GHRH分子的药物制剂
专利汇可以提供GHRH分子的药物制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了稳定的固体和液体药物制剂，其包含作为活性成分的GHRH分子、更具体而言是GHRH类似物、包括[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺。所述制剂包含阴离子型 表面活性剂 和非还原糖，并且具有约4.0至约7.5的pH。还公开了所述制剂用于 治疗 多种疾患的用途、制备所述制剂的方法以及包含该制剂的药盒。，下面是GHRH分子的药物制剂专利的具体信息内容。
1.一种固体药物制剂，其包含：
-GHRH分子，
-阴离子型表面活性剂，和
-非还原糖，
其中GHRH分子是式A的GHRH类似物：
X-GHRH肽 (A)
其中：
GHRH肽是式B的肽：
A1-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala- Arg-Lys-Leu-Leu-A24-A25-Ile-A27-A28-Arg-A30-R0(B)(SEQ ID NO：1)
其中，
A1是Tyr或His；
A2是Val或Ala；
A8是Asn或Ser；
A13是Val或Ile；
A15是Ala或Gly；
A18是Ser或Tyr；
A24是Gln或His；
A25是Asp或Glu；
A27是Met、Ile或Nle；
A28是Ser或Asn；
A30是价键或1至15个残基的氨基酸序列；并且
R0是NH2或NH-(CH2)n-CONH2，其中n＝1至12；并且
X是疏水尾，其通过酰胺键锚固于肽的N端，并且所述疏水尾定义了 5至7个原子的主链；
其中所述主链可被C1-6烷基、C3-6环烷基或C6-12芳基取代，并且所述 主链包含至少一个与所述主链的至少两个原子相连的刚性部分；
所述部分是双键、三键、饱和的或不饱和的C3-9环烷基或C6-12芳基。
2.如权利要求1所述的制剂，其中X是：
1(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式
2(R＝H或CH3或CH2CH3)
3(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
4(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
5(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
6(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
7(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
8(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
9(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
10(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
11(R＝H或CH3或CH2CH3)
12(R＝H或CH3或CH2CH3)
13(R＝H或CH3或CH2CH3)，或
3.如权利要求1所述的制剂，其中A30是：
(a)价键；
(b)对应于天然GHRH肽第30-44位的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，和
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的所述SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的制剂，其中所述GHRH肽是：
(a)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽；或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的所述(a)的多肽。
5.如权利要求1所述的制剂，其中所述GHRH类似物是(己烯酰基反 式-3)hGHRH(1-44)NH2(SEQ ID NO：7)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的制剂，其中所述制剂是冻干的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的制剂，其中所述非还原糖是海藻 糖或蔗糖。
8.如权利要求7所述的制剂，其中所述非还原糖是海藻糖。
9.如权利要求7所述的制剂，其中所述非还原糖是蔗糖。
10.如权利要求1至9中任一项所述的制剂，其中所述阴离子型表面 活性剂是聚氧乙烯失水山梨醇烷基酯。
11.如权利要求10所述的制剂，其中所述阴离子型表面活性剂是聚山 梨酯-20。
12.如权利要求1至11中任一项所述的制剂，其经混悬于水中而测量 时具有约4.0至约7.5的pH。
13.如权利要求1至12中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包 含膨胀剂。
14.如权利要求13所述的制剂，其中所述膨胀剂是甘露醇。
15.如权利要求1至14中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包 含抗氧化剂。
16.如权利要求15所述的制剂，其中所述抗氧化剂是甲硫氨酸。
17.一种液体药物制剂，其包含：
-GHRH分子，
-阴离子型表面活性剂，和
-非还原糖，
其中所述制剂具有约4.0至约7.5的pH，
其中所述GHRH分子是式A的GHRH类似物：
X-GHRH肽 (A)
其中
所述GHRH肽是式B的肽：
A1-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala- Arg-Lys-Leu-Leu-A24-A25-Ile-A27-A28-Arg-A30-R0(B)(SEQ ID NO：1)
其中，
A1是Tyr或His；
A2是Val或Ala；
A8是Asn或Ser；
A13是Val或Ile；
A15是Ala或Gly；
A18是Ser或Tyr；
A24是Gln或His；
A25是Asp或Glu；
A27是Met、Ile或Nle；
A28是Ser或Asn；
A30是价键或1至15个残基的氨基酸序列；并且
R0是NH2或NH-(CH2)n-CONH2，其中n＝1至12；并且
X是疏水尾，其通过酰胺键锚固于肽的N端，并且所述疏水尾定义了 5至7个原子的主链；
其中所述主链可被C1-6烷基、C3-6环烷基或C6-12芳基取代，并且所述 主链包含至少一个与所述主链的至少两个原子相连的刚性部分；
所述部分是双键、三键、饱和的或不饱和的C3-9环烷基或C6-12芳基。
18.如权利要求17所述的制剂，其中X是：
1(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式
2(R＝H或CH3或CH2CH3)
3(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
4(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
5(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
6(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
7(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
8(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
9(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
10(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
11(R＝H或CH3或CH2CH3)
12(R＝H或CH3或CH2CH3)
13(R＝H或CH3或CH2CH3)，或
19.如权利要求17所述的制剂，其中A30是：
(a)价键；
(b)对应于天然GHRH肽第30-44位的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的所述SEQ ID NO：6。
20.如权利要求17所述的制剂，其中所述GHRH肽是：
(a)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽；或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的所述(a)的多肽。
21.如权利要求17所述的制剂，其中所述GHRH类似物是(己烯酰基 反式-3)hGHRH(1-44)NH2(SEQ ID NO：7)。
22.如权利要求17至21中任一项所述的制剂，其中所述非还原糖是 海藻糖或蔗糖。
23.如权利要求22所述的制剂，其中所述非还原糖是海藻糖。
24.如权利要求22所述的制剂，其中所述非还原糖是蔗糖。
25.如权利要求17至24中任一项所述的制剂，其中所述非还原糖以 约0.1％至约5％(w/w)的浓度存在。
26.如权利要求25所述的制剂，其中所述非还原糖以约2％(w/w)的 浓度存在。
27.如权利要求17至26中任一项所述的制剂，其中所述阴离子型表 面活性剂是聚氧乙烯失水山梨醇烷基酯。
28.如权利要求27所述的制剂，其中所述阴离子型表面活性剂是聚山 梨酯-20。
29.如权利要求17至28中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂 以约0.001％(w/w)至约0.1％(w/w)的浓度存在。
30.如权利要求29所述的制剂，其中所述表面活性剂以约0.01％(w/w) 的浓度存在。
31.如权利要求17至30中任一项所述的制剂，其具有约5.0至约6.0 的pH。
32.如权利要求31所述的制剂，其具有约5.0的pH。
33.如权利要求31所述的制剂，其具有约5.5的pH。
34.如权利要求31所述的制剂，其具有约6.0的pH。
35.如权利要求17至34中任一项所述的制剂，其进一步包含缓冲剂， 其中所述缓冲剂是(i)琥珀酸盐缓冲剂、(ii)组氨酸缓冲剂、(iii)磷酸盐缓冲 剂或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。
36.如权利要求17至35中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步 包含膨胀剂。
37.如权利要求36所述的制剂，其中所述膨胀剂是甘露醇。
38.如权利要求36或37所述的制剂，其中所述膨胀剂以约1％至约 10％(w/w)的量存在。
39.如权利要求38所述的制剂，其中所述膨胀剂以约4％(w/w)的量 存在。
40.如权利要求17至39中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步 包含抗氧化剂。
41.如权利要求40所述的制剂，其中所述抗氧化剂是甲硫氨酸。
42.如权利要求17所述的制剂，其包含：
-[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺，
-约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20，
-约2％(w/w)的(i)海藻糖、(ii)蔗糖或(iii)(i)与(ii)的任意组合，
-约4％(w/w)的甘露醇，以及
-(i)琥珀酸盐缓冲剂、(ii)组氨酸缓冲剂或(iii)(i)与(ii)的任意组合，
所述制剂具有约5.0至约6.0的pH。
43.如权利要求17所述的制剂，其包含：
-[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺，
-约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20，
-约2％(w/w)的蔗糖，
-约4％(w/w)的甘露醇，以及
-组氨酸缓冲剂，
所述制剂具有约6.0的pH。
44.如权利要求17所述的制剂，其包含：
-[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺，
-约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20，
-约2％(w/w)的蔗糖，
-约4％(w/w)的甘露醇，以及
-琥珀酸盐缓冲剂，
所述制剂具有约5.5的pH。
45.如权利要求17所述的制剂，其包含：
-[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺，
-约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20，
-约2％(w/w)的蔗糖，
-约4％(w/w)的甘露醇，以及
-琥珀酸盐缓冲剂，
所述制剂具有约5.0的pH。
46.如权利要求17所述的制剂，其包括：
-[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺，
-约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20，
-约2％(w/w)的海藻糖，
-约4％(w/w)的甘露醇，以及
-琥珀酸盐缓冲剂，
所述制剂具有约5.5的pH。
47.通过将权利要求17至46中任一项所述的液体制剂进行冻干而制 得的冻干药物制剂。
48.(a)权利要求17至46中任一项所述的液体药物制剂或(b)通过用无 菌水性溶液混悬权利要求1至16中任一项所述的固体药物制剂而制得的液 体药物制剂或(c)通过用无菌水性溶液混悬权利要求47所述的冻干药物制 剂而制得的液体药物制剂用于治疗如下疾病中的至少一种的用途：与HIV 相关的脂肪营养不良、HIV-脂肪增生、腹部肥胖、GH缺乏、虚弱、轻度 认知障碍、免疫缺陷、与慢性病或长期疾病相关的消瘦或与慢性病或长期 疾病相关的营养不良。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述无菌水性溶液是无菌水。
50.如权利要求48或49所述的用途，其中所述液体药物制剂(a)、(b) 或(c)是用于通过皮下、肌内、静脉内或腹膜内途径施用的。
51.(a)权利要求17至46中任一项所述的液体药物制剂或(b)通过用无 菌水性溶液混悬权利要求1至16中任一项所述的固体药物制剂而制得的液 体药物制剂或(c)通过用无菌水性溶液混悬权利要求47所述的冻干药物制 剂而制得的液体药物制剂在制备用于治疗如下疾病中的至少一种的药物中 的用途：与HIV相关的脂肪营养不良、HIV-脂肪增生、腹部肥胖、GH缺 乏、虚弱、轻度认知障碍、免疫缺陷、与慢性病或长期疾病相关的消瘦或 与慢性病或长期疾病相关的营养不良。
52.如权利要求51所述的用途，其中所述无菌水性溶液是无菌水。
53.如权利要求51或52所述的用途，其中所述液体药物制剂(a)、(b) 或(c)是用于通过皮下、肌内、静脉内或腹膜内途径施用的。
54.(a)权利要求17至46中任一项所述的液体药物制剂或(b)通过用无 菌水性溶液混悬权利要求1至16中任一项所述的固体药物制剂而制得的液 体药物制剂或(c)通过混悬权利要求47所述的冻干药物制剂而制得的液体 药物制剂，其用来治疗如下疾病中的至少一种：与HIV相关的脂肪营养不 良、HIV-脂肪增生、腹部肥胖、GH缺乏、虚弱、轻度认知障碍、免疫缺 陷、与慢性病或长期疾病相关的消瘦或与慢性病或长期疾病相关的营养不 良。
55.如权利要求54所述的制剂，其中所述液体药物制剂(a)、(b)或(c) 是用于通过皮下、肌内、静脉内或腹膜内途径施用的。
56.一种治疗受治疗者的如下疾病中的至少一种的方法：与HIV相关 的脂肪营养不良、HIV-脂肪增生、腹部肥胖、GH缺乏、虚弱、轻度认知 障碍、免疫缺陷、与慢性病或长期疾病相关的消瘦或与慢性病或长期疾病 相关的营养不良；所述方法包括向受治疗者施用(a)权利要求17至46中任 一项所述的液体药物制剂或(b)通过用无菌水性溶液混悬权利要求1至16 中任一项所述的固体药物制剂而制得的液体药物制剂或(c)通过用无菌水 性溶液混悬权利要求47所述的冻干药物制剂而制得的液体药物制剂。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述施用是通过皮下、肌内、静 脉内或腹膜内途径进行的。
58.一种药盒，其包括在无菌容器中的权利要求1至16中任一项所述 的固体药物制剂或权利要求47所述的冻干制剂。
59.如权利要求58所述的药盒，其进一步包含无菌水性溶液。
60.如权利要求59所述的药盒，其中所述无菌水性溶液是无菌水。
61.制备GHRH分子的稳定冻干药物制剂的方法，其包括如下步骤： (a)在水性溶液中合并GHRH分子、非还原糖和阴离子型表面活性剂，从 而得到液体药物制剂。
62.如权利要求61所述的方法，其进一步包括如下步骤：(b)将步骤(a) 中的液体制剂冻干。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述冻干制剂在约40℃或以下 稳定至少6个月。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述冻干制剂在约40℃或以下 稳定至少4个月。
65.如权利要求62所述的方法，其中所述冻干制剂在约40℃或以下 稳定至少3个月。
66.如权利要求62所述的方法，其中所述冻干制剂在约40℃或以下 稳定至少2个月。
67.如权利要求61所述的方法，其中所述冻干制剂在约40℃或以下 稳定至少1个月。
68.如权利要求62至67中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(c) 用无菌水性溶液混悬所述冻干制剂。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述无菌水性溶液是无菌水。
发明领域
本发明涉及GHRH分子的药物制剂，其包括液体药物制剂和固体药物 制剂。此外，本发明涉及制备GHRH分子的这类药物制剂的方法及其用途。
发明背景
垂体腺中GH的分泌主要受两种下丘脑肽、即促生长素抑制素和生长 激素释放激素(GHRH；也被称作生长激素释放因子或GRF)控制。促生长 素抑制素抑制它的分泌，而GHRH刺激它。
在所有已知的GHRH分子中，如本申请所定义的包含疏水尾的GHRH 类似物由人GHRH的修饰型或类似物组成，其已经被证明在生物环境中具 有更高的蛋白质水解稳定性，因此这些类似物被证明显示更长的作用持续 时间，导致生长激素分泌和胰岛素样生长因子-1合成的提高(美国专利 5,861,379和5,939,386)。由于它们与天然的GHRH(1-44)酰胺相比具有更 优良的血浆稳定性和药理学特性，这些GHRH类似物被证明对数种医学疾 患具有治疗功效，例如与囊性纤维病和COPD相关的消瘦(国际申请WO 05/037307)、髋骨折后的恢复、老年人群的虚弱、提高免疫应答和与HIV 相关的脂肪营养不良(美国专利7,316,997)。
实际上，在制造过程、后续操作和储存中保存药学上感兴趣的肽或蛋 白质化合物的物理及化学完整性是很重要的。生物功效和效力的丧失与物 理(例如聚集、变性、二级或更高级结构的改变)和化学(例如氧化、脱酰胺 作用、单个氨基酸的异构化)完整性的改变有关。
蛋白质和肽在升高温度下特别容易降解。较低温度通常降低肽/蛋白质 的降解。然而，在室温下即约20℃至25℃储存蛋白质是更经济的。一般地， 在室温(在约20℃至约25℃)或冷藏(在约2℃至约8℃)储存的制剂稳定性是 所期望的。
也存在与制造过程中的操作、其长期储存和施用前的操作相关的稳定 性问题。长期储存可通过冷冻、冷冻干燥(冻干)、干燥或脱水实现。这些 生物蛋白质长期储存的方法阻止降解、聚集、天然构象的变性、解折叠和/ 或非特异性吸附。然而，冻干过程自身显露了困难。随着冷冻过程中液体 体积的减少，有效的盐浓度显著增加，这可以使蛋白质变性并降低了重构 后的有效治疗活性。此外，冷冻过程中冰晶的形成可以造成变性并降低可 获得的生物活性肽或蛋白质的有效量。
一些变性问题对某些氨基酸或某些氨基酸序列是特异性的，例如蛋白 质水解、酶促降解、氧化、pH相关的变性等等。已知GHRH的氨基酸序 列在长期以液态储存和在冻干或其它固化过程中会变性。
因此，同样有需要提供GHRH分子的改进的制剂以改善在长期储存后 其生物活性的保留。
发明概述
本发明涉及GHRH分子的药物制剂或组合物、其制备方法及其用途。
因此，在一个方面，本发明涉及一种干的或固体的药物制剂，其包含 GHRH分子、阴离子型表面活性剂和非还原糖。在一项实施方案中，所述 制剂经混悬于水中而测量时具有约4.0至约7.5的pH。在另一项实施方案 中，所述制剂经混悬于水中而测量时具有约4.0至约7.0的pH。在一项实 施方案中，所述固体制剂是冻干制剂。在一项实施方案中，所述固体制剂 是脱水的制剂。根据本发明，术语“固体”包括但不限于冻干的、脱水的、 冷冻的和任何其它固体形式。
本发明还涉及液体药物制剂，其包含GHRH分子、阴离子型表面活性 剂和非还原糖，并具有约4.0至7.5的pH。在一项实施方案中，所述制剂 具有约4.0至约7.0的pH。
本发明还涉及冻干或脱水的药物制剂，其通过将上述液体制剂冻干或 脱水制得。
本发明的液体药物制剂适合于冻干或脱水，并且当制剂以冻干的、干 的或固体的形式长期储存时提供GHRH分子的高稳定性，所述长期例如至 少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、 至少4个月或至少6个月。本发明的液体药物制剂适合于冻干或脱水，并 且当制剂在不同温度条件下以冻干的/干的形式被储存时提供了GHRH分 子的高稳定性，其中所述不同温度条件例如约2℃至约8℃、约20℃至约 25℃、约40℃或低于约40℃。
根据一项实施方案，GHRH分子是式A的GHRH类似物：
X-GHRH肽 (A)
其中GHRH肽是式B的肽：
A1-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-
Arg-Lys-Leu-Leu-A24-A25-Ile-A27-A28-Arg-A30-R0(B)(SEQ ID NO：1)
其中，
A1是Tyr或His；
A2是Val或Ala；
A8是Asn或Ser；
A13是Val或Ile；
A15是Ala或Gly；
A18是Ser或Tyr；
A24是Gln或His；
A25是Asp或Glu；
A27是Met、Ile或Nle；
A28是Ser或Asn；
A30是价键或1至15个残基的氨基酸序列；并且
R0是NH2或NH-(CH2)n-CONH2，其中n＝1至12；并且
X是疏水尾，其通过酰胺键锚固于肽的N端，并且所述疏水尾定义了 5至7个原子的主链；其中所述主链可被C1-6烷基、C3-6环烷基或C6-12芳 基取代，并且所述主链包含至少一个与所述主链的至少两个原子相连的刚 性部分；所述部分是双键、三键、饱和的或不饱和的C3-9环烷基或C6-12 芳基。
在另一项实施方案中，式A中的X是：
1(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式
2(R＝H或CH3或CH2CH3)
3(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
4(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
5(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
6(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
7(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
8(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
9(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
10(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
11(R＝H或CH3或CH2CH3)
12(R＝H或CH3或CH2CH3)
13(R＝H或CH3或CH2CH3)，或
在一项实施方案中，式B中的A30是：
(a)价键；
(b)对应于天然GHRH肽第30-44位的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在一项实施方案中，GHRH肽是：
(a)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽；或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的(a)的多肽。
在一项实施方案中，GHRH肽是：
(a)具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
(b)具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽；或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的(a)的多肽。
在另一项实施方案中，GHRH类似物是(己烯酰基反式-3)hGHRH (1-44)NH2(SEQ ID NO：7)。
在一项实施方案中，上述固体制剂是冻干制剂。
上述液体制剂中GHRH分子的浓度不限于某个范围。例如，上述液体 制剂中GHRH分子的浓度可以是在约1mg/ml至约20mg/ml之间(例如1、 2、4、6、8、10、12、14、16、18或20mg/ml)。
根据本发明的一项实施方案，固体制剂和/或液体制剂的非还原糖是海 藻糖或蔗糖。非还原糖优选以稳定有效量存在。在一项实施方案中，非还 原糖是海藻糖。在另一项实施方案中，非还原糖是蔗糖。在一项实施方案 中，非还原糖以约0.1％至约5％(w/w)的浓度存在。在另一项实施方案中， 非还原糖以约2％(w/w)的浓度存在。非还原糖的浓度和下文详述的任何组 分的浓度都对应于在液体制剂或使固体制剂混悬而得的溶液中的浓度。
根据本发明的一项实施方案，固体制剂和/或液体制剂的阴离子型表面 活性剂是聚氧乙烯失水山梨醇烷基酯。在另一项实施方案中，聚氧乙烯失 水山梨醇烷基酯是聚山梨酯-20。在一项实施方案中，阴离子型表面活性剂 以防止表面相关应激的有效量存在。表面相关应激包括但不限于聚集、沉 淀、解折叠等。在另一项实施方案中，表面活性剂以约0.001％(w/w)至约 0.1％(w/w)的浓度存在。在进一步的实施方案中，表面活性剂以约 0.01％(w/w)的浓度存在。
根据本发明的一项实施方案，固体制剂和/或液体制剂任选地进一步包 含膨胀剂(bulking agent)。在一项实施方案中，膨胀剂以给液体制剂或使固 体制剂混悬而得的溶液提供预期张力的有效量存在。在一项实施方案中， 膨胀剂是甘露醇。在另一项实施方案中，膨胀剂以约1％至约10％(w/w) 的浓度存在。在另一项实施方案中，膨胀剂以约4％(w/w)的浓度存在。
根据本发明的另一项实施方案，固体制剂和/或液体制剂任选地进一步 包含抗氧化剂。在一项实施方案中，抗氧化剂是甲硫氨酸。在一项实施方 案中，抗氧化剂以抗氧化有效量存在。在另一项实施方案中，抗氧化剂以 约0.1mM至约10mM的浓度存在。在另一项实施方案中，抗氧化剂以约 1mM的浓度存在。
根据本发明的一项实施方案，固体制剂和/或液体制剂基本上不含聚乙 二醇。在另一项实施方案中，固体制剂和/或液体制剂不含聚乙二醇。在一 项实施方案中，固体制剂和/或液体制剂中聚乙二醇的浓度低于稳定有效浓 度。在一项实施方案中，固体制剂和/或液体制剂含有低于约0.1％(w/w)的 聚乙二醇。在另一项实施方案中，固体制剂和/或液体制剂含有低于约 0.01％的聚乙二醇。在另一项实施方案中，固体制剂和/或液体制剂含有低 于约0.001％(w/w)的聚乙二醇。
根据本发明的一项实施方案，制剂具有约5.0至约6.0的pH。根据另 一项实施方案，制剂具有约5.0的pH。根据另一项实施方案，制剂具有约 5.5的pH。根据另一项实施方案，制剂具有约6.0的pH。在一项实施方案 中，制剂进一步包含缓冲剂。在另一项实施方案中，缓冲剂是(i)琥珀酸盐 缓冲剂、(ii)组氨酸缓冲剂、(iii)磷酸盐缓冲剂或(iv)(i)至(iii)的任意组合。 在实施方案中，pH是冻干或固化之前的液体制剂的pH，或是通过将冻干 或固体制剂混悬成液体形式而制得的液体制剂的pH。
根据一项实施方案，制剂包含[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺、 约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20、约2％(w/w)的(i)海藻糖、(ii)蔗糖或(iii)(i) 与(ii)的任意组合、约4％(w/w)的甘露醇，以及包含(i)琥珀酸盐缓冲剂、(ii) 组氨酸缓冲剂或(iii)(i)与(ii)的任意组合，其中所述制剂具有约5.0至约6.0 的pH。
根据另一项实施方案，制剂包含[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺、 约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20、约2％(w/w)的蔗糖、约4％(w/w)的甘露醇 以及包含组氨酸缓冲剂，其中所述制剂具有约6.0的pH。
根据另一项实施方案，制剂包含[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺、 约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20、约2％(w/w)的蔗糖、约4％(w/w)的甘露醇 以及包含琥珀酸盐缓冲剂，其中所述制剂具有约5.5的pH。
根据另一项实施方案，制剂包含[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺、 约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20、约2％(w/w)的蔗糖、约4％(w/w)的甘露醇 以及包含琥珀酸盐缓冲剂，其中所述制剂具有约5.0的pH。
根据另一项实施方案，制剂包含[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺、 约0.01％(w/w)的聚山梨酯-20、约2％(w/w)的海藻糖、约4％(w/w)的甘露 醇以及包含琥珀酸盐缓冲剂，其中所述制剂具有约5.5的pH。
本发明还涉及如下制剂用于制备药物或作为药物的用途：(a)上述液体 药物制剂，(b)通过用无菌水性溶液混悬上述固体药物制剂而制得的液体药 物制剂，或(c)通过用无菌水性溶液混悬冻干药物制剂而制得的液体药物制 剂，其中所述冻干药物制剂通过将上述液体药物制剂冻干而获得。
本发明还涉及如下制剂用于治疗与HIV相关的脂肪营养不良、HIV- 脂肪增生、GH缺乏、腹部肥胖、虚弱、轻度认知障碍、免疫缺陷、与慢 性病相关的消瘦或与慢性病相关的营养不良的用途：(a)上述液体药物制 剂，(b)通过用无菌水性溶液混悬上述固体药物制剂而制得的液体药物制 剂，或(c)通过用无菌水性溶液混悬冻干药物制剂而制得的液体药物制剂， 其中所述冻干药物制剂通过将上述液体药物制剂冻干而获得。
本发明还涉及如下制剂用于制备治疗与HIV相关的脂肪营养不良、 HIV-脂肪增生、腹部肥胖、GH缺乏、虚弱、轻度认知障碍、免疫缺陷、 与慢性病或长期疾病相关的消瘦或与慢性病或长期疾病相关的营养不良中 的至少一种的药物的用途：(a)上述液体药物制剂，(b)通过用无菌水性溶液 混悬上述固体药物制剂而制得的液体药物制剂，或(c)通过用无菌水性溶液 混悬冻干药物制剂而制得的液体药物制剂，其中所述冻干药物制剂通过将 上述液体药物制剂冻干而获得。
本发明还涉及上述液体药物制剂、固体药物制剂或冻干药物制剂，其 用于治疗如下疾病中的至少一种：与HIV相关的脂肪营养不良、HIV-脂 肪增生、腹部肥胖、GH缺乏、虚弱、轻度认知障碍、免疫缺陷、与慢性 病或长期疾病相关的消瘦或与慢性病或长期疾病相关的营养不良。
本发明还涉及治疗如下疾病中的至少一种的方法：与HIV相关的脂肪 营养不良、HIV-脂肪增生、腹部肥胖、GH缺乏、虚弱、轻度认知障碍、 免疫缺陷、与慢性病或长期疾病相关的消瘦或与慢性病或长期疾病相关的 营养不良，所述方法包括向受治疗者施用(a)上述液体药物制剂，(b)通过用 无菌水性溶液混悬上述固体药物制剂而制得的液体药物制剂，或(c)通过用 无菌水性溶液混悬冻干药物制剂而制得的液体药物制剂，其中所述冻干药 物制剂通过将上述液体药物制剂冻干而获得。
慢性疾患包括但不限于HIV感染、AIDS、囊性纤维病、慢性阻塞性 肺疾病、髋骨折、创伤和大外科手术。
在一项实施方案中，所述无菌水性溶液是无菌水或无菌缓冲溶液，其 具有约4.0至约7.5之间的pH，在一项实施方案中具有约4.0至约7.0之间 的pH，在另一项实施方案中具有约5.0至约6.0之间的pH。
根据本发明的一项实施方案，液体药物制剂或者混悬的固体药物制剂 或冻干药物制剂通过皮下、肌内、静脉内或腹膜内途径施用。
本发明还涉及用于混悬GHRH分子制剂的药盒或包装，其包括在无菌 容器中的上述固体药物制剂或冻干药物制剂。在一项实施方案中，药盒或 包装进一步包括无菌水性溶液。在另一项实施方案中，无菌水性溶液是无 菌水。在一项实施方案中，药盒或包装进一步包括将固体药物制剂混悬或 重构成液体形式的说明书。
本发明还涉及制备GHRH分子的稳定药物制剂的方法，其包括如下步 骤：(a)在水性溶液中合并GHRH分子、非还原糖和阴离子型表面活性剂， 从而得到液体药物制剂。
在一项实施方案中，上述制备稳定药物制剂的方法进一步包括：(b)将 步骤(a)的液体制剂冻干。
在一项实施方案中，上述GHRH分子的稳定药物制剂稳定至少1周、 至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个 月或至少6个月。在一项实施方案中，上述GHRH分子的稳定药物制剂在 不同温度条件下是稳定的，所述温度条件例如约2℃至约8℃、约20℃至 约25℃、约40℃或低于约40℃。
在另一项实施方案中，上述制备GHRH分子的稳定药物制剂的方法进 一步包括用无菌水性溶液混悬冻干制剂的步骤(c)。在一项实施方案中，无 菌水性溶液是无菌水。
当参考附图阅读以下对其仅仅通过实施例给出的具体实施方案的非限 制性描述时，本发明的其它目的、优点和特征将变得更加明显。
本描述提及了若干文件，其内容通过引用整体并入本文。
附图简述
在附图中：
图1显示了pH 4.0、5.0和6.0对冻干并储存在40℃的[反式-3-己烯酰 基]hGHRH(1-44)酰胺稳定性的影响(RP-HPLC数据)；
图2显示了稳定剂(乳糖、海藻糖和蔗糖)和作为抗氧化剂的甲硫氨酸 对冻干并储存在40℃的[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺稳定性的影响 (RP-HPLC数据)；
图3显示了膨胀剂(甘露醇、甘氨酸和PEG)对冻干并储存在40℃的[反 式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺稳定性的影响(RP-HPLC数据)；
图4显示了在40℃的储存期间不同的冻干制剂中[反式-3-己烯酰 基]hGHRH(1-44)酰胺的纯度(RP-HPLC数据)；
图5显示了在4℃储存经过15个月的时段，与不稳定制剂(5F644)相比， 冻干制剂(F13和F14)中[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺的纯度 (RP-HPLC数据)；
图6显示了在25℃储存经过15个月的时段，与不稳定制剂(5F644)相 比，冻干制剂(F13和F14)中[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺的纯度 (RP-HPLC数据)；和
图7提供了显示冻干制剂F4、F7和F10与粉末形式和液体形式(用水 溶解，200mg/ml)的单独活性主成分(API)的重叠对比的FT/IR分析结果。
说明性实施方案的描述
本发明提供了一种药物制剂，其包含GHRH分子，更具体地，包含下 文详述的式A的GHRH类似物。本文已经举例说明和比较了[反式-3-己烯 酰基]hGHRH(1-44)酰胺的若干制剂。
如本文所用的“生物学上可接受的”(或“药学上可接受的”)指特征 为在体内没有(或具有有限的)毒性或有害的生物效应的材料。它指这样的 那些化合物、制剂、配方和/或剂量形式：在合理的医学判断范围内，其适 合用于与受治疗者(例如人、动物)的生物液体和/或组织和/或器官接触，而 没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/ 危险比相称。
本文所用的术语“制剂”或“药物制剂”指这样的制品：它以允许活 性剂(例如GHRH分子如[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)有效的形式 存在，并且它不含对制剂所施予的受治疗者有毒的额外成分。它指活性剂 (例如GHRH分子如[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)和任意缓冲剂、 膨胀剂、辅助剂、载体、稳定剂、表面活性剂和其它在制造、储存、操作 和使用中对于维持活性剂活性和稳定性的可接受水平而言被认为是必要的 添加剂的制剂。本发明的药物制剂适合于冻干和以冻干形式长期储存活性 剂(例如GHRH分子如[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)。
本发明上下文中所用的术语“GHRH分子”包括但不限于人天然 GHRH(1-44)和片段(1-40)、(1-29)(在1-29和1-44序列之间的片段)和任意 其它片段；来自其它物种的GHRH及其片段；GHRH变体，含有氨基酸 置换、添加和/或缺失以至于所述变体的氨基酸序列具有与天然氨基酸序列 至少约90％的同源性，在一项实施方案中具有与天然氨基酸序列至少约 95％的同源性。在一项实施方案中，上述片段/变体当与以下相比时保留了 至少约10％的GH分泌刺激活性：天然GHRH；GHRH衍生物或类似物 或者其片段或变体，其具有例如与GHRH氨基酸序列在N端、C端或侧 链连接的有机基团或部分；和GHRH(人或来自其它物种)的盐以及GHRH 片段、变体、类似物和衍生物的盐。本发明的GHRH分子还涵盖本领域目 前已知的GHRH分子，包括但不限于白蛋白缀合的GHRH(美国专利 7,268,113)、聚乙二醇化GHRH肽(美国专利7,256,258和6,528,485)、猪 GHRH(1-40)(美国专利6,551,996)、犬GHRH(美国专利申请 2005/0064554)、1-29至1-44个氨基酸长度的GHRH变体(美国专利 5,846,936、5,696,089、5,756,458和5,416,073，以及美国专利申请2006/ 0128615和2004/0192593)和Pro0-GHRH肽及其变体(美国专利5,137,872)。
GHRH类似物包括美国专利5,681,379和5,939,386中所描述的那些， 所述美国专利也描述了它们的合成方法。更具体而言，这些GHRH类似物 由下面的式A所定义：
X-GHRH肽 (A)
GHRH肽是下式B的肽：
A1-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-Arg -Lys-Leu-Leu-A24-A25-Ile-A27-A28-Arg-A30-R0(B)(SEQ ID NO：1)
其中，
A1是Tyr或His；
A2是Val或Ala；
A8是Asn或Ser；
A13是Val或Ile；
A15是Ala或Gly；
A18是Ser或Tyr；
A24是Gln或His；
A25是Asp或Glu；
A27是Met、Ile或Nle；
A28是Ser或Asn；
A30是价键或1至15个残基的氨基酸序列；并且
R0是NH2或NH-(CH2)n-CONH2，其中n＝1至12；
X是疏水尾，其通过酰胺键锚固于肽的N端，并且所述疏水尾定义了 5至7个原子的主链。所述主链可被C1-6烷基、C3-6环烷基或C6-12芳基取 代，并且所述主链包含至少一个与所述主链的至少两个原子相连的刚性部 分。所述刚性部分是双键、三键、饱和的或不饱和的C3-9环烷基或C6-12 芳基。
在一项实施方案中，基团X是：
1(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式
2(R＝H或CH3或CH2CH3)
3(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
4(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
5(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
6(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
7(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
8(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
9(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
均为外消旋混合物或纯的对映异构体对
10(R＝H或CH3或CH2CH3)
顺式或反式，(当R≠H时)
11(R＝H或CH3或CH2CH3)
12(R＝H或CH3或CH2CH3)
13(R＝H或CH3或CH2CH3)，或
在一项实施方案中，式B中的A30是：
(a)价键；
(b)对应于天然GHRH肽第30-44位的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的(b)(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列。
在一项实施方案中，GHRH肽是：
(a)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽；或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的(a)的多肽。
在一项实施方案中，GHRH肽是：
(a)具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽；
(b)具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽；或
(c)从其C端缺失1-14个氨基酸的(a)的多肽。
在一项实施方案中，GHRH分子是(己烯酰基反式-3)hGHRH(1-44) NH2(SEQ ID NO：7)。[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺(也被称作(己烯 酰基反式-3)hGHRH(1-44)NH2)是合成的人生长激素释放因子类似物，其 包含人生长激素释放因子(hGHRH)的44个氨基酸序列，其中C6侧链己烯 酰基部分已经在N端被锚固在Tyr1上。
[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺具有如下结构：
(反式)CH3-CH2-CH＝CH-CH2-CO-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2(SEQ ID NO：7)
本文所用的术语“固体”在本发明的制剂的情况下指基本上不含水分 的形式的制剂，例如固体(例如粉末)形式的制剂。这样的固体制剂可以通 过任意去除水分的方法制备，例如冻干、脱水或其它干燥方法。
本文所用的术语“混悬”根据上下文意指混悬、重新混悬、重构和/ 或溶解(solubilisation)。就一致性来说，术语“混悬”在本文中用于通常指 将适宜的液体加入固体制剂中。
本文所用的术语“膨胀剂”指用来给使固体制剂混悬而得的溶液提供 适当或预期张力的化合物。溶液的适当或预期张力优选等于或接近于溶液 所施予的受治疗者的生理液体的等张性。例如，可以使用一种或多种糖作 为膨胀剂。本文所用的糖包括但不限于单糖、寡糖和多糖。适宜的糖的实 例包括但不限于甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和葡聚糖。 糖还包括糖醇，例如甘露醇、肌醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。根据 本发明还可以使用糖混合物。在一项实施方案中，膨胀剂是甘露醇。例如， 可以使用一种或多种氨基酸如甘氨酸作为膨胀剂。膨胀剂在制剂中的浓度 是约1％至约10％(w/w)。在一项实施方案中，膨胀剂的浓度是约3％至约 5％(w/w)。在另一项实施方案中，膨胀剂的浓度是约4％(w/w)。
在一项实施方案中，本发明的药物制剂具有约4.0至约7.5的pH。在 另一项实施方案中，本发明的药物制剂具有约4.0至约7.0的pH。在另一 项实施方案中，本发明的药物制剂具有约5.0至约6.0的pH。在另一项实 施方案中，本发明的药物制剂具有约6.0的pH。在另一项实施方案中，本 发明的药物制剂具有约5.5的pH。在另一项实施方案中，本发明的药物制 剂具有约5.0的pH。在另一项实施方案中，本发明的药物制剂具有5.0以 上的pH。
在一项实施方案中，本发明的制剂进一步包含缓冲剂。缓冲剂的适宜 量将根据所用缓冲剂类型和它的缓冲容量而变化。缓冲剂应该是适合于制 剂并以足以维持制剂的最终pH在上述pH范围内的量存在于制剂中的类 型。在一项实施方案中，缓冲剂是琥珀酸钠(琥珀酸盐)。在另一项实施方 案中，缓冲剂是L-组氨酸(组氨酸)。在另一项实施方案中，缓冲剂是磷酸 钠(磷酸盐)。这些缓冲剂常常可作为盐得到。在一项实施方案中，本发明 的药物制剂中缓冲剂的浓度是从约0.1mM至约50mM。在另一项实施方 案中，本发明的药物制剂中缓冲剂的浓度是从约1mM至约30mM。在另 一项实施方案中，本发明的药物制剂中缓冲剂的浓度是从约5mM至约20 mM。在另一项实施方案中，本发明的药物制剂中缓冲剂的浓度是约10 mM。
本发明的药物制剂中所包含的活性主成分(例如GHRH分子如[反式 -3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)的量可以根据待治疗疾病的特性和/或严 重性、患者的特点(年龄、重量等)和其它因素而确定。通常，本发明的药 物制剂包含约1μg/ml至约40000μg/ml的活性主成分(例如GHRH分子如 [反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)。在一项实施方案中，本发明的药物 制剂包含约1000μg/ml至约8000μg/ml(按重量计约0.099％至约0.792％) 的活性主成分(例如GHRH分子如[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)。 在另一项实施方案中，本发明的药物制剂包含约1000μg/ml至约4000 μg/ml(按重量计约0.099％至约0.396％)的活性主成分(例如GHRH分子如 [反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)。在另一项实施方案中，本发明的药 物制剂包含约1000μg/ml(按重量计约0.099％)的活性主成分(例如GHRH 分子如[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)。在另一项实施方案中，本发 明的药物制剂包含约4000μg/ml(按重量计约0.396％)的活性主成分(例如 GHRH分子如[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)。在实施方案中，制剂 包含一定量的活性主成分(例如GHRH分子如[反式-3-己烯酰 基]hGHRH(1-44)酰胺)以实现高于或等于约1mg、在另一项实施方案中约 1mg、在另一项实施方案中约2mg、在另一项实施方案中高于或等于约2mg 的活性主成分(例如GHRH分子如[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)剂 量的施用。在高浓度的活性主成分(例如GHRH分子如[反式-3-己烯酰 基]hGHRH(1-44)酰胺)下，可以使用较高浓度的缓冲剂。例如，在本文所 述的研究中，已经用30mM组氨酸缓冲剂来保持了含有10mg/ml或 30mg/ml[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺的制剂的pH。
在一项实施方案中，本发明的药物制剂还可以包含一种或多种表面活 性剂。表面活性剂的典型实例包括：
A)非离子型表面活性剂，例如，失水山梨醇脂肪酸酯，如失水山梨醇 单辛酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯；甘油脂肪酸 酯，如甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯；聚甘油脂肪 酸酯，如十聚甘油单硬脂酸酯、十聚甘油二硬脂酸酯、十聚甘油单亚油酸 酯；聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、 聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙 烯失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯失水 山梨醇三硬酯酸酯；聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯山梨醇四硬脂 酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯；聚氧乙烯甘油脂肪酸脂，如聚氧乙烯甘 油单硬脂酸酯；聚乙二醇脂肪酸酯，如聚乙二醇二硬脂酸酯；聚氧乙烯烷 基醚，如聚氧乙烯月桂基醚；烷基聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚，如聚氧乙烯聚 氧丙烯二醇醚(polyoxyethylene polyoxypropylene glycol ether)、丙基聚氧 乙烯聚氧丙烯聚醚、十六烷基聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚；聚氧乙烯烷基苯基 醚，如聚氧乙烯壬基苯基醚；聚氧乙烯硬化蓖麻油，如聚氧乙烯蓖麻油、 聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)；聚氧乙烯蜂蜡衍生物，如聚 氧乙烯山梨醇蜂蜡；聚氧乙烯羊毛脂衍生物，如聚氧乙烯羊毛脂；聚氧乙 烯脂肪酸酰胺，如聚氧乙烯硬脂酸酰胺；
B)阴离子型表面活性剂，例如，具有C10-18烷基的烷基硫酸盐，例如 十六烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、油基硫酸钠；聚氧乙烯烷基醚硫酸盐， 例如聚氧乙烯十二烷基硫酸钠；具有C8-18烷基的烷基磺基琥珀酸酯盐，如 十二烷基磺基琥珀酸钠；以及
C)天然表面活性剂，例如，卵磷脂、甘油磷脂、鞘氨醇磷脂如鞘磷脂、 C12-18脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯。这些表面活性剂中的一种或多种可以被组合 添加至本发明的制剂中。
在一项实施方案中，本发明的药物制剂的表面活性剂是阴离子型表面 活性剂。在另一项实施方案中，本发明的药物制剂的表面活性剂是聚氧乙 烯失水山梨醇烷基酯。在另一项实施方案中，本发明的药物制剂的表面活 性剂是聚山梨酯-20(T20或Tween-20TM)。
在另一项实施方案中，本发明的药物制剂中的表面活性剂的量是约 0.0001％至约10％(w/w)。在另一项实施方案中，本发明的药物制剂中的表 面活性剂的量是约0.001％至约5％(w/w)。在另一项实施方案中，本发明 的药物制剂中的表面活性剂的量是约0.01％(w/w)。
在一项实施方案中，本发明的药物制剂可进一步包含一种或多种稳定 化物质或稳定剂。如本文所用的术语“稳定剂”意指用来稳定治疗剂以对 抗将降低治疗剂的治疗活性的物理过程、化学过程和/或生物化学过程的化 合物。适合的稳定剂有非还原糖，通过举例方式和非限制性地包括蔗糖和 海藻糖；以及非还原性多元醇，通过举例方式和非限制性地包括山梨醇、 甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、甘醇、甘油和乙二醇。商业来源的聚乙二醇 是不适合的，因为它常常含有可导致GHRH分子降解的污染物。在一项实 施方案中，上述制剂基本上不含聚乙二醇。在另一项实施方案中，上述制 剂不含聚乙二醇。
在一项实施方案中，本发明的药物制剂包含非还原糖。本文所用的“非 还原糖”指不含半缩醛的糖(例如单糖或多糖)，例如特征如下的碳水化合 物或糖：具有在糖单元的还原端之间形成的糖苷键，而不是在一个糖单元 的还原端和另一个糖单元的非还原端之间形成的糖苷键。在另一项实施方 案中，上述非还原糖是海藻糖或蔗糖。在另一项实施方案中，上述非还原 糖是蔗糖。在另一项实施方案中，上述非还原糖是海藻糖。本发明的制剂 中非还原糖的浓度是约0.1％至约5％(w/w)。在一项实施方案中，非还原 糖的浓度是约1％至约3％(w/w)。在另一项实施方案中，非还原糖的浓度 是约2％(w/w)。
在另一项实施方案中，非还原糖以约1％(w/w)至约5％(w/w)的量存在 于药物制剂中。在另一项实施方案中，非还原糖以约2％(w/w)的量存在于 所述制剂中。
本发明的药物制剂如果需要的话可进一步包含稀释剂、增溶剂、赋形 剂、pH调节剂、润滑剂(soothing agent)、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂 等。例如，含硫还原剂包括N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、 硫双乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巯基乙酸及其盐、硫代 硫酸钠、谷胱甘肽、甲硫氨酸和含巯基化合物如具有1至7个碳原子的硫 代链烷酸。抗氧化剂包括甲硫氨酸、异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基 羟基茴香醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕 榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、 没食子酸丙酯或螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)二钠、焦磷酸钠、偏磷酸钠。 还可以含有其它通常添加的成分，例如，无机盐如氯化钠、氯化钾、氯化 钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠，以及有机盐如柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋 酸钠。
稳定的制剂是当储存时其中的活性主成分、即GHRH分子(例如[反式 -3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺)基本上保持其物理和化学稳定性以及完整 性的制剂。测量蛋白质或肽稳定性的各种分析技术在本领域内是可得的， 在《肽和蛋白质药物递送》(“Peptide and Protein Drug Delivery”，247-301， Vincent Lee编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约，N.Y.，Pubs.(1991))和Jones， A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中有综述。可以在选择的温度 下测定选择的时间段的稳定性。对于快速筛选，可以将制剂保存在例如约 40℃下达2周至1个月(至多6个月)，在这段时间测量稳定性。还可以将 制剂保存在例如约2℃至约8℃(例如约4℃)或保存在环境室温条件(约15 ℃至约30℃，优选约20℃至约25℃)下达至少6个月，在这段时间测量稳 定性。本发明的制剂提供了更好的液体或固体形式GHRH分子的稳定性， 并且还适合于在升高温度(例如40℃)、室温(即20-25℃)、冷藏温度(即2-8 ℃)下在存储时段保存固体或冻干形式的GHRH分子的稳定性。储存时段 可以例如以周、月或年表示，可以是至少1周、至少2周、至少4周、至 少6周、至少8周、至少3个月、至少4个月或至少6个月。例如，“稳 定”制剂可以是其中在制剂中存在约80％以上、约90％以上、约95％以 上、约96％以上、约97％以上、约98％以上或约99％以上的未降解活性 剂的制剂。本发明的制剂的稳定性可以采用RP-HPLC测量(例如参见下文 实施例)。本文所用的“稳定有效量或浓度”意指对有效获得稳定制剂的量 或浓度，在稳定制剂中，约80％以上、约90％以上、约95％以上、约96％ 以上、约97％以上、约98％以上或约99％以上的未降解活性剂存在于制 剂中。
本发明的制剂可用作用于治疗应用的药物，例如用于治疗脂肪营养不 良(例如与HIV相关的脂肪营养不良)、脂肪增生、GH缺乏、腹部肥胖、 血脂异常、高甘油三酯血症、X综合征、生活质量改善、虚弱、白天警醒 症(daytime vigilance)、包括思考、推理、解决问题和记忆在内的轻度认知 障碍(或认知功能)、免疫缺陷、与慢性病或长期疾病相关的肌肉消瘦或与 慢性病或长期疾病相关的营养不良。慢性病或长期疾病包括但不限于HIV 感染、AIDS、囊性纤维病、慢性阻塞性肺疾病、髋骨折、创伤和大外科手 术。在一项实施方案中，本发明的制剂可用于治疗与HIV相关的脂肪营养 不良。在另一项实施方案中，本发明的制剂可用于治疗慢性阻塞性肺疾病。 在另一项实施方案中，本发明的制剂可用于治疗囊性纤维病。
如本文所用的术语“受治疗者”或“患者”用于指温血动物如哺乳动 物，例如猫、狗、小鼠、豚鼠、马、牛、羊和人。在一项实施方案中，受 治疗者是哺乳动物。在另一项实施方案中，上述受治疗者是人。
本文所用的术语“治疗”被定义为：为了医治、治愈、缓和、延缓、 减轻、改变、补救、改善、改进或影响病症/疾病、病症/疾病的症状或者对 病症/疾病的易感性，将治疗剂应用或施用于受治疗者或者将治疗剂应用或 施用于从受治疗者分离的组织或细胞系，其中受治疗者具有病症、疾病、 病症或疾病的症状或者对病症或疾病的易感性。
本发明还提供了制备本文所述的制剂的方法。所述方法包括将各成分 在得到预期制剂的条件下(例如就配制、浓度、pH等而言)配制或合并在一 起(例如溶解、混合)。例如，就pH而言，可以相应地确定和调节制剂的 pH(如果需要的话)以落入预期的范围内。该方法的实例在下文实施例中有 描述。
本发明通过以下非限制性的实施例被进一步详细说明。
实施例
实施例1：材料和方法
[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺的合成。采用FMOC固相肽合成 法从Ramage三环酰胺树脂(Ramage Tricyclic Amide Resin)开始合成[反式 -3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺。使用被保护的氨基酸和反式-3-己烯酸进 行偶联，其中将被保护的氨基酸和反式-3-己烯酸各自溶解在用氧化铝处理 的DMF中，在偶联前使用TBTU帮助减少外消旋化和使用DIPEA促进 活化。通过Kaiser茚三酮试验(E.Kaiser等人，Anal.Biochem.，“Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid Phase Synthesis of Peptides”(肽固相合成中游离端氨基检测的色彩试验))和TNBS试验 (Means和Feeney，1971，Holden-Day Inc.，旧金山，“Chemical Modification of Proteins”(蛋白质的化学修饰)，第217页)来监测偶联的完全。
通过将被保护的肽-树脂在由在90％TFA、5％EDT和5％水组成的 裂解合剂中搅拌，使侧链保护基和肽-树脂键裂解。通过HPLC、经过三阶 段纯化方案、采用下述缓冲剂、即0.1％MSA、TEAP(pH6.5)和2％HOAc 纯化了肽粗品，得到纯的[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺(≥98.5％)。 将纯化的几批肽合并，在0.5％乙酸中重构，冻干。
冻干过程。通过将样品在-50℃冷冻并保持，恢复到-10℃并保持，在 100mTorr下于-10℃初次干燥，在100mTorr下于25℃第二次干燥，从而 将样品动干。
制剂。表I详述了作为活性成分的[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰 胺的几种受试制剂的组分。[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺以4mg/ml 的浓度存在于表I所列的所有制剂中，除了制剂F12，其中活性成分浓度 为8mg/ml。
表I：不同制剂的组分
编号 缓冲剂 pH 膨胀剂 (％w/w) 稳定剂 (％w/w) 抗氧化剂 表面活性剂 F1 10mM琥珀酸盐 5 甘露醇(4％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F3 10mM琥珀酸盐 4 甘露醇(4％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F4 10mM组氨酸 6 甘露醇(4％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F5 10mM磷酸盐 6 甘露醇(4％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F6 10mM琥珀酸盐 5 甘氨酸(2.5％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F7 10mM琥珀酸盐 5 PEG4K(10％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F8 10mM琥珀酸盐 5 甘露醇(2％) +PEG(5％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F9 10mM琥珀酸盐 5 甘露醇(4％) 乳糖(2％) 无 0.01％T20 F10 10mM琥珀酸盐 5 甘露醇(4％) 蔗糖(2％) 无 0.01％T20 F11 10mM琥珀酸盐 5 甘露醇(4％) 海藻糖(2％) 1mM 甲硫氨酸 0.01％T20 F12 10mM琥珀酸盐 5 甘露醇(4％) 海藻糖(2％) 无 0.01％T20 F13 10mM组氨酸 6 甘露醇(4％) 蔗糖(2％) 无 0.01％T20 F14 10mM琥珀酸盐 5.5 甘露醇(4％) 蔗糖(2％) 无 0.01％T20
＊T20指聚山梨酯-20，组氨酸指L-组氨酸。
制备制剂的过程
通过合并各成分、混合以及适当调节pH制得制剂。举例来说，下文 提供了制备制剂13和14(F13和F14，见表I)的细节。
如下制备F13：
制备下述储备溶液：
0.1M HCL储备溶液；
10mM组氨酸储备溶液；和
1％聚山梨酯-20储备溶液(将1g聚山梨酯-20与10mM组氨酸储备溶 液合并以达到100mL体积)。
按照表II将各成分合并：
表II：各成分-F13
成分 每kg的量 甘露醇 40g 蔗糖 20g 聚山梨酯1％储备溶液 10ml 组氨酸，游离碱 1.55g [反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺 4g
如下合并成分：
●将容器中装入0.90kg无菌水；
●将1.55g组氨酸(游离碱)在混合下加入到容器中，接着在环境温度下温 和搅拌10分钟；
●将40g甘露醇在混合下加入到容器中，接着在环境温度下温和搅拌10 分钟；
●将20g蔗糖在混合下加入到容器中，接着于环境温度温和搅拌10分钟；
●加入10ml聚山梨酯1％储备溶液，接着于环境温度温和搅拌15分钟；
●测定制剂的pH，如果必要的话用0.1M HCL储备溶液或10mM组氨酸 储备溶液将制剂酌情滴定到pH为6.6±0.2；
●加入4g[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺，在环境温度下将混合物 温和搅拌直到[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺完全溶解或搅拌至 少30分钟；
●测定制剂的pH，如果必要的话用0.1M HCl储备溶液或10mM组氨酸 储备溶液将制剂酌情滴定到pH为6.0±0.2；
●将溶液用无菌水补充至1kg，通过0.22μm膜过滤。
如下制备F14：
制备下述储备溶液：
0.1M NaOH储备溶液；
10mM琥珀酸钠储备溶液；和
1％聚山梨酯-20储备溶液(将1g聚山梨酯-20与10mM琥珀酸钠储备 溶液合并以达到100mL体积)。
接下来，按照表III将各成分合并：
表III：各成分-F14
成分 每kg的量 甘露醇 40g 蔗糖 20g 聚山梨酯1％储备溶液 10ml 琥珀酸钠 2.70g [反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺 4g
如下合并成分：
●将容器中装入0.90kg无菌水；
●将2.70g琥珀酸钠在混合下加入到容器中，接着在环境温度下温和搅拌 10分钟；
●将40g甘露醇在混合下加入到容器中，接着于环境温度温和搅拌10分钟；
●将20g蔗糖在混合下加入到容器中，接着于环境温度温和搅拌10分钟；
●加入10ml 1％聚山梨酯储备溶液，接着于环境温度温和搅拌15分钟；
●测定制剂的pH，如果必要的话用0.1M NaOH储备溶液或10mM琥珀酸 钠储备溶液将制剂滴定到pH为6.1±0.2；
●加入4g[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺，在环境温度下将混合物温 和搅拌直到[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺完全溶解或搅拌至少 30分钟；
●测定制剂的pH，如果必要的话用0.1M NaOH储备溶液或10mM琥珀酸 钠储备溶液将制剂酌情滴定到pH为5.5±0.2；
●将溶液用无菌水补充至1kg，通过0.22μm膜过滤。
反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。采用Agilent 1100TM HPLC系统、 WATERS DeltaPakTM HPI C18柱、1.0ml/min的流动相(乙腈/Milli-Q水) 和214nm的紫外检测进行了HPLC分析。
采用反相HPLC鉴别和定量[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺。通 过将样品中[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺的保留时间与新鲜制备 的、经校准的标准[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺溶液的各自保留时 间进行比较，建立了[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺的鉴别和定量， 其中标准[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺溶液由来自同一批的[反式 -3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺制得。通过与采用浓度已知的系列稀释液 获得的标准曲线进行比较，计算了样品中[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44) 酰胺的量。
实施例2：结果
图1比较了制剂组合在以冻干形式于40℃储存后的[反式-3-己烯酰 基]hGHRH(1-44)酰胺纯度水平，所述制剂组合采用三种不同缓冲剂(磷酸 盐、组氨酸和琥珀酸盐)制备并具有三种不同pH(4.0、5.0和6.0)。在冻干 前以及在冻干后于40℃储存1周、2周、4周、6周、8周、3个月、4个 月和6个月后重构后测定样品。可以看到，使用pH6.0的磷酸盐缓冲剂(F5)、 pH6.0的组氨酸缓冲剂(F4)和pH5的琥珀酸盐缓冲剂(F1)使得于40℃储存 的制剂具有良好稳定性。pH4的琥珀酸盐缓冲剂(F3)在于40℃储存时较不 稳定，但仍然可以提供适合的制剂。
图2比较了于40℃以冻干形式储存后的不同稳定剂(海藻糖、乳糖和蔗 糖)以及抗氧化剂(甲硫氨酸)的存在。在冻干前以及在冻干后于40℃储存1 周、2周、4周、6周、8周、3个月、4个月和6个月后重构后测定样品。 可以看到，非还原糖海藻糖(F1和F11)和蔗糖(F10)在40℃下提供了良好的 稳定作用。与不含甲硫氨酸的相同制剂(F1)相比，加入作为抗氧化剂的甲 硫氨酸(F11)对稳定性具有微小的积极作用。与此相反，还原糖乳糖(F9)在 40℃下不提供稳定作用。
图3比较了于40℃以冻干形式储存后的各种膨胀剂(甘露醇、甘氨酸、 PEG、甘露醇+PEG)。在冻干前以及在冻干后于40℃储存1周、2周、4 周、6周、8周、3个月、4个月和6个月后重构后测定样品。可以看到， 甘露醇(单独使用)(F1)和甘氨酸(F6)给于40℃储存的制剂提供了良好的稳 定作用。
图4说明了在于40℃以冻干形式储存1周、2周、4周、6周、8周、 3个月、4个月和6个月后制剂F1、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、 F11和F12的RP-HPLC结果。在40℃下储存6个月(其代表了应激条件) 后，最稳定的制剂是制剂F1、F4、F5、F6、F10、F11和F12。
基于图1、2、3和4的结果，已经设计出对应于制剂F13和F14的组 分组合，它们是：4％甘露醇、2％蔗糖、0.01％聚山梨酯-20，pH 6.0，在 组氨酸缓冲液中(F13)；以及4％甘露醇、2％蔗糖、0.01％聚山梨酯-20， pH 5.5，在琥珀酸钠缓冲液中(F14)。
图5说明了制剂F13和F14以及不稳定制剂(5F644)在4℃下以冻干形 式历经15个月时段的稳定性曲线图。恰好在纯度测试之前用无菌水进行重 构。不稳定制剂(5F644)含有4％甘露醇、1mg/ml[反式-3-己烯酰 基]hGHRH(1-44)酰胺，加入NaOH使pH为6.0。图5显示，在4℃下制 剂F13和F14以及不稳定制剂(5F644)的纯度曲线图是相似的。表I中所有 剩余的制剂在4℃下都有与不稳定制剂(5F644)相似的纯度曲线图(未显示)。
图6说明了制剂F13和F14以及不稳定制剂在25℃下以冻干形式历经 15个月时段的稳定性曲线图。恰好在纯度测试之前用无菌水进行重构。不 稳定制剂(5F644)在6个月时显示出显著的降解，而制剂F13和F14在15 个月后仍保持稳定。
通过卡尔·费歇尔水分分析(Karl Fisher Moisture Analysis)测得在两个 月时所有冻干制剂的含水量有利地在1％以下。卡尔·费歇尔水分分析(KF) 是测定产物或组合物中含水量的标准著名测试。
图7比较了制剂F4、F7和F10的冻干样品与粉末形式和液体形式(用 水溶解，200mg/ml)的单独活性主成分(API)的FT/IR分析。在此实例中， API是(己烯酰基反式-3)hGHRH(1-44)NH2。FT/IR分析通常提供关于活 性成分二级结构的信息。更具体地说，图7显示了[反式-3-己烯酰 基]hGHRH(1-44)酰胺肽在受试制剂中保持其天然结构。在1660cm-1处的 信号指示了[反式-3-己烯酰基]hGHRH(1-44)酰胺肽的保守的α-螺旋结构。
虽然在上文已经通过其具体实施方案对本发明进行了描述，但在不背 离所附权利要求书中所限定的本发明的精神和实质的情况下，可以对它进 行修改。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2007年4月4日提交的序列号为 60/909,985的美国临时申请的权益，其通过引用整体并入本文。
序列表
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海伦·洛夫里(Loughrey，Helen)
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<120>GHRH分子的药物制剂
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<151>2007-04-04
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GRF肽
<220>
<221>变体
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝Tyr或His
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Val或Ala
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝Asn或Ser
<220>
<221>变体
<222>(13)..(13)
<223>Xaa＝Val或Ile
<220>
<221>变体
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝Ala或Gly
<220>
<221>变体
<222>(18)..(18)
<223>Xaa＝Ser或Tyr
<220>
<221>变体
<222>(24)..(24)
<223>Xaa＝Gln或His
<220>
<221>变体
<222>(25)..(25)
<223>Xaa＝Asp或Glu
<220>
<221>变体
<222>(27)..(27)
<223>Xaa＝Met或Ile或Nle
<220>
<221>变体
<222>(28)..(28)
<223>Xaa＝Ser或Asn
<220>
<221>变体
<222>(30)..(30)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(31)..(31)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(32)..(32)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(33)..(33)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(35)..(35)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(36)..(36)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(37)..(37)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(38)..(38)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(39)..(39)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(40)..(40)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(41)..(41)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(42)..(42)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(43)..(43)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<220>
<221>变体
<222>(44)..(44)
<223>Xaa＝任意氨基酸或不存在
<400>1
Xaa Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Arg Lys Xaa Leu Xaa Gln
1 5 10 15
Leu Xaa Ala Arg Lys Leu Leu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40
<210>2
<211>44
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_特征
<222>(44)..(44)
<223>Leu残基被未取代的酰胺部分加帽
<400>2
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
<210>3
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人GRF的氨基酸序列
<400>3
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
<210>4
<211>29
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Arg残基被未取代的酰胺部分加帽
<400>4
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg
20 25
<210>5
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人GRF的最小活性核的氨基酸序列
<400>5
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg
20 25
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>对应于人GRF第30至44位的氨基酸序列
<400>6
Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
1 5 10 15
<210>7
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的GRF肽
<220>
<221>MISC_特征
<222>(1)..(1)
<223>Tyr残基与反式-3-己烯酰基部分连接
<220>
<221>MISC_特征
<222>(44)..(44)
<223>Leu残基被未取代的酰胺部分加帽
<400>7
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
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