或多处氨基酸突变、缺失和/或插入。相似地，如果细胞或生物经操作改变了其遗传信息(例如，经转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其他机制引入了原先没有的新遗传物质，或原有遗传物质经例如取代或缺失突变或经交配而改变或消除)。正如本领域技术人员所做和所知的，工程化多肽或细胞的衍生物和/或后代通常仍被称为是“工程化的”，即使实际操作是在先前的实体上进行的。
[0069] 表位：在本文中包括被免疫球蛋白(如抗体或受体)结合元件所识别的各种组成部分。某些实施方式中，表位包括抗原上的多个化学原子或基团。某些实施方式中，当抗原呈特定三维构象时，这些化学原子或基团外露于表面。某些实施方式中，当抗原呈这种构象时，这些化学原子或基团在空间上彼此物理上接近。某些实施方式中，当抗原呈另一种构象(如线性化)时，这些化学原子中至少部分是彼此物理上隔开的基团。
[0070] 离体(ex vivo)：在此指多细胞生物体外部的生物事件。例如，就基于细胞的系统而言，这可用来表示人造环境中细胞群内发生的事件(如细胞繁殖、细胞因子分泌等)。
[0071] 框架或框架区：在此指可变区序列扣除CDR的部分。由于CDR序列可据不同更多系统来确定，同样，框架区序列也适用相应的不同解释。六个CDR将重链和轻链上的框架区在各链上分成四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中，CDRl位于FRl与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，CDR3位于FR3与FR4之间。除非特指亚区为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他所称，框架区代表单个天然免疫球蛋白链可变区内FR的总和。本文中，单个FR表示四个亚区中的一个，例如，FR1表示最靠近可变区氨基末端的第一个框架区，位于CDR1的5'侧，而多个FR表示构成框架区的两个或更多亚区。
[0072] 人源化：如本领域所知，术语“人源化”通常用于指抗体(或抗体组分)，其氨基酸序列包括来自非人物种(如小鼠)中产生的参照抗体的VH和VL区序列，但也包括相对于参照抗体的序列修饰，所述序列修改旨在使它们更具备“人样”特征，即更类似于人种系可变序列。某些实施方式中，“人源化”抗体(或抗体组分)免疫特异性结合目标抗原，且其框架(FR)区具有基本上与人抗体框架区相同的氨基酸序列而互补决定区(CDR)具有基本上与非人抗体相同的氨基酸序列。人源化抗体包含基本上全部至少一个、通常两个可变域(Fab、Fab'、F(ab')2,、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体免疫球蛋白)的那些而所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列框架区。某些实施方式中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的恒定区。
某些实施方式中，人源化抗体既含有轻链又至少含有重链的可变区。抗体还可包含重链恒定区的CH1、铰链区、CH2、CH3和可选地CH4区。
某些实施方式中，人源化抗体既含有轻链又至少含有重链的可变区。抗体还可包含重链恒定区的CH1、铰链区、CH2、CH3和可选地CH4区。
[0073] 体外(in vitro)：术语“体外”在此指人工环境中(如试管或反应容器中、细胞培养物中等)而非多细胞生物体内发生的事件。
[0074] 体内(in vivo)：在此指多细胞生物体(如人和非人动物)内发生的事件。就基于细胞的系统而言，该术语可指活细胞内发生的事件(相对于体外(in vitro)系统)。
[0075] 分离的：在此指这样的物质和/或实体：(1)已分离掉其原初产生时(无论天然和/或实验环境中)与之关联的组分中至少部分组分，和/或(2)是人工设计的、生成的、制备的和/或制造的。分离的物质和/或实体可以是已经分离掉约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约
97％、约98％、约99％或约99％以上原初与之关联的其他组分。某些实施方式中，分离物质为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约
98％、约99％，或超过约99％纯。本文中，如果某物质基本不含其他组分，则认为其是“纯”的。某些实施方式中，如本领域技术人员理解的，某物质在与某些其他组分(例如一种或多种运载体或赋形剂(如缓冲剂、溶剂、水等))组合后仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；此时，物质的分离百分比或纯度百分比的计算不包括这些运载体和赋形剂。仅举一个例子：某些实施方式中，在以下情形时天然生物聚合物如多肽或多核苷酸被认为是“分离的”：a)就其起源或衍生之源而言，与其天然状态下的伴随组分部分或全部不相关联；b)它基本上不含其天然生产者所产同种物质中的其他多肽或核酸；c)经表达或因其他方式或原因而关联细胞或其他表达系统的组分，但所述细胞或其他表达系统不是其天然生产者。因此，举例来说，某些实施方式中，将化学合成或由非其天然生产者的细胞系统合成的多肽认为是“分离的”多肽。或者或此外，某些实施方式中，在以下程度上可以将已经历一种或多种纯化技术的多肽认为是“分离的”，即它已经与其他组分分离，所述其他组分是a)天然情况下与之关联的，和/或b)在其原初产生时与之关联的。
97％、约98％、约99％或约99％以上原初与之关联的其他组分。某些实施方式中，分离物质为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约
98％、约99％，或超过约99％纯。本文中，如果某物质基本不含其他组分，则认为其是“纯”的。某些实施方式中，如本领域技术人员理解的，某物质在与某些其他组分(例如一种或多种运载体或赋形剂(如缓冲剂、溶剂、水等))组合后仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；此时，物质的分离百分比或纯度百分比的计算不包括这些运载体和赋形剂。仅举一个例子：某些实施方式中，在以下情形时天然生物聚合物如多肽或多核苷酸被认为是“分离的”：a)就其起源或衍生之源而言，与其天然状态下的伴随组分部分或全部不相关联；b)它基本上不含其天然生产者所产同种物质中的其他多肽或核酸；c)经表达或因其他方式或原因而关联细胞或其他表达系统的组分，但所述细胞或其他表达系统不是其天然生产者。因此，举例来说，某些实施方式中，将化学合成或由非其天然生产者的细胞系统合成的多肽认为是“分离的”多肽。或者或此外，某些实施方式中，在以下程度上可以将已经历一种或多种纯化技术的多肽认为是“分离的”，即它已经与其他组分分离，所述其他组分是a)天然情况下与之关联的，和/或b)在其原初产生时与之关联的。
[0076] KD：在此指结合性物质(如抗体或其结合性组分)从与其配偶体(如所述抗体或其结合性组分所结合的表位)组成的复合物上解离的解离常数。
[0077] 药物组合物：术语“药物组合物”在此指这样的组合物即其中的活性物质与一种或多种药学上可接收的运载体配制在一起。某些实施方式中，组合物适合给予人或动物对象。某些实施方式中，活性物质以单位剂量存在，该单位剂量需适合在治疗方案中给药并在用于相关群体时显示出实现预定疗效的统计学显著性概率。
[0078] 多肽：术语“多肽”在此总体上具有其领域内公知的含义即至少三个氨基酸的聚合物。本领域普通技术人员明白，术语“多肽”应理解为足够广义从而不仅涵盖具有本文中的全序列的多肽，还涵盖代表这些完整多肽的功能性片段(即保留至少一种活性的片段)的多肽。并且，本领域普通技术人员明白，蛋白质序列通常容许一些不损害其活性的取代。因此，本文中，相关术语“多肽”涵盖如下所述的任何多肽：相比另一同类多肽，其保留活性并具有至少约30-40％的整体序列相同性，一般高于约50％、60％、70％或80％，且通常在一个或多个高度保守性区域内包括至少一个相同性高得多的区域，该相同性一般超过90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％，通常包括至少3-4个、一般多达20或更多个氨基酸。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或这两者，并可含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任何一种。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。某些实施方式中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。某些实施方式中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征性部分。
[0079] 预防或避免：在本文中用于疾病、紊乱和/或病症的出现时指降低发展成所述疾病、紊乱和/或病症的风险和/或延迟所述疾病、紊乱和/或病症一种或多种特征或症状的发生和/或严重程度。某些实施方式中，“预防”是基于群体评估的，即如果在疾病、紊乱或病症易感人群中观察到所述疾病、紊乱或病症一种或多种症状的发生发展、频率和/或强度有统计学显著的降低，则认为某药剂/物质能够“预防”所述具体疾病、紊乱或病症。
[0080] 重组：在此指用重组手段设计、工程化、制备、表达、创造、制造和/或分离的多肽，例如用重组病毒载体转入宿主细胞表达的多肽；从重组、组合人多肽文库分离的多肽；分离自动物(例如小鼠、兔、羊、鱼等)的多肽，所述动物是转基因的或经其他操作而表达一种或多种基因或基因组分，所述基因或基因组分编码和/或指导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达；和/或任何其他手段制备、表达、创造或分离的多肽，所述其他手段包括选定核酸序列元件之间的剪接或连接、化学合成选定的序列元件和/或以其他方式生成编码和/或指导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达的核酸。某些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件是天然的。某些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件是计算机模拟(in silico)设计的。某些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件来自已知序列元件的突变(如体内或体外)，例如来自天然或合成来源，如在目标源生物种系(如人、小鼠等)中。
[0081] 特异性结合：术语“特异性结合”在此指能够在结合发生的环境中在可能的结合配偶体之间进行区分的能力。结合性物质在存在有其他潜在靶标时与一种特定靶标相互作用时则称其为“特异性结合”其与之相互作用的靶标。某些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合性物质与其配偶体之间的结合程度来评定；某些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合性物质-配偶体复合物的解离程度来评定；某些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合性物质竞争其配偶体与另一实体之间另一相互作用的能力来评定。某些实施方式中，特异性结合通过在一系列浓度上进行这样的检测或测定来评定。
[0082] 对象：本文中，术语“对象”指生物体，通常是哺乳动物(如人，某些实施方式中包括人的产前形式)。某些实施方式中，对象患有相关疾病、紊乱或病症。某些实施方式中，对象易患相关疾病、紊乱或病症。某些实施方式中，对象表现出疾病、紊乱或病症的一种或多种症状或特征。某些实施方式中，对象未表现出疾病、紊乱或病症的任何症状或特征。某些实施方式中，对象具有疾病、紊乱或病症的一种或多种易感特征或风险特征。某些实施方式中，对象是人。某些实施方式中，对象是确诊和/或接受治疗的个体或是已经确诊过和/或接受过治疗的个体。
[0083] 治疗剂：短语“治疗剂”在此泛指给予生物体后激发所需药理学效应的任何物质。某些实施方式中，如果某物质在适当的群体中表现出统计学上显著的作用，则认为其是治疗剂。某些实施方式中，合适的群体可以是模式生物群体。某些实施方式中，合适的群体可以用各种标准来界定，例如特定年龄组、性别、遗传背景、原有临床病症等。某些实施方式中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟疾病、紊乱和/或病症一种或多种症状或特征的发作，降低其严重性和/或降低其发生率的物质。某些实施方式中，“治疗剂”是曾经或目前须经政府机构批准才能上市人用的物质。某些实施方式中，“治疗剂”是须经处方才能人用的物质。
[0084] 治疗有效量：术语“治疗有效量”在此指按照治疗剂量给药方案给予患有或易患疾病、紊乱和/或病症的群体时足以治疗所述疾病、紊乱和/或病症的量。某些实施方式中，治疗有效量是降低疾病、紊乱和/或病症一种或多种症状的发病率和/或严重性，稳定所述症状的一种或多种特征和/或延迟所述症状发生的量。本领域普通技术人员会明白，“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现治疗成功。相反，治疗有效量可以是给予需要这种治疗的患者时在显著数量的对象中提供特定的所需药理学反应的量。例如，某些实施方式中，术语“治疗有效量”是指这样的量，即创新疗法背景下，给予有需要的个体时能阻断、稳定、减轻或逆转该个体内的癌症支持性进程，或将增强或增加该个体内的癌症抑制性进程的量。就癌症治疗而言，“治疗有效量”是当给予癌症确诊个体时能预防、稳定、抑制或减少个体内癌症进一步发展的量。本文所述组合物的特别优选的“治疗有效量”逆转(在治疗性处置中)恶性肿瘤如胰腺癌的发展或辅助实现或延长恶性肿瘤的缓解。给予个体以治疗该个体癌症的治疗有效量可以与用于促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。像就大多数癌症疗法而言的那样，本文描述的治疗方法不应解释为限于或以其他方式限于癌症的“治愈”；相反，治疗方法指使用所述组合物来“处理”癌症，即，对患癌个体的健康产生期望的或有益的改变。这样的益处是肿瘤学领域有经验医疗保健提供者所知道的，包括但不限于患者病情稳定，肿瘤减小(肿瘤消退)，重要机能改善(例如患癌组织或器官的功能改善)，进一步转移的减少或抑制，机会性感染的减少，生存能力的提高，疼痛的减轻，运动机能改善，认知功能改善，精力改善(活力，不适减少)，健康感改善，恢复正常食欲，恢复健康的体重增加，以及它们的组合。此外，个体内特定肿瘤的消退(例如作为本文所述治疗的结果)还可以如下来评估：从肿瘤部位取样癌细胞(例如在治疗过程中)并对癌细胞进行代谢标志物和信号传导标志物水平检测，从而监测癌细胞的状态，由此在分子水平上验证癌细胞消退为低恶性表型。例如，采用本发明方法诱导的肿瘤消退可由以下所述来指示：发现任一前文所述促血管生成标志物减少，本文所述抗血管生成标志物增加，代谢路径或细胞间信号传导路径或细胞内信号传导路径(在癌症确诊个体内表现出异常活性)的正常化(即以非癌患正常个体的状态为方向的改变)。本领域普通技术人员会明白，某些实施方式中，治疗有效量可以配制成单剂量和/或以单剂量给药。某些实施方式中，治疗有效量可以配制成多剂量和/或以多剂量给药，例如作为给药方案的一部分。
[0085] 变体：在本文中就分子(如核酸、蛋白质或小分子)而言，术语“变体”指与参照分子显示出显著的结构同一性但结构上区别于参照分子的分子，例如，与参照相比，在一个或多个化学部分的存在或不存在或水平下有区别。某些实施方式中，变体在功能上也区别于其参照分子。通常，将特定分子认为参照分子的“变体”是否恰当是基于其与参照分子的结构同一性程度。如同本领域技术人员所理解的，任何生物或化学参照分子都具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共享一种或多种此类特征性结构元件但在至少一个方面与参照分子有差异的不同分子。仅举几个例子，多肽可具有由多个氨基酸组成的特征性序列元件，这些氨基酸在线性或三维空间上具有彼此相对的指定位置和/或参与构成特定的结构基序和/或生物学功能；核酸可具有多个核苷酸残基组成的特征性序列元件，这些核苷酸残基在线性或三维空间上具有彼此相对的指定位置。某些实施方式中，变体多肽或核酸可能因氨基酸或核苷酸序列上一处或多处差异而区别于参照多肽或核酸。某些实施方式中，变体多肽或核酸与参照多肽或核酸的总体序列相同性为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。某些实施方式中，变体多肽或核酸与参照多肽或核酸不共有至少一种特征序列元件。某些实施方式中，参照多肽或核酸具有一种或多种生物活性。某些实施方式中，变体多肽或核酸与参照多肽或核酸共有一种或多种生物学活性。
[0086] 载体：在此指能够运输与之相连的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，指可在其中连接其他DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中，其他DNA区段可连入病毒基因组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和其他游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能够引导与其操作性连接的基因的表达。此类载体在此称为“表达载体”。重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化可采用标准技术(如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可按照生产商的说明书或按照本领域常规操作或按照本文所述来进行。以上所述技术和方法可以一般性地按照如本领域所知、亦如本说明书所引用和论述的众多综合性和专论性文献中所述来进行。参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(1989))，该书通过援引纳入本文通用于所有目的。示例性实施方式的具体说明
[0087] 本发明涉及用于令调节性T细胞转化为TH1样细胞的抗AITR抗体。例如，相对于特异性识别人AITR胞外结构域内表位的亲本抗体，本文所述工程化抗体经修饰而增强了抗原亲和力。具体地说，如本文所述，发明人创造了几种改善了对人AITR亲和力的示例。值得注意的是，示例性抗AITR抗体能够令调节性T细胞(Treg细胞)转化为TH1细胞，并调节某些T细胞细胞因子的分泌量。因此，本文提供工程化抗AITR抗体，其相比参照抗体具有改善的特性，并且，本文还表明这些抗体在体外和体内具有出人意料的有益活性。AITR
[0088] 人类活化诱导型肿瘤坏死因子受体(activation-inducible-tumor necrosis factor receptor，AITR)是TNFR超家族的成员，亦称GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)、TNFRSF 18(TNF受体超家族成员18)或CD357(Kwon等，J Biol Chem,274:6056-6061,
1999)。AITR在Treg细胞(调节性T细胞)和活化的T细胞中表达水平特别高。AITR是指由细胞天然表达的任何变体、同种型和同源物，也可特指但不限于人AITR。AITR信息可见NCBI GenBank等数据库，例如但不限于NP_004186。AITR激发会产生独特的细胞内信号削弱调节性T细胞的免疫抑制功能并促进Teff细胞(效应T细胞)的活性(Shimizu等，Nat Immunol.,3:
135-142,2002)。所以，在免疫肿瘤学看来，AITR信号提高人的抗肿瘤免疫并诱导癌细胞死亡(Sakaguchi,Cell,101:455-458,2000)。
1999)。AITR在Treg细胞(调节性T细胞)和活化的T细胞中表达水平特别高。AITR是指由细胞天然表达的任何变体、同种型和同源物，也可特指但不限于人AITR。AITR信息可见NCBI GenBank等数据库，例如但不限于NP_004186。AITR激发会产生独特的细胞内信号削弱调节性T细胞的免疫抑制功能并促进Teff细胞(效应T细胞)的活性(Shimizu等，Nat Immunol.,3:
135-142,2002)。所以，在免疫肿瘤学看来，AITR信号提高人的抗肿瘤免疫并诱导癌细胞死亡(Sakaguchi,Cell,101:455-458,2000)。
[0089] AITR在生理条件下以三聚体形式起作用，而不是单个分子，其配体的功能性单元是三聚体。根据对TNFRSF(TNF受体超家族)和TNF的结构研究，三个受体分子和TNF三聚体对称结合，每个受体片段与两个相邻TNF的凹槽结合。因此，TNF和TNFR之间的接触界面在TNFR-TNF相互作用和结构中起重要作用。这一重要的功能可以解释为什么接触表面的氨基酸序列在种间以及在TNFR超家族内高度保守(Chan等,Immunity,13:419-422,2000)。
[0090] 此外，暴露于特定条件的细胞可由受体三聚体逐渐形成三聚体的四聚体，然后在内部产生渐进性的超信号。因此，AITR信号不是单个开关信号的简单传递，而是信号转导的精细调节，它成了控制Treg细胞抗癌能力的重要因素(Zhou等，PNAS，105:5465-5470，2008)。TNFR与其配体之间相互作用的复杂性和多样性、以及众多的可用表位促成了非常精确的信号调节。所以，识别特定结构表位的单克隆抗体(mAb)是开发AITR相关治疗剂的上佳候选者。也就是说，根据特定抗AITR抗体所识别AITR分子上表位的位置，特定的抗AITR抗体可以不同程度地模拟AITR的天然配体，例如，可以对活性进行选择性地调节和/或对受体寡聚化反应进行调节，从而能够以各种方式调节通过AITR的反应。
抗AITR抗体及其片段
抗AITR抗体及其片段
[0091] 本文，至少在部分内容中，提供了工程化的抗AITR抗体(本文中亦称IFN-γ-诱导性调节T细胞可转化性抗癌mAb(IRTCA))及其片段，它们表现出显著且出人意料优异的体外和/或体内特征。例如，某些所述抗体相对于参照抗AITR抗体具有更高的亲和力。
[0092] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合抗体片段包含1、2或3个重链CDR序列，这些CDR序列是或包括选自SEQ ID NO:8、9、10、14、15、16、17、24和25的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合抗体片段包括以下所述中的一项或多项：重链CDR1，其是或包括选自SEQ ID NO:8和24的序列；重链CDR2，其是或包括选自SEQ ID NO:9和25的序列；和重链CDR3，其是或包括选自SEQ ID NO:10、14、15、16和17的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合抗体片段包括以下每一项：重链CDR1，其是或包括选自SEQ ID NO:8和24的序列；重链CDR2，其是或包括选自SEQ ID NO:9和25的序列；和重链CDR3，其是或包括选自SEQ ID NO:10、14、15、16和17的序列。
[0093] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段包含1、2或3个轻链CDR序列，它们是或包括选自SEQ ID NO:11、12、13和18的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合抗体片段包括以下所述中的一项或多项：轻链CDR1，其是或包括SEQ ID NO:11所示序列；轻链CDR2，其是或包括SEQ ID NO:12所示序列；和轻链CDR3，其是或包括选自以下SEQ ID NO:13和18的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合抗体片段包括以下每一项：轻链CDR1，其是或包括SEQ ID NO:11所示序列；轻链CDR2，其是或包括SEQ ID NO:12所示序列，和轻链CDR3，其是或包括选自以下SEQ ID NO:13和18的序列。
[0094] 某些实施方式中，IRTCA抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO:8或24序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:9或25序列的重链CDR2和包含选自SEQ ID NO:14、15、16和17所示序列至少其一的重链CDR3；和(b)包含SEQ ID NO:11序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:12序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:13或18所示序列的轻链CDR3，其中，所述IRTCA抗体或其抗原结合片段不包含以下所述各项：含有SEQ ID NO:8序列的重链CDR1，含有SEQ ID NO:9序列的重链CDR2，含有SEQ ID NO:10序列的重链CDR，含有SEQ ID NO:11序列的轻链CDR1，含有SEQ ID NO:12序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO:13序列的轻链CDR3。
[0095] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段具有与如下所述抗体或抗体片段的实质同源性：所述抗体或抗体片段的重链可变域是或包括选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、20和21的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的重链可变域是或包括与选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、20和21的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％相同的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的重链可变域是或包括选自SEQ ID NO:1、3、4、5、
6、20和21的序列。
96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％相同的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的重链可变域是或包括选自SEQ ID NO:1、3、4、5、
6、20和21的序列。
[0096] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段具有与如下所述抗体或抗体片段的实质同源性：所述抗体或抗体片段的轻链可变域具有或包括选自SEQ ID NO:2、7、22和23的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的轻链可变域是或包括与选自SEQ ID NO:2、7、22和23的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％相同的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的重链可变域是或包括选自SEQ ID NO:2、7、22和23的序列。
[0097] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段包括与如下所述抗体或抗体片段的实质同源性：所述抗体或抗体片段的重链可变域是或包括选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、20和21的序列且轻链可变域是或包括选自SEQ ID NO:2、7、22和23的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的重链可变域是或包括与选自SEQ ID NOs:1、3、4、5、
6、20和21的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、
99.2％、99.3％、99.4％或99.5％相同的序列，且轻链可变域是或包括与选自SEQ ID NO:2、
7、22和23的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、
99.2％、99.3％、99.4％或99.5％相同的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的重链可变域是或包括选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、20和21的序列，且轻链可变域是或包括选自SEQ ID NO:2、7、22和23的序列。
6、20和21的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、
99.2％、99.3％、99.4％或99.5％相同的序列，且轻链可变域是或包括与选自SEQ ID NO:2、
7、22和23的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、
99.2％、99.3％、99.4％或99.5％相同的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合性抗体片段的重链可变域是或包括选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、20和21的序列，且轻链可变域是或包括选自SEQ ID NO:2、7、22和23的序列。
[0098] 本文IRTCA抗体或抗原结合片段的氨基酸序列可通过保守取代进行取代。术语“保守取代”在此指多肽的修饰，其中一个或多个氨基酸被生化特性相似的氨基酸取代，从而不会导致损失对应多肽的生物学或生物化学功能。术语“保守序列变体”或“保守氨基酸取代”在此指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基其定义如本领域所知。这些残基包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。所以，预计本发明抗体可以具有保守氨基酸取代并仍然确保活性。
[0099] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段可包括选自下组的恒定区：IgG1恒定域、IgG2恒定域、IgG1/IgG2杂合恒定域、人IgG4恒定域、IgA恒定域、IgE恒定域、IgM恒定域和IgD恒定域。
[0100] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段是或包括IgA、IgD、IgE、IgM、IgG或其变体。
[0101] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段包含κ和/或λ轻链和/或其变体。
[0102] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键结合的Fv片段、scFv片段、单域抗体、Humabody、纳米抗体和/或双功能抗体。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段是单价抗体。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段是多价抗体。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段是多特异性抗体(如双特异性抗体)。
[0103] 某些实施方式中，本文涵盖通过添加或缺失糖基化位点来修饰本文抗体的碳水化合物含量的方法。用于修饰抗体碳水化合物含量的方法是本领域熟知的，这些都包含在本文内容之中，此类方法参见例如美国专利No.6,218,149、EP 0 359 096B1、美国专利申请公开US 2002/0028486、WO 03/035835、美国专利申请公开No.2003/0115614、美国专利No.6,218,149、美国专利No.6,472,511，以上全部通过引用完全并入本文。其他一些实施方式中，本文包括通过缺失抗体一个或多个内源性碳水化合物部分来修饰本文抗体碳水化合物含量的方法。
[0104] 工程化的糖型可用于多种目的，包括但不限于提高或降低效应功能。工程化的糖型可用任何本领域技术人员所知方法产生，例如采用工程化或变异表达株，与一种或多种酶如DI N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTI11)共表达，在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达含有Fc区的分子，或者含Fc区的分子表达后进行碳水化合物修饰。产生工程化糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于Umana等，1999，Nat.Biotechnol17:176-180；Davies等，20017Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等，2002,J Biol Chem277:
26733-26740；Shinkawa等，2003,J Biol Chem 278:3466-3473)；美国专利No.6,602,684；
美国专利系列号10/277,370；美国专利系列号10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO
01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；POTILLEGENTTM技术(波娃公司(BiowaBiowa,Inc.)，新泽西州普林斯顿)；GLYCOMABTM糖基化工程技术(GLYCART生物技术公司(GLYCART biotechnology AG)，瑞士苏黎世)；以上均通过引用全文纳入本文。参见例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等，2004,JMB,336:1239-49，以上均通过引用全文纳入本文。
26733-26740；Shinkawa等，2003,J Biol Chem 278:3466-3473)；美国专利No.6,602,684；
美国专利系列号10/277,370；美国专利系列号10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO
01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；POTILLEGENTTM技术(波娃公司(BiowaBiowa,Inc.)，新泽西州普林斯顿)；GLYCOMABTM糖基化工程技术(GLYCART生物技术公司(GLYCART biotechnology AG)，瑞士苏黎世)；以上均通过引用全文纳入本文。参见例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等，2004,JMB,336:1239-49，以上均通过引用全文纳入本文。
[0105] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段是人AITR的拮抗剂。
[0106] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段结合人AITR分子。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段特异性结合人AITR分子。
[0107] 某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段结合SEQ ID NO:19所示序列或结合包含SEQ ID NO:19的序列。某些实施方式中，IRTCA抗体或抗原结合片段结合SEQ ID NO:19所示的IRTCA胞外域表位或结合包含SEQ ID NO:19序列的IRTCA胞外域表位。
[0108] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段结合AITR分子的结合亲和力(KD)为1x10-7至1x10-12M。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段结合人AITR分子的结合亲和力(KD)为1x10-8至1x10-12M。结合亲和力(KD)的测定可例如采用表面等离子体共振(如用BIACORE系统)。
[0109] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段结合人AITR分子或其片段的结合亲和力(KD)低于1.0×10-8M。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段结合人AITR分子或其片段的结合亲和力(KD)低于1.0x10-9M。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段结合人AITR分子或其片段的结合亲和力(KD)低于结合亲和力(KD)低于1.0x10-10M。
[0110] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段不能结合或弱结合非灵长类动物AITR多肽(如犬、小鼠和大鼠AITR多肽)。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段高效结合人或猴AITR分子。这样的结合亲和力提示灵长类动物AITR抗体的表位结构和/或序列可能与犬、小鼠和大鼠非常不同。
[0111] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段结合表达人AITR的CD4+T细胞。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段影响T细胞群。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段令调节性T细胞(nTreg细胞)转化为TH1样(IFN-γ-阳性)细胞。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段令诱导型调节性T细胞(iTreg细胞)转化为TH1样(IFN-γ-阳性)细胞。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段令效应T细胞(Teff细胞)转化为TH1(IFN-γ-阳性)细胞。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段减少调节性T细胞群(Treg细胞)。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段导致细胞群降低Treg细胞因子(如TGF-β)分泌。
[0112] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段具有低毒性特征(如给药后细胞死亡程度低)。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段具有低肝毒性特征。某些实施方式中，接受过治疗剂量本文IRTCA抗体或抗原结合片段的对象其ALT、AST和总胆红素中一项或多项的水平在正常范围内。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段的特征包括能够长时间治疗患者，提供可测知的症状缓解且毒性低和/或可接受。低或可接受的免疫原性和/或高亲和力以及其他合适的性质可有助于实现治疗结果。“低免疫原性”在此定义为在少于约75％或更好的是少于约50％接受治疗的患者中引起显著的HAHA、HACA或HAMA反应，和/或，在接受治疗的患者中仅引发低效价(Elliott等，Lancet 344:1125-1127(1994)，通过引用完全纳入本文)。核酸
[0113] 本文提供包含编码本文IRTCA抗体及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本文所述IRTCA抗体及其片段可用本领域所知的分子生物学方法由核酸分子产生。本文中的核酸包括例如DNA和/或RNA。
[0114] 某些实施方式中，核酸构建体包括编码IRTCA抗体或其片段(例如，H1F1、H1F1M69、H1F1M74)的区域。某些实施方式中，所述抗体或其片段包含VH和/或VL区。可对IRTCA抗体或其片段就所需结合和/或功能特性进行鉴定和/或选择，并对所述抗体的可变区进行分离、扩增、克隆和/或测序。可对VH和VL核苷酸序列进行修饰，包括添加编码氨基酸和/或携带限制性位点的核苷酸序列，和/或对编码氨基酸的核苷酸序列进行取代。某些实施方式中，核酸序列可以包括也可以不包括内含子序列。
[0115] 适当情况下，编码IRTCA抗体及其片段(如H1F1、H1F1M69、H1F1M74)的核酸序列可修饰成包含针对在特定细胞类型或生物中表达而优化的密码子(例如，参见美国专利No.5,670,356和美国专利No.5,874,304)。密码子优化的序列是合成序列，优选其编码与非密码子优化亲本多核苷酸所编码多肽相同的多肽(或具有与全长多肽基本相同活性的全长多肽的生物活性片段)。某些实施方式中，编码抗体组分的遗传物质的编码区可全部或部分包括经改变的序列以针对特定细胞类型(例如真核或原核细胞)优化密码子使用。例如，本文所述人源化重链(或轻链)可变区的编码序列可以针对在细菌细胞中表达进行优化。或者，编码序列可以为了在哺乳动物(如CHO细胞)中表达进行优化。这样的序列可称为密码子优化序列。
[0116] 本文核酸构建体可用本领域所知方法插入表达载体或病毒载体，核酸分子可操作性连接表达调控序列。本文还提供包含任意以上所述核酸分子或其片段的载体。任何以上所述核酸分子或其片段均可克隆到任何合适的载体中，且均可用于转化或转染任何合适的宿主。载体的选择及其构建方法是本领域普通技术人员公知的，并且可见一般技术参考文献(大致来说，可见“Recombinant DNA Part D”(“重组DNA部分D”)，Methods in Enzymology,153卷,Wu和Grossman编,学术出版社(Academic Press)(1987))。
[0117] 某些实施方式中，常用技术如电泳、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、脂质转染等可用来将外源核酸(DNA或RNA)引入原核或真核宿主细胞。理想的是，在合适且考虑载体DNA还是RNA的情况下，载体可包含调节序列，如转录和翻译起始密码子和终止密码子，调节序列对引入载体的宿主类型(如细菌、真菌、植物或动物)是特异性的。某些实施方式中，载体包含对宿主所在属特异性的调节序列。较好的是，载体包含对宿主所属种特异性的调节序列。
[0118] 除了复制系统和插入的核酸之外，核酸构建体可以包括一个或多个标志基因，由此可选择被转化或被转染的宿主。标志基因包括抗生素抗性如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中提供原养型的互补机制，等等。
[0119] 合适的载体包括设计用于增殖和扩增或用于表达或两者的载体。例如，克隆载体可以选自：pUC系列、pBluescript系列(司查塔基公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉荷亚)、pET系列(诺瓦基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(药物生物技术公司(Pharmacia Biotech)，瑞典乌普萨拉(Uppsala))和pEX系列(克隆泰克公司(Clontech)，加利福尼亚州帕洛阿尔托)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(司查塔基公司(Stratagene))、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的例子包括pBI110、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(克隆泰克公司)。动物表达载体的例子包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(克隆泰克公司)。还可采用TOPO克隆系统(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，按制造商的建议使用。
[0120] 病毒载体可包含天然或非天然启动子，其操作性连接分离或纯化的前文所述核酸分子。本领域技术人员知道如何选择启动子(例如强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性启动子)。类似的，本领域技术人员知道如何将前文所述核酸分子或其片段与启动子联合。
[0121] 合适的病毒载体包括例如逆转录病毒载体，基于细小病毒的载体，如基于腺相关病毒(AAV)的载体，AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体，以及慢病毒载体，例如基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体。这些病毒载体可用标准重组DNA技术制备，参见例如Sambrook等的Molecular Cloning,a Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第2版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(1989)和Ausubel等的Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约州纽约的格林出版联合公司(Greene
Publishing Associates)和约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)(1994)。
Publishing Associates)和约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)(1994)。
[0122] 逆转录病毒载体来源于逆转录病毒。逆转录病毒是能广泛感染宿主细胞的RNA病毒。转染后，逆转录病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中，并且与宿主细胞DNA一起复制，由此持续生成病毒RNA和逆转录病毒基因组中整合的任意核酸序列。如此，使用逆转录病毒时可获得一种或多种治疗因子的长期表达。考虑用于基因治疗的逆转录病毒是相对非致病性的，尽管也有致病性逆转录病毒。当使用致病性逆转录病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)或人T细胞淋巴营养性病毒(HTLV)时，必须小心改变病毒基因组以消除对宿主的毒性。逆转录病毒还可改造成病毒复制缺陷型。如此，逆转录病毒载体被认为对体内稳定基因转移尤其有用。慢病毒载体例如基于HIV的载体代表了用于基因递送的逆转录病毒载体。不同于其他逆转录病毒，已知基于HIV的载体将其乘客基因整合到非分裂细胞，因此能用于治疗持久型疾病。
[0123] 可向这些克隆克隆和/或表达序列添加其他序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能、协助多核苷酸的分离或改善多核苷酸向细胞中的引入。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域熟知的。(见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
[0124] 某些实施方式中，可对本文核酸和载体进行分离和/或纯化。本文还提供组合物，其中包含前文所述分离或纯化的核酸分子，所述核酸分子可以是载体形式的。分离的核酸和载体可用本领域所知标准技术来制备，包括例如碱/SDS处理、CsCl结合、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域所知其他技术。组合物可含有其他组分，如后文所述。
[0125] 某些实施方式中，将核酸分子插入载体，该载体能够在引入合适的宿主细胞后表达IRTCA抗体或其片段。合适的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。示例性宿主细胞包括原核细胞(如大肠杆菌)和真核细胞(如COS或CHO细胞)。可用的哺乳动物宿主细胞包括人HeLa、HEK293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1、Cos 7和CV 1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如DG44细胞)。某些实施方式中，适合表达抗体的哺乳动物宿主细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如包括与DHFR可选标志联用的DHFR-CHO细胞)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞或SP2细胞。某些实施方式中，宿主细胞选自大肠杆菌，毕赤酵母，Sf9，COS，HEK293，Expi293，CHO-S，CHO-DG44，CHO-K1和哺乳动物淋巴细胞。
[0126] 本领域技术人员所知用于将DNA片段插入载体的任何方法均可用于构建受转录/翻译控制信号控制的编码本文IRTCA抗体或其片段的表达载体。这些方法包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。抗体的生产
[0127] 本发明的抗体和抗原结合片段可用各种本领域所知技术来制备和/或纯化，以便后续形成稳定的抗体或抗体片段。
[0128] 使用常规方法可方便地对编码本文IRTCA抗体和/或抗原结合片段的核酸进行分离和测序。例如，可以使用设计用来从杂交瘤或噬菌体模板DNA特异性扩增相应的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物。可以将分离的核酸插入表达载体中，然后通过将该表达载体导入宿主细胞从合适的被转化宿主细胞(即转化体)产生所需单克隆抗体。某些实施方式中，用于制备本文IRTCA抗体和/或抗原结合片段的方法可包括扩增包含编码抗体的核酸的表达载体，但不限于此。
[0129] 某些实施方式中，宿主细胞是真核宿主细胞，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据在重组生产过程中采用的宿主，可对本文抗体和抗体片段进行糖基化或非糖基化。某些实施方式中，将编码本文IRTCA抗体和/或抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中，可通过对这样的宿主细胞进行足够时间的培养来表达抗体来从而制得抗体。某些实施方式中，哺乳动物宿主细胞经培养足够时间后向培养基中分泌本文抗体或抗体片段。
[0130] 某些实施方式中，表达的本文抗体可在与宿主细胞分离后均匀纯化。本文抗体的分离和/或纯化可用蛋白质分离与纯化的常规方法进行。例如，不希望受理论束缚，可用众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本文IRTCA抗体和/或抗原结合片段，这些方法包括但不限于蛋白A纯化、蛋白G纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。也可用高效液相色谱(“HPLC”)纯化。见例如Colligan,Current Protocols in Immunology(《新编免疫学方案》)或Current Protocols in Protein Science(《新编蛋白质科学方案》)，John Wiley&Sons出版社,NY,N.Y.,(1997-2001)，如第1、4、6、8、9和10章，各自通过援引全文纳入本文。某些实施方式中，本文抗体可通过进一步联合过滤、超滤、盐析、透析等来分离和/或纯化。
[0131] 纯化的本文IRTCA抗体和/或抗原结合片段可通过例如以下所述进行鉴定：ELISA、ELISPOT、流式细胞术、免疫细胞学、BIACORETM分析、SAPIDYNE KINEXATM动力学排斥测试(kinetic exclusion assay)、SDS-PAGE和Western印迹，或通过HPLC分析以及本文中许多其他功能测试来鉴定。治疗性应用
[0132] 本文认识到，工程化抗体和抗原结合片段可用于诊断、预防和/或治疗某些疾病例如癌症。任何本文IRTCA抗体或抗原结合片段均可用于治疗方法。例如本文IRTCA抗体或抗原结合片段可用作免疫治疗剂，例如用于治疗恶性病(如癌症)。
[0133] 本文提供治疗和/或预防恶性病的方法，所述方法包括给予对象本文IRTCA抗体或抗原结合片段。调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者内至少一种恶性病的方法包括但不限于癌症。
[0134] 本文中，癌症的处理可通过提高TH1样细胞及相关细胞因子(如IFN-γ)来介导。已知分泌IFN-γ的TH1细胞介导针对胞内病原的免疫反应并预防肿瘤相关癌症。已知TH1细胞引起的炎症不激发反而预防癌症(Haabeth OA等，Nat Commun，2:240，2011)。肿瘤中，Treg细胞促进局部肿瘤生长。所以认为下调肿瘤中的调节性T细胞是癌症治疗的重要组成部分(Liu Z等，J Immunol,182(10):6160-7,2009)。所以，Treg细胞向TH1细胞转化对于癌症预防或治疗来说或许非常有用。
[0135] Treg细胞向TH1细胞转化与TH1分化相关信号路径以及转录因子有关。尤其，Foxp3转录因子是Treg细胞的特异性胞内标志物，如果Treg细胞分化成TH1细胞则Foxp3的胞内水平下调。
[0136] 具体地说，已经证明本文IRTCA抗体或抗原结合片段与人AITR的结合增加了调节性T细胞(nTreg细胞)、诱导型调节性T细胞(iTreg细胞)或效应T细胞(Teff细胞)向TH1样(IFN-γ-阳性)细胞的转化。某些实施方式中，用本文IRTCA抗体或抗原结合片段的治疗能降低和/或抑制癌细胞的生长。
[0137] 某些实施方式中，本文提供延迟或抑制肿瘤生长的方法，这包括通过给予本文IRTCA抗体或抗原结合片段来体内或体外调节细胞因子分泌。某些实施方式中，本文提供降低肿瘤负荷的方法，这包括通过给予本文IRTCA抗体或抗原结合片段来体内或体外调节细胞因子分泌。
[0138] 某些实施方式中，本文提供通过监测待治疗癌症或肿瘤生物对象来治疗癌症或肿瘤的方法，其包括：(i)给予对象本文IRTCA抗体或抗原结合片段，(ii)然后从该对象分离生物样品，(iii)由样品测定INF-γ或TGF-β的分泌量并估测比例和(iv)通过比较接受或不接受IRTCA抗体或其抗原结合片段的对照样品来确定抗体或其抗原结合片段的治疗有效量。
[0139] 某些实施方式中，本文提供对有此需要对象的治疗方法，所述方法包括给予所述对象包含或递送本文IRTCA抗体或抗原结合片段和/或其核酸的组合物。某些实施方式中，对象有罹患癌症的风险或正处于所述风险中。某些实施方式中，本文提供用于预防或治疗患者癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给予癌症或肿瘤患者治疗有效量的IRTCA抗体或其抗原结合片段。
[0140] 某些实施方式中，本文提供在有此需要的对象中诱导免疫反应的方法，所述方法包括给予对象包含或递送本文IRTCA抗体或抗原结合片段和/或其核酸的组合物。某些实施方式中，对象有罹患癌症的风险或正处于所述风险中。
[0141] 某些实施方式中，本文提供在有此需要的对象中增强免疫反应或提高免疫细胞活性的方法，所述方法包括给予对象包含或递送本文IRTCA抗体或抗原结合片段和/或其核酸的组合物的步骤。某些实施方式中，对象有罹患癌症的风险或正处于所述风险中。
[0142] 适合用本文方法治疗的癌症可包括但不限于：膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，输卵管癌，胆囊癌，胃肠癌，头颈癌，血液癌，喉癌，肝癌，肺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，间皮瘤，卵巢癌，原发性腹膜癌，唾液腺癌，肉瘤，胃癌，甲状腺癌，胰腺癌，肾细胞癌，胶质母细胞瘤和前列腺癌。某些实施方式中，可用本文IRTCA抗体或抗原结合片段治疗的癌症可包括但不限于癌瘤、淋巴瘤(如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。某些实施方式中，癌症可包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴组织增生性异常以及各种类型的头颈癌。
[0143] 包含本文IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物可按照处理癌细胞或其转移或抑制癌生长的药用有效量来给予。为了用于治疗方法，本文IRTCA抗体或抗原结合片段将采用良好的医学实践方式进行配制、确定剂量和给药。就此而言的考量因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体临床状况、患者年龄、患者体重、病因、药物的递送位点、给药方法、给药安排，以及医务人员所知的其它因素。
[0144] 本文提供高亲和力IRTCA抗体，其性能可优于参照抗体。本文认识到这些抗体或许具有更好的诱导T细胞转化和/或细胞因子如IFN-γ分泌的能力。于是本文认识到本文IRTCA抗体或抗原结合片段可以低于参照抗体的剂量来给药。
[0145] 某些实施方式中，包含本文IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物可在需要时以推注或连续注射的形式给予患者。某些实施方式中，推注给药的是本文所述IRTCA Fab，可按以下剂量给药：0.0025至100mg/kg、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10至0.50mg/kg。连续注射时，Fab片段形式的本发明抗体可按照以下剂量给药：0.001至100mg/kg/min、0.0125至1.25mg/kg/min、0.010至0.75mg/kg/min、0.010至1.0mg/kg/min或0.10至
0.50mg/kg/min，持续1至24小时、1至12小时、2至12小时、6至12小时、2至8小时、或1至2小时。某些实施方式中，本文抗体是或包含全长抗体(具有完整的恒定区)。某些实施方式中，全长抗体给药剂量约为0.01至10mg/kg、1至8mg/kg或2至6mg/kg。某些实施方式中，全长抗体通过30至35分钟注射来给药。给药频率根据病情严重程度而异。例如，所述频率可以是每
2-7天一次、每周一次或每1、2、3或4周一次。
0.50mg/kg/min，持续1至24小时、1至12小时、2至12小时、6至12小时、2至8小时、或1至2小时。某些实施方式中，本文抗体是或包含全长抗体(具有完整的恒定区)。某些实施方式中，全长抗体给药剂量约为0.01至10mg/kg、1至8mg/kg或2至6mg/kg。某些实施方式中，全长抗体通过30至35分钟注射来给药。给药频率根据病情严重程度而异。例如，所述频率可以是每
2-7天一次、每周一次或每1、2、3或4周一次。
[0146] 某些实施方式中，组合物可通过皮下注射给予患者。具体来说，抗体可每2-7天一次、每周一次、每两周一次或每月一次按照0.1-100mg的剂量皮下注射给予患者。
[0147] 包含本文IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物可给予接受过或将要接受一种或多种其他抗癌治疗的对象，患者由此接受这两种治疗，所述抗癌治疗选自电离辐射、化学治疗剂、抗体类药物和细胞疗法。某些实施方式中，所述一种或多种其他抗癌治疗包括免疫哨点抑制剂，IL-12，GM-CSF，抗CD4药物，顺铂，氟尿嘧啶，多柔比星，伊立替康，紫杉醇，吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)抑制剂或环磷酰胺。
[0148] 本发明的各种实施方案还可用于确定一种或多种所述IRTCA抗体和/或其抗原结合片段、核酸分子、重组载体和/或宿主细胞的有利给药方案。例如，某些实施方案中，本发明提供确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，所述方法包括：(a)提供或获取对象生物样品中分泌IFN-γ的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物，并(b)将分泌IFN-γ的测量值与参比值相比，如果分泌IFN-γ的测量值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。
[0149] 某些实施方式中，参比值可以是所述IRTCA抗体或其抗原结合片段给药前对象生物样品中的IFN-γ水平。某些实施方式中，如果对象生物样品中的分泌IFN-γ的测得量高于参比值，则治疗维持与先前基本相同的水平。某些实施方式中，如果对象生物样品中的分泌IFN-γ测得量高于参比值，则接下来的治疗采用低于先前治疗的剂量。某些实施方式中，如果对象生物样品中的分泌IFN-γ测得量高于参比值，则治疗中断一段时间。某些实施方式中，如果对象生物样品中的分泌IFN-γ测得量与参比值基本相同或低于参比值，则接下来的治疗采用高于先前治疗的剂量。
[0150] 另外举例来说，某些实施方案中，本发明提供确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，所述方法包括：(a)提供或获取对象生物样品中Treg细胞群的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物，并(b)将Treg细胞群的测量值与参比值相比，如果Treg细胞群的测量值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。
[0151] 某些实施方式中，参比值可以是所述IRTCA抗体或其抗原结合片段给药前对象生物样品中的Treg细胞群水平。某些实施方式中，如果对象生物样品中的Treg细胞群测得量低于参比值，则治疗维持与先前基本相同的水平。某些实施方式中，如果对象生物样品中Treg细胞群的测得量低于参比值，则接下来的治疗采用低于先前治疗的剂量。某些实施方式中，如果对象生物样品中Treg细胞群的测得量低于参比值，则治疗中断一段时间。某些实施方式中，如果对象生物样品中Treg细胞群的测得量与参比值基本相同或高于参比值，则接下来的治疗采用高于先前治疗的剂量。
[0152] 另外举例来说，某些实施方案中，本发明提供确定IRTCA抗体或其抗原结合片段的剂量以用于治疗有此需要的对象的方法，所述方法包括：(a)提供或获取所述对象生物样品中IFN-γ分泌性T细胞群的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物；和(b)提供或获取所述对象生物样品中Treg细胞群的测量值，所述对象接受过包含或递送一定量所述IRTCA抗体或其抗原结合片段的组合物；(c)计算IFN-γ分泌性T细胞群的测量值与Treg细胞群的测量值之比；(d)将该比值与参比值相比，如果该比值高于或低于参比值，则调整IRTCA抗体或其抗原结合片段的给药量，由此确定用于治疗所述对象的剂量。
[0153] 某些实施方式中，参比值可以是所述IRTCA抗体或其抗原结合片段给药前对象生物样品中IFN-γ分泌性T细胞群水平与对象的同一生物样品中Treg细胞群水平之比。某些实施方式中，如果对象生物样品中的算得比值高于参比值，则治疗维持先前水平。某些实施方式中，如果对象生物样品中的算得比值高于参比值，则接下来的治疗采用低于先前治疗的剂量。某些实施方式中，如果对象生物样品中的算得比值高于参比值，则治疗中断一段时间。某些实施方式中，如果对象生物样品中的算得比值与参比值基本相同或低于参比值，则接下来的治疗采用高于先前治疗的剂量。组合物
[0154] 某些实施方式中，本文提供包含特异性结合AITR多肽表位的抗体和抗原结合片段的组合物。本文组合物(如递送IRTCA抗体或抗体片段的组合物)可包含任意合适且有效量的组合物用于将本文IRTCA抗体或抗体片段递送至需要该调节、处置或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者。本文还提供包含本文所述方法(例如包括细胞与IRTCA抗体或片段接触的方法)产生的转化细胞群(如转化成TH1样细胞)的组合物。
[0155] 本文组合物包括药物组合物，其包括本文IRTCA抗体或抗原结合片段和/或用本文方法所得细胞群。某些实施方式中，药物组合物可包含缓冲剂、稀释剂、赋形剂或以上所述的任意组合。某些实施方式中，如果需要，组合物还可含有一种或多种其他治疗活性物质。
[0156] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体、抗原结合片段和/或细胞群适合给予哺乳动物(如人)。虽然有关本文所述药物组合物的描述主要涉及在伦理上适合给予人的药物组合物，但本领域技术人员应理解这类组合物通常适合给予所有种类的动物。为适合给予各种动物的人用药物组合物改造是众所周知，兽药领域普通技术人员仅通过常规实验(如果需要)即可设计和/或进行这种改变。
[0157] 某些实施方式中，提供的组合物可配制成用于胃肠外给药。例如，本文所述药物组合物可以无菌注射形式(例如适合皮下注射或静脉输液的形式)提供。例如，某些实施方式中，药物组合物可以适合注射的液体形式提供。某些实施方式中，药物组合物以粉剂(如冻干和/或无菌粉剂)形式提供，可任选地将其置于真空条件下，这样的组合物可用水性稀释剂(如水、缓冲液、盐溶液等)在注射前重建。某些实施方式中，药物组合物在水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐缓冲盐溶液等中稀释和/或重建。某些实施方式中，可将粉剂与水性稀释剂温和混合(如避免摇振)。
[0158] 某些实施方式中，本文IRTCA抗体、抗原结合片段和/或细胞群用药学上可接受的胃肠外载剂来配制。此类载剂的例子包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和1-10％人血清白蛋白。还可用脂质体和非水性载剂如非挥发油。载剂或冻干粉可含有维持等渗性的添加剂(例如氯化钠，甘露醇)和维持化学稳定性的添加剂(例如缓冲剂和防腐剂)。某些实施方式中，制剂用已知或合适的技术稳定化。
[0159] 本文所述药物组合物的制剂可通过药理学领域已知或此后开发的任何方法制备。通常，这些制备方法包括将活性成分与稀释剂或其他赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分混合的步骤，然后，如果必要和/或想要，将产物成形和/或包装成合适的单剂量单位或多剂量单位。
[0160] 某些实施方式中，包含本文IRTCA抗体、抗原结合片段和/或细胞群的药物组合物可以包含在用于储存或给药的容器中，例如小瓶、注射器(例如IV注射器)或袋子(例如IV袋)。本文药物组合物可以单个单位剂量和/或多个单独单位剂量的形式大量制备、包装和/或出售。本文中，“单位剂量”是包含预定量活性成分的独立量的药物组合物。活性成分的量通常等于能给予对象的活性成分的剂量和/或是该剂量的适当分量(例如该剂量的一半或三分之一)。
[0161] 本文药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任意其他成分的相对量可根据受治对象个性特征(identity)、身量和/或病情而不同，还取决于所述组合物的给药途径。后文实例部分描述了对啮齿动物和猴子的示例性IRTCA抗体给药。本领域中已知如何在动物系统中调节剂量的标准方法。见例如J Basic Clin Pharm.2016年3月-2016年5月；7(2):27–31，本文通过援引将其全文纳入。例如，组合物可包含0.1％至100％(w/w)活性成分。
[0162] 某些实施方式中，组合物包含或递送剂量为0.01mg/kg至100mg/kg的本文IRTCA抗体或抗原结合片段。某些实施方式中，组合物包含或递送IRTCA抗体或抗原结合片段，其剂量在由下限和上限限定的范围内，上限大于下限。某些实施方式中，下限可以是约0.01mg/kg、0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.075mg/kg、0.1mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、80mg/kg或90mg/kg。某些实施方式中，上限可以是约0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.075mg/kg、0.1mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、
2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、
50mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、
50mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
[0163] 药物组合物可另外包含药学上可接受的赋形剂，本文中，所述赋形剂包括适合所需特定剂型的任一和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘结剂、润滑剂等。《雷明顿：药物科学和实践》(Remington’s:The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.Gennaro(马里兰州巴尔的摩市的利平科特.威廉姆斯.威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)公司)记载了用于配置药物组合物的各种赋形剂及所知的其制备技术。除非某常规赋形剂介质都与物质或其衍生物不相容，如产生不希望的生物作用或者与药物组合物的任意其他组分发生有害的相互作用，否则均被考虑在本文范围内使用。
[0164] 某些实施方式中，药学上可接受的赋形剂至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。某些实施方式中，赋形剂获批用于人用和兽用。某些实施方式中，赋形剂得到美国食品药品监督管理局的批准。某些实施方式中，赋形剂是药用级别的。
某些实施方式中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
某些实施方式中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
[0165] 用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油脂。药物制剂中可任选地包含这些赋形剂。赋形剂如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂布剂、甜味剂、风味剂和/或芳香剂可根据配制者的判断包含在组合物中。
[0166] 某些实施方式中，所提供的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(如防腐剂、惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、缓冲剂等)。某些实施方式中，药物组合物包含一种或多种防腐剂。某些实施方式中，药物组合物不含防腐剂。
[0167] 某些实施方式中，包含本文IRTCA抗体或抗原结合片段的组合物被稳定配制。某些实施方式中，本文IRTCA抗体或抗原结合片段的稳定制剂可包含：含有盐水或选定盐的磷酸盐缓冲液，以及含有防腐剂的保存溶液和制剂，以及适合药用或兽用的多用途的保存制剂。保存制剂含有水性稀释剂中的至少一种已知防腐剂或可任选地至少一种选自以下所述的防腐剂：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如六水合物)、羟苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或它们的混合物。可采用本领域已知的任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5％，或其间的任意范围或值，例如但不限于：0.001、0.003、0.005、0.009、
0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、
3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或其间的任意范围或值。
非限定性例子包括：无防腐剂，0.1-2％间甲酚(如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)，0.1-3％苯甲醇(如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)，0.001-0.5％硫柳汞(如0.005、0.01)，
0.001-2.0％苯酚(如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％羟苯甲酸烷基酯(如
0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、
0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)，等等。
0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、
3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或其间的任意范围或值。
非限定性例子包括：无防腐剂，0.1-2％间甲酚(如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)，0.1-3％苯甲醇(如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)，0.001-0.5％硫柳汞(如0.005、0.01)，
0.001-2.0％苯酚(如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％羟苯甲酸烷基酯(如
0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、
0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)，等等。
[0168] 某些实施方式中，药物组合物以可冷藏和/或冷冻的形式提供。某些实施方式中，药物组合物以不可冷藏和/或冷冻的形式提供。某些实施方式中，重建的溶液和/或液体剂型可在重建后保存一段时间(如2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、一个月、两个月或更长)。某些实施方式中，抗体组合物保存超过指定的时间会导致抗体降解。
[0169] 液体剂型和/或重建溶液在给药前可能含有颗粒物和/或变色。某些实施方式中，如果发生变色或混浊和/或如果在过滤后仍有颗粒物，则该溶液不得使用。
[0170] 药物的制剂和/或制药中的总体考虑可见例如《雷明顿：药物科学和实践》(Remington’s:The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，利平科特.威廉姆斯.威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)公司)，2005。.
试剂盒
试剂盒
[0171] 本文还提供药品套装和/或试剂盒(如药盒)，其中包含一个或多个容器，所述容器装有至少一种本文所述IRTCA抗体或抗体片段。试剂盒可用于各种适用的方法，这包括例如治疗方法、诊断方法、细胞增殖和/或分离方法等。这类容器任选附有药品或生物制品生产、使用或销售的政府管理机构规定的告知书，该告知书反映(a)已获批生产、使用或销售用于人体给药，(b)使用指南，或上述两者。
[0172] 某些实施方式中，试剂盒可包括一种或多种用于检测的试剂(如检测IRTCA抗体或抗体片段)。某些实施方式中，试剂盒可包括可检测形式(如共价结合可检测部分或物质)的IRTCA抗体或抗体片段。
[0173] 某些实施方式中，本文所述IRTCA抗体或抗体片段可包含在用于对象治疗的试剂盒中。某些实施方式中，本文所述IRTCA抗体或抗体片段可包含在用于T细胞转化(例如调节性T细胞转化为TH1样(IFN-γ-阳性)细胞)的试剂盒中。
[0174] 本申请中所有引用的文献(包括非专利文献、授权专利、专利申请公开和关联的未决专利申请)其内容在此明确通过援引纳入本申请。
[0175] 通过以下示例性实施方式的描述可看出本发明的其他特征。然而，提供以下实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不限于以下实施例。实施例
[0176] 本文的至少部分内容提供了对hAITR具有高亲和力的新型IRTCA抗体及其片段，其中示例性IRTCA抗体与其上表达hAITR的T细胞的结合能导致免疫增强和/或抗癌活性。新型IRTCA抗体及其片段的产生和表征在以下实施例中有进一步的详细说明。实施例1：包括IRTCA-A在内的抗AITR抗体的克隆
[0177] 本实施例描述示例性IRTCA抗体的生产。用单克隆抗体(mAb)IRTCA-A作为模板，用聚合酶链反应(PCR)来扩增各重链和轻链可变区基因和人恒定区基因，然后用Sfi-1限制酶处理、连接、插入表达载体。将介导向细菌周质区转移的pelB前导序列插入重链基因的上游，将诱导分泌的信号肽插入轻链基因的上游来进行修饰，从而使得大肠杆菌内的表达能定位于周质区。将具体的IRTCA可变区序列与人κ链相连来构建轻链、与人恒定区相连来构建重链，由此进行克隆从而能够保留与天然Fab相同的结构(见图1，分图a)。本发明所用AITR(hGITR)源性表位的氨基酸序列是'HCGDPCCTTC'(SEQ ID NO:19)。这对应于AITR(hGITR)胞外域的第55-64位氨基酸。
在亲本IRTCA-A的可变区插入琥珀终止密码子
在亲本IRTCA-A的可变区插入琥珀终止密码子
[0178] 用针对某一核苷酸的定点突变技术在亲本IRTCA-A可变区紧邻CDR3区的上游生成琥珀终止密码子(即，IRTCA-A:TGC->TGA)。在IRTCA-A中，将轻链亲本形式内第89位的半胱氨酸和重链亲本形式内第96位的半胱氨酸突变成终止密码子从而构建CDR3随机文库。避免选择亲本序列以降低基因表达的频率并防止污染，从而可以有效地进行筛选以进行设计(见图1，分图b)。实施例2：构建抗AITR抗体库并制造抗AITR抗体
[0179] 将包含IRTCA-A亲本碱基序列、插入有终止密码子的Fab用作模板，并进行随机PCR在CDR3区内产生随机突变(图2)。
[0180] 虽然CDR3内的序列变化不会造成抗体抗原决定簇的显著改变但会增加变异，改变待选抗体表位的可能性也随着诱变氨基酸数量的增加而增加。所以，在随机PCR的设计中对LCDR3-R引物和HCDR3-F引物的突变率进行了调节，使得IRTCA-A识别的原表位可不被改变而每一氨基酸序列的突变率可为70％或更低。对于轻链，用剪接PCR技术组装重链序列，将omp引物和LCDR3-R扩增所得片段1(350bp)和LFR4-R与dp序列(dp seq.)扩增所得片段2(～1200bp)用作模板来获得片段3(约1500bp)，其中在omp引物和dp序列扩增所得的轻链CDR3区内有随机突变(见图2，分图a)。对于重链，经相同模式的扩增(见图2，分图b)后，所得碱基序列经验证后克隆到表达载体以进行噬菌体表面表达。即，为了尽可能降低对抗体结构的影响，条件是使得可变轻链中的CDR3(CDR-L3)区的长度和重链中CDR3(CDR-H3)区的长度保持不变。出现突变的克隆的频率经测定可高达约86％。最后，建成噬菌体展示文库，其中轻链和重链的多样性达到1×108或更高(见表1)。
[0181] 表1显示表达IRTCA-A Fab的噬菌体文库。即，可用“文库多样性＝转化子数量×常态Fab克隆率”来计算多样性。表1
转化子数量 意向Fab克隆率(％) 多样性
IRTCA-A轻链 5.0x108 77.5 3.8x108
IRTCA-A重链 5.0x108 86.3 4.8x108
转化子数量 意向Fab克隆率(％) 多样性
IRTCA-A轻链 5.0x108 77.5 3.8x108
IRTCA-A重链 5.0x108 86.3 4.8x108
[0182] 另一方面，为了生成二价形式的抗AITR抗体，将从噬菌体展示文库获得的Fab(VH(重链可变区)和VL(轻链可变区))与CH(重链可变区)和CL(轻链可变区)基因连接，然后插入用于动物细胞的蛋白表达载体。将插入有抗AITR抗体基因的载体转染入动物细胞株，所述动物细胞株包括HEK293和/或CHO细胞，用蛋白A或蛋白G柱进行纯化从培养物上清液中分离得到二价形式的抗人AITR单克隆抗体制品(数据未显示)。实施例3：选择亲和力改善的抗AITR抗体
[0183] 对构建的Fab(片段抗原-结合)文库用固定化GST-AITR抗原进行选择处理，重复4次。对于IRTCA-A，重复淘选后，获得具有强阳性信号的17个重链克隆和33个轻链克隆。由于亲和力的增加降低Koff值，从总共50个克隆中选择了47个Fab纯化后基于SPR(表面等离子体共振)测定Koff(见图3和图4)。对数值降低的5个(4个重链的，1个轻链的)Fab，用SPR(表面等离子体共振)测定它们的KD值(见表2)。
[0184] 如表3所示，随后发现所有最终选定的IRTCA-A Fab都具有增加的亲和力，并且增加率为8-44倍不等。
[0185] 表2列出了针对AITR抗原的五种选定IRTCA-A Fab的Koff和KD测量值。表2
[0186] 表3列出了5种IRTCA-A Fab对AITR抗原的结合亲和力测量值和倍数比(KD＝Koff/Kon，KD比＝突变体KD/IRTCA-A KD)。
表3
表3
[0187] 表4列出了表2至表3中克隆抗体的重链可变区、轻链可变区、重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列的相关SEQ ID NO。
[0188] 表5列出了表2至表3中克隆抗体的重链可变区、轻链可变区、重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列。表4
表5
表6
实施例4：IFN-γ和TGF-β作为生物标志物的用途
表5
表6
实施例4：IFN-γ和TGF-β作为生物标志物的用途
[0189] TH1细胞被评估为在各种TH(辅助T)细胞类型中具有最有效的抗癌能力，并且已知Treg细胞和TH2细胞通过在肿瘤周围产生免疫抑制环境来促进肿瘤形成。已知Treg细胞也是抑制性T细胞，并且负责抗自身抗原以抑制自身免疫疾病和过度免疫反应(Sakaguchi等,Cell,133:775-787,2008)。因此，由于这个原因，Treg细胞可用于治疗自身免疫疾病。反过来，它削弱免疫系统抗肿瘤细胞的活性，因此降低患者的抗癌能力。然而，FoxP3表达不稳定的Treg细胞中的有些亚组可以转化成效应记忆表型(Zhou等,Nature immunology,10:1000-1007,2009)。此外，缺乏VHL(Von Hippel-Lindau)的Treg细胞的特性不是固定的，而是会在某种免疫环境中发生改变，例如，它可以转化为产生IFN-γ的Teff细胞(效应T细胞)(Lee等,Immunity,42:1062-1074,2015)。所以，基于Treg细胞的免疫调节代表了有效抑制肿瘤的手段，去除Treg细胞或转化为Teff细胞的技术是免疫细胞抗癌治疗的最终目标。
[0190] IFN-γ是T淋巴细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)分泌的代表性细胞因子，并且表现出增殖和抗病毒活性。它也是巨噬细胞的重要活化剂，并且是特别关键的细胞因子，它能令其他细胞类型分化为TH1细胞。这些TH1细胞分泌IFN-γ以刺激自身分裂，并能够将未分化的CD4+细胞(TH0)分化为TH1细胞。分化的TH1细胞在激活细胞毒性T细胞、吞噬细胞和B细胞中+起关键作用。另一方面，已知TGF-β是对Foxp3 Treg细胞免疫调节来说非常重要的因子(Maria等，Immunity,30:626-635,2009)，尤其，它促进CD4+T分化成Treg细胞和具有免疫抑制能力的TH17细胞(Basso等，CellRes.,4:399-411,2009)。最后，可以在分泌TGF-β的Treg细胞减少后确定抗癌药物的效力，并且必须相对评价诱导IFN-γ的TH1的增加。为此，测定针对某些刺激的IFN-γ和TGF-β分泌可能是可用作T细胞功能变化的定量指标的适宜标准。
[0191] 因此，为了验证IFN-γ(干扰素γ)和/或TGF-β(转化生长因子-β)作为生物标志物的潜力并确定IRTCA-A对Treg细胞的活性，用代表性的Treg细胞标志物(包括CD4和CD25)从外周血单核细胞(PBMC)中分离CD4+CD25高FOXP3+Treg细胞，然后用单克隆抗体(mAb)测定细胞因子分泌。
[0192] 然后，如图6A和图6B所示，IRTCA-A作用于Treg细胞的AITR增加IFN-γ的分泌，同时减少TGF-β的分泌。另外，IRTCA-A处理诱导CD4+T分泌IFN-γ并极化为TH1细胞(图5)。即，IRTCA-A以剂量依赖性方式有效刺激T细胞的AITR并促进Treg向TH1样细胞转化。这表明IFN-γ和TGF-β可作为有用的工具用来测定刺激AITR信号系统的效果。实施例5：基于亲和力成熟的IRTCA-A的CD4+T细胞活化和极化
[0193] 本实施例描述亲和力成熟的IRTCA-A系列抗体对CD4+T细胞的影响，包括细胞因子分泌。
[0194] 首先，为了验证Fabs的突变是否改变它们能够结合的表位，制备了AITR的缺失突变体，与亲本形式的比较显示，如预期的，IRTCA-A系列Fab保留了它们结合AITR表位的能力(表7)。为了评估5种亲和力成熟的IRTCA-A Fab(表7中的IRTCA-A1、10、12、14、15，它们对AITR具有与IRTCA-A相当的高结合亲和力)的功能，测定了抗体将CD4+T细胞转变为TH1型细胞的极化效率。
[0195] 表7列出了从IRTCA-A系列的Fab克隆中分离然后纯化的Fab形式的名称(*：验证其表位结合能力的Fab)。表7
[0196] 如表8和图7A所示，当用亲和力成熟的IRTCA-A mAb处理纯化的CD4+T细胞并测定培养物上清液中细胞因子的分泌量时，亲和力成熟的mAb促进IFN-γ的分泌并诱导IFN-γ+的分泌。这些数据表明IRTCA具有加速CD4T细胞极化为IFN-γ分泌性TH1细胞的功能，并且相同系列的Fab也与CD4+T细胞表面上的AITR相互作用。尤其，给予0.5μg IRTCA-A12、IRTCA-A14和IRTCA-A15导致细胞表现出的IFN-γ分泌比IRTCA-A引起的IFN-γ分泌水平高约200％或更多(见图7A和表8)。
[0197] 表8显示给予IRTCA-A系列mAb后CD4+T细胞内IFN-γ分泌的测定结果(KD比＝突变体KD/IRTCA-A KD)。表8
克隆 KD比 IFN-γ分泌
IRTCA-A 1.0 +
IRTCA-A1 8.2 +
IRTCA-A10 8.4 ++
IRTCA-A12 27.6 +++++
IRTCA-A14 30.1 +++++
IRTCA-A15 44.4 +++++
实施例6：抗AITR抗体对Treg细胞(调节性T细胞)的作用
克隆 KD比 IFN-γ分泌
IRTCA-A 1.0 +
IRTCA-A1 8.2 +
IRTCA-A10 8.4 ++
IRTCA-A12 27.6 +++++
IRTCA-A14 30.1 +++++
IRTCA-A15 44.4 +++++
实施例6：抗AITR抗体对Treg细胞(调节性T细胞)的作用
[0198] 为了确定IRTCA-A中结合亲和力提高的mAb对Treg细胞的作用，分离CD4+CD25高FOXP3+Treg细胞，并用IRTCA-A1、A10、A12、A14和A15处理。
[0199] 如表9和表10所示，在用IRTCA-A抗体处理后，IFN-γ(TH1极化的标志)分泌增加(图7B)，而TGF-β的分泌(Treg细胞的代表性抑制细胞因子)减少(图7C)。
[0200] 根据以上结果，预期IRTCA-A系列的mAb降低Treg细胞的抑制能力并增强Teff细胞的活化，由此形成包含抗癌作用的微环境。另外，如表3、表9和表10所示，对AITR的亲和力提高与细胞因子分泌显著相关，这对IRTCA-A抗体的抗抗癌作用有所贡献。IRTCA-A12和IRTCA-A15相比IRTCA-A具有更小的KD值(见表3)，即对AITR更高的结合亲和力，它们诱导IFN-γ分泌增加。
[0201] 并且，虽然具有不同CDR序列的IRTCA-A系列抗体仍然彼此相似，结合AITR抗原上共同的表位，但同样值得注意的是它们表现出不同趋势的影响。换言之，预计，基于结合亲和力，IRTCA-A15可以在CD4+CD25高Treg细胞中以约25％的IRTCA-A剂量实现相同的抗癌效果。这意味着不仅可以调节AITR mAb的剂量来控制Treg细胞的功能，而且，可以用识别相同表位但具有更强结合亲和力的不同mAb种类来发送不同强度的信号以控制治疗效果。
[0202] 表9显示给予IRTCA-A系列mAb后Treg细胞IFN-γ分泌的变化。表9
克隆 KD比 IFN-γ分泌
IRTCA-A 1.0 ++
IRTCA-A1 8.2 +
IRTCA-A10 8.4 ++
IRTCA-A12 27.6 ++++
IRTCA-A14 30.1 +
IRTCA-A15 44.4 +++++
克隆 KD比 IFN-γ分泌
IRTCA-A 1.0 ++
IRTCA-A1 8.2 +
IRTCA-A10 8.4 ++
IRTCA-A12 27.6 ++++
IRTCA-A14 30.1 +
IRTCA-A15 44.4 +++++
[0203] 表10显示给予IRTCA-A系列mAb后Treg细胞TGF-β分泌的变化。表10
克隆 KD比 TGF-β分泌
IRTCA-A 1.0 +++++
IRTCA-A1 8.2 +++
IRTCA-A10 8.4 +++
IRTCA-A12 27.6 +
IRTCA-A14 30.1 +
IRTCA-A15 44.4 +
实施例7：NOD-SCID小鼠中人外周血单核细胞的植入及抗AITR抗体的抗肿瘤活性
克隆 KD比 TGF-β分泌
IRTCA-A 1.0 +++++
IRTCA-A1 8.2 +++
IRTCA-A10 8.4 +++
IRTCA-A12 27.6 +
IRTCA-A14 30.1 +
IRTCA-A15 44.4 +
实施例7：NOD-SCID小鼠中人外周血单核细胞的植入及抗AITR抗体的抗肿瘤活性
[0204] 本实施例描述抗AITR抗体对接受了人外周血单核细胞(PBMC)和人结肠直肠癌细胞后NOD-SCID小鼠的抗肿瘤作用。
[0205] 首先，自HLA-A24型健康供体采集的外周静脉血用肝素处理后，进行Ficoll-paque(GE医疗，新泽西州皮斯卡塔韦)密度梯度离心分离来获得外周血单核细胞(PBMC)。接着，在7
用于恢复的3小时期间，给每个NOD-SCID小鼠腹膜内注射包含于RPMI中的1×10个人PBMC。
以上21只移植小鼠在注射人PBMC(HLA-A24型)后5周接受分析。
用于恢复的3小时期间，给每个NOD-SCID小鼠腹膜内注射包含于RPMI中的1×10个人PBMC。
以上21只移植小鼠在注射人PBMC(HLA-A24型)后5周接受分析。
[0206] 7周龄的NOD-SCID小鼠(Jackson实验室，缅因州巴港)饲养在SPF(无特异病原体)环境的动物房内。全部动物实验按照实验动物伦理指南进行。
[0207] 为了评定抗AITR单克隆抗体(IRTCA)的抗癌作用，给Hu-PBL-SCID小鼠背侧皮下注射人结直肠癌细胞HT29(HLA-A24型，1×107个细胞/小鼠)，当肿瘤大小达到～2cm直径时，腹腔注射抗AITR单克隆抗体(IRTCA)，剂量为每公斤体重0.3mg、0.6mg、1.0mg、3.0mg、5.0mg，每5天一次，共3次给药。人IgG用作对照组。按组、按天数测定肿瘤体积(以mm3为单位)。
[0208] 如图8所示，抗AITR单克隆抗体(IRTCA)处理的小鼠其肿瘤大小以与抗体浓度相关的方式降低。尤其，3.0mg/kg的IRTCA浓度显示这样的效果：在第33天，肿瘤完全消除。
[0209] 另外，如图9所示，当注射了HT29细胞的受肿瘤攻击小鼠接受隔周3.0mg/kg剂量静脉注射对照hIgG、H1F1、MK4166(默克(Merck)的抗GITR抗体)或帕博利珠单抗(Pambrolizumab)(Keytruda)处理时，仅H1F1在数周后导致肿瘤减小。
[0210] 还给7周龄用人PBMC人源化的(如上所述)雌性NOD-SCID小鼠施用了示例性抗AITR单克隆抗体H1F1，为的是检测其对以下四种癌症的抗肿瘤效果：三阴性乳腺癌(MDA-MB231)、结肠癌(HT-29)和黑色素瘤(MDA-MB435、SK-MEL2)。每只小鼠注射1×107个肿瘤细胞，一旦肿瘤体积达到1000-1500mm3，受肿瘤攻击小鼠每3天腹膜内(i.p.)注射H1F1或hIgG，共三次。在图10A-D中所示时间点用卡尺测量肿瘤的宽度、长度和高度。箭头指示注射H1F1或对照的时间点。
实施例8：抗AITR抗体在猕猴中的组织交叉反应性、毒理学及作用机制分析
实施例8：抗AITR抗体在猕猴中的组织交叉反应性、毒理学及作用机制分析
[0211] 本实施例描述用示例性抗AITR抗体治疗对食蟹猴的效果。本研究使用了七只大约25-35岁体重约2-3kg的食蟹猴(Macaca fascicularis)。对照组有1只雌性猴，其接受39mL/kg的剂量体积。低剂量组包括1只雄性猴和1只雌性猴，各自接受22.5mg/kg的H1F1剂量，浓度为2.3mg/kg，剂量体积为9.75mL/kg。中剂量组包括1只雄性猴和1只雌性猴，各自接受
45mg/kg的H1F1剂量，浓度为2.3mg/kg，剂量体积为19.5mL/kg。高剂量组包括1只雄性猴和1只雌性猴，各自接受90mg/kg的H1F1剂量，浓度为2.3mg/kg，剂量体积为39mL/kg。
45mg/kg的H1F1剂量，浓度为2.3mg/kg，剂量体积为19.5mL/kg。高剂量组包括1只雄性猴和1只雌性猴，各自接受90mg/kg的H1F1剂量，浓度为2.3mg/kg，剂量体积为39mL/kg。
[0213] 在体外，在CD4+CD25高Foxp3+T细胞上检测H1F1对细胞因子分泌的影响。如图11所示，H1F1治疗使得CD4+CD25高Foxp3+T细胞向TH1细胞极化，表现为H1F1处理后IFN-γ分泌增加和TGF-β减少。
[0214] 猕猴体内也观察到H1F1介导的调节性T细胞向TH1细胞的转化。如图12所示，全部三个剂量的H1F1在3周期间引起IFN-γ阳性CD4+T细胞增加。此外，H1F1的细胞因子诱导是有差异的，如图13所示，TH1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)在H1F1处理后升高，而TH2型细胞因子(IL-4和IL-5)的水平没有变化。H1F1处理还在猕猴体内影响Treg与TH1细胞之间的平衡。如图14所示，H1F1给药的猕猴的脾细胞中，调节性T细胞群和相关细胞因子TGF-β减少，而TH1型细胞群增加。
[0215] 此外，对来自15种不同大鼠器官、16种不同狗器官、16种不同猴器官、13种不同人体器官的组织(138个不同组织)和来自EBV相关胃癌患者和急性髓性白血病患者骨髓的组织进行组织交叉反应性研究。在免疫系统中检测到H1F1特异性染色，但在其他正常人组织中未检测到。图15显示在AML患者骨髓和EBV阳性胃癌中观察到H1F1特异性染色。在猕猴和狗淋巴细胞中检测到交叉反应性，但在大鼠组织中未观察到交叉反应性。实施例9：改良抗AITR抗体的构建
[0216] 本实施例描述优化抗AITR抗体的生产。抗AITR抗体的生产
[0217] 将Expi293细胞置于125mL Erlenmeyer烧瓶中，在Expi293表达培养基中、在8％CO2培养箱内37℃旋转(125rpm)培养。细胞按2-2.5x106个细胞/ml培养在烧瓶中。在第-1天，将细胞制备在125mL Erlenmeyer烧瓶内的30ml Expi293表达培养基中(每瓶2x106个细胞/ml)。在第0天，将Opti-MEM培养基在37℃培养箱中预热约30分钟。制备管1和2，各管中加入1.5mL预热的Opti-MEM培养基。将30μg DNA(HC:15μg，LC:15μg)加入管1，充分混合。将80μL Expifectamine 293试剂加入管2，充分混合。室温下反应5分钟后，将管2的内容物加入管1中并充分混合。混合物在室温下反应20分钟。一旦确认管内混合物变得浑浊，就从烧瓶中取
3mL DNA-复合物逐滴加入。加入后，在培养箱中培养旋转培养18-20分钟，并加入
Expifectamine 293转染试剂盒中提供的增强子1和增强子2。旋转培养约7天。以下表11汇总了用于产生突变抗AITR抗体的重链(HC)可变结构域和轻链(LC)可变结构域。下表12中包括对应于突变抗AITR抗体的重链和轻链可变结构域和CDR SEQ ID NO。
表11.H1F1突变抗体Expi293细胞转染表
表12
H1F1突变抗体序列
H1F1.H8
QVQLVQSGAQVKMPGESLKVSCKASGYTFDDYGMGWVRQAPGQCLEWMGWISPYTGRTNSSDKFQGRVTMTR
DTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDGTYYDFWSGYFDNNAFDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:20)
H1F1.H2.J1
QVQLVQSGAQVKMPGESLKVSCKASGYTFTDYGMGWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGRTNSSDKFQGRVTMTR
DTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDGTYYDFWSGYFDNNAFDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:21)
H1F1.L3.J1
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNYKRPSGVPDRFSGSKSGTSA
SLAITGLQTEDEADYYCGTWDSSLNAWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:22)
H1F1.L3.J2
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNYKRPSGVPDRFSGSKSGTSA
SLAITGLQSEDEADYYCGSWESGSNAYKFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:23)
H1F1.H2.J1的CDR1
GYTFTDYG(SEQ ID NO:24)
H1F1.H2.J1和H1F1.H8的CDR2
ISPYTGRT(SEQ ID NO:25)
hIgG1_3mu
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:26)
抗AITR抗体的纯化
制备层析柱
3mL DNA-复合物逐滴加入。加入后，在培养箱中培养旋转培养18-20分钟，并加入
Expifectamine 293转染试剂盒中提供的增强子1和增强子2。旋转培养约7天。以下表11汇总了用于产生突变抗AITR抗体的重链(HC)可变结构域和轻链(LC)可变结构域。下表12中包括对应于突变抗AITR抗体的重链和轻链可变结构域和CDR SEQ ID NO。
表11.H1F1突变抗体Expi293细胞转染表
表12
H1F1突变抗体序列
H1F1.H8
QVQLVQSGAQVKMPGESLKVSCKASGYTFDDYGMGWVRQAPGQCLEWMGWISPYTGRTNSSDKFQGRVTMTR
DTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDGTYYDFWSGYFDNNAFDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:20)
H1F1.H2.J1
QVQLVQSGAQVKMPGESLKVSCKASGYTFTDYGMGWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGRTNSSDKFQGRVTMTR
DTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDGTYYDFWSGYFDNNAFDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:21)
H1F1.L3.J1
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNYKRPSGVPDRFSGSKSGTSA
SLAITGLQTEDEADYYCGTWDSSLNAWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:22)
H1F1.L3.J2
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNYKRPSGVPDRFSGSKSGTSA
SLAITGLQSEDEADYYCGSWESGSNAYKFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:23)
H1F1.H2.J1的CDR1
GYTFTDYG(SEQ ID NO:24)
H1F1.H2.J1和H1F1.H8的CDR2
ISPYTGRT(SEQ ID NO:25)
hIgG1_3mu
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:26)
抗AITR抗体的纯化
制备层析柱
[0218] 用20％乙醇装柱(20ml体积)并洗涤一次。用结合缓冲液装柱并洗涤一次。用移液管从柱中去除全部剩余缓冲液。加入3-5ml 20％乙醇，缓慢加入1ml MabSelect SuRe LX树脂，在该过程中检查洗脱乙醇的量。持续该过程直至排出全部20％乙醇且Select SuRe LX树脂达到2ml。制备抗体混合物
[0220] 将MabSelect SuRe LX装填柱中的20％乙醇排尽，并用18ml结合缓冲液洗柱一次。加入全部抗体混合物。用18ml结合缓冲液洗柱一次。缓冲液排尽后，在柱下放一1.5ml小管，其中装有100μl中和缓冲液，每次用1ml洗脱缓冲液纯化附着于柱的抗体。
抗体纯化(用FPLC)
抗体纯化(用FPLC)
[0221] 将Mab select SURE(1ml)柱连接FPLC，并用缓冲液A(1X PBS)稳定。稳定到检测不出其他峰后，进行抗体结合，即以1ml/分钟的流速将样品上柱。将缓冲液A上柱，直到UV谱图从大约1500mAU升至2000mAU再降至10mAU以下。然后，用缓冲液B(0.1M甘氨酸pH 3.0)洗脱抗体，据UV图确认洗脱峰。由此得到适用峰级份。抗体透析
[0222] 抗体纯化后，将5μl Bradford溶液加到250μl洗脱的样品中进行显色反应，并用4单位的Amicon Ultra过滤器将抗体产物浓缩至1-1.5ml的体积。将浓缩的抗体产物加入装有43ml 1x DPBS的锥形管中，置于透析装置中，用振荡器(120rpm，2小时)透析。这一步骤重复2次，每次更换新的1x DPBS。将抗体产物从透析装置移至Spin-X离心管过滤部件，离心(10000rpm，2分钟)，放入2ml储存玻璃瓶中，使用前于-20℃和-80℃保存。实施例10：改进型抗AITR抗体的特征鉴定
确定改进型抗AITR抗体的AITR结合亲和力
确定改进型抗AITR抗体的AITR结合亲和力
[0223] 将AITR过表达细胞系培养在完全培养基(H-DMEM+10％FBS+1x青霉素-链霉素)中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。每3天进行一次再培养，同时监测细胞系的形态、数量和生长速率。
[0224] 用1x胰蛋白酶/EDTA溶液处理AITR过表达细胞系制备细胞后，将细胞等分成5x105个/FACS管。加入10μg、5μg、2.5μg或1.25μg H1F1突变抗体后，在4℃反应30分钟。加入3ml FACS缓冲液(1x DPBS+1％FBS)并离心和洗涤后，加入二抗(山羊抗人 488)，并在2-8℃孵育30分钟。离心并用3mL FACS缓冲液洗涤后，加入FACS储存缓冲液(1xDPBS+2.5％FBS)，然后进行FACS分析。用作对照的是无抗体细胞、只加二抗的细胞和加AITR-PE抗体的细胞。
实施例11：AITR抗原与抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74之间结合能力的分析
实施例11：AITR抗原与抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74之间结合能力的分析
[0225] 本实施例测评突变抗AITR抗体与亲本抗体H1F1识别的AITR抗原结合的能力。用表面等离子体共振来测定突变抗AITR抗体结合AITR的能力。
[0226] 用pH7.4的HBS-EP运行缓冲液和3M氯化镁再生缓冲液运行安装了CM5传感器芯片的Biacore T200。将抗人IgG(Fc)抗体通过胺结合反应固定到CM5芯片上，并以5μL/分钟的流速注射6分钟的固定化缓冲液即pH 5.0的10mM乙酸钠缓冲液。测试的捕获抗体是亲本抗体H1F1和突变抗体M69和M74。注射浓度为3.12、6.25、12.5、25、50和100nM的谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的AITR分析物，结合时间为150秒，解离时间为240秒。用3M氯化镁在30秒完成再生并评价1:1 74结合。
[0227] 如以下表12所示，H1F1突变体M69和M74以与亲本抗体H1F1相当的亲和力结合GST-AITR分析物。表12
抗体 KD(M)
H1F1M69 6.574x 10-10
-10
H1F1M74 9.655x 10
H1F1 7.892x 10-10
抗体 KD(M)
H1F1M69 6.574x 10-10
-10
H1F1M74 9.655x 10
H1F1 7.892x 10-10
[0228] 用过表达人AITR的HEK293细胞系(AITR-5)进一步分析抗AITR抗体M69和M74与AITR的结合。如图16A所示，阴性对照mAb EU101不与AITR-5结合(3.6％)，而89.8％的AITR-
5细胞被10μg/mL浓度的H1F1染色。此外，如图16B所示，89.1％的AITR-5细胞被M69染色，
73.8％的细胞被M74染色。这些数据表明H1F1、M69和M74均以剂量依赖性方式与细胞表面表达的人AITR分子结合。
实施例12：抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74对nTreg细胞(调节性T细胞)的影响
5细胞被10μg/mL浓度的H1F1染色。此外，如图16B所示，89.1％的AITR-5细胞被M69染色，
73.8％的细胞被M74染色。这些数据表明H1F1、M69和M74均以剂量依赖性方式与细胞表面表达的人AITR分子结合。
实施例12：抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74对nTreg细胞(调节性T细胞)的影响
[0229] 本实施例中，测试突变抗AITR抗体将nTreg细胞转化为TH1细胞的能力。
[0230] 用Ficoll-Paque密度梯度离心采集外周血单核细胞(PBMC)，然后用FACS分离CD4+CD25++CD127-(nTreg)细胞。然后，nTreg细胞每隔2-3天用100U/mL IL-2处理，并用2.5和10μg/mL浓度的单克隆抗体H1F1M69、H1F1M74、TRX518和MK4166处理，共5天，将10μg/mL hIgG用作阴性对照。5天的处理后，检测细胞的IFN-γ细胞内染色，并通过ELISA检测IIFN-γ和TGF-β分泌。
[0231] 如图17所示，H1F1M69和H1F1M74刺激后，nTreg细胞转化为TH1样细胞。M69令71％的Treg转化为IFN-γ阳性细胞，M74令57％的Treg转化为IFN-γ阳性细胞。各个分图中的数字表示阳性细胞的百分比。
[0232] 为了测定用IL-2和抗AITR抗体刺激后T细胞的IFN-γ和TGF-β分泌，用培养上清液来检测IFN-γ和TGF-β。图18中的图表汇总ELISA测试的结果。H1F1M69和H1F1M74刺激TH1细胞因子IFN-γ(灰色条)的分泌，但是引起Treg细胞因子TGF-β(黑色条)的分泌减少。该测定采用每孔5x104个nTreg细胞。实施例13：抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74对iTreg细胞(诱导型调节性T细胞)的影响
[0233] 本实施例中，测试突变抗AITR抗体将诱导型Treg(iTreg)细胞转化为TH1细胞的能力。
[0234] 通过Ficoll-Paque密度梯度离心采集外周血单核细胞(PBMC)，然后通过使用CD4+微珠(美天旎(Miltenyi))的磁激活细胞分选(MACS)按照制造商的说明分离CD4 T细胞。这些CD4+T细胞然后用抗CD3/抗CD28珠(25μL，英杰(Invitrogen))、100U/mL IL-2(诺华)和
5ng/mL TGF-β1刺激6天。6天的刺激后，对细胞进行CD4-BB515和Foxp3-APC染色。然后通过MACS除去CD3/CD28珠。这些CD4+T细胞然后每2-3天用100U/mL IL-2处理，并用2.5、5和10μg/mL浓度的单克隆抗体H1F1M69、H1F1M74、TRX518和MK4166处理，共5天，将10μg/mL的hIgG用作阴性对照。5天的处理后，检测细胞的胞内IFN-γ染色，并用ELISA测定IFN-γ和TGF-β分泌。
5ng/mL TGF-β1刺激6天。6天的刺激后，对细胞进行CD4-BB515和Foxp3-APC染色。然后通过MACS除去CD3/CD28珠。这些CD4+T细胞然后每2-3天用100U/mL IL-2处理，并用2.5、5和10μg/mL浓度的单克隆抗体H1F1M69、H1F1M74、TRX518和MK4166处理，共5天，将10μg/mL的hIgG用作阴性对照。5天的处理后，检测细胞的胞内IFN-γ染色，并用ELISA测定IFN-γ和TGF-β分泌。
[0235] 转录因子叉头框蛋白P3(Foxp3)是调节性T细胞的特异性标志物，在nTreg和iTreg细胞的抑制活性中起重要作用。为了评测Treg中AITR信号传导的作用，对调节性T细胞进行体外诱导并测定Foxp3表达。如图19所示，在用抗CD3/CD28珠、IL-2和TGF-β刺激6天后，由CD4+T细胞产生了iTreg细胞。Foxp3-阳性染色(右分图)证实83.7％的iTreg。这些数据表明CD4+T细胞群由上述条件分化成了iTreg。
[0236] 虽然CD4+T细胞上的AITR表达依赖于活化，但幼稚或诱导型调节性T细胞组成型地表达AITR。在测定Foxp3表达之前，测定H1F1对iTreg细胞上AITR的结合效率。如图20所示，突变H1F1抗体(M69—分图D和M74—分图E)检测到了表面AITR。并且，H1F1M69和H1F1M74识别约39％的细胞为人AITR阳性，这样的频率高于竞争者的抗AITR抗体(平均19％的细胞—图20，分图F和G)。
[0237] 此外，如图21所示，H1F1M69和H1F1M74刺激后，iTreg细胞转变成了TH1样细胞。M69令78％的iTreg转化成了IFN-γ-阳性细胞，M74令57％的iTreg转化成了IFN-γ-阳性细胞。各个分图中的数字表示阳性细胞的百分比。
[0238] 为了测试用IL-2和抗AITR抗体刺激后T细胞的IFN-γ和TGF-β分泌，用培养上清液来测定IFN-γ和TGF-β。图22中的图表汇总了ELISA测试的结果。H1F1M69和H1F1M74刺激分泌TH1细胞因子IFN-γ(灰色条)，但引起Treg细胞因子TGF-β(黑色条)的降低。本实验采用每孔1x105个iTreg细胞。实施例14：固定化抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74对iTreg细胞(诱导型调节性T细胞)的
作用
作用
[0239] 本实施例中，测试了固定化的突变抗AITR抗体令诱导型Treg(iTreg)细胞转化为TH1细胞的能力。
[0240] 通过Ficoll-Paque密度梯度离心采集外周血单核细胞(PBMC)，然后通过使用CD4微珠(美天旎(Miltenyi))的磁激活细胞分选(MACS)按照制造商的说明分离CD4+T细胞。这些CD4+T细胞然后用抗CD3/抗CD28珠(25μL，英杰(Invitrogen))、100U/mL IL-2(诺华)和5ng/mL TGF-β1刺激6天。6天的刺激后，对细胞进行CD4-BB515和Foxp3-APC染色。然后通过MACS除去CD3/CD28珠。这些CD4+T细胞然后每2-3天用100U/mL IL-2处理，并用2.5、5和10μg/mL浓度的固定化单克隆抗体M69和M74处理约1天，共5天。5天的处理后，检测细胞的胞内IFN-γ染色，并用ELISA测定IFN-γ和TGF-β分泌。
[0241] 由于Foxp3的下调降低iTreg的抑制活性，因此制备iTreg细胞并评估了H1F1M69和H1F1M74对Foxp3表达的影响。如上所述，为了产生iTreg细胞，用抗CD3和抗CD28珠刺激CD4+T细胞并在体外极化成为iTreg。如图23(分图B和C)所示，固定化的H1F1M69和H1F1M74抑制iTreg中的Foxp3表达。并且，虽然TRX518或MK4166未能降低Foxp3的表达(图23，分图D和E)，H1F1M69和H1F1M74即使在最低浓度(2.5μg/mL)仍能降低Foxp3的表达。这样，H1F1M69和H1F1M74引起Foxp3减少，而Foxp3正是维持调节性T细胞免疫抑制剂活性的重要转录因子。
[0242] 如图24所示，iTreg细胞在加入涂有IL-2和抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74的孔中后转换为TH1样细胞。M69以剂量依赖性方式令90％的iTreg转换为IFN-γ-阳性细胞，M74以剂量依赖性方式令68％的iTreg转换为IFN-γ-阳性细胞。各个分图中的数字表示阳性细胞的百分比。实施例15：抗AITR抗体M69和M74对Teff细胞(效应T细胞)的作用
[0243] 本实施例中测定了突变抗AITR抗体使得Teff细胞转换为TH1细胞的能力。
[0244] 从健康供体采集全血，并通过Ficoll-Paque密度梯度离心从血沉棕黄层中分离出PBMC。从血浆层和Ficoll-RBC层之间的界面收集PBMC，并用RPMI1640培养基洗涤。将PBMC用预分选缓冲液重悬，并用抗人CD4、抗CD25和抗CD127染色。用FACS分选CD4+CD25-CD127+(Teff)细胞。
[0245] 如图25所示，抗AITR抗体H1F1M69和H1F1M74使得Teff细胞极化成为TH1细胞。H1F1M69(10μg/mL)令81.1％的Teff细胞极化成为IFN-γ-阳性细胞，H1F1M74(10μg/mL)令
75.3％的Teff细胞极化成为IFN-γ-阳性细胞。各个分图中的数字表示阳性细胞的百分比。
75.3％的Teff细胞极化成为IFN-γ-阳性细胞。各个分图中的数字表示阳性细胞的百分比。
[0246] 此外还检测了极化Teff细胞的IFN-γ分泌。图26中的图表汇总ELISA测试的结果。H1F1M69和H1F1M74刺激TH1细胞因子IFN-γ的分泌，这表明Teff细胞极化成了TH1细胞。
等同形式
等同形式
[0247] 本领域技术人员将会明白，或者仅需常规试验即可确定本文所述本发明具体实施方式的众多等同形式。本发明的范围不限于以上描述，而是如权利要求中所述。
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