认知障碍的治疗
阅读：784发布：2020-05-11
专利汇可以提供认知障碍的治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 认知障碍 (例如轻度认知障碍)的 治疗 ，其包括在对象(优选人对象)中使用能够降低同型半胱 氨 酸 水 平的物质。本发明的一些方面涉及治疗此类障碍的方法，其包括施用一种或更多种B族维生素，例如叶酸、维生素B6和/或维生素B12或者其衍 生物 。，下面是认知障碍的治疗专利的具体信息内容。
1.组合物，其包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平的物质，所述组合物用于在对象中治疗轻度认知障碍(MCI)。
2.组合物，其包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平的物质，所述组合物用于在对象中延缓MCI的发病和/或发生。
3.组合物，其包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平的物质，所述组合物用于在对象中改善认知功能。
4.组合物，其包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平的物质，所述组合物用于在患有MCI的对象中延迟或预防阿尔茨海默病的发生。
5.组合物，其包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平的物质，所述组合物用于在对象中降低脑萎缩的速率。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于向至少60岁的对象施用。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述对象至少70岁。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含第一B族维生素或其衍生物。
9.根据权利要求8所述的组合物，所述组合物还包含第二B族维生素或者所述组合物用于与包含第二B族维生素的第二组合物组合使用。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的组合物，所述组合物还包含第三B族维生素或者所述组合物用于与包含第三B族维生素的第三组合物组合使用。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，其包含至少三种B族维生素。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的组合物，其中所述第一B族维生素选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的组合物，其中所述第二B族维生素选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中所述第三B族维生素选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中所述第一B族维生素、所述第二B族维生素和所述第三B族维生素各自独立地选自：叶酸(蝶酰单谷氨酸)；一种或更多种叶酰聚谷氨酸；这样的化合物，其中叶酸或叶酰聚谷氨酸的蝶呤部分的吡嗪环被还原以产生二氢叶酸或四氢叶酸；或所有前述化合物的衍生物，其中N-5位或N-10位带有多种氧化水平的一碳单位；或者其两种或更多种的组合。
16.根据权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二和第三B族维生素独立地选自：二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸、5，10-亚胺甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸(瘤可维)和10-甲酰四氢叶酸。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的组合物，其包括同时、分开或依次施用所述第一、第二和第三B族维生素。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含叶酸、维生素B6和维生素B12的组合。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述物质选自胆碱和甜菜碱。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述物质是甜菜碱。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述物质是胆碱。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其包含与至少一种B族维生素组合的或者用于与至少一种B族维生素组合使用的治疗有效量的甜菜碱和/或胆碱。
23.根据权利要求22所述的组合物，其包含与叶酸、维生素B6和维生素B12组合的或者用于与叶酸、维生素B6和维生素B12组合使用的甜菜碱和/或胆碱。
24.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于在所述对象中改善注意力。
25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于在所述对象中改善执行功能。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于在所述对象中改善反应时间。
27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于在所述对象中改善学习或记忆。
28.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述对象包含基线水平的tHcy，其在上三个四分位数中。
29.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其为药物组合物并且还包含一种或更多种可药用赋形剂。
30.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于经口施用。
31.根据权利要求30的组合物，其为固体剂型。
32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含叶酸或其衍生物并且其中所述组合物包含约0.1mg至10mg所述叶酸或其衍生物。
33.根据权利要求32所述的组合物，其包含约0.5mg至1.5mg叶酸或其衍生物。
34.根据权利要求33所述的组合物，其包含约0.8mg叶酸或其衍生物。
35.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含维生素B12或其衍生物并且其中所述组合物包含约0.01mg至2mg所述维生素B12或其衍生物。
36.根据权利要求35所述的组合物，其包含约0.4mg至1.0mg维生素B12或其衍生物。
37.根据权利要求36所述的组合物，其包含约0.5mg维生素B12或其衍生物。
38.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含维生素B6或其衍生物并且其中所述组合物包含约1mg至40mg所述维生素B6或其衍生物。
39.根据权利要求38所述的组合物，其包含约15mg至30mg维生素B6或其衍生物。
40.根据权利要求39所述的组合物，其包含约20mg维生素B6或其衍生物。
41.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于每天施用一次。
42.至少两种B族维生素的组合，其用于在对象中治疗轻度认知障碍(MCI)。
43.至少两种B族维生素的组合，其用于在对象中治疗MCI、延缓其发病和/或发生。
44.至少两种B族维生素的组合，其用于在对象中改善认知功能。
45.至少两种B族维生素的组合，其用于在患有MCI的对象中延迟或预防阿尔茨海默病的发生。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的组合，其包含三种B族维生素。
47.根据权利要求46所述的组合，其中所述三种B族维生素选自维生素B12或其衍生物、维生素B6或其衍生物以及叶酸或其衍生物。
48.根据权利要求47所述的组合，其中所述B族维生素还包含一种或更多种在权利要求15、16和34至40中任一项所公开的特征或者其被允许的组合。
49.用于在对象中治疗轻度认知障碍(MCI)的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低同型半胱氨酸水平的物质。
50.用于在对象中延缓MCI的发病和/或发生的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低同型半胱氨酸水平的物质。
51.在患有MCI的对象中改善认知功能的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低同型半胱氨酸水平的物质。
52.用于在患有MCI的对象中延迟或预防阿尔茨海默病之发生的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低同型半胱氨酸水平的物质。
53.用于在对象中降低脑萎缩速率的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低同型半胱氨酸水平的物质。
54.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述对象至少60岁。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述对象至少70岁。
56.根据权利要求49至55中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用第一B族维生素或其衍生物。
57.根据权利要求49至56中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的所述第一B族维生素和治疗有效量的第二B族维生素。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的所述第一B族维生素、所述第二B族维生素和治疗有效量的第三B族维生素。
59.根据权利要求49至58中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用至少三种B族维生素。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中所述第一B族维生素选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的方法，其中所述第二B族维生素选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述第三B族维生素选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的方法，其中所述第一B族维生素、所述第二B族维生素和所述第三B族维生素各自独立地选自：叶酸(蝶酰单谷氨酸)；一种或更多种叶酰聚谷氨酸；这样的化合物，其中叶酸或叶酰聚谷氨酸的蝶呤部分的吡嗪环被还原以产生二氢叶酸或四氢叶酸；或所有前述化合物的衍生物，其中N-5位或N-10位带有多种氧化水平的一碳单位；或者其两种或更多种的组合。
64.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三B族维生素独立地选自：二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸、5，10-亚胺甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸(瘤可维)和10-甲酰四氢叶酸。
65.根据权利要求58至64中任一项所述的方法，其包括同时、分开或依次施用所述第一、第二和第三B族维生素。
66.根据权利要求49至56中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用叶酸、维生素B6和维生素B12的组合。
67.根据权利要求49至55中任一项所述的方法，其中所述物质选自胆碱和甜菜碱。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述物质是甜菜碱。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述物质是胆碱。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的方法，其包括施用与至少一种B族维生素组合的治疗有效量的甜菜碱和/或胆碱。
71.根据权利要求70所述的方法，其包括向所述对象施用与叶酸、维生素B6和维生素B12组合的治疗有效量的甜菜碱和/或胆碱。
72.根据权利要求49至71中任一项所述的方法，其中在施用所述至少一种物质之后所述对象的注意力得到改善。
73.根据权利要求49至72中任一项所述的方法，其中在施用所述至少一种物质之后所述对象的执行功能得到改善。
74.根据权利要求49至73中任一项所述的方法，其中在施用所述至少一种物质之后所述对象的反应时间得到改善。
75.根据权利要求49至74中任一项所述的方法，其中在施用所述至少一种物质之后所述对象的学习或记忆得到改善。
76.根据权利要求49至75中任一项所述的方法，其中所述对象包括基线tHcy水平超过9.5μmol/L的那些。
77.根据权利要求49至56中任一项所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用叶酸或其衍生物，所述剂型包含约0.1mg至10mg所述叶酸或其衍生物。
78.根据权利要求77所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用叶酸或其衍生物，所述剂型包含约0.5mg至1.5mg所述叶酸或其衍生物。
79.根据权利要求78所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用叶酸或其衍生物，所述剂型包含约0.8mg所述叶酸或其衍生物。
80.根据权利要求49至56或权利要求77至79中任一项所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用维生素B12或其衍生物，所述剂型包含约0.01mg至2mg所述维生素B12或其衍生物。
81.根据权利要求80所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用维生素B12或其衍生物，所述剂型包含约0.4mg至1.0mg所述维生素B12或其衍生物。
82.根据权利要求81所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用维生素B12或其衍生物，所述剂型包含约0.5mg所述维生素B12或其衍生物。
83.根据权利要求49至56或权利要求77至82中任一项所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用维生素B6或其衍生物，所述剂型包含约1mg至40mg所述维生素B6或其衍生物。
84.根据权利要求83所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用维生素B6或其衍生物，所述剂型包含约15mg至30mg维生素B6或其衍生物。
85.根据权利要求84所述的方法，其包括以这样的剂型向所述对象施用维生素B6或其衍生物，所述剂型包含约20mg维生素B6或其衍生物。
认知障碍的治疗
[0001] 本发明涉及认知障碍的治疗，所述认知障碍例如轻度认知障碍(Mild Cognitive Impairment，MCI)，该术语是指通常以不显著影响日常生活之认知障碍程度为特征的障碍。本发明至少部分地涉及使用一种或更多种B族维生素(B vitamin)(或其他治疗)以降低
血浆总同型半胱氨酸的浓度，从而治疗和/或降低MCI和/或其他类型认知障碍的进展。
血浆总同型半胱氨酸的浓度，从而治疗和/或降低MCI和/或其他类型认知障碍的进展。
背景技术
[0002] 认知能力可因正常的衰老而衰退。另外，大量的老年人群体经历认知能力的衰退，这超过了在正常衰老中正常的衰退。轻度认知障碍(MCI)反映不妨碍日常生活活动的没有痴呆的认知障碍程度。这被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)的前驱状态(De Carli，2003；Petersen等，2009；Petersen等，1999)。在70岁以上的人群中，MCI的患病率为14％至18％(Petersen等，2009；Plassman等，2008)，这意味着在美国有约500万人并且在大欧洲(greater Europe)有1400万人患有该病症。患MCI的人群中的大约一半在5年内转变成阿尔茨海默病或转变成其他形式的痴呆(DeCarli，2003)，因此迫切需要鉴定可减慢或预防该转变的治疗。迄今为止，还没有试验成功，并且目前还没有经批准的MCI治疗。
[0003] 在认知健康的老年人中，脑显示出显著的进行性萎缩(progressive atrophy)(Resnick等，2003)，并且极大提升的脑萎缩速率与从正常衰老向阿尔茨海默病的转变相关(Bradley等，2002；Fox等，1999；Jack等，2004；Smith，2002)。在MCI中发现了萎缩的中间速率(intermediate rate)(Carlson等，2008；Jack等，2005；Killiany等，2000；Ries等，
2008；Risacher等，2009；Sluimer等，2008)。因为脑萎缩速率在向阿尔茨海默病转变的患有MCI的对象中更快(Jack等，2004)，所以鉴定确定萎缩速率的因素是重要的，这是因为降低萎缩速率可减慢向阿尔茨海默病的转变。一种这样的因素似乎是升高的血浆总同型半胱氨酸(homocysteine，tHcy)浓度。在许多横断面研究(cross-sectional study)和前瞻性的研究中，中度升高的tHcy浓度与升高的痴呆(尤其是阿尔茨海默病)风险相关(Clarke
等，1998；McCaddon等，1998；Seshadri，2006；Smith，2008；Zylberstein等，2009)。不仅是在阿尔茨海默病中(Clarke等，1998)，而且在正常的老年人中(den Jeijer等，2003a；
Sachdev等，2002；Seshadri等，2008；Williams等，2002；Yang等，2007)，升高的tHcy还与局部脑萎缩和全脑萎缩这二者都相关。因此，仍需要鉴定可用以在对象中延缓脑萎缩的用于治疗MCI的新的治疗，并且降低tHcy水平可能是一种合理的方法。
2008；Risacher等，2009；Sluimer等，2008)。因为脑萎缩速率在向阿尔茨海默病转变的患有MCI的对象中更快(Jack等，2004)，所以鉴定确定萎缩速率的因素是重要的，这是因为降低萎缩速率可减慢向阿尔茨海默病的转变。一种这样的因素似乎是升高的血浆总同型半胱氨酸(homocysteine，tHcy)浓度。在许多横断面研究(cross-sectional study)和前瞻性的研究中，中度升高的tHcy浓度与升高的痴呆(尤其是阿尔茨海默病)风险相关(Clarke
等，1998；McCaddon等，1998；Seshadri，2006；Smith，2008；Zylberstein等，2009)。不仅是在阿尔茨海默病中(Clarke等，1998)，而且在正常的老年人中(den Jeijer等，2003a；
Sachdev等，2002；Seshadri等，2008；Williams等，2002；Yang等，2007)，升高的tHcy还与局部脑萎缩和全脑萎缩这二者都相关。因此，仍需要鉴定可用以在对象中延缓脑萎缩的用于治疗MCI的新的治疗，并且降低tHcy水平可能是一种合理的方法。
[0004] 尽管报道了MCI与阿尔茨海默病之间有相关性，但是已经显示按照用于治疗阿尔茨海默病的经批准的治疗对MCI患者未必有作用。例如，对于阿尔茨海默病药物(加兰他敏(galantamine))是否可用作MCI之治疗的临床试验已经开展。这些试验没有发现加兰他敏在改善功能或预防转变成阿尔茨海默病方面有任何显著的益处。然而，研究者却注意到加兰他敏治疗组中的死亡数显著地高于接受安慰剂的组。(Winblad B，Gauthier S，Scinto L，Feldman H，Wilcock GK，等(2008)Safety and efficacy of galantamine in subj ects with mild cognitive impairment.Neurology70：2024-2035.)
[0005] 还进行了临床试验以确定利斯的明(rivastigmine) 是否延缓从MCI向阿尔茨海默病的转变。该试验在四年中未发现利斯的明对向阿尔茨海默病的进展速率或对认知功能有显著的益处(Feldman HH，Ferris S，Winblad B，Sfikas N，Mancione L，等(2007)Effect of rivastigmine on delay to diagnosis of Alzheimer′s disease from mild cognitive impairment：the InDDEx study.Lancet Neurol6：501-512.)
[0006] 因此，临床试验已经表明，批准用于阿尔茨海默病的药物未必对MCI或MCI与阿尔茨海默病之间的转变具有任何治疗作用。
[0007] 发明概述
[0008] 在最广泛的方面中，本发明涉及通过施用在对象中降低同型半胱氨酸(tHcy)水平的物质(agent)来治疗除了阿尔茨海默病之外的认知障碍。在一个方面中，所述物质可包含一种或更多种B族维生素。本发明的实施方案可用于在对象中治疗认知障碍，例如轻度认知障碍(MCI)。
[0009] 因此，根据本发明，提供了用于在对象中治疗轻度认知障碍(MCI)的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低tHcy水平的物质。
[0010] 在本发明的一个方面中，提供了用于在对象中治疗(即延缓或预防)MCI的发病和/或发生(onset and/or development)的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低tHcy水平的物质。所述对象在开始治疗时可患有或可未患有MCI。
[0011] 在本发明的一个方面中，提供了在患有或认为患有MCI的对象中改善认知功能的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低tHcy水平的物质。
[0012] 在本发明的一个方面中，提供了用于在患有MCI的对象中延迟或预防阿尔茨海默病的发生的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低tHcy水平的物质。
[0013] 在本发明的一个方面中，提供了用于在对象中降低脑萎缩速率的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种降低tHcy水平的物质。
[0014] 在一个实施方案中，所述对象是人，并且可以是至少60岁，例如是至少70岁。
[0015] 在一个实施方案中，本发明的方法包括向对象施用至少一种B族维生素或其衍生物。在一个实施方案中，所述方法包括向对象施用治疗有效量的两种B族维生素或其衍生物。在一个实施方案中，本发明的方法包括施用治疗有效量的三种或更多种B族维生素或其衍生物。所述第一、第二和/或第三B族维生素各自可以是盐或游离酸的形式。
[0016] 在一个实施方案中，本发明的方法包括向对象施用至少三种B族维生素。所述第一、第二和第三B族维生素可独立地选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。因此，所述第一B族维生素可选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。此外，所述第二B族维生素可选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。另外，所述第三B族维生素可选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
[0017] 在一个实施方案中，所述第一B族维生素、所述第二B族维生素和所述第三B族维生素各自独立地选自：叶酸(蝶酰单谷氨酸(pteroylmonoglutamate))；一种或更多种叶酰聚谷氨酸(folylpolyglutamate)；这样的化合物，其中叶酸或叶酰聚谷氨酸的蝶呤部分的吡嗪环被还原以产生二氢叶酸或四氢叶酸；或所有前述化合物的衍生物，其中N-5位或N-10位带有多种氧化水平的一碳单位(one carbon unit)；或者其两种或更多种的组合。
[0018] 在一个实施方案中，所述第一、第二和第三B族维生素独立地选自二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-methylenetetrahydrofolate)、5，10-次甲基四氢叶酸(5，10-methenyltetrahydrofolate)、5，10-亚胺甲基四氢叶酸(5，
10-formiminotetrahydrofolate)、5-甲酰四氢叶酸、(瘤可维(leucovorin))和10-甲酰
四氢叶酸。
10-formiminotetrahydrofolate)、5-甲酰四氢叶酸、(瘤可维(leucovorin))和10-甲酰
四氢叶酸。
[0019] 在一个实施方案中，本发明的方法包括同时、分开或依次施用所述第一、第二和第三B族维生素。在一个实施方案中，本发明的方法包括向所述对象施用叶酸、维生素B6和维生素B12的组合。在一个实施方案中，所述物质选自胆碱和甜菜碱。因此，在一个实施方案中，所述物质是胆碱。在一个替代的实施方案中，所述物质是甜菜碱。
[0020] 在一个实施方案中，本发明的方法包括施用与至少一种B族维生素组合的治疗有效量的甜菜碱和/或胆碱。在一个实施方案中，本发明的方法包括向对象施用与叶酸、维生素B6和维生素B12组合的治疗有效量的甜菜碱和/或胆碱。
[0021] 本文中描述的方法的一些实施方案在施用所述至少一种物质之后可在对象中引起注意力的改善。作为替代或补充，在施用所述至少一种物质之后可在对象中改善执行功能和/或反应时间和/或学习或记忆。所述施用可经数天、数周、数月或数年的时间。
[0022] 所述对象可具有超过9.5μmol/L的基线tHcy水平。
[0023] 在一个实施方案中，本发明的方法包括以这样的剂型向所述对象施用叶酸或其衍生物，所述剂型包含约0.1mg至10mg所述叶酸或其衍生物，例如约0.5mg至1.5mg以及任选地约0.8mg所述叶酸或其衍生物。
[0024] 在一个实施方案中，本发明的方法包括以这样的剂型向所述对象施用维生素B12或其衍生物，所述剂型包含约0.01mg至2mg(例如0.4mg至1.0mg)所述维生素B12或其衍生物，例如约0.5mg所述维生素B12或其衍生物。所述维生素B12可用于单独施用或与其他物质(例如，叶酸(或其衍生物)以及本文中描述的其他物质)组合施用。
[0025] 在一个实施方案中，本发明的方法包括以这样的剂型向对象施用维生素B6或其衍生物，所述剂型包含约1mg至40mg所述维生素B6或其衍生物，例如约15mg至30mg(例如约20mg)所述维生素B6或其衍生物。
[0026] 在一个实施方案中，本发明的方法包括以这样的剂型向对象施用胆碱和/或甜菜碱，所述剂型包含约1g至6g(例如，1、2、3、4、5或6g)所述胆碱或甜菜碱。
[0027] 在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质的组合物，用于在对象中治疗轻度认知障碍(MCI)。本发明还包括至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中治疗轻度认知障
碍(MCI)。
碍(MCI)。
[0028] 在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质的组合物，用于在对象中延缓MCI的发病和/或发生。本发明还包括至少一种降低同
型半胱氨酸(tHcy)水平之物质在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中延缓MCI的发病和/或发生。
型半胱氨酸(tHcy)水平之物质在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中延缓MCI的发病和/或发生。
[0029] 在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质的组合物，用于在对象中改善认知功能。本发明还包括至少一种降低同型半胱氨酸
(tHcy)水平之物质在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中改善功能。
(tHcy)水平之物质在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中改善功能。
[0030] 在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质的组合物，用于在患有MCI的对象中延迟或预防阿尔茨海默病的发生。本发明还包括至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质在制备药物中的用途，所述药物用于在患
有MCI的对象中延迟或预防阿尔茨海默病的发生。
有MCI的对象中延迟或预防阿尔茨海默病的发生。
[0031] 在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质的组合物，用于在对象中降低脑萎缩速率。本发明还包括至少一种降低同型半胱氨酸(tHcy)水平之物质在制备药物中的用途，所述药物用于降低脑萎缩速率。
[0032] 本发明的组合物和/或药物可用于向至少60岁(例如至少70岁)的对象施用。
[0033] 在一个实施方案中，所述组合物和/或药物包含第一B族维生素或其衍生物。任选地，所述组合物和/或药物还包含第二B族维生素。在一个实施方案中，所述组合物还包含第三B族维生素。
[0034] 因此，在一个实施方案中，本发明的组合物和/或药物包含至少三种B族维生素。
[0035] 在一个实施方案中，所述第一B族维生素、所述第二B族维生素和所述第三B族维生素独立地选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
[0036] 在一个实施方案中，所述第一B族维生素、所述第二B族维生素和所述第三B族维生素各自独立地选自：叶酸(蝶酰单谷氨酸)；一种或更多种叶酰聚谷氨酸；这样的化合物，其中叶酸或叶酰聚谷氨酸的蝶呤部分的吡嗪环被还原以产生二氢叶酸或四氢叶酸；或所有前述化合物的衍生物，其中N-5位或N-10位带有多种氧化水平的一碳单位；或者其两种或更多种的组合。
[0037] 在一个实施方案中，所述第一、第二和第三B族维生素独立地选自：二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸、5，10-亚胺甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸(瘤可维)和10-甲酰四氢叶酸。
[0038] 在一个实施方案中，本发明的组合物和/或药物包含叶酸、维生素B6和维生素B12的组合。
[0039] 在一个实施方案中，所述组合物和/或药物包含选自胆碱和甜菜碱的物质。在一个实施方案中，所述物质是甜菜碱。在一个实施方案中，所述物质是胆碱。在一个实施方案中，所述组合物和/或药物包含与治疗有效量的至少一种B族维生素组合的治疗有效量的甜菜碱和/或胆碱。在一个实施方案中，所述组合物包含与叶酸、维生素B6和/或维生素
B12组合的甜菜碱和/或胆碱。
B12组合的甜菜碱和/或胆碱。
[0040] 所述组合物和/或药物可在对象中用于(a)改善注意力；(b)改善执行功能；(c)改善反应时间；和/或(d)改善学习或记忆。
[0041] 所述对象可包含高于约9.5μmol/L的基线tHcy水平。
[0042] 在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物，并且还包含一种或更多种可药用赋形剂。所述组合物可用于经口施用并且任选地是固体剂型。
[0043] 在一个实施方案中，所述组合物和/或药物包含约0.1mg至10mg叶酸或其衍生物，例如约0.5mg至1.5mg(例如约0.8mg)叶酸或其衍生物。
[0044] 作为替代或补充，所述组合物和/或药物包含约0.01mg至2mg维生素B12或其衍生物，例如0.4mg至1.0mg(例如约0.5mg)所述维生素B12或其衍生物。
[0045] 作为替代或补充，所述组合物和/或药物可包含约1mg至40mg维生素B6或其衍生物，例如约15mg至30mg(例如约20mg)所述维生素B6或其衍生物。
[0046] 在一个实施方案中，所述组合物和/或药物用于每天施用一次。所述组合物可用于每天施用一次，持续数周或数月的时间。
[0047] 在一个实施方案中，所述方法包括单独施用甜菜碱或者与其他物质组合施用。在一个实施方案中，所述方法包括与一种或更多种B族维生素组合施用甜菜碱。在一个实施方案中，所述方法包括单独施用胆碱或与其他物质(例如，一种或更多种B族维生素)组合施用。
[0048] 本发明的实施方案可取决于对象中的基线tHcy水平。因此，在一个实施方案中，本发明用于在基线tHcy水平在上三个四分位数(upper three quartiles)中的对象中用于治疗MCI或其他认知障碍。本发明包括在基线tHcy高于约9.5μmol/L的对象中治疗
MCI和其他认知障碍。
MCI和其他认知障碍。
[0049] 本发明包括在tHcy浓度高于9.5μmol/L的患者类群中降低脑萎缩的方法，其包括向所述对象施用至少一种B族维生素。所述方法可包括施用至少一种选自以下的B族维
生素：叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物，以及其组合。在一个实施方案中，所述方法可包括向有此需要的对象施用叶酸、维生素B12和维生素B6的组合。在一个实施方案中，所述认知障碍不是阿尔茨海默病。
生素：叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物，以及其组合。在一个实施方案中，所述方法可包括向有此需要的对象施用叶酸、维生素B12和维生素B6的组合。在一个实施方案中，所述认知障碍不是阿尔茨海默病。
[0050] 因此，本发明的实施方案通过以下发挥作用：通过施用高剂量的补充B族维生素(例如，叶酸、维生素B6和B12)来降低tHcy浓度，以减慢患有MCI之老年对象的脑萎缩速率。如本文中描述的，本发明的实施方案显示，在来自没有强制性面粉叶酸营养强化之国家的人群中，tHcy水平降低了约30％。
附图说明
附图说明
[0051] 下文中参照附图进一步描述本发明的实施方案，其中：
[0052] 图1是显示试验中参与流程的图，所述试验研究B族维生素对MCI中脑萎缩速率的影响(实施例1)。
[0053] 图2显示相对于基线tHcy的萎缩速率。具有95％均数预测区间的线性回归线。安2 2
慰剂组(n＝83)的R 为0.242(P＝0.001)，治疗组(n＝85)的R 为0.001(P＝0.74)。
慰剂组(n＝83)的R 为0.242(P＝0.001)，治疗组(n＝85)的R 为0.001(P＝0.74)。
[0054] 图3显示相对于两年中tHcy之变化的萎缩速率。该分析中的对象是亚组(66/83)安慰剂；70/85活性治疗)，他们显示了良好依从性的生物化学证据。在基线相对于年龄进行调整的具有95％均数预测区间的线性回归；标准化β＝0.22，P＝0.011。
[0055] 图4显示选择的减影MRI扫描(subtraction MRI scan)。(A)在安慰剂组中女性参与者(基线年龄79岁)的减影图像(subtraction image)，两年中她们的tHcy浓度从
22μmol/L的基线值升高了8μmol/L。颜色显示了脑的扩张(红/黄)或收缩(蓝/亮
蓝)0.3至1.0mm，最亮的颜色表示最大的变化。萎缩速率为2.50％/年。在这里萎缩最
强烈地表现为脑室扩大。(B)在活性物治疗组中女性参与者(基线年龄72岁)的减影图
像，两年中她们的tHcy浓度从24μmol/L的基线值降低了12μmol/L。颜色显示了脑的扩
张(红/黄)或收缩(蓝/亮蓝)0.3至1.0mm，最亮的颜色表示最大的变化。萎缩速率为
0.46％/年。没有明显可见的萎缩图样。
22μmol/L的基线值升高了8μmol/L。颜色显示了脑的扩张(红/黄)或收缩(蓝/亮
蓝)0.3至1.0mm，最亮的颜色表示最大的变化。萎缩速率为2.50％/年。在这里萎缩最
强烈地表现为脑室扩大。(B)在活性物治疗组中女性参与者(基线年龄72岁)的减影图
像，两年中她们的tHcy浓度从24μmol/L的基线值降低了12μmol/L。颜色显示了脑的扩
张(红/黄)或收缩(蓝/亮蓝)0.3至1.0mm，最亮的颜色表示最大的变化。萎缩速率为
0.46％/年。没有明显可见的萎缩图样。
[0056] 图5a是显示随时间对于“较高tHcy组”中的已经治疗的某人与如果未经治疗的同一人相比正确回答来自HVLT-DR的问题的估计优势比(estimated odds ratio)的图。该优势比随时间显著地升高。例如，对于“较高tHcy组”中的某人在开始治疗后2年正确回答的优势与如果未进行治疗的其优势相比高出了74％(P值＝0.004)。
[0057] 图5b是显示对于根据治疗状况的平均对象在“较高tHcy组”中估计总HVLT-DR得分随时间如何变化的图。治疗导致维持表现，而安慰剂组得分随时间下降。对于HVLT-DR得分，从第0月时间点移除数据以消除初始练习效应。
[0058] 图6a的图显示对于“较高tHcy组”中的某人开始治疗后2年对MMSE的正确回答的优势与如果未经治疗相比高出了44％(P值＝0.003)。
[0059] 图6b是显示在“较高tHcy组”中估计总MMSE得分随时间如何变化的图。使用安慰剂的那些显示在MMSE中下降，而进行治疗的那些显示没有显著变化。
[0060] 图7给出对于“较高tHcy组”中的已经治疗的某人与如果未经治疗的同一人相比随时间的平均分类流畅性(fluency)得分。例如，对于“较高tHcy组”中的某人在开始治疗后2年的平均字数与如果未经治疗的他的平均字数多出了12％(P值＝0.003)。
[0061] 图8显示根据基线tHcy浓度在经治疗的组和安慰剂组中随时间的HVLT-DR得分。
[0062] 图9的图显示根据基线tHcy浓度是否低于和高于75th四分位数，对CDR得分为0之对象比例的治疗作用。图9(c)显示两年中治疗相对于安慰剂的优势比。
[0063] 图10(a)显示在“低tHcy组”中估计的总MMSE得分如何随时间变化
[0064] 图10(b)显示在高tHcy组中各自的MMSE变化。只有“高tHcy组”中的对象受益于B族维生素治疗。使用安慰剂的那些显示在MMSE中下降，而使用B族维生素的那些显示
没有显著变化。
没有显著变化。
[0065] 图10(c)显示对于“高tHcy组”中已经接受B族维生素的某人与如果用安慰剂治疗的同一人相比对MMSE的项目的正确回答随时间的优势。对于“高tHcy组”中的某人开
始治疗后2年对MMSE中的问题之正确回答的优势与如果未经治疗的相比高出了44％(优
势比＝1.44，P＝0.003)。
始治疗后2年对MMSE中的问题之正确回答的优势与如果未经治疗的相比高出了44％(优
势比＝1.44，P＝0.003)。
[0066] 图10(d)～(f)显示针对HVLT-DR的类似的一组结果。还有，对于具有升高的tHcy的某人，B族维生素治疗导致维持的表现，而对于服用安慰剂的人，得分随时间下降。对于HVLT-DR模型，排除从0～3个月时期的数据以降低初始练习效应。
[0067] 图1(g)和(h)分别显示在“低”相对于“高”tHcy组中随时间的估计平均分类流畅性得分。对于“高tHcy组”中的某人在开始B族维生素治疗后2年的平均字数与如果未经治疗该人的平均字数多出了12％(P＝0.003)。
[0068] 发明详述
[0069] 以下更详细地描述本发明。除非另有所指，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，published by Oxford University Press，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，The Encyclopaedia of Molecular Biology，published by Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9)；
和Robert A.Meyers(编 )，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，published by VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)。免疫学领域技术人员已知的定义以及另一些信息可见于例如Fundamental Immunology，W. E.Paul编，fourth edition，Lippincott-Raven Publishers，1999。
和Robert A.Meyers(编 )，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，published by VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)。免疫学领域技术人员已知的定义以及另一些信息可见于例如Fundamental Immunology，W. E.Paul编，fourth edition，Lippincott-Raven Publishers，1999。
[0070] 本文中使用的术语“认知功能”或“认知状况”分别指任何高阶智力脑过程或脑状态，涉及学习和/或记忆，包括但不限于注意力、信息获取、信息处理、工作记忆、短期记忆、长期记忆、顺行记忆(anterograde memory)、逆行记忆(retrograde memory)、记忆提取(memory retrieval)、辨别学习、决策、抑制性响应控制、注意定势转移(attentional set-shifting)、延迟强化学习、逆转学习(reversal learning)、有意行为(voluntary behavior)的时间整合(temporal integration)以及在自己的环境和自顾(self-care)下表达兴趣。在一个实施方案中，本发明导致记忆改善。在人中，认知功能可测量，例如但不限于通过临床变化总体印象量表(clinical global impression of change scale)
(CIBIC-补充量表(CIBIC-plus scale))；简易精神状态检查(Mini Mental State Exam，MMSE)；神经精神症状问卷(Neuropsychiatric Inventory，NPI)；临床痴呆评定量表
(Clinical Dementia Rating Scale，CDR)；剑桥神经心理自动化成套测试(Cambridge
Neuropsychological Test Automated Battery，CANTAB)或山德士老年临床评价(Sandoz Clinical Assessment-Geriatric，SCAG)。 参 见Folstein 等，J Psychiatric Res12：
189-98，(1975)；Robbins等，Dementia5：266-81，(1994)；Rey，L′examen clinique en psychologie，(1964)；Kluger等，J Geriatr Psychiatry Neurol12：168-79，(1999)。在动物模型系统中，认知功能可以以本领域已知的多种常规方式测量，包括使用Morris水迷宫(Morris Water Maze，MWM)、巴恩斯圆形迷宫(Barnes circular maze)、高架放射臂迷宫(elevated radial arm maze)、T迷宫或其中动物使用空间信息的任何其他迷宫。还
可将其他本领域已知的另一些测试用于评估认知功能，例如新物体识别(novel object
recognition)和气味识别任务(odour recognition task)。认知功能还可使用以下成像
技术进行测量，所述成像技术例如正电子发射断层显象(Positron Emission Tomography，PET)、功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)、单光子发射计算机化断层显象(Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT)或者允许测量脑功能的任何其他成像技术。在动物中，认知功能还可用电生理学技术进行测量。因此，在一个实施方案中，本发明涉及改善对象的认知功能。所述对象可以是老年对象，例如超过60岁，例如70岁、75岁或80岁。
(CIBIC-补充量表(CIBIC-plus scale))；简易精神状态检查(Mini Mental State Exam，MMSE)；神经精神症状问卷(Neuropsychiatric Inventory，NPI)；临床痴呆评定量表
(Clinical Dementia Rating Scale，CDR)；剑桥神经心理自动化成套测试(Cambridge
Neuropsychological Test Automated Battery，CANTAB)或山德士老年临床评价(Sandoz Clinical Assessment-Geriatric，SCAG)。 参 见Folstein 等，J Psychiatric Res12：
189-98，(1975)；Robbins等，Dementia5：266-81，(1994)；Rey，L′examen clinique en psychologie，(1964)；Kluger等，J Geriatr Psychiatry Neurol12：168-79，(1999)。在动物模型系统中，认知功能可以以本领域已知的多种常规方式测量，包括使用Morris水迷宫(Morris Water Maze，MWM)、巴恩斯圆形迷宫(Barnes circular maze)、高架放射臂迷宫(elevated radial arm maze)、T迷宫或其中动物使用空间信息的任何其他迷宫。还
可将其他本领域已知的另一些测试用于评估认知功能，例如新物体识别(novel object
recognition)和气味识别任务(odour recognition task)。认知功能还可使用以下成像
技术进行测量，所述成像技术例如正电子发射断层显象(Positron Emission Tomography，PET)、功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)、单光子发射计算机化断层显象(Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT)或者允许测量脑功能的任何其他成像技术。在动物中，认知功能还可用电生理学技术进行测量。因此，在一个实施方案中，本发明涉及改善对象的认知功能。所述对象可以是老年对象，例如超过60岁，例如70岁、75岁或80岁。
[0071] 本文中使用的术语“轻度认知障碍”或“MCI”是指这样的障碍或病症，其中个体的认知障碍超出了对于其年龄和教育所的预期，但是通常不会妨碍其日常活动。在一些实施方案中，术语“MCI”是指这样的病症，其可被认为是正常衰老和痴呆之间的边界或过渡阶段。MCI可表现为各种认知症状，包括例如记忆丧失(memory loss)。记忆丧失可通过例如以下确证；(a)对象报告他或她自己的记忆障碍(memory impairment)，这可通过另一人来确证；和/或(b)用标准记忆评估测试(standard memory assessment test)(Petersen RC，Roberts RO，Knopman DS，Boeve BF，Geda YE，等(2009)Mild cognitive impairment：ten years later.Arch Neurol66：1447-1455)检测的可测量的大于正常的记忆障碍。在一个实施方案中，本发明涉在对象中治疗或减慢MCI进展，包括使用一种或更多种B族维生素。以下更详细地描述用于本发明的B族维生素。在一个实施方案中，MCI可以是遗忘性MCI。
在一个实施方案中，对象未患有其他脑功能(例如规划(planning)或注意力)障碍。在一
个替代的实施方案中，对象具有记忆、语言或其他精神功能障碍，使得他们遭受(c)正常的一般思考和推理技能下降和/或(d)对象进行正常日常活动的能力下降。这样的障碍可能
很严重，足以被其他人注意到并且在测试中表现出来，但是尚未严重到足以妨碍日常生活。
在一个实施方案中，个体为50岁或更大，例如55、60、65、70、75、80或85岁。
在一个实施方案中，对象未患有其他脑功能(例如规划(planning)或注意力)障碍。在一
个替代的实施方案中，对象具有记忆、语言或其他精神功能障碍，使得他们遭受(c)正常的一般思考和推理技能下降和/或(d)对象进行正常日常活动的能力下降。这样的障碍可能
很严重，足以被其他人注意到并且在测试中表现出来，但是尚未严重到足以妨碍日常生活。
在一个实施方案中，个体为50岁或更大，例如55、60、65、70、75、80或85岁。
[0072] 本文中使用的“年龄相关记忆障碍(Age-Associate Memory Impairment，AAMI)”是指由于衰老而记忆下降。如果他或她至少50岁并且符合以下所有标准则可认为患者或对象患有AAMI：a)患者已经注意到记忆表现下降，b)患者与年轻人相比对标准记忆测试表现得更差，c)排除记忆下降的所有其他明显的原因(除了正常的衰老)(换句话说，记忆下降不可归因于其他原因，例如最近的心脏病发作或头部伤害、抑郁、对药物的不良反应、阿尔茨海默病等)。在一个实施方案中，本发明包括通过施用本文中描述的至少一种B族维生素来治疗AAMI。
[0073] 本文中使用的术语“年龄相关认知下降(Age-Related Cognitive Decline，ARCD)”是指记忆和认知能力下降，这是人衰老的正常结果(例如，Craik&Salthouse，
1992)。实际上在所有的哺乳动物物种中也是如此。在一个实施方案中，本发明包括通过施用本文中描述的物质来治疗或降低ARCD的速率。在一个实施方案中，这样的方法包括施用本文中描述的至少一种B族维生素。在一个实施方案中，所述方法包括施用叶酸、维生素B6和维生素B12的组合。本发明还包括用于治疗ARCD的组合物(至少包含本文中描述物质)。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种B族维生素。在一个实施方案中，所述组合物包含叶酸、维生素B12和维生素B6。
1992)。实际上在所有的哺乳动物物种中也是如此。在一个实施方案中，本发明包括通过施用本文中描述的物质来治疗或降低ARCD的速率。在一个实施方案中，这样的方法包括施用本文中描述的至少一种B族维生素。在一个实施方案中，所述方法包括施用叶酸、维生素B6和维生素B12的组合。本发明还包括用于治疗ARCD的组合物(至少包含本文中描述物质)。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种B族维生素。在一个实施方案中，所述组合物包含叶酸、维生素B12和维生素B6。
[0074] 本文中使用的术语“患者”、“对象”或“个体”可互换使用并且是指人或非人的动物。这些术语包括哺乳动物，例如人、灵长类、牲畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬(canine)、猫(feline)等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一个优选的实施方案中，所述对象是人。
[0075] 本文中使用的术语“治疗”是指试图改变被治疗个体或细胞之自然过程的临床干预，并且可用于预防或在临床病理状况的过程中进行。期望的效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理结果、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。条件或对象是指采取措施以得到有益或期望的结果(包括临床结果)。有益或期望的临床结果包括但不限于缓解或改善一种或更多种与MCI或年龄相关的认知障碍有关的病症，延迟或减慢该障碍，改善、缓和或稳定该障碍，以及其他有益的结果(例如在患有年龄相关认知障碍或有其患病风险的对象中改善认知功能或降低认知
功能的下降速率)。
功能的下降速率)。
[0076] “治疗有效量”的药物或物质(例如本发明的B族维生素或其衍生物)是一定量的药物或物质，当其施用于对象时将具有预期的治疗效果，例如在对象(例如患有MCI的患者或有其风险的患者)中减慢脑萎缩或改善认知功能。通过施用一个剂量未必出现完全的治疗效果，其仅可在施用一系列剂量之后才出现。因此，治疗有效量可以以一次或更多次施用来进行施用。对象需要的精确有效量将取决于例如对象的体型大小，健康状况和年龄，认知障碍的性质和程度，以及所选择的用于施用的治疗或治疗组合，以及施用方式。技术人员可很容易地通过常规实验确定给定情况的有效量。在一个实施方案中，本文中描述的至少一种B族维生素以每日的频率或每天多于一次(例如每天2、3或4次)进行施用。
[0077] 物质
[0078] 本发明涉及在有此需要的对象中能够降低同型半胱氨酸水平的一种或更多种物质的用途。在一个实施方案中，所述物质是胆碱或甜菜碱。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物包括以每天约1g至约6g(例如每天1、2、3、4、5或6g)的剂量施用甜菜碱。所述方法可包括每天一次或更多次向对象施用甜菜碱。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物包括以每天约1g至约6g的剂量施用胆碱。所述方法可包括每天一次或更多次向对
象施用胆碱。在一个替代的实施方案中，所述物质是每天约0.5g至约4g剂量的N-乙酰半
胱氨酸。
象施用胆碱。在一个替代的实施方案中，所述物质是每天约0.5g至约4g剂量的N-乙酰半
胱氨酸。
[0079] 本发明的物质和包括此类物质之用途的方法可用于长期施用。也就是说，本发明的实施方案包括施用物质数天、数周、数月或数年时间。在一个实施方案中，所述物质至少每天天一次施用1个月、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月或更多。
[0080] B族维生素
[0081] 在一个实施方案中，所述物质是B族维生素。因此，本发明涉及一种或更多种B族维生素的用途。在一个实施方案中，第一B族维生素选自维生素B6、维生素B12和叶酸及其衍生物。在一个实施方案中，所述组合物用于与含有一种或更多种替代B族维生素的组合物组合使用。
[0082] 在一个实施方案中，本发明的方法、药物和/或组合物还可包含第二B族维生素。所述第二B族维生素可选自叶酸、维生素B6和维生素B12及其衍生物。
[0083] 在一个实施方案中，本发明的方法和组合物还包含第三B族维生素的用途。在一个实施方案中，第三B族维生素选自维生素B6、维生素B12和叶酸及其衍生物。
[0084] 在一个实施方案中，本发明的方法和/或组合物包含三种或更多种B族维生素之组合的用途，所述组合包含维生素B6、维生素B12和叶酸或者一种或更多种上述维生素的衍生物。因此，本发明包括施用B族维生素的组合，所述B族维生素包含在同一组合物中施用或分开施用。在一个实施方案中，提供了用于治疗认知障碍的B族维生素(例如，维生素B6、维生素B12和叶酸或衍生物)的组合，如本文中更详细地描述的那样。
[0085] 在一个实施方案中，本发明包括向对象单独施用或与本文中描述的其他物质组合施用叶酸(蝶酰单谷氨酸)。叶酸(folic acid)还称为B9或叶酸(folacin)。在一个实施方案中，所述方法包括施用选自以下的化合物：叶酸(蝶酰单谷氨酸)；一种或更多种叶酰聚谷氨酸；这样的化合物，其中叶酸或叶酰聚谷氨酸的蝶呤部分的吡嗪环被还原以产生二氢叶酸或四氢叶酸；或者所有前述化合物的衍生物，其中N-5位或N-10位带有多种氧化水平的一碳单位；或者其两种或更多种的组合。在本发明的一个实施方案中，上述形式中之一种的叶酸(folic acid或folate)可存在于组合物中和/或以约0.1mg至约10mg的量
施用于对象。在另一实施方案中，维生素B12以约0.01mg至约1.5mg的量存在。在另一实
施方案中，维生素B12可以以约0.4mg至约0.9mg的量存在。在本发明的一个实施方案中，维生素B12可以以约0.8mg的量存在。
施用于对象。在另一实施方案中，维生素B12以约0.01mg至约1.5mg的量存在。在另一实
施方案中，维生素B12可以以约0.4mg至约0.9mg的量存在。在本发明的一个实施方案中，维生素B12可以以约0.8mg的量存在。
[0086] 在一个实施方案中，本发明包括单独或与其他B族维生素组合施用维生素B12。维生素B12还称为钴胺素，其可转化为活性辅酶(甲基钴胺素和5′-脱氧腺苷钴胺素)。这些辅酶对叶酸代谢、同型半胱氨酸移除和髓磷脂合成是必需的。例如，甲基钴胺素催化叶酸辅因子(folate cofactor)脱甲基。而缺乏脱甲基可导致缺乏DNA合成所需的叶酸。脱氧
腺苷钴胺素是用于将甲基丙二酰-CoA转化成琥珀酰-CoA的辅酶，并且奇数链脂肪酸进入
柠檬酸循环需要该辅酶。维生素B12以及吡哆醇和叶酸参与适当的同型半胱氨酸代谢。维生素B12可用作例如氰钴胺素、甲基钴胺素、羟钴胺素和腺苷钴胺素。
腺苷钴胺素是用于将甲基丙二酰-CoA转化成琥珀酰-CoA的辅酶，并且奇数链脂肪酸进入
柠檬酸循环需要该辅酶。维生素B12以及吡哆醇和叶酸参与适当的同型半胱氨酸代谢。维生素B12可用作例如氰钴胺素、甲基钴胺素、羟钴胺素和腺苷钴胺素。
[0087] 本发明的组合物和方法的一个实施方案可包括维生素B12。在本发明的一个实施方案中，维生素B12可存在于组合物中和/或以约0.01mg至约1.5mg的量施用于对象。在另一实施方案中，维生素B12可以约0.2mg至约1mg的量存在。在另一个实施方案中，维生素B12可以约0.4mg至约0.8mg的量存在。在本发明的一个实施方案中，维生素B12可以约
0.5mg的量存在。在一个实施方案中，维生素B12是氰钴胺素。
0.5mg的量存在。在一个实施方案中，维生素B12是氰钴胺素。
[0088] 在一个实施方案中，本发明包括单独或与其他B族维生素组合施用维生素B6。维生素B6可存在于组合物中和/或以约0.5mg至约40mg的量施用于对象。在另一实施方案中，维生素B6可以约15mg至约30mg的量存在。在另一实施方案中，维生素B6可以约15mg
至约25mg的量存在。在本发明的一个实施方案中，维生素B12可以约20mg的量存在。
至约25mg的量存在。在本发明的一个实施方案中，维生素B12可以约20mg的量存在。
[0089] 在一个实施方案中，向对象施用胆碱。胆碱可包含在例如磷脂(例如磷脂酰胆碱)中。在一个实施方案中，向对象施用甜菜碱。在人体中，胆碱是甜菜碱的前体。甜菜碱是在同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转化中发挥作用的底物。
[0090] 可药用载体
[0091] 本发明包括本文中描述的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含可药用载体。可用于本文中公开之方法的可药用载体是常规的。Remington′s Pharmaceutical Sciences，by E.W. Martin，Mack Publishing Co，Easton，PA，第15版(1975)描述了适于药物递送本文中公开的IL-2受体拮抗剂的组合物和制剂。
[0092] 本文中使用短语“可药用”来提及在合理医学判断的范围内适合用于与人类或动物之组织相接触且没有过度毒性、刺激性、变态反应或者与合理的利益/风险比相称的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0093] 一般来说，载体的性质将有赖于所使用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体作为载剂，所述流体包括可药用和生理学上可接受的流体，例如，水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸、片或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性载体之外，待施用的药物组合物可包含无毒性的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂、盐、氨基酸和pH缓冲剂等，例如钠或钾的氯化物或磷酸盐、吐温(Tween)、乙酸钠或者失水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0094] 在一个优选的实施方案中，本发明的组合物用于经口施用并且是例如固体剂型。用于经口施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性化合物通常与至少一种惰性可药用赋形剂或载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或一
种或更多种以下物质混合：a)填充剂或增量剂(extender)，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)黏合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)湿润剂(humectant)，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)润湿剂(wetting agent)，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸酯钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物还可在软填充和硬填充的明胶胶囊中用作填充剂，所述胶囊使用例如乳糖(lactose或
milk sugar)以及高分子量聚乙二醇的赋形剂。
种或更多种以下物质混合：a)填充剂或增量剂(extender)，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)黏合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)湿润剂(humectant)，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)润湿剂(wetting agent)，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸酯钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物还可在软填充和硬填充的明胶胶囊中用作填充剂，所述胶囊使用例如乳糖(lactose或
milk sugar)以及高分子量聚乙二醇的赋形剂。
[0095] 本发明的组合物可以是经口制剂的形式，因此本发明的方法包括经口施用物质(例如，胆碱、甜菜碱和/或B族维生素)。合适地，经口制剂包含溶解助剂(dissolution aid)。所述溶解助剂不受其身份的限制，只要是可药用即可。实例包括非离子表面活性
剂，例如蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，失水山梨糖醇三油酸酯)、聚乙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、甲氧基聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯烷基硫醚、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、季戊四醇脂肪酸酯、丙二醇单脂肪酸酯、聚氧乙烯丙二醇单脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、脂肪酸烷基醇酰胺(fatty acid alkylolamide)和烷基胺氧化物；胆汁酸及其盐(例如，鹅脱氧胆酸
(chenodeoxycholic acid)、胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸及其盐，以及其甘氨酸或其牛磺酸缀合物)；离子型表面活性剂，例如月桂基硫酸钠、脂肪酸皂、烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、醚磷酸盐、碱性氨基酸的脂肪酸盐；三乙醇胺皂和烷基季铵盐；以及两性表面活性剂，例如甜菜碱和氨基羧酸盐。
剂，例如蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，失水山梨糖醇三油酸酯)、聚乙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、甲氧基聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯烷基硫醚、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、季戊四醇脂肪酸酯、丙二醇单脂肪酸酯、聚氧乙烯丙二醇单脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、脂肪酸烷基醇酰胺(fatty acid alkylolamide)和烷基胺氧化物；胆汁酸及其盐(例如，鹅脱氧胆酸
(chenodeoxycholic acid)、胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸及其盐，以及其甘氨酸或其牛磺酸缀合物)；离子型表面活性剂，例如月桂基硫酸钠、脂肪酸皂、烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、醚磷酸盐、碱性氨基酸的脂肪酸盐；三乙醇胺皂和烷基季铵盐；以及两性表面活性剂，例如甜菜碱和氨基羧酸盐。
[0096] 可用包衣或壳体(shell)(例如肠溶衣和药物制剂领域中公知的其他包衣(例如多重包衣))制备片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可任选地包含遮光剂并且还可以是这样的组合物，其仅释放活性成分或者优选地在肠道的某一部分释放和/或以延迟的方式释放。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质(polymeric substance)和蜡。
[0097] 或者，本文中使用的物质(例如，B族维生素、甜菜碱和/或胆碱)可包含在液体剂型中。用于经口施用的液体剂型包括可药用乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型可包含通常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂之外，所述经口组合物还可包含辅料(adjuvant)，例如润湿剂，乳化剂和助悬剂，甜味剂、调味剂和芳香剂。除了活性化合物之外，混悬剂可包含助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和西黄芪胶及其混合物。
[0098] 在一个实施方案中，本发明物质的施用方式可以是静脉内、动脉内、肌内或皮下注射。在一个实施方案中，可肌内施用一种或更多种B族维生素(例如维生素B12)。本文中描述的B族维生素可用于同一或不同组合物中。
[0099] 参照以下非限制性实施例进一步描述本发明：
[0100] 实施例1
[0101] 简介
[0102] 上升的血浆总同型半胱氨酸(tHcy)浓度是认知衰退和阿尔茨海默病的风险因素，并且与更迅速的脑萎缩有关。升高的脑萎缩速率以轻度认知障碍(MCI)为特征。本发明人进行了随机对照试验(VITACOG、ISRCTN94410159)以观察降低tHcy的治疗(高剂量叶
酸、维生素B6和B12)是否会减慢脑萎缩速率并因此在治疗MCI中具有治疗益处。
酸、维生素B6和B12)是否会减慢脑萎缩速率并因此在治疗MCI中具有治疗益处。
[0103] 对象包括271位患有轻度认知障碍的个体(筛选了646位)轻度认知障碍。在研究开始和结束时一个亚组(187位)自愿进行颅MRI扫描。该研究在2004年至2009年
在牛津大学的调查记忆与衰老的牛津项目(Oxford Project to Investigate Memory and Ageing，OPTIMA)中进行。参与者被随机分为同等大小的两组，一组用含有叶酸(0.8mg/
天)、维生素B12(0.5mg/天)和维生素B6(20mg/天)的药片治疗，另一组用安慰剂药片治疗；
治疗进行24个月。预先指定的主要结果量度是全脑萎缩速率的变化。总共有168位参与
者(活性物治疗组有85位；83位接受安慰剂)完成了试验的MRI部分。活性物治疗组中的
平均每年脑萎缩速率比安慰剂组中的低30％(0.76％[95％CI，0.63-0.90]相对于1.08％
[0.9401.22]。P＝0.001)。治疗响应与基线tHcy水平相关：在活性物治疗组中，tHcy＞
13μmol/L的参与者的萎缩速率更低(53％)。治疗响应还与试验期间血浆tHcy水平的变
化相关：tHcy水平降低得最多的那些具有最低的萎缩速率。萎缩速率是影响最终认知测试得分的因素之一：较大的萎缩速率与较低的认知得分相关。因此，本发明提供通过用B族维生素治疗来减慢在轻度认知障碍中加快的脑萎缩速率的方法。
在牛津大学的调查记忆与衰老的牛津项目(Oxford Project to Investigate Memory and Ageing，OPTIMA)中进行。参与者被随机分为同等大小的两组，一组用含有叶酸(0.8mg/
天)、维生素B12(0.5mg/天)和维生素B6(20mg/天)的药片治疗，另一组用安慰剂药片治疗；
治疗进行24个月。预先指定的主要结果量度是全脑萎缩速率的变化。总共有168位参与
者(活性物治疗组有85位；83位接受安慰剂)完成了试验的MRI部分。活性物治疗组中的
平均每年脑萎缩速率比安慰剂组中的低30％(0.76％[95％CI，0.63-0.90]相对于1.08％
[0.9401.22]。P＝0.001)。治疗响应与基线tHcy水平相关：在活性物治疗组中，tHcy＞
13μmol/L的参与者的萎缩速率更低(53％)。治疗响应还与试验期间血浆tHcy水平的变
化相关：tHcy水平降低得最多的那些具有最低的萎缩速率。萎缩速率是影响最终认知测试得分的因素之一：较大的萎缩速率与较低的认知得分相关。因此，本发明提供通过用B族维生素治疗来减慢在轻度认知障碍中加快的脑萎缩速率的方法。
[0104] 方法
[0105] 研究方案
[0106] 在2004年4月至2006年11月通过当地报纸或广播的广告寻找担忧其记忆的≥70岁的人招募牛津地区的参与者。通过电话访问，受访者完成关于纳入和排除标准
(inclusion and exclusion criteria)的健康筛查问卷，并且完成TICS-M和分类流畅性
测验(category fluency test，CERAD)(De Jager等，2003；Morris等，1989)。询问合格的参与者他们是否同意进行两次颅MRI扫描，一次在开始治疗时以及一次在两年后治疗结束时，但是要强调扫描是自愿的。该研究经NHS研究伦理委员会(NHS research ethics
committee)(COREC04/Q1604/100)批准。
(inclusion and exclusion criteria)的健康筛查问卷，并且完成TICS-M和分类流畅性
测验(category fluency test，CERAD)(De Jager等，2003；Morris等，1989)。询问合格的参与者他们是否同意进行两次颅MRI扫描，一次在开始治疗时以及一次在两年后治疗结束时，但是要强调扫描是自愿的。该研究经NHS研究伦理委员会(NHS research ethics
committee)(COREC04/Q1604/100)批准。
[0107] 纳入标准包括：年龄大于70岁；主观担忧记忆；研究伙伴可作为知情人；根据具有日常生活活动的Petersen标准的MCI诊断，用基于之前定义的MCI界定得分(cut-offscore)(即最大39的17～29的得分)(De Jager等，2003)的TICS-M(Brandt等，1993)
评估客观记忆问题。对于临界个案：如果TICS-M＞29但是分类流畅性＜19或TICS-M字
词回忆≤10/20，那么对象合格。或者，如果TICS-M＜17但是分类流畅性＜19或TICS-M
字词回忆≤10/20，那么对象合格。另一些用于确证在初访时收集的MCI诊断的方法是
MMSE(Folstein等，1975)的得分＞24/30并且没有痴呆的证据。排除标准包括：诊断为痴呆或用抗痴呆药物治疗；活跃的癌症；在过去的3个月内有严重卒中；用氨甲喋呤、抗癌或抗癫痫药治疗，或者通过口服或通过注射任何剂量获得叶酸＞300μg/天、吡哆醇＞3mg/天或钴胺素＞1.5μg/天。
评估客观记忆问题。对于临界个案：如果TICS-M＞29但是分类流畅性＜19或TICS-M字
词回忆≤10/20，那么对象合格。或者，如果TICS-M＜17但是分类流畅性＜19或TICS-M
字词回忆≤10/20，那么对象合格。另一些用于确证在初访时收集的MCI诊断的方法是
MMSE(Folstein等，1975)的得分＞24/30并且没有痴呆的证据。排除标准包括：诊断为痴呆或用抗痴呆药物治疗；活跃的癌症；在过去的3个月内有严重卒中；用氨甲喋呤、抗癌或抗癫痫药治疗，或者通过口服或通过注射任何剂量获得叶酸＞300μg/天、吡哆醇＞3mg/天或钴胺素＞1.5μg/天。
[0108] 在临床随访时，参与者提供血液和尿液样本并且进行各种认知测试(包括MMSE(Folstein等，1982))并且完成老年抑郁量表(Geriatric Depression Scale，GDS)问卷(Yesavage等1982)。参与者还进行其音叉踝关节的振动感觉的简单测试。开始治疗后
在第3、6、12、15和18个月通过电话与参与者接触以验证依从性、询问不良事件并且进行口头记忆测试(verbal memory test)。24个月后，参与者回到临床进行检查和血液测试。并且重复成套认知测试(cognitive test battery)。在第27个月时对不良事件和认知进行
最终的电话评估。
在第3、6、12、15和18个月通过电话与参与者接触以验证依从性、询问不良事件并且进行口头记忆测试(verbal memory test)。24个月后，参与者回到临床进行检查和血液测试。并且重复成套认知测试(cognitive test battery)。在第27个月时对不良事件和认知进行
最终的电话评估。
[0109] 通过用于遗忘性和非遗忘性MCI的Petersen经修订标准(Petersen等，2009)，将满足入围标准并且给出书面知情同意书的患有MCI的对象随机分为治疗组和安慰剂组。集中化电话随机化(centralised telephone randomisation)与完全分配隐藏(allocation concealment)以及最简化年龄、性别、基线TICS-M得分和MRI同意一起使用。治疗组接受含有0.8叶酸、0.5mg氰钴胺素和20mg吡哆醇HCl的 (meda AB/Recip AB，Box906，Pipers 2A，SE-17009Solna，Sweden)或安慰剂药片。安慰剂药片与维生素药
片 相同，只是没有维生素并且添加氧化铁和硫酸亚铁(0.0055％)以得
到与维生素药片相匹配的颜色。
片 相同，只是没有维生素并且添加氧化铁和硫酸亚铁(0.0055％)以得
到与维生素药片相匹配的颜色。
[0110] 治疗期为2年。每位参与者在初访时和在每6个月的间隔通过邮寄接收其研究药物。对于同意MRI扫描的那些，在第一次扫描的当天分发药片。
[0111] 血液采集和测定
[0112] 在基线和2年后，通过静脉穿刺采集非空腹血液样本。如之前描述的那样测定血浆tHcy、叶酸、钴胺素、holoTC和总TC。(Vogiatzoglou等，2008)将TC饱和度计算为
holoTC和总TC的比率。通过液相色谱串联质谱测定血浆胱硫醚。(Antoniades等，2009)
使用Wizard DNA纯化试剂盒(Promega，Southampton，UK)从血液中提取基因组DNA。使
用Ampliflour SNP基因分型系统(Chemicon，Watford，UK)(Warden和Refsum，2005)对
MTHFR677C＞T多态性(NCBI Entrez Gene4524)和TCN2776C＞G多态性(NCBI Entrez
Gene6948)进行分型，同时使用一阶段PCR(one-stage PCR)法(Wenham等，1991)确定APOE基因型(CBI Entrez Gene：348)。
holoTC和总TC的比率。通过液相色谱串联质谱测定血浆胱硫醚。(Antoniades等，2009)
使用Wizard DNA纯化试剂盒(Promega，Southampton，UK)从血液中提取基因组DNA。使
用Ampliflour SNP基因分型系统(Chemicon，Watford，UK)(Warden和Refsum，2005)对
MTHFR677C＞T多态性(NCBI Entrez Gene4524)和TCN2776C＞G多态性(NCBI Entrez
Gene6948)进行分型，同时使用一阶段PCR(one-stage PCR)法(Wenham等，1991)确定APOE基因型(CBI Entrez Gene：348)。
[0113] MRI扫描
[0114] 在基线和2年后进行容积颅MRI扫描。具体地，用1.5T MRI系统(Sonata；Siemens Medical Solutions，E rlangen，Germany)进行颅MRI扫描。方案是T1-加权获取，梯度回波(FLASH-快速小角度激发)3D获取，其中1mm各向同性象素(isotropic voxel)翻转角19度TR＝12ms TE5.65ms。每板208个圆片，其中以冠向(coronal orientation)获取1
板，1平均。重复三次，并且在获得和交叉重复校准后进行平均。
板，1平均。重复三次，并且在获得和交叉重复校准后进行平均。
[0115] 使用完全自动化定量方法(SIENA)以得到每年全脑萎缩速率。SIENA是准确的(约0.2％脑体积变化误差)并且到达高稳健性(Smith等，2002)。使用颅骨以空间归一化，相对于标准图像，使用横断法(SIENAX)以从单一图像评估归一化脑体积(Smith等，2002)。将在基线的参与者的归一化脑体积用作一些分析中的协变量。
[0116] 从不同时间点取得的两幅MR图像评估变化的比率。SIENA自动地在每幅图像中将非脑与脑分割，并且评估每幅图像中颅骨的外表面。将两幅脑图像登记，同时使用颅骨图像来限制缩放和倾斜；这修正成像几何形状随时间的变化。使用登记的脑图像以亚像素精确发现了脑表面点(包括脑室表面)，并且在这些点的基础上评估表面移动。穿过整个脑表面的平均垂直边缘移动产生了变化图像，可转变成评估反映灰质和白质二者变化的萎缩的速率(Smith等，2002)。
[0117] 统计分析
[0118] 检验效能计算(power calculation)在使用同一MRI操作和来自OPTIMA的49位老年人(患有MCI)的SIENA(其中缩小的平均(SD)速率为0.74(0.27)％/年)的现有数
据的基础上。为了检测速率下降20％，在α＝0.05(双尾)，90％效能需要每组70位对象，或者80％效能需要每组50位对象。在～20％的退出率(drop-out rate)或失败MRI的基
础上，我们在研究开始时以每组90个样本大小为目标。
据的基础上。为了检测速率下降20％，在α＝0.05(双尾)，90％效能需要每组70位对象，或者80％效能需要每组50位对象。在～20％的退出率(drop-out rate)或失败MRI的基
础上，我们在研究开始时以每组90个样本大小为目标。
[0119] 使用SIENA方法，主要结果量度用于确定经试验期每年全脑萎缩速率在治疗组之间是否不同。因为必要条件是对象具有基线和随访MRI二者，所以对于主要结果进行按方案分析(per-protocol analysis)。首先在它们随机分入的组中分析对象。还根据生物依从性(由确认获取B族维生素补充物(或接受钴胺素注射)的每组中的对象所定义)使用以下截断(cut-off)值对数据进行分析：从基线到随访，血浆叶酸的提高＞10nmol/L以及钴胺素的提高＞150pmol/L。年龄被认为是主要终点的混淆变量(confounding variable)(Bradley等，2002)。可能与脑萎缩速率有关的(Anstey等，2006；Den Jeijer等，2003b；
Enzinger等，2005；Jack等，2004；Skoog等，1998；Vogiatzoglou等，2008)或与B族维生素状态有关的(Refsum等，2006)多种其他协变量在研究分析之前进行确认(下表2中
所列)。评估协变量包括单变量方法(非配对t检验(unpaired t test)或皮尔逊相关
性(Pearson′s correlation))，接着年龄调整分析(age-adjusted analyse)。如果在P
＜0.10时任何变量在年龄调整分析中相关，那么它包括在后续的分析中。使用分类变量的卡方检验(Chi square test)和连续变量的t检验或方差分析来检测干预组之间的差异。
Enzinger等，2005；Jack等，2004；Skoog等，1998；Vogiatzoglou等，2008)或与B族维生素状态有关的(Refsum等，2006)多种其他协变量在研究分析之前进行确认(下表2中
所列)。评估协变量包括单变量方法(非配对t检验(unpaired t test)或皮尔逊相关
性(Pearson′s correlation))，接着年龄调整分析(age-adjusted analyse)。如果在P
＜0.10时任何变量在年龄调整分析中相关，那么它包括在后续的分析中。使用分类变量的卡方检验(Chi square test)和连续变量的t检验或方差分析来检测干预组之间的差异。
[0120] 预先指定的二级分析包括认知和抑郁得分、严重的不良事件、退出、依从性和生物化学标志物的变化。使用ANOVA(分类变量)或线性回归(连续变量)的亚组分析包括基线标志物对治疗作用的影响，评价生化依从性之后两组的萎缩速率，生化标志物(独立于治疗代码)之变化和萎缩速率之间的关系，以及相关亚组的萎缩速率。报道P值为2侧
并且对于多重比较未调整；P＜0.05认为统计学上显著。使用Macintosh(第16版)或
Windows(第17版)，SPSS Inc，Chicago，IL；USA)的SPSS进行统计分析。
并且对于多重比较未调整；P＜0.05认为统计学上显著。使用Macintosh(第16版)或
Windows(第17版)，SPSS Inc，Chicago，IL；USA)的SPSS进行统计分析。
[0121] 结果
[0122] 参与者
[0123] 参与者通过研究的流程示于图1。从总共646位参与者通过最初的电话访问进行评估，有292位满足入围标准。这两组在随访中失去的数目类似，活性物组和安慰剂组中分别有110位和113位完成了24个月的试验。主要分析仅包括在基线和在随访中进行技术
上良好的MRI扫描的那些对象，即活性物组中的85位和安慰剂组中的83位。组中的基线
特征类似(表1和2)。MRI扫描之间的平均(SD)时间为24.3(0.7)个月。
上良好的MRI扫描的那些对象，即活性物组中的85位和安慰剂组中的83位。组中的基线
特征类似(表1和2)。MRI扫描之间的平均(SD)时间为24.3(0.7)个月。
[0124] 坚持性(adherence)和生物学维生素响应
[0125] 通过计算退回的药片评估的坚持性在两组中都良好：总共多于78％的参与者使用了他们药物的至少75％的。还通过测量血浆维生素浓度和相关化合物来评估坚持性(表
2)。在活性物组中，血浆叶酸的几何平均数(95％CI)升高了几乎270％并且血浆钴胺素
加倍。与此相反，安慰剂组的响应变化分别适中地提高了3％和10％。活性物组中的血浆tHcy降低了22.5％，而安慰剂组中的升高了7.7％。使用基于叶酸或钴胺素变化的生物学依从性的标准(如方法中所定义的)，发现安慰剂组的83位中的17位(20.5％)摄取了补
充的叶酸或钴胺素，而在活性物组中，84位对象中的14位(16.7％)的可用的血液样本没
有摄取或没有吸收维生素，至少在第二次血液采样(在第24个月时)之前的时期如此。因
此，总共136位对象被解释为生物学依从。
2)。在活性物组中，血浆叶酸的几何平均数(95％CI)升高了几乎270％并且血浆钴胺素
加倍。与此相反，安慰剂组的响应变化分别适中地提高了3％和10％。活性物组中的血浆tHcy降低了22.5％，而安慰剂组中的升高了7.7％。使用基于叶酸或钴胺素变化的生物学依从性的标准(如方法中所定义的)，发现安慰剂组的83位中的17位(20.5％)摄取了补
充的叶酸或钴胺素，而在活性物组中，84位对象中的14位(16.7％)的可用的血液样本没
有摄取或没有吸收维生素，至少在第二次血液采样(在第24个月时)之前的时期如此。因
此，总共136位对象被解释为生物学依从。
[0126] 表1.参与者的基线特征
[0127]
[0128] 缩写：APOE，载脂蛋白E的基因；CVD，心血管疾病；GDS：老年抑郁量表；MCV，平均红细胞体积；MI：心肌梗塞；MMSE，简易精神状态检查；MTHFR，亚甲基四氢叶酸还原酶基因；NSAID，非甾体抗炎药；TIA，短暂性脑缺血发作；TICS-M，认知状况的电话访问(改良的)[0129] a活性物治疗组每日接受补充叶酸(0.8mg)、维生素B12(0.5mg)和维生素
b c d
B12(20mg)，持续24个月。P＝0.22；P＝0.009；排除一个高异常值。表2.干预之前和
干预2年后血浆中的叶酸和钴胺素标志物
b c d
B12(20mg)，持续24个月。P＝0.22；P＝0.009；排除一个高异常值。表2.干预之前和
干预2年后血浆中的叶酸和钴胺素标志物
[0130]
[0131]
[0132] 缩写：HoloTC，全反钴胺素(holotranscobalamin)；TC饱和度，holoTC与总TCa
的比率；tHcy，血浆总同型半胱氨酸 活性物治疗组每日接受补充叶酸(0.8mg)、维生素
b c
B12(0.5mg)和维生素B6(20mg)，持续24个月。 配对样本的t检验，非配对样本的t检验。
的比率；tHcy，血浆总同型半胱氨酸 活性物治疗组每日接受补充叶酸(0.8mg)、维生素
b c
B12(0.5mg)和维生素B6(20mg)，持续24个月。 配对样本的t检验，非配对样本的t检验。
[0133] 与安慰剂组中的萎缩速率相关的因素
[0134] 这些因素列于表3和4中。年龄与脑萎缩速率强相关(r＝0.32，P＜0.01)，因此所有之后的分析对年龄进行调整。无论性别、吸烟、BMI、酒精消耗、APOE4或MTHFR677C＞T，多态性与萎缩速率相关(对于全部P＞0.1，对年龄调整)。对于连续变量，萎缩速率与基线log tHcy(偏r＝0.41，P＜0.001)以及与血浆肌酸酐(偏r＝0.21，P＝0.049)
显著相关。对于舒张压(偏r＝-0.21，P＝0.054)和对于初始脑体积(偏r＝-0.19，P
＝0.092)，观察到基线相关性。后者四个变量包括在之后经调整分析中。
显著相关。对于舒张压(偏r＝-0.21，P＝0.054)和对于初始脑体积(偏r＝-0.19，P
＝0.092)，观察到基线相关性。后者四个变量包括在之后经调整分析中。
[0135] 表3.安慰剂组(N＝83)中皮尔逊相关性与萎缩速率(％/年)
[0136]
[0137]
[0138] 缩写：GDS：老年抑郁量表；HoloTC，全反钴胺素；TC饱和度，holoTC与总TC的比值；tHcy，总同型半胱氨酸
[0139] 表4.亚组分析：数种因素对萎缩速率和对治疗作用的影响
[0140]
[0141]
[0142]
[0143] 缩写：APOE，载脂蛋白E的基因；CVD，心血管疾病；HoloTC，全反钴胺素；MTHFR，亚甲基四氢叶酸还原酶基因；NSAID，非甾族抗炎药；TCN2，钴胺传递蛋白-2；tHcy，血浆总同型半胱氨酸；TIA，短暂性脑缺血发作a
[0144] 活性物治疗组每日接受补充叶酸(0.8mg)、维生素B12(0.5mg)和维生素b
B6(20mg)，持续24个月。 将ANOVA用于检验每个因素对萎缩速率的作用以及其与治疗分
c
类可能的相互作用；在基线所有分析对年龄进行调整。 根据性别排列。
B6(20mg)，持续24个月。 将ANOVA用于检验每个因素对萎缩速率的作用以及其与治疗分
c
类可能的相互作用；在基线所有分析对年龄进行调整。 根据性别排列。
[0145] 结果
[0146] 用B族维生素治疗24个月显著地减慢了脑萎缩速率。在对年龄调整后，与安慰剂组相比，活性物组中脑萎缩速率/年降低了29.6％(0.76％[95％CI，0.63-0.90]相对于1.08％[0.94-1.22]，P＝0.001)。上述变量的其他调整仅最低限度地改变降低至27.1％
(萎缩速率：0.78％(0.64-0.91]相对于1.07％[0.94-1.21]，P＝0.003)。如果分析局限
于生物学依从的对象(n＝136)，那么治疗的作用稍微较大，萎缩速率下降了31.1％(萎缩速率：多调整分析之后，0.73％[0.57-0.88]相对于1.06％[0.90-1.22]，P＝0.004)。
(萎缩速率：0.78％(0.64-0.91]相对于1.07％[0.94-1.21]，P＝0.003)。如果分析局限
于生物学依从的对象(n＝136)，那么治疗的作用稍微较大，萎缩速率下降了31.1％(萎缩速率：多调整分析之后，0.73％[0.57-0.88]相对于1.06％[0.90-1.22]，P＝0.004)。
[0147] 另外，发现基线tHcy与治疗之间有显著的相互作用(log tHcy×治疗，P＝2
0.001)。在安慰剂组中，在基线的tHcy显示对萎缩速率明显的正相关(R ＝0.24)，而该相关性在活性物组中不存在(图2)。基线叶酸或钴胺素都未显示这样的相关。
0.001)。在安慰剂组中，在基线的tHcy显示对萎缩速率明显的正相关(R ＝0.24)，而该相关性在活性物组中不存在(图2)。基线叶酸或钴胺素都未显示这样的相关。
[0148] 关于tHcy、叶酸和钴胺素标志物从基线到随访的变化也检验了萎缩(图5)。萎缩速率显著地与tHcy的变化相关，并且与holoTC和TC饱和度的变化反相关。此外，当分析局限于生物学依从的对象时，作用变得更强并且叶酸和钴胺素的变化也变得显著。这与胱硫醚水平的变化没有关系。因此，叶酸和钴胺素状态的改进越大，萎缩速率越慢。相反，叶酸和钴胺素状态下降的那些对象对萎缩有提高的风险(图3所示，使用tHcy作为标志物)。
图4显示了两年中来自tHcy浓度升高的安慰剂组中之参与者和来自tHcy浓度降低的活性
物治疗组之成员的减影颅MRI扫描。两个对象开始都具有类似的tHcy浓度，但是获取安慰剂的参与者在两年中表现出tHcy明显的提高，而获取活性物治疗的参与者在该时期中表
现出tHcy显著的下降。获取B族维生素的参与者的萎缩速率比获取安慰剂的对象慢了高
于5倍。
图4显示了两年中来自tHcy浓度升高的安慰剂组中之参与者和来自tHcy浓度降低的活性
物治疗组之成员的减影颅MRI扫描。两个对象开始都具有类似的tHcy浓度，但是获取安慰剂的参与者在两年中表现出tHcy明显的提高，而获取活性物治疗的参与者在该时期中表
现出tHcy显著的下降。获取B族维生素的参与者的萎缩速率比获取安慰剂的对象慢了高
于5倍。
[0149] 表5.基于治疗萎缩速率与血浆生化标志物变化的相关性a
[0150]
[0151] 缩写：HoloTC，全反钴胺素；TC饱和度，holoTC与总TC的比值；tHcy，血浆总同型半胱氨酸
[0152] a活性物治疗组每日接受补充叶酸(0.8mg)、维生素B12(0.5mg)和维生素b c
B6(20mg)，持续24个月。 全部对象；生物学上依从的对象，定义为从基线到随访血浆叶酸的升高＞10nmol/L和钴胺素的升高＞150pmol/L以鉴定正确获取B族维生素添加物或者
d
独立或随机化代码的组中的对象。对年龄、基线舒张压、基线肌酸酐、初始脑体积和log基线tHcy进行调整。
B6(20mg)，持续24个月。 全部对象；生物学上依从的对象，定义为从基线到随访血浆叶酸的升高＞10nmol/L和钴胺素的升高＞150pmol/L以鉴定正确获取B族维生素添加物或者
d
独立或随机化代码的组中的对象。对年龄、基线舒张压、基线肌酸酐、初始脑体积和log基线tHcy进行调整。
[0153] 各亚组中的作用示于表4中。治疗和以下变量之间没有显著的相互作用：年龄、性别、MCI的分类、归一化初始脑体积、高血压、使用非阿司匹林NSAID、吸烟、肌酸酐、APOE4和MTHFR677C＞T。符合与上述基线tHcy相互作用，在基线tHcy低于中位值的参与者中，活性物治疗与萎缩速率11.2％降低相关，而基线tHcy高于中位值的那些显示了43.0％的
萎缩降低(P相互所用＝0.019)。当将tHcy进一步分类成四分位数时，在最低四分位数中的那些对象中没有治疗作用(tHcy≤9.5μmol/L)，而在用相对于安慰剂的B族维生素治疗的
tHcy之第四四分位数(＞13.0μmol/L)中的那些对象中萎缩速率降低了53.3％(P治疗＝
0.001：PtHcy＝0.139；P相互所用＝0.023)。发现治疗与在基线的卒中或TIA病史之间的相互作用：与没有事件的那些的1.01％[0.86-1.15]相比，在具有先前事件的安慰剂组中的那些的萎缩速率/年为1.76％[1.31-2.21]。在活性物治疗组中的那些的速率分别为0.74％
[0.35-1.14]和0.77％[0.63.0.91](P治疗＝0.001；P卒中＝0.028；P相互所用＝0.014)。当还包括患有用MRI观察到的静止性梗死的对象时，尽管卒中整体对萎缩速率仍然有显著影响(P＝0.025)，但是与卒中的该相互作用不再显著(P＝0.098)。常规使用阿司匹林显示倾
向于与治疗相互作用(P治疗＝0.021；P阿司匹林＝0.19，P相互所用＝0.052)；在获取阿司匹林的那些中，治疗出现较少作用。试验之前，参与者亚组报道获取含有B族维生素的多种维生素补充物。(表1)并且在这些中与治疗有显著的相互作用(P＝0.034)，使得活性物治疗不
再有效。该作用的缺乏可能与其已经在基线的低tHcy(几何平均数9.8[9.0-10.5]μmol/
L)和高叶酸(37.5[31.5-5-44.7]nmol/L)有关。
萎缩降低(P相互所用＝0.019)。当将tHcy进一步分类成四分位数时，在最低四分位数中的那些对象中没有治疗作用(tHcy≤9.5μmol/L)，而在用相对于安慰剂的B族维生素治疗的
tHcy之第四四分位数(＞13.0μmol/L)中的那些对象中萎缩速率降低了53.3％(P治疗＝
0.001：PtHcy＝0.139；P相互所用＝0.023)。发现治疗与在基线的卒中或TIA病史之间的相互作用：与没有事件的那些的1.01％[0.86-1.15]相比，在具有先前事件的安慰剂组中的那些的萎缩速率/年为1.76％[1.31-2.21]。在活性物治疗组中的那些的速率分别为0.74％
[0.35-1.14]和0.77％[0.63.0.91](P治疗＝0.001；P卒中＝0.028；P相互所用＝0.014)。当还包括患有用MRI观察到的静止性梗死的对象时，尽管卒中整体对萎缩速率仍然有显著影响(P＝0.025)，但是与卒中的该相互作用不再显著(P＝0.098)。常规使用阿司匹林显示倾
向于与治疗相互作用(P治疗＝0.021；P阿司匹林＝0.19，P相互所用＝0.052)；在获取阿司匹林的那些中，治疗出现较少作用。试验之前，参与者亚组报道获取含有B族维生素的多种维生素补充物。(表1)并且在这些中与治疗有显著的相互作用(P＝0.034)，使得活性物治疗不
再有效。该作用的缺乏可能与其已经在基线的低tHcy(几何平均数9.8[9.0-10.5]μmol/
L)和高叶酸(37.5[31.5-5-44.7]nmol/L)有关。
[0154] 另外，尽管研究没有进行检测治疗对认知的作用，但是应注意，一些最终认知测验得分与萎缩速率相关。多元线性回归显示在研究结束时显著确定MMSE得分的主因素是基线MMSE得分(偏re-0.42，P＝＜0.001)，脑萎缩速率(偏r＝-0.36，P＝＜0.001)和年
2
龄(偏r＝0.20，P＝0.01)；经调整的R 为0.33。相同的因素确定最终TICS-M得分：基
线TICS-M(偏r＝0.39，P＜0.001)，萎缩速率(偏r＝-0.36，P＜0.001)和年龄(偏r
2
＝0.27，P＝＜0.001)；经调整的R 为0.39。
2
龄(偏r＝0.20，P＝0.01)；经调整的R 为0.33。相同的因素确定最终TICS-M得分：基
线TICS-M(偏r＝0.39，P＜0.001)，萎缩速率(偏r＝-0.36，P＜0.001)和年龄(偏r
2
＝0.27，P＝＜0.001)；经调整的R 为0.39。
[0155] 在全部组群(cohort)中的安全结果
[0156] 整体B族维生素在全部271位参与者的组群中是非常良好的。在基线，仅7位参与者(2.5％)的血浆叶酸浓度＜7nmol/L和6位(2.2％)的维生素B12浓度＜150pmol/
L。因为维生素分析在试验结束后进行，除非通过他们的GP进行诊断，否则这些对象(尽管被分类为维生素不足)没有进行医学上治疗。
L。因为维生素分析在试验结束后进行，除非通过他们的GP进行诊断，否则这些对象(尽管被分类为维生素不足)没有进行医学上治疗。
[0157] 尽管整个试验无法随访48位对象(活性物组中28位和安慰剂组中20位)，但是退出的原因在如下表6中所示。在不良事件中没有显著的安全问题并且没有显著性差异，除了在活性物治疗组中有较少对象显示失去振动感觉(表6)。退出的时间在活性物组中较短，甚至在排除立即退出后亦是如此。
[0158] 表6.退出和不良事件
[0159]
[0160] 缩写：GDS，老年抑郁量表a
[0161] 活性物治疗组每日接受补充叶酸(0.8mg)、维生素B12(0.5mg)和维生素b c
B6(20mg)，持续24个月。 仅显示P值＜0.1。 排除在开始服药之前退出的5位和24个月
d e
访问后退出的2位。 包括2位死亡参与者中的一位。 一位出血性卒中；一位肺栓塞
B6(20mg)，持续24个月。 仅显示P值＜0.1。 排除在开始服药之前退出的5位和24个月
d e
访问后退出的2位。 包括2位死亡参与者中的一位。 一位出血性卒中；一位肺栓塞
[0162] 讨论
[0163] 与安慰剂相比，B族维生素治疗引起了在31.7％的最终tHcy浓度上的差别，并且伴随脑萎缩速率几乎30％的降低。没有发现安全问题，因此可推断，高剂量的B族维生素可在患有MCI的老年人中用于降低脑萎缩速率。
[0164] 在具有最高基线tHcy水平的那些中治疗作用最大，其中在最高四分位数tHcy(＞13.0μmol/L)中的那些的萎缩速率降低了53％。治疗对最低四分位数(≤9.5μmol/L)
中的那些的萎缩没有作用。在安慰剂组中，萎缩速率与基线tHcy浓度有关。与此相反，在使用活性物治疗的组中，基线tHcy与萎缩速率之间没有关系；该发现可说明，上升的tHcy直接引起萎缩和/或tHcy是低正常水平维生素(这是致病因素)的标志物。
中的那些的萎缩没有作用。在安慰剂组中，萎缩速率与基线tHcy浓度有关。与此相反，在使用活性物治疗的组中，基线tHcy与萎缩速率之间没有关系；该发现可说明，上升的tHcy直接引起萎缩和/或tHcy是低正常水平维生素(这是致病因素)的标志物。
[0165] 在本研究中，发现维生素B12状态或叶酸状态的提高与萎缩速率的降低有关。
[0166] 结论
[0167] 该研究在英国进行，在那里具有叶酸的自愿营养强化食物是经许可的，但是没有强制营养强化。治疗作用有赖于基线tHcy，在上三个四分位数(即9.5μmol/L)中的那些表明，与最低的四分位数中的那些相比，治疗后显著地减慢了萎缩。在有强制营养强化的美国，在2003-4中那些＞60岁中的13.6％具有＞13μmol/L的tHcy浓度(Pfeiffer等，
2008)，在该水平我们发现，用高剂量B族维生素治疗后，萎缩速率降低了＞50％。在美国，那些≥60岁的中位值tHcy浓度为10.1μmol/L，表明大部分患有MCI的那些可从干预中获
益。
2008)，在该水平我们发现，用高剂量B族维生素治疗后，萎缩速率降低了＞50％。在美国，那些≥60岁的中位值tHcy浓度为10.1μmol/L，表明大部分患有MCI的那些可从干预中获
益。
[0168] 认为该发现与患有MCI的人中的认知衰退有关。第一，在经长期(长达5年)的研究中，已经发现MCI中的全脑萎缩速率与数个测试(包括MMSE(Jack等，2004))中的认
知衰退有关。第二，当我们寻找最终认知测试得分的重要预测因素时，萎缩速率是决定最终MMSE和TICS-M得分的三个主因素之一。第三，降低同型半胱氨酸治疗的其他两个随机对照试验显示对认知的作用：试验(其中用叶酸(0.8mg/天)治疗基线tHcy水平＞13μmol/L
的正常参与者，持续三年)显示出对数个认知测试的有益作用(Durga等，2007)。因为脑萎缩速率在患有MCI的对象(转变成阿尔茨海默病)中更快，所以高剂量的叶酸、B6和B12可
被认为减慢从MCI转变成阿尔茨海默病。
知衰退有关。第二，当我们寻找最终认知测试得分的重要预测因素时，萎缩速率是决定最终MMSE和TICS-M得分的三个主因素之一。第三，降低同型半胱氨酸治疗的其他两个随机对照试验显示对认知的作用：试验(其中用叶酸(0.8mg/天)治疗基线tHcy水平＞13μmol/L
的正常参与者，持续三年)显示出对数个认知测试的有益作用(Durga等，2007)。因为脑萎缩速率在患有MCI的对象(转变成阿尔茨海默病)中更快，所以高剂量的叶酸、B6和B12可
被认为减慢从MCI转变成阿尔茨海默病。
[0169] 实施例2：
[0170] 进行另外的分析以确定是否(a)用B族维生素治疗显示对认知表现的作用，b)基线血浆tHcy水平是否改进对认知衰退速率的治疗作用，c)哪个认知领域与B族维生素治
疗最强相关，以及d)在试验结束时是否有任何相关的临床结果。
疗最强相关，以及d)在试验结束时是否有任何相关的临床结果。
[0171] 方法
[0172] 研究方案
[0173] 研究方案之前已描述于实施例1中。针对招募广告的响应者(n＝646)通过电话15
对于入围标准并对于使用筛选问卷的MCI、改良的认知状况的电话访问(TICS-M) (≥17
和≤29)和分类流畅性测验(Morris，1988)进行筛查。70岁或更大的患有MCI的那些有
研究伙伴并且具有非排除标准(痴呆，活跃的癌症，在过去3个月内严重卒中，用氨甲喋呤、抗癌或抗癫痫药物治疗，或者通过口服或通过注射任何剂量获取叶酸＞300g/天]，吡哆
醇＞3mg/天或钴胺素＞1.5g/天]；将用老年抑郁量表(Yesavage JA，Psychopharmacol
Bull1988，24：709-11)评估的严重抑郁的症状引入研究。
对于入围标准并对于使用筛选问卷的MCI、改良的认知状况的电话访问(TICS-M) (≥17
和≤29)和分类流畅性测验(Morris，1988)进行筛查。70岁或更大的患有MCI的那些有
研究伙伴并且具有非排除标准(痴呆，活跃的癌症，在过去3个月内严重卒中，用氨甲喋呤、抗癌或抗癫痫药物治疗，或者通过口服或通过注射任何剂量获取叶酸＞300g/天]，吡哆
醇＞3mg/天或钴胺素＞1.5g/天]；将用老年抑郁量表(Yesavage JA，Psychopharmacol
Bull1988，24：709-11)评估的严重抑郁的症状引入研究。
[0174] 在最初临床访问时，意向治疗(intention to treat，ITT)组包括266位对象，他们给出书面知情同意书并且被随机分成治疗或安慰剂。为确证MCI诊断[Petersen，2007](从研究伙伴证实)，采用的其他测量包括MMSE(＞24/30)、临床痴呆评定量表(clinical dementia rating scale，CDR，＝0.5)、老年人认知功能减退知情者访问(informantinterview on cognitive decline in the elderly，iQCODE)、来自剑桥对于老年精神障碍
20
检查(Cambridge examination for mental disorders of the elderly，CAMDEX) 的主观记忆抱怨的问卷以及来自剑桥行为调查表(Cambridge Behavioural Inventory)的日常生活活动。根据来自下述成套神经心理测试(neuropsychological test battery)的认知测试截断得分将对象编码为遗忘性或非遗忘性、单领域或多领域MCI。由于B族维生素的作用机制而包括非遗忘性MCI病例，并且同型半胱氨酸可能涉及记忆和非记忆领域的功能。
20
检查(Cambridge examination for mental disorders of the elderly，CAMDEX) 的主观记忆抱怨的问卷以及来自剑桥行为调查表(Cambridge Behavioural Inventory)的日常生活活动。根据来自下述成套神经心理测试(neuropsychological test battery)的认知测试截断得分将对象编码为遗忘性或非遗忘性、单领域或多领域MCI。由于B族维生素的作用机制而包括非遗忘性MCI病例，并且同型半胱氨酸可能涉及记忆和非记忆领域的功能。
[0175] 如果没有禁忌症(contra-indication)，参与者进行简要的医学检查，提供血液和尿样本并且询问同意进行两次颅MRI扫描(一次在治疗开始时和一次在两年后治疗结束时)。该研究经NHS研究伦理委员会批准(COREC04/Q1604/100)。
[0176] 完整的成套神经心理测试由经训练的研究护士和心理学家进行，他们会对CDR的结果和知情者信息不知情。成套测试包括以下测试：情景记忆(episodic memory)
(HVLT-R(Brandt，1991)、CANTAB PAL和空间识别任务(spatial recognition task)[www.camcog.com])、语义记忆(semantic memory)(超级市场物品的等级命名测试(Graded
Naming Test)[McKenna，1989]和分类流畅性(CERAD，Morris，1988))、执行功能(executive function)(Trailmaking A&B[Reitan]，SDMT[Smith]，CLOX(Royall，1998))以及选择性注意力测试(test of selective attention)(地图搜索(Map Search))[Robertson，1994]。
(HVLT-R(Brandt，1991)、CANTAB PAL和空间识别任务(spatial recognition task)[www.camcog.com])、语义记忆(semantic memory)(超级市场物品的等级命名测试(Graded
Naming Test)[McKenna，1989]和分类流畅性(CERAD，Morris，1988))、执行功能(executive function)(Trailmaking A&B[Reitan]，SDMT[Smith]，CLOX(Royall，1998))以及选择性注意力测试(test of selective attention)(地图搜索(Map Search))[Robertson，1994]。
[0177] 在开始治疗后，在第3、6、12、15和18个月通过电话联系参与者以验证依从性、不良事件并且为避免练习效应通过试验连续使用6个不同的版本来实施HVLT-R。24个月之后，参与者回到临床以重复所有的测试(包括如在访问1时的成套认知测试)。
[0178] 治疗在首次结构性MRI扫描的同一天开始或对于不进行MRI的那些在随机化之后首次临床询问的当天开始。集中电话随机化与完全分配隐藏和最简化年龄、性别、TICS-M得分、MRI同意一起使用。治疗组接受含有0.8mg叶酸；0.5mg氰钴胺素；20mg吡哆醇HCl的
TrioBe (Meda AB/Recip AB，Box906，Pipers 2A，SE-17009Solna，Sweden)。
安慰剂组接受无维生素药片。在第二次询问或第二次MRI扫描时，参与者退回药瓶。
TrioBe (Meda AB/Recip AB，Box906，Pipers 2A，SE-17009Solna，Sweden)。
安慰剂组接受无维生素药片。在第二次询问或第二次MRI扫描时，参与者退回药瓶。
[0179] 血液采集和测定(如前所述)
[0180] 在基线和在24个月后，血液样本送到常规临床实验室用于立即血液学测定和生化变量测定。加工并储存含有EDTA的样本。使用Abbott 分析仪通过荧光偏振免
疫测定(fluorescence polarization immunoassay)测定血浆tHcy。利用微生物测定对
血浆叶酸和钴胺素浓度进行测定。使用Wizard DNA纯化试剂盒(Promega，Southampton，UK)从血液中提取基因组DNA。使用一阶段PCR方法确定ApoE基因型(NCBI Entrez Gene：
348)。
疫测定(fluorescence polarization immunoassay)测定血浆tHcy。利用微生物测定对
血浆叶酸和钴胺素浓度进行测定。使用Wizard DNA纯化试剂盒(Promega，Southampton，UK)从血液中提取基因组DNA。使用一阶段PCR方法确定ApoE基因型(NCBI Entrez Gene：
348)。
[0181] 统计分析
[0182] 基于两年中的脑萎缩速率，该试验的检验效能计算在实施例1中描述。然而，较大样本(n＝223)的ITT参与者完成了本文中分析的第二次结果测量(神经心理测试)。由于数据是纵向的，所以将具有对元(logit)连接的二项分布(binomial distribution)
用于HVLT-延缓回忆(HVLT-delayed recall，HVLT-DR)和MMSE以及log连接的泊松分布
(Poisson distribution)用于分类流畅性来拟合广义线性混合效应模型(linear mixed
effects model)。将威布尔分布(Weibull distribution)用于Trailmaking A来拟合参数化AFT存活模型。因为得分表示来自一组预先确定问题的正确答案的数目，所以选择用于HVLT-DR和MMSE的二项分布是合适的。由于得分是时间间隔内正确项目的数目，所以选择用于分类流畅性的泊松分布。部分由于涉及CLOX测试的解释(interpretation)，所以后者通过以针对在基线的CLOX1和在随访中的CLOX2的随访条件建模CLOX1进行横断面分析。
高斯分布(Gaussian distribution)用于MMSE，这等同使用线性混合效应模型。由于CDR
得分是有序的分类结果，所以使用纵向积累logit模型(longitudinal cumulative logit model)对其进行分析。然而，由于非常少数对象的CDR得分等于或大于1，所以将CDR得分记录为二元结果0或{0.5或以上}，之后利用具有logit连接的伯努利分布(Bernoulli
distribution)拟合广义线性混合效应模型。最后，针对所有结果拟合使广义评估方程以获得比较结果，从而确证来源于随机效应模型(random effects model)的结论。
用于HVLT-延缓回忆(HVLT-delayed recall，HVLT-DR)和MMSE以及log连接的泊松分布
(Poisson distribution)用于分类流畅性来拟合广义线性混合效应模型(linear mixed
effects model)。将威布尔分布(Weibull distribution)用于Trailmaking A来拟合参数化AFT存活模型。因为得分表示来自一组预先确定问题的正确答案的数目，所以选择用于HVLT-DR和MMSE的二项分布是合适的。由于得分是时间间隔内正确项目的数目，所以选择用于分类流畅性的泊松分布。部分由于涉及CLOX测试的解释(interpretation)，所以后者通过以针对在基线的CLOX1和在随访中的CLOX2的随访条件建模CLOX1进行横断面分析。
高斯分布(Gaussian distribution)用于MMSE，这等同使用线性混合效应模型。由于CDR
得分是有序的分类结果，所以使用纵向积累logit模型(longitudinal cumulative logit model)对其进行分析。然而，由于非常少数对象的CDR得分等于或大于1，所以将CDR得分记录为二元结果0或{0.5或以上}，之后利用具有logit连接的伯努利分布(Bernoulli
distribution)拟合广义线性混合效应模型。最后，针对所有结果拟合使广义评估方程以获得比较结果，从而确证来源于随机效应模型(random effects model)的结论。
[0183] 最初进行没有相互作用相的模型以确定治疗对认知控制变量(包括年龄、ApoE、性别和教育)的直接作用。其后，将基线tHcy包括在相互作用相中，其首先作为连续变量，之后作为二元变量。为了易于解释，针对tHcy的该分析的结果报道为二元变量而不是连续变量。更具体地，如果研究参与者的基线tHcy水平低于中位值(11.3微mol/L)，那么他们被分类为“较低tHcy组”，或者对于其余被分类为“较高tHcy组”。
[0184] 作为每种测试的针对每个认知领域的一种测试(情景记忆的HVLT、语义记忆的分类流畅性、注意力和执行功能的CLOX以及整体认知的MMSE)的统计分析需要不同的统计模型。
[0185] 对于所有感兴趣的结果，分析以饱和模型(包括全部效应(主要效应、双向相互作用效应和三向相互作用效应))开始。之后，使用似然比检验(likelihood-ratio test)和AIC(艾卡信息量准则(Aikake information criterion))分层次简化模型。
[0186] 结果
[0187] 人口统计数据
[0188] 在初访时随机化其中的266个ITT样本，223位参与者完成了2年后的第二次访问并且完全重复了神经心理评估。退出的原因之前已描述于实施例1中。对于治疗招募者意图进行统计分析(安慰剂，n＝134，治疗n＝132)。
[0189] 治疗和安慰剂组的人口统计数据示于表7。
[0190] 表7.使用连续变量的t检验和分类变量的卡方(Chi2)针对治疗和安慰剂参与者(ITT)之人口统计学变量的比较。
[0191]＊
[0193] 在对于任何基线测量的组之间没有差别。完成者的人口统计数据类似。平均认知得分(包括MMSE28.13(1.76)、TICS-M24.85(2.8)和HVLT总回忆23.2(5.2))都比MCI的截断点高。平均GDS得分为6.7(4.8)，表明仅为轻度抑郁症状。基线叶酸、维生素B12和
tHcy都在正常的年龄范围内。在访问1时，低于MCI截断的认知得分用于遗忘性或非遗忘
性、单领域或多领域MCI分类。21位对象没有低于截断的得分，但是其中10位的CDR等级
为0.5。因此，通过使用的电话筛选方法随机进入研究的那些中的仅11位(4％)似乎尽管
招募时被分类为MCI，但是在随机化时没有客观的认知障碍。他们没有从本研究中排除。
tHcy都在正常的年龄范围内。在访问1时，低于MCI截断的认知得分用于遗忘性或非遗忘
性、单领域或多领域MCI分类。21位对象没有低于截断的得分，但是其中10位的CDR等级
为0.5。因此，通过使用的电话筛选方法随机进入研究的那些中的仅11位(4％)似乎尽管
招募时被分类为MCI，但是在随机化时没有客观的认知障碍。他们没有从本研究中排除。
[0194] B族维生素治疗对纵向认知的作用
[0195] 研究了B族维生素随时间对HVLT-延缓回忆(HVLT-DR)、MMSE、CLOX和分类流畅性得分的作用。
[0196] 在维生素治疗组中在随访中的CLOX1得分有统计上显著的改进。对于以在基线的类似CLOX1开始的对象，在经治疗的对象中在随访时正确回答CLOX1项目的优势与安慰剂组的相比高出30％(P＝0.014)。除了在基线的CLOX1，模型对在随访中的CLOX2以及对混
杂因素(年龄、教育、ApoE和性别)进行控制。治疗和基线tHcy水平之间没有显著的相互
作用。
杂因素(年龄、教育、ApoE和性别)进行控制。治疗和基线tHcy水平之间没有显著的相互
作用。
[0197] 当包括的在基线的tHcy作为相互作用相时，治疗对其他认知测试的作用显著。最终模型表明，在使用安慰剂的“较高Hcy组”中的那些显示了显著的认知衰退，而“较高tHcy组”中经治疗的对象显示没有衰退。对于治疗组和安慰剂组二者，“较低tHcy组”中的平均认知得分没有随时间下降。通过模型显示的显著性差异仅在“较高tHcy组”中的治疗和安慰剂之间。
[0198] 图5a给出随时间对于“较高tHcy组”中的已经治疗的某人与如果未经治疗的同一人相比正确回答来自HVLT-DR的问题的估计优势比。该优势比随时间显著地升高。例如，对于“较高tHcy组”中的某人开始治疗后2年正确回答的优势比如果他没有进行治疗时的比值高出了74％(P值＝0.004)。图5b显示对于根据治疗状况的平均对象在“较高tHcy组”中随时间评估总HVLT-DR得分如何变化。治疗导致维持表现，而安慰剂组得分随时间下降。对于HVLT-DR得分，我们从第0个月时间点移除数据以消除初始练习效应。
[0199] 图6a显示对于“较高tHcy组”中的某人开始治疗后2年对MMSE的正确回答的优势与如果未经治疗的相比高出了44％(P值＝0.003)。图6b显示在“较高tHcy组”中随
时间评估的总MMSE得分如何变化。使用安慰剂的那些显示在MMSE中下降，而治疗的那些
显示没有显著变化。
时间评估的总MMSE得分如何变化。使用安慰剂的那些显示在MMSE中下降，而治疗的那些
显示没有显著变化。
[0200] 图7给出对于“较高tHcy组”中的已经治疗的某人与如果未经治疗的同一人相比随时间平均分类流畅性得分。例如，对于“较高tHcy组”中的某人在开始治疗后2年的平均字数与如果未经治疗的他的平均字数多出了12％(P值＝0.003)。
[0201] 图8给出了根据四个不同基线tHcy浓度随时间HVLT-DR得分的变化。在减慢得分下降中的治疗作用受限于基线tHcy高于10μmol/L的对象，基线tHcy水平越高，治疗作用越大。
[0202] B族维生素治疗对纵向临床结果的作用
[0203] 当群体通过tHcy四分位数分层时，治疗对整个CDR得分有显著作用。分别对于安慰剂组[CDR＝0：29.8％，CDR＝0.5：70.2％，CDR＝1：0％]和治疗组[28.9％，70％，
1.1％]，在CDR得分方面在基线的样本组成几乎相同。结果，安慰剂组中相应的组成分别是41.4％、55.3％、3.3％，并且治疗组中的分别是50％、47.8％、1.2％。在基线tHcy为上四分位数的参与者(＞13.12μmol/L)中，开始治疗后两年具有CDR＝0的优势与没有进
行治疗的相比大了9倍(第2年的优势比＝9，P＝0.004)。图9显示治疗对CDR得分为0
之比例的影响，从其可看出，治疗作用受限于在tHcy的上四分位中的那些。
1.1％]，在CDR得分方面在基线的样本组成几乎相同。结果，安慰剂组中相应的组成分别是41.4％、55.3％、3.3％，并且治疗组中的分别是50％、47.8％、1.2％。在基线tHcy为上四分位数的参与者(＞13.12μmol/L)中，开始治疗后两年具有CDR＝0的优势与没有进
行治疗的相比大了9倍(第2年的优势比＝9，P＝0.004)。图9显示治疗对CDR得分为0
之比例的影响，从其可看出，治疗作用受限于在tHcy的上四分位中的那些。
[0204] 讨论
[0205] 结果显示了在认知测试表现中B族维生素治疗随时间在减慢下降中的作用。在执行功能测试(CLOX)中，治疗对提高得分的作用是直接的，而对于其他认知领域，所述作用有赖于基线tHcy水平。在血浆tHcy水平高于11.3μmol/L的那些中，与安慰剂组中提高的衰退速率相比，治疗组中没有认知衰退。对于整体认知、情景记忆和语义记忆，显示了该作用。该作用对情景记忆最显著，其中，与安慰剂相比，在高水平tHcy对象中治疗2年给出正确字词回忆的可能性高出了74％，并且治疗组和安慰剂组之间在衰退速率上有显著性差异。在基线具有较高tHcy水平的那些更加可能对用B族维生素治疗做出响应，并且在试验结束时具有较低tHcy水平，并且在治疗组中脑萎缩速率下降，这不依赖于tHcy水平。对
于具有在基线的低tHcy的那些，治疗对认知没有作用，但是认知保持如进行治疗的具有高tHcy的那些一样稳定。
于具有在基线的低tHcy的那些，治疗对认知没有作用，但是认知保持如进行治疗的具有高tHcy的那些一样稳定。
[0206] 结果还显示了对广泛使用的临床评估工具(CDR)的作用。在tHcy之上四分位中的对象中，在经治疗的那些中显著提高了CDR为0的对象的比例，但是在安慰剂组中则没有。由CDR显示的临床改善提供了一些在患有MCI的那些(他们的tHcy已通过B族维生素治
疗而降低)中逆转认知障碍的证据。
疗而降低)中逆转认知障碍的证据。
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