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用于治疗癌症的药物组合物

阅读：674发布：2021-11-03

专利汇可以提供用于治疗癌症的药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于治疗癌症的治疗性组合物，更具体地涉及含有受体4-1BB的激动剂配体和1-型干扰素的组合物，两者同时或相继给药会使得有关任何成分的个体给药产生协同的抗癌效应。本发明也涉及用于治疗癌症的本发明的组合物的治疗用途。本发明还涉及编码化合物、载体以及含有载体的细胞的多聚核苷酸以及其用于癌症的治疗的用途。，下面是用于治疗癌症的药物组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种组合物，其包括至少一种4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体、以及至少一种I型干扰素或其功能上等价的变体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述4-1BB受体激动剂配体是4-1BB受体的天然配体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述4-1BB受体激动剂配体是抗4-1BB受体抗体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抗4-1BB受体抗体是IgG-2A型免疫球蛋白。
5.根据权利要求2、3或4所述的组合物，其特征在于，所述抗4-1BB受体抗体是人源化抗体。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述I型干扰素选自包括干扰素-α和干扰素-β的组中。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述I型干扰素是选自包括IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α8及其组合的组中的干扰素-α。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述至少一种I型干扰素是聚乙二醇化干扰素。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的组合物，其还包括一种化学疗法的化合物。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的组合物在医药中的用途。
11.根据权利要求1-9中任意一项所述的组合物在用于制备用于治疗和预防癌症的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述癌症是实体瘤。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述癌症是结肠癌。
14.一种药物制剂，其包括根据权利要求1-9中任意一项所述的一种组合物和一种药物学上可接受的载体。
15.一种试剂盒，在一个或多个容器内，其包括：
(i)至少一种4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体的药学上可接受的剂型，(ii)至少一种I型干扰素或其功能上等价的变体的药学上可接受的剂型，以及可选地，
(iii)至少一种化学疗法的化合物的药学上可接受的剂型。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述4-1BB受体激动剂配体是4-1BB受体的天然配体。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述4-1BB受体激动剂配体是抗
4-1BB受体抗体。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述抗4-1BB受体抗体是IgG-2A型免疫球蛋白。
19.根据权利要求16、17或18所述的试剂盒，其特征在于，所述抗4-1BB受体抗体是人源化抗体。
20.根据权利要求15-19中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述I型干扰素选自包括干扰素-α和干扰素-β的组中。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述I型干扰素是选自包括IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α8及其组合的组中的干扰素-α。
22.根据权利要求15-21中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种I型干扰素是聚乙二醇化干扰素。
23.根据权利要求15-22中任意一项所述的试剂盒在医药中的用途。
24.根据权利要求15-23中任意一项中所述的试剂盒，其还包括对不同组分的同时、顺序或单独给药的用法说明。
25.根据权利要求15-24中任意一项所述的试剂盒在制备用于治疗和预防癌症的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其特征在于，所述癌症是实体瘤。
27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于，所述癌症是结肠癌。
28.根据权利要求25-27中任意一项所述的用途，其特征在于，所述不同组分的单独给药包括4-1BB受体激动剂配体的全身给药。
29.根据权利要求25-29中任意一项所述的用途，其特征在于，所述不同组分的单独给药包括I型干扰素的瘤内给药。
30.一种I型干扰素或其功能上等价的变体用于促进4-1BB受体激动剂配体的抗肿瘤效果的用途。
31.一种多核苷酸，包括：
(i)编码4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体的核苷酸序列，以及(ii)编码I型干扰素或其功能上等价的变体的核苷酸序列，
其中，所述两种序列均位于表达调控序列之后。
32.根据权利要求31所述的多核苷酸，所述4-1BB受体激动剂配体是4-1BB受体的天然配体。
33.根据权利要求31所述的多核苷酸，其特征在于，所述4-1BB受体激动剂配体是抗
4-1BB受体抗体。
34.根据权利要求33所述的多核苷酸，其特征在于，所述抗4-1BB受体抗体是IgG-2A型免疫球蛋白。
35.根据权利要求32、33或34所述的多核苷酸，其特征在于，所述抗4-1BB受体抗体是人源化抗体。
36.根据权利要求31-35中任意一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述I型干扰素选自包括干扰素-α和干扰素-β的组中。
37.根据权利要求36所述的多核苷酸，其特征在于，所述I型干扰素是选自包括IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α8及其组合的组中的干扰素-α。
38.根据权利要求31-37中任意一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少一种I型干扰素是聚乙二醇化干扰素。
39.一种包括根据权利要求31-38中任意一项所述的多核苷酸的载体。
40.一种包括根据权利要求39所述的载体的细胞。
41.根据权利要求31-38中任意一项所述的多核苷酸、根据权利要求39所述的载体或者根据权利要求40所述的细胞在医药中的用途。
42.根据权利要求31-38中任意一项所述的多核苷酸、根据权利要求39所述的载体或者根据权利要求40所述的细胞在制备用于治疗和预防癌症的药物中的用途。
43.根据权利要求42所述的用途，其特征在于，所述癌症是实体瘤。
44.根据权利要求42所述的用途，其特征在于，所述癌症是结肠癌。
45.一种药物制剂，包括根据权利要求31-38中任意一项所述的多核苷酸、根据权利要求39所述的载体或者根据权利要求40所述的细胞，以及一种药物学上可接受的载体。
46.一种试剂盒，包括根据权利要求31-38中任意一项所述的多核苷酸、根据权利要求
39所述的载体或者根据权利要求40所述的细胞。
47.根据权利要求46所述的试剂盒在医药中的用途。
48.根据权利要求46所述的试剂盒在制备用于治疗和预防癌症的药物中的用途。
49.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述癌症是实体瘤。
50.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述癌症是结肠癌。
51.一种编码I型干扰素或其功能上等价的变体的核苷酸用于促进4-1BB受体激动剂配体的抗肿瘤效果的用途。

说明书全文

用于治疗癌症的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及用于治疗癌症的治疗组合物，更具体地涉及包括受体4-1BB的激动剂配体和I型干扰素的组合物。

背景技术

[0002] 目前，用于癌症的常见的医学治疗，例如化学疗法、外科手术、放射疗法和细胞疗法已对所述的治疗的疗效和毒性形成了明显的限制。到目前为止，根据癌症的类型、病人的总体健康水平、诊断时疾病的阶段等，这些策略获得了不同程度的成功。

[0003] 在本领域中，已知的是免疫系统在各种各样的癌症的发病机理中起着关键作用。人们认为癌症的进展是由于免疫应答中的失败从而使得癌症得以发展。癌症的治疗的可能的策略包括刺激免疫系统使得其特异性地攻击肿瘤细胞。

[0004] 4-1BB(CD137)是在T细胞和NK(自然杀伤)细胞分别被抗原或细胞因子激活后，在T细胞和NK(自然杀伤)细胞的膜中主要表达的一种共刺激受体，尽管其在其他骨髓系的白细胞表面也被发现过。通过这个受体的被自然4-1BB-配体(4-1BB-L)或激动剂抗体诱导的共刺激信号可以：

[0005] (i)提高培养刺激的淋巴细胞的增殖和存活；

[0006] (ii)刺激抗原激活的T细胞，特别是CD8+T细胞的扩增；

[0007] (iii)有利于所述T细胞的存活(细胞凋亡的抑制)；

[0008] (iv)诱导细胞毒性T(CTL)反应；以及

[0009] (v)激活自然杀伤(NK)淋巴细胞的功能。

[0010] 激动剂抗4-1BB抗体的全身给药提高了细胞毒性T细胞抗肿瘤抗原的反应，这决定了在小鼠内的具有一定程度的起点免疫原性的可移植瘤的根除(Melero等，Nat Med.1997.3(6)：682-5)，并提高了具有肿瘤抗原的接种疫苗的活性或具有抗肿瘤反应性的T细胞的过继转移(Wilcox，R.A.等，J ClinInvest.2002.109(5)：651-9)。作为这些发现和发明的延续(clinicaltrials.gov：NTC00309023和NTC00351325)，进行了临床试验，将人源化抗4-1BB单克隆抗体给药至作为不同的腺瘤病的病原携带者的病人。专利申请WO200544996和WO2006088447描述了4-1BB受体激活剂在癌症治疗中的用途。

[0011] 临床前研究表明使用抗4-1BB抗体的治疗具有安全的毒理学特征，尽管在重复高剂量时，会发生一些以肝脏淋巴细胞浸润和骨髓抑制的形式出现的副作用。存在有对用这些以抗4-1BB抗体作为单一疗法的治疗耐药的可移植的小鼠肿瘤。因此，在具有晚期癌和高肿瘤负担的患者体内可能会存在免疫抑制或耐受的条件，从而使得抗肿瘤抗原的免疫应答变得困难。

[0012] 已经证明许多细胞因子在免疫应答的调节中起着非常重要的作用。I型干扰素(IFNs)是一族具有细胞因子活性的多肽，它们起初是由于它们对体外细胞系的病毒感染的抑制活性而被发现的(Pestka，S.，Krause，C.D.和Walter，M.R.2004.Immunol Rev.Vol.202：8-32)。根据它们的序列的同源性，I型干扰素可以被分为α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)和ω-干扰素(IFN-ω)。IFN-α和IFN-β共有一个单个的在大多数的有核细胞的表面被表达的二聚受体。人类和鼠类基因组都含有一个单个的编码IFN-β的基因，而它们则含有12或13个编码IFN-α的功能基因。这些细胞因子的功能在抗多种类型的病毒感染的免疫应答中是非常重要的，因为它们启动促进感染细胞的凋亡诱导的死亡和抑制病毒的复制的机制，且同时其有利于抗原呈递。最近，有实验记录其也通过直接激活NK细胞、B细胞和T细胞的活性以及免疫应答中的树突状细胞的活性来实现其功能(Le Bon A.等，2003.Nat.Immunol.Vol.：4(10)：1009-15；Le Bon A.等，2006.J.Immunol.Vol.：176(8)：4682-4689；Le Bon A.等，2006.J Immunol.Vol.：176(4)：2074-8)。

[0013] 作为药物，IFN-α在慢性病毒性肝炎的治疗中被用作处方药，并在许多恶性疾病的治疗中被使用，例如黑色素瘤和慢性骨髓性白血病。“Murata，M.等，2006.Cytokine，Vol.33：121-128”描述了α-干扰素和β-干扰素对肝癌细胞系的抗肿瘤作用，例如抗增殖作用、改变细胞周期和细胞凋亡。IFN-α的抗肿瘤作用是通过对肿瘤细胞的直接的促凋亡作用、对血管肿瘤细胞的抗血管生成作用以及提高抗肿瘤免疫应答的作用来介导的。然而，临床实验显示IFN-α在肿瘤的治疗中的功效是非常有限的，因此与副作用相比，临床受益不是非常有利的，所以目前其在肿瘤学中的应用是非常有限的。

[0014] 有许多的参考文献描述了通过将不同的化合物结合给药治疗癌症。Martinet，O.等(Journal of the National Cancer Institute，2000，92：931-936)描述了由于携带编码白细胞介素12(IL-12)和4-1BB配体的腺病毒的给药，通过基因疗法在小鼠模型内的肝转移缓解。Chen，S.等(Molecular Therapy，2000，2：39-46)描述了因为将使用IL-12+的基因疗法和抗4-1BB的激动剂单克隆抗体的全身释放结合，具有有效的抗肿瘤CD8T细胞应答。在IL-12和抗4-1BB的结合治疗后，IL-12的有效剂量减少了高达18倍，而且获得了比单独给药最大剂量的IL-12时更好的功效。专利申请WO2004/093831描述了将细胞因子表达的细胞疫苗和至少一种抗癌治疗剂结合给药，其中结合给药的两种化合物相对于其单独给药时都具有提高的治疗功效。

[0015] 由于这些原因，包括将对应对癌症的免疫应答与常见的医学治疗相结合的策略可以成为改进治疗的功效和减少其毒性的途径。

发明内容

[0016] 在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括至少一种4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体和至少一种I型干扰素或其功能上等价的变体。

[0017] 由于根据本发明的组合物的治疗的应用，在另一个方面，本发明涉及包括至少一种4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体和至少一种I型干扰素或其功能上等价的变体的组合物在医药中的用途。

[0018] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的组合物用于制备治疗或预防癌症的药物的用途。

[0019] 在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其在一个或多个容器内包括：

[0020] (i)至少一种4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体的药学上可接受的剂型，

[0021] (ii)至少一种I型干扰素或其功能上等价的变体的药学上可接受的剂型，以及可选地，

[0022] (iii)至少一种化学疗法的化合物的药学上可接受的剂型。

[0023] 在本发明中所描述的试剂盒的用途形成了附加的发明方面。因此，在另一个方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒在医药中的用途或其在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。

[0024] 在另一个方面，本发明涉及I型干扰素或其能上等价的变体在促进4-1BB受体激动剂配体的抗肿瘤作用中的应用。

[0025] 在另一个方面，本发明涉及一种多聚核苷酸，其包括

[0026] (i)编码4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体的核苷酸，和

[0027] (ii)编码I型干扰素或其功能上等价的变体的核苷酸，

[0028] 其中，两种序列之前都是表达调控序列。

[0029] 在另一个方面，本发明涉及包括在本发明所描述的多聚核苷酸的载体以及包括本发明中的载体的细胞。

[0030] 本发明中的多聚核苷酸、载体和细胞的用途形成了本发明的另一个方面。因此，在另一个方面，本发明涉及本发明中的多聚核苷酸、载体和细胞在医药中的用途，涉及多聚核苷酸、载体和细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的用途，以及涉及包括本发明中的多聚核苷酸、载体和细胞以及药学上可接受的载体的药物制剂。

[0031] 在另一个方面，本发明涉及包括根据本发明的多聚核苷酸、载体和细胞的试剂盒。

[0032] 在另一个方面，本发明涉及包括根据本发明的多聚核苷酸、载体或细胞的试剂盒在医药中的用途，以及所述的试剂盒在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。

[0033] 最后，本发明涉及编码I型干扰素或其功能上等价的变体的多聚核苷酸在促进4-1BB受体激动剂配体的抗肿瘤作用中的用途。
附图说明

[0034] 图1：通过在雌性C57BL/6小鼠中皮内接种5x105MC38细胞而产生的皮下肿瘤淋巴2
结的个体大小的追踪(以mm 表达肿瘤病变的表面积)。

[0035] 图1A示出了在肿瘤细胞接种后的第9天和第13天使用两种剂量所施加的不同的治疗方法处理后的个体的肿瘤的发展情况。在不同的组中以下剂量给药：50μL的瘤内PBS盐水溶液；不具有相关特异性的多克隆鼠免疫球蛋白G(腹(膜)腔内给药100μg/100μL)；抗鼠4-1BB(CD137)单克隆抗体2A(腹(膜)腔内给药100μg/100μL)；
与不具有相关特异性的多克隆鼠免疫球蛋白G结合的重组鼠IFN-α4(腹(膜)腔内给
4
药0.5x10U)，或者抗4-1BB抗体2A(腹(膜)腔内给药100μg/100μL)的给药和重组鼠
4
IFN-α4(腹(膜)腔内给药0.5x10U)的结合。图1a中的最后一个曲线图示出了抗4-1BB抗体2A的给药和重组鼠IFN-α4的结合治疗具有多高的治疗效果，其示出了6只小鼠中有两只为无肿瘤存活者。

[0036] 图1B示出了在肿瘤细胞接种后每个实验组(平均值±SEM)中的肿瘤表面积。

[0037] 图1C示出了抗4-1BB抗体2A的给药和重组鼠IFN-α4的结合治疗具有较高的治疗效果，其示出了6只小鼠中有两只为无肿瘤存活者。

[0038] 图2：研究了带有两个MC38肿瘤病变的小鼠，该小鼠以与图1中的小鼠类似的方式，通过同时于背腰区域的对立侧皮下注射而被移植了两个MC38肿瘤病变，只是在这个实例中是以两侧的方式进行的。

[0039] 在这些实例中，在从两侧移植MC38肿瘤细胞起的第9天、第12天和第15天，施用三种剂量对小鼠进行治疗。治疗包括腹腔内注射多克隆大鼠免疫球蛋白和只在一个病变内瘤内注射其中溶解了小鼠干扰素-α的载体或媒介(作为实验的阴性对照)，或者给药抗4-1BB单克隆抗体2A(腹(膜)腔内给药，100μg/100μL)或者两种治疗的结合，在对应的对照组中一直只在一个结节(右结节)中瘤内注射干扰素-α或其载体。对比于接收腹腔内的抗4-1BB的实验组以及瘤内注射干扰素-α(图2A的第4对曲线图)，其中两个肿瘤结节完全消退的小鼠的相对数量为4/6，在图2A的第3对曲线图中，用腹腔内的抗4-1BB加上瘤内对照载体治疗的实验组中两个肿瘤结节完全消退的小鼠的相对数量是1/5。

[0040] 图2B示出了在接种肿瘤细胞后和在治疗后小鼠的存活率。

[0041] 图3：具有或不具有在造血谱系细胞中表达的干扰素I型受体的嵌合小鼠骨髓中的肿瘤进展。

[0042] 野生型C57BL/6小鼠组(WT)和IFN I型受体(IFNAR-/-)缺陷型小鼠回交12次，得到背景为接收致死辐射剂量为600拉德的C57BL/6。

[0043] 24小时后，它们被移植了2-5x106个供体小鼠骨髓中的细胞。所得骨髓细胞来自年龄小于3个月的小鼠的股骨和胫骨。从而在4-8周的重建期后，受体小鼠中的造血原始细胞群来自供体小鼠。因此，可认为其为在造血隔室(compartment)内具有完全嵌合性的小鼠。在6-8周之后，一旦供体骨髓已被移植，就开始与图2中描述的那些类似的细胞免疫治疗实验方案。在背的两侧皮下植入肿瘤细胞后的第11、14和17天，对带有来自MC38系的皮下肿瘤的嵌合小鼠施用三种剂量。抗4-1BB(CD137)单克隆抗体被全身(腹腔内)注射，其与IFN-α结合，所述IFN-α在右侧的肿瘤病变处被瘤内给药。对照治疗如其在之前所描述的实验中那样进行。

[0044] 图3a、3b、3c和3d示出了肿瘤的大小的进展情况，直接用IFN-α或对照载体处理的结节和未注射的结节。在不同的嵌合体(供体-受体的结合)中所进行的实验是相同的。附图详述了不同的组中的具有两个肿瘤完全消退的小鼠的数量。

[0045] 图3e示出了不同类型的嵌合小鼠中，用4-1BB抗体和IFN-α处理的组中存活的结果。

[0046] 图4：对携带MC38的小鼠的肿瘤引流区淋巴结内的淋巴细胞问题的分析。

[0047] 在皮下注射MC38肿瘤细胞后，在第9天和第12天以与之前的实验中所描述的相同方式将不同的治疗组合物进行给药。在第二剂量给药的24小时后，将小鼠处死以便从携带有移植的肿瘤的一侧提取淋巴结。

[0048] 在处理来自淋巴结的组织并得到不含聚集体(aggregate-free)的细胞悬浮液后，进行免疫荧光染色用于流式细胞仪，以便分析不同的有关淋巴细胞群。图4a示出了不+同实验组内的引流淋巴结(LN)内的肿瘤特异性T CD8 淋巴细胞的百分比和绝对数量。通过对CD8的双重标记(double marking)和与留出(set aside)的H2-Kb四聚体的结合来限定这些组，该四聚体具有定义MC38肿瘤的一个显性抗原表位的KSPWFTTL肽。如图4b所int +
示，在定义为CD11c+B220-NK1.1-的常规细胞(cDC)和定义为CD11c B220NK1.1-的浆细胞样细胞(pCD)的树突状细胞群中也都观察到了差异。在本实验中，对引流结的细胞总体数量进一步进行了计算，附图揭示了实验组之间的重要差异(图4c)。

[0049] 图5：皮下病变内瘤内IFN-α以及全身抗4-1BB单克隆抗体的治疗具有抗伴发肝内肿瘤病变的高度疗效。

[0050] 在这个实验中，每只小鼠均通过两种不同的方法接种了MC38肿瘤细胞。首先，以与之前描述的实验中相同的方式，对其进行皮下注射。然后，对小鼠进行剖腹手术以进行肿瘤细胞的肝内接种。治疗包括在接种肿瘤后的第8天、第10天和第13天，将腹腔内注射抗4-1BB抗体(或作为对照的多克隆大鼠免疫球蛋白)与在皮下结节内的IFN-α瘤内给药相结合。

[0051] 在肿瘤接种后的第17天，通过剖腹探查术观察到了肝肿瘤的结果，包括病变的大小和每个实验组的代表性照片。在图5b中看到了皮下结节的大小的进展。

[0052] 发明详述

[0053] 本发明涉及通过使用不同的治疗剂治疗癌症。本发明的发明人发现，令人惊奇地，4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的结合给药取得了比每种疗法单独地根除小鼠中形成的多种肿瘤时明显更高的疗效。

[0054] 没有预想将其与任何理论相联系，可以认为IFN-α的给药能够在恶性组织或携带肿瘤的主体的淋巴细胞内诱导修饰(modification)，所述修饰有利于免疫应答的诱导，在结合治疗的情况下，该免疫应答在4-1BB受体激动剂配体、例如激动剂抗4-1BB受体抗体存在时被增强。

[0055] 因此，本发明涉及通过4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的结合给药治疗癌症，从而获得了比所述配体和干扰素单独给药时更好的疗效。

[0056] 因此，在一个方面，本发明涉及一组合物，在下文中，本发明的组合物包括至少一种4-1BB受体激动剂配体和至少一种I型干扰素。

[0057] 在本发明中，该4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素被看作是本发明的组合物中的“抗肿瘤剂”或“活性物质”或“活性组分”，因此，在涉及它们的所有描述之处，所述表述可无区别地使用。

[0058] 在本发明中，“4-1BB受体激动剂配体”被理解为特异性结合到4-1BB受体(也称为CD137受体)的配体，一旦结合，其能够刺激所述具有自己的天然配体(4-1BBL或CD137-L)的受体的的结合一些共刺激信号特征，或者刺激来源于与具有激动剂4-1BB受体的结合的其它信号。

[0059] 有各种各样的免疫学检测，其可用于检测4-1BB受体激动剂配体的活性，例如在“Wilcox，R.等2002，J.Clin.Invest.Vol.109(5)：651-659”中所描述的体外T细胞的生长共刺激。简单地说，所述检测包括将T细胞在4-1BB激动剂配体、例如抗4-1BB单克隆抗体存在的情况下进行培养，通过结合氚来测定T细胞增殖。作为替代地，也能够通过检测在暴露于所述的配体后T细胞内的细胞周期蛋白D2表达水平的变化来检测4-1BB激动剂配体的活性，如WO2005035584中所描述的那样。

[0060] 4-1BB受体激动剂配体的例子有(i)4-1BB受体的天然配体、或其功能上等价的变体，该变体保存了结合4-1BB受体并诱导在其上的共刺激信号的能力，或者(ii)抗4-1BB受体的激动剂抗体，或其功能上等价的变体，该变体能够特异性地结合4-1BB受体，更具体地，特异性地结合所述受体的胞外域，并诱导受该受体以及相关的蛋白质控制的一些共刺激信号。结合特异性可以是对人4-1BB受体或者对与人受体同源的但不同种的4-1BB受体。

[0061] 因此，在本发明的组合物的一个特别实施例中，至少一种4-1BB受体激动剂配体是4-1BB受体的天然配体，或其功能上等价的变体。在现有技术的叙述中，已知人和小鼠的天然4-1BB受体配体。人4-1BB受体配体对应254个氨基酸的多肽，其序列在全球蛋白资源(Uniprot)数据库中示出，登录号为P41273，并且编码该多肽的多核苷酸的序列在GenEMBL数据库中示出，登录号为U03398(SEQ ID NO：1)。鼠4-1BB受体配体对应的多肽，其序列在全球蛋白资源(Uniprot)数据库中示出，登录号为P41274，并且编码该多肽的多核苷酸的序列在GenEMBL数据库中示出，登录号为L15435(SEQID NO：2)。4-1BB受体配体是II型膜蛋白质。因此，本发明考虑使用完整的蛋白质(SEQ ID NO：3和4分别对应人和小鼠蛋白质)及其胞外域(SEQID NO：5和6分别对应人和小鼠蛋白质)。因此，本发明考虑使用包括小鼠蛋白质的第106至309位氨基酸的4-1BB受体配体的可溶形式(如US6,355,779中所描述的)，4-1BB的可溶形式与Fc区域的融合蛋白质(如US6,355,779中所描述的)，免疫球蛋白分子及其二聚体型式(version)，4-1BB受体配体的可溶部分的三聚体(如WO2007000675中所描述的)，由4-1BB受体配体的胞外域、连接子和与相对T细胞中出现的受体具有特异性的免疫球蛋白的轻链和重链的可变区对应并能够促进其活化的区域所形成的融合蛋白质的三聚体(如WO2004069876中所描述的)。

[0062] 4-1BB受体的天然配体的功能上等价的变体可理解为任意多肽，其序列可通过在天然的4-1BB配体序列中插入、替换或消除一个或多个氨基酸序列得到，该多肽至少部分地保存了刺激4-1BB受体的能力，该能力可通过上述检测来确定。优选地，天然4-1BB配体的变体与所述变体具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性。通过本领技术人员众所周知的计算机算法和方法可确定变体和自然配体之间的一致性程度。两个氨基酸序列之间的一致性优选使用BLASTP算法(BLASTManual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)来确定。

[0063] 在本发明的组合物的另一特别实施例中，至少一种4-1BB受体激动剂配体是任意类或亚类的免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的抗4-1BB受体抗体。在一特别实施例中，至少一种所述激动剂抗4-1BB受体抗体是IgG-2A型免疫球蛋白。

[0064] 在本发明中，术语“抗体”应解释为宽泛的含义，并且包括多特异性抗体、多克隆抗体、单克隆抗体以及其(F(ab′)2、Fab部分，只要它们能够识别相关的抗原，特异性地结合4-1BB受体或所述受体的胞外域。

[0065] 在本发明中，“激动剂4-1BB受体抗体”理解为能够特异性地结合4-1BB受体和所述受体的胞外域、并诱导被4-1BB受体以及相关的蛋白质控制的一些共刺激信号的任意抗体。在本发明的上下文中可使用的抗体的例子为，例如但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完整的人抗体等。

[0066] 多克隆抗体是使用抗原进行免疫的动物的血清中所产生的抗体分子的最初的异源混合物。它们也包括例如通过具有相关抗原的单一表位的肽的柱色谱从异源混合物获得的单特异性多克隆抗体。

[0067] 单克隆抗体是对抗原的单一表位具有特异性的抗体的同源性群体。这些单克隆抗体能够通过例如已在“ 和Milstein[Nature，1975；256：495-397]或Harlow和Lane[“Using Antibodies.A Laboratory Manual”由E.Harlow和D.Lane所著，Editor：Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；1998(ISBN
978-0879695439)]”中描述的常规技术进行制备。

[0068] 嵌合抗体是通过克隆或重组来自不同动物种的抗体所构建的单克隆抗体。在本发明的一个典型但非限制性的构型中，所述嵌合抗体包括单克隆抗体的一部分，该部分通常为包括识别和结合抗原的位点的可变区(Fv)，和对应于人抗体的另一部分，该部分通常包括恒定区和邻近的恒定区。

[0069] 完整的人抗体是这样的抗体，其使用人免疫系统在转基因动物内产生，或通过人免疫细胞的体外免疫产生(使用或不使用佐剂、纯的或不纯的抗原进行的基因免疫和传统免疫；或者通过将抗原暴露于免疫系统的任意方法)，或者通过由人免疫细胞所产生的自然/合成文库产生。这些抗体能够从转基因动物(例如，小鼠)中获得和筛选出，所述转基因的动物内人免疫球蛋白基因已被克隆并且使用目标抗原(在本发明中是使用4-1BB受体)对其进行免疫。这些抗体的获得可通过下列途径，筛选人噬菌体展示(phage-displayed)的单链可变区(ScFv)或抗原结合区(Fb)，之后克隆并移植到人抗体内，或者通过本领域技术人员已知的任意其他方法来生产和展示通过克隆两条链的可变区所产生的文库，并且之后克隆/突变它们以产生抗体文库。

[0070] 人源化抗体是通过将小鼠单克隆抗体的高变互补决定区(CDR)克隆并移植到人抗体中以替换其其自己的高变CDR区而构建的单克隆抗体。

[0071] 因此，在本发明的组合物的一个特别实施例中，至少一种激动剂抗4-1BB受体抗体是人源化抗体。对4-1BB受体具有特异性的人源化抗体的例子已在WO200410947中描述过。

[0072] 另外，在本发明的上下文中，术语“抗体”也包括如WO2006088447中描述的具有改变的糖基化模式(pattern)的变体，以及由蛋白质或通过重组技术获得的糖基化或非糖基化的抗体片段，其能够包括(i)通过结合肽而彼此结合的可变的抗体区域(ScFv)；(ii)与结合到轻链上的重链(Fd)的恒定区CH1相邻的可变区(ScFab)，所述重链是通过半胱氨酸或通过结合肽和二硫键结合到所述轻链上的；(iii)新变体，例如单独的重链；或者(iv)在抗体片段上实施的任意修饰，所述修饰是为了使其更相似、更少的免疫原性(人源化)或在生物体液中更稳定，从而它们能够产生一些4-1BB受体的共刺激信号的特征。

[0073] 在本发明中所描述的激动剂4-1BB受体抗体能够通过常见的重组或基因工程技术，用于从生物体液或组织生产、提取、纯化抗体的常见技术，或者本领域的技术人员众所周知的获得蛋白质和抗体的任何其它常见技术而得到。当4-1BB受体激动剂是抗体时，除了别的以外，以下技术可用于它们的生产，而不应作为任何限制：动物内的免疫技术，包括用于人免疫球蛋白基因的转基因动物、通过杂交瘤细胞生产单克隆抗体、通过抗体文库的生产，所述抗体文库可以是自然的、合成的或来自免疫相关的抗原的有机体，并且该抗体文库可以通过不同的展示方法筛选(噬菌体展示、核糖体展示等)且随后可通过基因工程技术在用于生产具有不同大小、组成和结构的重组抗体的载体中被重新设计和表达。用于生产和纯化抗体的主要方法的综述可以找到，例如：

[0074] ·S.Dübel.所著的“Handbook of Therapeutic Antibodies”，编辑：Wiley-VCH，2007，Vol：I至III(ISBN 978-3527314539)；

[0075] ·G.Subramanian Ed. 所著的“Antibodies：Volume 1：ProductionandPurification”，编辑：Springer，第一版，2004(ISBN 978-0306482458)；

[0076] ·G.Subramanian Ed.所著的“Antibodies：Volume 2：NovelTechnologies and Therapeutic Use”，编辑：Springer，第一版，2004(ISBN978-0306483158)；

[0077] ·J.Sambrook和 D.W.Russel Eds 所著的“Molecular Cloning：aLaboratory manual”，出版社：Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三版，2001(ISBN978-0879695774)。

[0078] 更具体地，在WO98/16249、WO2004/010947、US2004/0109847和US2005/0013811中所描述的任意方法都可用于生产和获得特异性结合4-1BB受体的抗体，上述申请的全部内容作为参考文献而被包括。

[0079] 如上所述，本发明的组合物包括至少一种4-1BB受体激动剂配体和一种I型干扰素。那些被用在本发明的药物的制备中的至少一种干扰素是任意类的I型干扰素，例如IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFNε、IFN-κ、IFN-τ和IFN-ω。

[0080] 在一个特别的实施例中，包括在本发明的组合物中的至少一种I型干扰素选自包括干扰素-α(IFN-α)和干扰素-β(IFN-β)的组中。

[0081] 当I型干扰素是IFN-α时，其可对应由属于人IFN-α基因家族中的成员的任意基因所编码的任意干扰素。在一个特别的实施例中，至少一种I型干扰素选自包括IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α8及其组合(包括与药物配方中的其它物质的组合)的组中。

[0082] 根据本发明能够使用的I型干扰素种类，特别是IFN-α和IFN-β的列表可以在Bekisz等(Growth Factors，2004；22：243-251)和Petska等(Immunological Reviews，2004；202：8-32)中找到。一种干扰素的组合，例如IFN-αn1(类淋巴母细胞衍生物)或IFN-α3[通过被仙台病毒(或另一病毒)或病毒颗粒刺激的人白细胞生产的干扰素的组合]，例如，能够额外地被用于制备本发明的组合物。

[0083] 所使用的I型干扰素的来源不是本发明的一个关键方面。它可以具有天然来源，从生物体液或组织中提取和纯化，或者它可以通过常见的重组或基因工程方法制备，例如那些在Sambrook和Russel(“Molecular Cloning：aLaboratory manual”by J.Sambrook，D.W.Russel Eds.2001，第三版，ColdSpring Harbor，New York)中所描述的，通过合成工艺或已在现有技术中有叙述的其它常见技术。

[0084] 在本发明的一个特别的实施例中，包括在本发明的组合物中的至少一种I型干扰素是聚乙二醇化形式。一些用于制备聚乙二醇化形式的干扰素的例子可以在US 5,762,923和US 5,766,582中找到。此外，也能够使用一些已经商业化的聚乙二醇化形式或非聚乙二醇化形式的干扰素。这些包括但不限于，Hoffmann La Roche Inc.的ROFERON-A(重组人IFN-α2a)和PEGASYS(聚乙二醇化IFN-α)，Schering Corp.的INTRON-A(人重组 IFN-α2b)和PEG INTRON( 聚乙二醇化IFN α2b)，Interferon Sciences 的ALFERON-N(IFN-α3n，天然干扰素的组合)，或者InterMune Pharmaceuticals Inc.的IFNERGEN(IFN-αcon1)，其序列是不与天然序列精确对应的共有序列。IFN-β制剂，例如Biogen Idec的AVONEX(IFN-β1a)，EMD Serono，Inc的REBIF(IFN-β1a)和Bayer Health Care的BETASERON(IFN-β1b)也包括在内。

[0085] 在另一特别的实施例中，本发明的组合物还包括化学疗法的化合物。

[0086] 在本发明中，“化学疗法的化合物”指的是那些在癌症的治疗中使用的化合物或试剂，例如烷化剂、生物碱、抗代谢物、抗肿瘤抗体、亚硝基脲、拮抗剂/激动剂类似物、免疫调节剂、酶以及其他等等。专利申请WO2004/093831中的表1和2描述了用于实现本发明的有用的化学治疗剂。

[0087] 根据本发明，4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的结合给药在癌症的治疗中取得了比所述配体和所述干扰素单独地给药时更好的疗效。

[0088] 因此，在另一个方面，本发明涉及根据本发明的组合物在医药中的用途。

[0089] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

[0090] 在本发明的上下文中，“抗肿瘤治疗”、“癌症的治疗”、“癌症的预防”指的是4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素结合给药来预防或延迟症状的发病、并发症或者癌症或肿瘤的生化指征，以缓解其症状，或停止或抑制其发展和进展，例如转移瘤的发病。治疗可以是延迟疾病的发病或预防其临床或亚临床的症状表现的预防性治疗，或者是消除或缓解在疾病表现后或与其相关的手术或放射疗法治疗后的症状的治疗性治疗。

[0091] 使用本发明的组合物治疗的癌症可以是任意类型的癌症或肿瘤。这些肿瘤或癌症包括但不限于，血液学癌症(例如，白血病或淋巴瘤)、神经病学肿瘤(例如，星形细胞瘤或成胶质细胞瘤)、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、胃肠肿瘤(例如胃癌、胰腺癌或结肠癌)、肝癌、肾细胞癌、泌尿生殖系肿瘤(例如，卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌)、骨肿瘤和血管瘤。

[0092] 因此，在一个特别的实施例中，通过使用本发明的组合物或由所述的组合物制备的药物治疗或预防的癌症是实体瘤，或者，在另一个特别的实施例中是结肠癌。

[0093] 本发明的组合物可以通过不同的方法给药，例如，静脉注射、腹腔注射、皮下给药、肌内给药、局部给药、皮内注射、鼻内给药或支气管内给药，并且可以局部或全身或直接给药至靶点。关于活性成分的不同给药方法、待使用的赋形剂以及制造它们的工艺的综述可以在“Tratado de Farmacia Galénica，C.Faulíi Trillo，Luzán 5，S.A.de Ediciones，1993和Remington’sPharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro，Ed.)，第20版，Williams & WilkinsPA，USA(2000)”中找到。

[0094] 给药方案将由医生和临床因素确定。在医药领域中众所周知，剂量取决于许多因素，包括病人的身体特征(年龄、体形、性别)、使用的给药方法、疾病的严重程度、使用的特别的化合物以及个体的药物代谢动力学特征。

[0095] 本发明的组合物包含的抗肿瘤剂的数量可在一较宽的范围内变化，但是其一直在治疗有效量内。

[0096] 在本发明中，“治疗有效量”指的是4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的量足以延迟或抑制肿瘤生长，或者诱导抗肿瘤免疫应答的增加。

[0097] 因此，本发明的组合物包含数量在0.1和2000mg范围内的抗肿瘤剂，优选在0.5至500mg的范围内，甚至更优选在1至200mg内。组合物的合适剂量可以在0.01-100mg/kg体重的范围内，优选在0.1-50mg/kg体重之间，更优选在0.5-20mg/kg体重之间。所述组合物每天可以各种次数进行给药，特别地是每天1到4次。

[0098] 根据本发明的组合物已经被证明在抗肿瘤的治疗中是有用的。因此，在另一个方面，本发明涉及包括本发明的组合物和药物上可接受的载体的药物制剂。

[0099] 为了在药物中使用，本发明的化合物的组合可以是前药、盐、溶剂、或包合物的形式，这些可以是分离的形式或者与额外的活性剂结合。根据本发明的化合物的组合可以与在药物学观点上可接受的赋形剂一起配制。在本发明中使用的优选的赋形剂包括糖、淀粉、纤维素、树胶和蛋白质。在一个特别的实施例中，本发明的药物组合物将会配制成固体(例如，药片、胶囊、糖衣药片、颗粒剂、栓剂、可以再造以提供液体形式的结晶的或无定形的无菌固体等)，液体(例如，溶液、悬浮液、乳液、酏剂、洗液、软膏等)，半固体(凝胶、药膏、乳霜等)的药物给药形式。本发明的药物组合物可以通过任意方法给药，包括但不限于，口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠道、局部、舌下或者直肠给药。关于活性成分的不同给药形式、待使用的赋形剂以及它们的制造工艺的综述可以在“Tratado de Farmacia Galénica，C.Faulíi Trillo，Luzán 5，S、A.deEdiciones，1993”和“Remington’s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro，Ed.)，第20版，Williams & Wilkins PA，USA(2000)”中找到。药物学上可接受的载体的例子在现有技术的叙述中是已知的，并且包括磷酸盐缓冲溶液、水、乳液(例如，油/水乳液)、不同类型的润湿剂、无菌溶液等。包括所述载体的组合物可以通过现有技术中已知的常见的工艺配制。

[0100] 在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，在下文中，本发明的试剂盒包括一个或多个容器，用于

[0101] (i)至少一种4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体的药物学上可接受的剂型，

[0102] (ii)至少一种I型干扰素或其功能上等价的变体的药物学上可接受的剂型，以及，可选地

[0103] (iii)一种化学疗法的化合物的药物学上可接受的剂型。

[0104] 在本发明中，“试剂盒”可理解为一种含有形成组合物的不同的活性成分的产品，所述活性成分被填充以便允许其运输、储存以及同时或顺序给药。因此，本发明的试剂盒含有一种或多种含有本发明的活性成分并且其可以制备为单剂量或多剂量的悬浮液、药片、胶囊、吸入器、注射器、贴片等。额外地，试剂盒可以含有一个合适的载体，用于重悬浮本发明的组合物，例如水溶性介质(例如，盐溶液、林格氏溶液、乳酸盐的林格氏溶液、葡萄糖和氯化钠)、水可溶的介质(例如乙醇、聚乙二醇、丙基乙烯乙二醇)和水不可溶的载体(例如玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯)。另一种可出现在试剂盒中的组分是包装材料，其使得本发明的剂型保持在确定的界限内。用于制备所述包装材料的合适材料包括玻璃、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸、小袋等。

[0105] 在本发明的试剂盒的一个特别实施例中，至少一种4-1BB受体激动剂配体是4-1BB受体的天然配体。

[0106] 在本发明的试剂盒的一个特别实施例中，至少一种4-1BB受体激动剂配体是激动剂抗4-1BB受体抗体，其一个更特别的实施例中，是IgG-2A型免疫球蛋白或人源化抗体。

[0107] 在本发明的试剂盒的一个特别实施例中，至少一种I型干扰素选自包括IFN-α和IFN-β的组中。

[0108] 在本发明的试剂盒的另一特别实施例中，至少一种I型干扰素是选自包括IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α4、IFN-α5、IFNα8及其组合的组中的IFN-α。

[0109] 在本发明的试剂盒的另一特别实施例中，至少一种I型干扰素是聚乙二醇化干扰素。

[0110] 本发明的试剂盒的不同用途形成了其附加的方面。因此，在一个方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒在医药中的用途。

[0111] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒在癌症的治疗或预防中的用途。

[0112] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。在一个特别的实施例中，所述癌症是实体瘤或结肠癌。

[0113] 额外地，本发明的试剂盒包含对试剂盒中存在的药物制剂的同时、顺序或单独给药的用法说明。因此，在一个特别的实施例中，本发明的试剂盒还包括对不同组分的同时、顺序或单独给药的用法说明。

[0114] 所述用法说明可以在印刷材料形式中找到，或者在能够储存用法说明的电子支持物的形式中找到，从而其可以被主体，例如电子存储媒介(磁盘、磁带等)、光学媒介(CD-ROM、DVD)等读取。额外地或作为替代地，所述媒介可以包含提供所述用法说明的互联网站。

[0115] 正如本领域的技术人员所理解的那样，本发明的试剂盒的药物制剂，即包括至少一种4-1BB受体激动剂配体或至少一种I型干扰素或者一种化学治疗剂的药物学上可接受的制剂将根据待使用的给药方法配制。因此，在一个特别的实施例中，包括至少一种4-1BB受体激动剂配体的药物学上制剂将以合适的方式配制，以便全身给药，并且包括至少一种I型干扰素的药物学上可接受的制剂将以合适的方式配制，以便瘤内给药。额外地，在本发明的上下文中，包括I型干扰素的药物学上制剂优选以有利于其在给药位点(例如肿瘤组织)的持续或者延迟其从那里消除的合适方式进行配制。

[0116] 如在上述说明书中所述，而非意图与任何理论相联系，建议I型干扰素的瘤内给药诱导恶性组织中的修饰，所述修饰有利于免疫应答的诱导，在结合治疗的情况下，所述修饰在4-1BB受体激动剂配体存在时被放大。因此，在本发明的上下文中，优选地，4-1BB受体激动剂配体优选非肠道或全身给药，并且I型干扰素瘤内给药。

[0117] 因此，在另一个方面，本发明涉及I型干扰素或其功能上等价的变体在促进4-1BB受体激动剂配体的抗肿瘤效果中的用途。

[0118] 正如本领域的技术人员所理解的那样，除了用于癌症治疗的4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的结合给药，实施本发明的另一种途径包括：给药包括编码4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的核苷酸序列的载体。当载体在受体有机体内表达时，它将产生实现用于癌症治疗的上述疗效的对应的蛋白质。

[0119] 因此，在另一个方面，本发明涉及一种多核苷酸，在下文中，本发明的多核苷酸，包括

[0120] (i)编码4-1BB受体激动剂配体或其功能上等价的变体的核苷酸序列，以及[0121] (ii)编码I型干扰素或其功能上等价的变体的核苷酸序列，其中，两种序列之前都是表达调控序列。

[0122] “功能上等价的变体”的定义与上述关于包含对应4-1BB配体的多肽的组合物中的定义一致。

[0123] 本领域的技术人员能够理解，在4-1BB受体激动剂配体的核苷酸序列中，引起对于蛋白质的功能性来说的非关键性位置处的氨基酸的保守替换的突变是进化上地中性突变，不会影响蛋白质的整体结构或功能性。因此，术语“功能上等价的变体”也包括(ii)从4-1BB受体激动剂配体的氨基酸系列通过替换、删除或插入一个或多个氨基酸得到的变体，和(ii)本质上保持了原始的蛋白质的功能。

[0124] 此外，位于本发明的多核苷酸的核苷酸序列之前的表达调控序列可以可操作地结合到所述核苷酸序列上。如在本说明书中所使用的，表达“可操作地结合”意指核苷酸序列位于正确的阅读框内，以便其在所述调节序列的控制下表达。

[0125] 对本发明有用的调控序列可以是核启动序列(nuclear promotingsequence)，或者，作为替代地，增强子序列和/或其他增加异源核酸序列表达的调控序列。启动子可以是组成的或诱导的。如果需要异源核酸序列的恒定表达，则使用组成启动子。众所周知的组成启动子的例子包括巨细胞病毒(CMV)前早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子等。大量的其他组成启动子的例子在本领域是众所周知的，并且可用于实施本发明。如果需要异源核酸序列的控制表达，则必须使用诱导启动子。在非诱导状态，诱导启动子必须是“沉默的”。“沉默的”可理解为在诱导子不存在时，很少或未检测到异源核酸序列的表达；然而，在诱导子存在时，异源核酸序列的表达发生。表达的水平可以通过改变诱导子的浓度频繁地控制。
通过控制表达，例如，通过改变诱导子的浓度，从而诱导启动子被刺激地更强或更弱，则异源核酸序列转录产品的浓度会受到影响。如果异源核酸序列编码基因，那么蛋白质的合成数量可被控制。因此，能够改变治疗产品的浓度。众所周知的诱导启动子的例子有：雄激素或雌激素启动子，金属硫蛋白启动子或响应蜕皮激素的启动子。其他各种各样的例子在本领域是众所周知的，并且可被用于实施本发明。除了组成的和诱导的启动子(其通常在各种各样的细胞或组织类型中起作用)之外，组织特异性启动子可用于获得细胞或组织中的特异性异源核酸序列的表达。众所周知的组织特异性启动子的例子包括许多肌肉特异性启动子，包括：骨骼α-肌动蛋白启动子、心肌肌动蛋白启动子、骨骼肌钙蛋白C启动子、慢收缩心肌肌钙蛋白C启动子和肌酸激酶启动子。在本领域中有大量的众所周知的肌肉特异性启动子，并且其可以用于实施本发明。(对于肌肉特异性启动子的综述，参见Miller等，(1993)Bioessays 15：191-196)。

[0126] 在一个特别的实施例中，本发明的多核苷酸编码4-1BB受体的天然配体。

[0127] 在另一特别的实施例中，本发明的多核苷酸编码激动剂抗4-1BB受体抗体，在另一个更特别的实施例中，所述激动剂抗4-1BB受体抗体是IgG-2A型免疫球蛋白。

[0128] 在另一特别的实施例中，本发明的多核苷酸编码选自包括干扰素-α和干扰素-β组中的I型干扰素。

[0129] 在本发明的多核苷酸的另一特别的实施例中，I型干扰素是选自包括IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α4、IFN-α5、IFNα8及其组合的组中的干扰素-α。

[0130] 在本发明的多核苷酸的另一特别的实施例中，I型干扰素是聚乙二醇化干扰素。

[0131] 本发明的多核苷酸可被包含在用于将其克隆到宿主细胞内的合适的载体中。因此，在另一个方面，本发明涉及一种载体，在下文中，本发明的载体包括根据本发明的多核苷酸。

[0132] 载体的选择取决于其将被引入的宿主细胞。举例来说，本发明的载体可以是质粒，或者是当其被引入宿主细胞时，整合或不整合到所述细胞的基因组内的载体。所述载体可以通过本领域技术人员已知的常见方法获得，并且可以例如在“Sambrock等，2001.“Molecular cloning：a Laboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，Vol.1-3”中找到。

[0133] 尽管如此，在本发明的范围内，本发明的载体优选在基因治疗使用的合适的病毒载体或非病毒载体；通过非限制性的说明，所述载体可以是基于逆转录病毒、腺病毒等的病毒载体，或者在非病毒载体的情形下，所述载体可以是DNA-脂质体、DNA-聚合物、DNA-聚合物-脂质体复合物等[参见Huang，Hung和Wagner编辑的“Nonviral Vectors for Gene Therapy”，AcademicPress(1999)]。含有本发明的多核苷酸的所述病毒或非病毒载体可以通过常见的方法直接给药至人体或动物体。作为替代地，所述载体可被用于例如，在活体外转化、转染或感染细胞，例如哺乳动物(包括人)细胞，接着，将其植入人体或动物体内以获得所需的疗效。为了给药至主体，所述细胞将以合适的介质配制，所述介质不会对其生存能力有不利的影响。

[0134] 同样地，本领域的技术人员将会理解，除了别的，所述载体可以包含多克隆位点、表达调控序列、用于载体将被引入的宿主细胞的合适的复制起点、选择标记等。

[0135] 在另一个方面，本发明涉及包括本发明的载体的细胞。

[0136] 如上所解释的那样，实施本发明的另一方式包括给药包括编码4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的核苷酸序列的载体。因此，当所述载体在受体有机体内表达时，它将产生对应的蛋白质，所述蛋白质将实现用于治疗癌症的上述疗效。

[0137] 因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的细胞在医药中的用途。

[0138] 在另一个方面，本发明涉及本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的细胞在制备用于癌症的治疗或预防的药物中的用途。

[0139] 在一个特别的实施例中，所述癌症是实体瘤或结肠癌。

[0140] 在另一个方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的细胞和药学上可接受的载体的药物制剂。

[0141] 在另一个方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的细胞的试剂盒。

[0142] 在另一个方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的细胞的试剂盒在医药中的用途。

[0143] 在另一个方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的细胞的试剂盒在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。

[0144] 在一个特别的实施例中，本发明涉及包括本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的细胞的试剂盒在制备治疗或预防实体瘤或结肠癌的药物中的用途。

[0145] 最后，在另一个方面，本发明涉及编码用于促进4-1BB受体激动剂配体的抗肿瘤效果的I型干扰素或其功能上等价的变体的多核苷酸。

[0146] 额外地，本发明涉及一种治疗或预防癌症的方法，包括(i)以治疗有效量将4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素以及可选地化学治疗的化合物一起结合给药，或者(ii)给药根据本发明的多核苷酸、载体或细胞。所述方法可以包括单独地、顺序地或同时地给药所述的配体和干扰素，其允许对每种组分使用不同的给药方法。

具体实施方式

[0147] 实例

[0148] 通过4-1BB受体激动剂配体和I型干扰素的结合给药延迟小鼠内的肿瘤生长[0149] I.材料和方法

[0150] 1.1细胞培养物

[0151] 起初，来自James Mulé’s实验室的MC38系在补充了10％v/v的热灭活的胎牛血清(GIBCO)、50μg/mL的2-巯基乙醇、100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的RPMI1640培养基(GIBCO)中体外培养。细胞是贴附的，所以通过使用胰蛋白酶溶液(GIBCO)在室温下孵育5分钟以将其从培养瓶(GREINER)中分离。在细胞洗涤后，将其隔开用于培养，或者重悬浮在盐水血清中用于注射。细胞的数目通过Neubauer室内的显微镜来确定。

[0152] 1.2肿瘤细胞的接种

[0153] 5x105MC38肿瘤细胞通过带有28G针的胰岛素注射器进行皮内注射，并且采用足以防止细胞悬浮液泄露的皮下途径被接种在实验动物内。Hamilton#710RN注射器(100μL)用于肝内接种。在腹腔镜检查期间，通过具有异氟醚的麻醉吸入装置使动物保持麻醉。在这种情况下，细胞被注射到小鼠的肝脏的左叶内。

[0154] 1.3获得实验动物

[0155] 相对于C57BL/6肿瘤细胞系同源的小鼠(6-9周大，雌性)在兽医的监督下处在没有特异病原体的动物机构中。植入小鼠内的肿瘤结节通过使用数字计量器测量来追踪和监测，肿瘤面积通过两个垂直的直径(以毫米计)相乘来计算。通过Jackson标记IFNAR-/-小鼠，并在我们研究所的动物室内进行杂交。

[0156] 1.4获得抗肿瘤剂

[0157] 1.4.1抗4-1BB单克隆抗体

[0158] 通过由Lieping Chen博士在梅奥诊所(罗彻斯特，明尼苏达州，美国)获得的杂交瘤2A(免疫球蛋白IgG2A的亚类)来生产抗4-1BB单克隆抗体，其识别小鼠4-1BB受体并在其上引起激动剂效果(WilcoxRA等2002.J ClinInvest.109(5)：651-9)。

[0159] 抗体通过亲和色谱纯化来自杂交瘤细胞的培养物的上清液得到，根据制造商的说明书(Pharmacia)，亲和色谱柱用蛋白质G琼脂糖凝胶填充。溶液中的抗体用磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行透析，并且通过光谱测定法分析抗体溶液相对盐水缓冲液在280nm处的吸光度以确定抗体的浓度。在证实了其在活性小鼠T细胞上的抗原结合能力和确定了不存在杂质内毒素后，将抗体保存在-80℃直到使用。使用的对照抗体是由SIGMA生产的多克隆小鼠免疫球蛋白G，其以相似的方式保存。

[0160] 1.4.2I型干扰素

[0161] 在使用表达质粒稳定转染的杂交瘤细胞系中生产小鼠IFN-α4(Le Bon A.等2003.Nature Immunology，Vol.4：1009-1015)。编码IFN-α4的基因被克隆到pEE12表达质粒(Celltech)内。在其在大肠杆菌中扩增后，质粒被纯化，转基因被测序。编码IFN-α4cDNA的pEE12质粒被用于转染NSo小鼠骨髓瘤细胞系。在筛选培养基生
长后，将菌落(克隆)进行筛选，并且选择了转染细胞的一个单菌落，因为其可高表达
6
IFN-α4。将所述细胞以0.5x10 细胞/mL的密度在补充了胆固醇脂类浓缩剂(1x；Life Technologies)的无血清培养基中培养10-15天。通过细胞病变抑制法测定培养在Falcon微板(BectonDickinson)的单层内的L细胞(ATCC号：CCL-1)上的水疱性口炎病毒，分析
6
收集的培养物的上清液中的IFN-α4含量。IFN-α4制剂显示的活性为2x10U/mL。通过IFN-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(PBL BiomedicalLaboratories)证实了IFN-α的浓度。

[0162] 将相同的但在其中使用的转染子却不增殖的培养基用作对照(对照载体)。与标准线(R&D)比较，通过ELISA来定量IFN-α4。

[0163] 1.5抗肿瘤剂的给药

[0164] 通过腹膜内穿刺注射来注射抗体，并且将含有抗体的溶液注射到腹膜腔内。小鼠IFN-α4或对照载体被注射到肿瘤结节内，所述肿瘤结节可通过28G胰岛素注射器访问。

[0165] 1.6获得来自淋巴结的细胞悬浮液

[0166] 将同一侧的肿瘤引流淋巴结(腹股沟淋巴结)(其中后者被接种)，在胶原酶/DNA酶(罗氏，巴塞尔，瑞士)中于37℃下孵育15分钟，并且在通过无菌的、70μm孔径的尼龙筛(BD Falcon)之前，先将其机械粉碎。细胞悬浮液通过使用多个与不同的荧光染料偶联的单克隆抗体的组合的直接荧光免疫检验法进行染色，并通过流式细胞仪(FACS SCAllibur.BDBiosciences)分析。

[0167] 1.7抗体和流式细胞仪

[0168] 使用抗CD16/32(2.4G2克隆；BD Biosciences-Pharmingen)对从淋巴结分离出6
的细胞(10/样品)进行预处理，通过结合免疫球蛋白FC受体来减少非特异性结合。以下单克隆抗体被用于FACS染色：抗CD8a异硫氰酸荧光素(FITC)(53-6.7；eBioscience)、抗CD3e-别藻蓝蛋白(APC)(145-2C11；BD Biosciences-Pharmingen)、抗CD11c APC(N418；
eBioscience)、抗B220FITC(RA3-6B2；BD Biosciences-Pharmingen)、抗NK1.1藻红蛋白(PE)(12-5941；eBioscience)。使用装载了MC38KSPWFTTL多肽并偶联了(PE)(Beckman Coulter)的四聚体iTAg MHC I类对细胞进行标记，以识别肿瘤特异性CD8淋巴细胞。使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)获得并分析样品。

[0169] II结果

[0170] 如在图1中示出的结果所观察到的，抗4-11B抗体2A的重复给药轻微地延迟了MC38衍生的肿瘤的生长。在一个组中，在植入肿瘤细胞后的第9天和第13天，使用100μg的抗体(文献中的标准剂量)对6只同源小鼠腹膜腔内给药治疗，观察到MC38衍生的肿瘤的肿瘤消退。相反地，对相似组中的小鼠，在第9天和第12天重复给药IFN-α4至肿瘤结节内，与对照组相比，其却没有改变肿瘤进展。然而，当一组小鼠以结合的方式接受这些治疗，抗肿瘤效果显示在2/6的病例中，肿瘤生长被延迟，所述肿瘤减少直至最终消失。

[0171] 为了检验抗肿瘤效果是否是全身的，即，效果是否发生在距离没有使用I型干扰素进行瘤内治疗的肿瘤结节一段距离的地方，两个相距一定距离的皮下的MC38细胞衍生的结节被植入小鼠的两侧(图2)。在这些条件下，在植入肿瘤细胞后的第9天、第12天和第15天，抗体三次均以100μg的剂量腹膜腔内给药，并且对两个同时发生的肿瘤结节的生长进行了分析。在所述的实验条件下，证实了在使用抗4-1BB治疗和使用对照载体的单侧瘤内治疗的肿瘤生长中的延迟效应，导致了1/6的小鼠排斥两种肿瘤结节。然而，单侧使用三次剂量的瘤内干扰素-α和相同的腹膜内剂量的抗4-1BB单克隆抗体治疗的组中，在六只小鼠的四只中产生了对肿瘤的完全的双侧排斥。这些在存活曲线中分析的数据显示了两种用于诱导肿瘤排斥的治疗方法的协同效应。

[0172] 一旦核实了结合的治疗改善了两个疗法被单独给药时的抗肿瘤效果，便进行实验以阐明协同的疗效发生的机制。首先，进行实验来阐明在哪些细胞群上必须有IFN-α的效果。为此，繁殖具有来自供体同源小鼠的骨髓的嵌合小鼠。因此，能够得到具有来自骨髓的造血干细胞的WT小鼠，所述小鼠缺少I型干扰素受体，并且反之亦然，具有来自WT小鼠的-/-造血细胞系的IFNAR 敲除小鼠。

[0173] 根据与之前的实验相似的治疗方案，核实在造血干细胞中缺少I型IFN受体如何抵消了与IFN-α结合的抗体的抗肿瘤作用(图3a)。然而，在相反的情况中，小鼠是-/-IFNAR ，但却已经接受了对I型干扰素敏感的正常骨髓的移植(图3c)，相对于在对照嵌合体中得到的结果，在接受治疗的组中观察到了部分应答(图3b和3d)。

[0174] 这些结果表明由IFN-α施加在造血原细胞上的作用对于通过IFN-α和抗4-1BB抗体的结合治疗策略诱导的肿瘤排斥是至关重要的。

[0175] 对进行了这些治疗的小鼠的引流结节内的细胞群的对比分析表明，变化取决于其上涉及的特异性免疫应答(图4a)。观察到含有大量的白细胞的结节增加的尺寸比荷瘤的对照小鼠中的结节增加的尺寸大4-5倍(图4c)。通过流式细胞仪测定能够证实，在结合治疗后，与通过H2-Kb MHC I类分子示出的KSPWFTTL(SEQ ID NO：7)肿瘤抗原反应的T CD8+淋巴细胞的含量，在百分比上和在绝对数量上存在增加的趋势。这些结果是在使用偶联了与抗CD8抗体结合的PE的四聚体进行免疫染色后获得的(图4a)。

[0176] 负责将抗原呈递至淋巴细胞(例如，肿瘤抗原)的特化细胞(specializedcell)是树突状细胞。树突状细胞可被分类为不同的亚群，其中，骨髓树突状细胞或常规树突状细胞(cDC)和浆细胞样树突状细胞(pCD)较为突出。这些细胞可通过与单克隆抗体共染色来区分和列出。从这些分析中观察到，IFN-α的瘤内注射和结合的IFN-α+抗4-1BB的治疗均显示了涉及治疗应答的数量和百分比上的增加(图4b)。

[0177] 为了证实结合治疗策略的强度，准备了小鼠肿瘤的实验条件，其中，实现了从MC38系移植的肿瘤病变在小鼠的肝脏和皮下组织内同时发生。图5a示出了对皮下病变使用IFN-α和抗4-1BB的腹膜内给药的治疗如何诱导了肝瘤的排斥，而所述排斥在未治疗(对照)组中并未观察到。除了在剖腹探查术中不存在肝病变之外，也对皮下病变的大小进行了追踪，所述皮下病变在图5b所示出的实验中在所有实例中均被完全排斥，而对照组中的肿瘤一直发展直到小鼠因为存在于肝脏内的同时发生的肿瘤病变的作用而死亡。

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