自闭症小鼠模型、其构建方法及用途
阅读：484发布：2020-05-14
专利汇可以提供自闭症小鼠模型、其构建方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 公开了一种 自闭症 小鼠模型、其构建方法及用途。所述构建方法包括用雷帕霉素药物对孕鼠进行孕期干预，从而获得自闭症子代小鼠模型。本 发明 为ASD的相关研究建立了新的可靠的动物模型，并为今后自闭症的防治探寻了一条新方向。，下面是自闭症小鼠模型、其构建方法及用途专利的具体信息内容。
1.一种自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括用雷帕霉素药物对孕鼠进行孕期干预，从而获得所述自闭症子代小鼠模型。
2.如权利要求1所述的自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于：对性成熟期的雌性健康小鼠，于孕11、12或13天开始，以3～7mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。
3.如权利要求2所述的自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于：对性成熟期的雌性健康小鼠，于孕12天开始，以5mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。
4.如权利要求1～3的任一项所述的自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述小鼠为C57BL/6小鼠。
5.如权利要求2所述的自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于：用DMSO溶解雷帕霉素。
6.一种自闭症小鼠模型，其特征在于：根据权利要求1～5任一项所述的方法构建。
7.如权利要求6所述的自闭症小鼠模型用于筛选治疗自闭症治疗药物的用途。
8.如权利要求6所述的自闭症小鼠模型用于研究自闭症发病机理的用途。
自闭症小鼠模型、其构建方法及用途
技术领域
[0001] 本公开涉及小鼠模型、其构建方法及用途，具体涉及自闭症小鼠模型、其构建方法及用途。
背景技术
[0002] 自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)是常见的一种神经系统发育失调导致的神经发育障碍(Neurodevelopmental Disorders)。根据Baird,G.等人[1]在2006年的一项调查显示，ASD的全球青少年中的发病率约为1％；根据美国心理学组织(American Psychiatric Association，APA)于2013年进行的修正，ASD患者往往表现为受损的社交、语言障碍(从语言滞后到言语缺失)，重复和/ 或强迫性行为和言语模仿症，多动症，记忆缺陷、学习、运动技能或其他神经功能异常兴奋，和超或低敏感的感官刺激，焦虑，适应新的环境和习惯困难。因此，ASD患者给家庭以及整个社会都带来了巨大的负担。
[0003] 尽管ASD具有如此高的患病率以及巨大的危害，其病因仍然不清楚。有相关报道证实雷帕霉素及其类似物有治疗自闭症的作用。
[0004] 在ASD研究过程中，遇到的一个关键问题是缺乏简单易重复的动物模型。许多研究机构都致力于自闭症及自闭症样行为表现的基础实验，因此急需要一种稳定而又具有确切机理的实验动物模型。现在 ASD研究主要依赖于基于遗传因素的单一基因的突变或敲除模型。然而这类模型往往根据不同基因的突变或敲除，表型往往有差异。另外，这类模型繁殖所需要的周期较长，需要的小鼠繁殖基数比较大。这为 ASD研究尤其是ASD药物研发带来了障碍。因此，研发基于某种机制的ASD的动物模型迫在眉睫。
[0005] mTOR(mechanistic target of rapamycin)参与调控从蛋白质、脂类合成到细胞自噬(autophagy)的多个细胞进程[2,3]。mTOR亦参与多种神经系统疾病的发生发展进程[3]。雷帕霉素(雷帕霉素)是mTOR 受体选择性抑制剂[4-8]。
发明内容
发明内容
[0006] 鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种简单易重复的 ASD模型。
[0008] 本发明用雷帕霉素药物对孕鼠进行孕期干预，从而获得了自闭症子代小鼠模型。
[0009] 根据本发明的一个方面，提供了一种自闭症小鼠模型的构建方法，所述构建方法包括用雷帕霉素对孕鼠进行孕期干预，从而获得自闭症子代小鼠模型。
[0010] 根据一个实施方式，对性成熟期的雌性健康小鼠，于孕11、12或 13天开始，以3～7mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。优选地，于孕12天开始注射。优选地，以
5mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。
5mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。
[0011] 根据一个实施方式，所述小鼠优选为C57BL/6。
[0012] 根据一个实施方式，所述自闭症小鼠模型的构建方法包括对性成熟期的C57BL/6小鼠，于孕12天开始，以5mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。
[0013] 根据一个实施方式，用二甲基亚砜(DMSO)溶解所述雷帕霉素。
[0014] 根据本发明的另一个方面，提供了一种自闭症小鼠模型，根据上述的方法构建。根据一个实施方式，所述模型用于研究自闭症发病机理。
[0015] 根据本发明的另一个方面，提供了所述的自闭症小鼠模型用于筛选治疗自闭症治疗药物的用途。
[0016] 根据本发明的另一个方面，提供了所述的自闭症小鼠模型用于研究自闭症发病机理的用途。
[0017] 本发明通过监测整个孕期孕鼠的一般状态，及子代小鼠在出生后的相关功能，而证实了孕期接触雷帕霉素药物可以引起子代在出生后不久出现一系列运动、社交以及认知功能障碍，即出现了自闭症样表现，从而为ASD的相关研究建立了新的可靠的动物模型，并为今后自闭症的防治探寻了一条新方向。附图说明
[0019] 图1显示了实验组和对照组子代小鼠的体型或脑体积大小；
[0020] 图2至图12显示了小鼠自闭症样社交行为方面的行为学测试结果；其中图2至图5显示了三室社交实验结果，其中“小鼠”表示放有同种同性小鼠的鼠笼的一侧，“空鼠笼”表示放有空鼠笼的一侧，“熟悉小鼠”表示放有熟悉小鼠的一侧，“陌生小鼠”表示放有陌生小鼠的一侧；图6和图7显示了旷场实验的结果，旷场实验中，“中心区域”表示在旷场中心区域活动，“周围区域”表示在旷场的周围区域活动；图8显示了社交互动实验的结果；图9显示了少年玩耍实验的结果；图10显示了筑巢实验的结果；图11显示了Y迷宫自发性选择的实验结果；图12显示了自我捋毛实验结果。
[0021] 图13至图20显示了小鼠认知行为方面的行为学测试结果；其中， *P<0.05，**P＜0.01，***P<0.001；图13和图14为新物体识别实验内容，其中图13表示新物体识别中的探索新物体偏向比较；图14表示新事物识别记忆比较；图15至图20为水迷宫实验内容，其中图15 为水迷宫小鼠定位航行逃避潜伏期比较；图16为水迷宫小鼠定位航行训练搜索距离比较；
图17为水迷宫空间探索实验穿越平台次数比较；图18为水迷宫定位航行训练游泳速度比较；图19为水迷宫空间探索实验目标象限停留时间比较；图20为水迷宫空间探索实验小鼠游泳轨迹典型图示。
图17为水迷宫空间探索实验穿越平台次数比较；图18为水迷宫定位航行训练游泳速度比较；图19为水迷宫空间探索实验目标象限停留时间比较；图20为水迷宫空间探索实验小鼠游泳轨迹典型图示。
具体实施方式
[0022] 下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
[0023] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
[0024] 本发明人首次发现：若是在孕期接触雷帕霉素，可使子代产生自闭症样行为。具体地，本发明用雷帕霉素抑制剂直接抑制mTOR受体，进而产生了一系列激活自噬通路的分子机制，并提出了过度自噬是导致自闭症及自闭症样行为的可能原因之一。
[0025] 由此，本发明提出了一种新的构建自闭症模型的方法。
[0026] 根据一个方面，本发明提供了一种自闭症小鼠模型的构建方法，所述方法包括用雷帕霉素药物对孕鼠进行孕期干预，从而获得自闭症子代小鼠模型。
[0027] 根据一个实施方式，所述小鼠优选为C57BL/6。C57BL/6小鼠的基因信息明确，并且其生育力强，所以广泛应用于重大疾病的研究。根据一个实施方式，也可以使用其他品系的小鼠，例如balb/c系，c3H 系小鼠等。
[0028] 根据一个实施方式，对性成熟期的雌性健康小鼠，于孕11、12或 13天开始，以3～7mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。优选地，于孕12天开始注射。选择孕12天是由于小鼠脑皮层神经元发育的起始时间是孕11天左右，而孕12天是皮层神经元发育的最佳时间，而且孕12天起开始注射，死胎率较低。优选地，以5mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，直至孕鼠分娩。超过7mg/kg体重腹腔注射雷帕霉素溶液，则死亡率很高。
[0029] 根据一个实施方式，用DMSO作为溶剂溶解雷帕霉素。这是因为，雷帕霉素溶解度很低，其他溶剂无法溶解。DMSO是常用的万能溶剂，可以很好地溶解DMSO。虽然也可以用0.02％酒精溶解雷帕霉素，但是其刺激性太强，所以未采用。
[0030] 根据一个实施方式，对9周龄雌性健康C57BL/6小鼠，于孕12 天开始，腹腔注射雷帕霉素溶液(5mg/kg体重)，直至孕18天。
[0031] 为了验证获得的子代小鼠是否可用作自闭症模型，对子代小鼠的体型、脑体积大小进行了比较，并对其社交、运动及认知功能行为进行了测试。
[0032] 一、实验材料及分组
[0033] C57BL/6小鼠购买自北京华阜康生物有限公司，小鼠饲养并繁殖于陆军总医院附属八一脑科医院神经外科研究所的层流动物房。房内温度常年维持在22±2℃，湿度55～65％，每天保持室内12小时的昼夜交替节律(白昼08:30-20:30)。所有小鼠给予全营养颗粒饲料喂养和无菌水饮用并定期进行清洁垫料的更换。所有实验动物的相关管理遵循中华人民共和国卫生部动物实验管理条例，本研究中所有实验动物的使用和管理均获得了相关实验动物管理委员的批准。
[0034] 雷帕霉素购自Sigma公司(Sigma Aldrich)，编号V900930，规格1MG。溶剂为DMSO(二甲基亚砜，Sigma Aldrich，D2650)。1mg 的雷帕霉素溶于1mL的DMSO中。
[0035] 对9周龄雌性健康C57BL/6小鼠，于孕12天开始，腹腔注射雷帕霉素溶液(5mg/kg体重)，按小鼠的体重进行量取。每只小鼠约注射0.1～0.2ml，直至孕18天。对照组进行注射DMSO溶剂。
[0036] 图1显示了实验组和对照组子代小鼠的体型或脑体积大小，其中左侧为雷帕霉素组子鼠，右侧为对照组子鼠。如图1所示，实验组和对照组子代小鼠在出生后P0天，无论从体型或脑体积大小相比，注射雷帕霉素组的子鼠均小于对照组小鼠。
[0037] 对实验组和对照组子代小鼠进行了社交、运动及认知功能行为学测试[0038] 使用的主要仪器设备如下：
[0039] 3-Chamber test实验装置 Bioseb公司(美国)
[0040] Y-maze test实验装置 Bioseb公司(美国)
[0041] Hot plate test实验装置 Bioseb公司(美国)
[0042] Light-dark box实验装置 Bioseb公司(美国)
[0043] 标准小鼠饲养笼 珠海市再鑫仪器有限公司(中国)
[0044] 水迷宫泳池 中国科之蓝仪器有限公司
[0045] Smart图像采集系统 Panlab公司(美国)
[0046] 清洁垫料 北京华阜康生物科技股份有限公司
[0047] 清洁棉垫 北京华阜康生物科技股份有限公司
[0048] 独立式鼠笼饲养箱 中国 V.M.I.S36
[0049] 奶酪饼干 达利园食品股份有限公司(中国)
[0050] 无水乙醇 北京化工有限责任公司
[0051] 实验动物及行为学流程
[0052] 1.1实验动物
[0053] 6～8周龄大小的实验组(Rapa:n＝7)和对照组(Con:n＝13)子代小鼠用于一系列自闭症相关的行为学测试。实验所用小鼠在饲养过程中，均于出生后4周给予断奶离母饲养，并于出生后5周左右按照性别分笼饲养，每笼3～4只同性别小鼠。饲养环境如前所述。其中，少年玩耍实验(Juvenil play test)所用小鼠均为出生后21天的小鼠。
[0054] 1.2实验前准备及行为学流程
[0055] 进行行为学测试之前，将所有待测的小鼠分别进行编号，并于测试前一天对所有测试小鼠的饲养笼进行清洁垫料更换，并将所有测试小鼠放入行为学测试的房间，以适应新的环境。
[0056] 行为学进行流程如下：
[0057] 1、三室社交偏好实验(3-chamber social preference test)
[0058] 2、旷场实验(Open field test)
[0059] 3、社交互动实验(Reciprocal interaction test)
[0060] 4、自我捋毛实验(Self-grooming test)
[0061] 5、Y迷宫自发性选择实验(Y-maze spontaneous alternation test)[0062] 6、筑巢实验(Nest building test)于上述行为学测试期间的夜间进行[0063] 7、少年玩耍实验于测试小鼠出生后21天左右进行
[0064] 8、水迷宫实验(Morris Water Maze test)
[0065] 所有行为学测试均在白天(09:00-17:00)进行(筑巢实验除外)。
[0066] 1.3实验结果
[0067] 1、注射雷帕霉素小鼠显示出了自闭症样社交功能障碍。
[0068] 首先研究了注射雷帕霉素对小鼠社交行为的影响。实验中，对6～8 周龄(少年玩耍实验除外)的注射雷帕霉素组小鼠和对照的注射DMSO 小鼠中进行了自闭症样社交行为方面的行为学测试。
[0069] (1)三室社交偏好实验：三室社交偏好实验可以一定程度的反应社交，一侧室箱(chamber)内放入一个静止的空笼子作为一个物体刺激(非社会性刺激)，而另一侧室箱内则放入一个装有陌生同龄小鼠的笼子作为社会性刺激。小鼠天生的社交性会使其更加的偏好于停留在有陌生小鼠一侧的室箱内并更多地与其发生交流；如果小鼠对于陌生和熟悉小鼠之间没有明显偏好，则可以间接说明小鼠社交出现了相应的障碍。
[0070] (2)旷场实验又称敞箱实验，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。此实验以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为。
[0071] (3)社交互动实验：社交互动实验是另一项反映社交行为及社交行为是否存在缺陷的实验。其中攻击性行为包括：受测小鼠主动攻击撕咬/抓互动小鼠、受测小鼠与互动小鼠互成类似站立样的“怒视”等行为；非攻击性行为包括：受测小鼠主动追逐互动小鼠、受测小鼠主动尾随互动小鼠、受测小鼠主动靠近互动小鼠并发生密切地身体接触、受测小鼠主动将前肢搭于互动小鼠身上、受测小鼠主动为互动小鼠捋毛、受测小鼠主动与互动小鼠发生鼻—鼻互触或鼻—下体接触等行为。
[0072] (4)少年玩耍实验：少年玩耍实验是另一项测试早期社交功能障碍的行为学测试。测试内容包括发生社交行为，自我捋毛行为以及挖掘行为的时间。社交行为包括：受测小鼠主动追逐互动小鼠、受测小鼠主动尾随互动小鼠、受测小鼠主动靠近互动小鼠并发生密切地身体接触、受测小鼠主动将前肢搭于互动小鼠身上、受测小鼠主动为互动小鼠捋毛、受测小鼠主动与互动小鼠发生鼻—鼻互触或鼻—下体接触等行为；自我捋毛行为包括：受测小鼠自发性地用舌梳理和/或舔食自己全身任何部位的重复性动作；挖掘行为，即受测小鼠用前肢挖掘垫料的行为。
[0073] (5)筑巢实验
[0074] 1、取清洁的标准小鼠饲养笼，并放入约2～3cm厚的清洁垫料待用；
[0075] 2、将大小5cm×5cm×1cm的清洁棉垫放入待用鼠笼内；
[0076] 3、将受测小鼠于每天18:00放入上述准备好的鼠笼内(每笼一只受测小鼠)并给予充分的食物和饮水，然后于正常光照节律下进行实验(20:30—次日8:30关闭灯源)；
[0077] 4、次日8:40左右对受测小鼠所筑的巢进行评分，根据筑成巢的形状和高度给予从1～5分不等。具体标准如下：棉垫几乎没有被使用 (超过90％的完整的)或只是位置上的移动，给予1分；棉垫部分被撕碎(50～90％保持完整)，给予2分；棉垫大部分被撕碎，但撕碎的部分只是零散的摆放，给予3分；棉垫绝大部分被撕碎，并且撕碎的棉垫被集中摆放在鼠笼的某处(一般是某个角落)，其摆放形状可以大致看出是一个巢，但是稍显平整，筑巢小鼠并不能处于其中(筑巢高度第一小鼠身体高度的50％)，给予4分；棉垫超过90％被撕碎，撕碎的棉垫被集中于鼠笼某个角落并且摆放成一个巢样，筑巢高度高于小鼠身体高度的50％，小鼠能够很好的置身其中，给予5分；
[0078] 5、评分结束后，取出受测小鼠，更换干净垫料和棉垫，待夜间进行下一只小鼠的测试。
[0079] (6)Y迷宫自发性选择实验
[0080] 1、受测小鼠从Y迷宫的起始臂轻轻放入，让其自由选择进入左右两侧的目标臂中，一旦选择进入之后，轻轻关上目标臂的门，让受测小鼠在目标臂内探索1分钟。此时未被受测小鼠选择进入的另一个臂则为非目标臂；
[0081] 2、探索结束后，打开目标臂的门，轻轻取出受测小鼠，然后依次从起始臂处放入，连续放入10次，记录10次中受测小鼠进入之前选择的目标臂的次数。小鼠进入标准：双后肢及尾根部越过门线。每次受测小鼠做出选择之后，任其进入到整个选择的臂内并在内停留5～10 秒，然后轻轻取出进行下次放置。最后统计每只受测小鼠未发生选择改变的百分比((选择目标臂的次数/10)×100)；
[0082] 3、测试结束后取出受测小鼠，然后用70％的乙醇溶液清洁Y迷宫装置，待其干燥后进行下一只小鼠的测试。
[0083] 图2至图12显示了小鼠自闭症样社交行为方面的行为学测试结果；其中三室社交偏好实验的结果如图2至图5所示，“小鼠”表示放有同种同性小鼠的鼠笼的一侧，“空鼠笼”表示放有空鼠笼的一侧，“熟悉小鼠”表示放有熟悉小鼠的一侧，“陌生小鼠”表示放有陌生小鼠的一侧。当用空笼子和陌生小鼠作为偏好刺激时，注射雷帕霉素小鼠对空笼子和带有陌生小鼠的笼子没有明显的偏好(t＝0.471, p＝0.646)，虽然和带有陌生小鼠的笼子的交流时间多于和空笼子的交流时间，但是差异无统计学意义(t＝0.514，p＝0.616)，且交流时间的差异比起注射DMSO的对照小鼠来说是明显减少的(t＝﹣3.791, p＝0.001)；随着另一只新的陌生小鼠的放入，注射雷帕霉素的小鼠不仅对熟悉和陌生小鼠没有表现出明显的偏好(t＝0.284,p＝0.781)，和熟悉、陌生小鼠之间的交流时间也不再有明显的差异(t＝0.101, p＝0.922)，而且这种交流时间比起对照的注射DMSO的小鼠来说依旧是明显减少的(t＝﹣3.024,p＝0.007)。由此可以看出，雷帕霉素组小鼠和对照组相比出现了明显的社交行为障碍。
[0084] 旷场实验的结果如图6和图7所示，其中，“中心区域”表示在旷场中心区域活动，“周围区域”表示在旷场的周围区域活动。如图所示，雷帕霉素注射组小鼠在旷场中心区域活动的时间明显少于对照组，而在旷场周围区域活动的时间明显多于对照组，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，证明雷帕霉素注射组小鼠对于中心区域缺乏正常的探索行为；而在活动距离方面，雷帕霉素注射组小鼠亦明显少于对照组小鼠，差异具有统计学意义(P＜0.05)，更多的是在角落中进行刻板运动(自我捋毛等)。旷场试验的结果证明，与对照组相比，雷帕霉素组小鼠对于新鲜事物缺乏兴趣，只愿意在自己的区域活动，不愿意探究外界未知事物，且在旷场周围区域活动过程中，也常长时间出现捋毛等典型的刻板重复动作。
[0085] 社交互动实验的结果如图8所示。如图所示：注射雷帕霉素小鼠虽然在发生攻击性行为和非攻击性行为的时间方面与其同窝对照的注射DMSO的小鼠相比，均明显低于同窝对照的注射DMSO组的小鼠，且差异具有统计学意义(t＝4.930，4.145,p＜0.001)。此实验结果再次证实，雷帕霉素组小鼠的社交功能出现了明显的缺陷，与和同龄其他小鼠进行正常的交流相比，雷帕霉素组小鼠更倾向于独自活动。
[0086] 少年玩耍实验的结果如图9所示。正常情况下，在10分钟的测试时间里，小鼠的社交行为应相对较长，而自我捋毛行为和挖掘行为应较短。若出现社交功能障碍的小鼠，则社交时间明显减少，而自我捋毛行为和挖掘行为明显增加。如图9所示，出生后21天大小的注射雷帕霉素小鼠发生社交行为的时间明显的少于其同窝对照的注射DMSO 的小鼠(t＝5.989,p＜0.001)，虽然在另一种带有逃避心理的重复行为 (挖掘行为)的发生时间上并没有明显的差异(t＝0.01,p＝0.992)，但是发生重复性的自我捋毛行为的时间却较注射DMSO组的小鼠明显长得多(t＝7.387,p＜0.001)。
[0087] 图10显示了筑巢实验结果，该结果同样显示：注射雷帕霉素小鼠有着较同窝对照的注射DMSO的小鼠更差的筑巢能力评分(t＝﹣3.380, p＝0.003)。
[0088] 此外，对注射雷帕霉素小鼠和其同窝对照的注射DMSO的小鼠中进行了与自闭症重复刻板样行为相关的行为学测试，结果显示注射雷帕霉素小鼠展示出了自闭症样的重复刻板样行为。具体结果如图11和图12所示：
[0089] 图11显示了Y迷宫自发性选择的实验结果，结果显示：注射雷帕霉素小鼠很难对首次选择的目标臂进行改变，因而展示出了更高的未改变选择的比例(No alternation(％)＝57.14±2.85；对照组＝49.23 ±2.39)；
[0090] 图12显示了自我捋毛实验结果，结果显示：注射雷帕霉素小鼠比起对照的注射DMSO的小鼠展示出了更多的重复性的捋毛行为 (t＝5.177，p＜0.001)。
[0091] 2、注射雷帕霉素小鼠展示出了认知功能障碍
[0092] 研究了注射雷帕霉素对小鼠认知功能的影响。包括：新物体识别测试和水迷宫实验。
[0093] (1)对子代小鼠进行了新事物识别行为学实验，以检验其非空间学习和记忆能力的，进一步验证雷帕霉素对识别记忆的影响。新物体识别测试是Ennaceur&Delacour(1988)根据啮齿类对新环境的先天的探索倾向而设计的实验，依据动物对环境中曾见到过、熟悉的物体和从未见过的新异物体的探究时间来评价被测试动物的记忆能力，考察的是识别记忆。正常情况下，小鼠对于不熟悉的物体的探索时间往往较熟悉物体长；若小鼠探索不熟悉的物体所用时间(RI)明显短于正常小鼠，提示这种情景记忆存在障碍，即区分熟悉和新异物体能力受损。
[0094] 图13至图20显示了注射雷帕霉素小鼠显示出了认知功能障碍。其中，图13和图14显示了新物体识别测试结果。如图13所示：在训练期间，两组探索相同物体的偏好分别是(mean±SEM)：雷帕霉素组0.48±0.008，对照组0.48±0.13，两组相比差异不具有统计学意义 (p＝0.74)，故对照组和注射雷帕霉素组小鼠之间没有显著性偏好差异。这些观察结果表明，这两组的小鼠具有相同水平的动机，好奇心和兴趣，探索新的对象。在30分钟后的训练，一个新的物体被替换一个已识别过的物体。如图14所示：正对照组小鼠表现出显著的偏好，在记忆测试中探索新的物体。相反，注射雷帕霉素组小鼠表现为对新异物体只有一点偏好，两组认知指数分别为对照组小鼠0.68±0.018 和注射雷帕霉素组小鼠0.56±0.023(t＝﹣4.067，P＝0.001)。这些结果表明注射雷帕霉素组小鼠在新物体再认记忆上严重缺损。
[0095] (2)水迷宫实验
[0096] 水迷宫实验是一种利用啮齿类动物既会水又怕水的天性将其置于水中，迫使其奋力逃避水环境而学会利用环境标记物和隐匿平台的关系来寻找水中平台位置的实验，已被应用于学习记忆的神经生物学机制探讨。其包括定位航行和空间探索试验两个部分。定位航行试验是通过多次训练，使其学习寻找固定位置的平台，是以周围环境中的线索为参照的空间位置认知，其形成的是空间参考记忆，这种记忆的储存、提取涉及边缘系统(海马)、纹状体、基底前脑、小脑和其他脑区。空间探索试验主要是考察小鼠对逃生平台的记忆。如果水迷宫实验中实验小鼠无法正确的找到平台位置，说明小鼠的空间记忆及认知存在障碍。
[0097] 如图15所示：水迷宫实验的定位航行实验中全部小鼠逃避潜伏期在训练进程中均不断下降，说明小鼠的空间记忆的获得能力随训练天数的增加而增强。定位航行的前两天，两组小鼠表现近似；而在第三、第四和第五天，注射雷帕霉素组小鼠的逃避潜伏期显著高于对照组小鼠(t值及p值分别为第3天：t＝2.211,p＝0.04；第4天：t＝3.839,p＝0.001；第5天：t＝5.109,p＝0.000)。
[0098] 如图16所示：搜索距离方面，注射雷帕霉素组呈“下降-上升-下降”波动性下降趋势，在第3天有所增加，而对照组则呈稳步下降趋势，在训练第五天两组具有明显差异(t＝5.304,p＜0.05)。
[0099] 如图17所示：注射雷帕霉素组的小鼠穿越原平台位置次数显著低于对照组小鼠(P＜0.05)。
[0100] 如图18所示：定位航行训练全程小鼠游泳的速度差异不明显。
[0101] 如图19所示：注射雷帕霉素组的小鼠在水迷宫空间探索实验目标象限停留时间也显著低于对照组小鼠(P＜0.001)。
[0102] 如图20所示：在定位航行训练5天结束后，撤去平台，进行空间探索实验，绘制小鼠寻找平台的轨迹图，从而比较两组小鼠的参考记忆的能力有无受到影响。从图20可见：对照组小鼠多能根据空间线索较迅速的找到平台所在位置，搜索轨迹最多为原平台所在象限，其次是在原平台所在象限的邻近象限，很少跨至对侧象限进行搜索。而注射雷帕霉素组小鼠多是围绕池壁寻找，罕有跨直径探索。注射雷帕霉素组小鼠在原平台象限探索的时间百分率明显少于对照组小鼠雷帕霉素(mean±SEM：10.16±1.64，对照：31.71±1.56；t＝-8.732,P＜0.001)。
[0103] 对过注射雷帕霉素组子代小鼠和对照组小鼠的体型、脑体积大小进行了比较，以及对其社交、运动及认知功能行为进行了测试，证实了用雷帕霉素药物对孕鼠进行孕期干预，从而获得自闭症子代小鼠模型。为ASD的相关研究建立了新的可靠的动物模型，并为今后自闭症的防治探寻了一条新方向。
[0104] 以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于) 具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
[0105] 主要参考文献：
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[0107] 2.Schneider T,Przewlocki R:Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid:animal model of autism. Neuropsychopharmacology 2005,30(1):80-89.
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