含有BDNF的融合蛋白
阅读：739发布：2020-12-30
专利汇可以提供含有BDNF的融合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种含有脑源性神经营养因子(BDNF)的融合蛋白。该融合蛋白为BDNF与特定范围的人抗转 铁 蛋白受体 抗体 的融合蛋白， 给药 于血中的BDNF能够通过血脑屏障。，下面是含有BDNF的融合蛋白专利的具体信息内容。
1.一种脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
(1)CDR1中含有序列号6或序列号7的氨基酸序列、CDR2中含有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号10的氨基酸序列的氨基酸序列；
(2)CDR1中含有序列号11或序列号12的氨基酸序列、CDR2中含有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号15的氨基酸序列的氨基酸序列；
(3)CDR1中含有序列号16或序列号17的氨基酸序列、CDR2中含有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列Lys-Val-Ser、且CDR3中含有序列号20的氨基酸序列的氨基酸序列；
(4)CDR1中含有序列号21或序列号22的氨基酸序列、CDR2中含有序列号23或序列号24的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列；
(5)CDR1中含有序列号26或序列号27的氨基酸序列、CDR2中含有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号30的氨基酸序列的氨基酸序列；
(6)CDR1中含有序列号31或序列号32的氨基酸序列、CDR2中含有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号35的氨基酸序列的氨基酸序列；
(7)CDR1中含有序列号36或序列号37的氨基酸序列、CDR2中含有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列Gln-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号40的氨基酸序列的氨基酸序列；
(8)CDR1中含有序列号41或序列号42的氨基酸序列、CDR2中含有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列Gly-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号45的氨基酸序列的氨基酸序列；
(9)CDR1中含有序列号46或序列号47的氨基酸序列、CDR2中含有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列Phe-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号50的氨基酸序列的氨基酸序列；
(10)CDR1中含有序列号51或序列号52的氨基酸序列、CDR2中含有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号55的氨基酸序列的氨基酸序列；
(11)CDR1中含有序列号56或序列号57的氨基酸序列、CDR2中含有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号60的氨基酸序列的氨基酸序列；
(12)CDR1中含有序列号61或序列号62的氨基酸序列、CDR2中含有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Ser-Ser、且CDR3中含有序列号65的氨基酸序列的氨基酸序列；
(13)CDR1中含有序列号66或序列号67的氨基酸序列、CDR2中含有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号70的氨基酸序列的氨基酸序列；和
(14)CDR1中含有序列号71或序列号72的氨基酸序列、CDR2中含有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号75的氨基酸序列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
(1)CDR1中含有序列号6的氨基酸序列、CDR2中含有序列号8的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号10的氨基酸序列的氨基酸序列；
(2)CDR1中含有序列号11的氨基酸序列、CDR2中含有序列号13的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号15的氨基酸序列的氨基酸序列；
(3)CDR1中含有序列号16的氨基酸序列、CDR2中含有序列号18的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号20的氨基酸序列的氨基酸序列；
(4)CDR1中含有序列号21的氨基酸序列、CDR2中含有序列号23的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列；
(5)CDR1中含有序列号26的氨基酸序列、CDR2中含有序列号28的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号30的氨基酸序列的氨基酸序列；
(6)CDR1中含有序列号31的氨基酸序列、CDR2中含有序列号33的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号35的氨基酸序列的氨基酸序列；
(7)CDR1中含有序列号36的氨基酸序列、CDR2中含有序列号38的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号40的氨基酸序列的氨基酸序列；
(8)CDR1中含有序列号41的氨基酸序列、CDR2中含有序列号43的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号45的氨基酸序列的氨基酸序列；
(9)CDR1中含有序列号46的氨基酸序列、CDR2中含有序列号48的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号50的氨基酸序列的氨基酸序列；
(10)CDR1中含有序列号51的氨基酸序列、CDR2中含有序列号53的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号55的氨基酸序列的氨基酸序列；
(11)CDR1中含有序列号56的氨基酸序列、CDR2中含有序列号58的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号60的氨基酸序列的氨基酸序列；
(12)CDR1中含有序列号61的氨基酸序列、CDR2中含有序列号63的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号65的氨基酸序列的氨基酸序列；
(13)CDR1中含有序列号66的氨基酸序列、CDR2中含有序列号68的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号70的氨基酸序列的氨基酸序列；和
(14)CDR1中含有序列号71的氨基酸序列、CDR2中含有序列号73的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号75的氨基酸序列的氨基酸序列。
3.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与权利要求1或2中的任一轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
4.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与权利要求1或2中的任一轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
5.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求1或2的任一轻链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
6.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求1或2的任一轻链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
7.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
(1)CDR1中含有序列号76或序列号77的氨基酸序列、CDR2中含有序列号78或序列号79的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号80或序列号81的氨基酸序列的氨基酸序列；
(2)CDR1中含有序列号82或序列号83的氨基酸序列、CDR2中含有序列号84或序列号85的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号86或序列号87的氨基酸序列的氨基酸序列；
(3)CDR1中含有序列号88或序列号89的氨基酸序列、CDR2中含有序列号90或序列号91的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号92或序列号93的氨基酸序列的氨基酸序列；
(4)CDR1中含有序列号94或序列号95的氨基酸序列、CDR2中含有序列号96或序列号97的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号98或序列号99的氨基酸序列的氨基酸序列；
(5)CDR1中含有序列号100或序列号101的氨基酸序列、CDR2中含有序列号102或序列号
103的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号104或序列号105的氨基酸序列的氨基酸序列；
(6)CDR1中含有序列号106或序列号107的氨基酸序列、CDR2中含有序列号108的氨基酸序列或序列号266的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号109或序列号110的氨基酸序列的氨基酸序列；
(7)CDR1中含有序列号111或序列号112的氨基酸序列、CDR2中含有序列号113或序列号
114的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号115或序列号116的氨基酸序列的氨基酸序列；
(8)CDR1中含有序列号117或序列号118的氨基酸序列、CDR2中含有序列号119的氨基酸序列或序列号267的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号120或序列号121的氨基酸序列的氨基酸序列；
(9)CDR1中含有序列号122或序列号123的氨基酸序列、CDR2中含有序列号124或序列号
125的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号126或序列号127的氨基酸序列的氨基酸序列；
(10)CDR1中含有序列号128或序列号129的氨基酸序列、CDR2中含有序列号130或序列号131的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号132或序列号133的氨基酸序列的氨基酸序列；
(11)CDR1中含有序列号134或序列号135的氨基酸序列、CDR2中含有序列号136或序列号137的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号138或序列号139的氨基酸序列的氨基酸序列；
(12)CDR1中含有序列号140或序列号141的氨基酸序列、CDR2中含有序列号142或序列号143的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号144或序列号145的氨基酸序列的氨基酸序列；
(13)CDR1中含有序列号146或序列号147的氨基酸序列、CDR2中含有序列号148或序列号149的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号150或序列号151的氨基酸序列的氨基酸序列；和(14)CDR1中含有序列号152或序列号153的氨基酸序列、CDR2中含有序列号154或序列号155的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号156或序列号157的氨基酸序列的氨基酸序列。
8.根据权利要求7的BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
(1)CDR1中含有序列号76的氨基酸序列、CDR2中含有序列号78的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号80的氨基酸序列的氨基酸序列；
(2)CDR1中含有序列号82的氨基酸序列、CDR2中含有序列号84的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号86的氨基酸序列的氨基酸序列；
(3)CDR1中含有序列号88的氨基酸序列、CDR2中含有序列号90的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号92的氨基酸序列的氨基酸序列；
(4)CDR1中含有序列号94的氨基酸序列、CDR2中含有序列号96的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号98的氨基酸序列的氨基酸序列；
(5)CDR1中含有序列号100的氨基酸序列、CDR2中含有序列号102的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号104的氨基酸序列的氨基酸序列；
(6)CDR1中含有序列号106的氨基酸序列、CDR2中含有序列号108的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号109的氨基酸序列的氨基酸序列；
(7)CDR1中含有序列号111的氨基酸序列、CDR2中含有序列号113的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号115的氨基酸序列的氨基酸序列；
(8)CDR1中含有序列号117的氨基酸序列、CDR2中含有序列号119的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号120的氨基酸序列的氨基酸序列；
(9)CDR1中含有序列号122的氨基酸序列、CDR2中含有序列号124的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号126的氨基酸序列的氨基酸序列；
(10)CDR1中含有序列号128的氨基酸序列、CDR2中含有序列号130的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号132的氨基酸序列的氨基酸序列；
(11)CDR1中含有序列号134的氨基酸序列、CDR2中含有序列号136的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号138的氨基酸序列的氨基酸序列；
(12)CDR1中含有序列号140的氨基酸序列、CDR2中含有序列号142的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号144的氨基酸序列的氨基酸序列；
(13)CDR1中含有序列号146的氨基酸序列、CDR2中含有序列号148的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号150的氨基酸序列的氨基酸序列；和
(14)CDR1中含有序列号152的氨基酸序列、CDR2中含有序列号154的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号156的氨基酸序列的氨基酸序列。
9.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与权利要求7或8中的任一重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
10.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与权利要求7或8中的任一重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
11.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求7或8的任一重链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
12.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求7或8的任一重链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
13.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区和重链的可变区选自由以下的(1)～(14)组成的组：
(1)轻链的可变区的CDR1含有序列号6或序列号7的氨基酸序列、CDR2含有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号10的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号76或序列号77的氨基酸序列、CDR2含有序列号78或序列号79的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号80或序列号81的氨基酸序列；
(2)轻链的可变区的CDR1含有序列号11或序列号12的氨基酸序列、CDR2含有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号15的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号82或序列号83的氨基酸序列、CDR2含有序列号84或序列号85的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号86或序列号87的氨基酸序列；
(3)轻链的可变区的CDR1含有序列号16或序列号17的氨基酸序列、CDR2含有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列Lys-Val-Ser、以及CDR3含有序列号20的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号88或序列号89的氨基酸序列、CDR2含有序列号90或序列号91的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号92或序列号93的氨基酸序列；
(4)轻链的可变区的CDR1含有序列号21或序列号22、CDR2含有序列号23或序列号24的氨基酸序列或Asp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号94或序列号95的氨基酸序列、CDR2含有序列号96或序列号97的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号98或序列号99的氨基酸序列；
(5)轻链的可变区的CDR1含有序列号26或序列号27的氨基酸序列、CDR2含有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号30的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号100或序列号101的氨基酸序列、CDR2含有序列号102或序列号103的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号104或序列号105的氨基酸序列；
(6)轻链的可变区的CDR1含有序列号31或序列号32的氨基酸序列、CDR2含有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号35的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号106或序列号107的氨基酸序列、CDR2含有序列号108或序列号266的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号109或序列号110的氨基酸序列；
(7)轻链的可变区的CDR1含有序列号36或序列号37的氨基酸序列、CDR2含有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列Gln-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号40的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号111或序列号112的氨基酸序列、CDR2含有序列号113或序列号114的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号115或序列号116的氨基酸序列，(8)轻链的可变区的CDR1含有序列号41或序列号42的氨基酸序列、CDR2含有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列Gly-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号45的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号117或序列号118的氨基酸序列、CDR2含有序列号119或序列号267的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号120或序列号121的氨基酸序列；
(9)轻链的可变区的CDR1含有序列号46或序列号47的氨基酸序列、CDR2含有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列Phe-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号50的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号122或序列号123的氨基酸序列、CDR2含有序列号124或序列号125的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号126或序列号127的氨基酸序列；
(10)轻链的可变区的CDR1含有序列号51或序列号52的氨基酸序列、CDR2含有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号55的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号128或序列号129的氨基酸序列、CDR2含有序列号130或序列号131的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号132或序列号133的氨基酸序列；
(11)轻链的可变区的CDR1含有序列号56或序列号57的氨基酸序列、CDR2含有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号60的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号134或序列号135的氨基酸序列、CDR2含有序列号136或序列号137的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号138或序列号139的氨基酸序列；
(12)轻链的可变区的CDR1含有序列号61或序列号62的氨基酸序列、CDR2含有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Ser-Ser、以及CDR3含有序列号65的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号140或序列号141的氨基酸序列、CDR2含有序列号142或序列号143的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号144或序列号145的氨基酸序列；
(13)轻链的可变区的CDR1含有序列号66或序列号67的氨基酸序列、CDR2含有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号70的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号146或序列号147的氨基酸序列、CDR2含有序列号148或序列号149的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号150或序列号151的氨基酸序列；和(14)轻链的可变区的CDR1含有序列号71或序列号72的氨基酸序列、CDR2含有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号75的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号152或序列号153的氨基酸序列、CDR2含有序列号154或序列号155的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号156或序列号157的氨基酸序列。
14.根据权利要求13的BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区和重链的可变区选自由以下的(1)～(14)组成的组：
(1)轻链的可变区的CDR1中含有序列号6的氨基酸序列、CDR2中含有序列号8的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号10的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号76的氨基酸序列、CDR2中含有序列号78的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号80的氨基酸序列；
(2)轻链的可变区的CDR1中含有序列号11的氨基酸序列、CDR2中含有序列号13的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号15的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
82的氨基酸序列、CDR2中含有序列号84的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号86的氨基酸序列；
(3)轻链的可变区的CDR1中含有序列号16的氨基酸序列、CDR2中含有序列号18的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号20的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
88的氨基酸序列、CDR2中含有序列号90的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号92的氨基酸序列；
(4)轻链的可变区的CDR1中含有序列号21的氨基酸序列、CDR2中含有序列号23的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号25的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
94的氨基酸序列、CDR2中含有序列号96的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号98的氨基酸序列；
(5)轻链的可变区的CDR1中含有序列号26的氨基酸序列、CDR2中含有序列号28的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号30的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
100的氨基酸序列、CDR2中含有序列号102的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号104的氨基酸序列；
(6)轻链的可变区的CDR1中含有序列号31的氨基酸序列、CDR2中含有序列号33的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号35的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
106的氨基酸序列、CDR2中含有序列号108的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号109的氨基酸序列；
(7)轻链的可变区的CDR1中含有序列号36的氨基酸序列、CDR2中含有序列号38的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号40的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
111的氨基酸序列、CDR2中含有序列号113的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号115的氨基酸序列；
(8)轻链的可变区的CDR1中含有序列号41的氨基酸序列、CDR2中含有序列号43的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号45的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
117的氨基酸序列、CDR2中含有序列号119的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号120的氨基酸序列；
(9)轻链的可变区的CDR1中含有序列号46的氨基酸序列、CDR2中含有序列号48的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号50的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
122的氨基酸序列、CDR2中含有序列号124的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号126的氨基酸序列；
(10)轻链的可变区的CDR1中含有序列号51的氨基酸序列、CDR2中含有序列号53的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号55的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
128的氨基酸序列、CDR2中含有序列号130的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号132的氨基酸序列；
(11)轻链的可变区的CDR1中含有序列号56的氨基酸序列、CDR2中含有序列号58的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号60的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
134的氨基酸序列、CDR2中含有序列号136的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号138的氨基酸序列；
(12)轻链的可变区的CDR1中含有序列号61的氨基酸序列、CDR2中含有序列号63的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号65的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
140的氨基酸序列、CDR2中含有序列号142的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号144的氨基酸序列；
(13)轻链的可变区的CDR1中含有序列号66的氨基酸序列、CDR2中含有序列号68的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号70的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1中含有序列号146的氨基酸序列、CDR2中含有序列号148的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号150的氨基酸序列；和
(14)轻链的可变区的CDR1中含有序列号71的氨基酸序列、CDR2中含有序列号73的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号75的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号
152的氨基酸序列、CDR2中含有序列号154的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号156的氨基酸序列。
15.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与权利要求13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列具有80％以上的同源性。
16.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与权利要求13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列具有90％以上的同源性。
17.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
18.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
19.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号158、序列号159、序列号160、序列号161、序列号162和序列号163的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且重链的可变区含有选自由序列号166、序列号167、序列号168、序列号169、序列号170和序列号171的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列。
20.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号174、序列号175、序列号176、序列号177、序列号178和序列号179的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且重链的可变区含有选自序列号182、序列号183、序列号
184、序列号185、序列号186和序列号187的氨基酸序列中的任一氨基酸序列。
21.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号190、序列号191、序列号192、序列号193、序列号194和序列号195的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且重链的可变区含有选自由序列号204、序列号205、序列号206、序列号207、序列号208和序列号209的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列。
22.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其选自由以下的(1a)～(3d)组成的组：
(1a)该抗体的轻链的可变区含有序列号163的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号
171的氨基酸序列的融合蛋白，
(2a)该抗体的轻链的可变区含有序列号179的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号
187的氨基酸序列的融合蛋白，
(3a)该抗体的轻链的可变区含有序列号191的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号
205的氨基酸序列的融合蛋白，
(3b)该抗体的轻链的可变区含有序列号193的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号
205的氨基酸序列的融合蛋白，
(3c)该抗体的轻链的可变区含有序列号194的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号
205的氨基酸序列的融合蛋白，和
(3d)该抗体的轻链的可变区含有序列号195的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号
205的氨基酸序列的融合蛋白。
23.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其选自由以下的(1b)～(31)组成的组：
(1b)该抗体的轻链含有序列号164的氨基酸序列且该抗体的重链含有序列号172的氨基酸序列的融合蛋白，
(2b)该抗体的轻链含有序列号180的氨基酸序列且重链含有序列号188的氨基酸序列的融合蛋白，
(3e)该抗体的轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
(3f)该抗体的轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
(3g)该抗体的轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
(3h)该抗体的轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
(3i)该抗体的轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白，
(3j)该抗体的轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白，
(3k)该抗体的轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白，和
(31)该抗体的轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白。
24.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列与权利要求19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
25.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列与权利要求19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
26.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列中、1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
27.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列中、1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
28.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求19～23中任一项的重链的可变区的氨基酸序列中、1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
29.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求19～23中任一项的重链的可变区的氨基酸序列中、1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
30.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求19～23中任一项的构成轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列各自的氨基酸中、分别有1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
31.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为权利要求19～23中任一项的构成轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列各自的氨基酸中、分别有1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
32.根据权利要求1～31中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF结合于该抗体的轻链的C末端侧或N末端侧。
33.根据权利要求32的融合蛋白，其中，该BDNF直接或通过接头结合于该抗体的轻链的C末端侧或N末端侧。
34.根据权利要求33的融合蛋白，其中，该接头是由1～50个氨基酸残基构成的肽。
35.根据权利要求33的融合蛋白，其中，该接头是含有选自由甘氨酸、丝氨酸、氨基酸序列(Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)、序列号3、序列号4、序列号5和1～10个这些氨基酸序列连接而成的序列组成的组中的氨基酸序列的肽。
36.根据权利要求1～31中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF结合于该抗体的重链的C末端侧或N末端侧。
37.根据权利要求36的融合蛋白，其中，该BDNF直接或通过接头结合于该抗体的重链的C末端侧或N末端侧。
38.根据权利要求37的融合蛋白，其中，该接头是由1～50个氨基酸残基构成的肽。
39.根据权利要求37的融合蛋白，其中，该接头是含有选自由氨基酸序列(Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)、序列号3、序列号4和序列号5组成的组中的氨基酸序列的肽。
40.根据权利要求1～39中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF为人BDNF。
41.根据权利要求40的融合蛋白，其中，该人BDNF含有序列号247的氨基酸序列或与其实质上一致的氨基酸序列、或者具有与序列号247所示的蛋白质同一性质的功能。
42.根据权利要求1～41中任一项的融合蛋白，其对人转铁蛋白受体的胞外区和猴转铁蛋白受体的胞外区这两者具有亲和性。
43.根据权利要求42的融合蛋白，其中，该抗转铁蛋白受体抗体与人转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为1×10-8M以下，与猴转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为5×10-8M以下。
44.根据权利要求40的融合蛋白，其选自由以下的(1)～(4)组成的组：
(1)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号164的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号248所示的氨基酸序列的融合蛋白；
(2)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号180的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号250所示的氨基酸序列的融合蛋白；和
(3)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号196的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号252所示的氨基酸序列的融合蛋白；
(4)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号196的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列与人BDNF结合且整体具有序列号254所示的氨基酸序列的融合蛋白，所述接头序列由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。
45.根据权利要求1～43中任一项所述的融合蛋白，其中，该抗人转铁蛋白受体抗体为抗原结合性片段。
46.根据权利要求45所述的融合蛋白，其中，在抗原结合性片段的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
47.根据权利要求45或46所述的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为单链抗体。
48.根据权利要求47所述的融合蛋白，其中，该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链可变区和重链可变区通过将轻链和重链结合的接头序列而结合。
49.根据权利要求48所述的融合蛋白，其中，在该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链可变区的C末端侧通过将轻链和重链结合的接头序列而结合有该抗人转铁蛋白受体抗体的重链可变区。
50.根据权利要求48所述的融合蛋白，其中，在该抗人转铁蛋白受体抗体的重链可变区的C末端侧通过将轻链和重链结合的接头序列而结合有该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链可变区。
51.根据权利要求48～50所述的融合蛋白，其中，该将轻链和重链结合的接头序列由2～50个氨基酸残基构成。
52.根据权利要求51所述的融合蛋白，其中，该将轻链和重链结合的接头序列含有选自由氨基酸序列(Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Gly)、序列号
3、序列号4、序列号5和2～10个这些氨基酸序列连接而成的序列组成的组中的氨基酸序列。
53.根据权利要求47～52所述的融合蛋白，其中，单链抗体是含有具有序列号205的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号191的氨基酸序列的轻链可变区的单链抗体。
54.根据权利要求53所述的融合蛋白，其中，单链抗体是由序列号257的氨基酸序列构成的单链抗体，在其N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
55.根据权利要求54所述的融合蛋白，其含有序列号259的氨基酸序列，单链抗体为由序列号257的氨基酸序列构成的单链抗体且在其N末端侧通过接头结合有人前体BDNF。
56.根据权利要求54所述的融合蛋白，其含有序列号260的氨基酸序列，单链抗体为由序列号257的氨基酸序列构成的单链抗体且在其N末端侧通过接头结合有人BDNF。
57.根据权利要求45或46所述的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一种。
58.根据权利要求57所述的融合蛋白，其中，在Fab、F(ab’)2或F(ab’)的任一者的重链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
59.根据权利要求58所述的融合蛋白，其中，轻链由序列号196的氨基酸序列构成，且重链为由序列号261的氨基酸序列构成的Fab重链，在该重链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
60.根据权利要求59所述的融合蛋白，其中，轻链由序列号196的氨基酸序列构成，并且由Fab重链和直接或通过接头结合在其N末端侧的人前体BDNF构成的部分由序列号263的氨基酸序列构成。
61.根据权利要求59所述的融合蛋白，其中，轻链由序列号196的氨基酸序列构成，并且由Fab重链和直接或通过接头结合在其N末端侧的人BDNF构成的部分由序列号264的氨基酸序列构成。
62.一种DNA片段，其编码权利要求1～61中任一项的融合蛋白。
63.一种表达载体，其整合有权利要求62的DNA片段。
64.一种哺乳动物细胞，其用权利要求63的表达载体进行了转化。
65.一种药剂，其为用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的药剂，其含有权利要求1～61中任一项的融合蛋白作为有效成分。
66.根据权利要求65的药剂，其中，该疾病或障碍为神经系统的疾病或障碍。
67.根据权利要求66的药剂，其中，该神经系统的疾病或障碍为神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症、癫痫、自闭症、Rett综合症、West综合症、新生儿惊厥、痴呆伴发问题行为、焦虑症、疼痛、先天性巨结肠或快速眼动睡眠行为障碍。
68.根据权利要求67的药剂，其中，该神经退行性疾病为脑神经退行性疾病、脊髓退行性疾病、视网膜退行性疾病或周围神经退行性疾病。
69.根据权利要求68的药剂，其中，该脑神经退行性疾病为脑神经系统的神经退行性疾病、脑缺血性疾病、创伤性脑损伤、脑白质病或多发性硬化症。
70.根据权利要求69的药剂，其中，该脑神经系统的神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、路易体痴呆、匹克氏病、多系统萎缩症、进行性上行性麻痹或唐氏综合症。
71.权利要求1～61中任一项的融合蛋白在预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍中的应用。
72.权利要求1～61中任一项的融合蛋白在制造用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的药物中的应用。
73.一种预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的方法，其含有如下步骤：向具有该疾病或障碍的患者的血中给药含有治疗上有效量的权利要求1～61中任一项的融合蛋白的药物组合物。
含有BDNF的融合蛋白
技术领域
背景技术
[0002] 对除包括脑室周围器官(松果体、脑垂体、最后区等)在内的几个区域以外的大部分脑组织供给血液的毛细血管与存在于肌肉等其它组织中的毛细血管不同，形成其内皮的内皮细胞彼此通过牢固的细胞间接合而紧密结合。因此会妨碍物质从血液向脑部的被动转运，虽然也有例外，但除了脂溶性高的物质或分子量小(200～500道尔顿以下)且在生理pH附近为电中性的物质以外，均难以从毛细血管向脑中迁移。这种通过脑内的毛细血管内皮来限制血液与脑组织液之间的物质交换的机制被称为血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)。此外，血脑屏障不仅限制脑的组织液与血液之间的物质交换，而且还限制包括脑和脊髓在内的中枢神经系统的组织液与血液之间的物质交换。
[0003] 由于血脑屏障的存在，中枢神经系统的大部分细胞不会受到血中的激素、淋巴因子等物质的浓度变动等的影响，从而能保持其生化学的稳态。
[0004] 但是，血脑屏障的存在在药剂开发上引起问题。例如已知：脑源性神经营养因子(BDNF；Brain-derived neurotrophic factor)为神经营养因子家族中的一员，其二聚体与位于靶细胞表面上的高亲和性BDNF受体(TrkB；也被称为Tyrosine receptor kinase B，Tropomyosin receptor kinase B或Tropomyosin-related Kinase B)特异性结合，在中枢神经系统和周围神经系统的细胞分化、功能维持、突触形成以及损伤时的再生和修复等中发挥重要的作用(非专利文献1和2)。因此，期待开发BDNF来作为阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病等神经退行性疾病、肌萎缩性侧索硬化症等脊髓退行性疾病以及糖尿病性神经障碍、脑缺血性疾病、发育障碍、精神分裂症、抑郁症和Rett综合症等多种疾病的治疗剂(非专利文献3～8)。但是，由于高分子蛋白质通常极难通过血脑屏障，因此在将BDNF本身作为中枢神经系统的疾病治疗药或作为作用于中枢神经系统的疾病治疗药并通过外周给药使用方面存在较大障碍。
[0005] 关于用于使应在中枢神经系统中起作用的这种蛋白质等高分子物质通过血脑屏障的方法，已经开发出各种方法。例如，在神经生长因子的情况下，尝试了通过使包封有神经生长因子的脂质体与脑内毛细血管的内皮细胞的细胞膜融合而使其通过血脑屏障的方法，但未达到实用化(非专利文献9)。在α-L-艾杜糖醛酸酶的情况下，进行了通过增加每次给药的酶量来提高其血药浓度、从而提高血脑屏障中的酶的被动转运的尝试，并且示出了使用Hurler综合症的动物模型通过该方法缓解了中枢神经系统(CNS)的异常(非专利文献10)。
[0006] 此外，为了避开血脑屏障，还进行了将高分子物质直接给药于髓腔内或脑内的尝试。例如报道了：向Hurler综合症(粘多糖症I型)的患者的髓腔内给药人α-L-艾杜糖醛酸酶的方法(专利文献1)、向Niemann-Pick(尼曼-匹克)病的患者的脑室内给药人酸性鞘磷脂酶的方法(专利文献2)、向Hunter综合症的模型动物的脑室内给药艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)的方法(专利文献3)。认为根据这样的方法可以切实地使药剂作用于中枢神经系统，但另一方面存在侵入性极高的问题。
[0007] 作为使高分子物质通过血脑屏障而到达脑内的方法，报道了多种按照与存在于脑内毛细血管的内皮细胞上的膜蛋白具有亲和性的方式来修饰高分子物质的方法。作为存在于脑内毛细血管的内皮细胞上的膜蛋白，可以列举胰岛素、转铁蛋白、胰岛素样生长因子(IGF-I，IGF-II)、LDL、来普汀(leptin)等化合物的受体。
[0008] 例如报道了如下技术：将神经生长因子(NGF)以与胰岛素的融合蛋白的形态合成，通过与胰岛素受体的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4～6)。此外报道了如下技术：将神经生长因子(NGF)以与抗胰岛素受体抗体的融合蛋白的形态合成，通过与胰岛素受体的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4和7)。
[0009] 报道了如下技术：将脑源性神经营养因子(BDNF)以与抗胰岛素受体抗体的融合蛋白的形态合成，使该融合蛋白通过与胰岛素受体的结合而通过血脑屏障(非专利文献11)。报道了如下技术：将神经生长因子(NGF)以与转铁蛋白的融合蛋白的形态合成，通过与转铁蛋白受体(TfR)的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献8)。此外报道了如下技术：
将神经生长因子(NGF)以与抗转铁蛋白受体抗体(抗TfR抗体)的融合蛋白的形态合成，通过与TfR的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4和9)。此外报道了如下技术：将添加有聚乙二醇(PEG)的脑源性神经营养因子(BDNF)以通过链霉亲和素-生物素接头与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体抗体(抗TfR抗体)进行化学结合而成的缀合物的形态合成，在大鼠中，通过与TfR的结合而使该缀合物通过血脑屏障(非专利文献12)。
将神经生长因子(NGF)以与抗转铁蛋白受体抗体(抗TfR抗体)的融合蛋白的形态合成，通过与TfR的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4和9)。此外报道了如下技术：将添加有聚乙二醇(PEG)的脑源性神经营养因子(BDNF)以通过链霉亲和素-生物素接头与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体抗体(抗TfR抗体)进行化学结合而成的缀合物的形态合成，在大鼠中，通过与TfR的结合而使该缀合物通过血脑屏障(非专利文献12)。
[0010] 报道了：对使用抗TfR抗体的技术进行进一步审视，在通过与抗TfR抗体结合而使药剂通过血脑屏障的技术中，在链霉亲和素的情况下可以使用单链抗体(非专利文献13)。此外报道了：与人TfR(hTfR)的解离常数较大的抗hTfR抗体(低亲和性抗hTfR抗体)可以制成药剂在通过血脑屏障的技术中适当利用(专利文献10和11，非专利文献14)。进一步报道了：与hTfR的亲和性依赖于pH而变化的抗TfR抗体可以作为用于使药剂通过血脑屏障的载体使用(专利文献12，非专利文献15)。
[0011] 现有技术文献
[0012] 专利文献
[0013] 专利文献1：日本特表2007-504166号公报
[0014] 专利文献2：日本特表2009-525963号公报
[0015] 专利文献3：日本特开2012-62312号公报
[0016] 专利文献4：美国专利5154924号公报
[0017] 专利文献5：日本特开2011-144178号公报
[0018] 专利文献6：美国专利2004/0101904号公报
[0019] 专利文献7：日本特表2006-511516号公报
[0020] 专利文献8：日本特开H06-228199号公报
[0021] 专利文献9：美国专利5977307号公报
[0022] 专利文献10：WO2012/075037
[0023] 专利文献11：WO2013/177062
[0024] 专利文献12：WO2012/143379
[0025] 非专利文献
[0026] 非专利文献1：Moses V.Chao.Nature Reviews Neuroscience.4.299-309(2003)[0027] 非专利文献2：Tabakman R.Progress in Brain Research.146.387-401(2004)[0028] 非专利文献3：Bollen E.Behavioural Brain Research.257C.8-12(2013)[0029] 非专利文献4：Altar C.Anthony.Journal of Neurochemistry.63.1021-32(1994)
[0030] 非专利文献5：Zuccato C.Progress in Neurobiology.81.294-330(2007)[0031] 非专利文献6：Dafang Wu.The Journal of the American Society for Experimental Neurotherapeutics.2.120-8(2005)
[0032] 非专利文献7：David M.Katz.The Handbook of Experimental Pharmacology.220.481-95(2014)
[0033] 非专利文献8：E.Castren.The Handbook of Experimental Pharmacology.220.461-79(2014)
[0034] 非专利文献9：Xie Y.J Control Release.105.106-19(2005)
[0035] 非专利文献10：Ou L.Mol Genet Metab.111.116-22(2014)
[0036] 非专利文献11：Ruben J.B.Biotechnology Bioengineering，97.1376-1386(2007)
[0037] 非专利文献12：Dafang W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96.254-259(1999)[0038] 非专利文献13：Li JY.Protein Engineering.12.787-96(1999)
[0039] 非专利文献14：Bien-Ly N.J Exp Med.211.233-44(2014)
[0040] 非专利文献15：Sada H.PLoS ONE.9.E96340(2014)
发明内容
[0041] 发明所要解决的问题
[0042] 在上述背景下，本发明的目的在于提供：使给药于血中的BDNF能够通过血脑屏障从而能够在脑内起作用的、抗TfR抗体与BDNF的融合蛋白；其制造方法；使用方法；以及，通过给药该融合蛋白而实现的、规定范围的疾病的预防和/或治疗方法。
[0043] 用于解决问题的方法
[0044] 在面对上述目的的研究中，本发明人反复进行了深入研究，结果发现，通过本说明书中详述的抗体制作方法得到的、识别hTfR的胞外区的抗人转铁蛋白受体抗体(抗hTfR抗体)在给药于血中时高效地通过血脑屏障，并且还发现，将该抗体与BDNF融合而成的融合蛋白也通过血脑屏障，从而完成了本发明。即，本发明提供以下方案。
[0045] 1.一种脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
[0046] (1)CDR1中含有序列号6或序列号7的氨基酸序列、CDR2中含有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号10的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0047] (2)CDR1中含有序列号11或序列号12的氨基酸序列、CDR2中含有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号15的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0048] (3)CDR1中含有序列号16或序列号17的氨基酸序列、CDR2中含有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列Lys-Val-Ser、且CDR3中含有序列号20的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0049] (4)CDR1中含有序列号21或序列号22的氨基酸序列、CDR2中含有序列号23或序列号24的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0050] (5)CDR1中含有序列号26或序列号27的氨基酸序列、CDR2中含有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号30的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0051] (6)CDR1中含有序列号31或序列号32的氨基酸序列、CDR2中含有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号35的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0052] (7)CDR1中含有序列号36或序列号37的氨基酸序列、CDR2中含有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列Gln-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号40的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0053] (8)CDR1中含有序列号41或序列号42的氨基酸序列、CDR2中含有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列Gly-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号45的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0054] (9)CDR1中含有序列号46或序列号47的氨基酸序列、CDR2中含有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列Phe-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号50的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0055] (10)CDR1中含有序列号51或序列号52的氨基酸序列、CDR2中含有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号55的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0056] (11)CDR1中含有序列号56或序列号57的氨基酸序列、CDR2中含有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号60的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0057] (12)CDR1中含有序列号61或序列号62的氨基酸序列、CDR2中含有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Ser-Ser、且CDR3中含有序列号65的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0058] (13)CDR1中含有序列号66或序列号67的氨基酸序列、CDR2中含有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、且CDR3中含有序列号70的氨基酸序列的氨基酸序列；和
[0059] (14)CDR1中含有序列号71或序列号72的氨基酸序列、CDR2中含有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、且CDR3中含有序列号75的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0060] 2.根据上述1的BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
[0061] (1)CDR1中含有序列号6的氨基酸序列、CDR2中含有序列号8的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号10的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0062] (2)CDR1中含有序列号11的氨基酸序列、CDR2中含有序列号13的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号15的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0063] (3)CDR1中含有序列号16的氨基酸序列、CDR2中含有序列号18的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号20的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0064] (4)CDR1中含有序列号21的氨基酸序列、CDR2中含有序列号23的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0065] (5)CDR1中含有序列号26的氨基酸序列、CDR2中含有序列号28的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号30的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0066] (6)CDR1中含有序列号31的氨基酸序列、CDR2中含有序列号33的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号35的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0067] (7)CDR1中含有序列号36的氨基酸序列、CDR2中含有序列号38的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号40的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0068] (8)CDR1中含有序列号41的氨基酸序列、CDR2中含有序列号43的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号45的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0069] (9)CDR1中含有序列号46的氨基酸序列、CDR2中含有序列号48的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号50的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0070] (10)CDR1中含有序列号51的氨基酸序列、CDR2中含有序列号53的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号55的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0071] (11)CDR1中含有序列号56的氨基酸序列、CDR2中含有序列号58的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号60的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0072] (12)CDR1中含有序列号61的氨基酸序列、CDR2中含有序列号63的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号65的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0073] (13)CDR1中含有序列号66的氨基酸序列、CDR2中含有序列号68的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号70的氨基酸序列的氨基酸序列；和
[0074] (14)CDR1中含有序列号71的氨基酸序列、CDR2中含有序列号73的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号75的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0075] 3.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与上述1或2中的任一轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
[0076] 4.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与上述1或2中的任一轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
[0077] 5.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述1或2的任一轻链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0078] 6.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述1或2的任一轻链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0079] 7.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
[0080] (1)CDR1中含有序列号76或序列号77的氨基酸序列、CDR2中含有序列号78或序列号79的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号80或序列号81的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0081] (2)CDR1中含有序列号82或序列号83的氨基酸序列、CDR2中含有序列号84或序列号85的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号86或序列号87的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0082] (3)CDR1中含有序列号88或序列号89的氨基酸序列、CDR2中含有序列号90或序列号91的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号92或序列号93的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0083] (4)CDR1中含有序列号94或序列号95的氨基酸序列、CDR2中含有序列号96或序列号97的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号98或序列号99的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0084] (5)CDR1中含有序列号100或序列号101的氨基酸序列、CDR2中含有序列号102或序列号103的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号104或序列号105的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0085] (6)CDR1中含有序列号106或序列号107的氨基酸序列、CDR2中含有序列号108的氨基酸序列或序列号266的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号109或序列号110的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0086] (7)CDR1中含有序列号111或序列号112的氨基酸序列、CDR2中含有序列号113或序列号114的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号115或序列号116的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0087] (8)CDR1中含有序列号117或序列号118的氨基酸序列、CDR2中含有序列号119的氨基酸序列或序列号267的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号120或序列号121的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0088] (9)CDR1中含有序列号122或序列号123的氨基酸序列、CDR2中含有序列号124或序列号125的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号126或序列号127的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0089] (10)CDR1中含有序列号128或序列号129的氨基酸序列、CDR2中含有序列号130或序列号131的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号132或序列号133的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0090] (11)CDR1中含有序列号134或序列号135的氨基酸序列、CDR2中含有序列号136或序列号137的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号138或序列号139的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0091] (12)CDR1中含有序列号140或序列号141的氨基酸序列、CDR2中含有序列号142或序列号143的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号144或序列号145的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0092] (13)CDR1中含有序列号146或序列号147的氨基酸序列、CDR2中含有序列号148或序列号149的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号150或序列号151的氨基酸序列的氨基酸序列；和
[0093] (14)CDR1中含有序列号152或序列号153的氨基酸序列、CDR2中含有序列号154或序列号155的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号156或序列号157的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0094] 8.根据上述7的BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
[0095] (1)CDR1中含有序列号76的氨基酸序列、CDR2中含有序列号78的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号80的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0096] (2)CDR1中含有序列号82的氨基酸序列、CDR2中含有序列号84的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号86的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0097] (3)CDR1中含有序列号88的氨基酸序列、CDR2中含有序列号90的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号92的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0098] (4)CDR1中含有序列号94的氨基酸序列、CDR2中含有序列号96的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号98的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0099] (5)CDR1中含有序列号100的氨基酸序列、CDR2中含有序列号102的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号104的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0100] (6)CDR1中含有序列号106的氨基酸序列、CDR2中含有序列号108的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号109的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0101] (7)CDR1中含有序列号111的氨基酸序列、CDR2中含有序列号113的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号115的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0102] (8)CDR1中含有序列号117的氨基酸序列、CDR2中含有序列号119的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号120的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0103] (9)CDR1中含有序列号122的氨基酸序列、CDR2中含有序列号124的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号126的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0104] (10)CDR1中含有序列号128的氨基酸序列、CDR2中含有序列号130的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号132的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0105] (11)CDR1中含有序列号134的氨基酸序列、CDR2中含有序列号136的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号138的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0106] (12)CDR1中含有序列号140的氨基酸序列、CDR2中含有序列号142的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号144的氨基酸序列的氨基酸序列；
[0107] (13)CDR1中含有序列号146的氨基酸序列、CDR2中含有序列号148的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号150的氨基酸序列的氨基酸序列；和
[0108] (14)CDR1中含有序列号152的氨基酸序列、CDR2中含有序列号154的氨基酸序列、且CDR3中含有序列号156的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0109] 9.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与上述7或8中的任一重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
[0110] 10.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与上述7或8中的任一重链的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
[0111] 11.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述7或8的任一重链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0112] 12.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述7或8的任一重链的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0113] 13.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区和重链的可变区选自由以下的(1)～(14)组成的组：
[0114] (1)轻链的可变区的CDR1含有序列号6或序列号7的氨基酸序列、CDR2含有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号10的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号76或序列号77的氨基酸序列、CDR2含有序列号78或序列号79的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号80或序列号81的氨基酸序列；
[0115] (2)轻链的可变区的CDR1含有序列号11或序列号12的氨基酸序列、CDR2含有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号15的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号82或序列号83的氨基酸序列、CDR2含有序列号84或序列号85的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号86或序列号87的氨基酸序列；
[0116] (3)轻链的可变区的CDR1含有序列号16或序列号17的氨基酸序列、CDR2含有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列Lys-Val-Ser、以及CDR3含有序列号20的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号88或序列号89的氨基酸序列、CDR2含有序列号90或序列号91的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号92或序列号93的氨基酸序列；
[0117] (4)轻链的可变区的CDR1含有序列号21或序列号22、CDR2含有序列号23或序列号24的氨基酸序列或Asp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号94或序列号95的氨基酸序列、CDR2含有序列号96或序列号97的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号98或序列号99的氨基酸序列；
[0118] (5)轻链的可变区的CDR1含有序列号26或序列号27的氨基酸序列、CDR2含有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号30的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号100或序列号101的氨基酸序列、CDR2含有序列号102或序列号103的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号104或序列号105的氨基酸序列；
[0119] (6)轻链的可变区的CDR1含有序列号31或序列号32的氨基酸序列、CDR2含有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号35的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号106或序列号107的氨基酸序列、CDR2含有序列号108或序列号266的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号109或序列号110的氨基酸序列；
[0120] (7)轻链的可变区的CDR1含有序列号36或序列号37的氨基酸序列、CDR2含有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列Gln-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号40的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号111或序列号112的氨基酸序列、CDR2含有序列号113或序列号114的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号115或序列号116的氨基酸序列，[0121] (8)轻链的可变区的CDR1含有序列号41或序列号42的氨基酸序列、CDR2含有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列Gly-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号45的氨基酸序列，CDR1重链的可变区含有序列号117或序列号118的氨基酸序列、CDR2含有序列号119或序列号267的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号120或序列号121的氨基酸序列；
[0122] (9)轻链的可变区的CDR1含有序列号46或序列号47的氨基酸序列、CDR2含有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列Phe-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号50的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号122或序列号123的氨基酸序列、CDR2含有序列号124或序列号125的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号126或序列号127的氨基酸序列；
[0123] (10)轻链的可变区的CDR1含有序列号51或序列号52的氨基酸序列、CDR2含有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号55的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号128或序列号129的氨基酸序列、CDR2含有序列号130或序列号131的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号132或序列号133的氨基酸序列；
[0124] (11)轻链的可变区的CDR1含有序列号56或序列号57的氨基酸序列、CDR2含有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号60的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号134或序列号135的氨基酸序列、CDR2含有序列号136或序列号137的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号138或序列号139的氨基酸序列；
[0125] (12)轻链的可变区的CDR1含有序列号61或序列号62的氨基酸序列、CDR2含有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Ser-Ser、以及CDR3含有序列号65的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号140或序列号141的氨基酸序列、CDR2含有序列号142或序列号143的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号144或序列号145的氨基酸序列；
[0126] (13)轻链的可变区的CDR1含有序列号66或序列号67的氨基酸序列、CDR2含有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser、以及CDR3含有序列号70的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号146或序列号147的氨基酸序列、CDR2含有序列号148或序列号149的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号150或序列号151的氨基酸序列；和[0127] (14)轻链的可变区的CDR1含有序列号71或序列号72的氨基酸序列、CDR2含有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser、以及CDR3含有序列号75的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1含有序列号152或序列号153的氨基酸序列、CDR2含有序列号
154或序列号155的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号156或序列号157的氨基酸序列。
154或序列号155的氨基酸序列、以及CDR3含有序列号156或序列号157的氨基酸序列。
[0128] 14.根据上述13的BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区和重链的可变区选自由以下的(1)～(14)组成的组：
[0129] (1)轻链的可变区的CDR1中含有序列号6的氨基酸序列、CDR2中含有序列号8的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号10的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号76的氨基酸序列、CDR2中含有序列号78的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号80的氨基酸序列；
[0130] (2)轻链的可变区的CDR1中含有序列号11的氨基酸序列、CDR2中含有序列号13的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号15的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号82的氨基酸序列、CDR2中含有序列号84的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号86的氨基酸序列；
[0131] (3)轻链的可变区的CDR1中含有序列号16的氨基酸序列、CDR2中含有序列号18的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号20的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号88的氨基酸序列、CDR2中含有序列号90的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号92的氨基酸序列；
[0132] (4)轻链的可变区的CDR1中含有序列号21的氨基酸序列、CDR2中含有序列号23的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号25的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号94的氨基酸序列、CDR2中含有序列号96的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号98的氨基酸序列；
[0133] (5)轻链的可变区的CDR1中含有序列号26的氨基酸序列、CDR2中含有序列号28的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号30的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号100的氨基酸序列、CDR2中含有序列号102的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号104的氨基酸序列；
[0134] (6)轻链的可变区的CDR1中含有序列号31的氨基酸序列、CDR2中含有序列号33的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号35的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号106的氨基酸序列、CDR2中含有序列号108的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号109的氨基酸序列；
[0135] (7)轻链的可变区的CDR1中含有序列号36的氨基酸序列、CDR2中含有序列号38的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号40的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号111的氨基酸序列、CDR2中含有序列号113的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号115的氨基酸序列；
[0136] (8)轻链的可变区的CDR1中含有序列号41的氨基酸序列、CDR2中含有序列号43的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号45的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号117的氨基酸序列、CDR2中含有序列号119的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号120的氨基酸序列；
[0137] (9)轻链的可变区的CDR1中含有序列号46的氨基酸序列、CDR2中含有序列号48的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号50的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号122的氨基酸序列、CDR2中含有序列号124的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号126的氨基酸序列；
[0138] (10)轻链的可变区的CDR1中含有序列号51的氨基酸序列、CDR2中含有序列号53的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号55的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号128的氨基酸序列、CDR2中含有序列号130的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号132的氨基酸序列；
[0139] (11)轻链的可变区的CDR1中含有序列号56的氨基酸序列、CDR2中含有序列号58的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号60的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号134的氨基酸序列、CDR2中含有序列号136的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号138的氨基酸序列；
[0140] (12)轻链的可变区的CDR1中含有序列号61的氨基酸序列、CDR2中含有序列号63的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号65的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号140的氨基酸序列、CDR2中含有序列号142的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号144的氨基酸序列；
[0141] (13)轻链的可变区的CDR1中含有序列号66的氨基酸序列、CDR2中含有序列号68的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号70的氨基酸序列，重链的可变区的CDR1中含有序列号146的氨基酸序列、CDR2中含有序列号148的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号150的氨基酸序列；和
[0142] (14)轻链的可变区的CDR1中含有序列号71的氨基酸序列、CDR2中含有序列号73的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号75的氨基酸序列，并且，重链的可变区的CDR1中含有序列号152的氨基酸序列、CDR2中含有序列号154的氨基酸序列、以及CDR3中含有序列号156的氨基酸序列。
[0143] 15.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列具有80％以上的同源性。
[0144] 16.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列与上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR1、CDR2和CDR3的各氨基酸序列具有90％以上的同源性。
[0145] 17.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0146] 18.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的CDR的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0147] 19.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号158、序列号159、序列号160、序列号161、序列号162和序列号163的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且重链的可变区含有选自由序列号166、序列号167、序列号168、序列号169、序列号170和序列号171的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列。
[0148] 20.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号174、序列号175、序列号176、序列号177、序列号178和序列号179的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且重链的可变区含有选自序列号182、序列号183、序列号184、序列号185、序列号186和序列号187的氨基酸序列中的任一氨基酸序列。
[0149] 21.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号190、序列号191、序列号192、序列号193、序列号194和序列号195的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且重链的可变区含有选自由序列号204、序列号205、序列号206、序列号207、序列号208和序列号209的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列。
[0150] 22.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其选自由以下的(1a)～(3d)组成的组：
[0151] (1a)该抗体的轻链的可变区含有序列号163的氨基酸序列、且重链的可变区含有序列号171的氨基酸序列的融合蛋白，
[0152] (2a)该抗体的轻链的可变区含有序列号179的氨基酸序列、且重链的可变区含有序列号187的氨基酸序列的融合蛋白，
[0153] (3a)该抗体的轻链的可变区含有序列号191的氨基酸序列、且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的融合蛋白，
[0154] (3b)该抗体的轻链的可变区含有序列号193的氨基酸序列、且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的融合蛋白，
[0155] (3c)该抗体的轻链的可变区含有序列号194的氨基酸序列、且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的融合蛋白，和
[0156] (3d)该抗体的轻链的可变区含有序列号195的氨基酸序列、且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的融合蛋白。
[0157] 23.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其选自由以下的(1b)～(31)组成的组：
[0158] (1b)该抗体的轻链含有序列号164的氨基酸序列且该抗体的重链含有序列号172的氨基酸序列的融合蛋白，
[0159] (2b)该抗体的轻链含有序列号180的氨基酸序列且重链含有序列号188的氨基酸序列的融合蛋白，
[0160] (3e)该抗体的轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
[0161] (3f)该抗体的轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
[0162] (3g)该抗体的轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
[0163] (3h)该抗体的轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的融合蛋白，
[0164] (3i)该抗体的轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白，
[0165] (3j)该抗体的轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白，
[0166] (3k)该抗体的轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白，和
[0167] (3l)该抗体的轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的融合蛋白。
[0168] 24.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列与上述19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
[0169] 25.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列与上述19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
[0170] 26.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0171] 27.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述19～23中任一项的轻链的可变区的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0172] 28.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述19～23中任一项的重链的可变区的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0173] 29.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述19～23中任一项的重链的可变区的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0174] 30.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述19～23中任一项的构成轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列各自的氨基酸中、分别有1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0175] 31.一种BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其为上述19～23中任一项的构成轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列各自的氨基酸中、分别有1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的融合蛋白。
[0176] 32.根据上述1～31中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF结合于该抗体的轻链的C末端侧或N末端侧。
[0177] 33.根据上述32的融合蛋白，其中，该BDNF直接或通过接头结合于该抗体的轻链的C末端侧或N末端侧。
[0178] 34.根据上述33的融合蛋白，其中，该接头是由1～50个氨基酸残基构成的肽。
[0179] 35.一种融合蛋白，该接头是含有选自由甘氨酸、丝氨酸、氨基酸序列(Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)、序列号3、序列号4、序列号5和1～10个这些氨基酸序列连接而成的序列组成的组中的氨基酸序列的肽。
[0180] 36.根据上述1～31中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF结合于该抗体的重链的C末端侧或N末端侧。
[0181] 37.根据上述36的融合蛋白，其中，该BDNF直接或通过接头结合于该抗体的重链的C末端侧或N末端侧。
[0182] 38.根据上述37的融合蛋白，其中，该接头是由1～50个氨基酸残基构成的肽。
[0183] 39.根据上述37的融合蛋白，其中，该接头是含有选自由氨基酸序列(Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)、序列号3、序列号4和序列号5组成的组中的氨基酸序列的肽。
[0184] 40.根据上述1～39中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF为人BDNF。
[0185] 41.根据上述40的融合蛋白，其中，该人BDNF含有序列号247的氨基酸序列或与其实质上一致的氨基酸序列、或者具有与序列号247所示的蛋白质同一性质的功能。
[0186] 42.根据上述1～41中任一项的融合蛋白，其对人转铁蛋白受体的胞外区和猴转铁蛋白受体的胞外区这两者具有亲和性。
[0187] 43.根据上述42的融合蛋白，其中，该抗转铁蛋白受体抗体与人转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为1×10-8M以下，与猴转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为5×10-8M以下。
[0188] 44.根据上述40的融合蛋白，其选自由以下的(1)～(4)组成的组：
[0189] (1)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号164的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号248所示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0190] (2)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号180的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号250所示的氨基酸序列的融合蛋白；和
[0191] (3)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号196的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号252所示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0192] (4)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号196的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列与人BDNF结合且整体具有序列号254所示的氨基酸序列的融合蛋白，所述接头序列由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。
[0194] 46.根据上述45所述的融合蛋白，其中，在抗原结合性片段的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0195] 47.根据上述45或46所述的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为单链抗体。
[0196] 48.根据上述47所述的融合蛋白，其中，该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链可变区和重链可变区通过将轻链和重链结合的接头序列而结合。
[0197] 49.根据上述48所述的融合蛋白，其中，在该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链可变区的C末端侧通过将轻链和重链结合的接头序列而结合有该抗人转铁蛋白受体抗体的重链可变区。
[0198] 50.根据上述48所述的融合蛋白，其中，在该抗人转铁蛋白受体抗体的重链可变区的C末端侧通过将轻链和重链结合的接头序列而结合有该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链可变区。
[0199] 51.根据上述48～50所述的融合蛋白，其中，该将轻链和重链结合的接头序列由2～50个氨基酸残基构成。
[0200] 52.根据上述51所述的融合蛋白，其中，该将轻链和重链结合的接头序列含有选自由氨基酸序列(Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)、氨基酸序列(Gly-Gly-Gly)、序列号3、序列号4、序列号5和2～10个这些氨基酸序列连接而成的序列组成的组中的氨基酸序列。
[0201] 53.根据上述47～52所述的融合蛋白，其中，单链抗体是含有具有序列号205的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号191的氨基酸序列的轻链可变区的单链抗体。
[0202] 54.根据上述53所述的融合蛋白，其中，单链抗体是由序列号257的氨基酸序列构成的单链抗体，在其N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0203] 55.根据上述54所述的融合蛋白，其含有序列号259的氨基酸序列，单链抗体为由序列号257的氨基酸序列构成的单链抗体且在其N末端侧通过接头结合有人前体BDNF。
[0204] 56.根据上述54所述的融合蛋白，其含有序列号260的氨基酸序列，单链抗体为由序列号257的氨基酸序列构成的单链抗体且在其N末端侧通过接头结合有人BDNF。
[0205] 57.根据上述45或46所述的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一种。
[0206] 58.根据上述57所述的融合蛋白，其中，在Fab、F(ab’)2或F(ab’)的任一重链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0207] 59.根据上述58所述的融合蛋白，其中，轻链由序列号196的氨基酸序列构成，且重链为由序列号261的氨基酸序列构成的Fab重链，在该重链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0208] 60.根据上述59所述的融合蛋白，其中，轻链由序列号196的氨基酸序列构成，并且由Fab重链和直接或通过接头结合在其N末端侧的人前体BDNF构成的部分由序列号263的氨基酸序列构成。
[0209] 61.根据上述59所述的融合蛋白，其中，轻链由序列号196的氨基酸序列构成，并且由Fab重链和直接或通过接头结在其N末端侧的人BDNF构成的部分由序列号264的氨基酸序列构成。
[0210] 62.一种DNA片段，其编码上述1～61中任一项的融合蛋白。
[0211] 63.一种表达载体，其整合有上述62的DNA片段。
[0213] 65.一种药剂，其为用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的药剂，其含有上述1～61中任一项的融合蛋白作为有效成分。
[0214] 66.根据上述65的药剂，其中，该疾病或障碍为神经系统的疾病或障碍。
[0215] 67.根据上述66的药剂，其中，该神经系统的疾病或障碍为神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症、癫痫、自闭症、Rett综合症、West综合症、新生儿惊厥、痴呆伴发问题行为、焦虑症、疼痛、先天性巨结肠或快速眼动睡眠行为障碍。
[0216] 68.根据上述67的药剂，其中，该神经退行性疾病为脑神经退行性疾病、脊髓退行性疾病、视网膜退行性疾病或周围神经退行性疾病。
[0217] 69.根据上述68的药剂，其中，该脑神经退行性疾病为脑神经系统的神经退行性疾病、脑缺血性疾病、创伤性脑损伤、脑白质病或多发性硬化症。
[0218] 70.根据上述69的药剂，其中，该脑神经系统的神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、路易体型痴呆、匹克氏病、多系统萎缩症、进行性上行性麻痹或唐氏综合症。
[0219] 71.上述1～61中任一项的融合蛋白在预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍中的应用。
[0220] 72.上述1～61中任一项的融合蛋白在制造用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的药物中的应用。
[0221] 73.一种预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的方法，其含有如下步骤：向具有该疾病或障碍的患者的血中给药含有治疗上有效量的上述1～61中任一项的融合蛋白的药物组合物。
[0222] 发明效果
[0223] 本发明中，对于不能通过血脑屏障的脑源性神经营养因子(BDNF)，通过使其形成与特定的抗hTfR抗体的融合蛋白的形态，能够通过血脑屏障。因此，通过将BDNF以这种融合蛋白的形态通过静脉注射等给药于血中，能够使其作用于中枢神经系统。附图说明
[0224] 图1是示出单次静脉内给药抗hTfR抗体后的、食蟹猴的大脑皮层的针对抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为未给药抗hTfR抗体的大脑皮层的染色图，(b)为给药抗hTfR抗体号1后的大脑皮层的染色图，(c)为给药抗hTfR抗体号2后的大脑皮层的染色图，(d)为给药抗hTfR抗体号3后的大脑皮层的染色图。各照片右下方的线条为表示50μm的标尺。
[0225] 图2是示出单次静脉内给药抗hTfR抗体后的、食蟹猴的海马的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为未给药抗hTfR抗体的海马的染色图，(b)为给药抗hTfR抗体号1后的海马的染色图，(c)为给药抗hTfR抗体号2后的海马的染色图，(d)为给药抗hTfR抗体号3后的海马的染色图。各照片右下方的线条为表示50μm的标尺。
[0226] 图3是示出单次静脉内给药抗hTfR抗体后的、食蟹猴的小脑的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为未给药抗hTfR抗体的小脑的染色图，(b)为给药抗hTfR抗体号1后的小脑的染色图，(c)为给药抗hTfR抗体号2后的小脑的染色图，(d)为给药抗hTfR抗体号3后的小脑的染色图。各照片右下方的线条为表示50μm的标尺。
[0227] 图4是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的脑以外的各种脏器中的人源化抗hTfR抗体的累积量的图。纵轴表示各脏器的单位湿重中人源化抗hTfR抗体的量(μg/g湿重)。白柱从左侧起依次表示给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)后的猴的各脏器中的累积量，黑柱表示给TM药曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin) )后的猴的各脏器中的累积量。ND表示未测定。
[0228] 图5是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的大脑皮层的针对人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为给药赫赛汀后的大脑皮层的染色图，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3后的大脑皮层的染色图，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2后的大脑皮层的染色图，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)后的大脑皮层的染色图，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)后的大脑皮层的染色图。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
[0229] 图6是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的海马的针对人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)为给药赫赛汀后的海马的染色图，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3后的海马的染色图，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2后的海马的染色图，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)后的海马的染色图，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)后的海马的染色图。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
[0230] 图7是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的小脑的针对人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)为给药赫赛汀后的小脑的染色图，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3后的小脑的染色图，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2后的小脑的染色图，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)后的小脑的染色图，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)后的小脑的染色图。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
[0231] 图8是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的延髓的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为给药赫赛汀后的延髓的染色图，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3后的延髓的染色图，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2后的延髓的染色图，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)后的延髓的染色图，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)后的延髓的染色图。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
具体实施方式
[0232] 在本发明中，“抗体”这一术语主要是指人抗体、小鼠抗体、人源化抗体、人抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体和小鼠抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体中的任意一种，但只要具有与特定的抗原特异性结合的性质则不限于这些抗体，此外，对抗体的动物种属也没有特别限制。其中，优选的是人源化抗体。
[0233] 在本发明中，“人抗体”这一术语是指其蛋白质全体由源自人的基因编码的抗体。但是，出于提升基因的表达效率等目的而在不使原始的氨基酸序列发生改变的条件下在原始的人的基因中引入了变异的基因所编码的抗体也包含在“人抗体”中。此外，将编码人抗体的2个以上的基因组合、将某一人抗体的一部分置换为另一人抗体的一部分而制作的抗体也为“人抗体”。人抗体具有免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)。免疫球蛋白轻链的3个CDR从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。免疫球蛋白重链的3个CDR也从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。通过将某一人抗体的CDR置换为另一人抗体的CDR而改变了人抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也包含在人抗体中。
[0234] 在本发明中，通过改变原始的人抗体的基因而在原始的抗体的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异的抗体也包含在“人抗体”中。在用其它氨基酸置换原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。在使原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，缺失的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。此外，引入了组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异的抗体也为人抗体。在添加氨基酸的情况下，在原始的抗体的氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～20个、更优选1～5个、进一步优选1～3个氨基酸。引入了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异的抗体也为人抗体。引入了变异的抗体的氨基酸序列与原始的抗体的氨基酸序列优选显示80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性，更进一步优选显示98％以上的同源性。即，在本发明中述及“源自人的基因”时，除了源自人的原始的基因以外，还包含通过对其施加改变而得到的基因。
[0235] 在本发明中，在述及“小鼠抗体”时，是指其蛋白质全体由源自小鼠的基因编码的抗体。但是，出于提升基因的表达效率等目的而在不使原始的氨基酸序列发生改变的条件下在原始的小鼠的基因中引入了变异后的基因所编码的抗体也包含在“小鼠抗体”中。此外，将编码小鼠抗体的2个以上的基因组合、将某一小鼠抗体的一部分置换为另一小鼠抗体的一部分而得到的抗体也包含在小鼠抗体中。小鼠抗体具有免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)。免疫球蛋白轻链的3个CDR从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。免疫球蛋白重链的3个CDR从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。例如，通过将某一小鼠抗体的CDR置换为另一小鼠抗体的CDR而改变了小鼠抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也包含在小鼠抗体中。
[0236] 在本发明中，通过改变原始的小鼠抗体的基因而在原始的抗体的氨基酸序列引入了置换、缺失、添加等变异的抗体也包含在“小鼠抗体”中。在用其它氨基酸置换原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。在使原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。此外，引入了组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异的抗体也包含在“小鼠抗体”中。在添加氨基酸的情况下，在原始的抗体的氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～20个、更优选1～5个、进一步优选1～3个氨基酸。引入了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异的抗体也包含在“小鼠抗体”中。引入了变异的抗体的氨基酸序列与原始的抗体的氨基酸序列优选显示80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性，更进一步优选显示98％以上的同源性。即，在本发明中述及“源自小鼠的基因”时，除了源自小鼠的原始的基因以外，还包含通过对其施加改变而得到的基因。
[0237] 在本发明中，“人源化抗体”这一术语是指：可变区的一部分(例如，特别是CDR的全部或一部分)的氨基酸序列源自人以外的哺乳动物、除此以外的区域源自人的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举通过将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)置换为其它哺乳动物的CDR而制作的抗体。成为被移植到人抗体的合适位置的CDR的来源的其它哺乳动物的生物种属，只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，进一步优选为小鼠。
[0238] 在本发明中，“嵌合抗体”这一术语是指：来自2个以上的不同种属的、2个以上的不同的抗体片段连接成的抗体。
[0239] 人抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指：人抗体的一部分被置换为人以外的哺乳动物的抗体的一部分而得到的抗体。抗体由以下说明的Fc区、Fab区和铰链区构成。作为这样的嵌合抗体的具体例子，可以列举Fc区源自人抗体而Fab区源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或其它哺乳动物的抗体中的任意一者。相反地，可以列举Fc区源自其它哺乳动物而Fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或其它哺乳动物的抗体中的任意一者。
[0240] 此外，也可以说抗体由可变区和恒定区构成。作为嵌合抗体的其他具体例子，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(C1)源自人抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(C1)源自其它哺乳动物的抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自人抗体的嵌合抗体。在此，其它哺乳动物的生物种属只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，例如小鼠。
[0241] 小鼠抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指：小鼠抗体的一部分被置换为小鼠以外的哺乳动物的抗体的一部分而得到的抗体。作为这样的嵌合抗体的具体例子，可以列举Fc区源自小鼠抗体而Fab区源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举Fc区源自其它哺乳动物而Fab区源自小鼠抗体的嵌合抗体。在此，其它哺乳动物的生物种属优选为人。
[0242] 人抗体与小鼠抗体的嵌合抗体特指“人/小鼠嵌合抗体”。人/小鼠嵌合抗体中，可以列举Fc区源自人抗体而Fab区源自小鼠抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举Fc区源自小鼠抗体而Fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或小鼠抗体中的任意一者。作为人/小鼠嵌合抗体的其他具体例子，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(C1)源自人抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自小鼠抗体的人/小鼠嵌合抗体，相反地，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(C1)源自小鼠抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自人抗体的人/小鼠嵌合抗体。
[0243] 抗体原本具有由2条免疫球蛋白轻链和2条免疫球蛋白重链共计4条多肽链构成的基本结构。但是，在本发明中，述及“抗体”时，不仅包含具有该基本结构的抗体，[0244] (1)由1条免疫球蛋白轻链和1条免疫球蛋白重链共计2条多肽链构成的抗体，以及如以下详述的
[0245] (2)在免疫球蛋白轻链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白重链而成的单链抗体，和
[0246] (3)在免疫球蛋白重链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体，而且，
[0247] (4)从本来意义上的抗体的基本结构中缺失了Fc区的由Fab区构成的抗体以及由Fab区和铰链区的全部或一部分构成的抗体(包括Fab、F(ab’)和F(ab’)2)也包含在本发明的“抗体”中。
[0248] 在此，Fab是指：含有可变区和CL区域(轻链的恒定区)的轻链以及含有可变区和CH1区域(重链的恒定区的部分1)的重链以各自中存在的半胱氨酸残基彼此通过二硫键结合而得到的分子。在Fab中，重链除了可变区和CH1区域(重链的恒定区的部分1)以外可以进一步含有铰链区的一部分，但此时的铰链区缺失了存在于铰链区且使抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基。在Fab中，轻链和重链通过二硫键结合，所述二硫键形成于存在于轻链的恒定区(CL区域)的半胱氨酸残基和存在于重链的CH1区域或铰链区的半胱氨酸残基之间。Fab缺失了存在于铰链区且使抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基，由1条轻链和1条重链构成。在F(ab’)中，其重链除了可变区和CH1区域以外还含有具有使重链彼此结合的半胱氨酸残基的铰链区的全部或一部分。F(ab’)2是指；2个F(ab’)以存在于相互的铰链区中的半胱氨酸残基彼此通过二硫键结合而得到的分子。此外，多个抗体直接或通过接头结合而得到的二聚体、三聚体等聚合物也是抗体。进而，不限于这些，含有免疫球蛋白分子的一部分且具有与抗原特异性结合的性质的物质均包含在本发明所述的“抗体”中。即，在本发明中，述及免疫球蛋白轻链时，含有源自免疫球蛋白轻链的具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列物质。此外，述及免疫球蛋白重链时，包含源自免疫球蛋白重链的具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列的物质。因此，只要具有可变区的全部或一部分氨基酸序列，则例如Fc区缺失的物质也是免疫球蛋白重链。
[0249] 此外，在此，Fc或Fc区是指：抗体分子中的、含有由CH2区域(重链的恒定区的部分2)和CH3区域(重链的恒定区的部分3)构成的片段的区域。Fc或Fc区除了CH2区域和CH3区域以外还可以含有铰链区的一部分。
[0250] 进而，在本发明中，在述及“抗体”时，还包含：
[0251] (5)将构成上述(4)所示的Fab、F(ab’)或F(ab’)2的轻链和重链通过接头序列结合而分别形成的单链抗体scFab、scF(ab’)和scF(ab’)2。在此，就scFab、scF(ab’)和scF(ab’)2而言，可以在轻链的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合重链，此外，也可以在重链的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合轻链。进而，使轻链的可变区和重链的可变区通过接头序列结合而形成的单链抗体scFv也包含在本发明的抗体中。就scFv而言，可以使轻链的可变区的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合重链的可变区，此外，也可以使重链的可变区的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合轻链的可变区。
[0252] 进而，本说明书中所述的“抗体”中，除了全长抗体、上述(1)～(3)所示的抗体以外，还包含作为涵盖了上述(4)和(5)的概念的、全长抗体的一部分缺损的抗原结合性片段(抗体片段)的任一形态。
[0253] “抗原结合性片段”这一术语是指保持了与抗原的特异性结合活性的至少一部分的抗体片段。作为结合性片段的例子，除了例如上述(4)和(5)所示的例子以外，还包含：可变区(Fv)、以适当的接头将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接而成的单链抗体(scFv)、作为含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的多肽的二聚体的双链抗体、作为在scFv的重链(H链)上结合有恒定区的一部分(CH3)的肽的二聚体的微抗体(Minibody)、其它低分子化抗体等。但是，只要具有与抗原的结合能力则不限于这些分子。此外，这些结合性片段不仅包含将抗体蛋白的全长分子用适当的酶处理而得到的产物，也包含使用经基因工程方法改变后的抗体基因在适当的宿主细胞中产生的蛋白质。
[0254] 在本发明中，在述及“单链抗体”时，是指在含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质。例如，上述(2)、(3)和(5)所示的抗体包含在单链抗体中。此外，在含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质也是本发明中的“单链抗体”。就在免疫球蛋白重链的C末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体而言，通常免疫球蛋白重链的Fc区是缺失的。免疫球蛋白轻链的可变区具有3个与抗体的抗原特异性相关的互补性决定区(CDR)。同样，免疫球蛋白重链的可变区也具有3个CDR。这些CDR为决定抗体的抗原特异性的主要区域。因此，优选单链抗体中含有免疫球蛋白重链的全部3个CDR和免疫球蛋白轻链的全部3个CDR。但是，只要可维持抗体的抗原特异性的亲和性，则也可以设为缺失了1个或多个CDR的单链抗体。
[0255] 在单链抗体中，配置于免疫球蛋白的轻链和重链之间的接头序列为由优选2～50个、更优选8～50个、进一步优选10～30个、更进一步优选12～18个或15～25个、例如15个或25个氨基酸残基构成的肽链。就这种接头序列而言，只要用其连接两条链而成的抗hTfR抗体可保持对hTfR的亲和性则对其氨基酸序列没有限定，优选仅由甘氨酸构成或由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如：含有氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)或者相当于2～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的序列的序列的接头序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的C末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区时，优选含有由相当于3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号
3)连接而成的序列的、共计15个氨基酸构成的接头序列的接头。
3)连接而成的序列的、共计15个氨基酸构成的接头序列的接头。
[0256] 在本发明中，“人转铁蛋白受体”或“hTfR”这一术语是指具有序列号1的氨基酸序列的膜蛋白。在本发明的一个实施方式中，应与BDNF融合的抗hTfR抗体是与序列号1的氨基酸序列中从N末端起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的部分(hTfR的胞外区)特异性结合的抗体，但不限于此。此外，在本发明中，“猴转铁蛋白受体”或“猴TfR”这一术语，特指源自食蟹猴(Macaca fascicularis)的、具有序列号2的氨基酸序列的膜蛋白。在实施方式之一中，本发明的抗hTfR抗体是还与序列号2的氨基酸序列中从N末端起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的部分(猴TfR的胞外区)结合的抗体，但不限于此。
[0257] 作为针对hTfR的抗体的制作方法，通常为如下方法：使用导入有整合了hTfR基因的表达载体的细胞，制作重组人转铁蛋白受体(rhTfR)，使用该rhTfR免疫小鼠等动物，从而得到。从免疫后的动物中取出产生针对hTfR的抗体的细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，由此，可以制作具有抗hTfR抗体产生能力的杂交瘤细胞。
[0258] 此外，利用体外免疫法以rhTfR免疫由小鼠等动物得到的免疫系统细胞，由此也可以获得产生针对hTfR的抗体的细胞。使用体外免疫法时，对该免疫系统细胞的来源动物种属没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、马和包括人在内的灵长类，更优选为小鼠、大鼠和人，进一步优选为小鼠和人。作为小鼠的免疫系统细胞，例如可以使用由小鼠的脾脏制备的脾细胞。作为人的免疫系统细胞，可以使用由人的外周血、骨髓、脾脏等制备的细胞。在利用体外免疫法免疫人的免疫系统细胞时，可以得到针对hTfR的人抗体。
[0259] 利用体外免疫法免疫免疫系统细胞后，使细胞与骨髓瘤细胞融合，由此，可以制作具有抗体产生能力的杂交瘤细胞。此外，还可以：从免疫后的细胞中提取mRNA并合成cDNA，以该cDNA为模板通过PCR反应扩增含有编码免疫球蛋白的轻链和重链的基因的DNA片段，使用这些人工再构建抗体基因。
[0260] 利用上述方法得到的状态的杂交瘤细胞中还含有产生将hTfR以外的蛋白质识别为抗原的抗体的细胞。此外，产生抗hTfR抗体的杂交瘤细胞未必全部都产生对hTfR显示高亲和性的抗hTfR抗体。
[0261] 同样，人工再构建的抗体基因中还含有编码将hTfR以外的蛋白质识别为抗原的抗体的基因。此外，编码抗hTfR抗体的基因未必全部具有编码对hTfR显示高亲和性的抗hTfR抗体等所期望的特性。
[0262] 因此，需要从上述得到的状态的杂交瘤细胞中选择出产生具有所期望的特性(对hTfR的高亲和性等)的抗体的杂交瘤细胞的步骤。此外，就人工再构建的抗体基因而言，需要从该抗体基因中选择出编码具有所期望的特性(对hTfR的高亲和性等)的抗体的基因的步骤。作为选择出产生对hTfR显示高亲和性的抗体(高亲和性抗体)的杂交瘤细胞或编码高亲和性抗体的基因的方法，以下详述的方法是有效的。需要说明的是，对hTfR显示高亲和性的抗体是指：利用实施例7中记载的方法测定出的与hTfR的解离常数(KD)优选为1×10-8M以下的抗体，更优选为1×10-9M以下的抗体，进一步优选为1×10-10以下抗体，另外进一步优选为1×10-11以下的抗体。例如，作为优选的例子，可以列举解离常数为1×10-13M～1×10-9M的抗体、1×10-13M～1×10-10的抗体。
[0263] 例如，在选择产生对抗hTfR抗体为高亲和性的抗体的杂交瘤细胞时可使用以下方法：将重组hTfR添加到板中并在其中保持后，添加杂交瘤细胞的培养上清，然后将不与重组hTfR结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。根据该方法，添加到板中的杂交瘤细胞的培养上清中所含的抗体对hTfR的亲和性越高，则保持在板中的抗体的量越多。因此，可以测定板中所保持的抗体的量，选择保持有更多抗体的板所对应的杂交瘤细胞来作为产生对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的细胞株。从这样选择出的细胞株中提取mRNA并合成cDNA，以该cDNA为模板使用PCR法来扩增含有编码抗hTfR抗体的基因的DNA片段，由此，还可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
[0264] 在从上述人工再构建的抗体基因中选择编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因时，暂时将人工再构建的抗体基因整合到表达载体中，将该表达载体导入到宿主细胞中。此时，就作为宿主细胞使用的细胞而言，只要是可以通过导入整合有人工再构建的抗体基因的表达载体而表达抗体基因的细胞，则不论原核细胞、真核细胞均可以，没有特别限定，优选源自人、小鼠、中国仓鼠等哺乳动物的细胞，特别优选源自中国仓鼠卵巣的CHO细胞或源自小鼠骨髓瘤的NS/0细胞。此外，用于整合并表达编码抗体基因的基因的表达载体，只要是导入到哺乳动物细胞内时表达该基因的载体则可以没有特别限定地使用。整合到表达载体中的该基因被配置于可以在哺乳动物细胞内调节基因转录频率的DNA序列(基因表达控制部位)的下游。作为本发明中可以使用的基因表达控制部位，可以列举例如：源自巨细胞病毒的启动子、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子等。
[0265] 导入有这样的表达载体的哺乳动物细胞能够表达整合到表达载体中的上述人工再构建的抗体。在从这样得到的表达人工再构建的抗体的细胞中选择产生对抗hTfR抗体具有高亲和性的抗体的细胞时可使用以下方法：将重组hTfR添加到板中并在其中保持后，使重组hTfR接触细胞的培养上清，然后将不与重组hTfR结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。根据该方法，细胞的培养上清中所含的抗体对hTfR的亲和性越高，则保持在板中的抗体的量越多。因此，可以测定保持在板中的抗体的量，选择保持有更多抗体的板所对应的细胞来作为产生对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的细胞株，进而，可以选择出编码对hTfR具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因。从这样选择出的细胞株中，将含有编码抗hTfR抗体的基因的DNA片段使用PCR法扩增，由此，可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
[0266] 关于从上述人工再构建的抗体基因中选择编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因，也可以如下进行：将人工再构建的抗体基因整合到表达载体中，将该表达载体导入到大肠杆菌中，使用培养该大肠杆菌而得到的培养上清或含有使大肠杆菌溶解而得到的抗体的溶液，通过与上述选择杂交瘤细胞时同样的方法来选择具有所期望的基因的大肠杆菌。所选择的大肠杆菌株是表达编码对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的基因的细胞株。可以从该细胞株中选择编码对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的基因。在使抗体分泌到大肠杆菌的培养上清中的情况下，按照在N末端侧结合分泌信号序列的方式将抗体基因整合到表达载体中即可。
[0267] 作为选择编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因的其他方法，有如下方法：使上述人工再构建的抗体基因所编码的抗体保持在噬菌体颗粒上并使其表达。此时，以编码单链抗体的基因的形式进行抗体基因的再构建。使抗体保持在噬菌体颗粒上的方法记载于国际公开公报(WO1997/09436，WO1995/11317)等中，是公知的。在从保持人工再构建的抗体基因所编码的抗体的噬菌体中选择保持对抗hTfR抗体具有高亲和性的抗体的噬菌体时，可使用以下方法：将重组hTfR添加到板中并保持后，使其接触噬菌体，然后从板中除去不与重组hTfR结合的噬菌体，测定板中所保持的噬菌体的量。根据该方法，保持在噬菌体颗粒上的抗体对hTfR的亲和性越高，则板中所保持的噬菌体的量越多。因此，可以测定板中所保持的噬菌体的量，选择保持有更多噬菌体的板所对应的噬菌体颗粒来作为产生对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的噬菌体颗粒，进而，可以选择出编码对hTfR具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因。从这样选择出的噬菌体颗粒中，将含有编码抗hTfR抗体的基因的DNA片段使用PCR法扩增，由此，可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
[0268] 利用使用了酶免疫测定法(EIA、ELISA)的直接和间接夹心分析、流式细胞术、表面等离子激元共振法(以下称为“SPR法”)、生物膜层干涉法(以下称为“BLI法”)或免疫沉降分析等公知的结合分析，可以选择出产生对hTfR具有高亲和性的抗体的杂交瘤细胞。可以：由该产生高亲和性抗体的细胞制备cDNA，以其为模板，将含有以下基因的DNA片段通过PCR法等扩增并分离，所述基因为编码抗hTfR抗体的轻链、抗hTfR抗体的重链或作为抗hTfR抗体的单链抗体的全部或其一部分的基因。同样地，还可以：将含有编码抗hTfR抗体的轻链的可变区的全部或其一部分的基因的DNA片段、含有编码抗hTfR抗体的重链的可变区的全部或其一部分的基因的DNA片段通过PCR法等扩增并分离。
[0269] 将该编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的轻链和重链的基因的全部或其一部分整合到表达载体中，使用该表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养所得到的转化细胞，由此，可以产生具有高亲和性的抗hTfR抗体。还可以：由分离出的编码抗hTfR抗体的基因的碱基序列翻译出抗hTfR抗体的氨基酸序列，人工合成出编码该氨基酸序列的DNA片段。在人工合成DNA片段时，还可以通过选择合适的密码子而使宿主细胞中的抗hTfR抗体的表达量增加。
[0270] 为了向原始的抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异，也可以向分离出的DNA片段中所含的编码抗hTfR抗体的基因中适宜引入变异。引入变异后的编码抗hTfR抗体的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。通过在氨基酸序列中引入变异，还可以改变与抗hTfR抗体结合的糖链数、糖链种类，从而增加抗hTfR抗体在生物体内的稳定性。
[0271] 在向编码抗hTfR抗体的轻链的可变区的全部或其一部分的基因中引入变异时，引入变异后的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。在用其它氨基酸置换轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使轻链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向轻链的可变区添加氨基酸时，向轻链的可变区的氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的轻链的可变区的氨基酸序列与原始的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。特别是在用其它氨基酸置换CDR的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在添加氨基酸时，向该氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个、更进一步优选1个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0272] 在向编码抗hTfR抗体的重链的可变区的全部或其一部分的基因中引入变异时，引入变异后的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。在用其它氨基酸置换重链的可变区的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，另外进一步优选为1～2个。在使重链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，另外进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向重链的可变区添加氨基酸时，向重链的可变区的氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的重链的可变区的氨基酸序列与原始的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。特别是在用其它氨基酸置换CDR的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在添加氨基酸时，向该氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个、更进一步优选1个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0273] 还可以将对上述抗hTfR抗体的轻链的可变区的变异和对上述抗hTfR抗体的重链的可变区的变异组合，在抗hTfR抗体的轻链和重链的可变区这两者中引入变异。
[0274] 作为上述抗hTfR抗体的轻链和重链的氨基酸序列中的氨基酸的利用其它氨基酸进行的置换，可以列举例如：作为酸性氨基酸的天冬氨酸与谷氨酸的相互置换、作为酰胺型氨基酸的天冬酰胺与谷氨酰胺的相互置换、作为碱基性氨基酸的赖氨酸与精氨酸的相互置换、作为支链氨基酸的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的相互置换、作为脂肪族氨基酸的甘氨酸与丙氨酸的相互置换、作为羟基氨基酸的丝氨酸与苏氨酸的相互置换、作为芳香族氨基酸的苯丙氨酸与酪氨酸的相互置换等。
[0275] 需要说明的是，在向抗hTfR抗体中引入变异而在C末端或N末端添加了氨基酸的情况下，如果该添加的氨基酸在使抗hTfR抗体与BDNF融合时位于抗hTfR抗体与BDNF之间，则该添加的氨基酸构成接头的一部分。关于抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白中配置在抗hTfR抗体与BDNF之间的接头序列，将在后文详述。
[0276] 培养利用上述方法等选择出的产生对hTfR具有较高亲和性的抗hTfR抗体的细胞而得到的抗hTfR抗体、以及使编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因表达而得到的抗hTfR抗体，也可以通过向其氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异而改变成具有所期望的特性的抗体。向抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入变异可通过向与其氨基酸序列对应的基因中引入变异来进行。
[0277] 抗hTfR抗体可以通过向该抗体的可变区的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异而适当调节抗体对hTfR的亲和性。例如，在抗体与抗原的亲和性高、在水性溶液中的解离常数显著低的情况下，将其给药于生物体内时，抗体不与抗原解离，其结果是可能产生功能上的不良情况。这种情况下，可通过向抗体的可变区引入变异而将解离常数阶梯性地调整为原始的抗体的2～5倍、5～10倍、10～100倍等，获得与目的相符的最优选的抗体。相反地，还可以通过该变异的引入将解离常数阶梯性地调整为原始的抗体的1/2～1/5倍、1/5～1/10倍、1/10～1/100倍等。
[0278] 向抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异例如可以如下进行：以编码抗hTfR抗体的基因为模板，利用PCR等方法向基因的碱基序列的特定位点引入变异或随机地引入变异。
[0279] 目的在于调整抗体与hTfR的亲和性的、向抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入变异例如可以如下进行：将编码作为单链抗体的抗hTfR抗体的基因整合到噬菌粒中，使用该噬菌粒制作在衣壳蛋白表面上表达单链抗体的噬菌体，一边通过使诱变剂等发挥作用而向编码单链抗体的基因上引入变异一边使噬菌体增殖，从增殖后的噬菌体中，利用上述方法选择出表达具有所期望的解离常数的单链抗体的噬菌体，或者通过在一定条件下使用抗原柱进行纯化而得到表达具有所期望的解离常数的单链抗体的噬菌体。
[0280] 由前述杂交瘤细胞产生的抗体利用实施例7中记载的方法测定的与hTfR的解离常数(KD)优选为1×10-8M以下，更优选为1×10-9M以下，进一步优选为1×10-10M以下，另外进一步优选为1×10-11M以下。例如，作为优选的例子，可以列举解离常数为1×10-13M～1×10-9M的抗体、为1×10-13M～1×10-10M的抗体。在抗体为单链抗体时也同样。对于暂且得到的抗体，可以进行向编码该抗体的基因中引入变异等适当改变以使其具有所期望的特性。
[0281] 通过从抗hTfR抗体中选择出对猴的TfR具有亲和性的抗体，可以得到对人和猴的TfR均有亲和性的抗体。对猴的TfR具有亲和性的抗体例如可以通过使用了重组猴TfR的ELISA法等进行选择，所述重组猴TfR使用基因重组技术制作。在该ELISA法中，将重组猴TfR添加到板中并在其中保持后，使其接触抗hTfR抗体，然后将不与重组猴TfR结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。对重组猴TfR的亲和性越高则保持在板中的抗体的量越多，因此，可以选择保持有更多抗体的板所对应的抗体作为对猴TfR具有亲和性的抗体。需要说明的是，这里所谓的“猴”优选为除人以外的被分类为类人猿的动物，更优选为被分类为猴科的动物，进一步优选为被分类为猕猴属的动物，例如食蟹猴或猕猴，特别是食蟹猴在用于评价方面更优选。
[0282] 对人和猴的hTfR均具有亲和性的抗体具有如下有利效果：可以使用猴观察给药该抗体与BDNF的融合蛋白时的生物体内的动态。例如，在对本发明的抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白进行药物开发时，由于可以用猴实施该药物的药代动力学研究，因此可以显著促进该药物的开发。
[0283] 对hTfR具有相对高的亲和性且对人和猴的TfR均具有亲和性的抗体，利用实施例7中记载的方法测定的与猴的TfR的解离常数优选为5×10-8M以下，更优选为2×10-8M以下，进一步优选为1×10-8M以下。例如，作为优选的例子，可以列举：解离常数为1×10-13M～2×-8 -13 -810 M的抗体、为1×10 M～2×10 M的抗体。抗体为单链抗体时也同样。
[0284] 在利用上述的选择出产生高亲和性抗体的细胞的方法得到的、对hTfR具有相对高的亲和性的抗体为人以外的动物的抗体的情况下，可以制成人源化抗体。人源化抗体是指：在维持对抗原的特异性的情况下、使用人以外的动物的抗体的可变区的一部分(例如特别是CDR的全部或一部分)的氨基酸序列、并将人抗体的合适区域用该序列置换(该序列向人抗体的移植)而得到的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)用其它哺乳动物的CDR置换而得到的抗体。整合到人抗体中的CDR的来源生物种属只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马、人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，进一步优选为小鼠。
[0285] 人源化抗体的制作方法在该技术领域中是公知的，最常规的是基于Winter等设计的将位于人抗体的可变区中的互补性决定区(CDR)的氨基酸序列置换为非人哺乳动物的抗体的CDR的方法(Verhoeyen M.Science.239.1534-1536(1988))的制作方法。在此，公知的是，为了再现供体抗体所具有的本来的活性，不仅利用非人哺乳动物的抗体的CDR、而且也利用参与CDR的结构保持或与抗原的结合的CDR外的区域的氨基酸序列来置换成为受体的人抗体的对应位置有时是必要的(Queen C.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86.10029-10033(1989)。在此，CDR外的区域也称为框架区(FR)。
[0286] 人源化抗体的制作包括如下操作：移植非人哺乳动物的抗体的CDR(和必要时其周边的FR)来代替人抗体的可变区CDR(和必要时其周边的FR)。在该操作中，成为基础的人抗体的可变区的框架区可以从含有种系抗体基因序列的公共DNA数据库等中得到。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列和氨基酸序列可以从“VBase”人生殖细胞系序列数据库(可以在互联网中用www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)中选择。此外，还可以从发表的文献、例如“Kabat EA.Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国保健福祉省，NIHPublication No.91-3242(1991)”、“Tomlinson IM.J.Mol.Biol.227.776-98(1992)”、“Cox JPL.Eur.J Immunol.24：827-836(1994)”等中记载的DNA序列和氨基酸序列中选择。
[0287] 如上所述，在人源化抗体中，被移植到原始的人抗体的可变区的非人哺乳动物的抗体区域通常含有CDR本身或CDR和其周边的FR。但是，与CDR一起被移植的FR也参与CDR的结构保持或与抗原的结合，认为实质上也具有决定抗体的互补性的功能，因此，在本发明中，“CDR”这一术语在制作人源化抗体时是指从非人哺乳动物的抗体中被移植到人源化抗体的区域或可被移植的区域。即，就CDR而言，即使是通常被视为FR的区域，只要其参与CDR的结构保持或与抗原的结合而被认为实质上具有决定抗体的互补性的功能，则在本发明中也包含在CDR中。
[0288] 就本发明中的抗hTfR抗体而言，在通过静脉注射等将其给药于生物体内时，可以与存在于脑内的毛细血管的内皮细胞上的hTfR高效地结合。此外，与hTfR结合后的抗体通过胞吞作用、转胞吞作用等机制通过血脑屏障而被摄入脑内。因此，通过预先使BDNF与本发明的抗hTfR抗体结合，可以使BDNF高效地通过血脑屏障而到达脑内。此外，本发明的抗hTfR抗体在通过血脑屏障后可以到达大脑的脑实质、海马的神经元样细胞、小脑的浦肯野细胞等、或者至少到达这些中的任意一者。并且，还有望到达大脑的纹状体的神经元样细胞和中脑的黑质的神经元样细胞。因此，通过使BDNF与本发明的抗hTfR抗体结合，可以使其到达这些组织或细胞。
[0289] 在使通常不能通过血脑屏障、因此静脉内给药时不能在脑内发挥功能的BDNF从血中到达脑内并在脑内发挥功能方面，使用抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白可能成为有效的手段。特别是本发明的抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白在通过血脑屏障后会到达大脑的脑实质、海马的神经元样细胞、小脑的浦肯野细胞等、或者至少到达这些中的任意一者。并且还有望到达大脑的纹状体的神经元样细胞和中脑的黑质的神经元样细胞。因此，通过将BDNF以与本发明的抗hTfR抗体分子结合的形态利用静脉内给药等进行血中给药，能够使BDNF的功能在这些脑的组织或细胞中发挥、强化。
[0290] 在本说明书中，BDNF是1982年被Barde等发现、于1990年被Jones等克隆的公知蛋白质(EMBO J，(1982)1：549-553，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：8060-8064)，作为一例，示出序列号247的人成熟BDNF的氨基酸序列，也可以是含有与其实质上一致的氨基酸序列的蛋白质、源自其它恒温动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、狗、猪、绵羊、牛、猴等)的BDNF。
[0291] 此外，在本说明书中，BDNF不仅包含表示人成熟BDNF的特定的氨基酸序列(序列号247)所示的“蛋白质”或“(多)肽”，而且只要与这些具有同一性质的功能则其同族体(同源物、剪接变体)、变异体、衍生物和氨基酸修饰体等也包含在BDNF中。
[0292] 在此，“同一性质的功能”例如是指：从生理学或药理学上来看，其性质在定性上相同，功能的程度(例如约0.1～约10倍、优选为0.5～2倍)、蛋白质的分子量等定量要素可以不同。此外，将具有天然BDNF所具有的功能、例如(1)对BDNF受体(TrkB)的亲和力、(2)BDNF受体的磷酸化活性、(3)对神经细胞的增殖促进作用、(4)对神经细胞的生存维持作用、(5)对神经细胞的轴突延长作用的蛋白质、或者(6)可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的蛋白质视为与BDNF“具有同一性质的功能的蛋白质”。
[0293] 上述的BDNF的功能可以用后述的(2)“BDNF的功能”部分所记载的公知的各种评价方法、本说明书的实施例18～22中记载的方法来考察。
[0294] 在此，作为同源物，可以例示与人的蛋白质对应的小鼠、大鼠等其它生物种属的蛋白质，这些除了由Maisonpierre等(Genomics(1991)10：558-568)进行了报道的物质以外，也可以由UniProt所刊载的蛋白质的氨基酸序列(P21237-1、P23363-1、P25429-1、Q7YRB4-1、P14082-1、Q5IS78-1、Q95106-1)等推演地进行鉴定。此外，变异体包含天然存在的等位基因变异体、非天然存在的变异体、以及具有通过人为地缺失、置换、添加或插入而进行了改变的氨基酸序列的变异体。需要说明的是，作为上述变异体，可以列举与无变异的蛋白质或(多)肽至少70％、优选80％、更优选90％、更进一步优选95％、更加优选97％、特别优选
98％、最优选99％同源的变异体。此外，氨基酸修饰体包含天然存在的氨基酸修饰体、非天然存在的氨基酸修饰体，具体可以列举氨基酸的磷酸化体。
98％、最优选99％同源的变异体。此外，氨基酸修饰体包含天然存在的氨基酸修饰体、非天然存在的氨基酸修饰体，具体可以列举氨基酸的磷酸化体。
[0295] 进而，在本说明书中，“BDNF”可以是可发挥与BDNF同一性质的功能的上述BDNF的前躯体(prepro体)或从该前躯体中切除信号序列而得到的前体，其不仅包含表示人BDNF前躯体的特定的氨基酸序列(UniProt ID No.P23560-1)所示的“蛋白质”或“(多)肽”，而且只要与这些具有同一性质的功能则其同族体(同源物、剪接变体)、变异体、衍生物、前体和氨基酸修饰体等也包含在BDNF中。作为人BDNF的前体(前体BDNF)，可以列举序列号256的氨基酸序列。
[0296] 在此，与BDNF前躯体同一性质的功能是指BDNF前躯体所具有的功能，例如可生成BDNF的前体(前体BDNF)或成熟BDNF的功能，与BDNF的前体同一性质的功能是指BDNF的前体所具有的功能，例如对p75受体的亲和力。
[0297] 在此，作为人BDNF前躯体的剪接变体，可以列举UniProt所刊载的蛋白质的氨基酸序列(P23560-2、P23560-3、P23560-4、P23560-5)等。此外，编码这些人BDNF前躯体蛋白质的基因也是公知的，可以列举例如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov中刊载的基因的碱基序列(NM_001143805.1、NM_001143806.1、NM_001143807.1、NM_001143808.1、NM_001143809.1、NM_001143810.1、NM_001143811.1、NM_001143812.1、NM_001143813.1、NM_001143814.1、NM_001143816.1、NM_001709.4、NM_170731.4、NM_170732.4、NM_170733.3、NM_170734.3、NM_170735.5)等。
[0298] 作为BDNF前躯体的同源物及其剪接变体，可以例示与人的蛋白质对应的小鼠、大鼠等其它生物种属的蛋白质及其剪接变体，这些可以由http：//www.ncbi.nlm.nih.gov中刊载的基因的碱基序列(NM_001048139.1、NM_001048141.1、NM_001048142.1、NM_001285416.1、NM_001285417.1、NM_001285418.1、NM_001285419.1、NM_001285420.1、NM_
001285421.1、NM_001285422.1、NM_007540.4等小鼠BDNF基因的碱基序列，NM_
001270630.1、NM_001270631.1、NM_001270632.1、NM_001270633.1、NM_001270634.1、NM_
001270635.1、NM_001270636.1、NM_001270637.1、NM_001270638.1、NM_012513.4等大鼠BDNF基因的碱基序列)等推演地进行鉴定。
001285421.1、NM_001285422.1、NM_007540.4等小鼠BDNF基因的碱基序列，NM_
001270630.1、NM_001270631.1、NM_001270632.1、NM_001270633.1、NM_001270634.1、NM_
001270635.1、NM_001270636.1、NM_001270637.1、NM_001270638.1、NM_012513.4等大鼠BDNF基因的碱基序列)等推演地进行鉴定。
[0299] 此外，BDNF前躯体的变异体包含：天然存在的等位基因变异体、非天然存在的变异体、以及具有通过人为地缺失、置换、添加或插入而进行了改变的氨基酸序列的变异体。需要说明的是，作为上述变异体，可以列举与无变异的蛋白质或(多)肽至少70％、优选80％、更优选90％、进一步优选95％、另外进一步优选97％、特别优选98％、最优选99％同源的变异体。此外，氨基酸修饰体包含天然存在的氨基酸修饰体、非天然存在的氨基酸修饰体，具体可以列举氨基酸的磷酸化体。
[0300] 作为序列号247的氨基酸序列或与其实质上一致的氨基酸序列，可以列举以下的(A)～(E)：
[0301] (A)序列号247的氨基酸序列，
[0302] (B)在序列号247的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、添加、插入或置换、并且具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，
[0303] (C)与序列号247的氨基酸序列具有至少80％以上的同源性、并且具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，
[0304] (D)由具有序列号246的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列，或者
[0305] (E)由与相对于具有序列号246的碱基序列的DNA具有互补性的DNA在严格条件下杂交的DNA编码、并且具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列。
[0306] 具体可以列举：由序列号247的氨基酸序列构成的人蛋白质在其它哺乳动物中的直向同源物的氨基酸序列、或者由序列号247的氨基酸序列构成的人蛋白质或其直向同源物在剪接变体、等位基因变异体或多态性变体中的氨基酸序列。
[0307] 在此，“同源性”是指：使用该技术领域中公知的数学算法对2个氨基酸序列进行比对时，最佳的比对(优选的是，该算法为了进行最佳的比对可考虑向一个或两个序列中引入空位)中一致氨基酸和类似氨基酸残基相对于发生重叠的全部氨基酸残基的比例(％)。“类似氨基酸”是指物理化学性质类似的氨基酸，可以列举例如被分类在芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱基性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、侧链小的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等中的同一组中的氨基酸。利用这样的类似氨基酸进行的置换有望不引起蛋白质的表型变化(即，保守性氨基酸置换)。保守性氨基酸置换的具体例子在该技术领域是公知的，被记载在各种文献中(参照例如Bowie等，Science，247：1306-1310(1990))。
[0308] 本说明书中的氨基酸序列的同源性可以使用同源性计算算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)在以下的条件(期望值＝10；允许空位；matrix＝BLOSUM62；filtering＝OFF)下进行计算。作为用于确定氨基酸序列的同源性的其它算法，可以列举例如：Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)中记载的算法[该算法已整合到NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)中(Altschul等，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))]，Needleman等，J.Mol.Biol.，48：444-453(1970)中记载的算法[该算法已整合到GCG软件包中的GAP程序中]，Myers和Miller，CABIOS，4：11-17(1988)中记载的算法[该算法已整合到作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(version 2.0)中]，Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444-2448(1988)中记载的算法[该算法已整合到GCG软件包中的FASTA程序中]等，这些也可同样优选使用。
[0309] 上述(E)中的严格条件可以列举：例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，6.3.1-6.3.6，1999中记载的条件，例如6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)/45℃下的杂交，然后以0.2×SSC/0.1％SDS/50～65℃下洗涤一次以上等，本领域技术人员可以适当选择可提供与上述同等的严格性的杂交条件。
[0310] 更优选的是，作为“与序列号247的氨基酸序列实质上一致的氨基酸序列”，可以列举：与序列号247的氨基酸序列具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、进一步优选约95％以上、另外进一步优选约97％以上、特别优选约98％以上、最优选约99％以上的一致性的氨基酸序列。
[0311] 作为本发明中的蛋白质：BDNF，还包含例如含有下述氨基酸序列的蛋白质等所谓的突变蛋白：
[0312] (i)序列号247的氨基酸序列中的1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸发生了缺失的氨基酸序列，
[0313] (ii)在序列号247的氨基酸序列中添加了1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸的氨基酸序列，
[0314] (iii)在序列号247的氨基酸序列中插入了1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸的氨基酸序列，
[0315] (iv)序列号247的氨基酸序列中的1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸被其它氨基酸置换的氨基酸序列，或者[0316] (v)对上述进行组合而成的氨基酸序列。
[0317] 在如上述那样发生氨基酸序列的插入、缺失、添加或置换时，该插入、缺失、添加或置换的位置只要使施加了这种变更的蛋白质具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能、或者可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别，则没有特别限定。例如，除了由序列号247的氨基酸序列构成的成熟BDNF以外，在其N末端添加了甲硫氨酸的Met-BDNF等只要具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能，则也可作为BDNF用于本发明的融合蛋白中。
[0318] 在此，作为人为地进行氨基酸的缺失、添加、插入或置换时的方法，可以列举例如：对编码序列号247的氨基酸序列的DNA实施惯用的位点特异性突变的引入、然后通过常规方法使该DNA表达的方法。在此，作为位点特异性突变的引入方法，可以列举例如：利用琥珀突变的方法(缺口双链法，Nucleic Acids Res.，12，9441-9456(1984))、基于使用了突变引入用引物的PCR的方法等。
[0319] 作为BDNF的优选例子，可以列举例如：由序列号247的氨基酸序列构成的人蛋白质、或者其等位基因变异体或多态性变体等。
[0320] “编码BDNF的基因”表示具有编码氨基酸序列的碱基序列的基因，所述氨基酸序列是指上述(A)～(E)所示的、序列号247的氨基酸序列或与其实质上一致的氨基酸序列。具体可以列举具有以下(F)～(J)的碱基序列的基因：
[0321] (F)编码序列号247的氨基酸序列的碱基序列，
[0322] (G)编码如下氨基酸序列的碱基序列：在序列号247的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、添加、插入或置换、并且具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，
[0323] (H)编码如下氨基酸序列的碱基序列：与序列号247的氨基酸序列具有至少80％以上的同源性、并且具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，[0324] (I)编码如下氨基酸序列的碱基序列：由具有序列号246的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列，或者
[0325] (J)编码如下氨基酸序列的碱基序列：由与相对于具有序列号246的碱基序列的DNA具有互补性的DNA在严格条件下杂交的DNA编码、并且具有与由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号247的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列。
[0326] 需要说明的是，在此，基因可以为cDNA或基因组DNA等DNA、或者mRNA等RNA中的任意一种，并且是同时包含单链核酸序列和双链核酸序列的概念。此外，在本说明书中，序列号165、序列号173、序列号181、序列号189、序列号197、序列号199、序列号201、序列号203、序列号211、序列号213、序列号246、序列号249、序列号251、序列号253等所示的核酸序列为了方便而为DNA序列，但在表示mRNA等RNA序列时，将胸腺嘧啶(T)理解为尿嘧啶(U)。
[0327] 此外，作为本发明中使用的BDNF，可以是用聚乙二醇(PEG)等具有蛋白质稳定化作用的分子等进行了修饰的衍生物等(Drug Delivery System(1998)；13：173-178)。
[0328] 作为本发明中的抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的一例，可以列举在构成抗hTfR抗体的“重链”的C末端通过接头序列Gly-Ser融合有人BDNF的类型。作为这样的融合蛋白，可以例示：
[0329] (1)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号164的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号248所示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0330] (2)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号180的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号250所示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0331] (3)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号196的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列Gly-Ser与人BDNF结合且整体具有序列号252所示的氨基酸序列的融合蛋白；和
[0332] (4)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号196的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链以其C末端侧通过接头序列与人BDNF结合且整体具有序列号254所示的氨基酸序列的融合蛋白，所述接头序列由在接头序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。
[0333] 上述(1)～(4)所述的融合蛋白为：
[0334] (1)含有具有序列号164的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链、和在具有序列号172的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列Gly-Ser结合有序列号247所示的人BDNF的结构的融合蛋白；
[0335] (2)含有具有序列号180的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链、和在具有序列号188的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列Gly-Ser结合有序列号247所示的人BDNF的结构的融合蛋白；
[0336] (3)含有具有序列号196的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链、和在具有序列号210的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列Gly-Ser结合有序列号247所示的人BDNF的结构的融合蛋白；和
[0337] (4)含有具有序列号196的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链、和在具有序列号210的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列结合有序列号247所示的人BDNF的结构的融合蛋白，所述接头序列由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。
[0338] 这样的融合蛋白例如可以通过用表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号250的氨基酸序列的碱基序列(序列号251)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号180的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号181)的DNA片段的表达载体。
[0339] 作为本发明中的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的更具体的实施方式的一例，可以列举：在抗hTfR抗体重链的C末端侧通过由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成的接头序列融合了人BDNF的融合蛋白。作为这样的融合蛋白，可以例示：轻链由序列号196的氨基酸序列构成、且在重链的C末端侧通过该接头结合人BDNF而成的肽由序列号254的氨基酸序列构成的融合蛋白。
[0340] 这样的融合蛋白例如可以通过用表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号254的氨基酸序列的碱基序列(序列号255)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号196的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号197)的DNA片段的表达载体。
[0341] 需要说明的是，序列号254的氨基酸序列所示的蛋白质是在序列号210记载的抗hTfR抗体重链的C末端侧通过接头序列结合了人BDNF的蛋白质，所述接头序列由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。在此，作为抗hTfR抗体重链，可以使用序列号188的重链来代替序列号210的重链，此时，作为抗hTfR抗体轻链，优选使用序列号196的轻链。此外，在此，作为抗hTfR抗体重链，可以使用序列号172的重链来代替序列号210的重链，此时，作为抗hTfR抗体轻链，优选使用序列号164的轻链。
[0342] 作为与人BDNF结合的抗hTfR抗体的1个优选的实施方式，可以列举该抗体的抗原结合性片段，具体可以列举单链抗体、Fab、F(ab’)和F(ab’)2等。
[0343] 作为抗hTfR抗体为单链抗体时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以例示：由序列号259或260的氨基酸序列构成的融合蛋白，即，在人BDNF的C末端侧通过第1接头序列结合了单链抗体的融合蛋白，其中，所述第1接头序列由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。在此，单链抗体是具有序列号257的氨基酸序列的单链抗体，即，在具有序列号205的氨基酸序列的抗hTfR抗体重链的可变区的C末端通过第2接头序列结合了具有序列号191的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的可变区的单链抗体，其中，所述第2接头序列由3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的共计15个氨基酸构成。因此，作为抗hTfR抗体为单链抗体时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：在含有具有序列号205的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号191的氨基酸序列的轻链可变区的单链抗体的N末端侧直接或通过接头结合了人BDNF的融合蛋白。
[0344] 抗hTfR抗体为单链抗体的这种融合蛋白，例如可以通过用整合有具有编码序列号259的氨基酸序列的碱基序列(序列号258)的DNA片段的表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造。
[0345] 需要说明的是，在本发明中，当1个肽链中含有多个接头序列时，为了方便，将各接头序列从N末端侧起依次称为第1接头序列、第2接头序列。
[0346] 作为抗hTfR抗体为Fab时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：在人BDNF的C末端侧通过接头序列融合了含有抗hTfR抗体重链的可变区和CHl区域的区域的融合蛋白，其中，所述接头序列由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。此时，除了CHl区域以外还可以含有铰链区的一部分，但该铰链区不含用于形成重链间的二硫键的半胱氨酸残基。序列号263和264为其优选的一例。序列号263和264中的抗hTfR抗体重链的氨基酸序列由与序列号210所示的人源化抗hTfR抗体的重链的氨基酸序列的N末端起第1位～第226位的部分相当的氨基酸序列(序列号261)构成。需要说明的是，序列号210的N末端起第1位～第118位的部分与序列号205(人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2)相当，第119位～第216位的部分与CHl区域相当，第217位～第226位的部分与铰链区相当。作为抗hTfR抗体为Fab时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举在人源化抗hTfR抗体的Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任一重链的N末端侧直接或通过接头结合了人BDNF的融合蛋白作为优选的一个实施方式。
[0347] 作为抗hTfR抗体为Fab时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：轻链由序列号196的氨基酸序列构成、并且重链为由序列号261的氨基酸序列构成的Fab重链且在该重链的N末端侧直接或通过接头结合了人BDNF的融合蛋白。更具体而言，可以列举：轻链由序列号196的氨基酸序列构成、并且由Fab重链和直接或通过接头结合在其N末端侧的人前体BDNF构成的部分由序列号263的氨基酸序列构成的融合蛋白；轻链由序列号196的氨基酸序列构成、并且由Fab重链和直接或通过接头结合在其N末端侧的人BDNF构成的部分由序列号264的氨基酸序列构成的融合蛋白。
[0348] 抗hTfR抗体为Fab的这种融合蛋白，例如也可以通过用表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号263的氨基酸序列的碱基序列(序列号262)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号196的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号197)的DNA片段的表达载体。
[0349] 抗hTfR抗体为Fab的这种融合蛋白，例如也可以通过用表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号264的氨基酸序列的碱基序列(序列号265)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号196的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号197)的DNA片段的表达载体。
[0350] 需要说明的是，在向人BDNF(hBDNF)中引入变异而在C末端或N末端添加了氨基酸的情况下，如果该添加的氨基酸在使hBDNF与抗hTfR抗体融合时位于hBDNF与抗hTfR抗体之间，则该添加的氨基酸构成接头的一部分。
[0351] 作为使抗hTfR抗体与BDNF结合的方法，有通过非肽接头或肽接头使其结合的方法。作为非肽接头，可以使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、多氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类和透明质酸、或者这些的衍生物，或者将这些组合使用。肽接头为由形成了肽键的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端分别与抗hTfR抗体或BDNF中的任意一者形成共价键，从而将抗hTfR抗体与BDNF结合。
[0352] 使用作为非肽接头的PEG使本发明的抗hTfR抗体与BDNF结合而成的融合蛋白特指抗hTfR抗体-PEG-BDNF。抗hTfR抗体-PEG-BDNF可以如下制造：使抗hTfR抗体与PEG结合而制作抗hTfR抗体-PEG，然后使抗hTfR抗体-PEG与BDNF结合。或者，抗hTfR抗体-PEG-BDNF还可以如下制造：使BDNF与PEG结合而制作BDNF-PEG，然后使BDNF-PEG与抗hTfR抗体结合。在使PEG与抗hTfR抗体和BDNF结合时，可使用利用碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等的官能团修饰后的PEG。这些被导入到PEG中的官能团主要通过与抗hTfR抗体和BDNF分子内的氨基反应而使PEG与hTfR抗体和BDNF形成共价键。对于此时使用的PEG的分子量和形状没有特别限定，其平均分子量(MW)优选为MW＝500～60000，更优选为MW＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的PEG可以优选作为非肽接头使用。
[0353] 例如，抗hTfR抗体-PEG如下得到：将抗hTfR抗体与醛基改性PEG(ALD-PEG-ALD)按照该改性PEG相对于该抗体的摩尔比达到11、12.5、15、110、120等的方式混合，向其中添加NaCNBH3等还原剂而使其反应，从而得到。然后，使抗hTfR抗体-PEG在NaCNBH3等还原剂存在下与BDNF反应，从而得到抗hTfR抗体-PEG-BDNF。相反，通过先使BDNF与ALD-PEG-ALD结合而制作BDNF-PEG、然后使BDNF-PEG与抗hTfR抗体结合，也可以得到抗hTfR抗体-PEG-BDNF。
[0354] BDNF由于其二聚体与位于靶细胞表面上的高亲和性BDNF受体结合，因此被认为以二聚体形式发挥作用，但与抗hTfR抗体结合的BDNF可以是1分子也可以是2分子。例如，可以使在抗hTfR抗体上结合1分子BDNF而成的融合蛋白与BDNF反应而形成二聚体，也可以形成使2分子BDNF结合在抗hTfR抗体上的融合蛋白。此外，该结合既可以如下所示地将编码抗hTfR抗体和BDNF的DNA整合到表达载体中而得到，也可以通过在分别制造抗hTfR抗体和BDNF后进行化学结合而制作。具体而言，可以通过在抗hTfR抗体的重链或轻链的C末端侧或N末端侧通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的N末端或C末端，从而使抗hTfR抗体和BDNF一体化。作为BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白的1个优选的实施方式，可以列举：在抗hTfR抗体的重链或轻链的N末端侧通过接头序列或直接地结合BDNF的C末端而得到的融合蛋白。
[0355] 如前所述，作为与人BDNF结合的抗hTfR抗体的1个优选的实施方式，可以列举该抗体的抗原结合性片段，具体可以列举单链抗体、Fab、F(ab’)和F(ab’)2。因此，作为BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白的1个优选的实施方式，可以例示以下的融合蛋白。
[0356] (1)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为抗原结合性片段，在该抗原结合性片段的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0357] (2)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为单链抗体，在该单链抗体的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0358] (3)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一种，在这些Fab、F(ab’)2或F(ab’)的重链或轻链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0359] 在此，在上述(3)的情况下，可以使人BDNF特别优选地与抗hTfR抗体的Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一者的重链的N末端侧结合。因此，更具体而言，可以例示以下的融合蛋白。
[0360] (4)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一种，在这些Fab、F(ab’)2或F(ab’)的重链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
[0361] 就构成抗hTfR抗体的“轻链”的C末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在轻链的C末端侧。在此，抗hTfR抗体的轻链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0362] 就构成抗hTfR抗体的“重链”的C末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在重链的C末端侧。在此，抗hTfR抗体的重链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0363] 就构成抗hTfR抗体的“轻链”的N末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在轻链的N末端侧。在此，抗hTfR抗体的轻链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0364] 就构成抗hTfR抗体的“重链”的N末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在重链的N末端侧。在此，抗hTfR抗体的重链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0365] 这样的抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白可以通过将DNA片段整合到哺乳动物细胞用表达载体中并培养导入了该表达载体的哺乳动物细胞而得到，所述DNA片段是在编码抗hTfR抗体的重链或轻链的cDNA的3’末端侧或5’末端侧直接或通过编码接头序列的DNA片段以框内方式配置编码BDNF的cDNA(序列号246)而成的DNA片段。在使编码BDNF的DNA片段与重链结合时，将整合有编码构成抗hTfR抗体的轻链的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体也一并导入到同一宿主细胞中，此外，在使编码BDNF的DNA片段与轻链结合时，将整合有编码抗hTfR抗体的重链的cDNA片段的哺乳动物细胞用的表达载体也一并导入到同一宿主细胞中。
[0366] 在此，在哺乳动物细胞中，将整合有编码在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的C末端直接或通过接头序列结合BDNF而成的融合蛋白的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体、和整合有编码抗hTfR抗体的轻链(或重链)的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体一并导入到同一宿主细胞中，由此，可以制作由在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的C末端侧结合了BDNF的融合蛋白、和抗hTfR抗体的重链(或轻链)构成的融合蛋白。
[0367] 此外，通过将整合有编码在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的N末端直接或通过接头序列结合BDNF而成的融合蛋白的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体、和整合有编码抗hTfR抗体的轻链(或重链)的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体导入到同一宿主细胞中，还可以制作由在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的N末端侧结合BDNF而成的融合蛋白、和抗hTfR抗体的轻链(重链)构成的融合蛋白。
[0368] 抗hTfR抗体为单链抗体时，抗hTfR抗体与BDNF结合而成的融合蛋白可以通过将DNA片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物或大肠杆菌等原核生物细胞用的表达载体中并使其在与导入有该表达载体的细胞所对应的细胞中表达而得到，所述DNA片段是在编码BDNF的cDNA的5’末端或3’末端直接或通过编码接头序列的DNA片段连接编码单链抗hTfR抗体的cDNA而得到的DNA片段。
[0369] 抗hTfR抗体为Fab时，抗hTfR抗体与BDNF结合而成的融合蛋白可以通过将表达载体导入到同一宿主细胞中并使其在细胞中表达而得到，所述表达载体为：整合有在编码BDNF的cDNA的5’末端或3’末端直接或通过编码接头序列的DNA片段连接编码该Fab的重链和轻链中的任意一者的cDNA片段而成的DNA片段的表达载体(哺乳动物细胞、酵母等真核生物或大肠杆菌等原核生物细胞用)、和整合有编码该Fab重链和轻链中的另一者的cDNA片段的表达载体。
[0370] 在抗hTfR抗体与BDNF之间配置接头序列时，接头序列优选由1～50个氨基酸构成。在此，氨基酸的个数可适当调整为1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～
29个、27个等。这种接头序列只要其所连接的抗hTfR抗体可保持与hTfR的亲和性、且所连接的BDNF在生理条件下可发挥其生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如含有如下序列的接头序列：由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的、由50个以下的氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、
25～29个或27个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用含有在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸序列的序列作为接头序列。
29个、27个等。这种接头序列只要其所连接的抗hTfR抗体可保持与hTfR的亲和性、且所连接的BDNF在生理条件下可发挥其生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如含有如下序列的接头序列：由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的、由50个以下的氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、
25～29个或27个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用含有在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸序列的序列作为接头序列。
[0371] 在抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白中，抗hTfR抗体为单链抗体时，含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列与含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列通常通过接头序列而结合。此时，只要抗hTfR抗体可保持对hTfR的亲和性，则既可以是在含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进而在其C末端侧结合含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而得到的融合蛋白，此外也可以是在含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进而在其C末端侧结合含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而得到的融合蛋白。
[0372] 配置在免疫球蛋白的轻链和重链之间的接头序列由优选为2～50个、更优选为8～50个、进一步优选为10～30个、更进一步优选为12～18个或15～25个、例如15个或25个氨基酸构成。就这种接头序列而言，只要用其连接两条链而成的抗hTfR抗体可与hTfR保持亲和性、且该抗体所结合的BDNF在生理条件下可发挥其生理活性，则对氨基酸序列没有限定，优选仅由甘氨酸构成或由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如含有如下序列的接头序列：氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者2～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的C末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区时，优选含有由3个序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的共计15个氨基酸的接头序列。
[0373] 作为抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：在抗hTfR抗体重链的C末端通过作为接头序列的氨基酸序列Gly-Ser融合人BDNF而成的、具有序列号252的氨基酸序列的融合蛋白。使用通过一并导入整合有具有编码该融合蛋白的序列号253的碱基序列的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号196的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的序列号197的碱基序列的DNA片段的表达载体而进行了转化的宿主细胞，由此，可以制作抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白。
[0374] 抗hTfR抗体为人以外的动物的抗体时，在将其给药于人时，非常担心激起针对该抗体的抗原抗体反应而产生不期望的副作用。人以外的动物的抗体通过形成人源化抗体可以减少这种抗原性，可以抑制给药于人时起因于抗原抗体反应的副作用的发生。此外，据报道，根据使用猴的实验，人源化抗体与小鼠抗体相比在血中更为稳定，认为可以使治疗效果相应地持续长时间。也可以通过使用人抗体作为抗hTfR抗体来抑制起因于抗原抗体反应的副作用的发生。
[0375] 以下更详细地说明抗hTfR抗体为人源化抗体或人抗体的情况。人抗体的轻链有λ链和κ链。构成抗hTfR抗体的轻链可以为λ链和κ链中的任意一者。此外，人的重链有γ链、μ链、α链、σ链和ε链，分别对应于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。构成抗hTfR抗体的重链可以为γ链、μ链、α链、σ链和ε链中的任意一者，优选为γ链。进而，人的重链的γ链有γ1链、γ2链、γ3链和γ4链，分别对应于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。构成抗hTfR抗体的重链为γ链时，该γ链可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一者，优选为γ1链或γ4链。抗hTfR抗体为人源化抗体或人抗体且为IgG时，人抗体的轻链也可以为λ链和κ链中的任意一者，人抗体的重链也可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一者，优选为γ1链或γ4链。例如，作为优选的抗hTfR抗体的一个实施方式，可以列举轻链为λ链、重链为γ1链的抗hTfR抗体。
[0376] 在抗hTfR抗体为人源化抗体或人抗体时，可以通过在抗hTfR抗体的重链或轻链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端(或N末端)而将抗hTfR抗体与BDNF连接。在使BDNF结合于抗hTfR抗体的重链的N末端侧(或C末端侧)时，在抗hTfR抗体的γ链、μ链、α链、σ链或ε链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端(或N末端)。在抗hTfR抗体的轻链的N末端侧(或C末端侧)结合BDNF时，在抗hTfR抗体的λ链和κ链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端(或N末端)。但是，在抗hTfR抗体为由缺失了Fc区的Fab区构成的抗体或由Fab区和铰链区的全部或一部分构成的抗体(Fab、F(ab’)和F(ab’)2)的情况下，可以在构成Fab、F(ab’)2和F(ab’)的重链或轻链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端或N末端。
[0377] 就作为人源化抗体或人抗体的抗hTfR抗体的“轻链”的C末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在该轻链的C末端侧。在此，抗hTfR抗体的轻链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0378] 就作为人源化抗体或人抗体的抗hTfR抗体的“重链”的C末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在该重链的C末端侧。在此，抗hTfR抗体的重链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0379] 就作为人源化抗体或人抗体的抗hTfR抗体的“轻链”的N末端侧结合有BDNF这样的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在该轻链的N末端侧。在此，抗hTfR抗体的轻链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0380] 就作为人源化抗体或人抗体的抗hTfR抗体的“重链”的N末端侧结合有BDNF这样的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在该重链的N末端侧。在此，抗hTfR抗体的重链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0381] 在抗hTfR抗体与BDNF之间配置接头序列时，接头序列由优选为1～50个、更优选为10～40个、进一步优选为20～34个、例如27个氨基酸构成。构成接头序列的氨基酸的个数可适当调整为1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、27个等。这种接头序列只要其所连接的抗hTfR抗体可保持对hTfR的亲和性、且所连接的BDNF在生理条件下可发挥其生理活性，则对氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如含有如下序列的接头序列：由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的、由50个以下的氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用含有在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸序列的序列作为接头序列。
[0382] 抗hTfR抗体对hTfR的特异性亲和性主要依赖于抗hTfR抗体的重链和轻链的CDR的氨基酸序列。这些CDR的氨基酸序列只要使抗hTfR抗体具有对hTfR的特异性的亲和性则没有特别限制。但是，本发明的抗hTfR抗体优选为利用实施例7中记载的方法测定的与hTfR的解离常数(KD)优选为1×10-8M以下的抗体、更优选为1×10-9M以下的抗体、进一步优选为1×-10 -1110 M以下的抗体、另外进一步优选为1×10 M以下的抗体。例如作为优选的例子，可以列举：解离常数为1×10-13M～1×10-9M的抗体、为1×10-13M～1×10-10M的抗体。此外，在本发明的抗hTfR抗体对猴TfR也具有亲和性时，利用实施例7中记载的方法测定的抗hTfR抗体与猴TfR的解离常数优选为5×10-8M以下，更优选为2×10-8M以下，进一步优选为1×10-8M以下。
-13 -8 -13
例如作为优选的例子，可以列举：解离常数为1×10 M～2×10 M的抗体、为1×10 M～2×
10-8M的抗体。抗体为单链抗体时也同样。
-13 -8 -13
例如作为优选的例子，可以列举：解离常数为1×10 M～2×10 M的抗体、为1×10 M～2×
10-8M的抗体。抗体为单链抗体时也同样。
[0383] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的抗体的优选实施方式，可以例示抗体的轻链的CDR具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0384] (1)CDR1为序列号6或序列号7的氨基酸序列、CDR2为序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Thr-Ser和CDR3为序列号10的氨基酸序列，
[0385] (2)CDR1为序列号11或序列号12的氨基酸序列、CDR2为序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser和CDR3为序列号15的氨基酸序列，
[0386] (3)CDR1为序列号16或序列号17的氨基酸序列、CDR2为序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列Lys-Val-Ser和CDR3为序列号20的氨基酸序列，
[0387] (4)CDR1为序列号21或序列号22的氨基酸序列、CDR2为序列号23或序列号24的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser和CDR3为序列号25的氨基酸序列，
[0388] (5)CDR1为序列号26或序列号27的氨基酸序列、CDR2为序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser和CDR3为序列号30的氨基酸序列，
[0389] (6)CDR1为序列号31或序列号32的氨基酸序列、CDR2为序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser和CDR3为序列号35的氨基酸序列，
[0390] (7)CDR1为序列号36或序列号37的氨基酸序列、CDR2为序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列Gln-Thr-Ser和CDR3为序列号40的氨基酸序列，
[0391] (8)CDR1为序列号41或序列号42的氨基酸序列、CDR2为序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列Gly-Thr-Ser和CDR3为序列号45的氨基酸序列，
[0392] (9)CDR1为序列号46或序列号47的氨基酸序列、CDR2为序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列Phe-Thr-Ser和CDR3为序列号50的氨基酸序列，
[0393] (10)CDR1为序列号51或序列号52的氨基酸序列、CDR2为序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser和CDR3为序列号55的氨基酸序列，
[0394] (11)CDR1为序列号56或序列号57的氨基酸序列、CDR2为序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser和CDR3为序列号60的氨基酸序列，
[0395] (12)CDR1为序列号61或序列号62的氨基酸序列、CDR2为序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Ser-Ser和CDR3为序列号65的氨基酸序列，
[0396] (13)CDR1为序列号66或序列号67的氨基酸序列、CDR2为序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser和CDR3为序列号70的氨基酸序列，
[0397] (14)CDR1为序列号71或序列号72的氨基酸序列、CDR2为序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser和CDR3为序列号75的氨基酸序列。
[0398] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的抗体的更具体的实施方式，可以例示抗体的轻链的CDR具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0399] (1)CDR1含有序列号6的氨基酸序列、CDR2含有序列号8的氨基酸序列和CDR3含有序列号10的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0400] (2)CDR1含有序列号11的氨基酸序列、CDR2含有序列号13的氨基酸序列和CDR3含有序列号15的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0401] (3)CDR1含有序列号16的氨基酸序列、CDR2含有序列号18的氨基酸序列和CDR3含有序列号20的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0402] (4)CDR1含有序列号21的氨基酸序列、CDR2含有序列号23的氨基酸序列和CDR3含有序列号25记载的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0403] (5)CDR1含有序列号26的氨基酸序列、CDR2含有序列号28的氨基酸序列和CDR3含有序列号30的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0404] (6)CDR1含有序列号31的氨基酸序列、CDR2含有序列号33的氨基酸序列和CDR3含有序列号35的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0405] (7)CDR1含有序列号36的氨基酸序列、CDR2含有序列号38的氨基酸序列和CDR3含有序列号40的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0406] (8)CDR1含有序列号41的氨基酸序列、CDR2含有序列号43的氨基酸序列和CDR3含有序列号45的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0407] (9)CDR1含有序列号46的氨基酸序列、CDR2含有序列号48的氨基酸序列和CDR3含有序列号50的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0408] (10)CDR1含有序列号51的氨基酸序列、CDR2含有序列号53的氨基酸序列和CDR3含有序列号55的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0409] (11)CDR1含有序列号56的氨基酸序列、CDR2含有序列号58的氨基酸序列和CDR3含有序列号60的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0410] (12)CDR1含有序列号61的氨基酸序列、CDR2含有序列号63的氨基酸序列和CDR3含有序列号65的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0411] (13)CDR1含有序列号66的氨基酸序列、CDR2含有序列号68的氨基酸序列和CDR3含有序列号70的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0412] (14)CDR1含有序列号71的氨基酸序列、CDR2含有序列号73的氨基酸序列和CDR3含有序列号75的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0413] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的抗体的优选实施方式，可以例示抗体的重链的CDR具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0414] (1)CDR1含有序列号76或序列号77的氨基酸序列、CDR2含有序列号78或序列号79的氨基酸序列和CDR3含有序列号80或序列号81的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0415] (2)CDR1含有序列号82或序列号83的氨基酸序列、CDR2含有序列号84或序列号85的氨基酸序列和CDR3含有序列号86或序列号87的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0416] (3)CDR1含有序列号88或序列号89的氨基酸序列、CDR2含有序列号90或序列号91的氨基酸序列和CDR3含有序列号92或序列号93的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0417] (4)CDR1含有序列号94或序列号95的氨基酸序列、CDR2含有序列号96或序列号97的氨基酸序列和CDR3含有序列号98或序列号99的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0418] (5)CDR1含有序列号100或序列号101的氨基酸序列、CDR2含有序列号102或序列号103的氨基酸序列和CDR3含有序列号104或序列号105的氨基酸序列的氨基酸序列，[0419] (6)CDR1含有序列号106或序列号107的氨基酸序列、CDR2含有序列号108的氨基酸序列或序列号266的氨基酸序列和CDR3含有序列号109或序列号110的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0420] (7)CDR1含有序列号111或序列号112的氨基酸序列、CDR2含有序列号113或序列号114的氨基酸序列和CDR3含有序列号115或序列号116的氨基酸序列的氨基酸序列，[0421] (8)CDR1含有序列号117或序列号118的氨基酸序列、CDR2含有序列号119的氨基酸序列或序列号267的氨基酸序列和CDR3含有序列号120或序列号121的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0422] (9)CDR1含有序列号122或序列号123的氨基酸序列、CDR2含有序列号124或序列号125的氨基酸序列和CDR3含有序列号126或序列号127的氨基酸序列的氨基酸序列，[0423] (10)CDR1含有序列号128或序列号129的氨基酸序列、CDR2含有序列号130或序列号131的氨基酸序列和CDR3含有序列号132或序列号133的氨基酸序列的氨基酸序列，[0424] (11)CDR1含有序列号134或序列号135的氨基酸序列、CDR2含有序列号136或序列号137的氨基酸序列和CDR3含有序列号138或序列号139的氨基酸序列的氨基酸序列，[0425] (12)CDR1含有序列号140或序列号141的氨基酸序列、CDR2含有序列号142或序列号143的氨基酸序列和CDR3含有序列号144或序列号145的氨基酸序列的氨基酸序列，[0426] (13)CDR1含有序列号146或序列号147的氨基酸序列、CDR2含有序列号148或序列号149的氨基酸序列和CDR3含有序列号150或序列号151的氨基酸序列的氨基酸序列，和[0427] (14)CDR1含有序列号152或序列号153的氨基酸序列、CDR2含有序列号154或序列号155的氨基酸序列和CDR3含有序列号156或序列号157的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0428] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的抗体的更具体的实施方式，可以例示抗体的重链的CDR具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0429] (1)CDR1含有序列号76的氨基酸序列、CDR2含有序列号78的氨基酸序列和CDR3含有序列号80的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0430] (2)CDR1含有序列号82的氨基酸序列、CDR2含有序列号84的氨基酸序列和CDR3含有序列号86的氨基酸序列的氨基酸序列链，
[0431] (3)CDR1含有序列号88的氨基酸序列、CDR2含有序列号90的氨基酸序列和CDR3含有序列号92的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0432] (4)CDR1含有序列号94的氨基酸序列、CDR2含有序列号96的氨基酸序列和CDR3含有序列号98的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0433] (5)CDR1含有序列号100的氨基酸序列、CDR2含有序列号102的氨基酸序列和CDR3含有序列号104的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0434] (6)CDR1含有序列号106的氨基酸序列、CDR2含有序列号108的氨基酸序列和CDR3含有序列号109的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0435] (7)CDR1含有序列号111的氨基酸序列、CDR2含有序列号113的氨基酸序列和CDR3含有序列号115的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0436] (8)CDR1含有序列号117的氨基酸序列、CDR2含有序列号119的氨基酸序列和CDR3含有序列号120的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0437] (9)CDR1含有序列号122的氨基酸序列、CDR2含有序列号124的氨基酸序列和CDR3含有序列号126的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0438] (10)CDR1含有序列号128的氨基酸序列、CDR2含有序列号130的氨基酸序列和CDR3含有序列号132的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0439] (11)CDR1含有序列号134的氨基酸序列、CDR2含有序列号136的氨基酸序列和CDR3含有序列号138的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0440] (12)CDR1含有序列号140的氨基酸序列、CDR2含有序列号142的氨基酸序列和CDR3含有序列号144的氨基酸序列的氨基酸序列，
[0441] (13)CDR1含有序列号146的氨基酸序列、CDR2含有序列号148的氨基酸序列和CDR3含有序列号150的氨基酸序列的氨基酸序列、和
[0442] (14)CDR1含有序列号152的氨基酸序列、CDR2含有序列号154的氨基酸序列和CDR3含有序列号156的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0443] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的抗体的优选的轻链与重链的组合，可以例示CDR为以下所示的(1)～(14)中记载的组合。即，
[0444] (1)CDR1具有序列号6或序列号7的氨基酸序列、CDR2具有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Thr-Ser和CDR3具有序列号10的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号76或序列号77的氨基酸序列、CDR2具有序列号78或序列号79的氨基酸序列和CDR3具有序列号80或序列号81的氨基酸序列的重链的组合，
[0445] (2)CDR1具有序列号11或序列号12的氨基酸序列、CDR2具有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser和CDR3具有序列号15的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号82或序列号83的氨基酸序列、CDR2具有序列号84或序列号85的氨基酸序列和CDR3具有序列号86或序列号87的氨基酸序列的重链的组合，
[0446] (3)CDR1具有序列号16或序列号17的氨基酸序列、CDR2具有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列Lys-Val-Ser和CDR3具有序列号20的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号88或序列号89的氨基酸序列、CDR2具有序列号90或序列号91的氨基酸序列和CDR3具有序列号92或序列号93的氨基酸序列的重链的组合，
[0447] (4)CDR1具有序列号21或序列号22的氨基酸序列、CDR2具有序列号23或序列号24的氨基酸序列或Asp-Thr-Ser和CDR3具有序列号25的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号94或序列号95的氨基酸序列、CDR2具有序列号96或序列号97的氨基酸序列和CDR3具有序列号98或序列号99的氨基酸序列的重链的组合，
[0448] (5)CDR1具有序列号26或序列号27的氨基酸序列、CDR2具有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser和CDR3具有序列号30的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号100或序列号101的氨基酸序列、CDR2具有序列号102或序列号103的氨基酸序列和CDR3具有序列号104或序列号105的氨基酸序列的重链的组合，
[0449] (6)CDR1具有序列号31或序列号32的氨基酸序列、CDR2具有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser)和CDR3具有序列号35的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号106或序列号107的氨基酸序列、CDR2具有序列号108的氨基酸序列或序列号266的氨基酸序列和CDR3具有序列号109或序列号110的氨基酸序列的重链的组合，[0450] (7)CDR1具有序列号36或序列号37的氨基酸序列、CDR2具有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列Gln-hr-Ser和CDR3具有序列号40的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号111或序列号112的氨基酸序列、CDR2具有序列号113或序列号114的氨基酸序列和CDR3具有序列号115或序列号116的氨基酸序列的重链的组合，
[0451] (8)CDR1具有序列号41或序列号42的氨基酸序列、CDR2具有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列Gly-Thr-Ser和CDR3具有序列号45的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号117或序列号118的氨基酸序列、CDR2具有序列号119的氨基酸序列或序列号267的氨基酸序列和CDR3具有序列号120或序列号121的氨基酸序列的重链的组合，[0452] (9)CDR1具有序列号46或序列号47的氨基酸序列、CDR2具有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列Phe-Thr-Ser和CDR3具有序列号50的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号122或序列号123的氨基酸序列、CDR2具有序列号124或序列号125的氨基酸序列和CDR3具有序列号126或序列号127的氨基酸序列的重链的组合，
[0453] (10)CDR1具有序列号51或序列号52的氨基酸序列、CDR2具有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列Ala-Ala-Ser和CDR3具有序列号55的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号128或序列号129的氨基酸序列、CDR2具有序列号130或序列号131的氨基酸序列和CDR3具有序列号132或序列号133的氨基酸序列的重链的组合，
[0454] (11)CDR1具有序列号56或序列号57的氨基酸序列、CDR2具有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser和CDR3具有序列号60的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号134或序列号135的氨基酸序列、CDR2具有序列号136或序列号137的氨基酸序列和CDR3具有序列号138或序列号139的氨基酸序列的重链的组合，
[0455] (12)CDR1具有序列号61或序列号62的氨基酸序列、CDR2具有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列Trp-Ser-Ser和CDR3具有序列号65的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号140或序列号141的氨基酸序列、CDR2具有序列号142或序列号143的氨基酸序列和CDR3具有序列号144或序列号145的氨基酸序列的重链的组合，
[0456] (13)CDR1具有序列号66或序列号67的氨基酸序列、CDR2具有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列Tyr-Ala-Ser和CDR3具有序列号70的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号146或序列号147的氨基酸序列、CDR2具有序列号148或序列号149的氨基酸序列和CDR3具有序列号150或序列号151的氨基酸序列的重链的组合、和
[0457] (14)CDR1具有序列号71或序列号72的氨基酸序列、CDR2具有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列Asp-Thr-Ser和CDR3具有序列号75的氨基酸序列的轻链、与CDR1具有序列号152或序列号153的氨基酸序列、CDR2具有序列号154或序列号155的氨基酸序列和CDR3具有序列号156或序列号157的氨基酸序列的重链的组合。
[0458] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的抗体的轻链与重链的组合的具体实施方式，可以例示CDR具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的组合的抗体。即，[0459] (1)CDR1具有序列号6的氨基酸序列、CDR2具有序列号8的氨基酸序列和CDR3具有序列号10的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号76的氨基酸序列、CDR2具有序列号78的氨基酸序列和CDR3具有序列号80的氨基酸序列的重链的组合，
[0460] (2)CDR1具有序列号11的氨基酸序列、CDR2具有序列号13的氨基酸序列和CDR3具有序列号15的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号82的氨基酸序列、CDR2具有序列号84的氨基酸序列和CDR3具有序列号86的氨基酸序列的重链的组合，
[0461] (3)CDR1具有序列号16的氨基酸序列、CDR2具有序列号18的氨基酸序列和CDR3具有序列号20的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号88的氨基酸序列、CDR2具有序列号90的氨基酸序列和CDR3具有序列号92的氨基酸序列的重链的组合，
[0462] (4)CDR1具有序列号21的氨基酸序列、CDR2具有序列号23的氨基酸序列和CDR3具有序列号25的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号94的氨基酸序列、CDR2具有序列号96的氨基酸序列和CDR3具有序列号98的氨基酸序列的重链的组合，
[0463] (5)CDR1具有序列号26的氨基酸序列、CDR2具有序列号28的氨基酸序列和CDR3具有序列号30的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号100的氨基酸序列、CDR2具有序列号102的氨基酸序列和CDR3具有序列号104的氨基酸序列的重链的组合，
[0464] (6)CDR1具有序列号31的氨基酸序列、CDR2具有序列号33的氨基酸序列和CDR3具有序列号35的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号106的氨基酸序列、CDR2具有序列号108的氨基酸序列和CDR3具有序列号109的氨基酸序列的重链的组合，
[0465] (7)CDR1具有序列号36的氨基酸序列、CDR2具有序列号38的氨基酸序列和CDR3具有序列号40的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号111的氨基酸序列、CDR2具有序列号113的氨基酸序列和CDR3具有序列号115的氨基酸序列的重链的组合，
[0466] (8)CDR1具有序列号41的氨基酸序列、CDR2具有序列号43的氨基酸序列和CDR3具有序列号45的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号117的氨基酸序列、CDR2具有序列号119的氨基酸序列和CDR3具有序列号120的氨基酸序列的重链的组合，
[0467] (9)CDR1具有序列号46的氨基酸序列、CDR2具有序列号48的氨基酸序列和CDR3具有序列号50的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号122的氨基酸序列、CDR2具有序列号124的氨基酸序列和CDR3具有序列号126的氨基酸序列的重链的组合，
[0468] (10)CDR1具有序列号51的氨基酸序列、CDR2具有序列号53的氨基酸序列和CDR3具有序列号55的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号128的氨基酸序列、CDR2具有序列号130的氨基酸序列和CDR3具有序列号132的氨基酸序列的重链的组合，
[0469] (11)CDR1具有序列号56的氨基酸序列、CDR2具有序列号58的氨基酸序列和CDR3具有序列号60的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号134的氨基酸序列、CDR2具有序列号136的氨基酸序列和CDR3具有序列号138的氨基酸序列的重链的组合，
[0470] (12)CDR1具有序列号61的氨基酸序列、CDR2具有序列号63的氨基酸序列和CDR3具有序列号65的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号140的氨基酸序列、CDR2具有序列号142的氨基酸序列和CDR3具有序列号144的氨基酸序列的重链的组合，
[0471] (13)CDR1具有序列号66的氨基酸序列、CDR2具有序列号68的氨基酸序列和CDR3具有序列号70的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号146的氨基酸序列、CDR2具有序列号148的氨基酸序列和CDR3具有序列号150的氨基酸序列的重链的组合和
[0472] (14)CDR1具有序列号71的氨基酸序列、CDR2具有序列号73的氨基酸序列和CDR3具有序列号75的氨基酸序列的轻链与CDR1具有序列号152的氨基酸序列、CDR2具有序列号154的氨基酸序列和CDR3具有序列号156的氨基酸序列的重链的组合。
[0473] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的人源化抗体的优选的实施方式，可以列举使用序列号218～序列号245所示的小鼠抗人TfR抗体的轻链和重链的可变区的氨基酸序列作为CDR而制作的人源化抗体。人源化抗体通过将这些小鼠抗人TfR抗体的轻链和重链的可变区的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的可变区的合适位置而制作。
[0474] 例如，可以用序列号218的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第34位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第56位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第89位～第97位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号219的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第105位的任意的连续3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0475] 另外，例如，可以用序列号220的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第34位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第56位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第89位～第97位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号221的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第112位的任意的连续3个以上或14个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0476] 进而，例如，可以用序列号222的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第39位的任意的连续3个以上或11个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第55位～第61位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第94位～第102位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号223的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第107位的任意的连续3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0477] 进而，例如，可以用序列号224的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第33位的任意的连续3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第49位～第55位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第88位～第96位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号225的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第111位的任意的连续3个以上或13个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0478] 进而，例如，可以用序列号226的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第33位的任意的连续3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第49位～第55位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第88位～第95位的任意的连续3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。可以用序列号227的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第107位的任意的连续3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0479] 进而，例如，可以用序列号228的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第34位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第56位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第89位～第97位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号229的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第65位的任意的连续3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第96位～第101位的任意的连续3个以上或4个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0480] 进而，例如，可以用序列号230的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第33位的任意的连续3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第49位～第55位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第88位～第96位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号231的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第109位的任意的连续3个以上或11个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0481] 进而，例如，可以用序列号232的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第33位的任意的连续3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第49位～第55位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第88位～第96位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号233的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第65位的任意的连续3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第96位～第101位的任意的连续3个以上或4个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0482] 进而，例如，可以用序列号234的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第33位的任意的连续3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第49位～第55位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第88位～第96位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号235的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第106位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0483] 进而，例如，可以用序列号236的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第34位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第56位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第89位～第97位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号237的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第109位的任意的连续3个以上或11个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0484] 进而，例如，可以用序列号238的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第34位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第56位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第89位～第97位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号239的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第107位的任意的连续3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0485] 进而，例如，可以用序列号240的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第34位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第56位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第89位～第97位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号241的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第108位的任意的连续3个以上或10个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0486] 进而，例如，可以用序列号242的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第34位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第50位～第56位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第89位～第97位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号243的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第107位的任意的连续3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0487] 进而，例如，可以用序列号244的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第24位～第33位的任意的连续3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第49位～第55位的任意的连续3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第88位～第96位的任意的连续3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的轻链。此外，可以用序列号245的氨基酸序列中、作为CDR1的由位于第26位～第35位的任意的连续3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR2的由位于第51位～第66位的任意的连续3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为CDR3的由位于第97位～第107位的任意的连续3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应CDR的氨基酸序列，将所得产物作为人源化抗体的重链。可以将这样得到的人源化抗体的轻链和重链组合而制作人源化抗体。
[0488] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的人源化抗体的优选的实施方式，可以例示具有以下所示的(1)～(3)中记载的氨基酸序列的方式。即，
[0489] (1)一种抗hTfR抗体，其中，轻链的可变区含有选自由序列号158、序列号159、序列号160、序列号161、序列号162和序列号163中记载的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列，重链的可变区含有选自由序列号166、序列号167、序列号168、序列号169、序列号170和序列号171中记载的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列，
[0490] (2)一种抗hTfR抗体，其中，轻链的可变区含有选自由序列号174、序列号175、序列号176、序列号177、序列号178和序列号179中记载的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列，重链的可变区含有选自由序列号182、序列号183、序列号184、序列号185、序列号186和序列号187中记载的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列，
[0491] (3)一种抗hTfR抗体，其中，轻链的可变区含有选自由序列号190、序列号191、序列号192、序列号193、序列号194和序列号195中记载的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列，重链的可变区含有选自由序列号204、序列号205、序列号206、序列号207、序列号208和序列号209中记载的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列。
[0492] 序列号158、序列号159、序列号160、序列号161、序列号162和序列号163中记载的轻链的可变区的氨基酸序列中，CDR1含有序列号6或7的氨基酸序列、CDR2含有序列号8或9的氨基酸序列、CDR3含有序列号10的氨基酸序列。但是，就序列号158～162中记载的轻链的可变区的氨基酸序列而言，述及CDR时，CDR的序列不限于这些，含有这些CDR的氨基酸序列的区域、含有这些CDR的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为CDR。
[0493] 序列号166、序列号167、序列号168、序列号169、序列号170和序列号171中记载的重链的可变区的氨基酸序列中，CDR1含有序列号76或77的氨基酸序列、CDR2含有序列号78或79的氨基酸序列、CDR3含有序列号80或81的氨基酸序列。但是，就序列号166～171中记载的重链的可变区的氨基酸序列而言，述及CDR时，CDR的序列不限于这些，含有这些CDR的氨基酸序列的区域、含有这些CDR的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为CDR。
[0494] 序列号174、序列号175、序列号176、序列号177、序列号178和序列号179中记载的轻链的可变区的氨基酸序列中，CDR1含有序列号11或12的氨基酸序列、CDR2含有序列号13或14的氨基酸序列、CDR3含有序列号15的氨基酸序列。但是，就序列号174～179中记载的轻链的可变区的氨基酸序列而言，述及CDR时，CDR的序列不限于这些，含有这些CDR的氨基酸序列的区域、含有这些CDR的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为CDR。
[0495] 序列号182、序列号183、序列号184、序列号185、序列号186和序列号187中记载的重链的可变区的氨基酸序列中，CDR1含有序列号82或83的氨基酸序列、CDR2含有序列号84或85的氨基酸序列、CDR3含有序列号86或87的氨基酸序列。但是，就序列号182～187中记载的重链的可变区的氨基酸序列而言，述及CDR时，CDR的序列不限于这些，含有这些CDR的氨基酸序列的区域、含有这些CDR的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为CDR。
[0496] 序列号190、序列号191、序列号192、序列号193、序列号194和序列号195中记载的轻链的可变区的氨基酸序列中，CDR1含有序列号16或17的氨基酸序列、CDR2含有序列号18或19的氨基酸序列、CDR3含有序列号20的氨基酸序列。但是，就序列号190～195中记载的轻链的可变区的氨基酸序列而言，述及CDR时，CDR的序列不限于这些，含有这些CDR的氨基酸序列的区域、含有这些CDR的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为CDR。
[0497] 序列号204、序列号205、序列号206、序列号207、序列号208和序列号209中记载的重链的可变区的氨基酸序列中，CDR1含有序列号88或89的氨基酸序列、CDR2含有序列号90或91的氨基酸序列、CDR3含有序列号92或93的氨基酸序列。但是，就序列号204～209中记载的重链的可变区的氨基酸序列而言，述及CDR时，CDR的序列不限于这些，含有这些CDR的氨基酸序列的区域、含有这些CDR的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为CDR。
[0498] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的人源化抗体的更具体的实施方式，可以列举：
[0499] (1a)轻链的可变区含有序列号163的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号171的氨基酸序列的抗体，
[0500] (2a)轻链的可变区含有序列号179的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号187的氨基酸序列的抗体，
[0501] (3a)轻链的可变区含有序列号191的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体，
[0502] (3b)轻链的可变区含有序列号193的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体，
[0503] (3c)轻链的可变区含有序列号194的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体，和
[0504] (3d)轻链的可变区含有序列号195的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体。
[0505] 作为应与BDNF融合的对hTfR具有亲和性的人源化抗体的更具体的实施方式，可以列举：
[0506] (1b)轻链含有序列号164的氨基酸序列且重链含有序列号172的氨基酸序列的抗体，
[0507] (2b)轻链含有序列号180的氨基酸序列且重链含有序列号188的氨基酸序列的抗体，
[0508] (3e)轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
[0509] (3f)轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
[0510] (3g)轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
[0511] (3h)轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
[0512] (3i)轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体，
[0513] (3j)轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体，
[0514] (3k)轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体，和
[0515] (31)轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体。
[0516] 如上所述地例示出应与hBDNF融合的对hTfR具有亲和性的人源化抗体的优选的实施方式。就这些抗hTfR抗体的轻链和重链而言，可以出于将抗hTfR抗体与hTfR的亲和性调整至期望程度等目的，向其可变区的氨基酸序列中适当引入置换、缺失、添加等变异。此外，还可以出于将hBDNF的功能等调整为期望功能的目的，向hBDNF中适当引入置换、缺失、添加等变异。
[0517] 在用其它氨基酸置换轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使轻链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，另外进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0518] 在轻链的可变区添加氨基酸时，在轻链的可变区的氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的轻链的可变区的氨基酸序列与原始的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示
90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0519] 特别是用其它氨基酸置换轻链的各CDR各自的氨基酸序列中的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使各CDR各自的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0520] 在向轻链的各CDR各自的氨基酸序列中添加氨基酸时，在该氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个、更进一步优选1个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR各自的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0521] 在用其它氨基酸置换重链的可变区的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。使重链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，另外进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0522] 在向重链的可变区添加氨基酸时，在重链的可变区的氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的重链的可变区的氨基酸序列与原始的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0523] 特别是用其它氨基酸置换重链的各CDR各自的氨基酸序列中的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使各CDR各自的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0524] 在向重链的各CDR各自的氨基酸序列中添加氨基酸时，在该氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR各自的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0525] 还可以将对上述抗hTfR抗体的轻链的可变区的变异与对上述抗hTfR抗体的重链的可变区的变异组合，在抗hTfR抗体的轻链和重链的可变区这两者中引入变异。
[0526] 作为上述抗hTfR抗体的轻链和重链的氨基酸序列中的氨基酸的利用其它氨基酸进行的置换，可以列举例如：作为酸性氨基酸的天冬氨酸与谷氨酸的相互置换、作为酰胺型氨基酸的天冬酰胺与谷氨酰胺的相互置换、作为碱基性氨基酸的赖氨酸与精氨酸的相互置换、作为支链氨基酸的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的相互置换、作为脂肪族氨基酸的甘氨酸与丙氨酸的相互置换、作为羟基氨基酸的丝氨酸与苏氨酸的相互置换、作为芳香族氨基酸的苯丙氨酸与酪氨酸的相互置换等。
[0527] 需要说明的是，在向抗hTfR抗体或hBDNF中引入变异而在C末端或N末端添加了氨基酸的情况下，如果该添加的氨基酸在使抗hTfR抗体与BDNF融合时位于抗hTfR抗体与BDNF之间，则该添加的氨基酸构成接头的一部分。
[0528] 本发明的融合蛋白可以通过后述实施例中记载的方法或本领域中公知的方法来制造。
[0529] 例如，通过如本说明书的实施例16和17中记载的那样分别构建具有编码在所取得的抗人转铁蛋白抗体的重链的C末端直接或通过接头(例如，Gly-Ser)融合了BDNF的N末端或C末端的融合蛋白的DNA的表达用载体、和具有编码该抗体的轻链的DNA的动植物细胞表达用载体，一并导入到合适的宿主细胞中，可以得到产生本发明的融合蛋白的细胞或转基因动植物。或者，通过分别构建具有编码在所取得的抗人转铁蛋白抗体的轻链的C末端直接或通过接头(例如，Gly-Ser)融合了BDNF的N末端或C末端的融合蛋白的DNA的表达用载体、和具有编码该抗体的重链的DNA的表达用载体，一并导入到合适的宿主细胞中，可以得到产生本发明的融合蛋白的细胞或转基因动植物。
[0530] 如前述那样构建的融合蛋白基因可以通过公知的方法来进行表达、并取得。为了使融合蛋白的表达量最大化，可以根据用于表达融合蛋白的细胞或动物种属的密码子使用频率对融合蛋白基因的碱基序列进行最优化。在哺乳类细胞的情况下，可以利用在常用的有用的启动子、要表达的抗体基因的3’侧下游功能性地结合了多聚A信号的DNA或含有该DNA的载体来使其表达。例如，作为启动子/增强子，可以列举人巨细胞病毒早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
[0531] 此外，作为其它可以用于本发明中使用的抗体表达的启动子/增强子，还可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子、人延伸因子1α(hEF1α)等源自哺乳类细胞的启动子/增强子。
[0532] 例如，在使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108-114)可以容易地实施，此外，在使用hEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地实施。
[0533] 在大肠杆菌的情况下，可以使常用的有用的启动子、用于抗体分泌的信号序列、要表达的抗体基因功能性地结合并使其表达。例如，作为启动子，可以列举lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，按照Ward等的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.et al.，FASEB J.(1992)6，2422-2427)即可，使用araB启动子时，按照Better等的方法(Better，M.et al.，Science(1988)240，1041-1043)即可。
[0534] 作为用于抗体分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al.，J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。(参照例如国际公开第96/30394号)。
[0535] 作为复制起点，可以使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点，进而，为了提高在宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体可以含有作为选择标记的氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
[0536] 在使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的产生系统。作为动物细胞，已知有：(1)哺乳类细胞，例如CHO、HEK293、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney，幼仑鼠肾)，HeLa、Vero等；(2)两栖类细胞，例如非洲爪蟾卵母细胞；或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知有源自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可以对其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有：酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)属，例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
[0537] 在使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
[0538] 通过转化向这些细胞中导入目标抗体基因，对转化后的细胞进行离体(in vitro)培养，从而得到抗体。培养按照公知的方法来进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，还可以组合使用胎牛血清(FCS)等血清补液。此外，也可以将导入了抗体基因的细胞移植到动物的腹腔等中，从而在体内(in vivo)产生抗体。
[0539] 作为体内的产生系统，可以列举使用动物的产生系统、使用植物的产生系统。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生系统等。
[0540] 作为哺乳类动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。此外，作为昆虫，可以使用蚕。使用植物时，可以使用例如烟草。
[0541] 向这些动物或植物中导入融合蛋白基因，在动物或植物的体内产生融合蛋白并回收。例如，将融合蛋白基因插入到编码山羊β-酪蛋白之类在乳汁中特征性地产生的蛋白质的基因中间，来制备融合基因。将含有插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊胚胎中，将该胚胎导入到雌性山羊中。从接受了胚胎的山羊所生产的转基因山羊或然后代所产生的乳汁中得到期望的融合蛋白。为了使由转基因山羊产生的含有期望的融合蛋白的乳汁量增加，可以对转基因山羊适当地使用激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
[0542] 此外，使用蚕时，使蚕感染插入有目标融合蛋白基因的杆状病毒，由该蚕的体液得到期望的抗体(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592-594)。进而，使用烟草时，将目标融合蛋白基因插入植物表达用载体、例如pMON 530中，将该载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)之类的细菌中。使烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)感染该细菌，由该烟草的叶得到期望的融合蛋白(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
[0543] 可以从细胞内外、宿主细胞分离如前述那样产生、表达的融合蛋白，并纯化至均一。本发明中使用的融合蛋白的分离、纯化可以通过亲和色谱来进行。作为亲和色谱所用的柱，可以列举例如：蛋白A柱、蛋白G柱、蛋白L柱。作为蛋白A柱中使用的载体，可以列举例如：Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，也可以使用通常用于蛋白质的分离，纯化方法，并没有任何限定。根据需要，也可以将上述亲和色谱以外的色谱、过滤、超滤、盐析、透析等组合，对本发明中使用的抗体进行分离、纯化。作为色谱，可以列举例如离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤等。这些色谱也可以用于HPLC(High performance liquid chromatography)。此外也可以使用反相HPLC(reverse phase HPLC)。
[0544] BDNF的同源二聚体与位于靶细胞表面上的BDNF受体(TrkB)特异性结合，在中枢神经和周围神经系统的细胞分化、功能维持、突触形成以及损伤时的再生和修复等中发挥重要的作用(非专利文献1、非专利文献2)。由于这样的作用，BDNF作为能够广泛用于中枢神经和周围神经有障碍的疾病的治疗的蛋白质而受到关注。
[0545] 此外，据报道：在亨延顿氏舞蹈病、帕金森病、阿尔茨海默病等各种神经系统疾病中，BDNF的表达下调、量降低(Nuerosci.Lett.(1999)270：45-48)，已知用浸透压泵等将BDNF持续注入这些疾病模型动物的脑内或髓腔内时，显示出抑制纹状体的神经细胞死亡、改善运动障碍、改善记忆力等效果(J.Nuerosci.(2004)24：7727-7739，Proc.Nati.Acad.Sci.USA(1992)89：11347-11351)，Nat.Med.(2009)15：331-337)。
[0546] 进而还已知，BDNF具有牙齿相关细胞和血管内皮细胞的增殖、分化促进、摄食调节、糖代谢等多种作用(Tissue Eng.(2005)11：1618-629，肥満研究(2009)15：97-99)。
[0547] 由于这些作用，期待开发BDNF来作为阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病等神经退行性疾病、肌萎缩性侧索硬化症等脊髓退行性疾病、以及糖尿病性神经障碍、脑缺血性疾病、发育障碍、精神分裂症、抑郁症和Rett综合症等各种疾病的治疗剂(非专利文献3、非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6、非专利文献7、非专利文献8、WO91/03568)。
[0548] BDNF不能通过血脑屏障(BBB；Blood-Brain Barrier)，但本发明的融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白)能够通过BBB，因此外周给药的本发明的融合蛋白可迁移到脑内并发挥BDNF本来具有的效果。这样的BDNF的功能可以通过以下方法来确认。
[0549] 通过考察对BDNF受体(TrkB)的亲和力(Eur J Neurosci(1994)6：1389-1405)、以BDNF受体的磷酸化为指标的BDNF受体的活化(Biochim Biophys Acta(2015)1852：862-872)、与BDNF受体的活化相伴的细胞内钙增加等细胞内信号传导增强活性(Nature Reviews Neuroscience(2009)10：850-860)、对表达TrkB的神经细胞的增殖促进作用(岐阜药科大学纪要(2006)55：53-54)、生存维持作用(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry(2015)60：11-17)、轴突延长作用(J Biol Chem(2007)282：34525-34534)等，来离体评价BDNF的功能。作为离体使用的细胞，可以为内源性表达TrkB的细胞，也可以为外源性强制表达TrkB的细胞。例如，可以使用在BAF细胞、CHO细胞、PC-12细胞等中导入TrkB基因并强制表达的细胞、海马和纹状体等的原代培养神经细胞。
[0550] 此外，可以通过考察对帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、阿尔茨海默病等疾病模型动物的治疗效果(Proc.Nati.Acad.Sci.USA(1994)91：8920-8924)，来体内评价BDNF的功能。例如，可以用实施例2～5中记载的方法考察帕金森病模型动物的运动功能障碍改善作用、纹状体多巴胺量恢复效果、纹状体多巴胺神经再生效果等，来评价本发明的融合蛋白(TfR抗体-BDNF融合蛋白)在体内的BDNF生物活性。作为帕金森病模型，可以利用进行了已知会特异性破坏多巴胺神经的MPTP处置的小鼠和猴。
[0551] 需要说明的是，通过外周对于某种疾病模型动物、例如帕金森病模型动物给药本发明的融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白)，改善了该疾病或障碍则表明本发明的融合蛋白以BDNF可发挥本来具有的效果的程度到达了目标部位(例如脑内)，这意味着本发明的融合蛋白不限于该疾病、可以广泛用于治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病和障碍。
[0552] 本发明可以用于：通过给药含有治疗有效量的本发明的融合蛋白作为有效成分的药物组合物，来治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍。因此，本发明此外提供一种能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的预防和/或治疗剂，其含有本发明的融合蛋白作为有效成分。在此，“治疗”这一术语不仅是指完全治愈，而且也含有症状改善。
[0553] 作为能通过曝露于本发明的融合蛋白而受益的疾病或障碍，不仅含有由于BDNF的表达下调或量减少而发生的疾病或障碍，还含有能在BDNF作用下得到治疗的疾病或障碍，可以列举例如：神经系统的疾病或障碍(神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症、癫痫、自闭症、Rett综合症、West综合症、新生儿惊厥、痴呆伴发问题行为(例如徘徊、攻击性行为等)、焦虑症、疼痛、先天性巨结肠、快速眼动睡眠行为障碍等)及其它疾病或障碍。作为神经退行性疾病，可以列举以下的脑神经退行性疾病、脊髓退行性疾病、视网膜退行性疾病、周围神经退行性疾病等。
[0554] 作为脑神经退行性疾病，可以列举例如：脑神经系统的神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、路易体型痴呆、匹克氏病、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、唐氏综合症等)、脑缺血性疾病(脑卒中、脑梗塞、一过性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血、缺血性脑病、脑梗塞(腔隙性脑梗塞、动脉粥样硬化性脑梗死、心源性脑梗塞、出血性脑梗塞、其他梗塞)等)、创伤性脑损伤、脑白质病和多发性硬化等。
[0555] 作为脊髓退行性疾病，可以列举例如：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓损伤、各种原因引起的脊髓障碍、脊髓性进行性肌萎缩症、和脊髓小脑变性等。
[0557] 作为周围神经退行性疾病，可以列举例如：糖尿病性神经障碍、周围神经损伤、创伤性周围神经障碍、中毒、其它毒性物质引起的周围神经障碍、癌症化学治疗法引起的周围神经障碍、Guillain-Barre综合症、缺乏维生素等引起的周围神经障碍、淀粉样周围神经障碍、缺血性周围神经障碍、恶性肿瘤所伴随的周围神经障碍、尿毒症性周围神经障碍、物理原因引起的周围神经障碍、Charcot-Marie-Tooth病、酒精性周围神经障碍、植物性神经异常(无意识低血糖、胃轻瘫、神经性腹泻和便秘、勃起功能障碍、体位性低血压、心律失常、心力衰竭、无痛性心肌梗塞、出汗障碍、神经性膀胱等)、膀胱功能障碍(例如无抑制膀胱、反射性膀胱、自主性膀胱、知觉麻痹性膀胱、运动麻痹性膀胱等)等。
[0558] 作为其它疾病或障碍，可以列举例如：牙周病、糖尿病、糖尿病性心肌病、糖尿病足、炎症性肠疾病(例如溃疡性大肠炎、克罗恩病等)、听觉障碍、骨病(例如骨质疏松症等)、关节疾病(例如夏科氏关节、骨关节炎、风湿性关节炎等)等。
[0559] 本发明的融合蛋白可以以给药于血中并使其应该在中枢神经系统(CNS)中发挥药效的药剂形式使用。所述药剂大体上可通过基于点滴静脉注射等的静脉注射、皮下注射、肌肉注射给药于患者，但对给药途径没有特别限定。
[0560] 就本发明的融合蛋白而言，作为药剂可以以冷冻干燥品或水性液剂等形态提供给医疗机构。在水性液剂的情况下，可以以将药剂预先溶解于含有稳定剂、缓冲剂、等渗剂的溶液中并密封在药瓶或注射器中的制剂形式来提供。密封在注射器中的制剂通常被称为预填充注射器制剂。通过制成预填充注射器制剂，可以由患者本人容易地进行药剂的给药。
[0561] 在以水性液剂形式来提供时，水性液剂中所含的与抗hTfR抗体结合的BDNF的浓度应根据用法用量来适当调整，为例如0.01～5mg/mL。此外，水性液剂中所含的稳定剂只要是药剂学上允许的稳定剂则没有特别限定，可以优选使用非离子型表面活性剂。作为这样的非离子型表面活性剂，可以单独使用聚山梨醇酯、泊洛沙姆等或将这些组合使用。作为聚山梨醇酯，特别优选聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，作为泊洛沙姆，特别优选泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)。此外、水性液剂中所含的非离子型表面活性剂的浓度优选为0.01～1mg/mL，更优选为0.01～0.5mg/mL，进一步优选为0.1～0.5mg/mL。作为稳定剂，还可以使用组氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸等氨基酸。作为稳定剂使用时的、水性液剂中所含的氨基酸的浓度优选为0.1～40mg/mL，更优选为0.2～5mg/mL，进一步优选为0.5～4mg/mL。水性液剂中所含的缓冲剂只要是药剂学上允许的缓冲剂则没有特别限定，优选磷酸盐缓冲剂，特别优选磷酸钠缓冲剂。作为缓冲剂使用磷酸钠缓冲剂时的、磷酸钠的浓度优选为0.01～0.04M。此外，用缓冲剂调整的水性液剂的pH优选为5.5～7.2。水性液剂中所含的等渗剂只要是药剂学上允许的等渗剂则没有特别限定，可以优选单独使用氯化钠、甘露醇或将它们组合作为等渗剂。
[0562] 含有本发明的融合蛋白的上述药物的给药量还根据给药对象、对象疾病、症状、给药途径等而不同，例如在为了治疗和/或预防神经退行性疾病而使用时，给药量以有效量、例如治疗有效量计时，脑内的以BDNF计的浓度至少为约0.001ng/g以上、优选为超过0.01、0.1、1、10或100ng/g脑。此外，优选在给药1次后即使经过数天(1、2、3、4、5、6、7天)、2周、进而1个月BDNF的脑内水平也维持上升状态，以脑内维持浓度计，优选例如维持在超过约1ng/g脑、约10ng/g脑、约100ng/g脑、或约100ng/g脑的状态。
[0563] 例如，给药量虽然不限于这些，但在几个实施方式中，以1次给药量计可以在0.0001～1、000mg/kg体重的范围内选择。或者，也可以在每个患者0.001～100,000mg的范围内选择。通常以约0.01～1000mg、约0.1～100mg、约1～100mg、约0.05～500mg、约0.5～
50mg、或约5mg～50mg的给药量例如通过静脉内给药来进行给药。在症状特别重时，可以根据其症状而增加。
50mg、或约5mg～50mg的给药量例如通过静脉内给药来进行给药。在症状特别重时，可以根据其症状而增加。
[0564] 本发明的组合物、例如本发明的融合蛋白可以单独使用，或者也可以在不损害本发明的效果的范围内根据需要与其它药品或其它治疗法一起以同一制剂内或单独的组合物形式给药于患者。例如，作为阿尔茨海默型痴呆中与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举阿尔茨海默病治疗药，例如多奈哌齐盐酸盐、利凡斯的明、氢溴酸加兰他敏盐酸盐等乙酰胆碱酯酶抑制剂或盐酸美金刚。此外可以列举目前处于临床开发阶段的索拉奈珠单抗(N Engl J Med.(2014)370：311-21)、冈特奈卢单抗(Arch Neurol.(2012)69：198-207)等抗Aβ抗体、维贝司他(AAIC 2013，Boston：Abs 01-06-05，Jul 2013)、AZD-3293(AAIC2014，Copenhargen：Abs P1-363，Jul 2014)等β淀粉样蛋白产生抑制剂等。作为在阿尔茨海默型痴呆中可与本发明的药物组合物组合使用的治疗法，可以列举脑部活化型康复疗法等。作为在帕金森病中可与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举帕金森病治疗药，例如左旋多巴等多巴胺补充疗法药，他利克索、普拉克索，溴隐亭等多巴胺受体激动剂，MAO-B抑制剂，COMT抑制剂等多巴胺分解酶抑制剂，金刚烷胺和NOURIAST等多巴胺释放促进剂。作为在帕金森病中可与本发明的药物组合物组合使用的治疗法，可以列举丘脑刺激术、苍白球刺激术、底丘脑核刺激术等。作为在亨延顿氏舞蹈病中可与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举亨延顿氏舞蹈病治疗药，例如丁苯那嗪等单胺囊泡转运体2抑制剂。作为在脑缺血性疾病中可与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举依达拉奉(Radicut)等脑保护药。作为在脑缺血性疾病中可与本发明的药物组合物组合使用的治疗法，可以列举溶栓疗法、康复疗法等。
[0565] 对给药本发明的药物组合物的时机没有特别限定，可以适宜地为其它药物的给药或治疗的前后或同时。
[0566] 实施例
[0567] 以下参照实施例更详细地说明本发明，但并不意味者本发明受实施例限定。
[0568] 〔实施例1〕hTfR表达用载体的构建
[0569] 以人脾脏Quick Clone cDNA(Clontech公司)为模板，用引物hTfR5’(序列号214)和引物hTfR3’(序列号215)通过PCR扩增编码人转铁蛋白受体(hTfR)的基因片段。将扩增出的编码hTfR的基因片段用MluI和NotI消化，并插入到pCI-neo载体(Promega公司)的MluI和NotI之间。将得到的载体命名为pCI-neo(hTfR)。然后将该载体用MluI和NotI消化，切出编码hTfR的基因片段，将其整合到国际公开公报(WO2012/063799)中记载的表达载体pE-mIRES-GS-puro的MluI和NotI之间，从而构建hTfR表达用载体pE-mIRES-GS-puro(hTfR)。
[0570] 〔实施例2〕重组hTfR的制作
[0571] 利用电穿孔法向CHO-K1细胞中导入pE-mIRES-GS-puro(hTfR)后，用含有甲硫氨酸砜亚胺(MSX)和嘌呤霉素的CD OptiCHOTM培养基(Invitrogen公司)进行细胞的选择培养，得到重组hTfR表达细胞。培养该重组hTfR表达细胞来制备重组hTfR。
[0572] 〔实施例3〕使用重组hTfR免疫小鼠
[0573] 使用实施例2中制备的重组hTfR作为抗原来免疫小鼠。将抗原静脉内给药或腹腔内给药于小鼠来进行免疫。
[0574] 〔实施例4〕杂交瘤的制作
[0575] 在最后给药细胞之日起约1周后，摘出小鼠的脾脏并均质化，分离脾细胞。用聚乙二醇法将得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株(P3.X63.Ag8.653)进行细胞融合。在细胞融合结束后，将细胞悬浮于含有(1×)HAT补充剂(Life Technologies公司)和10％Ultra low IgG胎牛血清(Life Technologies公司)的RPMI1640培养基中，将细胞悬浮液以200μL/孔分注到20块96孔板中。用二氧化碳培养箱(37℃，5％CO2)将细胞培养10天后，在显微镜下观察各孔，选择存在单一集落的孔。
[0576] 在各孔的细胞达到几乎汇合的时刻回收培养上清，将其作为杂交瘤的培养上清，供于以下的筛选。
[0577] 〔实施例5〕高亲和性抗体产生细胞株的筛选
[0578] 将重组hTfR溶液(Sino Biologics公司)用50mM碳酸钠缓冲液(pH9.5～9.6)稀释而调整为5μg/mL的浓度，将其作为固相溶液。将固相溶液向Nunc MaxiSorpTM flat-bottom 96孔板(基材：聚苯乙烯，Nunc公司制)的各孔中分别添加50μL后，将板在室温下静置1小时，使重组hTfR吸附、固定于板。弃去固相溶液，将各孔用250μL洗涤液(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤3次后，向各孔中添加200μL封闭液(含有1％BSA的PBS)，将板在室温下静置1小时。
[0579] 弃去封闭液，将各孔用250μL洗涤液(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤3次后，向各孔中分别添加50μL产生小鼠抗人转铁蛋白受体抗体(小鼠抗hTfR抗体)的杂交瘤的培养上清，将板在室温下静置1小时，使培养上清中所含的小鼠抗hTfR抗体与重组hTfR结合。此时，作为对照，设置在孔中添加50μL不产生小鼠抗hTfR抗体的杂交瘤的培养上清的例子。此外，设置在加入了各培养上清的孔的横向的孔中添加50μL杂交瘤的培养用培养基的例子，将其作为空白对照孔(Mock well)。测定以n＝2来实施。然后弃去溶液，将各孔用250μL洗涤液(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。
[0580] 在上述各孔中添加100μL的HRP标记山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体溶液(Promega公司)，将板在室温下静置1分钟。然后弃去溶液，将各孔用250μL的洗涤液(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。然后向各孔中添加50μL的显色用底物液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase(Promega公司)，在室温下静置10～20分钟。然后向各孔中添加100μL的终止液(2N硫酸)后，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。对各培养上清和对照各取2个孔的平均值，从这些平均值中分别减去各培养上清和对照各自设置的2个空白对照孔的平均值，将结果作为测定值。
[0581] 选择显示高测定值的孔中所添加的培养上清所对应的14种杂交瘤细胞，作为产生对hTfR显示高亲和性的抗体(高亲和性抗hTfR抗体)的细胞株(高亲和性抗体产生细胞株)。将这14种细胞株编号为克隆1株～克隆14株。此外，将克隆1株～克隆14株所产生的抗hTfR抗体分别设为抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号14。
[0582] 〔实施例6〕高亲和性抗hTfR抗体的可变区的氨基酸序列的分析
[0583] 由实施例5中选择出的克隆1株～克隆14株制备cDNA，以这些cDNA为模板，扩增编码抗体的轻链和重链的基因。对扩增出的基因的碱基序列进行翻译，对于各细胞株所产生的抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号14的抗体分别确定轻链和重链的可变区的氨基酸序列。
[0584] 抗hTfR抗体号1是轻链的可变区含有序列号218的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号219的氨基酸序列的抗体。此外，轻链的可变区中，CDR1含有序列号6或7、CDR2含有序列号8或9、CDR3含有序列号10的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号76或77、CDR2含有序列号78或79、CDR3含有序列号80或81的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0585] 抗hTfR抗体号2是轻链的可变区含有序列号220的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号221的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号11或12、CDR2含有序列号13或14、CDR3含有序列号15的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号82或83、CDR2含有序列号84或85、CDR3含有序列号86或87的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0586] 抗hTfR抗体号3是轻链的可变区含有序列号222的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号223的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号16或17、CDR2含有序列号18或19、CDR3含有序列号20中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号88或89、CDR2含有序列号90或91、CDR3含有序列号92或93的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0587] 抗hTfR抗体号4是轻链的可变区含有序列号224的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号225的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号21或22、CDR2含有序列号23或24、CDR3含有序列号25的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号94或95、CDR2含有序列号96或97、CDR3含有序列号98或99的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0588] 抗hTfR抗体号5是轻链的可变区含有序列号226的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号227的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号26或27、CDR2含有序列号28或29、CDR3含有序列号30的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号100或101、CDR2含有序列号102或103、CDR3含有序列号104或105的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0589] 抗hTfR抗体号6是轻链的可变区含有序列号228的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号229的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号31或32、CDR2含有序列号33或34、CDR3含有序列号35中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号106或107、CDR2含有序列号108或266、CDR3含有序列号109或110中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0590] 抗hTfR抗体号7是轻链的可变区含有序列号230中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号231的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号36或37、CDR2含有序列号38或39、CDR3含有序列号40中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号111或112、CDR2含有序列号113或114、CDR3含有序列号115或116中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0591] 抗hTfR抗体号8是轻链的可变区含有序列号232中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号233中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号41或42、CDR2含有序列号43或44、CDR3含有序列号45中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号117或118、CDR2含有序列号119或267、CDR3含有序列号120或121中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0592] 抗hTfR抗体号9是轻链的可变区含有序列号234中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号235中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号46或47、CDR2含有序列号48或49、CDR3含有序列号50中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号122或123、CDR2含有序列号124或125、CDR3含有序列号126或127中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0593] 抗hTfR抗体号10是轻链的可变区含有序列号236中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号237中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号51或52、CDR2含有序列号53或54、CDR3含有序列号55中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号128或129、CDR2含有序列号130或131、CDR3含有序列号132或133中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0594] 抗hTfR抗体号11是轻链的可变区含有序列号238中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号239中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号56或57、CDR2含有序列号58或59、CDR3含有序列号60中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号134或135、CDR2含有序列号136或137、CDR3含有序列号138或139中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0595] 抗hTfR抗体号12是轻链的可变区含有序列号240中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号241中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号61或62、CDR2含有序列号63或64、CDR3含有序列号65中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号140或141、CDR2含有序列号142或143、CDR3含有序列号144或145中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0596] 抗hTfR抗体号13是轻链的可变区含有序列号242中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号243中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号66或67、CDR2含有序列号68或69、CDR3含有序列号70中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号146或147、CDR2含有序列号148或149、CDR3含有序列号150或151中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0597] 抗hTfR抗体号14是轻链的可变区含有序列号244中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号245中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号71或72、CDR2含有序列号73或74、CDR3含有序列号75中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号152或153、CDR2含有序列号154或155、CDR3含有序列号156或157中记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[0598] 将抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号14的轻链和重链的可变区中所含的氨基酸序列的序列号汇总示于表1。
[0599] 表1抗hTfR抗体号1～14的轻链和重链的可变区所含的氨基酸序列的序列号[0600]抗体号 轻链的可变区 重链的可变区
1 218 219
2 220 221
3 222 223
4 224 225
5 226 227
6 228 229
7 230 231
8 232 233
9 234 235
10 236 237
11 238 239
12 240 241
13 242 243
14 244 245
1 218 219
2 220 221
3 222 223
4 224 225
5 226 227
6 228 229
7 230 231
8 232 233
9 234 235
10 236 237
11 238 239
12 240 241
13 242 243
14 244 245
[0601] 将抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号14的轻链的可变区的CDR1～3和重链的可变区的CDR1～3中所含的氨基酸序列的序列号汇总示于表2。其中，表2例示出各CDR的氨基酸序列，但各CDR的氨基酸序列不限于表2中记载的氨基酸序列，认为含有这些氨基酸序列的区域的氨基酸序列、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可作为CDR。
[0602] 表2抗hTfR抗体号1～14的轻链和重链的可变区的CDR1～3所含的氨基酸序列的序列号(各CDR的氨基酸序列的例示)
[0603]
[0604] 〔实施例7〕抗hTfR抗体与人TfR和猴TfR的亲和性的测定
[0605] 抗hTfR抗体与人TfR和猴TfR的亲和性的测定用OctetRED96(ForteBio公司，Pall公司的一个部门)来实施，所述OctetRED96为利用生物膜层干涉法(BioLayer Interferometry：BLI)的生物分子相互作用分析系统。对生物膜层干涉法的基本原理进行简单说明。对固定有传感器芯片表面的生物分子层(Layer)投射特定波长的光时，光被生物分子层和作为内部参照的层的两个表面反射，产生光的干涉波。测定试样中的分子与传感器芯片表面的生物分子结合而使传感器前端的层的厚度增加，使干涉波产生波长偏移。通过测定该波长偏移的变化，可以实时进行固定于传感器芯片表面的生物分子所结合的分子数的定量和动力学分析。测定大体上按照OctetRED96所附的操作手册来实施。作为人TfR，使用N末端添加有组氨酸标签的、具有序列号1所示的氨基酸序列中的从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的hTfR的胞外区的氨基酸序列的重组人TfR(r人TfR：Sino Biological公司)。作为猴TfR，使用N末端添加有组氨酸标签的、具有序列号2所示的氨基酸序列中的从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的食蟹猴的TfR的胞外区的氨基酸序列的重组猴TfR(r猴TfR：Sino Biological公司)。
[0606] 将实施例5中选择出的克隆1株～克隆14株分别按照细胞浓度达到约2×105个/mL的方式用含有(1×)HAT补充剂(Life Technologies公司)和10％Ultra low IgG胎牛血清(Life Technologies公司)的RPMI1640培养基稀释，向1L的三角烧瓶中加入200mL的细胞悬浮液，在37℃下在含有5％CO2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(Millipore公司)过滤，作为培养上清。将回收的培养上清上样到预先用含有150mM NaCl的为柱体积3倍体积的20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡化的ProteinG柱(柱体积：1mL，GE Healthcare公司)。然后用柱体积的5倍体积的同一缓冲液洗涤柱后，用含有150mM NaCl的柱体积的4倍体积的50mM甘氨酸缓冲液(pH2.8)洗脱所吸附的抗体，收集洗脱级分。对洗脱级分添加1M Tris缓冲液(pH8.0)将pH调整为7.0。将其作为抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号14的纯化品用于以下的实验。
[0607] 将纯化后的各抗体(抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号14)分别用HBS-P+(含有150mM NaCl、50μM EDTA和0.05％表面活性剂P20的10mM HEPES)进行2级稀释，制备0.78125～50nM(0.117～7.5μg/mL)的7级浓度的抗体溶液。将该抗体溶液作为样品溶液。将r人TfR和r猴TfR分别用HBS-P+稀释，制备25μg/mL的溶液，分别作为r人TfR-ECD(Histag，组氨酸标签)溶液和r猴TfR-ECD(Histag)溶液。
[0608] 将上述进行2级稀释而制备的样品溶液以200μL/孔添加至96孔板，黑色(greiner bio-one公司)中。此外，将上述制备的r人TfR-ECD(Histag)溶液或r猴TfR-ECD(Histag)溶液以200μL/孔添加至规定的孔中。向基线、解离用和洗涤用的孔中以200μL/孔添加HBS-P+。向再生用的孔中以200μL/孔添加10mM甘氨酸-HCl，pH1.7。向活性化用的孔中以200μL/孔添加0.5mM NiCl2溶液。将该板和生物传感器(Biosensor/Ni-NTA：ForteBio公司，Pall公司的一个部门)设置在OctetRED96的规定位置。
[0609] 使OctetRED96在下述表3所示的条件下工作，在取得数据后，用OctetRED96附带的分析软件将结合反应曲线拟合为1∶1结合模型或2∶1结合模型，测定抗hTfR抗体与r人TfR和r猴TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)，算出解离常数(Kd)。需要说明的是，测定在25～30℃的温度下实施。
[0610] 表3 OctetRED96的工作条件
[0611]
[0612] 表4中示出抗hTfR抗体号1～14(表中，分别对应于抗体号1～14)与人TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kD)。
[0613] 表4抗hTfR抗体对人TfR的亲和性
[0614]抗体号 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
1 5.00x105 2.55x10-6 5.09x10-12
2 1.11x106 1.23x10-5 1.12x10-11
3 6.53x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
6 -4 -10
4 1.91x10 2.29x10 1.20x10
5 6.71x105 2.44x10-5 3.64x10-11
6 7.54x105 7.23x10-4 9.58x10-10
7 3.69x105 3.03x10-5 8.22x10-11
5 -7 -12
8 6.96x10 ＜1.0x10 ＜1.0x10
9 7.82x105 9.46x10-5 1.21x10-10
10 6.79x105 7.66x10-4 1.13x10-9
11 2.72x105 2.28x10-5 8.37x10-11
5 -4 -10
12 7.54x10 7.23x10 4.32x10
13 8.35x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
14 9.61x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
1 5.00x105 2.55x10-6 5.09x10-12
2 1.11x106 1.23x10-5 1.12x10-11
3 6.53x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
6 -4 -10
4 1.91x10 2.29x10 1.20x10
5 6.71x105 2.44x10-5 3.64x10-11
6 7.54x105 7.23x10-4 9.58x10-10
7 3.69x105 3.03x10-5 8.22x10-11
5 -7 -12
8 6.96x10 ＜1.0x10 ＜1.0x10
9 7.82x105 9.46x10-5 1.21x10-10
10 6.79x105 7.66x10-4 1.13x10-9
11 2.72x105 2.28x10-5 8.37x10-11
5 -4 -10
12 7.54x10 7.23x10 4.32x10
13 8.35x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
14 9.61x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
[0615] 表5中示出抗hTfR抗体号1～14(表中，分别对应于No.1～14)与猴TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kD)。
[0616] 表5抗hTfR抗体对猴TfR的亲和性
[0617]抗体号 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
1 2.80x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
2 4.18x105 1.75x10-6 4.18x10-11
3 3.89x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
4 7.54x105 1.21x10-4 1.61x10-10
5 5.19x105 7.58x10-4 1.46x10-9
6 4.95x105 2.36x10-4 1.23x10-10
7 2.66x105 4.54x10-6 1.71x10-11
8 5.52x105 5.07x10-3 9.18x10-9
9 6.99x105 1.47x10-4 2.10x10-9
10 3.87x105 1.22x10-2 3.16x10-8
11 1.24x105 4.21x10-4 3.38x10-9
12 5.05x105 1.26x10-4 2.49x10-10
5 -5 -10
13 5.91x10 7.29x10 1.23x10
14 7.00x105 3.61x10-5 5.16x10-11
1 2.80x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
2 4.18x105 1.75x10-6 4.18x10-11
3 3.89x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
4 7.54x105 1.21x10-4 1.61x10-10
5 5.19x105 7.58x10-4 1.46x10-9
6 4.95x105 2.36x10-4 1.23x10-10
7 2.66x105 4.54x10-6 1.71x10-11
8 5.52x105 5.07x10-3 9.18x10-9
9 6.99x105 1.47x10-4 2.10x10-9
10 3.87x105 1.22x10-2 3.16x10-8
11 1.24x105 4.21x10-4 3.38x10-9
12 5.05x105 1.26x10-4 2.49x10-10
5 -5 -10
13 5.91x10 7.29x10 1.23x10
14 7.00x105 3.61x10-5 5.16x10-11
[0618] 抗hTfR抗体对人TfR的亲和性的测定结果，全部抗体与人TfR的解离常数为1×10-8M以下，除抗体号10以外的13种抗体与人TfR的解离常数为1×10-9M以下，特别是抗体号3、-12
8、13和14与人TfR的解离常数为1×10 M以下(表4)。这些结果表明14种抗体全部为与人TfR具有高亲和性的抗体。然后观察抗hTfR抗体对猴TfR的亲和性的测定结果，全部抗体与猴TfR的解离常数为5×10-8M以下，特别是抗体号1和3与猴TfR的解离常数为1×10-12M以下(表5)。这些结果表明14种抗体不仅全部为与人TfR具有高亲和性的抗体，而且全部为与猴TfR也具有高亲和性的抗体。
8、13和14与人TfR的解离常数为1×10 M以下(表4)。这些结果表明14种抗体全部为与人TfR具有高亲和性的抗体。然后观察抗hTfR抗体对猴TfR的亲和性的测定结果，全部抗体与猴TfR的解离常数为5×10-8M以下，特别是抗体号1和3与猴TfR的解离常数为1×10-12M以下(表5)。这些结果表明14种抗体不仅全部为与人TfR具有高亲和性的抗体，而且全部为与猴TfR也具有高亲和性的抗体。
[0619] 〔实施例7-2〕抗hTfR抗体的使用小鼠的脑迁移评价
[0620] 然后，对于抗hTfR抗体号1～9和11～14这13种抗体，使用将编码小鼠转铁蛋白受体的胞外区的基因置换为编码人转铁蛋白受体基因的胞外区的基因的hTfR敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，来评价各抗体通过BBB迁移到脑内的情况。hTfR-KI小鼠大体上通过下述方法来制作。此外，作为抗hTfR抗体，使用实施例7中记载的纯化品。
[0621] 化学合成具有序列号253所示的碱基序列的DNA片段，所述序列号253所示的碱基序列为如下序列：在编码胞内区为小鼠hTfR的氨基酸序列、胞外区为人hTfR的氨基酸序列的嵌合hTfR的cDNA的3’侧配置有被loxP序列夹入的新霉素抗性基因。通过常规方法将该DNA片段整合到具有作为5’臂序列的序列号254所示的碱基序列、作为3’臂序列的序列号255所示的碱基序列的打靶载体中，利用电穿孔法将其导入到小鼠ES细胞中。在新霉素存在下对基因导入后的小鼠ES细胞进行选择培养，选择打靶载体已通过同源重组整合到染色体的小鼠ES细胞。将得到的基因重组小鼠ES细胞注入到ICR小鼠的8细胞期胚(宿主胚)，移植到通过与进行了输精管结扎的小鼠交配而得到的假孕小鼠(受体小鼠)。对于得到的鼠仔(嵌合小鼠)进行毛色判定，选择ES细胞在生物体的形成中有高效贡献的个体、即白色毛相对于整体毛色所占的比率高的个体。将该嵌合小鼠个体与ICR小鼠交配，得到F1小鼠。选出白色的F1小鼠，对从尾部组织提取的DNA进行分析，将染色体上小鼠转铁蛋白受体基因被置换为嵌合hTfR的小鼠作为hTfR-KI小鼠。
[0622] 用荧光素标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)按照所附的操作手册通过异硫氰酸荧光素(FITC)对上述13种抗hTfR抗体进行荧光标记。分别制备含有该FITC荧光标记的13种抗hTfR抗体的PBS溶液。将该抗体溶液按照给药的抗hTfR抗体的用量达到3mg/kg的方式分别对1只hTfR-KI小鼠(雄，10～12周龄)进行静脉注射。此外，作为对照。将同样制备的含有FITC荧光标记小鼠IgG1(西格玛公司)的PBS溶液以3mg/kg的用量对1只hTfR-KI小鼠(雄，10～12周龄)进行静脉注射。在静脉注射起约8小时后，用生理盐水进行全身灌注，摘取脑(含有大脑和小脑的部分)。测定所摘出的脑的重量(湿重)后，添加含有蛋白酶抑制剂混合物(西格玛社)的T-PER(Thermo Fisher Scientific公司)，将脑组织制成匀浆液。将匀浆液离心并回收上清，用以下方法测定上清中所含的FITC荧光标记的抗体的量。首先，将抗FITC抗体(Bethyl公司)向High Bind Plate(高结合板)(Meso Scale Diagnostics公司)的各孔中各添加10μL，静置1小时，使其固定于板。然后向各孔中添加SuperBlock blocking buffer in PBS(SuperBlock(PBS)封闭缓冲液)(Thermo Fisher Scientific公司)各150μL，振荡1小时，对板进行封闭。然后向各孔中添加脑组织的匀浆液的上清各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody(Goat)(SULFO标记的抗小鼠抗体(山羊))(Meso Scale Diagnostics公司)各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)各150μL，用SectorTM Imager 6000reader测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的FITC荧光标记的抗hTfR抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出每克脑重量(湿重)中所含的抗体量(脑组织中的抗hTfR抗体的浓度)。将其结果示于表5-2。
[0623] 与对照相比，抗hTfR抗体号1～9和11～14的抗体在脑组织中的浓度均为25倍以上。对于抗hTfR抗体号5和6而言，其浓度与对照相比为100倍以上，特别是抗hTfR抗体号6达到了约160倍。这些结果表明：抗hTfR抗体号1～9和11～14的抗体具有积极通过BBB迁移到脑内的性质。
[0624] 表5-2脑组织中的抗hTfR抗体的浓度
[0625]
[0626] 〔实施例8〕抗hTfR抗体的使用猴的药物动力学分析
[0627] 将抗hTfR抗体号1～3的抗体分别以5.0mg/kg的用量分别对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，给药8小时后用生理盐水实施全身灌注。此外，作为阴性对照，对未给药抗hTfR抗体的1只个体同样地进行全身灌注。灌注后，摘出包括延髓在内的脑组织。使用该脑组织，进行以下抗hTfR抗体的浓度测定和免疫组织化学染色。此外，作为抗hTfR抗体，使用实施例7中记载的纯化品。
[0628] 脑组织中的抗hTfR抗体的浓度测定大体上按照以下步骤进行。对于所采集的组织，将脑组织分成大脑、小脑、海马和延髓后，分别用含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich公司)的RIPA缓冲液(和光纯药工业株式会社)制成匀浆液离心，回收上清。将亲和纯化山羊抗小鼠IgG FcγpAb(Jackson ImmunoResearch公司)向高结合板(Meso Scale Diagnostics公司)的各孔中添加各10μL，静置1小时，将其固定于板。然后向各孔中添加SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)各150μL，振荡1小时，将板封闭。然后向各孔中添加脑组织的匀浆液的上清各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加亲和纯化山羊抗小鼠IgG Fab-生物素(Jackson ImmunoResearch公司)各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加SULFO-Tag-Streptavidin(SULFO标记的链霉亲和素)(Meso Scale Diagnostics公司)各25μL，振荡0.5小时。向各孔中添加Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)各150μL，用SectorTM Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnostics公司)测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的抗hTfR抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出各脑组织的每克重量(湿重)中所含的抗体的量(脑组织中的抗hTfR抗体的浓度)。
[0629] 将脑组织中的抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于表6。抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号3的抗体均确认到在大脑、小脑、海马和延髓中的累积，关于其量，抗hTfR抗体号1＜抗hTfR抗体号3＜抗hTfR抗体号2，抗hTfR抗体号1最少，抗hTfR抗体号2最多。hTfR抗体号2与抗hTfR抗体号1相比，确认到在大脑中为约4.3倍、在小脑中为约6.6倍、在海马中为约4.6倍、在延髓中为约2倍的抗体累积。这些结果表明这3种抗体具有通过血脑屏障、在脑组织中累积的性质，表明通过使应在脑组织内发挥功能的药剂BDNF与这些抗体结合、从而可以使该药剂高效地在脑组织中累积。
[0630] 表6脑组织中的抗hTfR抗体的浓度(μg/g湿重)
[0631]抗体号 大脑 小脑 海马 延髓
1 0.18 0.15 0.12 0.22
2 0.78 0.99 0.56 0.43
3 0.72 0.6 0.33 0.31
1 0.18 0.15 0.12 0.22
2 0.78 0.99 0.56 0.43
3 0.72 0.6 0.33 0.31
[0632] 脑组织中的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色大体上按照以下步骤进行。用Tissue Tek Cryo3DM(Sakura Finetek株式会社)将采集的组织快速冷冻到-80℃，制作组织的冷冻块。将该冷冻块薄切成4μm后，贴合于MAS涂层载玻片(松浪硝子株式会社)。使组织薄片与4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)在4℃下反应5分钟，将组织薄片固定在载玻片上。然后，使组织薄片与含有0.3％双氧水的甲醇溶液(和光纯药工业株式会社)反应30分钟，使内源性过氧化物酶失活。然后使载玻片与SuperBlock blocking buffer in PBS在室温下反应30分钟，进行封闭。然后使组织薄片与小鼠IgG-重链和轻链抗体(Bethyl Laboratories公司)在室温下反应1小时。将组织薄片用DAB底物(3，3’-二氨基联苯胺，Vector Laboratories公司)显色，用Mayer’s苏木精(Merck公司)进行对比染色，脱水，透明后密封，用光学显微镜观察。
[0633] 图1示出大脑皮层的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号3的猴的大脑皮层中，确认到血管的特异性染色(分别如图1b～d)。特别是给药抗hTfR抗体号2的猴和给药抗hTfR抗体号3的猴的大脑皮层(分别如图1c和图1d)中，在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的未给药抗hTfR抗体的猴的大脑皮层中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图1a)。
[0634] 图2示出海马的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号3的猴的大脑中，确认到血管的特异性染色(分别如图2b～d)。特别是给药抗hTfR抗体号2的猴和给药抗hTfR抗体号3的猴的海马(分别如图2c和图2d)中，神经元样细胞也确认到特异性染色，进而在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的未给药抗hTfR抗体的猴的海马中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图2a)。
[0635] 图3示出小脑的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗hTfR抗体号1～抗hTfR抗体号3的猴的小脑中，确认到血管的特异性染色(分别如图3b～d)。特别是给药抗hTfR抗体号2的猴和给药抗hTfR抗体号3的猴的小脑(分别如图3c和图3d)中，浦肯野细胞也确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的未给药抗hTfR抗体的猴的小脑中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图3a)。
[0636] 根据以上的大脑、海马和小脑的免疫组织化学染色的结果，可认为：抗hTfR抗体号1可以与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，但与抗hTfR抗体号2和3相比，向脑实质的迁移量较少。另一方面可知：抗hTfR抗体号2和3可以与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，且在与hTfR结合后，通过血脑屏障向脑实质内迁移，进而在海马中从脑实质内被摄入到神经元样细胞中，在小脑中被摄入到浦肯野细胞中。
[0637] 〔实施例9〕人源化抗hTfR抗体的制作
[0638] 尝试了表1所示的抗hTfR抗体号1～3的轻链和重链的可变区中所含的氨基酸序列的人源化。对于抗hTfR抗体号1，得到具有序列号158～序列号163所示的氨基酸序列的人源化的轻链的可变区、和具有序列号166～序列号171所示的氨基酸序列的人源化的重链的可变区。对于抗hTfR抗体号2，得到具有序列号174～序列号179所示的氨基酸序列的人源化的轻链的可变区、和具有序列号182～序列号187所示的氨基酸序列的人源化的重链的可变区。对于抗hTfR抗体号3，得到具有序列号190～序列号195所示的氨基酸序列的人源化的轻链的可变区、和具有序列号204～序列号209所示的氨基酸序列的人源化的重链的可变区。
[0639] 〔实施例10〕编码人源化抗hTfR抗体的基因的构建
[0640] 对于上述抗hTfR抗体号1～3，人工合成了含有如下基因的DNA片段，所述基因为编码分别包含人源化抗hTfR抗体的轻链和重链的可变区的轻链和重链的全长的基因。此时，在编码轻链的全长的基因的5’侧，从5’端起依次导入MluI序列和编码前导肽的序列，在3’侧导入NotI序列。此外，在编码重链的全长的基因的5’侧，从5’端起依次导入MluI序列和编码前导肽的序列，在3’侧导入NotI序列。需要说明的是，在此，所导入的前导肽发挥分泌信号的作用，即，使人源化抗体的轻链和重链在作为宿主细胞的哺乳动物细胞中表达时，使轻链和重链被分泌到细胞外。
[0641] 对于抗hTfR抗体号1的轻链，合成了含有如下基因的DNA片段(序列号165)，所述基因编码可变区具有序列号163所示的氨基酸序列的序列号164所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗hTfR抗体号1的轻链)的全长。对于抗hTfR抗体号1的重链，合成了含有如下基因的DNA片段(序列号173)，所述基因编码可变区具有序列号171所示的氨基酸序列的序列号172所示的氨基酸序列的重链(人源化抗hTfR抗体号1的重链)的全长。序列号173所示的DNA片段所编码的人源化抗hTfR抗体的重链为IgG1。
[0642] 对于抗hTfR抗体号2的轻链，合成了含有如下基因的DNA片段(序列号181)，所述基因编码可变区具有序列号179所示的氨基酸序列的序列号180所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗hTfR抗体号2的轻链)的全长。对于抗hTfR抗体号2的重链，合成了含有如下基因的DNA片段(序列号189)，所述基因编码可变区具有序列号187所示的氨基酸序列的序列号188所示的氨基酸序列的重链(人源化抗hTfR抗体号2的重链)的全长。序列号189所示的DNA片段所编码的人源化抗hTfR抗体的重链为IgG1。
[0643] 对于抗hTfR抗体号3的轻链，合成了编码可变区具有序列号191所示的氨基酸序列的序列号196所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗hTfR抗体号3的轻链)的全长的DNA片段(序列号197)。
[0644] 对于抗hTfR抗体号3的轻链，还合成了：编码可变区具有序列号193所示的氨基酸序列的序列号198所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗hTfR抗体号3-2的轻链)的全长的DNA片段(序列号199)、编码可变区具有序列号194所示的氨基酸序列的序列号200所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗hTfR抗体号3-3的轻链)的全长的DNA片段(序列号201)、和编码可变区具有序列号195所示的氨基酸序列的序列号202所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链)的全长的DNA片段(序列号203)。对于抗hTfR抗体号3的重链，合成了编码可变区具有序列号205所示的氨基酸序列的序列号210所示的氨基酸序列的重链(人源化抗hTfR抗体号3的重链)的全长的DNA片段(序列号211)。序列号211所示的DNA片段所编码的人源化抗hTfR抗体的重链为IgG1。
[0645] 进而，对于抗hTfR抗体号3的重链，合成了编码可变区具有序列号205所示的氨基酸序列的序列号212所示的氨基酸序列的重链(人源化抗hTfR抗体号3的重链IgG4)的全长的DNA片段(序列号213)。该序列号213所示的DNA片段所编码的人源化抗hTfR抗体的重链为IgG4。
[0646] 〔实施例11〕人源化抗hTfR抗体表达载体的构建
[0647] 将pEF/myc/nuc载体(Invitrogen公司)用KpnI和NcoI消化，切出含有EF-1α启动子及其第一内含子的区域，将其用T4 DNA聚合酶进行平末端化处理。将pCI-neo(Invitrogen公司)用BglII和EcoRI消化，切出含有CMV的增强子/启动子和内含子的区域后，用T4 DNA聚合酶进行平末端化处理。向其中插入上述含有EF-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pE-neo载体。将pE-neo载体用SfiI和BstXI消化，切出含有新霉素抗性基因的约1kbp的区域。以pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen公司)为模板用引物Hyg-Sfi5’(序列号216)和引物Hyg-BstX3’(序列号217)通过PCR反应扩增潮霉素基因。将扩增出的潮霉素基因用SfiI和BstXI消化，插入到上述切除了新霉素抗性基因的pE-neo载体中，构建pE-hygr载体。
[0648] 将pE-hygr载体和pE-neo载体分别用MluI和NotI消化。将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号1的轻链的DNA片段(序列号165)和编码重链的DNA片段(序列号173)用MluI和NotI消化，分别插入到pE-hygr载体和pE-neo载体的MluI-NotI之间。将得到的载体分别作为人源化抗hTfR抗体号1的轻链表达用载体pE-hygr(LC1)和人源化抗hTfR抗体号1的重链表达用载体pE-neo(HC1)用于以下实验。
[0649] 同样，将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号2的轻链的DNA片段(序列号181)和编码重链的DNA片段(序列号189用MluI和NotI消化，分别插入到pE-hygr载体和pE-neo载体的MluI-NotI之间。将得到的载体分别作为人源化抗hTfR抗体号2的轻链表达用载体pE-hygr(LC2)、人源化抗hTfR抗体号2的重链表达用载体pE-neo(HC2)用于以下实验。
[0650] 进而，同样地将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号3的轻链的DNA片段(序列号197)和编码重链的DNA片段(序列号211)用MluI和NotI消化，分别插入到pE-hygr载体和pE-neo载体的MluI-NotI之间。将得到的载体分别作为人源化抗hTfR抗体号3的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)、人源化抗hTfR抗体号3的重链表达用载体pE-neo(HC3)用于以下实验。
[0651] 进而，对于抗hTfR抗体号3的轻链，将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号3-2的轻链的DNA片段(序列号199)、编码人源化抗hTfR抗体号3-3的轻链的DNA片段(序列号
201)和编码人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链的DNA片段(序列号203)用MluI和NotI消化，插入到pE-hygr载体的MluI-NotI之间，分别构建人源化抗hTfR抗体号3-2的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-2)、人源化抗hTfR抗体号3-3的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-3)和人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-4)。
201)和编码人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链的DNA片段(序列号203)用MluI和NotI消化，插入到pE-hygr载体的MluI-NotI之间，分别构建人源化抗hTfR抗体号3-2的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-2)、人源化抗hTfR抗体号3-3的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-3)和人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-4)。
[0652] 进而，同样地对于抗hTfR抗体号3的重链，将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号3的重链IgG4的DNA片段(序列号213)用MluI和NotI消化，插入到pE-neo载体的MluI-NotI之间，构建人源化抗hTfR抗体号3的重链IgG4表达用载体pE-neo(HC3-IgG4)。
[0653] 〔实施例12〕人源化抗hTfR抗体表达用细胞的构建
[0654] 利用下述方法，用GenePulser(Bio-Rad公司)通过实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC1)和重链表达用载体pE-neo(HC1)转化CHO细胞(CHO-K1：由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得)。细胞的转化为大体上按照以下方法进行。将5×105个CHO-K1细胞接种到添加有CD OptiCHOTM培养基(LIFE TECHNOLOGY INC.)的3.5cm培养盘中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晚。将培养基交换为Opti-MEMTM I培养基(LIFE TECHNOLOGY INC.)，按照达到5×106细胞/mL的密度使细胞悬浮。取细胞悬浮液100μL，向其中添加用Opti-MEMTMI培养基稀释成100μg/mL的pE-hygr(LC1)和pE-neo(HC1)质粒DNA溶液各5μL。用GenePulser(Bio-Rad公司)实施电穿孔，向细胞中导入质粒。将细胞在37℃、5％CO2的条件下培养一晚后，用添加有0.5mg/mL的潮霉素和0.8mg/mL的G418的CD OptiCHOTM培养基进行选择培养。
[0655] 然后，利用有限稀释法按照每1孔中接种1个以下细胞的方式在96孔板上接种通过选择培养所选出的细胞，按照使各细胞形成单克隆集落的方式培养约10天。采集形成了单克隆集落的孔的培养上清，通过ELISA法考察培养上清中的人源化抗体含量，选择人源化抗hTfR抗体高表达细胞株。
[0656] 该时的ELISA法大体上通过以下的方法实施。向96孔微量滴定板(Nunc公司)的各孔中，添加将山羊抗人IgG多克隆抗体溶液用0.05M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释为4μg/mL的溶液各100μL，在室温下至少静置1小时，使抗体吸附于板。然后用在磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中添加有0.05％Tween 20的溶液(PBS-T)将各孔洗涤3次后，将Starting Block(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific公司)向各孔中添加各200μL，将板在室温下静置30分钟。将各孔用PBS-T洗涤3次后，将用在PBS中添加有0.5％BSA和0.05％Tween 20的溶液(PBS-BT)稀释为合适浓度的培养上清或人IgG标准品向各孔中添加各100μL，将板在室温下至少静置1小时。将板用PBS-T洗涤3次后，将用PBS-BT稀释的HRP标记抗人IgG多克隆抗体溶液向各孔中添加各100μL，将板在室温下至少静置1小时。用PBS-T将各孔洗涤3次后，将含有磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 5.0)的0.4mg/mL邻苯二胺向各孔中添加各100μL，在室温下静置8～20分钟。然后，将1mol/L硫酸向各孔中添加各100μL，使反应停止，用96孔板酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度。将与显示高测定值的孔对应的细胞作为人源化抗hTfR抗体号1的高表达细胞株。将其作为抗体号1表达株。
[0657] 同样地，用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC2)和重链表达用载体pE-neo(HC2)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号2的高表达细胞株。将其作为抗体号2表达株。
[0658] 进而，同样地，用实施例11中构建的轻链表达用载体pE--hygr(LC3)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3的高表达株。将其作为抗体号3表达细胞株。
[0659] 进而，同样地，用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-2)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-2的高表达细胞株。将其作为抗体号3-2表达株。
[0660] 进而，同样地，用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-3)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-3的高表达细胞株。将其作为抗体号3-3表达株。
[0661] 进而，同样地，用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-4)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-4的高表达细胞株。将其作为抗体号3-4表达株。
[0662] 进而，同样地，用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)和重链表达用载体pE-neo(HC3-IgG4)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)的高表达细胞株。将其作为抗体号3(IgG4)表达株。
[0663] 进而，同样地，用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-2)和重链表达用载体pE-neo(HC3-IgG4)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的高表达细胞株。将其作为抗体号3-2(IgG4)表达株。
[0664] 〔实施例13〕人源化抗hTfR抗体的纯化
[0665] 将实施例12中得到的抗体号1表达株、抗体号2表达株、抗体号3表达株、抗体号3-2表达株、抗体号3-3表达株和抗体号3-4表达株分别按照细胞浓度达到约2×105个/mL的方TM式用CD OptiCHO 培养基稀释，向1L的三角烧瓶中加入200mL的细胞悬浮液，在37℃下在含有5％CO2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(Millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加含有150mM NaCl的5倍体积的20mM Tris缓冲液(pH8.0)，上样到预先用含有150mM NaCl的为柱体积3倍体积的20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡化的蛋白A柱(柱体积：1mL，Bio-Rad公司)中。然后用柱体积的5倍体积的同一缓冲液洗涤柱后，用含有150mM NaCl的柱体积的4倍体积的50mM甘氨酸缓冲液(pH2.8)洗脱所吸附的人源化抗hTfR抗体，将其作为抗体的纯化品。
[0666] 在此，将从抗体号1表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号1。将从抗体号2表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号2。将从抗体号3表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3。将从抗体号3-2表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3-2。将从抗体号3-3表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3-3。此外，将从抗体号3-4表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3-4。
[0667] 此外，对于实施例12中得到的抗体号3(IgG4)表达株和抗体号3-2(IgG4)表达株，也与上述同样地进行培养，由其培养上清分别得到纯化的人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)。这2种抗体用于记载于实施例15的使用猴的药物动力学分析。
[0668] 〔实施例14〕人源化抗hTfR抗体与人TfR和猴TfR的亲和性的测定
[0669] 通过实施例7中记载的方法测定了实施例13中得到的人源化抗hTfR抗体与人TfR和猴TfR的亲和性。表7中示出人源化抗hTfR抗体号1～3-4(表中，分别对应于No.1～3-4)与人TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kD)。
[0670] 表7人源化抗hTfR抗体对人TfR的亲和性
[0671]抗体号 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
1 3.93x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
2 1.97x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
3 1.19x106 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
3-2 6.06x105 1.45x10-5 2.39x10-11
3-3 6.00x105 1.25x10-5 2.09x10-11
3-4 1.01x106 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
1 3.93x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
2 1.97x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
3 1.19x106 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
3-2 6.06x105 1.45x10-5 2.39x10-11
3-3 6.00x105 1.25x10-5 2.09x10-11
3-4 1.01x106 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
[0672] 表8中示出人源化抗hTfR抗体号1～3-4(表中，分别对应于抗体号1～3-4)与猴TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kD)。
[0673] 表8人源化抗hTfR抗体对猴TfR的亲和性
[0674]抗体号 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
1 2.53x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
2 4.87x105 3.67x10-5 7.55x10-11
3 6.03x105 6.76x10-4 1.12x10-9
5 -4 -9
3-2 4.95x10 8.76x10 1.77x10
3-3 4.88x105 9.32x10-4 1.91x10-9
3-4 5.19x105 1.35x10-4 2.60x10-10
1 2.53x105 ＜1.0x10-7 ＜1.0x10-12
2 4.87x105 3.67x10-5 7.55x10-11
3 6.03x105 6.76x10-4 1.12x10-9
5 -4 -9
3-2 4.95x10 8.76x10 1.77x10
3-3 4.88x105 9.32x10-4 1.91x10-9
3-4 5.19x105 1.35x10-4 2.60x10-10
[0675] 人源化抗hTfR抗体号1～3-4与人TfR的亲和性的测定结果是，人源化抗hTfR抗体-12号1、2、3和3-4抗体与人TfR的解离常数小于1×10 M(表7)。此外，人源化抗hTfR抗体号3-2和3-3与人TfR的解离常数分别为2.39×10-11M和2.09×10-11M。另一方面，关于与这些抗体对应的人源化前的抗hTfR抗体与人TfR的解离常数，抗体号1为5.09×10-12M，抗体号2为
1.12×10-11M，抗体号3小于1×10-12M(表4)。这些结果表明抗hTfR抗体与人TfR的高亲和性在抗体人源化的前后得到维持，抗hTfR抗体号4～14在进行抗体人源化后也可维持与人TfR的亲和性。
1.12×10-11M，抗体号3小于1×10-12M(表4)。这些结果表明抗hTfR抗体与人TfR的高亲和性在抗体人源化的前后得到维持，抗hTfR抗体号4～14在进行抗体人源化后也可维持与人TfR的亲和性。
[0676] 然后观察人源化抗hTfR抗体与猴TfR的亲和性的测定结果，人源化抗hTfR抗体号1在抗体人源化前后解离常数均小于1×10-12M，维持了亲和性，人源化抗hTfR抗体号2的人源化前的解离常数为4.18×10-11M，人源化后的解离常数为7.55×10-11M，也维持了亲和性(表5、表8)。另一方面，就人源化抗hTfR抗体号3～3-4而言，与人源化前的这些抗体对应的抗-12 -10 -9
hTfR抗体号3与猴TfR的解离常数小于1×10 M，但人源化后为2.60×10 M～1.91×10 M，观察到与猴TfR的亲和性降低。虽然对于人源化抗hTfR抗体号3观察到与猴TfR的亲和性降低，但这些结果表明抗hTfR抗体与猴TfR的高亲和性在抗体人源化前后并非丧失、而是大体上得到维持，抗hTfR抗体号4～14在进行抗体人源化后也可维持与猴TfR的亲和性。
hTfR抗体号3与猴TfR的解离常数小于1×10 M，但人源化后为2.60×10 M～1.91×10 M，观察到与猴TfR的亲和性降低。虽然对于人源化抗hTfR抗体号3观察到与猴TfR的亲和性降低，但这些结果表明抗hTfR抗体与猴TfR的高亲和性在抗体人源化前后并非丧失、而是大体上得到维持，抗hTfR抗体号4～14在进行抗体人源化后也可维持与猴TfR的亲和性。
[0677] 〔实施例15〕人源化抗hTfR抗体的使用猴的药物动力学分析
[0678] 使用人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)这4种抗体，进行使用猴的药物动力学分析。需要说明的是，人源化抗hTfR抗体号3的重链为IgG1，人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)是将人源化抗hTfR抗体号3的重链在可变区保持原样的状态下变更为IgG4的抗体。此外，人源化抗hTfR抗体号3-2的重链为IgG1，人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)是将人源化抗hTfR抗体号3-2的重链在可变区保持原样的状态下变更为IgG4的抗体。将这4种抗体分别以5.0mg/kg的用量分别对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，在给药前、给药后2分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时后采集外周血，采血后实施全身灌注。此外，作为阴性对照，将针对HER2蛋白的作为人源化抗hTfR抗体的曲妥珠单抗(赫赛汀TM，中外制药)同样地给药于一只个体，在给药前、给药后2分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时后采集外周血，采血后实施全身灌注。灌注后，摘出包括延髓在内的脑组织、脊髓组织及其它组织(包括肝脏、心脏、脾脏和骨髓)。使用该脑组织、脊髓组织及其它组织进行以下的人源化抗hTfR抗体的浓度测定和免疫组织化学染色。
[0679] 组织中和外周血中的人源化抗hTfR抗体的浓度测定大体上按照以下步骤进行。需要说明的是，对于脑，将所采集的组织分成大脑皮层、小脑、海马和延髓后，进行人源化抗hTfR抗体的浓度测定。将所采集的组织分别用含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich公司)的RIPA缓冲液(和光纯药工业株式会社)制成匀浆液离心，回收上清。对于外周血，分离出血清。将亲和纯化山羊抗小鼠IgG FcγpAb(Jackson ImmunoResearch公司)向高结合板(Meso Scale Diagnostics公司)的各孔中添加各10μL，静置1小时而固相化。然后向各孔中添加SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)各150μL，振荡1小时，将板封闭。然后向各孔中添加匀浆液的上清或血清各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加亲和纯化山羊抗小鼠IgG Fab-生物素(Jackson ImmunoResearch公司)各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加SULFO-Tag-Streptavidin(Meso Scale Diagnostics公司)各25μL，振荡0.5小时。向各孔中添加Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)各150μTM
L，用Sector Imager 6000 reader测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的抗hTfR抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出各组织中和外周血中所含的抗体的量。浓度的测定对各样品重复进行3次。
L，用Sector Imager 6000 reader测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的抗hTfR抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出各组织中和外周血中所含的抗体的量。浓度的测定对各样品重复进行3次。
[0680] 将脑组织和脊髓组织中的人源化抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于表9。
[0681] 表9脑组织中的人源化抗hTfR抗体的浓度(μg/g湿重)
[0682]抗体号 大脑皮层 小脑 海马 延髓 脊髓
3 0.67±0.12 0.61±0.02 0.49±0.02 0.59±0.10 0.46±0.17
3-2 1.05±0.07 0.72±0.04 0.72±0.07 0.69±0.03 0.46±0.02
3(IgG4) 0.65±0.05 0.59±0.03 0.56±0.02 0.59±0.02 0.46±0.07
3-2(IgG4) 0.76±0.02 0.57±0.07 0.62±0.05 0.73±0.16 0.48±0.03
阴性对照 0.0082±0.0032 0.0090±0.0067 0.0053±0.0009 0.011±0.003 0.15±0.04[0683] 人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的抗体均确认到在大脑皮层、小脑、海马、延髓和脊髓中的累积(表9)。关于其量，人源化抗hTfR抗体号3与阴性对照的曲妥珠单抗(赫赛汀TM)相比，大脑皮层中为约82倍，小脑中为约68倍，海马中为约92倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3-2与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约128倍，小脑中为约80倍，海马中为约136倍，延髓中为约63倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约79倍，小脑中为约66倍，海马中为约
106倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约93倍，小脑中为约63倍，海马中为约117倍，延髓中为约66倍，脊髓中为约3.2倍(表10)。这些结果表明：这4种人源化抗hTfR抗体具有通过血脑屏障、在脑组织中累积的性质，通过使应在脑组织内发挥功能的药剂BDNF与这些抗体结合、从而可以使该药剂高效地在脑组织中累积。
3 0.67±0.12 0.61±0.02 0.49±0.02 0.59±0.10 0.46±0.17
3-2 1.05±0.07 0.72±0.04 0.72±0.07 0.69±0.03 0.46±0.02
3(IgG4) 0.65±0.05 0.59±0.03 0.56±0.02 0.59±0.02 0.46±0.07
3-2(IgG4) 0.76±0.02 0.57±0.07 0.62±0.05 0.73±0.16 0.48±0.03
阴性对照 0.0082±0.0032 0.0090±0.0067 0.0053±0.0009 0.011±0.003 0.15±0.04[0683] 人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的抗体均确认到在大脑皮层、小脑、海马、延髓和脊髓中的累积(表9)。关于其量，人源化抗hTfR抗体号3与阴性对照的曲妥珠单抗(赫赛汀TM)相比，大脑皮层中为约82倍，小脑中为约68倍，海马中为约92倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3-2与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约128倍，小脑中为约80倍，海马中为约136倍，延髓中为约63倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约79倍，小脑中为约66倍，海马中为约
106倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约93倍，小脑中为约63倍，海马中为约117倍，延髓中为约66倍，脊髓中为约3.2倍(表10)。这些结果表明：这4种人源化抗hTfR抗体具有通过血脑屏障、在脑组织中累积的性质，通过使应在脑组织内发挥功能的药剂BDNF与这些抗体结合、从而可以使该药剂高效地在脑组织中累积。
[0684] 表10 脑组织中的人源化抗hTfR抗体的累积量(与阴性对照相比的累积量的倍率)[0685]抗体号 大脑皮层 小脑 海马 延髓 脊髓
3 82 68 92 54 3.1
3-2 128 80 136 63 3.1
3(IgG4) 79 66 106 54 3.1
3-2(IgG4) 93 63 117 66 3.2
阴性对照 1 1 1 1 1
3 82 68 92 54 3.1
3-2 128 80 136 63 3.1
3(IgG4) 79 66 106 54 3.1
3-2(IgG4) 93 63 117 66 3.2
阴性对照 1 1 1 1 1
[0686] 然后，将肝脏、心脏、脾脏和骨髓各组织中的人源化抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于图4。在肝脏和脾脏中，4种人源化抗hTfR抗体和阴性对照的曲妥珠单抗均确认到累积，关于其量，人源化抗hTfR抗体与曲妥珠单抗同等。心脏中，有人源化抗hTfR抗体与阴性对照的曲妥珠单抗相比累积量更多的倾向，关于其量，止于阴性对照的1.5倍～2.8倍左右。骨髓中，有人源化抗hTfR抗体与阴性对照的曲妥珠单抗相比累积量显著多的倾向，关于其量，为阴性对照的3.5～16倍。关于人源化抗hTfR抗体向骨髓中的累积，可认为原因在于，在作为造血器官的骨髓中，TfR的表达量多，通过与TfR结合，与阴性对照相比更多的人源化抗hTfR抗体累积下来。这些数据表明：这4种人源化抗hTfR抗体具有在作为中枢神经系统的大脑、小脑、海马和延髓中特异性累积的性质，表明通过使应在脑组织内发挥功能的药剂BDNF与这些抗体结合，可以使该药剂高效地在脑组织中累积。
[0687] 然后，将人源化抗hTfR抗体的血药动力学的测定结果示于表11。4种人源化抗hTfR抗体与阴性对照的曲妥珠单抗同样地在给药后8小时时显示血药浓度为60μg/mL以上的高值，表明在血中是稳定的(表11)。
[0688] 表11 人源化抗hTfR抗体的血药动力学(μg/mL血液)
[0689]
[0690] 脑组织中的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色大体上按照以下步骤进行。用Tissue Tek Cryo 3DM(Sakura Finetek株式会社)，将采集的组织快速冷冻到-80℃，将冷冻块薄切成4μm后，贴合于MAS涂层载玻片(松浪硝子株式会社)。使组织薄片与4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)在4℃下反应5分钟，将组织薄片固定在载玻片上。然后，使组织薄片与含有0.3％双氧水的甲醇溶液(和光纯药工业株式会社)反应30分钟，使内源性过氧化物酶失活。然后使载玻片与SuperBlock blocking buffer in PBS在室温下反应30分钟，进行封闭。然后使组织薄片与小鼠IgG-重链和轻链抗体(Bethyl Laboratories)在室温下反应1小时。将组织薄片用DAB底物(3，3’-diaminobenzidine，Vector Laboratories公司)显色，用Mayer’s苏木精(Merck公司)进行对比染色，脱水，透明后密封，用光学显微镜观察。
[0691] 图5示出大脑皮层的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的大脑皮层中，确认到血管和神经元样细胞的特异性染色(分别如图5b～e)。特别是给药人源化抗hTfR抗体号3-2的猴的大脑皮层(图5c)中，在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的给药赫赛汀的猴的大脑皮层中未确认到染色，表明图5b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图5a)。
[0692] 图6示出海马的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的海马中，确认到血管和神经元样细胞的特异性染色(分别如图6b～e)。需要说明的是，作为对照的给药赫赛汀的猴的海马中未确认到染色，表明图6b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图6a)。
[0693] 图7示出小脑的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的小脑中，确认到血管和浦肯野细胞的特异性染色(分别如图7b～e)。需要说明的是，作为对照的给药赫赛汀的猴的小脑中未确认到染色，表明图7b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图7a)。
[0694] 图8示出延髓的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的延髓中，确认到血管和神经元样细胞的特异性染色(分别如图8b～e)。需要说明的是，作为对照的给药赫赛汀的猴的延髓中未确认到染色，表明图8b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图8a)。
[0695] 根据实施例8的大脑和小脑的免疫组织化学染色的结果，可认为作为人源化前的小鼠抗体的抗hTfR抗体号1可以与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，但向脑实质的迁移量少。另一方面，作为人源化前的小鼠抗体的抗hTfR抗体号2和3可以与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，且与hTfR结合后，通过血脑屏障向脑实质内迁移，进而，在海马中从脑实质内被摄入到神经元样细胞，在小脑中被摄入到浦肯野细胞。
[0696] 根据该实施例15的大脑、海马、小脑和延髓的免疫组织化学染色的结果，可知：供于实验的将抗hTfR抗体号3人源化而得到的4种人源化抗hTfR抗体与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，且与hTfR结合后，通过血脑屏障向脑实质内迁移，进而在大脑皮层中被摄入到神经元样细胞，在海马中从脑实质内被摄入到神经元样细胞，在小脑内被摄入到浦肯野细胞，在延髓内被摄入到神经元样细胞。
[0697] 〔实施例16〕hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白)表达用细胞的制作
[0698] 将pEF/myc/nuc载体(Invitrogen公司)用KpnI和NcoI消化，切出含有EF-1α启动子及其第一内含子的区域，将其用T4 DNA聚合酶进行平末端化处理。将pCI-neo(Invitrogen公司)用BglII和EcoRI消化，切除含有CMV的增强子/启动子和内含子的区域后，用T4 DNA聚合酶进行平末端化处理。向其中插入上述含有EF-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pE-neo载体。将pE-neo载体用SfiI和BstXI消化，切除含有新霉素抗性基因的约1kbp的区域。以pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen公司)为模板用引物Hyg-Sfi5’(序列号216)和引物Hyg-BstX3’(序列号217)通过PCR反应扩增潮霉素基因。将扩增出的潮霉素基因用SfiI和BstXI消化，插入到上述切除了新霉素抗性基因的pE-neo载体中，构建pE-hygr载体。
[0699] 人工合成具有序列号249所示的碱基序列的DNA片段，所述DNA片段含有编码在具有序列号172所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列(Gly-Ser)结合有具有序列号247所示的氨基酸序列的hBDNF的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号248所示的氨基酸序列的在人源化抗hTfR抗体的重链上通过接头序列(Gly-Ser)结合有hBDNF的蛋白质。此外，该DNA片段在5’侧从5’端起依次具有MluI序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有NotI序列。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(HC-BDNF-1)。
[0700] 人工合成具有序列号251所示的碱基序列的DNA片段，所述DNA片段含有编码在具有序列号188所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列(Gly-Ser)结合有具有序列号247所示的氨基酸序列的hBDNF的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号250所示的氨基酸序列的在人源化抗hTfR抗体的重链上通过接头序列(Gly-Ser)结合有hBDNF的蛋白质。此外，该DNA片段在5’侧从5’端起依次具有MluI序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有NotI序列。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(HC-BDNF-2)。
[0701] 人工合成具有序列号253所示的碱基序列的DNA片段，所述DNA片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列(Gly-Ser)结合有具有序列号247所示的氨基酸序列的hBDNF的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号252所示的氨基酸序列的在人源化抗hTfR抗体的重链上通过接头序列(Gly-Ser)结合有hBDNF的蛋白质。此外，该DNA片段在5’侧从5’端起依次具有MluI序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有NotI序列。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(HC-BDNF-3)。
[0702] 人工合成具有序列号255所示的碱基序列的DNA片段，所述DNA片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列融合有具有序列号247所示的氨基酸序列的hBDNF的融合蛋白的基因，所述接头序列由在Gly-Ser之后重复5次序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的共计27个氨基酸构成。该DNA片段编码具有序列号254所示的氨基酸序列的在人源化抗hTfR抗体的重链上通过上述通过接头序列结合有hBDNF的蛋白质。此外，该DNA片段在5’侧从5’端起依次具有MluI序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有NotI序列。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(HC-BDNF-4)。
[0703] 人工合成具有序列号258所示的碱基序列的DNA片段，所述DNA片段含有编码在具有序列号256所示的氨基酸序列的hBDNF的前体的C末端侧通过接头序列融合有具有序列号257所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体(scFv)的融合蛋白的基因，所述接头序列由在Gly-Ser之后重复5次序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的共计27个氨基酸构成。在此，在序列号257所示的氨基酸序列中，N末端侧起第1位～第118位的氨基酸序列相当于序列号205所示的氨基酸序列，第119位～第133位的氨基酸序列相当于接头序列，第
134位到C末端为止的氨基酸序列相当于序列号191所示的氨基酸序列。即，该融合蛋白的人源化抗hTfR抗体scFv部分如下：在序列号205(人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2)的C末端侧通过接头序列融合有序列号191(人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列2)，所述接头由使序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复
3次的共计15个氨基酸构成。该DNA片段编码具有序列号259所示的氨基酸序列的hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体(scFv)的融合蛋白。具有序列号259所示的氨基酸序列的融合蛋白在表达后接受加工，成为具有序列号260所示的氨基酸序列的hBDNF与人源化抗hTfR抗体scFv的融合蛋白。在序列号259所示的氨基酸序列中，N末端侧起第1位～第110位的氨基酸序列为hBDNF从前体被加工成成熟型时所除去的部分。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(BDNF-scFv)。需要说明的是，在pE-neo(BDNF-scFv)所编码的、BDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白中，位于BDNF与scFv之间的接头序列为第1接头序列，在scFv中位于重链与轻链之间的接头序列为第2接头序列。
134位到C末端为止的氨基酸序列相当于序列号191所示的氨基酸序列。即，该融合蛋白的人源化抗hTfR抗体scFv部分如下：在序列号205(人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2)的C末端侧通过接头序列融合有序列号191(人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列2)，所述接头由使序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复
3次的共计15个氨基酸构成。该DNA片段编码具有序列号259所示的氨基酸序列的hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体(scFv)的融合蛋白。具有序列号259所示的氨基酸序列的融合蛋白在表达后接受加工，成为具有序列号260所示的氨基酸序列的hBDNF与人源化抗hTfR抗体scFv的融合蛋白。在序列号259所示的氨基酸序列中，N末端侧起第1位～第110位的氨基酸序列为hBDNF从前体被加工成成熟型时所除去的部分。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(BDNF-scFv)。需要说明的是，在pE-neo(BDNF-scFv)所编码的、BDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白中，位于BDNF与scFv之间的接头序列为第1接头序列，在scFv中位于重链与轻链之间的接头序列为第2接头序列。
[0704] 人工合成具有序列号262所示的碱基序列的DNA片段，所述DNA片段含有编码在具有序列号256所示的氨基酸序列的hBDNF的前体的C末端侧通过接头序列融合有具有序列号261所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白的基因，所述接头序列由在Gly-Ser之后重复5次序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的共计27个氨基酸构成。在此，序列号261所示的氨基酸序列相当于序列号210所示的氨基酸序列的N末端侧起第1位～第226位。在此，N末端侧起第1位～第118位的氨基酸序列相当于序列号205(人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2)，第119位～第216位的氨基酸序列相当于CH1区域，第217位～第226位的氨基酸序列相当于铰链区。
[0705] 该DNA片段编码具有序列号263所示的氨基酸序列的hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白。具有序列号263所示的氨基酸序列的融合蛋白在表达后接受加工，成为具有序列号264所示的氨基酸序列的、hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白。在序列号259所示的氨基酸序列中，N末端侧起第1位～第110位的氨基酸序列为hBDNF从前体被加工为成熟型时所除去的部分。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(BDNF-Fab HC-1)。
[0706] 人工合成具有序列号265所示的碱基序列的DNA片段，所述DNA片段含有编码在具有序列号247所示的氨基酸序列的hBDNF的C末端侧通过接头序列融合有具有序列号261所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白的基因，所述接头序列由在Gly-Ser之后重复5次序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的共计27个氨基酸构成。在此，序列号261所示的氨基酸序列相当于序列号210所示的氨基酸序列的N末端侧起第1位～第226位。在此，N末端侧起第1位～第118位的氨基酸序列相当于序列号205(人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2)，第119位～第216位的氨基酸序列相当于CH1区域，第217位～第226位的氨基酸序列相当于铰链区。
[0707] 该DNA片段编码具有序列号264所示的氨基酸序列的、hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白。将该DNA片段用MluI和NotI消化，并整合到pE-neo载体的MluI和NotI之间，构建pE-neo(BDNF-Fab HC-2)。
[0708] 利用实施例12中记载方法，用pE-neo(HC-BDNF-1)和实施例11中构建的pE-hygr(LC1)转化CHO细胞(CHO-K1：由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得)，得到表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hBDNF-抗hTfR抗体表达株1。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为hBDNF-抗hTfR抗体1。
[0709] 同样地，用pE-neo(HC-BDNF-2)和实施例11中构建的pE-hygr(LC2)转化CHO细胞，得到表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hBDNF-抗hTfR抗体表达株2。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为hBDNF-抗hTfR抗体2。
[0710] 进而，同样地，用pE-neo(HC-BDNF-3)和实施例11中构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞，得到表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hBDNF-抗hTfR抗体表达株3。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为hBDNF-抗hTfR抗体3。
[0711] 进而，同样地，用pE-neo(HC-BDNF-4)和实施例11中构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞，得到表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hBDNF-抗hTfR抗体表达株4。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为hBDNF-抗hTfR抗体4。
[0712] 进而，同样地，用pE-neo(BDNF-scFv)转化CHO细胞，得到表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hBDNF-抗hTfR抗体表达株5。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为hBDNF-抗hTfR抗体5。
[0713] 同样地，用pE-neo(BDNF-Fab HC-1)和实施例11中构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞，得到表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hBDNF-抗hTfR抗体表达株6。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为hBDNF-抗hTfR抗体6。
[0714] 进而，同样地，用pE-neo(BDNF-Fab HC-2)和实施例11中构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞，得到表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hBDNF-抗hTfR抗体表达株7。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为hBDNF-抗hTfR抗体7。
[0715] 〔实施例17〕hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的制造
[0716] hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白可以利用以下方法来制造。将实施例16中得到的hBDNF-抗hTfR抗体表达株5、6和7分别按照细胞浓度达到约2×105个/mL的方式用CD OptiCHOTM培养基稀释，向1L的三角烧瓶中加入200mL的细胞悬浮液，在37℃下在含有5％CO2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(Millipore公司)过滤，作为培养上清。向上述所回收的培养上清中添加为柱体积的5倍体积的含有150mL NaCl的20mM Tris缓冲液(pH8.0)，上样到用柱体积3倍体积的含有150mM NaCl的20mM Tris缓冲液(pH8.0)预先平衡化的蛋白A柱(Bio-Rad公司)或蛋白L柱(柱体积：1mL，GE Healthcare公司)。在此，对于hBDNF-抗hTfR抗体表达株1、2、3和6使用蛋白A柱，对hBDNF-抗hTfR抗体表达株4、5、7使用蛋白L柱。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液洗涤柱后，用含有150mM NaCl的柱体积的4倍体积的50mM甘氨酸缓冲液(pH2.8)洗脱所吸附的hBDNF-抗hTfR抗体。洗脱后立即用1M Tris缓冲液(pH8.0)将pH调整为7.0。将这些作为hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体5、6和7)的纯化品用于以下试验。
[0717] 〔实施例18〕使用BDNF受体(TrkB)表达细胞评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的BDNF活性
[0718] 通过测定细胞内信号传导增强活性来评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白所具有的BDNF生物活性，所述细胞内信号传导增强活性以将TrkB基因导入到源自中国仓鼠卵巣的细胞(CHO细胞)中的CHO-TrkB细胞中的Ca浓度变化为指标。
[0719] 用传代用培养基(Nutrient Mixture F-12 Ham，10％胎牛血清)培养CHO细胞。然后，交换成评价用培养基(Nutrient Mixture F-12 Ham，3％胎牛血清，10mM Hepes(pH7.4))，制作细胞悬浮液。向细胞中导入表达apoaequorin和人TrkB(GenBank Acc.No.NP_001018074.1)的病毒，按照达到2×103细胞/孔的方式接种到黑色384细胞培养用平底透明板后，在CO2培养箱(37℃，95％空气，5％CO2)内静置培养一晚。
[0720] 以20μL/孔添加含有1μM的Viviren(Promega)的HHBS液(1×Hanks’Balanced Salt Solution，20mM HEPES(pH7.4))，在室温下静置4小时。用含有0.1％的牛血清白蛋白的HHBS液将BDNF和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体5、6和7)分别稀释成目标浓度，添加后用FDSS7000(Hamamatsu Photonics K.K.)经时测定发光强度。将111ng/mL的BDNF(#450-02，Peprotech公司)所显示的发光强度设为100％，由得到的发光强度计算出相对的TrkB效应活性，由其用量反应曲线算出EC50，作为BDNF活性。
[0721] 表12示出hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的评价结果。
[0722] 表12 hBDNF一抗TfR抗体融合蛋白的BDNF活性
[0723](No.)名称 BDNF活性(TrkB效应性EC50，nmol/L)
hBDNF一抗hTfR抗体5 0.092
hBDNF一抗hTfR抗体6 0.16
hBDNF一抗hTfR抗体7 0.23
hBDNF一抗hTfR抗体5 0.092
hBDNF一抗hTfR抗体6 0.16
hBDNF一抗hTfR抗体7 0.23
[0724] 〔实施例18-2〕hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白与hTfR的亲和性的测定
[0725] 利用ELISA法测定hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白与hTfR的亲和性。基于ELISA法的测定大体上按照以下方法进行。作为人TfR，使用N末端添加有组氨酸标签的、具有序列号1所示的氨基酸序列中的从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的hTfR的胞外区的氨基酸序列的重组人TfR(r人TfR：Sino Biological公司)。作为猴TfR，使用N末端添加有组氨酸标签的、具有序列号2所示的氨基酸序列中的从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的食蟹猴的TfR的胞外区的氨基酸序列的重组猴TfR(r猴TfR：Sino Biological公司)。对于实施例17中得到的hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白中的hBDNF-抗hTfR抗体3、4和6实施测定。
[0726] 将重组人和猴TfR(Sino Biological公司)稀释成0.5ug/mL，将该稀释液向96孔板(Nunc公司)的各孔中添加各100μL，静置1小时。弃去固相溶液，向各孔中添加Block Ace(DS Pharma Biomedical Co.，Ltd.)各300μL，静置1小时。将hBDNF-抗hTfR抗体6用TBS-T(Sigma-Aldrich公司)稀释成20nmol/L，进而进行9级的3倍稀释，作为样品溶液。弃去Block Ace，向各孔中添加样品溶液各100μL，静置1小时。此时，向空白的孔中添加100μL的TBS-T。弃去溶液并用TBS-T洗涤3次后，向各孔中添加用TBS-T稀释成0.5μg/mL的浓度的生物素标记兔抗BDNF抗体(PeproTech公司)各100μL，静置1小时。弃去溶液并用TBS-T洗涤3次后，向各孔中添加用TBS-T稀释成200倍的链霉亲和素溶液(Streptavidin-HRP(R&D system公司))各100μL，静置1小时。弃去溶液并用TBS-T洗涤3次后，向各孔中添加TMB substrate溶液(Nacalai tesque，INC.)各50μL，在室温下反应5分钟，然后向各孔中添加0.5NHCl各100μL，使反应停止。用酶标仪测定450nm处的吸光度。绘制4参数分析曲线，由该曲线计算出hBDNF-抗hTfR抗体6对人和猴TfR的EC50。
[0727] hBDNF-抗hTfR抗体3对人TfR的EC50为1.6×10-9M，与猴TfR的结合活性为EC50为2.0×10-9M。hBDNF-抗hTfR抗体4对人TfR的EC50为8.3×10-10M，与猴TfR的结合活性为EC50为2.1×10-9M。此外，hBDNF-抗hTfR抗体6对人TfR的EC50为6.3×10-10M，与猴TfR的结合活性为EC50为2.3×10-9M。
[0728] 在此，hBDNF-抗hTfR抗体3是由在人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列(Gly-Ser)结合有hBDNF的、具有序列号252所示的氨基酸序列的蛋白质和具有序列号196所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体轻链构成的hBDNF-抗hTfR抗体。此外，hBDNF-抗hTfR抗体4是由在人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头序列结合有hBDNF的具有序列号254所示的氨基酸序列的蛋白质和具有序列号196所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体轻链构成的hBDNF-抗hTfR抗体，其中，所述接头序列由在Gly-Ser之后重复5次序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的共计27个氨基酸构成。此外，hBDNF-抗hTfR抗体6是由在hBDNF的C末端侧通过接头序列融合有具有序列号261所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体Fab重链、整体具有序列号263所示的氨基酸序列的由hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链结合而成的蛋白质、和具有序列号196所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体轻链构成的hBDNF-抗hTfR抗体，其中，所述接头序列由在Gly-Ser之后重复5次序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的共计27个氨基酸构成。因此，这些测定结果表明：通过在抗hTfR抗体的重链的C末端侧直接或通过接头序列结合hBDNF、或者在hBDNF的C末端侧通过接头序列结合人源化抗hTfR抗体Fab重链，从而可取得与人TfR和猴TfR均具有高亲和性的、hBDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白。此外，这些测定结果表明：通过在移植序列号218～245所示的小鼠抗体的CDR而得到的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧直接或通过接头序列结合hBDNF、或者在人源化抗hTfR抗体的Fab的重链的N末端侧通过接头序列结合hBDNF而形成融合蛋白，可以使hBDNF以融合蛋白形式以高亲和性与人TfR结合，进而形成hBDNF并通过BBB，可在脑内发挥其功能。
[0729] 需要说明的是，利用本测定法测定了与hBDNF-抗hTfR抗体3的人源化抗体部分相-11同的、人源化抗hTfR抗体号3与hTfR的亲和性，结果对人TfR的EC50为9.0×10 M，与猴TfR的结合活性为EC50为2.5×10-10M。用实施例7中记载的方法测定的人源化抗hTfR抗体号3对人TfR的解离常数(kD)小于1.0×10-12M，对猴TfR的解离常数(kD)为1.12×10-9M(实施例14)。
[0730] 〔实施例19〕hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的使用KI小鼠和猴的药物动力学分析
[0731] 关于实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的脑内迁移性，例如可以如下评价：与实施例7-2、8、15中记载的方法同样地，在对hTfR敲入小鼠或食蟹猴给药后，在一定时间后用生理盐水进行全身灌注，测定脑组织中的hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的浓度和hBDNF，从而进行评价。hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白可以与实施例7-2同样地在给药前根据需要用FITC等进行荧光标记。
[0732] 在测定脑组织中的hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的浓度时，大体上按照以下步骤进行。对于所采集的组织，将脑组织分成大脑、小脑、海马和延髓后，分别用包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(Nacalai tesque)制成匀浆液，离心，回收上清。将Anti-Human IgG H&L pre-adsorbed(abcam公司)添加到Normal Plate(Meso Scale Diagnotics公司)的各孔中，静置1小时，使其固定于板。然后向各孔中添加SuperBlocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)，振荡1小时，将板封闭。然后向板添加脑组织的匀浆液的上清，振荡1小时。然后添加SULFO-Tag-Anti-BDNF抗体[35928.11](abcam公司)，振荡1小时。添加Read buffer T(Meso Scale Diagnotics公司)，用Sector Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnotics公司)测定发光量。利用浓度已知的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出各脑组织的每克重量(湿重)中所含的抗体的量(脑组织中的抗hTfR抗体的浓度)。
[0733] 此外，在测定脑组织中的hBDNF的浓度时，大体上按照以下的步骤进行。
[0734] 向人BDNF检测试剂盒(Meso Scale Diagnotics公司)的各孔中添加脑组织的匀浆液的上清，振荡1小时。然后添加SULFO-Tag-Human BDNF Detection(Meso Scale Diagnotics公司)，振荡1小时。添加Read buffer T(Meso Scale Diagnotics公司)，用Sector Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnotics公司)测定发光量。利用浓度已知的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出各脑组织的每克重量(湿重)中所含的BDNF浓度。
[0735] 〔实施例19-2〕使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处置帕金森病模型小鼠研究本发明的融合蛋白所产生的运动功能改善作用
[0736] 例如，可以使用以下记载的方法，通过MPTP处置小鼠中的帕金森病症状改善效果来评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
[0737] (1)帕金森病模型小鼠的制作
[0738] 使用C57BL/6系雄性小鼠(8-15周龄)，对于结束了检疫、驯化后的小鼠，，将生理盐水或溶解于生理盐水的MPTP(25或30mg/kg)1天1次地腹腔内给药5天、或1天内每隔2小时给药20mg/kg，进行4次腹腔内给药。
[0739] 在最终给药的3天以后，通过Pole试验评价运动迟缓(bradykinesia)症状，或通过转棒(Rota-rod)试验评价协调运动能力的降低。
[0740] (2)Pole试验
[0741] 使MPTP处置小鼠头部朝上地抓住垂直竖立的木制棒的上部5cm附近。测定小鼠从抓住棒起到变为朝向下方的时间(Tturn)和抓住棒起到下降到地板的时间(TLA)。进而观察小鼠的动作，按照下述对其症状进行评分。
[0742] 0：灵活地使用四肢下降/正常的动作。
[0743] 1：在棒的上部改变方向时看起来笨拙。
[0744] 2：未能彻底跨过棒，采取了侧滑的动作。
[0745] 3：掉落。
[0746] 最初进行1次训练后，5分钟1次，重复进行3次试验。将3次的平均时间用于分组用数据中。基于体重和Pole试验的数据，通过多变量完全随机化分组将MPTP处置小鼠分成3或4组。
[0747] 对于生理盐水处置小鼠(溶剂处置组)、MPTP处置小鼠(溶剂处置组、本发明的融合蛋白0.1～10mg/kg处置组)共计4～5组，1周1～2次，反复静脉内给药4～8周。在最终给药起1周后再次进行Pole试验(与取得上述分组用数据时方案相同)，评价运动迟缓症状的改善作用。通过给药于静脉内的本发明的融合蛋白向脑内迁移、在脑内发挥BDNF活性，从而可改善帕金森病模型动物的运动迟缓等运动功能的障碍。
[0748] 如上可以确认：给药于静脉内的本发明的融合蛋白向疾病模型动物(小鼠)的脑内迁移，可发挥BDNF活性。
[0749] (3)转棒(Rota-rod)试验
[0750] 1条棒上1只地将小鼠放在Rota-rod装置(MK-610A，室町机械)的旋转轴上，静置30秒后，使轴以1分钟8rpm旋转进行驯化，然后，在用3分钟使转速加快到25rpm的条件下进行训练。在训练1小时后进行以下评价试验。
[0751] 本试验中，使小鼠适应以8rpm旋转的轴的动作30秒后，在用5分钟使转速加快到40rpm的条件下测定直至小鼠从轴掉落的时间。以1小时的间隔将本试验重复3次，将3次的平均时间用于分组用数据中。基于体重和Rota-rod试验的数据，通过多变量完全随机化分组将MPTP处置小鼠分成4组。
[0752] 对于生理盐水处置小鼠(溶剂处置组)、MPTP处置小鼠(溶剂处置组、本发明的融合蛋白0.3和1,3mg/kg处置组)共计5组，1周1次，反复静脉内给药4～8周。在最终给药起1周后再次进行Rota-Rod试验(与上述(1)的分组时方案相同)，评价协调运动能力的改善作用。通过给药于静脉内的本发明的融合蛋白向脑内迁移、在脑内发挥BDNF活性，从而可改善帕金森病模型动物的协调运动能力等运动功能的障碍。
[0753] 如上可以确认：给药于静脉内的本发明的融合蛋白向疾病模型动物(小鼠)的脑内迁移，可发挥BDNF活性。
[0754] (3)转棒(Rota-rod)试验
[0755] 将小鼠在Rota-rod装置(MK-610A，室町机械)的旋转轴上各放1只，静置30秒后，使轴以1分钟8rpm旋转进行驯化，然后，在以3分钟使转速加快到25rpm的条件下进行训练。在训练1小时后进行以下评价试验。
[0756] 本试验中，在使小鼠适应以8rpm旋转的轴的动作30秒后，在用5分钟使转速加快到40rpm的条件下测定直至小鼠从轴掉落的时间。以1小时的间隔将本试验重复3次，将3次的平均时间用于分组用数据中。基于体重和Rota-rod试验的数据，用SAS(SAS Institute Inc.，Ver.9.2)和Stat Preclinica(Takumi Information Technology Inc.，Ver.1.2)的多变量完全随机分组将MPTP处置小鼠分成4组。
[0757] 对于生理盐水处置小鼠(溶剂处置组)、MPTP处置小鼠(溶剂处置组、本发明的融合蛋白0.3、1、3mg/kg处置组)共计5组，1周1次，反复静脉内给药4～8周。在最终给药起1周后再次进行Rota-Rod试验(上述(1)的分组时方案相同)，评价协调运动能力的改善作用。通过给药于静脉内的本发明的融合蛋白向脑内迁移、在脑内发挥BDNF活性，从而可改善帕金森病模型动物的协调运动能力等运动功能的障碍。
[0758] 如上可以确认：给药于静脉内的本发明的融合蛋白向疾病模型动物(小鼠)的脑内迁移，可发挥BDNF活性。
[0759] 〔实施例20〕使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处置帕金森病模型猴研究本发明的融合蛋白所产生的运动功能改善效果
[0760] 例如，可以使用以下记载的方法通过MPTP处置的猴的帕金森病样症状改善效果，评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
[0761] 在MPTP处置前5天，对预先评价为行动正常的雄性猕猴(5～8岁)或食蟹猴(4～8岁)按照1周最多连续5天地进行4周以上的MPTP(0.2mg/kg或该量以上，上限为2mg/kg)的静脉内给药、或肌肉内给药或皮下给药，确认UPDRS的评分降低或运动量降低。或者仅对内颈动脉的单侧给药1次或2次MPTP(0.2mg/kg或该量以上，上限为2mg/kg)，以UPDRS评分(J Neurosci Methods.2000；96：71-76)、运动量以及回旋运动量为指标，确认帕金森病样症状，结束MPTP的处置。
[0762] 在MPTP的最终给药起1周后，在确认了帕金森病样症状稳定后，1周1次地静脉内给药hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白(0.03～10mg/kg)，通过评价UPDRS、运动量或回旋运动来评价运动功能的改善度。给药于静脉内的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白向脑内迁移，在脑内发挥BDNF活性，从而可改善帕金森病模型动物的运动功能的障碍。
[0763] 如上可以确认：给药于静脉内的本发明的融合蛋白向疾病模型动物(猴)的脑内迁移，可发挥BDNF活性。
[0764] 〔实施例21〕使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处置帕金森病模型小鼠研究本发明的融合蛋白所产生的纹状体多巴胺量恢复效果
[0765] 例如，可以使用以下记载的方法测定进行了MPTP处置的动物的纹状体中的多巴胺量，评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白所产生的纹状体多巴胺量恢复效果。
[0766] 按照实施例19-2的方法通过MPTP处置制作帕金森病模型后，将溶剂或hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白(使用显示出运动功能改善的用量)以1周1次反复静脉内给药4～8周。在最终给药起7～10天后，用微波装置(TMW-6402，东芝)对颈部照射微波(5.0～5.2kw，1.0～1.1秒)。摘出纹状体后，在干冰上冻结，在-80℃保存至神经传导物质的提取操作为止。
[0767] 将冻结纹状体加入到含有0.01％(w/v)EDTA-2Na和20ng/mL 5-羟基-色醇(内标物)的1M甲酸·丙酮(15：85)溶液(纹状体湿重的50倍量)中，均质化。将匀浆液离心(4℃，10,000rpm×15分钟)，取上清100μL，用离心蒸发器(CE1D，TP-80，日立)蒸发干固90分钟，在-20℃保存至定量操作。
[0768] 向蒸发干固后的样品中加入0.01M乙酸溶液(含有0.01％(w/v)EDTA-2Na)各100μL，溶解，离心(4℃，9,000rpm×15分钟)后，用HPLC测定上清中的多巴胺、多巴胺代谢物(DL-3，4-二羟基苯基乙二醇和高香草酸)。
[0769] 结果可以确认，通过将本发明的融合蛋白给药于静脉内，可发挥使疾病模型动物的纹状体多巴胺量恢复的这一BDNF功能。
[0770] 〔实施例22〕使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处置帕金森病模型小鼠/猴研究本发明的融合蛋白所产生的黑质纹状体多巴胺神经再生效果
[0771] 例如，可以使用以下记载的方法，通过将MPTP处置后的动物的黑质纹状体中多巴胺神经细胞用针对作为其细胞标记的酪氨酸羟化酶(TH)的抗体染色的病理组织学研究，评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白所产生的多巴胺神经再生效果。
[0772] 按照实施例19-2和20的方法通过MPTP处置制作帕金森病模型后，将溶剂或hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白以1周1次反复静脉内给药4～8周。
[0773] 在最终给药起7～10天后，用4％多聚甲醛(PFA)进行回流固定，摘出脑。用4％PFA进行后固定，切出包含黑质和/或纹状体在内的部分(对于小鼠，使用脑切片机)，用10％中性缓冲福尔马林进行一晚的再固定后，制作石蜡块。将石蜡块切成厚度约4μm，贴合于MAS-GP Type A涂层载玻片，供于免疫染色。
[0774] 根据需要进行酶处理或加热处理等以进行抗原活化。例如，将黑质和/或纹状体部分的石蜡切片浸入10倍稀释的加热到60℃程度的SEROTEC TARGET UNMASKING FLUID MARK2(UNIVERSAL)(BUF025B，AbD Serotec)等抗原活化试剂，放入已经产生蒸汽的压力锅内，在高压模式下处理10分钟，从而进行抗原活化。然后，对于小鼠组织切片，用3％H2O2、小鼠染色试剂盒(414322，NICHIREI CORPORATION)的封闭试剂A进行封闭，对于猴组织切片，用3％H2O2、4％Block Ace(DS Pharma Biomedical)进行封闭，用以具有活化效果的抗体稀释液(IMMUNO SHOT immunostaining，Mild，IS-M-20，COSMO BIO co.，ltd.)适当稀释的一抗(anti-TH antibody，clone LNC1，MAB318，Millipore)处置，在室温下反应30分钟或在4℃下反应一晚。反应后，用PBS-T(含有0.05％TWEEN20的PBS)进行洗涤，对于小鼠组织切片，用小鼠染色试剂盒的封闭试剂B处置10分钟，滴加二抗(小鼠染色试剂盒的ヒストフアインシンプルステインマウスMAX-PO(M))反应10分钟，对于猴组织切片，滴加二抗(ヒストフアインシンプルステインMAX-PO(M))并反应30分钟。用PBS-T(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤后，在DAB液(DAB底物试剂盒，425011，NICHIREI CORPORATION)中浸渍10分钟，进行显色。
[0775] 将染色切片风干并密封后，用Aperio(注册商标)AT2(Leica Biosystems)进行扫描并数字化。用图像分析软件ImageScope(Leica Biosystems)分析数字化后的切片，对TH阳性区域的面积进行定量。
[0776] 如上可以确认：给药于静脉内的本发明的融合蛋白向疾病模型动物的脑内迁移，可发挥使黑质纹状体多巴胺神经再生的这一BDNF功能。
[0777] 〔实施例23〕使用亨延顿氏舞蹈病模型小鼠(R6/2小鼠)研究本发明的融合蛋白所产生的病状进展抑制效果
[0778] 例如，可以使用非专利文献(Giralt A.et al.，2011.Mol Neurodegener.6；71-86.，DeMarch Z.et al.，2008.Neurobiol Dis.30；375-387.)中报道的行为药理学方法，通过R6/2小鼠(Mangiarini L，et al.，1996 Cell 87；493-506.)的病状进展抑制效果，评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
[0779] (1)体重变化和生存率
[0780] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和R6/2小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从4周龄起1周1次地反复进行静脉内给药。
[0781] 对R6/2小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组的体重的变化和生存率进行比较，从而可以评价亨延顿氏舞蹈病模型动物的病状进展抑制效果。
[0782] (2)Rota-rod试验
[0783] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和R6/2小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从4周龄起1周1次地反复进行静脉内给药。Rota-Rod试验以1周1次或2周1次来实施，针对连续性的协调运动能力降低，评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的进展抑制效果。
[0784] 1条棒上1只地将小鼠放在Rota-rod装置(MK-610A，室町机械)的旋转轴上，静置30秒后，使轴以1分钟2rpm进行旋转而进行驯化，然后，在用3分钟使转速加快至15rpm的条件下进行训练。在训练1小时后进行本试验。本试验中，在使小鼠适应以4rpm旋转的动作30秒后，在用5分钟使转速加快至30rpm的条件下测定直至小鼠从轴掉落的时间。以1小时的间隔将本试验重复3次，将3次的平均时间作为各个体的数据。通过对R6/2小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组进行比较，可以评价亨延顿氏舞蹈病模型动物的协调运动能力降低的进展抑制效果。
[0785] (3)Clasping试验
[0786] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和R6/2小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从4周龄起以1周1次反复进行静脉内给药。Clasping试验以1周1次来实施，通过评价四肢反射异常(四肢的交叠(足组み))的出现时间或有无，来评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的中枢神经变性的进展抑制效果。
[0787] 抓住小鼠的尾部，从尾部进行悬吊，悬吊在约40cm高度。用秒表测定1分钟的悬吊状态下显示四肢反射异常(四肢的交叠)的时间。进行3次测定，将其平均值作为数据。通过对R6/2小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组进行比较，可以评价亨延顿氏舞蹈病模型动物的中枢神经变性的进展抑制效果。此外，也可以如非专利文献(Guyenet S.J.et al.，2010.J.Vis.Exp.21；pii：1787)中报道那样，对于刚悬吊后(10秒以内)的四肢异常的出现，通过例如以下所示的评分来评价药效：0，无；1，拉拽单后肢；2，拉拽两后肢；3，拉拽四肢。
[0788] (4)新奇物体识别试验
[0789] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和R6/2小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从4周龄起以1周1次反复进行静脉内给药。新物体识别试验以1-2周1次来实施，通过评价由在第2探索中对已知物体和新奇物体的探索时间的长度和探索时间算出的识别系数(DI)，来评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的认知功能增强效果。
[0790] 将小鼠放入装有2个同形状物体的试验箱中，使其自由探索5分钟(第1探索)。计测对物体的探索时间，1小时后进行第2探索。在第2探索中，保留在第1探索中探索时间长的物体，并将另一个换成新奇物体。计测第2探索(5分钟)中的已知和新奇物体的探索时间，计算出DI(DI＝(新奇物体探索时间-已知物体探索时间)/(新奇物体探索时间+已知物体探索时间))。通过对R6/2小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组的DI进行比较，可以评价亨延顿氏舞蹈病模型动物的认知功能增强效果。
[0791] 〔实施例24〕使用肌萎缩性侧索硬化症(ALS)模型小鼠(wobbler小鼠)研究本发明的融合蛋白所产生的病状进展抑制效果
[0792] 例如，可以用非专利文献(Ishiyama T.et al.，2004.Brain Res.1019；226-236.)中报道的行为药理学方法，通过Wobbler小鼠的神经肌肉功能降低的进展抑制效果评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
[0793] (1)Grip试验
[0794] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和Wobbler小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从3-4周龄起以1周1次反复进行静脉内给药。Grip试验以1周1次来实施，可以通过评价握力来评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的神经肌肉功能降低的进展抑制效果。
[0795] 使小鼠抓柱握力计(NS-TRM-M，ニュ一ロサイエンス)的杆，拉拽其尾部。记录直至杆脱手为止的力，作为握力，将5次测定的平均值作为各个体的数据。通过对Wobbler小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组进行比较，可以评价ALS模型动物的神经肌肉功能降低的进展抑制效果。
[0796] (2)Rota-rod试验
[0797] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和Wobbler小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从3-4周龄起以1周1次反复进行静脉内给药。Rota-Rod试验以1周1次或2周1度来实施，针对连续性的协调运动能力的降低，评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的进展抑制效果。
[0798] 1条棒上1只地将小鼠放在Rota-rod装置(MK-610A，室町机械)的旋转轴上，静置30秒后，使轴以1分钟2rpm旋转进行驯化，然后，在用3分钟使转速加快至15rpm的条件下进行训练。在训练1小时后进行本试验。本试验中，在使小鼠适应以4rpm旋转的轴的动作30秒后，在用5分钟使转速加快到30rpm的条件下测定直至小鼠从轴掉落的时间。以1小时的间隔将本试验重复3次，将3次的平均时间作为各个体的数据。通过对Wobbler小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组进行比较，可以评价ALS模型动物的神经肌肉功能降低的进展抑制效果。
[0799] 〔实施例25〕使用Rett综合症模型小鼠(MeCP2(methyl-CpG binding protein 2)敲除小鼠)研究本发明的融合蛋白所产生的病状改善效果
[0800] 例如，可以用非专利文献(Derecki N.C.et al.，2012.Nature 484；105-109.)所报道的行为药理学方法，通过MeCP2敲除(KO)小鼠的病状改善效果评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
[0801] (1)体重变化和生存率
[0802] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和MeCP2 KO小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从3-4周龄起以1周1次反复进行静脉内给药。
[0803] 通过比较MeCP2 KO小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组的体重的变化和生存率，可以评价Rett综合症模型动物的病状改善效果。
[0804] (2)呼吸功能评价
[0805] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和MeCP2 KO小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从3-4周龄起以1周1次反复进行静脉内给药。呼吸功能评价以1周1次来实施，通过评价无呼吸次数了评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的呼吸功能改善效果。
[0806] 将小鼠放入呼吸功能测定装置(Biosystem XA，Buxco)室内，测定自主呼吸1小时。将确认不到体动的时间内的无呼吸次数(1秒以上无呼吸的状态的次数)作为数据。通过对MeCP2 KO小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组进行比较，可以评价Rett综合症模型动物的呼吸功能的改善效果。
[0807] (3)Clasping试验
[0808] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和MeCP2 KO小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从3-4周龄起以1周1次反复进行静脉内给药。Clasping试验以1周1次来实施，通过评价四肢反射异常(四肢的交叠)的出现时间或有无来评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的中枢神经变性的进展抑制效果。
[0809] 抓住小鼠的尾部，从尾部进行悬吊，悬吊在约40cm高度。用秒表测定1分钟的悬吊状态下显示四肢反射异常(四肢的交叠)的时间。进行3次测定，将其平均值作为数据。通过对MeCP2 KO小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组进行比较，可以评价Rett综合症模型动物的中枢神经变性的进展抑制效果。此外，也可以如非专利文献(Guyenet S.J.et al.，2010.J.Vis.Exp.21；pii：1787)中报道那样，对于刚悬吊后(10秒以内)的四肢异常的出现，通过例如以下所示的评分来评价药效：0，无；1，拉拽单后肢；2，拉拽两后肢；3，拉拽四肢。
[0810] 〔实施例26〕使用阿尔茨海默病模型小鼠(Tg2576小鼠)研究本发明的融合蛋白所产生的认知功能改善效果
[0811] 例如，可以用非专利文献(Iwasaki Y.et al.，2012.J Neurosci.Res.90；981-989.Cuadrado-Tejedor M.et al.，2010.Br.J.Pharmacol.164；2029-2041.)所报道的行为药理学方法，通过Tg2576小鼠的认知功能障碍的改善效果评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
[0812] (1)Morris型水迷宫试验
[0813] 对于野生型小鼠(溶剂处置组)和Tg2576小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，从14-16月龄起以1周1次反复进行静脉内给药。4周以后实施水迷宫试验，通过评价训练探索中到达平台的到达时间长短和探索试验中在平台存在区域的滞留时间的长度，来评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的认知功能增强效果。
[0814] 将小鼠放入充满水的直径1.2m的圆形池子，在池子周边无标记、可看到平台的条件下进行3天训练，每天8次探索。然后在池子周边环境中加入标记、平台没入水中的条件下训练8天，每天4次探索。在第9天进行探索试验。探索试验中，取出平台，计测游过存在平台时的池子4分之1的区域的时间。通过对Tg2576小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组的训练中的平台到达时间ょび探索试验中的游泳时间，可以评价阿尔茨海默病模型动物的认知功能的增强效果。
[0815] 〔实施例27〕使用神经变性模型小鼠研究本发明的融合蛋白所产生的神经再生/神经变性进展抑制效果
[0816] 例如，亨延顿氏舞蹈病模型小鼠时可以使用非专利文献(Giralt A.et al.，2011.Mol Neurodegener.6；71-86.，DeMarch Z.et al.，2008.Neurobiol Dis.30；375-
387.)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)模型小鼠时可以使用非专利文献(Ishiyama T.et al.，
2004.Brain Res.1019；226-236.)、阿尔茨海默病模型小鼠时可以使用非专利文献(Iwasaki Y.et al.，2012.JNeurosci.Res.90；981-989.Cuadrado-Tejedor M.et al.，
2010.Br.J.Pharmacol.164；2029-2041.)所报道的免疫组织学方法或蛋白印迹法，通过神经再生效果或神经变性进展抑制效果评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
387.)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)模型小鼠时可以使用非专利文献(Ishiyama T.et al.，
2004.Brain Res.1019；226-236.)、阿尔茨海默病模型小鼠时可以使用非专利文献(Iwasaki Y.et al.，2012.JNeurosci.Res.90；981-989.Cuadrado-Tejedor M.et al.，
2010.Br.J.Pharmacol.164；2029-2041.)所报道的免疫组织学方法或蛋白印迹法，通过神经再生效果或神经变性进展抑制效果评价实施例17中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内的BDNF生物活性。
[0817] 对野生型小鼠(溶剂处置组)和模型小鼠(溶剂处置1组，hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置2-3组)，以1周1次反复进行静脉内给药。在持续进行融合蛋白的给药一定时期后，为了进行免疫组织学评价，放血致死后用4％多聚甲醛进行灌注固定，取得脑样品，为了进行蛋白印迹评价，断颈致死后摘出脑并切出所需的部位而取样。评价对象如上述非专利文献所报道那样为VGLUT1、PSD-95、Calbindin、DARPP32、含脑啡肽的神经细胞、Synaptophysin、NeuN，SMI-32以及胆碱乙酰基转移酶、酪氨酸羟化酶等。通过对模型小鼠的溶剂处置组和hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白处置组进行比较，可以评价神经再生效果/神经变性进展抑制效果。
[0818] 产业上的可利用性
[0819] 本发明的hBDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白可以通过血脑屏障，因此作为提供使hBDNF在中枢神经系统发挥作用的手段的发明有用性高。
[0820] 标号的说明
[0821] 1 血管
[0822] 2 脑实质
[0823] 3 神经元样细胞
[0824] 4 浦肯野细胞
[0826] 序列号3：接头例1的氨基酸序列
[0827] 序列号4：接头例2的氨基酸序列
[0828] 序列号5：接头例3的氨基酸序列
[0829] 序列号6：小鼠抗hTfR抗体号1的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0830] 序列号7：小鼠抗hTfR抗体号1的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0831] 序列号8：小鼠抗hTfR抗体号1的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0832] 序列号9：小鼠抗hTfR抗体号1的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0833] 序列号10：小鼠抗hTfR抗体号1的轻链CDR3的氨基酸序列
[0834] 序列号11：小鼠抗hTfR抗体号2的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0835] 序列号12：小鼠抗hTfR抗体号2的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0836] 序列号13：小鼠抗hTfR抗体号2的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0837] 序列号14：小鼠抗hTfR抗体号2的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0838] 序列号15：小鼠抗hTfR抗体号2的轻链CDR3的氨基酸序列
[0839] 序列号16：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0840] 序列号17：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0841] 序列号18：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0842] 序列号19：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0843] 序列号20：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR3的氨基酸序列
[0844] 序列号21：小鼠抗hTfR抗体号4的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0845] 序列号22：小鼠抗hTfR抗体号4的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0846] 序列号23：小鼠抗hTfR抗体号4的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0847] 序列号24：小鼠抗hTfR抗体号4的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0848] 序列号25：小鼠抗hTfR抗体号4的轻链CDR3的氨基酸序列
[0849] 序列号26：小鼠抗hTfR抗体号5的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0850] 序列号27：小鼠抗hTfR抗体号5的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0851] 序列号28：小鼠抗hTfR抗体号5的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0852] 序列号29：小鼠抗hTfR抗体号5的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0853] 序列号30：小鼠抗hTfR抗体号5的轻链CDR3的氨基酸序列
[0854] 序列号31：小鼠抗hTfR抗体号6的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0855] 序列号32：小鼠抗hTfR抗体号6的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0856] 序列号33：小鼠抗hTfR抗体号6的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0857] 序列号34：小鼠抗hTfR抗体号6的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0858] 序列号35：小鼠抗hTfR抗体号6的轻链CDR3的氨基酸序列
[0859] 序列号36：小鼠抗hTfR抗体号7的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0860] 序列号37：小鼠抗hTfR抗体号7的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0861] 序列号38：小鼠抗hTfR抗体号7的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0862] 序列号39：小鼠抗hTfR抗体号7的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0863] 序列号40：小鼠抗hTfR抗体号7的轻链CDR3的氨基酸序列
[0864] 序列号41：小鼠抗hTfR抗体号8的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0865] 序列号42：小鼠抗hTfR抗体号8的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0866] 序列号43：小鼠抗hTfR抗体号8的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0867] 序列号44：小鼠抗hTfR抗体号8的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0868] 序列号45：小鼠抗hTfR抗体号8的轻链CDR3的氨基酸序列
[0869] 序列号46：小鼠抗hTfR抗体号9的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0870] 序列号47：小鼠抗hTfR抗体号9的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0871] 序列号48：小鼠抗hTfR抗体号9的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0872] 序列号49：小鼠抗hTfR抗体号9的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0873] 序列号50：小鼠抗hTfR抗体号9的轻链CDR3的氨基酸序列
[0874] 序列号51：小鼠抗hTfR抗体号10的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0875] 序列号52：小鼠抗hTfR抗体号10的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0876] 序列号53：小鼠抗hTfR抗体号10的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0877] 序列号54：小鼠抗hTfR抗体号10的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0878] 序列号55：小鼠抗hTfR抗体号10的轻链CDR3的氨基酸序列
[0879] 序列号56：小鼠抗hTfR抗体号11的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0880] 序列号57：小鼠抗hTfR抗体号11的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0881] 序列号58：小鼠抗hTfR抗体号11的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0882] 序列号59：小鼠抗hTfR抗体号11的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0883] 序列号60：小鼠抗hTfR抗体号11的轻链CDR3的氨基酸序列
[0884] 序列号61：小鼠抗hTfR抗体号12的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0885] 序列号62：小鼠抗hTfR抗体号12的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0886] 序列号63：小鼠抗hTfR抗体号12的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0887] 序列号64：小鼠抗hTfR抗体号12的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0888] 序列号65：小鼠抗hTfR抗体号12的轻链CDR3的氨基酸序列
[0889] 序列号66：小鼠抗hTfR抗体号13的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0890] 序列号67：小鼠抗hTfR抗体号13的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0891] 序列号68：小鼠抗hTfR抗体号13的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0892] 序列号69：小鼠抗hTfR抗体号13的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0893] 序列号70：小鼠抗hTfR抗体号13的轻链CDR3的氨基酸序列
[0894] 序列号71：小鼠抗hTfR抗体号14的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0895] 序列号72：小鼠抗hTfR抗体号14的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0896] 序列号73：小鼠抗hTfR抗体号14的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0897] 序列号74：小鼠抗hTfR抗体号14的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0898] 序列号75：小鼠抗hTfR抗体号14的轻链CDR3的氨基酸序列
[0899] 序列号76：小鼠抗hTfR抗体号1的重链CDR1的氨基酸序列1
[0900] 序列号77：小鼠抗hTfR抗体号1的重链CDR1的氨基酸序列2
[0901] 序列号78：小鼠抗hTfR抗体号1的重链CDR2的氨基酸序列1
[0902] 序列号79：小鼠抗hTfR抗体号1的重链CDR2的氨基酸序列2
[0903] 序列号80：小鼠抗hTfR抗体号1的重链CDR3的氨基酸序列1
[0904] 序列号81：小鼠抗hTfR抗体号1的重链CDR3的氨基酸序列2
[0905] 序列号82：小鼠抗hTfR抗体号2的重链CDR1的氨基酸序列1
[0906] 序列号83：小鼠抗hTfR抗体号2的重链CDR1的氨基酸序列2
[0907] 序列号84：小鼠抗hTfR抗体号2的重链CDR2的氨基酸序列1
[0908] 序列号85：小鼠抗hTfR抗体号2的重链CDR2的氨基酸序列2
[0909] 序列号86：小鼠抗hTfR抗体号2的重链CDR3的氨基酸序列1
[0910] 序列号87：小鼠抗hTfR抗体号2的重链CDR3的氨基酸序列2
[0911] 序列号88：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR1的氨基酸序列1
[0912] 序列号89：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR1的氨基酸序列2
[0913] 序列号90：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR2的氨基酸序列1
[0914] 序列号91：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR2的氨基酸序列2
[0915] 序列号92：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR3的氨基酸序列1
[0916] 序列号93：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR3的氨基酸序列2
[0917] 序列号94：小鼠抗hTfR抗体号4的重链CDR1的氨基酸序列1
[0918] 序列号95：小鼠抗hTfR抗体号4的重链CDR1的氨基酸序列2
[0919] 序列号96：小鼠抗hTfR抗体号4的重链CDR2的氨基酸序列1
[0920] 序列号97：小鼠抗hTfR抗体号4的重链CDR2的氨基酸序列2
[0921] 序列号98：小鼠抗hTfR抗体号4的重链CDR3的氨基酸序列1
[0922] 序列号99：小鼠抗hTfR抗体号4的重链CDR3的氨基酸序列2
[0923] 序列号100：小鼠抗hTfR抗体号5的重链CDR1的氨基酸序列1
[0924] 序列号101：小鼠抗hTfR抗体号5的重链CDR1的氨基酸序列2
[0925] 序列号102：小鼠抗hTfR抗体号5的重链CDR2的氨基酸序列1
[0926] 序列号103：小鼠抗hTfR抗体号5的重链CDR2的氨基酸序列2
[0927] 序列号104：小鼠抗hTfR抗体号5的重链CDR3的氨基酸序列1
[0928] 序列号105：小鼠抗hTfR抗体号5的重链CDR3的氨基酸序列2
[0929] 序列号106：小鼠抗hTfR抗体号6的重链CDR1的氨基酸序列1
[0930] 序列号107：小鼠抗hTfR抗体号6的重链CDR1的氨基酸序列2
[0931] 序列号108：小鼠抗hTfR抗体号6的重链CDR2的氨基酸序列
[0932] 序列号109：小鼠抗hTfR抗体号6的重链CDR3的氨基酸序列1
[0933] 序列号110：小鼠抗hTfR抗体号6的重链CDR3的氨基酸序列2
[0934] 序列号111：小鼠抗hTfR抗体号7的重链CDR1的氨基酸序列1
[0935] 序列号112：小鼠抗hTfR抗体号7的重链CDR1的氨基酸序列2
[0936] 序列号113：小鼠抗hTfR抗体号7的重链CDR2的氨基酸序列1
[0937] 序列号114：小鼠抗hTfR抗体号7的重链CDR2的氨基酸序列2
[0938] 序列号115：小鼠抗hTfR抗体号7的重链CDR3的氨基酸序列1
[0939] 序列号116：小鼠抗hTfR抗体号7的重链CDR3的氨基酸序列2
[0940] 序列号117：小鼠抗hTfR抗体号8的重链CDR1的氨基酸序列1
[0941] 序列号118：小鼠抗hTfR抗体号8的重链CDR1的氨基酸序列2
[0942] 序列号119：小鼠抗hTfR抗体号8的重链CDR2的氨基酸序列
[0943] 序列号120：小鼠抗hTfR抗体号8的重链CDR3的氨基酸序列1
[0944] 序列号121：小鼠抗hTfR抗体号8的重链CDR3的氨基酸序列2
[0945] 序列号122：小鼠抗hTfR抗体号9的重链CDR1的氨基酸序列1
[0946] 序列号123：小鼠抗hTfR抗体号9的重链CDR1的氨基酸序列2
[0947] 序列号124：小鼠抗hTfR抗体号9的重链CDR2的氨基酸序列1
[0948] 序列号125：小鼠抗hTfR抗体号9的重链CDR2的氨基酸序列2
[0949] 序列号126：小鼠抗hTfR抗体号9的重链CDR3的氨基酸序列1
[0950] 序列号127：小鼠抗hTfR抗体号9的重链CDR3的氨基酸序列2
[0951] 序列号128：小鼠抗hTfR抗体号10的重链CDR1的氨基酸序列1
[0952] 序列号129：小鼠抗hTfR抗体号10的重链CDR1的氨基酸序列2
[0953] 序列号130：小鼠抗hTfR抗体号10的重链CDR2的氨基酸序列1
[0954] 序列号131：小鼠抗hTfR抗体号10的重链CDR2的氨基酸序列2
[0955] 序列号132：小鼠抗hTfR抗体号10的重链CDR3的氨基酸序列1
[0956] 序列号133：小鼠抗hTfR抗体号10的重链CDR3的氨基酸序列2
[0957] 序列号134：小鼠抗hTfR抗体号11的重链CDR1的氨基酸序列1
[0958] 序列号135：小鼠抗hTfR抗体号11的重链CDR1的氨基酸序列2
[0959] 序列号136：小鼠抗hTfR抗体号11的重链CDR2的氨基酸序列1
[0960] 序列号137：小鼠抗hTfR抗体号11的重链CDR2的氨基酸序列2
[0961] 序列号138：小鼠抗hTfR抗体号11的重链CDR3的氨基酸序列1
[0962] 序列号139：小鼠抗hTfR抗体号11的重链CDR3的氨基酸序列2
[0963] 序列号140：小鼠抗hTfR抗体号12的重链CDR1的氨基酸序列1
[0964] 序列号141：小鼠抗hTfR抗体号12的重链CDR1的氨基酸序列2
[0965] 序列号142：小鼠抗hTfR抗体号12的重链CDR2的氨基酸序列1
[0966] 序列号143：小鼠抗hTfR抗体号12的重链CDR2的氨基酸序列2
[0967] 序列号144：小鼠抗hTfR抗体号12的重链CDR3的氨基酸序列1
[0968] 序列号145：小鼠抗hTfR抗体号12的重链CDR3的氨基酸序列2
[0969] 序列号146：小鼠抗hTfR抗体号13的重链CDR1的氨基酸序列1
[0970] 序列号147：小鼠抗hTfR抗体号13的重链CDR1的氨基酸序列2
[0971] 序列号148：小鼠抗hTfR抗体号13的重链CDR2的氨基酸序列1
[0972] 序列号149：小鼠抗hTfR抗体号13的重链CDR2的氨基酸序列2
[0973] 序列号150：小鼠抗hTfR抗体号13的重链CDR3的氨基酸序列1
[0974] 序列号151：小鼠抗hTfR抗体号13的重链CDR3的氨基酸序列2
[0975] 序列号152：小鼠抗hTfR抗体号14的重链CDR1的氨基酸序列1
[0976] 序列号153：小鼠抗hTfR抗体号14的重链CDR1的氨基酸序列2
[0977] 序列号154：小鼠抗hTfR抗体号14的重链CDR2的氨基酸序列1
[0978] 序列号155：小鼠抗hTfR抗体号14的重链CDR2的氨基酸序列2
[0979] 序列号156：小鼠抗hTfR抗体号14的重链CDR3的氨基酸序列1
[0980] 序列号157：小鼠抗hTfR抗体号14的重链CDR3的氨基酸序列2
[0981] 序列号158：人源化抗hTfR抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列1
[0982] 序列号159：人源化抗hTfR抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列2
[0983] 序列号160：人源化抗hTfR抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列3
[0984] 序列号161：人源化抗hTfR抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列4
[0985] 序列号162：人源化抗hTfR抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列5
[0986] 序列号163：人源化抗hTfR抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列6
[0987] 序列号164：人源化抗hTfR抗体号1的、含有氨基酸序列6作为可变区的轻链的氨基酸序列，合成序列
[0988] 序列号165：编码人源化抗hTfR抗体号1的、含有氨基酸序列6作为可变区的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0989] 序列号166：人源化抗hTfR抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列1
[0990] 序列号167：人源化抗hTfR抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列2
[0991] 序列号168：人源化抗hTfR抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列3
[0992] 序列号169：人源化抗hTfR抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列4
[0993] 序列号170：人源化抗hTfR抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列5
[0994] 序列号171：人源化抗hTfR抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列6
[0995] 序列号172：人源化抗hTfR抗体号1的、含有氨基酸序列6作为可变区的重链的氨基酸序列
[0996] 序列号173：编码人源化抗hTfR抗体号1的重链的可变区的含有氨基酸序列6的重链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0997] 序列号174：人源化抗hTfR抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列1
[0998] 序列号175：人源化抗hTfR抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列2
[0999] 序列号176：人源化抗hTfR抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列3
[1000] 序列号177：人源化抗hTfR抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列4
[1001] 序列号178：人源化抗hTfR抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列5
[1002] 序列号179：人源化抗hTfR抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列6
[1003] 序列号180：人源化抗hTfR抗体号2的、含有氨基酸序列6作为可变区的轻链的氨基酸序列
[1004] 序列号181：含有编码人源化抗hTfR抗体号2的、含有氨基酸序列6作为可变区的轻链的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列，合成序列
[1005] 序列号182：人源化抗hTfR抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列1
[1006] 序列号183：人源化抗hTfR抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列2
[1007] 序列号184：人源化抗hTfR抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列3
[1008] 序列号185：人源化抗hTfR抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列4
[1009] 序列号186：人源化抗hTfR抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列5
[1010] 序列号187：人源化抗hTfR抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列6
[1011] 序列号188：人源化抗hTfR抗体号2的、含有氨基酸序列6作为可变区的重链的氨基酸序列
[1012] 序列号189：含有编码人源化抗hTfR抗体号2的、含有氨基酸序列6作为可变区的重链的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列，合成序列
[1013] 序列号190：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列1
[1014] 序列号191：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列2
[1015] 序列号192：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列3
[1016] 序列号193：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列4
[1017] 序列号194：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列5
[1018] 序列号195：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列6
[1019] 序列号196：人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列2作为可变区的轻链的氨基酸序列
[1020] 序列号197：编码人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列2作为可变区的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1021] 序列号198：人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列4作为可变区的轻链的氨基酸序列
[1022] 序列号199：编码人源化抗hTfR抗体号3的、含有作为可变区的氨基酸序列4的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1023] 序列号200：含有人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列5的轻链的氨基酸序列
[1024] 序列号201：编码人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列5作为可变区的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1025] 序列号202：人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列6作为可变区的、可变区[1026] 序列号203：编码人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列6作为可变区的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1027] 序列号204：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列1
[1028] 序列号205：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2
[1029] 序列号206：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列3
[1030] 序列号207：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列4
[1031] 序列号208：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列5
[1032] 序列号209：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列6
[1033] 序列号210：人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列2作为可变区的重链的氨基酸序列
[1034] 序列号211：编码人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列2作为可变区的重链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1035] 序列号212：人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列2作为可变区的重链(IgG4)的氨基酸序列
[1036] 序列号213：编码人源化抗hTfR抗体号3的、含有氨基酸序列2作为可变区的重链(IgG4)的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1037] 序列号214：引物hTfR5’，合成序列
[1038] 序列号215：引物hTfR3’，合成序列
[1039] 序列号216：引物Hyg-Sfi5’，合成序列
[1040] 序列号217：引物Hyg-BstX3’，合成序列
[1041] 序列号218：抗hTfR抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列
[1042] 序列号219：抗hTfR抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列
[1043] 序列号220：抗hTfR抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列
[1044] 序列号221：抗hTfR抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列
[1045] 序列号222：抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列
[1046] 序列号223：抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列
[1047] 序列号224：抗hTfR抗体号4的轻链的可变区的氨基酸序列
[1048] 序列号225：抗hTfR抗体号4的重链的可变区的氨基酸序列
[1049] 序列号226：抗hTfR抗体号5的轻链的可变区的氨基酸序列
[1050] 序列号227：抗hTfR抗体号5的重链的可变区的氨基酸序列
[1051] 序列号228：抗hTfR抗体号6的轻链的可变区的氨基酸序列
[1052] 序列号229：抗hTfR抗体号6的重链的可变区的氨基酸序列
[1053] 序列号230：抗hTfR抗体号7的轻链的可变区的氨基酸序列
[1054] 序列号231：抗hTfR抗体号7的重链的可变区的氨基酸序列
[1055] 序列号232：抗hTfR抗体号8的轻链的可变区的氨基酸序列
[1056] 序列号233：抗hTfR抗体号8的重链的可变区的氨基酸序列
[1057] 序列号234：抗hTfR抗体号9的轻链的可变区的氨基酸序列
[1058] 序列号235：抗hTfR抗体号9的重链的可变区的氨基酸序列
[1059] 序列号236：抗hTfR抗体号10的轻链的可变区的氨基酸序列
[1060] 序列号237：抗hTfR抗体号10的重链的可变区的氨基酸序列
[1061] 序列号238：抗hTfR抗体号11的轻链的可变区的氨基酸序列
[1062] 序列号239：抗hTfR抗体号11的重链的可变区的氨基酸序列
[1063] 序列号240：抗hTfR抗体号12的轻链的可变区的氨基酸序列
[1064] 序列号241：抗hTfR抗体号12的重链的可变区的氨基酸序列
[1065] 序列号242：抗hTfR抗体号13的轻链的可变区的氨基酸序列
[1066] 序列号243：抗hTfR抗体号13的重链的可变区的氨基酸序列
[1067] 序列号244：抗hTfR抗体号14的轻链的可变区的氨基酸序列
[1068] 序列号245：抗hTfR抗体号14的重链的可变区的氨基酸序列
[1069] 序列号248：抗hTfR抗体号1的重链(人源化6)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列[1070] 序列号249：编码抗hTfR抗体号1的重链(人源化6)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1071] 序列号250：抗hTfR抗体号2的重链(人源化6)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列[1072] 序列号251：编码抗hTfR抗体号2的重链(人源化6)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1073] 序列号252：抗hTfR抗体号3的重链(人源化2)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列[1074] 序列号253：编码抗hTfR抗体号3的重链(人源化2)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1075] 序列号254：抗hTfR抗体号3的重链(人源化2)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列[1076] 序列号255：编码抗hTfR抗体号3的重链(人源化2)与hBDNF的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1077] 序列号256：hBDNF的前体的氨基酸序列
[1078] 序列号257：单链抗hTfR抗体的氨基酸序列
[1079] 序列号258：编码hBDNF的前体与单链抗hTfR抗体的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1080] 序列号259：hBDNF的前体与单链抗hTfR抗体的融合蛋白的氨基酸序列
[1081] 序列号260：hBDNF与单链抗hTfR抗体的融合蛋白的氨基酸序列
[1082] 序列号261：人源化抗hTfR抗体Fab重链的氨基酸序列
[1083] 序列号262：编码hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1084] 序列号263：hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列[1085] 序列号264：hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列[1086] 序列号265：编码hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1087] 序列号266：小鼠抗hTfR抗体号6的重链CDR2的氨基酸序列2
[1088] 序列号267：小鼠抗hTfR抗体号8的重链CDR2的氨基酸序列2
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