认知障碍改善剂
阅读：880发布：2020-05-11
专利汇可以提供认知障碍改善剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种对于 认知障碍 ，特别优选对于阿尔茨海默病的 预防 或 治疗 有用的认知障碍改善剂。所述认知障碍改善剂含有 蜂王浆 作为有效成分。，下面是认知障碍改善剂专利的具体信息内容。
1.一种认知障碍改善剂，其含有蜂王浆作为有效成分。
2.一种认知障碍改善剂，其含有川皮苷或其类似物或者柑橘类提取物、和蜂王浆作为有效成分。
3.一种认知障碍改善剂，其含有川皮苷或其类似物和蜂王浆、以及红景天提取物、银杏叶提取物和阿魏酸作为有效成分。
4.4-脱甲基川皮苷的制备方法，其包含以下工序：
使2’-羟基-3’，4’，5’，6’-四甲氧基苯乙酮与4-苄氧基-3-甲氧基苯甲醛反应，得到3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮的工序；
使得到的3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮在碘存在下反应，得到3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮的工序；和
使得到的3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮在氢和钯碳的存在下反应，得到2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5，6，7，8-四甲氧基色烯-4-酮的工序。
认知障碍改善剂
技术领域
背景技术
[0004] 蜂王浆(Royal jelly)是来自蜜蜂的年轻工蜂的咽腺的分泌物，作为将成为蜂王的幼虫或已成为成虫的蜂王的食物给食。其是寿命是工蜂40倍的蜂王的一生中唯一的能量源。另外，已知其含有蜂蜜无法比拟的大量的维生素类、矿物质、氨基酸，以高蛋白含有各种营养素。但是，还未知蜂王浆对认知障碍的效果。
[0005] 专利文献1：日本特开2002-60340号公报
[0006] 专利文献2：国际公开WO2005-082351号小册子
发明内容
[0007] 本发明的课题在于提供一种认知障碍改善剂，其是对于认知障碍、特别优选对于阿尔茨海默病的预防或治疗有用的认知障碍改善剂。
[0008] 本发明人等反复深入研究，结果首次发现，含有川皮苷或其类似物或者柑橘类提取物、和蜂王浆作为有效成分的组合物对于学习障碍模型表现出极其优异的效果，从而完成了本发明。
[0009] 即，本发明涉及
[0010] [1]一种认知障碍改善剂，其含有蜂王浆作为有效成分。
[0011] [2]一种认知障碍改善剂，其含有川皮苷或其类似物或者柑橘类提取物、和蜂王浆作为有效成分。
[0012] [3]一种认知障碍改善剂，其含有川皮苷或其类似物和蜂王浆、以及红景天提取物、银杏叶提取物和阿魏酸作为有效成分。
[0013] [4]4-脱甲基川皮苷的制备方法，其包含以下工序：
[0014] 使2’-羟基-3’，4’，5’，6’-四甲氧基苯乙酮与4-苄氧基-3-甲氧基苯甲醛反应，得到3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮的工序；
[0015] 使得到的3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮在碘存在下反应，得到3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮的工序；和
[0016] 使得到的3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮在氢和钯碳的存在下反应，得到2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5，6，7，8-四甲氧基色烯-4-酮的工序。附图说明
[0017] 图1表示蜂王浆和川皮苷对PC12D细胞中的ERK磷酸化的影响。数据为平均±标准误差(n＝3)。*为相对于溶剂p＜0.05，***为p＜0.001(n＝3)。横轴，Veh为溶剂，Nb30为30μM的川皮苷，RJ1/200和RJ1/100分别为稀释200倍和稀释100倍的蜂王浆，RJ1/200+Nb30和RJ1/100+Nb30分别为稀释200倍和稀释100倍的蜂王浆+30μM的川皮苷。纵轴为磷酸化ERK相对于ERK总量的相对值。
[0018] 图2表示川皮苷对PC12D细胞中的ERK磷酸化的蜂王浆诱导刺激的增强效果。表示由至少3次的独立试验得到的代表性结果(上部)。纵轴的数值为对于PC12D细胞中ERK磷酸化的浓度测定值，以相对于对照组(0.1％DMSO)的数值的相对值表示。*为相对于溶剂p＜0.05，**为p＜0.01，***为p＜0.005。##为相对于30μM的川皮苷p＜0.01，###为p＜0.005。+为相对于稀释400倍的蜂王浆p＜0.05，+++为p＜0.01。数值为平均±标准误差(n＝3)。Veh为溶剂，Nb30为30μM的川皮苷，RJ1/400、RJ1/200和RJ1/100分别为稀释400倍、200倍和100倍的蜂王浆，RJ1/400+Nb30、RJ1/200+Nb30和RJ1/100+Nb30分别为稀释400倍、200倍和100倍的蜂王浆+30μM的川皮苷。
[0019] 图3表示蜂王浆(RJ)和川皮苷(nobiletin)对PC12D细胞中的CRE依赖性转录的联用效果。数据为平均±S.E.M(n＝4)。*为相对于RJ、p＜0.05，**为相对于RJ、p＜0.001。
[0020] 图4表示蜂王浆和柑橘类提取物对PC12D细胞中的CRE依赖性转录的联用效果。数据为平均±S.E.M(n＝4)。*为相对于对照p＜0.05，**为相对于柑橘类提取物p＜0.001。
[0021] 图5表示川皮苷对培养大鼠的海马神经细胞中的CRE依赖性转录的浓度依赖效4
果。将细胞以8×10/48孔板的密度接种，将板保持10-14天。然后，使用显示CRE依赖性转录的荧光素酶报告构建(luciferase reporterconstruct)对细胞进行16小时的转染。
转染后，用不同浓度的4-脱甲基川皮苷将细胞处理8小时。数据为平均±S.E.M(n＝6)。
*为相对于对照p＜0.05，**为相对于对照p＜0.001。
果。将细胞以8×10/48孔板的密度接种，将板保持10-14天。然后，使用显示CRE依赖性转录的荧光素酶报告构建(luciferase reporterconstruct)对细胞进行16小时的转染。
转染后，用不同浓度的4-脱甲基川皮苷将细胞处理8小时。数据为平均±S.E.M(n＝6)。
*为相对于对照p＜0.05，**为相对于对照p＜0.001。
[0022] 图6表示4-脱甲基川皮苷对培养大鼠的海马神经细胞中的CRE依赖性转录的浓4
度依赖效果。将细胞以8×10/48孔板的密度接种，将板保持10-14天。然后，使用显示CRE依赖性转录的荧光素酶报告构建对细胞进行16小时的转染。转染后，用不同浓度的4-脱甲基川皮苷将细胞处理8小时。数据为平均±S.E.M(n＝6)。*为相对于对照p＜0.05，**为相对于对照p＜0.001。
度依赖效果。将细胞以8×10/48孔板的密度接种，将板保持10-14天。然后，使用显示CRE依赖性转录的荧光素酶报告构建对细胞进行16小时的转染。转染后，用不同浓度的4-脱甲基川皮苷将细胞处理8小时。数据为平均±S.E.M(n＝6)。*为相对于对照p＜0.05，**为相对于对照p＜0.001。
具体实施方式
[0024] 本发明的川皮苷可以使用本领域技术人员公知的方法进行化学合成。另外，也可以由芸香科植物进行提取。在本发明中，还可以使用含有川皮苷的芸香科植物的提取物。例如，包含作为川皮苷的类似物的4’-羟基-5，6，7，8，3’-五甲氧基黄酮(4-脱甲基川皮苷)、其药学上可接受的盐、它们的水合物或溶剂化物。
[0025] [化1]
[0026]
[0027] R＝OH：4’-脱甲基川皮苷
[0028] R＝OCH3：川皮苷
[0029] 作为 芸 香 科植 物，可 以列 举 扁 平橘 (Citrus depressa)、温 州 蜜 橘(Citrusunshiu)、大红橘(Citrus tangerina)、小红橘(Citrus erythrosa)、酸橙(Citrus aurantium)、地中海红橘(Citrus deliciosa)、柚子(Citrusgrandis)、乳橘(Citrus kinokuni)、柑橘(Citrus reticulata)、立花橘(Citrustachibana)、酸橘(Citrus sunki)等。
[0031] 可用于本发明的蜂王浆没有特别限定，可以使用市售的蜂王浆。优选可以列举日本蜂王浆株式会社的产品。在本发明中，在没有特别记载时制成蜂王浆冻干粉末(FD粉末)。
[0032] 在本发明中，川皮苷的含量为0.0025重量％～2.00重量％，优选为0.005重量％～1.50重量％，更优选为0.01重量％～1.00重量％。另一方面，在使用含有10％川皮苷的提取物时，为0.025重量％～20.0重量％，优选为0.05重量％～15.0重量％，更优选为0.1重量％～10.0重量％。另外，蜂王浆的含量以蜂王浆FD粉末计，为3重量％～60重量％，优选为5重量％～45重量％，更优选为10重量％～30重量％。
[0033] 在本发明中，川皮苷含量与蜂王浆含量的比例为2∶3～1∶24000，优选为3∶10～1∶9000，更优选为1∶10～1∶600。另一方面，在使用含有10％川皮苷的提取物时，为20∶3～1∶2400，优选为3∶1～1∶900，更优选为1∶1～1∶60。
[0034] 本发明的认知障碍改善剂可以配合在药品、准药品或食品等中。另外，本发明的神经突起延长剂在经口给药或非经口给药的任意方式中都可以使用。
[0035] 作为药品的剂型，可以列举片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂等。这些药品可以使用通常的医药制造中的添加剂进行制造。
[0036] 本发明的认知障碍改善剂的给药量没有特别限定，但是例如，在经口给药时，为每天10～60mg/kg体重，优选为每天20mg/kg体重，在非经口给药时，为每天2～6mg/kg体重，优选为每天2～3mg/kg体重。上述给药量可以为1天1次或分为2～3次进行给药，也可以根据年龄、病情、症状进行适当增减。
[0037] 作为添加剂的具体例，可以列举乳糖、糊精、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、山梨糖醇、结晶性纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可以将它们单独或适当组合而使用。这些药品，按照日本药局方的记载，可以以适宜于各种药品的形态的方法进行制造。另外，还可以适当使用芳香剂、着色料、甜味料等。本领域技术人员可以对这些添加剂的含量进行适当选择。
[0038] 作为准药品的剂型，可以列举片剂、胶囊剂、颗粒剂、胶浆剂(jelly)、饮剂等。这些准药品可以使用通常的准药品制造中的添加剂进行制造。而且，这些准药品还可以含有例如维生素类等其它有效成分。另外，还可以将甜味料、芳香剂、着色料、抗氧化剂等添加剂单独或适当组合而使用。这些准药品可以用本领域技术人员公知的方法进行制造。
[0039] 作为食品的形态，可以列举面、食用面糊(pasta)、颗粒、果味片(錠果)、果子冻、液体(饮料)等。这些食品可以适当使用各种食品材料进行制造。食品材料的具体例为米、小麦、玉米、马铃薯、甘薯、大豆粉、海藻粉、糖稀、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇等，可以将它们单独或适当组合而使用。根据需要，可以通过使用水等制成期望的形状。而且，还可以适当地添加芳香剂、着色料、甜味料、食用油、维生素类等。
[0040] 以下，用实施例对本发明进行具体说明，但这表示其代表例，本发明不受该实施例的限定。实施例
[0041] 已经证明了cAMP/PKA/ERK/CREB依赖性信号传导通路与脑的记忆·学习能力密切相关。近年来，逐步理解到：除了由在脑内的β-淀粉样蛋白质(Aβ)累积而引起的神经变性·脱落之外，可溶性Aβ导致的不伴有神经细胞死亡的突触可塑性障碍也是阿尔茨海默病(AD)中的记忆障碍的原因之一。例如，在认为是学习和记忆形成的细胞机制之一的海马谷氨酸突触中的神经传导的长时程增强(LTP)是突触可塑性的代表性例子。已知Aβ阻碍PKA/CREB信号传导，从而抑制该LTP的发生。即，认为含有改善或抑制这样的Aβ导致的信号传导阻碍的生理活性物质的食品可用于AD的改善·预防。
[0042] 于是，在认为是神经细胞的细胞模型的PC12D细胞中，以“蜂王浆FD粉末”的水溶性成分对ERK磷酸化的影响为指标，用蛋白质印迹法研究蜂王浆对ERK活性的效果和蜂王浆与川皮苷的联用对ERK活性的效果。
[0043] 1.实验方法
[0044] PC12D细胞的培养
[0045] 对于PC12D细胞(爱知县コロニ一研究所)，使用添加了经灭活(56℃、30分钟)的5％的马血清(HS:Gibco)、10％牛胎血清(FCS:CELLect)、青霉素(50单位/mL)和链霉素(50μg/mL)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)进行传代培养。将细胞在保温于37℃的含有95％空气-5％CO2的培养箱中进行培养。此外，在本实验中，将以HS为2％、FCS为1％的方式配制的培养基用于药物的稀释。
[0046] “蜂王浆FD粉末”储备水溶液(25％(w/v))的配制
[0047] 使用经灭菌的刮铲，在灭菌完毕的2ml试管中称量入0.25g的“蜂王浆FD粉末”(日本蜂王浆株式会社)。之后，在超净工作台内，添加灭菌完毕的PBS(-)，使容量为1ml。搅拌后，移至冷藏室，每隔1小时重复搅拌，在冷藏室内静置过夜。第二天，搅拌后，在
12000×g、4℃的条件下离心10分钟。将其上清液过滤灭菌，分装后在-20℃下冷冻保存。
12000×g、4℃的条件下离心10分钟。将其上清液过滤灭菌，分装后在-20℃下冷冻保存。
[0048] 蛋白质印迹法
[0049] 在35mm培养皿中以1×106细胞/培养皿接种PC12D细胞，在CO2培养箱内培养24小时后，用药物进行处理。用90μl的细胞裂解液(1mMEDTA、1％SDS、10mM NaF、10nM花萼海绵诱癌素、320nM冈田酸、1mM原钒酸钠、1mMp-APMSF、10μg/ml胃蛋白酶抑制剂、10μg/ml抗蛋白酶、10μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂、10μg/ml磷酰二肽、10mM HEPES(pH7.5))将经药物处理的细胞裂解之后，回收入1.5ml试管中，在95℃下加热
5分钟。进而，在冰水中超声处理5分钟后，在14,000rpm的条件下离心20分钟，回收上清液，对蛋白质进行定量。之后，加入SDS-PAGE样品缓冲液。在SDS-PAGE之后，通过蛋白质印迹法将蛋白质转录在PVDF膜上，使用封闭缓冲液(10mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.05％Tween20、5％脱脂乳；pH 7.4)进行2小时封闭。之后，用TBST洗涤膜，与用封闭缓冲液稀释的一抗在4℃培养过夜。进而，用TBST洗涤膜，与用封闭缓冲液稀释的HRP标记IgG抗体在室温下培养2小时，再次用TBST洗涤。条带的检测使用ECL法进行。重探测为，使用蛋白印迹膜再生液(stripping buffer)(62.5mM Tris-HCl、2％SDS、100mM β-巯基乙醇；pH
7.4)除去抗体，之后检测内标蛋白质。
5分钟。进而，在冰水中超声处理5分钟后，在14,000rpm的条件下离心20分钟，回收上清液，对蛋白质进行定量。之后，加入SDS-PAGE样品缓冲液。在SDS-PAGE之后，通过蛋白质印迹法将蛋白质转录在PVDF膜上，使用封闭缓冲液(10mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.05％Tween20、5％脱脂乳；pH 7.4)进行2小时封闭。之后，用TBST洗涤膜，与用封闭缓冲液稀释的一抗在4℃培养过夜。进而，用TBST洗涤膜，与用封闭缓冲液稀释的HRP标记IgG抗体在室温下培养2小时，再次用TBST洗涤。条带的检测使用ECL法进行。重探测为，使用蛋白印迹膜再生液(stripping buffer)(62.5mM Tris-HCl、2％SDS、100mM β-巯基乙醇；pH
7.4)除去抗体，之后检测内标蛋白质。
[0050] 数据分析
[0051] 用平均值±标准误差表示实验值。统计处理使用Student′s t检验、方差分析和Dunnett检验，将显著性水平不足5％的情况判断为有明显差异。
[0052] 2.结果
[0053] 蜂王浆和川皮苷对PC12D细胞中的ERK磷酸化的效果
[0054] 以1×106细胞/3.5cm培养皿的细胞密度接种PC12D细胞，培养过夜，用含有各种药物的低血清培养基处理15分钟，用细胞裂解液使细胞裂解，得到细胞提取液。使用蛋白质印迹法，分析该细胞提取液中的p-ERK和ERK总量的表达量。此外，对于蜂王浆溶液，配制25％溶液后，用低血清培养基稀释，提供给实验。
[0055] 结果，在PC12D细胞中，在蜂王浆稀释400倍～100倍(0.0625-0.25％(w/v))的浓度下，已知在作为记忆·学习的细胞机制之一的突触传导的长时程增强中发挥重要作用的cAMP/PKA/ERK/CREB依赖性信号传导通路的重要构成分子、即ERK的磷酸化得到显著促进(图1和图2)。另一方面，在30μM川皮苷处理组中，确认ERK的磷酸化的弱促进作用(图2)。
[0056] 川皮苷对PC12D细胞中的蜂王浆诱导性的ERK磷酸化的促进的效果
[0057] 进而，得到非常令人感兴趣的结果。即，判明在单独使用时只表现出ERK磷酸化的弱促进作用的30μM川皮苷使蜂王浆的显著的ERK磷酸化促进活性进一步增强。这充分表明，蜂王浆和川皮苷的联用能够显著促进与记忆·学习密切相关的cAMP/PKA/ERK/CREB依赖性信号传导(图2)。
[0058] 对于蜂王浆单独、或者蜂王浆与川皮苷的联用对在C12D细胞中的cAMP/PKA/ERK/CREB依赖性信号传导的作用进行研究。PC12D细胞的培养、“蜂王浆FD粉末”储备水溶液(25％(w/v))的配制使用上述的方法进行。
[0059] 1.实验方法
[0060] 大鼠海马神经细胞的原代培养
[0061] 将妊娠SD大鼠(E18)乙醚麻醉后，使颈椎脱臼。之后，用70％乙醇将腹部消毒后，通过将腹部正中剖开而摘出胎儿。进而，由大鼠胎仔摘出脑，在立体显微镜下分离海马。海马神经细胞的培养使用SUMITOMOBAKELITE公司制的SUMITOMO Nerve-Cell Culture System进行。用含有木瓜蛋白酶的分散液(SUMILON)使海马组织分散，在1,000rpm的条件下离心4分钟后，除去上清液。使颗粒分散在分散液(SUMILON)中，进一步通过移液在充分分散的细胞中加入除去液(SUMILON)，在800rpm下离心5分钟后，除去上清液。使用Neurobasal培养基(不含酚红的Neurobasal培养基500ml、50×B-27Supplement 10ml、4
0.5mML-谷氨酰胺、0.005％青霉素-链霉素)将颗粒悬浊，以8×10 细胞/孔在涂布有聚赖氨酸的48孔板上接种，培养1天后，用PBS洗涤后更换为新的培养基，之后每隔2-3天更换一半培养基，由此以含有10μM AraC的培养基进行培养。
0.5mML-谷氨酰胺、0.005％青霉素-链霉素)将颗粒悬浊，以8×10 细胞/孔在涂布有聚赖氨酸的48孔板上接种，培养1天后，用PBS洗涤后更换为新的培养基，之后每隔2-3天更换一半培养基，由此以含有10μM AraC的培养基进行培养。
[0062] 转染和报告基因检测
[0063] 将PC12D细胞以8×104细胞/孔在48孔板上接种，用增殖培养基培养24小时后，以pCRE的报告基因质粒(萤火虫荧光素酶)为0.1μg/孔，内标用pRG-TK质粒(海肾荧光素酶)为0.01μg/孔的浓度，使用LIPOFECTAMINE(商标)2000试剂(invitrogen)进行共转染。在转染16小时后更换为添加有各种药物的培养基。用含有各种浓度的药物的培养基处理5小时后，吸取培养基，向细胞加入被动裂解液(Dual-LuciferaseReportor Assay System Cat.#E1960(Promega))，进行裂解并回收。此外，使用Dual-Ruciferase Reporter Assay System(Promega)以发光计(MiniLumat LB9506(BERTHOLD))对萤火虫和海肾荧光素酶的活性进行测定。
[0064] 另一方面，以Neurobasal培养基将用上述方法配制的海马神经细胞培养10-14天后，以脂质转染法将报告质粒(0.1μg/孔)、海肾pRG-TK质粒(0.01μg/孔)进行转染，进行一定时间的药物处理。转录活性的测定使用Promega公司制的Dual-Luciferase(注册商标)Reporter Assay System进行。
[0065] 统计学分析
[0066] 使用one-way ANOVA(Tukey)对用报告基因检测得到的结果进行评价，以双侧5％测定显著性水平，p＜0.05为具有显著性。
[0067] 研究蜂王浆(RJ)和川皮苷对PC12D细胞中的CRE依赖性转录的联用效果。
[0068] 如图3所示，可知即使是蜂王浆单独也对PC12D细胞中的CRE依赖性转录表现出影响，但如果联用15μM川皮苷或30μM川皮苷则其效果更高，与15μM川皮苷相比，联用增加了添加量的30μM川皮苷的试验区域的一方对CRE依赖性转录的影响增大。
[0069] 其次，研究蜂王浆和柑橘类提取物对PC12D细胞中的CRE依赖性转录的联用效果。
[0070] 如图4所示，可知即使是蜂王浆单独也对PC12D细胞中的CRE依赖性转录表现出影响，但在联用含有川皮苷的柑橘类提取物时，对CRE依赖性转录的影响更大。
[0071] 而且，研究了川皮苷对原代培养大鼠海马神经细胞中的CRE依赖性转录的效果。
[0072] 使用报告基因检测法就川皮苷对CRE依赖性转录的效果进行研究，结果为：在海马神经细胞中，川皮苷浓度依赖性地促进CRE依赖性转录。
[0073] 如图5所示，使用报告基因检测法就川皮苷对CRE依赖性转录的效果进行研究，结果为：在海马神经细胞中，川皮苷浓度依赖性地促进CRE依赖性转录。另外，如图6所示，4-脱甲基川皮苷与川皮苷一样，也浓度依赖性地促进CRE依赖性转录。
[0074] 以下示出4-脱甲基川皮苷的制备方法。其中，4-脱甲基川皮苷的制备方法不限于记载的方法。
[0075] 4-脱甲基川皮苷的有机合成的流程图如下所示。
[0076] [化2]
[0077]
[0078] 3，4，5-三甲氧基苯酚(2)
[0079] 在3，4，5-三甲氧基苯甲醛(2.0g，10.2mmol)的甲醇(20.4ml，0.5M)溶液中，在冰冷却下加入浓硫酸(0.54ml，10.2mmol)后，缓慢加入30％过氧化氢水溶液(3.5ml，30.6mmol)。在室温搅拌15分钟后，在冰冷却下加入10％氢氧化钠水溶液和亚硫酸钠，将反应停止。用盐水洗涤以乙酸乙酯萃取得到的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(5∶6v/v)洗脱部得到无色固体形式的3，4，
5-三甲氧基苯酚(1.08g，7.0mmol，58％)。
5-三甲氧基苯酚(1.08g，7.0mmol，58％)。
[0080] 无 色 薄 片( 乙 酸 乙 酯/ 己 烷 )：mp 145-147 ℃ .IR(CHCl3)：3303，1612，-1 11129cm .H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：6.09(2H，s)，5.90(1H，s)，3.79(3H，s)，3.76(6H，
13 +
s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：153.6，152.7，131.4，93.0，61.0，55.9.MS m/z：184(M)。
HRMS计算值C9H12O4：184.0736.实测值：184.0715.
13 +
s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：153.6，152.7，131.4，93.0，61.0，55.9.MS m/z：184(M)。
HRMS计算值C9H12O4：184.0736.实测值：184.0715.
[0081] 1，2，3，4，5-五甲氧基苯(3)
[0082] 室温下，在3，4，5-三甲氧基苯酚(0.10g，0.54mmol)的DMF(3.6ml，0.15M)溶液中加入2-碘酰基苯甲酸(IBX)(160mg，5.7mmol)，搅拌30分钟。加入10％Pd/C(10mg)后，将体系内置换成氢气氛围并搅拌1天。在使体系内回复到氩气氛围后，加入碳酸钾(220mg，1.6mmol)和硫酸二甲酯(0.13ml，1.4mmol)，进一步在室温搅拌3小时后，将反应溶液进行硅藻土(Celite)过滤，在减压下蒸馏除去溶剂。用盐水洗涤以乙醚萃取残渣而得的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(5∶7v/v)洗脱部得到无色固体形式的1，2，3，4，5-五甲氧基苯(42mg，0.18mmol，34％)。
[0083] 无色针状(己烷)：mp 59-61℃.IR(CHCl3)：1108cm-1.1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：13
6.30(1H，s)，3.95(3H，s)，3.85(6H，s)，3.83(6H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：149.1，+
147.9，136.7，93.7，61.4，61.3，56.5.MSm/z：228(M).HRMS计算值C11H16O5：228.0998.实测值：228.0983.分析计算值C11H16O5：C，57.88.H，7.07.实测值：C，57.77.H，7.00.[0084] 1，2，3，5-四甲氧基苯(6)
6.30(1H，s)，3.95(3H，s)，3.85(6H，s)，3.83(6H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：149.1，+
147.9，136.7，93.7，61.4，61.3，56.5.MSm/z：228(M).HRMS计算值C11H16O5：228.0998.实测值：228.0983.分析计算值C11H16O5：C，57.88.H，7.07.实测值：C，57.77.H，7.00.[0084] 1，2，3，5-四甲氧基苯(6)
[0085] 将2，6-二甲氧基[1，4]苯醌(10g，58.8mmol)加入到阮内镍(3.5g)的甲醇(100ml，0.59M)溶液中，在室温、氢气氛围的条件下搅拌6小时。将反应溶液进行硅藻土(Celite)过滤，在减压下蒸馏除去溶剂，由此得到粗2，6-二甲氧基苯-1，4-二醇。
[0086] 在粗2，6-二甲氧基苯-1，4-二醇(＜58.8mmol)的丙酮(100ml，＜0.59M)溶液中，加入碳酸钾(41g，297mmol)和硫酸二甲酯(14ml，147mmol)，进一步以加热回流搅拌3小时。用盐水洗涤以乙酸乙酯萃取得到的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(1∶2v/v)洗脱部得到无色油状形式的1，2，3，
5-四甲氧基苯(11.5g，158.1mmol，99％)。
5-四甲氧基苯(11.5g，158.1mmol，99％)。
[0087] 无 色 油 状 IR(CHCl3)：2931，1594，1506，1129cm-1.1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：13
6.15(2H，s)，3.85(6H，s)，3.79(3H，s)，3.79(3H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：156.2，+
153.7，132.4，91.7，61.0，56.1，55.5.MSm/z：198(M).HRMS计算值C10H14O4：198.0892.实测值：198.0885.
6.15(2H，s)，3.85(6H，s)，3.79(3H，s)，3.79(3H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：156.2，+
153.7，132.4，91.7，61.0，56.1，55.5.MSm/z：198(M).HRMS计算值C10H14O4：198.0892.实测值：198.0885.
[0088] 2’-羟基-3’，4’，6’-三甲氧基苯乙酮(7)
[0089] 在1，2，3，5-四甲氧基苯(11.5g，58.1mmol)的乙醚(200ml，0.29M)溶液中，在冰冷却下加入AlCl3(26g，192mmol)。之后，缓慢加入乙酰氯(5.4ml，75.5mmol)，在室温搅拌2小时。在冰冷却下加入水直到铝溶解为止，使反应停止。用盐水洗涤以乙醚萃取得到的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(1∶1v/v)洗脱部得到黄色固体形式的2’-羟基-3’，4’，6’-三甲氧基苯乙酮(11.1g，
49.1mmol，85％)。
49.1mmol，85％)。
[0090] 黄 色 针 状 ( 乙 酸 乙 酯 )：mp 114-116 ℃ .IR(CHCl3)：1626，1587，-1 11126cm .H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：13.80(1H，s)，5.97(1H，s)，3.94(3H，s)，3.90(3H，s)，
13
3.82(3H，s)，2.62(3H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：203.7，159.0，158.8，158.4，130.5，+
106.3，86.4，60.7，55.9，55.5，33.2.MS m/z：226(M).HRMS计算值C11H14O5：226.0841.实测值：226.0829.分析计算值C11H14O5：C，58.40.H，6.24.实测值：C，58.37.H，6.18.[0091] 2’-羟基-3’，4’，5’，6’-四甲氧基苯乙酮(9)
13
3.82(3H，s)，2.62(3H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：203.7，159.0，158.8，158.4，130.5，+
106.3，86.4，60.7，55.9，55.5，33.2.MS m/z：226(M).HRMS计算值C11H14O5：226.0841.实测值：226.0829.分析计算值C11H14O5：C，58.40.H，6.24.实测值：C，58.37.H，6.18.[0091] 2’-羟基-3’，4’，5’，6’-四甲氧基苯乙酮(9)
[0092] 在2’-羟基-3’，4’，6’-三甲氧基苯乙酮(10.8g，47.7mmol)的甲醇(130ml，0.37M)溶液中，在冰冷却下加入10％氢氧化钠水溶液(40ml，48mmol)后，缓慢加入6％过氧化氢水溶液(82ml，143mmol)。在室温下搅拌30分钟后，在冰冷却下加入10％盐酸和亚硫酸钠，使反应停止。用盐水洗涤以乙酸乙酯萃取得到的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂，由此得到无色固体形式的粗3，4，6-三甲氧基苯-1，2-二醇。
[0093] 在粗3，4，6-三甲氧基苯-1，2-二醇的丙酮(150ml)溶液中，加入碳酸钾(170g，1.2mol)和硫酸二甲酯(22ml，239mmol)后，加热回流3小时。用盐水洗涤以乙酸乙酯萃取得到的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(5∶7v/v)洗脱部得到作为与硫酸二甲酯不能分离的混合物形式的1，2，3，4，5-五甲氧基苯(11.5g，158.1mmol，99％)。
[0094] 在粗1，2，3，4，5-五甲氧基苯的乙醚(300ml)溶液中，在冰冷却下加入AlCl3(42g，313mmol)。之后，缓慢加入乙酰氯(14ml，187.5mmol)，在室温搅拌2小时。在冰冷却下加入水直到铝溶解为止，使反应停止。用盐水洗涤以乙醚萃取得到的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(1∶3v/v)洗脱部得到黄色油状形式的2’-羟基-3’，4’，5’，6’-四甲氧基苯乙酮(4.5g，17.6mmol，37％)。
[0095] 黄 色 油 状 .IR(CHCl3)：2985，1621，1409，1064cm-1.1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：13.12(1H，s)，4.08(3H，s)，3.96(3H，s)，3.86(3H，s)，3.81(3H，s)，2.68(3H，13
s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：204.2，154.6，153.7，151.4，138.0，136.8，110.4，61.3，+
61.2，61.1，61.0，32.2.MS m/z：256(M).HRMS 计 算 值 C12H16O6：256.0947. 实 测 值：
256.0963.
s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：204.2，154.6，153.7，151.4，138.0，136.8，110.4，61.3，+
61.2，61.1，61.0，32.2.MS m/z：256(M).HRMS 计 算 值 C12H16O6：256.0947. 实 测 值：
256.0963.
[0096] 3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮(10)
[0097] 在室温下，在4-苄氧基-3-甲氧基苯甲醛(340mg，1.41mmol)和2’-羟基-3’，4’，5’，6’-四甲氧基苯乙酮(240mg，0.94mmol)的乙醇(5.0ml，0.19M)溶液中，滴加50％氢氧化钾水溶液(0.37ml，3.3mmol)。搅拌24小时后，在冰冷却下加入10％盐酸，使反应停止，以乙酸乙酯进行萃取。用盐水将有机层洗涤后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。
将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(1∶2v/v)洗脱部得到黄色固体形式的3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮(0.32g，0.66mmol，
71％)。
将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(1∶2v/v)洗脱部得到黄色固体形式的3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮(0.32g，0.66mmol，
71％)。
[0098] 黄色针状(乙酸乙酯/己烷)：mp 99-100℃.IR(CHCl3)：1626，1509，1408，1259，-1 11055cm .H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：13.26(1H，s)，7.82(1H，d，J ＝ 15.6Hz)，7.78(1H，d，J ＝ 15.6Hz)，7.45-7.31(5H，m)，7.17(1H，d，J ＝ 8.4Hz)，7.16(1H，s)，6.90(1H，d，J ＝ 8.4Hz)，5.21(2H，s)，4.09(3H，s)，3.95(3H，s)，3.89(3H，s)，3.87(3H，s)，3.86(3H，
13 3
s). C-NMR(100MHz，CDCl)δ：193.3，154.8，153.2，150.7，150.4，149.6，144.0，138.3，
137.1，1136.4，128.5，128.4，127.9，127.1，124.2，122.8，113.4，111.0，110.9，70.8，62.2，
61.6，61.3，61.0，56.0.分析计算值C22H28O8：C，67.49.H，5.87.实测值：C，67.28.H，5.83.[0099] 2-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-5，6，7，8-四甲氧基色烯-4-酮(11)
13 3
s). C-NMR(100MHz，CDCl)δ：193.3，154.8，153.2，150.7，150.4，149.6，144.0，138.3，
137.1，1136.4，128.5，128.4，127.9，127.1，124.2，122.8，113.4，111.0，110.9，70.8，62.2，
61.6，61.3，61.0，56.0.分析计算值C22H28O8：C，67.49.H，5.87.实测值：C，67.28.H，5.83.[0099] 2-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-5，6，7，8-四甲氧基色烯-4-酮(11)
[0100] 在室温下，在3-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-1-(2-羟基-3，4，5，6-四甲氧基苯基)-丙烯酮(95mg，0.20mmol)的DMSO(1.5ml，0.13M)溶液中加入碘(3mg，0.01mmol)，在150度搅拌1.5小时。在冰冷却下加入亚硫酸钠使反应停止。用盐水洗涤以乙醚萃取得到的有机层后，用MgSO4干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯/己烷(3∶1v/v)洗脱部得到黄色固体形式的2-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-5，6，7，8-四甲氧基色烯-4-酮(79mg，0.16mmol，83％)。
[0101] 淡黄色薄片(乙酸乙酯/己烷)：mp 109-111℃.IR(CHCl3)：1641，1514，-1 11361cm .H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.49-7.32(7H，m)，6.99(1H，d，J＝8.5Hz)，6.60(1H，
13
s)，5.24(2H，s)，4.10(3H，s)，4.01(3H，s)，3.98(3H，s)，3.95(6H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：177.2，160.8，151.3，150.9，149.7，148.3，147.6，144.0，137.9，136.2，128.6，
1128.0，127.1，124.2，119.4，114.8，113.4，108.9，106.9，70.9，62.3，62.0，61.8，61.7，
56.1.分析计算值C27H26O8：C，67.77.H，5.48.实测值：C，67.55.H，5.58.
13
s)，5.24(2H，s)，4.10(3H，s)，4.01(3H，s)，3.98(3H，s)，3.95(6H，s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：177.2，160.8，151.3，150.9，149.7，148.3，147.6，144.0，137.9，136.2，128.6，
1128.0，127.1，124.2，119.4，114.8，113.4，108.9，106.9，70.9，62.3，62.0，61.8，61.7，
56.1.分析计算值C27H26O8：C，67.77.H，5.48.实测值：C，67.55.H，5.58.
[0102] 2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5，6，7，8-四甲氧基色烯-4-酮(12，G010)
[0103] 在Pd/C(8mg)的乙醇(2ml，0.08M)溶液中加入2-(4-苄氧基-3-甲氧基苯基)-5，6，7，8-四甲氧基色烯-4-酮(79mg，0.17mmol)，在室温、氢气氛围的条件下搅拌2小时。将反应溶液进行硅藻土(Celite)过滤，在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣置于硅胶色谱，从乙酸乙酯洗脱部得到黄色固体形式的G010(64mg，0.17mmol，99％)。
[0104] 无色棱柱(乙酸乙酯/己烷)：mp 155-156℃.IR(CHCl3)：3201，1634，1515，1355，-1 11076cm .H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.53(1H，d，J ＝ 8.3Hz)，7.40(1H，s)，7.05(1H，d，J ＝ 8.3Hz)，6.60(1H，s)，6.13(1H，m)，4.09(3H，s)，4.04(3H，s)，3.97(3H，s)，3.93(6H，
13
s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：177.4，161.2，151.4，149.1，148.3，147.6，147.0，144.0，
138.0，123.4，120.2，115.1，114.7，108.2，106.5，62.2，61.9，61.7，61.6，56.0.分析计算值C20H20O8：C，61.85.H，5.19.实测值：C，61.72.H，5.29.
13
s). C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：177.4，161.2，151.4，149.1，148.3，147.6，147.0，144.0，
138.0，123.4，120.2，115.1，114.7，108.2，106.5，62.2，61.9，61.7，61.6，56.0.分析计算值C20H20O8：C，61.85.H，5.19.实测值：C，61.72.H，5.29.
[0105] 对于上述的合成方法，使用I2/DMSO的从2’-羟基查尔酮到黄酮的氧化成环反应(黄酮骨架合成)在A.M.S.Silva，D.C.G.A.Pinto，J.A.S.Cavaleiro，Tetrahedron Lett，1994，35，5899-5902中有记载；对于从化合物1到2的转变(芳香族醛到酚的氧化)在M.Matsumoto，H.Kobayashi，Y.Hotta，J.Org.Chem.1984，49，4740中有记载；对于从化合物2到3的转变(起始于酚的儿茶酚的合成)在D.Magdziak，A.A.Rodriguez，R.W.VanDe Water，T.R.R.Pettus，Org.Lett.2002，4，285-288中有记载；对于化合物3的其它合成路径(流程图2，从化合物4到化合物3的合成)在M.Tsukayama，Y.Kawamura，T.Ishizuka，S.Hayashi，F.Torii，Heterocycles2003，60，2775-2784中有记载；并且，对于化合物9的合成(Friedel-Crafts乙酰化)在M.Tsukayama，E.Kusunoki，M.M.Hossain，Y.Kawamura，S.Hayashi，Heterocycles 2007，71，1589-1600中有记载。
[0106] 在将本发明品用作健康食品时，配合成分的推荐量如下所示。认为对认知症有效果的健康食品原料的1天摄取推荐量如下所示。其中，由于健康食品是食品的一部分，因此没有限制。
[0107] [表1]
[0108] 健康食品原料一览
[0109]健康食品原料 一天摄取推荐量
银杏叶提取物 ～240mg
DHA(二十二碳六烯酸) ～4,000mg
红景天提取物粉末 ～1,350mg
磷脂酰丝氨酸 ～100mg
蜂王浆FD粉末 ～500mg(以原乳换算量计～1,500mg)
阿魏酸 ～500mg
银杏叶提取物 ～240mg
DHA(二十二碳六烯酸) ～4,000mg
红景天提取物粉末 ～1,350mg
磷脂酰丝氨酸 ～100mg
蜂王浆FD粉末 ～500mg(以原乳换算量计～1,500mg)
阿魏酸 ～500mg
[0110] 示出将本发明品用作健康食品时的一个例子。蜂王浆和川皮苷是必须的，还可以含有DHA(二十二碳六烯酸)、红景天提取物粉末、磷脂酰丝氨酸、阿魏酸等。不论健康食品的形态，下面示出制成糖衣片的例子。
[0111] [表2]
[0112] 健康食品的一个例子
[0113]
[0114] 以每天服用5粒～10粒的方式设计。
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