本发明的技术方案是提供式(VIII)所示化合物在制备抗肿瘤药物中 的应用；

其中，Ar为一苯环，R选自C5-20的烷基，C5-20的烯基，C5-20的炔 基，C5-20的烷酰基，C5-20的烯酰基，C5-20的炔酰基；R1独立选自H原 子，C1-12的烷基，C2-12烯基，C2-12炔基，--COOR’-NR’R’，卤原子，--OR’， --COR’，--CONR’R’，＝O，--SR’，SO3R’，--SO2NR’R’，--SOR’，--SO2R’，--NO2， --CN，葡糖苷，甲硅烷基；R’独立选自H原子，烷基，烯基或炔基；n＝2或3； m＝1，2，3或4；及其药学上可接受的盐。
优选当n＝2，m＝1时，R是法尼基、十二烷基或壬基，R1是甲基、卤 原子；更优选格利福林、新格利福林，2-溴--6-十二烷基间苯二酚，4-溴--6- 十二烷基间苯二酚，2-甲基-5-壬基间苯二酚。
优选当n＝2，m＝2时，R是法尼基、戊基、己基、壬基、癸基、十二 烷基、十三烷基或十七烷基，R1是H原子、甲基、-CHO或-COOH；更优 选2-法尼基-4-羧基-5-甲基间苯二酚、4-甲酰基-5-甲基-6-法尼基间苯二酚、 4-己基间苯二酚、4-壬基间苯二酚、4-十二烷基间苯二酚、5-戊基间苯二酚、 s-壬基间苯二酚。
优选当n＝3，m＝1时，R是法尼基，R1是甲基、-CHO；更优选2-羟 基-5-甲基-6-法尼基间苯二酚。
优选当n＝3，m＝2时，R是法尼基，R1是甲基、-CHO；更优选2-羟 基-4-甲酰基-5-甲基-6-法尼基间苯二酚。
申请人以2-法尼基-5-甲基间苯二酚(格利福林)为例对该类化合物对 各种肿瘤细胞作用进行了深入的实验。
通过MTT实验发现，格利福林抑制多种肿瘤细胞系增殖，包括鼻咽癌 细胞系(CNE1)、乳腺癌细胞系(MCF7)、宫颈癌细胞系(HeLa)、结肠癌细 胞系(SW480)、伯基特淋巴瘤细胞系(Raji)、慢性粒细胞白血病细胞系 (K562)、绒猴淋巴瘤细胞系(B95-8)，具有广谱的抗肿瘤效应。(参考图 1、2)，并确定了其在这些肿瘤系中的IC50值。
申请人除了进行上述细胞水平的实验外，还在分子水平对式(VIII) 化合物抗肿瘤的机理进行了研究。
通过基因芯片对格利福林作用的分子靶标进行高通量筛查，发现格利 福林显著下调丝裂原激活信号转导通路(MAPK)中的MAPKKK3、MAPKK1、 MAPKK5等激酶基因的表达，表明格利福林主要通过对参与肿瘤细胞生长增 殖的MAPK信号转导通路中多个激酶分子靶标的干预，发挥其抗肿瘤效应。 MAPK信号转导通路是连接外界信号和细胞内反应的纽带，在多种肿瘤组织 中异常活化，参与肿瘤的发生和演进，因此，对其干预将具有良好的抗肿 瘤治疗前景。
MAPK信号转导通路参与细胞凋亡的调控，在肿瘤细胞中异常活化的 MAPK信号转导通路抵抗细胞凋亡的发生。利用不同浓度的格利福林处理多 种肿瘤细胞系，发现格利福林能诱导多种肿瘤细胞系发生显著的凋亡，以 剂量依赖的方式产生从早期凋亡(核固缩靠边等)到晚期凋亡(凋亡小体 等)的形态学变化。以剂量依赖性方式诱导凋亡率的显著增加，从0.57％ 到81％。同时，对细胞凋亡相关分子检测发现，格利福林能迅速激活 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，诱导细胞色素c从线粒体中释放，并 以剂量依赖性方式抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表达，诱导促凋亡 蛋白Bax的表达。
MAPK信号转导通路也参与细胞周期的调控，异常活化的MAPK导致细 胞周期的失控，包括细胞周期启动、运行、和终止的异常，使肿瘤细胞获 得以增殖过多、凋亡过少为主要形式的失控性生长特征。通过流式细胞仪 检测，格利福林能以剂量依赖性方式将多种肿瘤细胞系细胞周期阻滞于 G0/G1期，显著下调细胞周期G0/G1期相关分子的表达，包括Cyclin D1、 CDK4、Cyclin E、RB、E2F等。
由于本发明提供的具有通式(VIII)的化合物的抗肿瘤机理与现有技 术中已知的、抗肿瘤作用明确的、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药 物的作用机理是一致的，因此该类化合物用于制备抗肿瘤药物，将具有良 好的抗肿瘤效果。
附图说明
图1是格利福林以时间与剂量依赖性降低CNE1细胞的存活率；
图2是格利福林以剂量依赖性降低MCF7、HeLa、SW480、B95-8、K562、 Raji的存活率；
图3是格利福林诱导CNE1发生凋亡的差异基因表达谱分析图；其中 红色的表示上调，蓝色的表示下调，绿色的表示没有差别；
图4是格利福林干预CNE1细胞系的转录因子谱；
图5是格利福林诱导CNE1发生凋亡的形态变化，其中1是活细胞，2 是早期凋亡细胞，3是凋亡小体；
图6是格利福林对Bcl-2和Bax的干预作用；
图7是格利福林对Survivin的干预作用；
图8是格利福林诱导caspase活性的变化；
图9是格利福林诱导细胞色素c的释放，其中A为对照组，B为经格 利福林处理后的情况；A(1)、B(1)是DAPI衬染核图，A(2)、B(2) 是CY3标记细胞色素C图，A(3)、B(3)是共定位图。
具体实施例
本发明中所用的肿瘤细胞系HeLa(ATCC CCL-2)、SW480(ATCC CCL-228)、MCF-7(ATCC HTB-22)、B95-8(ATCC CCL-1612)、K562 (ATCC CCL-243)和Raji(ATCC CCL-86)均来自美国标准培养物收藏 所(American Type Culture Collection，ATCC)，CNE1细胞系由中国科学 院和湛江医学院合建。有商品化的CNE1细胞系。
实施例1
格利福林抑制多种肿瘤细胞系的增殖。
将格利福林溶于DMSO中，用不同浓度的格利福林(0、15、20、25， 33和43μM)处理鼻咽癌细胞系(CNE1)，用MTT检测(参考文献J.Cancer Res.Clin Oncol.126(2000)448-454)，24小时、48小时以及72小时后 对CNE1抑制作用，结果见图1。
用不同浓度的格利福林溶液(0、15、20、25，33和43μM)处理乳腺 癌细胞系(MCF7)、宫颈癌细胞系(HeLa)、结肠癌细胞系(SW480)、伯基 特淋巴瘤细胞系(Raji)、慢性粒细胞白血病细胞系(K562)、绒猴淋巴瘤 细胞系(B95-8)，用MTT检测，其结果见图2。
通过Bliss法，计算格利福林的IC50，结果见表1。
表1：格利福林作用各肿瘤细胞系的IC50   Cell Iines   IC50(μM)   HeLa   MCF7   SW480   Raji   CNE1   B95-8   K562   34   30   27   27   24   24   18
实施例2
格利福林诱导肿瘤细胞系发生凋亡。
用不同浓度的格利福林处理CNE1细胞，利用AO/EB双染，荧光显微镜 下检测，发现不同浓度的格利福林处理CNE1细胞48小时都可诱导不同程 度的凋亡产生，见图5。其中30μM诱导主要可见核固缩并靠边的早期凋 亡细胞，晚期凋亡小体较少见；而以40μM诱导不仅可见核固缩并靠边的 早其凋亡细胞，而且可见大量晚期的凋亡小体的产生，以50μM诱导由于 大部分细胞已经脱壁，因此，主要在脱壁悬浮的细胞中可见大量的晚期凋 亡小体的产生，并出现了核碎裂。
实施例3
流式细胞仪检测格利福林诱导肿瘤细胞系发生的凋亡率。
表2.格利福林诱导不同肿瘤细胞系发生凋亡的凋亡率比较   细胞系   0μM   30μM   40μM   50μM   MCF7   1.89％   28.8％   50.6％   67.8％   HeLa   1.96％   12.6％   32.7％   70.7％   SW480   0.57％   4.73％   46.2％   60.2％   CNE1   3.41％   22.4％   60.2％   81.0％
用不同浓度的格利福林溶液处理肿瘤细胞系，利用流式细胞仪，PI 单染检测凋亡率，发现格利福林以剂量依赖性的方式诱导多种肿瘤系发生 凋亡，其结果见表2。在0μM凋亡率在4％以下，基本无凋亡发生，而随 着格利福林剂量的增加，凋亡率逐渐增加，在50μM的剂量，诱导CNE1 发生凋亡的凋亡率已高达81％，其它几种细胞系也已超过50％，说明格利福 林具有显著的诱导凋亡的能力。
实施例4
利用cDNA Microarray，确定格利福林对MAPK信号转导通路的干预 作用。
未经格利福林处理和以浓度为40μM的格利福林溶液处理的CNE1细 胞，48小时后提取RNA，逆转录成cDNA与Microarray膜杂交，显影后， 灰度扫描，见图3。
表达上调基因：
  分类号   名称   差异倍数   M95712   B-raf   proto-oncogene(RAFB1)   5.9   D89667   C-myc-binding protein MM-1   4.9   M36981   Nucleoside diphosphate   kinase B(NDPKB)   4.2   M62402   Insulin-like growth factor   binding protein6(IGFBP6)   2.6   M35410   Insulin-like growth   factor-binding protein2   (IGFBP2)   2.3   X76104   Death-asscociated protein   kinase(DAPK1)   2.3   U21092   CD40-receptor-asscociated   factor(CRAF1)   2.2   U40343   Cyclin-dependent kinase 4   inhibitor 2D(CDKN2D)   2.2
表达下调基因   分类号   名称   差异倍数   U78876   Mitogen-activated protein   kinase kinase kinase 3   (MAPKKK3)   2.1   X66362   PCTAIRE protein kinase 3   (PCTK3)   2.2   L05624   Mitogen-activated protein   kinase kinase 1(MAPKK1)   2.5   U25265   Mitogen-activated protein   kinase kinase 5(MAPKK5)   2.6
利用Clontech.公司的配套软件AtlasImage 1.0进行分析，两张膜 的信号强度以膜上所有基因的整体值进行校正，微弱的信号通过设定背景 的阈值为200％进行排除，基因表达的差异值以两倍阈值进行评价，共获得 明显表达下调基因四个，明显表达上调的基因8个。
通过分析，格利福林明显下调MAPK信号转导通路的MAPKKK3、 MAPKK1、MAPKK5，MAPKKK3能分别激活MAPKK1和MAPKK5，进而通过ERK1/2 和ERK5传递信号，格利福林对MAPKKK3、MAPKK1和MAPKK5基因的下调， 强烈提示格利福林很有可能通过干预MAPK信号转导通路的ERK1/2和ERK5， 发挥其抗肿瘤细胞增殖，诱导细胞发生凋亡以及阻滞细胞周期的运行等多 种生物学效应。
实施例5
格利福林干预肿瘤细胞系转录因子谱。
将带有不同转录因子的顺式作用元件的SEAP(分泌性碱性磷酸酶)报 告质粒转染CNE1细胞后，用不同浓度的格利福林溶液(0、30、40、50μM) 处理，通过对SEAP活性的分析来反映格利福林对转录因子转录活性的影 响，结果见图4。从实验结果发现格利福林能以剂量依赖性抑制多个转录 因子的转录活性，尤其对转录因子NFκB、HSF(热休克因子)、AP-1转录活 性的影响最为显著，在30μM对转录因子NFκB、HSF(热休克因子)、AP-1 的抑制率在50-60％左右，分别为64％、57％、53％；而在40μM时，这三种 转录因子分别下降到20-30％左右，分别为23％、28％、34％；在50μM时， 已经下降到20％以下，分别为19％、17％、20％，而对于阳性对照的SEAP活 性，不同浓度的格利福林处理后，基本上没有影响。
由于这些下游的多个转录因子都受到MAPK信号转导通路的调节， 因此，格利福林对这些转录因子转录活性的抑制，与格利福林对MAPK信号 转导通路的干预有关。
实施例6
格利福林干预细胞凋亡信号转导通路的分子靶标。
(1)格利福林对Bcl-2家族分子的调控。
Bcl-2家族是哺乳动物细胞中调节凋亡的重要因子，其中Bcl-2具有抑 制凋亡的作用，而Bax通过形成同源二聚体或与Bcl-2形成异源二聚体， 具有促进细胞发生凋亡的作用，Bcl-2和Bax间的平衡是细胞接受死亡信 号后的一个检查点，这一平衡决定了细胞的存活或凋亡。利用不同浓度的 格利福林(0、30、40、50μM)处理CNE1细胞后，发现格利福林对Bcl-2 家族中这两种重要的凋亡调节因子都有影响，结果见图6。格利福林以剂 量依赖性的方式下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时以剂量依赖性方式上 调促凋亡蛋白Bax的表达，这说明Bcl-2和Bax可能是格利福林干预细胞 凋亡信号转导通路上的重要分子靶标。
(2)格利福林对IAPs(凋亡抑制蛋白)家族的干预。
IAPs是细胞凋亡过程中的负性调节子，具有抑制细胞凋亡的功能， Survivin是IAPs家族中的重要成员，具有抵抗细胞凋亡发生的重要功能。 利用不同浓度的格利福林(0、30、40、50μM)处理CNE1细胞，发现格 利福林能以剂量依赖性的方式抑制Survivin的表达，结果见图7。
实施例7
格利福林调节caspase的活性。结果见图8。
利用40μM的格利福林处理CNE1细胞(处理方法)，收集不同时间点 的蛋白，通过Caspase比色分析法分析Caspase活性的变化，结果发现格 利福林能迅速诱导Caspase活性的升高，在0-6h caspase-8的活性迅速 上升并达到峰值，随后下降，在12-48h caspase-8的活性基本趋于平稳 转态；而Caspase-9的活性在0-12h逐渐上升，在12h达到峰值，12h后 开始下降；Caspase-3的活性则在0-6h呈上升趋势，在6-12h维持一个 较高的水平，12h后开始下降，这可能是由于Caspase-3作为Caspase-9 和caspase-8共同的下游效应分子，在0-6h随着Caspase-8活性的上升， 导致Caspase-3活性的升高，而在6-12h虽然Caspase-8的活性开始 下降，但由于Caspase-9的活性呈上升趋势，导致Caspase-3活性依然维 持一个较高的水平，12h后伴随着Caspase-8和Caspase-9的共同下降， Caspase-3活性也持续下降。
实施例8
格利福林诱导细胞色素c的释放。
细胞色素C定位于线粒体内膜，当细胞色素C释放入胞质后，能与Apaf -1和Caspase-9结合，并进一步激活Caspase的级联反应，促使细胞发 生凋亡。利用格利福林以40uM的浓度处理CNE1细胞，实验结果见图9。 通过confocal发现，未处理的CNE1细胞细胞色素C在胞浆中主要呈颗粒 状分布，说明未处理的细胞细胞色素C主要集中在线粒体中，没有从线粒 体中释放；而处理的CNE1细胞，大部分细胞色素C在胞浆中呈弥撒性分布， 说明细胞在格利福林处理后，促进了细胞色素C的释放。这与格利福林下 调Bcl-2表达的结果一致，因为细胞色素C从线粒体释放主要通过线粒体 PTP(通透性转变孔)，而PTP主要受Bcl-2和Bax的调控。同时也发现用 格利福林以40μM的浓度处理后，用DAPI标记细胞核，与对照相比，可 见明显的细胞核浓缩、靠边、碎裂的早期凋亡现象。
实施例9
格利福林阻滞细胞周期的运行。
以不同浓度的格利福林溶液(0、30、40、50μM)处理CNE1细胞， 通过流式细胞仪分析细胞细胞周期的改变，其结果见表3、4。
(1)格利福林以剂量依赖性的方式阻滞CNE1细胞的细胞周期于 G0/G1期。
细胞周期结果分析表明，格利福林以剂量依赖的方式，导致CNE1细 胞G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，高浓度50μM导致G2/M期细胞 减少，阻滞细胞周期于G0/G1期。
表3：格利福林对CNE1细胞周期的影响   G0/G1   S   G2/M   0μM   60.75％   26.74％   12.51％   30μM   83.06％   3.23％   13.71％   40μM   89.72％   2.57％   7.71％   50μM   91.87％   2.94％   7.07％
(2)流式平均荧光强度分析格利福林对细胞周期G0/G1期相关分子靶 标的干预。
表4：格利福林对CNE1细胞周期G0/G1期相关分子靶标的干预   0μM   40μM   下调率   Cyclin D1   6.1％   0.155   97.46％   CDK4   96.76％   75.71％   21.755   Cyclin E   11.4％   7.41％   35％   CDK2   99.07   95.36％   3.74％   Rb   87.18％   8.1％   90.71％   E2F   94.89％   67.02   29.37％
cylin D是连接外界生长因子、信号转导与细胞周期调控机制的纽带， 在G1早期cyclin D表达增加，与CDK4/6形成复合物，促进pRB磷酸化而 失活，释放大量的转录因子，驱动细胞周期的运行。在G1晚期Cyclin E 与CDK2结合，形成Cyclin E-CDK2复合物，进一步使pRB处入高磷酸化 状态，产生或激活许多细胞周期相关蛋白，启动进入S期。进一步以40μM 浓度处理CNE1细胞，通过流式平均荧光强度分析，我们发现JK226能下调 G1早期分子Cyclin D1和CDK4的表达，也能下调G1晚期分子Cyclin E 的表达，但对CDK2的表达没有影响。同时，也下调G1期制动分子pRB， 并抑制转录因子E2F1的表达，因此，最终导致格利福林阻滞CNE1细胞细 胞周期于G0/G1期。