读者可以参考2000.11.23公开的WO 0069441关于ET743治疗癌 症的组合物及用途。该文献引用在此作为参考。
发明概述
根据本发明的一个方面，我们提供了应用ET 743及其它药物的有 效的治疗联合。
优选实施方案
其它药物可形成同一组合物的一部分，或在同时或不同时作为单 独的组合物进行给药。其它药物并不特别限定，合适的药物包括：
a)具有抗有丝分裂活性的药物，特别是那些药靶为细胞骨架成分 的药物，包括微管调节剂如紫杉碱类药物(如紫杉酚、紫杉醇、 taxotere、docetaxel)，鬼臼霉素或长春花属生物碱(长春新碱、 长春碱)；
b)抗代谢药物如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、嘌呤类似物 如喷司他丁、甲氨喋呤；
c)烷化剂如氮芥(如环磷酰胺或异环磷酰胺)；
d)靶向DNA的药物如蒽环类抗生素药物多柔比星、阿霉素、表阿 霉素或表柔比星；
e)靶向拓朴异构酶的药物如依托泊苷；
f)激素及激素兴奋剂或拮抗剂，如雌激素、抗雌激素(他莫昔芬 及相关物质)和雄激素、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、环丙孕酮或 奥曲肽；
g)靶向肿瘤细胞信号转导的药物包括抗体衍生物如herceptin；
h)烷化剂如铂类药物(顺铂、卡铂、奥沙利铂、卡帕)或亚硝基 脲；
i)影响肿瘤转移的药物，如基质金属蛋白酶抑制剂；
j)基因治疗和反义试剂；
k)抗体治疗剂；
l)其它来自海产资源的有生物活性的物质，特别是didemnins如 aplidine；
m)类固醇，特别是地塞米松；
n)抗炎药物，特别是地塞米松；以及
o)止吐药物，特别是地塞米松。
作为本专利说明书的一部分，我们列举了一系列的参考实施例。 这些实施例证实了应用ET-743与其它药物联合可提高疗效，并涉及应 用ET-743的不同的联合。
实施例1涉及ET-743与阿霉素的联合在无胸腺大鼠体内对鼠和人 的肉瘤生长的抑制作用。
实施例2表明ET-743与阿霉素的联合对软组织肉瘤系HT-1080和 HS-18产生协同的细胞毒作用。
这两个实施例表明ET-743与蒽环类抗生素类药物(特别是阿霉 素)的联合有超过加和作用的效果，比其各自单独使用有更好的抗人 肿瘤效果(在特定的肉瘤试验中)，该效果与给药顺序无关。该结果 明确表明其对肿瘤治疗的前景。
实施例3表明ET-743与顺铂协同的细胞毒作用。
实施例4顺序评估了ET-743与化疗药物的联合对一系列人类肿瘤 细胞系的作用，特别是ET-743与阿霉素、紫杉酚、SN-38、顺铂和吉 西他滨的联合。
这两个实施例表明了ET-743与铂类抗肿瘤化合物(特别是顺铂)、 与核苷酸类似物吉西他滨，及与拓朴异构酶II抑制剂(SN-38，得自 前药CPT-11的活性物质，CPT-11是一种喜树碱类药物)的联合有超 过加和作用的效果。这些联合比其各自单独使用有更好的抗人肿瘤效 果(在特定的不同的肿瘤细胞：卵巢、结肠、肺、乳房、骨肉瘤的试 验中)，该效果在某些情况下与给药顺序无关。该结果明确表明其对 肿瘤治疗的前景。
有趣的是，协同作用不是明确可预见的：实施例4表明在大多数 测试的联合中，没有观察到协同作用(实际上，有些病例还显示拮抗 作用)。
实施例5涉及ET-743与阿霉素或曲美沙特或紫杉醇的联合的评 估。
该实施例显示了ET-743与蒽环类抗生素(特别是阿霉素)的联合 有超过加和作用的效果。这些联合比其各自单独使用有更好的抗人肿 瘤效果(在特定的肉瘤的试验中)，该效果与给药顺序无关。该结果 明确表明其对肿瘤治疗的前景。
实施例6至8是对前述实施例的补充，特别说明了ET-743与阿霉 素以及ET-743与顺铂的协同作用。
实施例9证实本发明所述的联合的不同的效果，其中高剂量的地 塞米松可防止ET-743的肝细胞毒性。
总之，本发明提供了组合物、治疗方法、制备组合物的方法及相 关的实施方案。
本发明还扩展到应用于本发明治疗方法中的化合物，以及这些化 合物在制备癌症治疗的组合物中的应用。
因此，本发明提供一种任何患癌症的哺乳动物，特别是人的治疗 方法，包括给予患病个体治疗有效量的本发明的化合物，或相应的药 物组合物。
本发明还涉及包含可药用载体的药物制剂，其中含有本发明的作 为活性成分的一种或多种化合物，以及所述制剂的制备方法。
药物组合物的实例包括任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂 等)或液体(溶液剂、悬浮剂或乳剂)形式，其组成适于口服、局部 或非肠道给药，其可以含有纯化合物或与任何载体或其它有药理活性 的化合物的联合。这些组合物在非肠道给药时需要进行灭菌处理。
本发明的化合物或组合物的给药可以是任何合适的形式，如静脉 滴注、口服、腹膜内给药和静脉内给药。我们优选的滴注时间不超过 24小时，更优选是2-12小时，最优选是2-6小时。在医院内不过夜 的短期滴注治疗是特别希望的。然而，如果需要，滴注可在12-24小 时之间，甚至更长。滴注合适的间隔一般为2-4星期。包含本发明化 合物的药物组合物可以做成脂质体或纳米颗粒的胶囊形式的持久释放 制剂或其它标准释放形式释放。
化合物合适的剂量根据制剂形式、给药方法及特定的施用位置、 患者及所治疗的肿瘤而不同。其它固素如年龄、体重、性别、饮食状 况、给药时间、排泄速率、患者健康状况、药物联合、身体的敏感度 及疾病的严重程度也要考虑到。给药可以在最大耐受剂量内持续或周 期性实施。
本发明的联合可用于顽固性患者。读者可参考WO 0069441中的 ET-743给药剂量方案，及其它本发明的药用联合的应用资料。
实施例
实施例1
ET-743与阿霉素的有效联合对无胸腺大鼠体内的鼠和人肉瘤的肿 瘤生长抑制作用。
ET-743已被证实具有对用先前的包括阿霉素(Dx)和异环磷酰胺 的化疗难以治愈的软组织和骨肉瘤患者的临床治疗活性。考虑到将 ET-743与Dx联合有潜在的临床价值，我们研究了该联合对鼠纤维内 瘤UV2237、它的mdr耐受亚系UV2237/ADR和人类横纹肌肉瘤移植 TE671的作用。ET743和Dx单独使用对鼠UV2237纤维肉瘤有效，然而 对UV2237/ADR和TE671无效或基本无效。但是，ET-743与Dx的联合 却对以上三种疾病模型均有效。这种协同作用在人类横纹肌肉瘤 TE 671中特别显著，且似乎与给药顺序或联合无关。
在肿瘤TE671约100mg时单次静脉给药后，肿瘤重量抑制作用值 (TWI)和Log 10细胞杀灭水平(LCK)值分别是；单独使用ET-743 (0.1mg/kg)，为46％和0.132；单独使用Dx(10mg/kg)，为50％和 0.33；同时给药ET-743(0.1mg/kg)和Dx(10mg/kg)，为77％和0.924； 先给ET-743(0.1mg/kg)，1小时后给药Dx(10mg/kg)，为82％和 1.12；先给Dx(10mg/kg)，1小时后给药ET-743(0.1mg/kg)，为 75％和0.85。
数据显示ET-743和Dx的联合对单独使用这些药物无效或基本无 效的肿瘤同样有效，这为使用这种联合进行临床研究提供了有力的理 论支持。
实施例2
ET-743和阿霉素对软组织肉瘤系HT-1080和HS-18产生协同的细 胞毒作用。
两种肉瘤细胞系HT-1080和HS-18用于评估ET-743与阿霉素、曲 美沙特或紫杉醇的联合的毒性。HT-1080是对ET-743敏感的纤维肉瘤 细胞系(IC50＝10pm)，HS-18是对ET-743较不敏感的脂肪肉瘤细胞 系(IC50＝270pm)。ET-743与这些药物按恒定摩尔比联合使用，用Chou and Talalay法分析，结论是ET-743-阿霉素的联合有协同作用，而 ET-743同曲美沙特或紫杉醇的联合却没有协同作用(温育72小时)。 在细胞暴露在ET-743下72小时，并在后48小时内加入阿霉素、曲美 沙特或紫杉醇温育，同样得到ET-743与阿霉素对两种肉瘤细胞系的协 同作用。有趣的是，先用紫杉醇而后用ET-743的效果比相反的顺序给 药效果要好。这些结果促进了阿霉素与ET-743联合治疗软组织肉瘤患 者的临床实验，因为这两种药物都显示对此种疾病的治疗活性。
实施例3
ET-743与顺铂协同的细胞毒作用。
ET-743在许多临床前的实验中显示具有惊人的抗肿瘤活性，并很 有希望具有临床活性。ET-743在小沟内与N2鸟嘌呤结合并影响转录 的调节(Minuzzo等的PNAS，Vol.97，6780-84，2000)。
早期的研究显示错配修复(MMR)缺陷细胞与正常细胞一样都对 ET-743敏感。NER缺陷细胞对ET-743的敏感度是对顺铂的敏感度的 6-8倍。在ET-743和顺铂的不同的修复机理的基础上及由于此种联合 的潜在的令人感兴趣的临床应用，我们做了评估ET-743和顺铂在几种 人肿瘤细胞系中的细胞毒作用的研究。人类卵巢癌Igrove-1细胞群、 耐受ET-743的亚系(IG/PSC/ET)、人结肠癌HCT 116(MMR缺陷细 胞)和HCT 11-ch3(MMR正常细胞)细胞系被用于本研究中。
这些细胞用不同浓度的ET-743或cisDDP单独或联合处理1或24 小时，用比色分析法在经sulforodhamine B染色后评估其细胞毒性。 在所有细胞系中在1小时或24小时观察协同作用。有趣的是，在对 cisDDP耐受的HCT 116中，ET-743明显有相反的敏感性，即使在单 独应用基本无效的ET-743浓度下。这些数据综合起来显示临床研究 ET-743与cisDDP联合的合理性。
实施例4
ET-743与阿霉素、紫杉酚、SN-38、顺铂和吉西他滨的联合。
评估ET-743与阿霉素、紫杉醇、SN-38、顺铂和吉西他滨的联合 对一系列人肿瘤细胞系的作用。这些研究是为了确定ET-743与标准的 化疗药物间的相互作用的性质以及使用顺序对抗肿瘤活性的影响。多 种ET-743与标准细胞毒试剂的联合用于一种无模型设计(Laska.et al.Biometrics 50：834，1994)，以描述药物间的相互作用的性质。 这些研究表明，与给药方式无关，药物间的相互作用呈现出最典型的 加和形式。
当ET-743的联合作用于非小细胞肺癌(先用SN-38)、骨肉瘤(先 用ET-743，后用顺铂)、乳癌(先用ET-743，后用吉西他滨)、结肠 癌(先用ET-743，后用SN-38及与SN38同时使用)细胞系时显示出 药物间的协同作用。观察到加和/协同作用的药物间相互作用形式(先 用ET-743，后用SN-38治疗NSCL；先用SN-38治疗结肠癌和NSCL； 用SN-38同时用顺铂治疗骨肉瘤，用SN-38治疗NSCL)。当紫杉酚 同时用于两种NSCL细胞系，阿霉素用于横纹肌肉瘤细胞系时，发现拮 抗作用。
这些研究表明在二期临床实验中，ET-743可以与数个细胞毒试剂 联合应用于较宽范围类型的肿瘤治疗中。
材料和方法
细胞培养：
人类乳房肿瘤细胞系(MDA-435，MDA-231，T-470)、非小细胞 肺肿瘤细胞系(NCI-H522，NC1-H226，NCI-H23)、结肠肿瘤细胞系 (HCT-116，HT-29，Colo-320)、骨肉瘤肿瘤细胞系(HOS，U-2， SaOS-2)、横纹肌肉瘤肿瘤细胞系(RH1，RH30，RD)在RPMI-1640 中加入10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺进行培养。所有原培养物放入 75cm2烧瓶中在37℃环境为5％CO2-95％空气的湿润培养箱中培养。
IC50分析：
将预定数目的指数生长的肿瘤细胞接种在96孔组织培养皿中，稳 定24小时。然后，含有连续稀释浓度的ET-743或标准化疗药剂的药 物皿加入到细胞中。细胞做24小时培养，持续3天，而后加入MTT持 续4小时。所得的甲臜结晶用酸/醇溶解，用微板读取器测定吸光率 (570nm检测波长/630nm对照波长)。结果用和培养基对照比较的肿 瘤细胞杀灭百分数表示。
联合研究：
为研究药物的联合，用于描述药物相互作用类型的浓度(用单个 试剂的IC50的百分数表示)方案如下所述：
  药物浓度(用IC50的百分数表示)   ET-743   标准试剂   100   0   75   25   60   40   50   50   40   60   25   75   0   100   0   0
药物联合研究的统计学分析：
对每个受试联合(75∶25-ET-743/标准试剂)和端点(100∶0- ET-743和0∶100-标准试剂)进行统计学比较。统计学意义上的显著 性差异要求在药物联合(ET-743与标准试剂)的吸光率与两个端点(单 用ET-743和标准试剂)的吸光率上存在不同。如果多数值(5个中≥ 3)较之具有统计学意义上的高或低，则可认为其具有拮抗作用或协同 作用。否则就更接近加和的相互作用关系。很难解释相对于端点间的 连线有相当大的斜率。如果各个试剂的IC50曲线倾斜一致(不太可能)， 常常就可以确定药物的相互作用类型。
  ET-743与化疗药物的顺序联合   肿瘤类型/细胞   系   给药条件/试剂   所观察到的药   物间作用类型   骨肉瘤   NOS   24小时ET-743而后24小时顺铂   24小时顺铂而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/顺铂   协同   加和   加和   U2-OS   24小时ET-743而后24小时顺铂   24小时顺铂而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/顺铂   加和   加和   加和   Sa06   24小时ET-743而后24小时顺铂   24小时顺铂而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/顺铂   加和   加和   加和/协同
  非小细胞肺癌   NCB-H226   24小时ET-743而后24小时紫杉酚   24小时紫杉酚而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/紫杉酚   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时SN38而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/SN38   加和   加和   拮抗   加和/协同   加和/协同   加和   NCB-N522   24小时ET-743而后24小时紫杉酚   24小时紫杉酚而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/紫杉酚   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时SN38而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/SN38   加和   加和   拮抗   加和/协同   加和/协同   加和   NCB-N23   24小时ET-743而后24小时紫杉酚   24小时紫杉酚而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/紫杉酚   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时SN38而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/SN38   加和/拮抗   加和   拮抗   加和   协同   加和/协同   乳癌   MDA-435   24小时ET-743而后24小时吉西他滨   24小时吉西他滨而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/吉西他滨   加和   加和   加和   MDA-231   24小时ET-743而后24小时吉西他滨   24小时吉西他滨而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/吉西他滨   加和   加和   加和   T47-8   24小时ET-743而后24小时吉西他滨   24小时吉西他滨而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/吉西他滨   加和   加和   加和   结肠癌   MCT-116   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时同时应用ET-743/SN38   协同   加和   加和
  NT-29   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时同时应用ET-743/SN38   加和   加和   加和   Colo-320   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时ET-743而后24小时SN38   24小时同时应用ET-743/SN38   加和   加和/协同   协同   横纹肌肉瘤   RN1   24小时ET-743而后24小时阿霉素   24小时阿霉素而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/阿霉素   加和   加和   拮抗   RD   24小时ET-743而后24小时阿霉素   24小时阿霉素而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/阿霉素   加和   加和   加和/拮抗   RN30   24小时ET-743而后24小时阿霉素   24小时阿霉素而后24小时ET-743   24小时同时应用ET-743/阿霉素   加和   加和   拮抗
结论概述
这些研究表明，不管应用ET-743和标准化疗药物的顺序如何，所 观察到的最典型的药物间的相互作用是加和型。
当NC1-H552和NC1-H23NSCL细胞系先用SN-38，骨肉瘤HOS先 用ET-743加顺铂，T-470乳癌细胞系用吉西他滨，结肠癌HCT-116用 SN-38，及对Colo-320结肠肿瘤细胞系共用SN-38时观察到协同作 用。
当NC1-H226和NC1-H23NSCL细胞系共用紫杉酚以及横纹肌肉瘤 RHI肿瘤细胞系应用阿霉素时观察到拮抗作用。
实施例5
ET-743和其它抗肿瘤药剂的相互作用
虽然ET-743目前用于人类癌症的临床实验中，ET-743的抗肿瘤 活性机理并没有完全阐明。本实验的目的是用Chou和Talalay的联合 指数(CI)法评估ET-743和其它抗肿瘤试剂(阿霉素；DXR；曲美沙 特；TMTX和紫杉醇；紫杉酚)的相互作用的性质。为了更好地了解 ET-743如何用于临床，本实验应用SRB测定法检测ET-743和三种其 它抗肿瘤试剂联合在对两种软组织肉瘤细胞系HT-1080和HS-18的不 同给药方案下的细胞毒性。DXR是唯一的与ET-743联合后产生与给药 顺序无关的协同作用的试剂。共同应用ET-743和DXR则在两种细胞系 中都产生协同作用。
在该给药方案下的C I值(平均值)为：在HT-1080细胞中相应在 50、75、90和95％的细胞杀灭水平分别为0.86、0.83、0.84和0.85， 在HS-18细胞中相应在50、75、90和95％的细胞杀灭水平分别为0.89、 0.74、0.64和0.60。在DXR之前应用ET-74324小时的给药顺序对 两种细胞系都是最有效的方案；它在两种细胞系中直到约90％细胞杀灭 水平都得到一致较低的CI值。在ET-743前应用紫杉酚也是有效的方 案。这些结果表明ET-743和DXR的联合应在治疗软组织肉瘤上有进一 步临床研究的价值。
材料和方法
化学试剂
ET-743是由Pharma-Mar S.A(Tres Cantos，西班牙马德里)提 供，并制成2mM二甲基亚砜储备溶液。紫杉醇和DXR是从Sigma化学 公司(St.Louis，MO)获得的。TMTX是由Warner-Lambert (Parke-Davis，Ann Arbor，Mich)提供的。
细胞培养
软组织肉瘤细胞系HT-1080和HS-18是在含有10％胎牛血清的 RP＜I-1640中单层培养的。
SRB细胞毒检测
药物的细胞毒性是通过SRB细胞毒检测在96孔微量滴定板中进行 的。将细胞接种到两排孔中(每孔5000个细胞)，放入不同浓度的药 物。细胞用50％TCA溶液固定1小时，每孔加入0.4％SRB(Sigma)。 培养30分钟后，用1％醋酸洗涤板，在570nm下在Biowhitaker微量 滴定读取器2001上读数。用不含药物的细胞的孔和只含药物不含有细 胞的孔分别作阳性及阴性对照。
同时应用ET-743和DXR、TMTX或紫杉醇
细胞如前所述接种到96孔板中。细胞用七种不同浓度的单用的药 物或联合的摩尔比1∶100(ET-743：其它药物)的药物处理。72小时 后，用SRB检测法测定细胞生长的抑制情况。
按顺序给药ET-743和DXR、TMTX或紫杉醇
用以上相同的装置，我们将细胞用三种不同的分别代表ET-743、 DXR、TMTX和紫杉醇的IC25、IC50、IC75的浓度的药物处理。用ET-743 或药物联合预处理24小时后，各孔分别加入第二种药物处理48小时。 用SRB检测法测定细胞生长的抑制情况。
细胞周期分析
指数生长的细胞用或不用药物处理数小时。收集细胞并用冰冷的 70％甲醇固定。用先前描述过的propidium iodide作DNA染色。一万 个染色的细胞在Becton Dickinson荧光活化细胞分选装置(FACS) 上作分析。
判断协同作用和拮抗作用，及Isobolograms的计算
用Chou-Talalay公式计算C I值，同时考虑药物的效力(Dm或 IC50)和剂量-效果曲线的形状(m值)。一般的经典isobologram(CI ＝1)的公式如下：
CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2(A)
其中分母上的(Dx)1和(Dx)2为(D)1(ET-743)和(D)2(另一种药物) 单用给出X％抑制的剂量(或浓度)，而分子上的(D)1和(D)2是联合 ET-743和另一种药物也达到X％抑制(即等效)时的剂量。CI＜1，CI ＝1，CI＞1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。
(Dx)1或(Dx)2可以很容易地用Chou和Chou et al中值效应公式 计算出来：
Dx＝Dm[fa/(1-fa)]1/m(B)
其中Dm是中效剂量，得自中效坐标图上的X轴的截距的反log值， 该坐标图X轴是log(D)，Y轴是log[fa/(1-fa)]，或
Dm＝10-(Y轴截距)/m，m是中效坐标图的斜率。Chou和Chou的计算机 软件可自动计算出m，Dm，Dx和CI值。从(Dm)1，(Dx)2和D1+D2，可 以很容易地在公式A的基础上自动计算isobolograms。
对于两种试剂保守的相互间非排他的isobolograms，在公式A中 加入第三项
(D1)(D2)/(Dx)1(Dx)2(C)
为简单起见，第三项通常省略，因此呈现出相互排他的假定或经 典的isobologram。在2、3的结果中，CI值是从经典(相互排他的) 计算方法算出的。
结果1
  四种药物对HT-1080和S18的细胞毒性   对人软组织肉瘤细胞的IC50   HT-1080   HS-18   ET-743   (nM)   0.01   0.27   DXR   (nM)   25   225   TMTX   (nM)   6   70000   紫杉醇   (nM)   1.3   10
该表显示HT-1080和S18细胞系对ET-743的敏感度均高于其它抗 肿瘤试剂。
  每种试剂在约IC50剂量上处理24和72小时后   对HS-18细胞的细胞周期分布的影响   药物   剂量   HR   ％G1   ％S期   ％G2-M   对照   76.3   11.2   12.5   ET-743   270pM   24   72   32.4   86.7   47.6   8.4   20.0   4.9   DXR   225nM   24   72   10.1   1.3   64.9   63.8   25.0   34.9   TMTX   70uM   24   72   44.2   35.5   53.8   57.6   1.9   7.0   紫杉醇   10nM   24   72   32.8   23.5   52.5   58.7   15.5   26.2
  每种试剂在约IC50剂量上处理24和72小时后   对HT-1080细胞的细胞周期分布的影响   药物   剂量   HR   ％G1   ％S期   ％G2-M   对照   47.5   35.8   16.7   ET-743   10pM   24   72   42.6   83.1   36.1   10.2   21.3   6.7   DXR   25nM   24   72   36.1   46.2   17.5   5.3   46.4   48.5   TMTX   6nM   24   72   31.9   32.0   56.8   53.7   11.3   14.4   紫杉醇   1.3nM   24   72   45.4   86.0   37.3   9.0   17.3   5.0
结果2表明了分别对HT-1080和HS-18细胞同时应用ET-743和一 种抗肿瘤药物如DXR、TMTX或紫杉醇的1-100摩尔比的联合的CI值。 当使用ET-743和DXR处理细胞时，CI值均小于1，显示了在两种细胞 系中的协同作用。在HT-1080细胞中相应的CI值(平均)在50、75、 90和95％的细胞杀灭水平分别为0.86、0.83、0.84和0.85，在HS- 18细胞中在50、75、90和95％的细胞杀灭水平分别为0.89、0.74、 0.64和0.60。这个结果说明同时应用ET-743和DXR产生协同的细胞 毒效果。相反，当使用ET-743和TMTX或紫杉醇处理细胞时，观察到 的是拮抗的细胞毒作用。
对两种细胞系先用ET-74324小时而后使用DXR 48小时得到CI 曲线图。在两种细胞系中，先用ET-743而后用DXR处理产生协同的细 胞毒作用，HT-1080在80％细胞杀灭水平的CI值为0.64±0.12，HS- 18在88％细胞杀灭水平的C I值为0.24±0.06。相反，先用DXR而后 用ET-743处理(结果3a，较低的数值)初看起来有好的CI值，然而， HT-1080在80％细胞杀灭水平的CI值为1.00±0.03，表明两种试剂只 产生加和作用，而且，在两种细胞中，峰值杀灭分数的CI值不如中值 杀灭分数的值。
当先用ET-743而后用TMTX处理细胞时，HT-1080细胞的CI值接 近1或大于1，表明此两种试剂产生拮抗或加和作用。相反，HS-18的 CI值均小于0.6，说明此两种试剂产生协同作用。当先用TMTX而后使 用ET-743处理时，在HT-1080和HS-18两种细胞中都显示加和作用。
先用紫杉醇而后使用ET-743处理产生协同的细胞毒作用。当先用 紫杉醇而后用ET-743处理细胞时，HT-1080在89％细胞杀灭水平的CI 值为0.92±0.06，HS-18在78％细胞杀灭水平的C I值为0.38±0.13。
总结
ET-743具有很高的抗人类软组织肉瘤细胞的活性，特别是对恶性 纤维肉瘤细胞系HT-1080。
DXR在与ET-743联合时产生与给药顺序无关的协同作用，然而， 先用ET-743而后应用DXR对两种细胞系更为有效。
先用紫杉醇而后应用ET-743也对人类软组织肉瘤细胞有效，但共 同使用却有拮抗作用。
实施例6
在体内化疗药物与ET-743联合治疗实体瘤。
已经描述了几种ET-743的独特的活性机理，包括附着于DNA的小 沟，鸟嘌呤N 2的烷基化，MDR1基因的转录抑制作用(Jin et.al.， PNAS97，6775，2000；Minuzzo et.al.，PNAS97，6780，2000)和 拮抗核受体SXR的活化(Synold et al.，Nature Med 7，584，2001)。 作为单一试剂，ET-743在体内对几种人类肿瘤细胞株包括黑色素瘤 (MEXF 989)、NSCL(LXFL 529)、卵巢瘤(HOC 22)和乳癌(MX- 1)达到完全抑制肿瘤生长的作用(Hendriks et.al.，Ann Oneol 10， 1233，1999)。ET-743与药物联合以交替机理产生治疗效果，可以减 少任一种药物的毒性，或增强药物对耐药或复发癌症的治疗效果。
几种试剂包括阿霉素(DOX；8mg/Kg)、顺铂(DDP；12mg/Kg) 和长春碱(VINB；6mg/Kg)在ET-743(0.2mg/Kg)预处理1小时 前或后给药对一种或多种以下肿瘤进行评估：软骨肉瘤(CSHA)、骨 肉瘤(OSA-FH)、纤维肉瘤(SW684)、卵巢瘤(MRI-H-1834)、NSCL (LX-1)和肾瘤(MRI-H-121)，活性定义为＜50％T/C。在中空纤维(HF) 模型中，在使用ET-7431小时前使用DOX，比单用ET-743对软骨肉 瘤(6％对10％)、纤维肉瘤(33％对48％)、骨肉瘤(20％对34％)有更 好的效果。对骨肉瘤异种移植物有17％对43％的相似的结果。对DDP的 中空纤维模型的研究表明先用ET-743而后应用DDP比单用ET-743对 卵巢瘤(28％对100％)、软骨肉瘤(15％对19％)有更好的治疗效果， 而对骨肉瘤有等效的活性(36％T/C)。异种移植物的数据表明先用 ET-743而后应用DDP比单用ET-743更为有效(35％对66％)。一个例 外是NSCL，单用ET-743没有活性(62％T/C)，而先用DDP而后应用 ET-743产生完全的抑制作用(＜1％T/C)。在肾异种移植物中单用ET- 743很有效果(22％T/C)，但先用ET-743而后应用VINB也能产生完 全的抑制作用(＜1％T/C)。对其它标准试剂在乳癌、肾癌、黑色素瘤 和胃部肿瘤异种移植物的研究正在进行当中。
实施例7
在人类横纹肌肉瘤中ET-743和阿霉素(DOX)的联合的临床前活 性和生物学分布。
ET-743是一类具有抗肿瘤活性的新的抗肿瘤试剂中最早被发现 者。ET-743对使用DOX和异环磷酰胺难治的肉瘤患者显示出活性。考 虑到其是一种具有潜力的有效药物，我们做了如下研究：(1) ET743/DOX联合对于人类横纹肌肉瘤TE 671的临床前抗肿瘤活性；和 (2)药物间的可能的相互作用和药物在裸鼠以及肿瘤异种移植物中的 生物学分布。
体外实验：每种药物或药物联合施用1小时后的药效通过 clonogenic分析进行评估。单独使用ET-743或DOX显示对TE671细 胞的抗肿瘤活性。根据isobologram分析法和联合指数(Combination Index)获得的药物联合至少对几种包括TE671在内的肿瘤细胞系有加 和的作用。
体内实验：对异种移植瘤重量大约为100mg的裸鼠静脉单次给药 (ET-743，0.1mg/Kg；DOX，10mg/Kg)处理。肿瘤重量的抑制/Log10 细胞杀灭值对于单用ET-743为46％/0.132，对于单用DOX是50％/ 0.33，对于同时使用ET-743和DOX是77％/O.924，对于先用ET-743 一小时后使用DOX的联合是82％/1.12，以及对于先用DOX一小时后 使用ET-743的联合是75％/0.85。协同作用还在鼠纤维肉瘤UV2237 和其耐受多种药物的UV2237/ADR亚系上观察到。
这些数据表明ET-743/DOX具有协同作用，并在迄今所研究的情 形中似乎与给药顺序或联合无关。DOX单独应用或与ET-743联合应用 时，DOX在血浆及肿瘤中的浓度均没有显著的差异。单独应用ET-743 或与DOX联合应用的药代动力学(PK)研究正在进行当中。在横纹肌 肉瘤TE671中，ET-743和DOX的联合在体外表现出加和作用，而在体 内表现出协同作用。DOX的药代动力学形式不受共同应用的ET-743的 影响。这些数据为在早期临床实验中使用这种联合提供了依据。
实施例8
ET-743和顺铂(DDP)在体内和体外对抗人类肉瘤和卵巢癌细胞 系显示出协同作用
我们在这里表明了ET-743在体内和体外均增强了DDP的活性。在 一些包括人类肠癌(HCT116)、卵巢癌(Igrov-1，A2780)及其耐药 亚系(Igrov-1/PSC-ET和1A9)、横纹肌肉瘤(TE671)的癌细胞群 中，单独应用较低浓度的ET-743可以提高DDP的活性至少两倍。相当 于ET-743 IC30/IC50的浓度产生加和或协同作用。这些结果导致了应 用异种移植模型对ET-743的有效药物联合进行体内研究。
在部分对ET-743或DDP敏感的皮下，移植的TE671中，两种药物 的联合所产生的抗肿瘤效果远大于在它们各自的MTD水平单独应用任 一种药物的效果。卵巢肿瘤1A9通常对ET-743和DDP单独使用时有耐 受作用，而联合应用产生高于50％的肿瘤生长抑制作用。原位移植的人 类卵巢瘤HOC8，会在带腹水的腹膜腔内产生小瘤，对ET-743有耐受 性，对DDP部分敏感，联合应用时，即使是在ET-743的剂量是 0.05mg/Kg(1/4MTD)时也使存活率急剧增加，并不引起明显的细胞毒 性反应。剂量为0.15mg/Kg的ET-743明显提高存活率，但同时也增加 了由失重表明的毒性，增加幅度明显比用每种药物治疗后观察到的 高。
这些发现可以对使用ET-743和DDP联合治疗肉瘤和卵巢癌设计临 床实验提供有力的理论依据。正在进行体内和体外研究以阐明ET-743 和DDP在对这些类型的癌症的协同作用的机理。
实施例9
高剂量地塞米松(dex)在大鼠中对ET-743的肝细胞毒性的保护
ET-743，一种得自海产被囊动物的药剂，目前已进入二期临床实 验。它具有治疗肉瘤的临床活性，初步的数据表明其有治疗乳癌和卵 巢癌的活性。然而，表现为可逆的转氨基作用的肝细胞毒性在多数治 疗患者中发生，而表现为胆汁郁积的肝细胞毒性在少数患者中发生。 在多数敏感动物如大鼠中，ET-743的毒性表现为肝细胞坏死和胆管炎 症。由于地塞米松有抗炎活性，我们研究了其在ET-743诱导的大鼠肝 损伤的疗效。雌性Wistar大鼠接受单次静脉给药的ET-743(40μ g/kg)。一些大鼠预先在给药ET-74324小时前分别以1、5、10或 20mg/kg的剂量口服了地塞米松。肝病变和血浆碱性磷酸酶(ALP)、 天冬氨酸氨基转移酶(GOT)和总胆红素(TB)的浓度在ET-743给药 三天后评估。利用常规的肝组织切片通过光学显微法检查。
在用ET-743处理两天后，单独应用ET-743的大鼠的肝脏显示出 胆管炎症，胆管上皮细胞有明显的质变，肝区出现坏死。血浆的ALP 和GOT水平两天后有显著上升。ET-743给药第二天后胆汁郁积造成明 显的血浆TB浓度的上升。而在预先用10或20mg/kg地塞米松处理的 大鼠未发生ET-743诱导的组织病变和血浆ALP、GOT和TB水平的升 高。
1mg/kg的地塞米松只有很少的保护作用，5mg/kg的地塞米松有 中等的保护作用。在ET-743之前每天接受地塞米松(50mg/kg)共三 天的大鼠的血浆ET-743水平相比单独使用ET-743的大鼠并没有减 少。而且，ET-743对植入小鼠的黑色素瘤B16的治疗活性并不因地塞 米松的使用而受到妨碍。这些发现表明高剂量的地塞米松加入ET-743 治疗方案可以改善其在癌症患者体内的肝细胞毒性。