免疫亲和素配体以及调节免疫亲和素和钙通道活性的方法
阅读：688发布：2020-09-03
专利汇可以提供免疫亲和素配体以及调节免疫亲和素和钙通道活性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 揭示免疫亲和素配体和其作为 钙 通道活性调节剂的用途。本发明还揭示对例如神经变性病症和心血管病症等与钙通道功能障碍有关的病况的筛选、 治疗 和 预防 方法。，下面是免疫亲和素配体以及调节免疫亲和素和钙通道活性的方法专利的具体信息内容。
1.一种经纯化复合物，其包含免疫亲和素配体以及(i)免疫亲和素或其功能片段和/ 或(ii)钙通道亚基或其功能片段中的一者或两者。
2.根据权利要求1所述的经纯化复合物，其中所述免疫亲和素配体为在雷帕霉素主链 的1位和4位具有杂原子取代基的雷帕霉素类似物。
3.根据权利要求1所述的经纯化复合物，其中所述免疫亲和素配体为具有式I的雷帕 霉素类似物：
其中：
R1和R2为不同的独立基团，并且选自由OR3和N(R3′)(R3″)组成的群组；或
R1和R2不同、经由单键连接并且选自由O和NR3组成的群组；
R3、R3′和R3″独立地选自由H、C1到C6烷基、C1到C6经取代烷基、C3到C8环 烷基、经取代C3到C8环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基和经取代杂芳基组成的 群组；
R4和R4′：
(a)独立地选自由H、OH、O(C1到C6烷基)、O(经取代C1到C6烷基)、O(酰 基)、O(芳基)、O(经取代芳基)和卤素组成的群组；或
(b)一起形成与O键结的双键；
R5、R6和R7独立地选自由H、OH和OCH3组成的群组；
R8与R9(i)经由单键连接且都为CH2，或(ii)经由双键连接且都为CH；
R15选自由C＝O、CHOH和CH2组成的群组；n为1或2；或其医药学上可接受 的盐。
4.根据权利要求3所述的经纯化复合物，其中所述雷帕霉素类似物的R1为O，且R2 为NR3。
5.根据权利要求3所述的经纯化复合物，其中所述雷帕霉素类似物的R1为OR3，且 R2为N(R3′)(R3″)。
6.根据权利要求3所述的经纯化复合物，其中所述雷帕霉素类似物的R3、R3′或R3″ 为芳基或经取代芳基。
7.根据权利要求6所述的经纯化复合物，其中所述雷帕霉素类似物的所述芳基或经取 代芳基具有以下结构：
其中：
R10、R11、R12、R13和R14独立地选自由H、C1到C6烷基、经取代C1到C6烷 基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、卤素、酰基、OH、O(烷基)、 O(经取代烷基)、O(芳基)、O(经取代芳基)、O(酰基)、NH2、NH(烷基)、NH(经 取代烷基)、NH(芳基)、NH(经取代芳基)和NH(酰基)组成的群组。
8.根据权利要求1所述的经纯化复合物，其中所述免疫亲和素配体为选自由以下组成 的群组的雷帕霉素类似物：
9.根据权利要求1所述的经纯化复合物，其中所述免疫亲和素为FKBP52或其功能片 段，其具有与图12A-12D中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：11-14)至少95％一致 或一致的序列。
10.根据权利要求1所述的经纯化复合物，其中所述钙通道亚基为电压门控L型钙通道 β1亚基或其功能片段，其具有与图11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10) 至少95％一致或一致的序列。
11.一种重组宿主细胞，其包含第一重组核酸，所述第一重组核酸包含编码具有图 12A-12D中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：11-14)的FKBP52的核苷酸序列；和/或 第二重组核酸，所述第二重组核酸包含编码具有图11A-11J中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10)的电压门控L型钙通道β1亚基的核苷酸序列。
12.一种抗体或其抗原结合片段，其结合根据权利要求1所述的经纯化复合物。
13.一种鉴别测试化合物的方法，所述测试化合物使包括所述测试化合物以及(i)免 疫亲和素和/或(ii)电压门控L型钙通道β1亚基中的一者或两者的复合物的形成 增加，所述方法包含：
使免疫亲和素或其功能片段和/或β1亚基或其功能片段与测试化合物在允许形成 所述复合物的条件下接触；
相对于参考物，检测在存在所述测试化合物的情况下所述复合物的存在；
其中在存在所述测试化合物的情况下所述复合物的含量相对于在所述参考物中 所述复合物的含量的增加表明，所述测试化合物使复合物形成增加。
14.根据权利要求13所述的方法，其中样本为细胞溶解产物、重构系统，其包含培养 的细胞或动物个体中的细胞。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述复合物形成的增加是通过检测以下一者或 多者来测定：所述复合物的实际形成的增加；信号转导的改变；钙通道活性的降低； 或神经元活性的改变。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述神经元活性的改变被检测为存活、分化或 神经突起生长中的一者或多者的增加。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述测试化合物为从天然存在或经修饰吸水链 霉菌(S.hygroscopicus)获得的聚酮。
18.一种通过权利要求13所述的方法鉴别的化合物。
19.一种使复合物形成增加的方法，所述复合物包括免疫亲和素配体以及(i)免疫亲 和素或其功能性变异体和/或(ii)钙通道亚基或其功能性变异体中的一者或两者， 所述方法包含：使免疫亲和素或其功能片段和/或电压门控L型钙通道β1亚基或其 功能片段与免疫亲和素配体在使所述复合物形成增加的条件下接触。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述接触步骤是在细胞溶解产物、重构系统或 培养的细胞或动物个体中发生。
21.一种降低细胞中电压门控钙通道活性和/或FKBP52活性的方法，其包含：使表达 FKBP52或其功能片段和/或所述电压门控L型钙通道β1亚基或其功能片段中的一 者或两者的细胞与免疫亲和素配体在允许所述免疫亲和素配体与所述FKBP52或 其片段和/或所述亚基或其片段中的一者或两者结合的条件下接触，由此抑制所述 钙通道活性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触步骤包含将所述免疫亲和素配体加入 培养的哺乳动物神经元或心血管细胞中。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触步骤包含对个体投与一定量的所述免 疫亲和素配体，所述量足以形成所述免疫亲和素配体与所述FKBP52或其片段和/ 或所述亚基或其片段中的一者或两者的复合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述投与所述个体的免疫亲和素的量是通过在 活体外测试诱导复合物形成所需的免疫亲和素配体的量来测定。
25.根据权利要求23所述的方法，其进一步包含鉴别具有患一种或多种与涉及L型钙 通道功能障碍的病症有关的症状的风险或具有所述症状的个体。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述个体为罹患神经变性病症或心血管病症的 哺乳动物。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述免疫亲和素配体是与L型钙通道拮抗剂组 合投与。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述免疫亲和素配体为在雷帕霉素主链的1位 和4位具有杂原子取代基的雷帕霉素类似物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述雷帕霉素类似物具有式I：
其中：
R1和R2为不同的独立基团，并且选自由OR3和N(R3′)(R3″)组成的群组；或
R1和R2不同，经由单键连接并且选自由O和NR3组成的群组；
R3、Re3′和R3″独立地选自由H、C1到C6烷基、C1到C6经取代烷基、C3到C8环 烷基、经取代C3到C8环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基和经取代杂芳基组成的 群组；
R4和R4′：
(a)独立地选自由H、OH、O(C1到C6烷基)、O(经取代C1到C6烷基)、O(酰 基)、O(芳基)、O(经取代芳基)和卤素组成的群组；或
(b)一起形成与O键结的双键；
R5、R6和R7独立地选自由H、OH和OCH3组成的群组；
R8与R9(i)经由单键连接且都为CH2，或(ii)经由双键连接且都为CH；
R15选自由C＝O、CHOH和CH2组成的群组；n为1或2；或其医药学上可接受 的盐。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述雷帕霉素类似物选自由以下组成的群组：
31.根据权利要求21所述的方法，其中所述FKBP52或其功能片段包含与图12A-12D 中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：11-12)至少95％一致或一致的氨基酸序列。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述电压门控L型钙通道的β1亚基或其功能片 段包含与图11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10)至少95％一致的氨 基酸序列。
33.一种刺激神经元细胞的神经突起生长和/或存活的方法，其包含：使所述神经元细 胞与免疫亲和素配体接触，其中所述免疫亲和素配体以引起以下一种或多种作用的 浓度存在：(i)下调钙信号转导路径中至少一种组分的表达或活性；(ii)降低 FKBP52活性或表达；(iii)降低或抑制L型钙通道的活性或表达；(iv)活化糖皮 质激素受体信号转导；(v)诱导形成包含所述免疫亲和素配体、FKBP52和/或β1 亚基的复合物；和/或(vi)防止神经元遭受钙诱导的细胞死亡。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述接触步骤包含对个体投与一定量的所述免 疫亲和素配体，所述量足以形成包含所述免疫亲和素配体以及FKBP52和/或β1亚 基中的一者或两者的复合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述投与所述个体的免疫亲和素的量是通过在 活体外测试诱导复合物形成所需的免疫亲和素配体的量来测定。
36.根据权利要求33所述的方法，其进一步包含鉴别具有患一种或多种与涉及L型钙 通道功能障碍的病症有关的症状的风险或具有所述症状的个体。
37.一种治疗与L型钙通道功能障碍有关的病症的方法，其包含对个体投与一定量的免 疫亲和素配体，所述量足以形成包括所述免疫亲和素配体以及免疫亲和素或其功能 片段和/或钙通道亚基或其功能片段中的一者或两者的复合物，由此治疗所述病症。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述投与所述个体的免疫亲和素的量是通过在 活体外测试诱导复合物形成所需的免疫亲和素配体的量来测定。
39.根据权利要求37所述的方法，其进一步包含鉴别具有患一种或多种与涉及L型钙 通道功能障碍的病症有关的症状的风险或具有所述症状的个体。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述个体为罹患神经变性病症或心血管病症的 哺乳动物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述个体为罹患选自由以下组成的群组的病症 的哺乳动物：中风、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、癫痫、心绞痛、心律失常 和局部缺血。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述个体为罹患选自由以下组成的群组的病症 的哺乳动物：偏头痛、神经性疼痛、急性疼痛、情绪障碍、精神分裂症、抑郁症、 焦虑症、小脑性共济失调、迟发性运动障碍、高血压和尿失禁。
43.根据权利要求37所述的方法，其中所述免疫亲和素配体是与L型钙通道拮抗剂组 合投与。
44.根据权利要求33或37所述的方法，其中所述免疫亲和素配体为具有式I的雷帕霉 素类似物：
其中：
R1和R2为不同的独立基团，并且选自由OR3和N(R3′)(R3″)组成的群组；或
R1和R2不同、经由单键连接并且选自由O和NR3组成的群组；
R3、R3′和R3″独立地选自由H、C1到C6烷基、C1到C6经取代烷基、C3到C8环 烷基、经取代C3到C8环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基和经取代杂芳基组成的 群组；
R4和R4′：
(a)独立地选自由H、OH、O(C1到C6烷基)、O(经取代C1到C6烷基)、O(酰 基)、O(芳基)、O(经取代芳基)和卤素组成的群组；或
(b)一起形成与O键结的双键；
R5、R6和R7独立地选自由H、OH和OCH3组成的群组；
R8与R9(i)经由单键连接且都为CH2，或(ii)经由双键连接且都为CH；
R15选自由C＝O、CHOH和CH2组成的群组；n为1或2；或其医药学上可接受 的盐。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述雷帕霉素类似物选自由以下组成的群组：
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述免疫亲和素为FKBP52或其功能片段，其 具有与图12A-12D中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：11-14)至少95％一致或一致的 氨基酸序列。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述钙通道亚基为电压门控L型钙通道的β1 亚基或其功能片段，其具有与图11A-11J中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10)至 少95％一致或一致的氨基酸序列。
48.一种刺激神经元细胞的神经突起生长的方法，其包含使所述神经元细胞与电压门控 L型钙通道β1亚基的拮抗剂和/或FKBP52拮抗剂中的一者或两者在降低所述β1 亚基或FKBP52的活性或表达的条件下接触。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述神经元细胞选自由多巴胺能细胞、胆碱能 细胞、皮层细胞和脊髓细胞组成的群组。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述拮抗剂为与所述β1亚基和/或FKBP52形 成复合物的免疫亲和素配体。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述拮抗剂为所述钙通道β亚基或FKBP52的 转录抑制剂。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述拮抗剂为抗体。
53.一种免疫亲和素配体的用途，其用于制备供预防或治疗与L型钙通道功能障碍有关 的病况的药物。
54.根据权利要求53所述的用途，其中所述免疫亲和素配体为在雷帕霉素主链的1位 和4位具有杂原子取代基的雷帕霉素类似物。
55.一种免疫亲和素配体与L型钙通道拮抗剂的组合的用途，其用于预防或治疗与L 型钙通道功能障碍有关的病况。
56.一种根据权利要求13至17中任一权利要求鉴别的化合物的用途，其用于制备供预 防或治疗与L型钙通道功能障碍有关的病况的药物。
57.一种免疫亲和素配体，其用于预防或治疗与L型钙通道功能障碍有关的病况。
58.一种组合物，其包含免疫亲和素配体和L型钙通道拮抗剂，所述组合物用于预防或 治疗与L型钙通道功能障碍有关的病况。
59.一种根据权利要求13至17中任一权利要求鉴别的化合物，其用于预防或治疗与L 型钙通道功能障碍有关的病况。
技术领域
无
背景技术
钙经由电压门控钙通道进入哺乳动物细胞中将介导多种细胞和生理反应，包括兴奋 -收缩偶联、激素分泌和基因表达(米勒(Miller)等人，(1987)科学(Science)235：46-52； 奥古斯汀(Augustine)等人，(1987)神经系统学评述(Annu，Rev.Neurosci.)10：633-93)。 钙通道直接影响到膜电位并有助于神经元的不同电学特性。钙进入通过调控钙依赖性离 子通道并调节诸如蛋白激酶C和钙调蛋白(calmodulin)依赖性蛋白激酶II等钙依赖性 酶的活性而进一步影响神经元功能。突触前神经末梢的钙浓度的增加通常会引起神经递 质的释放，并增加钙通道活性。所述钙增加已涉及多种人类病症，包括(但不限于)神 经病症和心脏病症(例如，先天性偏头痛、小脑性共济失调、心绞痛、癫痫、高血压、 局部缺血和一些节律失常)。
考虑到电压门控钙通道在生理学和病理学功能方面的广泛作用，仍需要鉴别新颖钙 通道活性调节剂并了解其作用机制。
发明内容
本发明揭示调节免疫亲和素和钙通道活性的方法和组合物。在一个实施例中，已显 示，在雷帕霉素(rapamycin)mTOR结合区经修饰的免疫亲和素配体能降低FKBP52和 电压门控L型钙通道、尤其L型钙通道的β1亚基的活性。经证实，所述活性降低与神 经突起生长和神经元存活的伴随增加相关联。在不受理论束缚的情况下，相信FKBP52 和通道活性的降低至少部分是经由形成包括免疫亲和素配体；免疫亲和素(例如 FKBP52)和/或L型钙通道β1亚基中的一者或两者的复合物而发生。因此，本发明提供 使用免疫亲和素配体(例如，在mTOR结合区经修饰的免疫亲和素配体)来调节(例如， 抑制、减弱和/或降低)免疫亲和素和/或L型钙通道β亚基的活性的方法。在其它方面， 还揭示治疗或预防例如神经变性病症和心血管病症等与钙通道功能障碍有关的病况的 方法。另外，本发明涵盖鉴别调节免疫亲和素和/或钙通道亚基的活性的化合物的方法和 试剂。
一方面，本发明提供一种经纯化复合物，其包括免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素 或美立霉素(meridamycin)类似物(例如，已知或未知类似物))，以及(i)免疫亲和 素或其功能性变异体，和/或(ii)钙通道亚基或其功能性变异体中的一者或两者。因此， 本发明的例示性复合物可包括免疫亲和素配体和免疫亲和素或其功能片段；免疫亲和素 配体和钙通道亚基或其功能性变异体；以及免疫亲和素配体、免疫亲和素或其功能性变 异体和钙通道亚基或其功能性变异体。应了解，本发明的复合物还可包括其它多肽或其 片段。
在一个实施例中，雷帕霉素类似物是在雷帕霉素的mTOR结合区经修饰，例如，在 雷帕霉素主链的1位和4位具有杂原子取代基(参看图1A)。在其它实施例中，雷帕霉 素类似物在雷帕霉素主链的1位、2位、3位和/或4位具有环状结构。在其它实施例中， 雷帕霉素类似物具有如本文中所述的化学式(例如，式I、Ia和/或Ib)。在其它实施例 中，雷帕霉素类似物具有在本文中称为“雷帕霉素I”和“雷帕霉素II”(图1A)(在本 文中也分别称为“化合物I”和“化合物II”)的化合物的结构。在其它实施例中，相对 于其它免疫亲和素(例如，FKBP12)，免疫亲和素配体以一定选择性结合例如FKBP-52 等免疫亲和素，所述选择性比雷帕霉素的选择性高至少100、200、300、400、500、600、 700、800倍或更高。
在各实施例中，免疫亲和素为FK506结合蛋白，例如FKBP52(例如哺乳动物 FKBP52)或其功能性变异体。在其它实施例中，钙通道亚基为电压门控L型钙通道亚 基，例如β1亚基(例如哺乳动物β1亚基)或其功能性变异体。本文所述多肽的功能性 变异体包括保留未经修饰形式的一种或多种活性(例如，保留结合免疫亲和素配体和/ 或形成如本文所述的复合物的能力)的片段、突变形式、融合蛋白、经标记形式(例如 放射性标记)。尽管出于阅读的便利，短语“其功能性变异体”可能在全文中重复出现 或可能并未重复出现，但术语“免疫亲和素”和“钙通道”等仍包括“其功能性变异体”。
另一方面，本发明提供一种鉴别测试化合物(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立 霉素类似物)的方法或分析，所述测试化合物能与(i)免疫亲和素(例如，如本文所述 的免疫亲和素(例如FKBP52))(或其功能性变异体)和/或(ii)钙通道亚基(例如， 如本文所述的钙通道亚基(例如β1亚基))(或其功能性变异体)相互作用(或结合)， 和/或调节(例如，降低或增加)其活性。所述方法或所述分析包括：使免疫亲和素和/ 或钙通道亚基与测试化合物在允许发生相互作用和/或活性调节的条件下接触；检测在存 在测试化合物的情况下免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用和/或活性相对于参考物 (例如，参考样本，例如未暴露于测试化合物的对照样本或暴露于雷帕霉素的对照样本) 的变化。在存在测试化合物的情况下，免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用水平和/ 或活性相对于参考物的变化(例如，增加或降低)表明，所述测试化合物与免疫亲和素 和/或钙通道亚基相互作用和/或影响(例如，增加或降低)其活性。
在各实施例中，测试化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基中的一者或两者的相互作 用是通过形成复合物(例如，以下一者或多者的复合物：测试化合物与免疫亲和素；测 试化合物与钙通道亚基；或测试化合物、免疫亲和素与钙通道亚基)来检测。在存在测 试化合物的情况下，所述复合物的形成和/或稳定性相对于参考物的变化表明，所述测试 化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基中的一者或两者相互作用。
另一方面，本发明提供一种鉴别神经营养和/或神经保护化合物的方法或分析。所述 方法或所述分析包括：使(i)免疫亲和素(例如，如本文所述的免疫亲和素(例如 FKBP52))(或其功能性变异体)和/或(ii)钙通道亚基(例如，如本文所述的钙通道亚 基(例如β1亚基))(或其功能性变异体)与测试化合物在允许发生相互作用和/或活性 调节的条件下接触；检测在存在测试化合物的情况下免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互 作用和/或活性相对于参考物(例如，参考样本，例如未暴露于测试化合物的对照样本或 暴露于雷帕霉素的对照样本)的变化。在存在测试化合物的情况下，免疫亲和素和/或钙 通道亚基相对于参考物的相互作用水平的增加和/或活性降低将指示潜在神经营养和/或 神经保护化合物。在各实施例中，测试化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用 的增加是通过两种或两种以上上述组分的复合物的形成和/或稳定性的增加来检测。在其 它实施例中，活性降低是通过检测钙通道活性的降低(例如，如本文中更详细描述)来 确定。可例如通过测量糖皮质激素受体活化来检测免疫亲和素活性的降低。
上述筛选方法和分析的其它实施例可包括以下一个或多个特征：
在各实施例中，免疫亲和素和/或钙通道亚基存在于样本中。所述样本可为细胞溶解 产物或重构系统(例如，细胞膜或可溶组分)。或者，所述样本可包括培养(例如，纯 化培养)的细胞，或重组细胞，或动物个体的活体内细胞。测试化合物或神经营养化合 物与免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用和/或活性的变化可通过检测以下一种或多 种变化来确定：例如通过生物化学检测、基于亲和力的检测(例如，蛋白质免疫印迹 (Western blot)、亲和柱)、免疫沉淀、基于荧光共振能量转移(FRET)的分析、分光光 度方式(例如，圆二色谱、吸光度和溶液特性的其它测量法)检测的复合物本身的结合 或实际形成的变化；例如钙依赖性磷酸化和/或转录活性(例如，如本文所述的转录谱) 等信号转导的变化，例如增加或降低；钙通道活性(例如，电生理学活性、钙动力学) 的变化，例如增加或降低；和/或神经元存活、分化和/或神经突起生长的变化，例如增 加或降低。在一个实施例中，鉴别测试化合物或神经营养化合物并以相同或不同分析再 测试。举例来说，以活体外或无细胞系统鉴别测试化合物或神经营养化合物，并且以动 物模型或基于细胞的分析进行再测试。可使用任何分析次序或组合。举例来说，可将高 通量分析与动物模型或组织培养组合使用。
在其它实施例中，所述方法或分析包括：提供基于接近程度依赖性信号产生的步骤， 例如包括第一融合蛋白(例如，包含免疫亲和素部分的融合蛋白)和第二融合蛋白(例 如，包含β亚基部分的融合蛋白)的双杂交分析；使双杂交分析与测试化合物在一定条 件下接触，其中所述双杂交分析检测复合物的形成和/或稳定性的变化，例如，复合物的 形成将起始报告基因的转录活化。
在其它实施例中，所述方法或分析进一步包括以下步骤：使免疫亲和素和/或钙通道 亚基与已知的免疫亲和素配体(例如，如本文所述，在雷帕霉素的mTOR结合区经修饰 的雷帕霉素类似物)接触；检测在不存在或存在测试化合物的情况下，已知的免疫亲和 素配体与免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用和/或活性。在存在或不存在测试化合 物的情况下，免疫亲和素和/或钙通道亚基的结合(例如，复合物形成)和/或活性的变 化将指示，所述测试化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基相互作用和/或结合。
在其它实施例中，所述方法或分析进一步包括以下步骤：将测试化合物与复合物的 结合与已知的免疫亲和素配体与复合物的结合相比较。另外，所述方法或分析可任选包 括：检测相对于测试化合物与个别组分的相互作用，测试化合物与免疫亲和素和/或钙通 道亚基的复合物的相互作用(例如，结合)。
在一些实施例中，所述方法另外包括评估神经元活性(例如，神经元存活、分化和 /或神经突起生长中的一者或多者)的变化(例如，增加或降低)的步骤。神经元存活、 分化和/或神经突起生长中的一者或多者的增加将指示神经营养和/或神经保护化合物。 评估步骤可在培养的细胞或如本文所述的动物模型中进行。
候选测试化合物或神经营养化合物能增加本文所述的复合物的形成，和/或抑制钙通 道或免疫亲和素活性。在一个实施例中，测试化合物以比结合复合物的个别组分的亲和 力高的亲和力结合复合物。测试化合物或神经营养化合物可为天然产物或化学合成的化 合物。举例来说，测试化合物可为从天然存在或经修饰(例如，重组修饰)的原核生物 (例如，放射菌类(Actinomycete)，诸如链霉菌(Streptomyces)，例如吸水链霉菌(S. hygroscopicus))或真核生物(例如，真菌或哺乳动物)细胞获得的聚酮。在各实施例中， 测试化合物为雷帕霉素或美立霉素，或其类似物(例如，本文所述的雷帕霉素或美立霉 素化合物，或其类似物)。
本文所揭示和/或通过本文所述的方法或分析鉴别的化合物也在本发明的范围内。本 发明还揭示包括本发明的化合物和医药学上可接受的载剂的组合物，例如医药组合物。 在一个实施例中，所述组合物包括本发明的化合物与一种或多种药剂(例如，治疗剂) 的组合。在一个实施例中，第二药剂为钙通道拮抗剂，例如L型钙通道拮抗剂。L型钙 通道拮抗剂的实例包括二氢吡啶、苯基烷基胺和苯并硫氮杂卓二苯基丁基哌啶类抗精神 分裂症神经安定药。在某些实施例中，所投与的在组合物中存在的免疫亲和素配体和/ 或钙通道拮抗剂的量低于单独投与的组合物中存在的药物的量。
另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含一个或多个编码本文所揭示的复合物 的一种或多种多肽成分的核酸。在一个实施例中，宿主细胞含有第一核酸，其包括编码 免疫亲和素(例如FKBP52，例如哺乳动物FKBP52)(或其功能性变异体)的核苷酸序 列；和/或第二核酸，其包括编码电压门控L型钙通道亚基(例如β1亚基，例如哺乳动 物β1亚基)(或其功能性变异体)的核苷酸序列。在一些实施例中，重组免疫亲和素和 钙通道亚基和/或其控制调控序列是通过外源方式添加。
另一方面，本发明提供一种结合本文所揭示的复合物的抗体，或其抗原结合片段。 在某些实施例中，抗体或其片段能增加本文所揭示的复合物的形成。在其它实施例中， 抗体或其片段能减少或抑制本文所揭示的复合物的形成。在一个实施例中，抗体或其片 段选择性结合复合物，但不会显著结合复合物的个别组分。如本文所述，所述复合物可 包括免疫亲和素配体或测试化合物和免疫亲和素和/或钙通道。
另一方面，本发明提供一种制造抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括：使 用本文所述的复合物作为抗原(例如，动物模型或噬菌体呈现选择中的免疫原)；和根 据与复合物的结合，选择抗体或其结合片段。所述方法可任选包括以下步骤：确定抗体 或其片段与复合物的结合；和比较抗体与所述复合物的个别组分或与含有所述复合物的 三种组分的复合物的结合。优选相对于个别组分或其复合物，选择性结合所述复合物的 抗体或其片段。
另一方面，本发明提供一种调节(例如降低)免疫亲和素(或其功能性变异体)和 /或钙通道亚基(或其功能性变异体)的活性的方法。所述方法包括：使(i)免疫亲和 素(例如，如本文所述的FKBP52)和/或(ii)钙通道亚基(例如，如本文所述的β1亚 基)中的一者或两者与免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似 物)在允许发生相互作用(例如结合)的条件下接触。在各实施例中，活性的调节(例 如增加)将指示包括免疫亲和素配体以及免疫亲和素和/或钙通道亚基中的一者或两者的 复合物的形成和/或稳定性。在一个实施例中，接触步骤可在活体外，例如在细胞溶解产 物或重构系统中实现。或者，可对培养(例如，活体外或离体)的细胞执行本方法。举 例来说，可在活体外培养细胞(例如，纯化或重组细胞)，并且可通过将免疫亲和素配 体(例如，雷帕霉素或美立霉素类似物)加入培养基中来实现接触步骤。通常，所述细 胞为哺乳动物细胞，例如人类细胞。在一些实施例中，所述细胞为神经元细胞或心血管 细胞。
另一方面，本发明提供一种调节(例如，抑制)细胞中的钙通道活性(例如，电压 门控钙通道活性)和/或免疫亲和素活性的方法。所述方法包括：使表达(i)免疫亲和 素(例如FKBP52，例如哺乳动物FKBP52)(或其功能性变异体)和/或(ii)电压门控 L型钙通道亚基(例如β1亚基，例如哺乳动物β1亚基)(或其功能性变异体)的细胞与 免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)在允许发生配体与 免疫亲和素和/或亚基中的一者或两者的相互作用(例如，包括所述物质的复合物的形成) 的条件下接触，由此抑制钙通道和/或免疫亲和素活性。通常，所述细胞为哺乳动物细胞， 例如人类细胞。在一些实施例中，所述细胞为神经元细胞或心血管细胞。所述方法可利 用如本文所述的培养基中的细胞来进行。
另一方面，本发明提供一种增加例如神经突起生长和/或存活等神经元功能的方法。 所述方法包括：使神经元细胞与足以促进神经元功能的量的免疫亲和素配体接触。在各 实施例中，免疫亲和素配体是以引起以下一种或多种作用的浓度存在：(i)下调钙信号 转导路径中至少一种组分(例如，钙流入通道、谷氨酸的N-甲基D-天冬氨酸亚型(NMDA) 受体、纤溶酶原活化剂(PLAU)、SHT3R通道)的表达和/或活性；(ii)降低免疫亲和 素(例如，FKBP52)的活性和/或表达；(iii)降低或抑制钙通道(例如，L型钙通道) 的活性和/或表达；(iv)活化类固醇受体信号转导(例如，糖皮质激素受体信号转导)； (v)诱导形成包括免疫亲和素配体、免疫亲和素(例如，FKBP52)和/或电压门控L型 钙通道亚基(例如β1亚基)的复合物；和/或(vi)保护神经元免于经历钙诱导的细胞 死亡。
另一方面，本发明提供一种治疗或预防个体的与钙通道功能障碍相关的病症(例如， 与L型钙通道功能相关的病症)的方法。在各实施例中，所述病症与雷诺定受体离子通 道病(ryanodine receptor channelopathy)无关。所述方法包括对个体投与足以治疗或预 防病症的量的免疫亲和素配体。在各实施例中，免疫亲和素配体是以引起以下一种或多 种作用的浓度存在：(i)下调钙信号转导路径中至少一种组分(例如，钙流入通道、NMDA 受体、纤溶酶原活化剂(PLAU)、SHT3R通道)的表达或活性；(ii)降低免疫亲和素 (例如，FKBP52)的活性和/或表达；(iii)降低或抑制钙通道(例如，L型钙通道)的 活性和/或表达；(iv)活化类固醇受体信号转导(例如，糖皮质激素受体信号转导)；(v) 诱导形成包括免疫亲和素配体、免疫亲和素(例如，FKBP52)和/或电压门控L型钙通 道亚基(例如β1亚基)的复合物；和/或(vi)保护神经元免于经历钙诱导的细胞死亡。
上述调节活性和治疗或预防病症的方法的其它实施例可包括以下一个或多个特征。
在一个实施例中，免疫亲和素配体为在mTOR结合区经修饰，例如在雷帕霉素主链 的1位和4位具有杂原子取代基(参看图1A)的雷帕霉素类似物。在其它实施例中， 雷帕霉素类似物在雷帕霉素主链的1位、2位、3位和/或4位具有环状结构。在其它实 施例中，雷帕霉素类似物具有如本文中所述的化学式(例如，式I、Ia和/或Ib)。在其 它实施例中，雷帕霉素类似物具有在本文中称为“雷帕霉素I”和“雷帕霉素II”的化 合物的结构(图1A)。在其它实施例中，相对于其它免疫亲和素(例如，FKBP-12)，免 疫亲和素配体以一定选择性结合例如FKBP-52等免疫亲和素，所述选择性比雷帕霉素的 选择性高至少100、200、300、400、500、600、700、800或更高。
在其它实施例中，可对个体(例如，作为活体内(例如治疗或预防)方案的一部分， 或动物个体(例如，活体内动物模型))中存在的细胞(例如，神经元细胞)执行所述 方法。对于活体内方法，可将单独或与另一药剂组合的免疫亲和素配体(例如，雷帕霉 素或美立霉素类似物)以足以形成复合物和/或使复合物稳定的量投与罹患例如神经变性 病症或心血管病症等病症的个体，例如哺乳动物。
在一些实施例中，例如在对个体投药之前，可通过在活体外测试引起以下一种或多 种作用所需的免疫亲和素配体的量来确定治疗量或剂量：(i)诱导复合物形成；(ii)下 调钙信号转导路径中至少一种组分的表达或活性；(iii)降低或抑制钙通道(例如，L型 钙通道)的活性；和/或(iv)活化类固醇受体信号转导(例如，糖皮质激素受体信号转 导)。活体内方法可任选包括以下步骤：鉴别(例如，评估、诊断、筛选和/或选择)有 患一种或多种与钙通道功能障碍的相关病症(例如，与L型钙通道功能有关的病症)有 关的症状的风险或具有所述症状的个体。在各实施例中，所述病症与雷诺定受体离子通 道病无关。
所述个体可为例如罹患神经变性病症或心血管病症的哺乳动物，例如人类。在各实 施例中，个体为具有一种或多种与钙通道功能障碍的相关病症(例如，与L型钙通道功 能有关的病症)有关的症状的哺乳动物。在各实施例中，所述病症与雷诺定受体离子通 道病无关。举例来说，个体为罹患选自以下一者或多者的病症的哺乳动物(例如，人类 患者)：中风、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、癫痫、心绞痛、心律失常和局部缺血。 在其它实施例中，所述个体为罹患以下一种或多种病症的哺乳动物：偏头痛、神经性疼 痛、急性疼痛、情绪障碍、精神分裂症、抑郁症、焦虑症、小脑性共济失调、迟发性运 动障碍、高血压和/或尿失禁。
可将免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素或美立霉素类似物)单独或与一种或多种药 剂(例如治疗剂)组合投与个体。在一个实施例中，第二药剂为钙通道拮抗剂，例如L 型钙通道拮抗剂。L型钙通道拮抗剂的实例包括二氢吡啶、苯基烷基胺和苯并硫氮杂卓 二苯基丁基哌啶类抗精神分裂症神经安定药。在某些实施例中，组合投与的免疫亲和素 配体和/或钙通道拮抗剂的量低于单独投与的药物的量。所述药剂可同时或依次投与。
另一方面，本发明提供一种刺激神经元细胞(例如，多巴胺能、胆碱能、皮层和脊 髓神经元细胞)的神经突起生长、存活和/或分化中的一者或多者的方法。所述方法包括： 使细胞与免疫亲和素(例如FKBP52)和/或钙通道β亚基(例如，电压门控L型钙通道 β1亚基)的拮抗剂接触。所述拮抗剂也可为免疫亲和素(例如FKBP52)或钙通道β亚 基的活性和/或表达的抑制剂。在一个实施例中，抑制剂为钙通道的细胞内拮抗剂，例如 钙通道β亚基的拮抗剂。在另一实施例中，所述拮抗剂为免疫亲和素配体，例如，如本 文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物。通常，免疫亲和素配体是以足以形成包括配体、 免疫亲和素(或其功能性变异体)和/或钙通道亚基(或其功能性变异体)的复合物和/ 或使所述复合物稳定的量投与。在其它实施例中，所述拮抗剂为免疫亲和素(例如 FKBP52)和/或钙通道β亚基的转录抑制剂，例如RNAi。如本文所述，可在活体外(例 如，在培养过程中)或在活体内(例如，通过投与个体)来实现接触步骤。
如本文所使用，冠词“一”(“a”和“an”)是指所述冠词的一个或一个以上(例 如，至少一个)语法主体。
除非上下文中另作清楚指示，否则术语“或”在本文中用于指术语“和/或”，并且 可与术语“和/或”互换使用。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。
本发明的其它特征、目的和优势将根据实施方式和图式以及权利要求而变得显而易 见。
附图说明
图1A提供雷帕霉素类似物I和II(在图式(和全文)中可分别互换称为“1”和“2”， 或“化合物1”和“化合物2”)的化学合成和结构图。还提供使用本文所参考的编号系 统的雷帕霉素结构。
图1B提供描述皮层神经元中神经元存活响应雷帕霉素类似物I(在图式中称为“化 合物1”)而得到促进的柱状图。
图1C提供描述皮层神经元中神经突起响应雷帕霉素类似物I(在图式中称为“化合 物1”)而生长的图。
图1D提供描述F-11细胞中神经突起响应雷帕霉素类似物I(在图式中称为“化合 物1”)而生长的图。
图2提供展示若干雷帕霉素类似物I、II、FK506以及雷帕霉素的亲和基质的制备的 图。
图3提供通过由F11细胞(小鼠胚胎神经母细胞瘤与大鼠背根神经节(DRG)神经 元的融合物)的溶解产物亲和沉淀而分离的蛋白质的移动性的SDS-PAGE凝胶照片。
图4提供经胰蛋白酶消化的SDS-PAGE凝胶谱带的傅立叶变换离子回旋共振质谱 (Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometric，FT-ICR-MS)分析。“Rap.An. I”表示雷帕霉素类似物I。
图5A-5D描述雷帕霉素类似物I和II的免疫亲和素结合特征。
图5A提供与各种亲和基质结合的蛋白质的SDS-PAGE凝胶分析。标记泳道中所见 的谱带为(1)220kDa、(2)78kDa、(3)45.7kDa；在雷帕霉素类似物I下拉部分 (pull-down fraction)中为(4)肌球蛋白(Myosin)，(5)FKBP52、(6)CACNB1、FKBP25 和FKBP12；在空白珠粒对照中为(7)肌动蛋白；且在雷帕霉素类似物II下拉部分中 为(5)FKBP52和(6)CACNB1。“化合物1”表示雷帕霉素类似物I，并且“化合物 II”表示雷帕霉素类似物II。
图5B提供使用抗FKBP52和抗Ca2+通道β1亚基抗体进行的用于检测涂有雷帕霉素 类似物I和FK506的亲和珠粒上相应抗原的存在的蛋白质免疫印迹分析。
图5C为描述测量结合纯重组免疫亲和素和亲环素(cyclophilin)的[14C]-1部分的尺 寸排阻色谱的结果的柱状图。
图5D为描述测试FKBP25和PPID蛋白与化合物2的结合的亲和色谱的结果的图。 泳道标记如下：“C”表示蛋白质标准品；“+”表示与含化合物2的珠粒一起培育的蛋白 质；“-”表示与空白珠粒一起培育的蛋白质。
图6A-6D描述化合物I和II与L型钙通道β亚基的结合特征。
图6A描述使用相应抗体进行的关于存在CACNB1的部分的蛋白质免疫印迹分析。
图6B为描述测量结合纯重组CACBN1和CACBN4的[14C]-1部分的尺寸排阻色谱 的结果的柱状图。
图6C描述测量在化合物2(1μM)与CACNB1(0-8μM)结合后诱导的荧光淬灭 的荧光分析的结果。
图6D描述测试CACNB1与化合物2的结合的亲和色谱的结果。泳道标记如下：“C” 表示蛋白质标准品；“+”表示与含化合物2的珠粒一起培育的蛋白质；“-”表示与空白 珠粒一起培育的蛋白质。
图7提供使用抗FKBP52抗体沉淀的暴露于各种浓度的雷帕霉素类似物I(0μM、5 μM或50μM)的F11细胞溶解产物的免疫共沉淀物的免疫印迹。用抗Ca2+通道β1亚基 抗体进行免疫沉淀的部分的免疫印迹。下图提供概述蛋白质相互作用的图。“RA I”表示 雷帕霉素类似物I。
图8提供描述使用神经丝蛋白ELISA测定的各种浓度的雷帕霉素类似物I(50μM、 5μM或0μM，)对F11细胞的神经突起生长的影响的柱状图。
图9A-9F描述化合物1和2对钙电流的生物作用。
图9A为由在浸浴液中用5μM化合物1、FK-506或媒剂处理2小时的F-11细胞的 全细胞记录得到的平均Ca2+电流密度的柱状图。记录是用各情形中7个细胞来进行。
图9B描述在0秒(底部迹线)、800秒(中间迹线)时内部施用化合物1(移液管 中10μM)的情况下且在外部存在L型Ca2+通道阻断剂BAY-K 5552(顶部迹线)的情 况下的代表性Ca2+电流。
图9C描述图9B中所述实验的时程图。全细胞及随后化合物1扩散到细胞中是在零 时开始。在400秒后电流稳定后，即在浸浴液中施用10μM BayK-5552。(n＝3)
图9D描述与图9C类似的情形，但在300秒后经由浸浴液施用100nM ωCTX MVIIA。(n＝2)
图9E描述在侵入全细胞(对照)后立即取得的以及在内部施用10μM化合物2和 外部施用ωCTX GVIA的情况下记录10分钟后取得的海马神经元的Ca2+电流迹线。
图9F描述归一化为海马神经元的初始电流的平均反应(+/-SEM)。从零时开始， 经由记录移液管内部施用化合物2(10μM)，其中指示为(●和)。外部溶液含有1μM TTX+100nM ωCTX GVIA+10μM BAY-K 5552(n＝4)，或1μM TTX+100nM ωCTX GVIA(●，n＝5)。无化合物的对照(■)含有外部施用的100nM ωCTX GVIA(n＝3)。
图10A提供描述siRNA驱动的FKBP52和CACNB1减少对神经突起生长的影响的 图。
图10B提供描述siRNA驱动的FKBP52和CACNB1减少对神经元存活的影响的图。
图10C展示蛋白质免疫印迹，其证实siRNA处理在24小时后减少皮层神经元中核 纤层蛋白(lamin)A/C、CACNB1或FKBP52蛋白的表达。
图11A-11B提供人Ca2+通道β1亚基同功异形体1的氨基酸序列和核苷酸序列(分 别为SEQ ID NO：1-2)。
图11C-11D提供人Ca2+通道β1亚基同功异形体2的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：3-4)。
图11E-11F提供人Ca2+通道β1亚基同功异形体3的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO： 5-6)。
图11G-11H提供小鼠(小家鼠(Mus musculus))Ca2+通道β1亚基同功异形体A的 氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：7-8)。
图11I-11J提供小鼠(小家鼠)Ca2+通道β1亚基同功异形体B的氨基酸序列(SEQ ID NO：9-10)。
图12A-12B提供人FKBP52的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：11-12)。
图12C-12D提供小鼠(小家鼠)FKBP52的氨基酸序列(SEQ ED NO：13-14)。
考虑到电压门控钙通道在生理学和病理学功能方面的广泛作用，仍需要鉴别新颖钙 通道活性调节剂并了解其作用机制。
发明内容
本发明揭示调节免疫亲和素和钙通道活性的方法和组合物。在一个实施例中，已显 示，在雷帕霉素(rapamycin)mTOR结合区经修饰的免疫亲和素配体能降低FKBP52和 电压门控L型钙通道、尤其L型钙通道的β1亚基的活性。经证实，所述活性降低与神 经突起生长和神经元存活的伴随增加相关联。在不受理论束缚的情况下，相信FKBP52 和通道活性的降低至少部分是经由形成包括免疫亲和素配体；免疫亲和素(例如 FKBP52)和/或L型钙通道β1亚基中的一者或两者的复合物而发生。因此，本发明提供 使用免疫亲和素配体(例如，在mTOR结合区经修饰的免疫亲和素配体)来调节(例如， 抑制、减弱和/或降低)免疫亲和素和/或L型钙通道β亚基的活性的方法。在其它方面， 还揭示治疗或预防例如神经变性病症和心血管病症等与钙通道功能障碍有关的病况的 方法。另外，本发明涵盖鉴别调节免疫亲和素和/或钙通道亚基的活性的化合物的方法和 试剂。
一方面，本发明提供一种经纯化复合物，其包括免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素 或美立霉素(meridamycin)类似物(例如，已知或未知类似物))，以及(i)免疫亲和 素或其功能性变异体，和/或(ii)钙通道亚基或其功能性变异体中的一者或两者。因此， 本发明的例示性复合物可包括免疫亲和素配体和免疫亲和素或其功能片段；免疫亲和素 配体和钙通道亚基或其功能性变异体；以及免疫亲和素配体、免疫亲和素或其功能性变 异体和钙通道亚基或其功能性变异体。应了解，本发明的复合物还可包括其它多肽或其 片段。
在一个实施例中，雷帕霉素类似物是在雷帕霉素的mTOR结合区经修饰，例如，在 雷帕霉素主链的1位和4位具有杂原子取代基(参看图1A)。在其它实施例中，雷帕霉 素类似物在雷帕霉素主链的1位、2位、3位和/或4位具有环状结构。在其它实施例中， 雷帕霉素类似物具有如本文中所述的化学式(例如，式I、Ia和/或Ib)。在其它实施例 中，雷帕霉素类似物具有在本文中称为“雷帕霉素I”和“雷帕霉素II”(图1A)(在本 文中也分别称为“化合物I”和“化合物II”)的化合物的结构。在其它实施例中，相对 于其它免疫亲和素(例如，FKBP12)，免疫亲和素配体以一定选择性结合例如FKBP-52 等免疫亲和素，所述选择性比雷帕霉素的选择性高至少100、200、300、400、500、600、 700、800倍或更高。
在各实施例中，免疫亲和素为FK506结合蛋白，例如FKBP52(例如哺乳动物 FKBP52)或其功能性变异体。在其它实施例中，钙通道亚基为电压门控L型钙通道亚 基，例如β1亚基(例如哺乳动物β1亚基)或其功能性变异体。本文所述多肽的功能性 变异体包括保留未经修饰形式的一种或多种活性(例如，保留结合免疫亲和素配体和/ 或形成如本文所述的复合物的能力)的片段、突变形式、融合蛋白、经标记形式(例如 放射性标记)。尽管出于阅读的便利，短语“其功能性变异体”可能在全文中重复出现 或可能并未重复出现，但术语“免疫亲和素”和“钙通道”等仍包括“其功能性变异体”。
另一方面，本发明提供一种鉴别测试化合物(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立 霉素类似物)的方法或分析，所述测试化合物能与(i)免疫亲和素(例如，如本文所述 的免疫亲和素(例如FKBP52))(或其功能性变异体)和/或(ii)钙通道亚基(例如， 如本文所述的钙通道亚基(例如β1亚基))(或其功能性变异体)相互作用(或结合)， 和/或调节(例如，降低或增加)其活性。所述方法或所述分析包括：使免疫亲和素和/ 或钙通道亚基与测试化合物在允许发生相互作用和/或活性调节的条件下接触；检测在存 在测试化合物的情况下免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用和/或活性相对于参考物 (例如，参考样本，例如未暴露于测试化合物的对照样本或暴露于雷帕霉素的对照样本) 的变化。在存在测试化合物的情况下，免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用水平和/ 或活性相对于参考物的变化(例如，增加或降低)表明，所述测试化合物与免疫亲和素 和/或钙通道亚基相互作用和/或影响(例如，增加或降低)其活性。
在各实施例中，测试化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基中的一者或两者的相互作 用是通过形成复合物(例如，以下一者或多者的复合物：测试化合物与免疫亲和素；测 试化合物与钙通道亚基；或测试化合物、免疫亲和素与钙通道亚基)来检测。在存在测 试化合物的情况下，所述复合物的形成和/或稳定性相对于参考物的变化表明，所述测试 化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基中的一者或两者相互作用。
另一方面，本发明提供一种鉴别神经营养和/或神经保护化合物的方法或分析。所述 方法或所述分析包括：使(i)免疫亲和素(例如，如本文所述的免疫亲和素(例如 FKBP52))(或其功能性变异体)和/或(ii)钙通道亚基(例如，如本文所述的钙通道亚 基(例如β1亚基))(或其功能性变异体)与测试化合物在允许发生相互作用和/或活性 调节的条件下接触；检测在存在测试化合物的情况下免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互 作用和/或活性相对于参考物(例如，参考样本，例如未暴露于测试化合物的对照样本或 暴露于雷帕霉素的对照样本)的变化。在存在测试化合物的情况下，免疫亲和素和/或钙 通道亚基相对于参考物的相互作用水平的增加和/或活性降低将指示潜在神经营养和/或 神经保护化合物。在各实施例中，测试化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用 的增加是通过两种或两种以上上述组分的复合物的形成和/或稳定性的增加来检测。在其 它实施例中，活性降低是通过检测钙通道活性的降低(例如，如本文中更详细描述)来 确定。可例如通过测量糖皮质激素受体活化来检测免疫亲和素活性的降低。
上述筛选方法和分析的其它实施例可包括以下一个或多个特征：
在各实施例中，免疫亲和素和/或钙通道亚基存在于样本中。所述样本可为细胞溶解 产物或重构系统(例如，细胞膜或可溶组分)。或者，所述样本可包括培养(例如，纯 化培养)的细胞，或重组细胞，或动物个体的活体内细胞。测试化合物或神经营养化合 物与免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用和/或活性的变化可通过检测以下一种或多 种变化来确定：例如通过生物化学检测、基于亲和力的检测(例如，蛋白质免疫印迹 (Western blot)、亲和柱)、免疫沉淀、基于荧光共振能量转移(FRET)的分析、分光光 度方式(例如，圆二色谱、吸光度和溶液特性的其它测量法)检测的复合物本身的结合 或实际形成的变化；例如钙依赖性磷酸化和/或转录活性(例如，如本文所述的转录谱) 等信号转导的变化，例如增加或降低；钙通道活性(例如，电生理学活性、钙动力学) 的变化，例如增加或降低；和/或神经元存活、分化和/或神经突起生长的变化，例如增 加或降低。在一个实施例中，鉴别测试化合物或神经营养化合物并以相同或不同分析再 测试。举例来说，以活体外或无细胞系统鉴别测试化合物或神经营养化合物，并且以动 物模型或基于细胞的分析进行再测试。可使用任何分析次序或组合。举例来说，可将高 通量分析与动物模型或组织培养组合使用。
在其它实施例中，所述方法或分析包括：提供基于接近程度依赖性信号产生的步骤， 例如包括第一融合蛋白(例如，包含免疫亲和素部分的融合蛋白)和第二融合蛋白(例 如，包含β亚基部分的融合蛋白)的双杂交分析；使双杂交分析与测试化合物在一定条 件下接触，其中所述双杂交分析检测复合物的形成和/或稳定性的变化，例如，复合物的 形成将起始报告基因的转录活化。
在其它实施例中，所述方法或分析进一步包括以下步骤：使免疫亲和素和/或钙通道 亚基与已知的免疫亲和素配体(例如，如本文所述，在雷帕霉素的mTOR结合区经修饰 的雷帕霉素类似物)接触；检测在不存在或存在测试化合物的情况下，已知的免疫亲和 素配体与免疫亲和素和/或钙通道亚基的相互作用和/或活性。在存在或不存在测试化合 物的情况下，免疫亲和素和/或钙通道亚基的结合(例如，复合物形成)和/或活性的变 化将指示，所述测试化合物与免疫亲和素和/或钙通道亚基相互作用和/或结合。
在其它实施例中，所述方法或分析进一步包括以下步骤：将测试化合物与复合物的 结合与已知的免疫亲和素配体与复合物的结合相比较。另外，所述方法或分析可任选包 括：检测相对于测试化合物与个别组分的相互作用，测试化合物与免疫亲和素和/或钙通 道亚基的复合物的相互作用(例如，结合)。
在一些实施例中，所述方法另外包括评估神经元活性(例如，神经元存活、分化和 /或神经突起生长中的一者或多者)的变化(例如，增加或降低)的步骤。神经元存活、 分化和/或神经突起生长中的一者或多者的增加将指示神经营养和/或神经保护化合物。 评估步骤可在培养的细胞或如本文所述的动物模型中进行。
候选测试化合物或神经营养化合物能增加本文所述的复合物的形成，和/或抑制钙通 道或免疫亲和素活性。在一个实施例中，测试化合物以比结合复合物的个别组分的亲和 力高的亲和力结合复合物。测试化合物或神经营养化合物可为天然产物或化学合成的化 合物。举例来说，测试化合物可为从天然存在或经修饰(例如，重组修饰)的原核生物 (例如，放射菌类(Actinomycete)，诸如链霉菌(Streptomyces)，例如吸水链霉菌(S. hygroscopicus))或真核生物(例如，真菌或哺乳动物)细胞获得的聚酮。在各实施例中， 测试化合物为雷帕霉素或美立霉素，或其类似物(例如，本文所述的雷帕霉素或美立霉 素化合物，或其类似物)。
本文所揭示和/或通过本文所述的方法或分析鉴别的化合物也在本发明的范围内。本 发明还揭示包括本发明的化合物和医药学上可接受的载剂的组合物，例如医药组合物。 在一个实施例中，所述组合物包括本发明的化合物与一种或多种药剂(例如，治疗剂) 的组合。在一个实施例中，第二药剂为钙通道拮抗剂，例如L型钙通道拮抗剂。L型钙 通道拮抗剂的实例包括二氢吡啶、苯基烷基胺和苯并硫氮杂卓二苯基丁基哌啶类抗精神 分裂症神经安定药。在某些实施例中，所投与的在组合物中存在的免疫亲和素配体和/ 或钙通道拮抗剂的量低于单独投与的组合物中存在的药物的量。
另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含一个或多个编码本文所揭示的复合物 的一种或多种多肽成分的核酸。在一个实施例中，宿主细胞含有第一核酸，其包括编码 免疫亲和素(例如FKBP52，例如哺乳动物FKBP52)(或其功能性变异体)的核苷酸序 列；和/或第二核酸，其包括编码电压门控L型钙通道亚基(例如β1亚基，例如哺乳动 物β1亚基)(或其功能性变异体)的核苷酸序列。在一些实施例中，重组免疫亲和素和 钙通道亚基和/或其控制调控序列是通过外源方式添加。
另一方面，本发明提供一种结合本文所揭示的复合物的抗体，或其抗原结合片段。 在某些实施例中，抗体或其片段能增加本文所揭示的复合物的形成。在其它实施例中， 抗体或其片段能减少或抑制本文所揭示的复合物的形成。在一个实施例中，抗体或其片 段选择性结合复合物，但不会显著结合复合物的个别组分。如本文所述，所述复合物可 包括免疫亲和素配体或测试化合物和免疫亲和素和/或钙通道。
另一方面，本发明提供一种制造抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括：使 用本文所述的复合物作为抗原(例如，动物模型或噬菌体呈现选择中的免疫原)；和根 据与复合物的结合，选择抗体或其结合片段。所述方法可任选包括以下步骤：确定抗体 或其片段与复合物的结合；和比较抗体与所述复合物的个别组分或与含有所述复合物的 三种组分的复合物的结合。优选相对于个别组分或其复合物，选择性结合所述复合物的 抗体或其片段。
另一方面，本发明提供一种调节(例如降低)免疫亲和素(或其功能性变异体)和 /或钙通道亚基(或其功能性变异体)的活性的方法。所述方法包括：使(i)免疫亲和 素(例如，如本文所述的FKBP52)和/或(ii)钙通道亚基(例如，如本文所述的β1亚 基)中的一者或两者与免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似 物)在允许发生相互作用(例如结合)的条件下接触。在各实施例中，活性的调节(例 如增加)将指示包括免疫亲和素配体以及免疫亲和素和/或钙通道亚基中的一者或两者的 复合物的形成和/或稳定性。在一个实施例中，接触步骤可在活体外，例如在细胞溶解产 物或重构系统中实现。或者，可对培养(例如，活体外或离体)的细胞执行本方法。举 例来说，可在活体外培养细胞(例如，纯化或重组细胞)，并且可通过将免疫亲和素配 体(例如，雷帕霉素或美立霉素类似物)加入培养基中来实现接触步骤。通常，所述细 胞为哺乳动物细胞，例如人类细胞。在一些实施例中，所述细胞为神经元细胞或心血管 细胞。
另一方面，本发明提供一种调节(例如，抑制)细胞中的钙通道活性(例如，电压 门控钙通道活性)和/或免疫亲和素活性的方法。所述方法包括：使表达(i)免疫亲和 素(例如FKBP52，例如哺乳动物FKBP52)(或其功能性变异体)和/或(ii)电压门控 L型钙通道亚基(例如β1亚基，例如哺乳动物β1亚基)(或其功能性变异体)的细胞与 免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)在允许发生配体与 免疫亲和素和/或亚基中的一者或两者的相互作用(例如，包括所述物质的复合物的形成) 的条件下接触，由此抑制钙通道和/或免疫亲和素活性。通常，所述细胞为哺乳动物细胞， 例如人类细胞。在一些实施例中，所述细胞为神经元细胞或心血管细胞。所述方法可利 用如本文所述的培养基中的细胞来进行。
另一方面，本发明提供一种增加例如神经突起生长和/或存活等神经元功能的方法。 所述方法包括：使神经元细胞与足以促进神经元功能的量的免疫亲和素配体接触。在各 实施例中，免疫亲和素配体是以引起以下一种或多种作用的浓度存在：(i)下调钙信号 转导路径中至少一种组分(例如，钙流入通道、谷氨酸的N-甲基D-天冬氨酸亚型(NMDA) 受体、纤溶酶原活化剂(PLAU)、SHT3R通道)的表达和/或活性；(ii)降低免疫亲和 素(例如，FKBP52)的活性和/或表达；(iii)降低或抑制钙通道(例如，L型钙通道) 的活性和/或表达；(iv)活化类固醇受体信号转导(例如，糖皮质激素受体信号转导)； (v)诱导形成包括免疫亲和素配体、免疫亲和素(例如，FKBP52)和/或电压门控L型 钙通道亚基(例如β1亚基)的复合物；和/或(vi)保护神经元免于经历钙诱导的细胞 死亡。
另一方面，本发明提供一种治疗或预防个体的与钙通道功能障碍相关的病症(例如， 与L型钙通道功能相关的病症)的方法。在各实施例中，所述病症与雷诺定受体离子通 道病(ryanodine receptor channelopathy)无关。所述方法包括对个体投与足以治疗或预 防病症的量的免疫亲和素配体。在各实施例中，免疫亲和素配体是以引起以下一种或多 种作用的浓度存在：(i)下调钙信号转导路径中至少一种组分(例如，钙流入通道、NMDA 受体、纤溶酶原活化剂(PLAU)、SHT3R通道)的表达或活性；(ii)降低免疫亲和素 (例如，FKBP52)的活性和/或表达；(iii)降低或抑制钙通道(例如，L型钙通道)的 活性和/或表达；(iv)活化类固醇受体信号转导(例如，糖皮质激素受体信号转导)；(v) 诱导形成包括免疫亲和素配体、免疫亲和素(例如，FKBP52)和/或电压门控L型钙通 道亚基(例如β1亚基)的复合物；和/或(vi)保护神经元免于经历钙诱导的细胞死亡。
上述调节活性和治疗或预防病症的方法的其它实施例可包括以下一个或多个特征。
在一个实施例中，免疫亲和素配体为在mTOR结合区经修饰，例如在雷帕霉素主链 的1位和4位具有杂原子取代基(参看图1A)的雷帕霉素类似物。在其它实施例中， 雷帕霉素类似物在雷帕霉素主链的1位、2位、3位和/或4位具有环状结构。在其它实 施例中，雷帕霉素类似物具有如本文中所述的化学式(例如，式I、Ia和/或Ib)。在其 它实施例中，雷帕霉素类似物具有在本文中称为“雷帕霉素I”和“雷帕霉素II”的化 合物的结构(图1A)。在其它实施例中，相对于其它免疫亲和素(例如，FKBP-12)，免 疫亲和素配体以一定选择性结合例如FKBP-52等免疫亲和素，所述选择性比雷帕霉素的 选择性高至少100、200、300、400、500、600、700、800或更高。
在其它实施例中，可对个体(例如，作为活体内(例如治疗或预防)方案的一部分， 或动物个体(例如，活体内动物模型))中存在的细胞(例如，神经元细胞)执行所述 方法。对于活体内方法，可将单独或与另一药剂组合的免疫亲和素配体(例如，雷帕霉 素或美立霉素类似物)以足以形成复合物和/或使复合物稳定的量投与罹患例如神经变性 病症或心血管病症等病症的个体，例如哺乳动物。
在一些实施例中，例如在对个体投药之前，可通过在活体外测试引起以下一种或多 种作用所需的免疫亲和素配体的量来确定治疗量或剂量：(i)诱导复合物形成；(ii)下 调钙信号转导路径中至少一种组分的表达或活性；(iii)降低或抑制钙通道(例如，L型 钙通道)的活性；和/或(iv)活化类固醇受体信号转导(例如，糖皮质激素受体信号转 导)。活体内方法可任选包括以下步骤：鉴别(例如，评估、诊断、筛选和/或选择)有 患一种或多种与钙通道功能障碍的相关病症(例如，与L型钙通道功能有关的病症)有 关的症状的风险或具有所述症状的个体。在各实施例中，所述病症与雷诺定受体离子通 道病无关。
所述个体可为例如罹患神经变性病症或心血管病症的哺乳动物，例如人类。在各实 施例中，个体为具有一种或多种与钙通道功能障碍的相关病症(例如，与L型钙通道功 能有关的病症)有关的症状的哺乳动物。在各实施例中，所述病症与雷诺定受体离子通 道病无关。举例来说，个体为罹患选自以下一者或多者的病症的哺乳动物(例如，人类 患者)：中风、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、癫痫、心绞痛、心律失常和局部缺血。 在其它实施例中，所述个体为罹患以下一种或多种病症的哺乳动物：偏头痛、神经性疼 痛、急性疼痛、情绪障碍、精神分裂症、抑郁症、焦虑症、小脑性共济失调、迟发性运 动障碍、高血压和/或尿失禁。
可将免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素或美立霉素类似物)单独或与一种或多种药 剂(例如治疗剂)组合投与个体。在一个实施例中，第二药剂为钙通道拮抗剂，例如L 型钙通道拮抗剂。L型钙通道拮抗剂的实例包括二氢吡啶、苯基烷基胺和苯并硫氮杂卓 二苯基丁基哌啶类抗精神分裂症神经安定药。在某些实施例中，组合投与的免疫亲和素 配体和/或钙通道拮抗剂的量低于单独投与的药物的量。所述药剂可同时或依次投与。
另一方面，本发明提供一种刺激神经元细胞(例如，多巴胺能、胆碱能、皮层和脊 髓神经元细胞)的神经突起生长、存活和/或分化中的一者或多者的方法。所述方法包括： 使细胞与免疫亲和素(例如FKBP52)和/或钙通道β亚基(例如，电压门控L型钙通道 β1亚基)的拮抗剂接触。所述拮抗剂也可为免疫亲和素(例如FKBP52)或钙通道β亚 基的活性和/或表达的抑制剂。在一个实施例中，抑制剂为钙通道的细胞内拮抗剂，例如 钙通道β亚基的拮抗剂。在另一实施例中，所述拮抗剂为免疫亲和素配体，例如，如本 文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物。通常，免疫亲和素配体是以足以形成包括配体、 免疫亲和素(或其功能性变异体)和/或钙通道亚基(或其功能性变异体)的复合物和/ 或使所述复合物稳定的量投与。在其它实施例中，所述拮抗剂为免疫亲和素(例如 FKBP52)和/或钙通道β亚基的转录抑制剂，例如RNAi。如本文所述，可在活体外(例 如，在培养过程中)或在活体内(例如，通过投与个体)来实现接触步骤。
如本文所使用，冠词“一”(“a”和“an”)是指所述冠词的一个或一个以上(例 如，至少一个)语法主体。
除非上下文中另作清楚指示，否则术语“或”在本文中用于指术语“和/或”，并且 可与术语“和/或”互换使用。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。
本发明的其它特征、目的和优势将根据实施方式和图式以及权利要求而变得显而易 见。
附图说明
图1A提供雷帕霉素类似物I和II(在图式(和全文)中可分别互换称为“1”和“2”， 或“化合物1”和“化合物2”)的化学合成和结构图。还提供使用本文所参考的编号系 统的雷帕霉素结构。
图1B提供描述皮层神经元中神经元存活响应雷帕霉素类似物I(在图式中称为“化 合物1”)而得到促进的柱状图。
图1C提供描述皮层神经元中神经突起响应雷帕霉素类似物I(在图式中称为“化合 物1”)而生长的图。
图1D提供描述F-11细胞中神经突起响应雷帕霉素类似物I(在图式中称为“化合 物1”)而生长的图。
图2提供展示若干雷帕霉素类似物I、II、FK506以及雷帕霉素的亲和基质的制备的 图。
图3提供通过由F11细胞(小鼠胚胎神经母细胞瘤与大鼠背根神经节(DRG)神经 元的融合物)的溶解产物亲和沉淀而分离的蛋白质的移动性的SDS-PAGE凝胶照片。
图4提供经胰蛋白酶消化的SDS-PAGE凝胶谱带的傅立叶变换离子回旋共振质谱 (Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometric，FT-ICR-MS)分析。“Rap.An. I”表示雷帕霉素类似物I。
图5A-5D描述雷帕霉素类似物I和II的免疫亲和素结合特征。
图5A提供与各种亲和基质结合的蛋白质的SDS-PAGE凝胶分析。标记泳道中所见 的谱带为(1)220kDa、(2)78kDa、(3)45.7kDa；在雷帕霉素类似物I下拉部分 (pull-down fraction)中为(4)肌球蛋白(Myosin)，(5)FKBP52、(6)CACNB1、FKBP25 和FKBP12；在空白珠粒对照中为(7)肌动蛋白；且在雷帕霉素类似物II下拉部分中 为(5)FKBP52和(6)CACNB1。“化合物1”表示雷帕霉素类似物I，并且“化合物 II”表示雷帕霉素类似物II。
图5B提供使用抗FKBP52和抗Ca2+通道β1亚基抗体进行的用于检测涂有雷帕霉素 类似物I和FK506的亲和珠粒上相应抗原的存在的蛋白质免疫印迹分析。
图5C为描述测量结合纯重组免疫亲和素和亲环素(cyclophilin)的[14C]-1部分的尺 寸排阻色谱的结果的柱状图。
图5D为描述测试FKBP25和PPID蛋白与化合物2的结合的亲和色谱的结果的图。 泳道标记如下：“C”表示蛋白质标准品；“+”表示与含化合物2的珠粒一起培育的蛋白 质；“-”表示与空白珠粒一起培育的蛋白质。
图6A-6D描述化合物I和II与L型钙通道β亚基的结合特征。
图6A描述使用相应抗体进行的关于存在CACNB1的部分的蛋白质免疫印迹分析。
图6B为描述测量结合纯重组CACBN1和CACBN4的[14C]-1部分的尺寸排阻色谱 的结果的柱状图。
图6C描述测量在化合物2(1μM)与CACNB1(0-8μM)结合后诱导的荧光淬灭 的荧光分析的结果。
图6D描述测试CACNB1与化合物2的结合的亲和色谱的结果。泳道标记如下：“C” 表示蛋白质标准品；“+”表示与含化合物2的珠粒一起培育的蛋白质；“-”表示与空白 珠粒一起培育的蛋白质。
图7提供使用抗FKBP52抗体沉淀的暴露于各种浓度的雷帕霉素类似物I(0μM、5 μM或50μM)的F11细胞溶解产物的免疫共沉淀物的免疫印迹。用抗Ca2+通道β1亚基 抗体进行免疫沉淀的部分的免疫印迹。下图提供概述蛋白质相互作用的图。“RA I”表示 雷帕霉素类似物I。
图8提供描述使用神经丝蛋白ELISA测定的各种浓度的雷帕霉素类似物I(50μM、 5μM或0μM，)对F11细胞的神经突起生长的影响的柱状图。
图9A-9F描述化合物1和2对钙电流的生物作用。
图9A为由在浸浴液中用5μM化合物1、FK-506或媒剂处理2小时的F-11细胞的 全细胞记录得到的平均Ca2+电流密度的柱状图。记录是用各情形中7个细胞来进行。
图9B描述在0秒(底部迹线)、800秒(中间迹线)时内部施用化合物1(移液管 中10μM)的情况下且在外部存在L型Ca2+通道阻断剂BAY-K 5552(顶部迹线)的情 况下的代表性Ca2+电流。
图9C描述图9B中所述实验的时程图。全细胞及随后化合物1扩散到细胞中是在零 时开始。在400秒后电流稳定后，即在浸浴液中施用10μM BayK-5552。(n＝3)
图9D描述与图9C类似的情形，但在300秒后经由浸浴液施用100nM ωCTX MVIIA。(n＝2)
图9E描述在侵入全细胞(对照)后立即取得的以及在内部施用10μM化合物2和 外部施用ωCTX GVIA的情况下记录10分钟后取得的海马神经元的Ca2+电流迹线。
图9F描述归一化为海马神经元的初始电流的平均反应(+/-SEM)。从零时开始， 经由记录移液管内部施用化合物2(10μM)，其中指示为(●和)。外部溶液含有1μM TTX+100nM ωCTX GVIA+10μM BAY-K 5552(n＝4)，或1μM TTX+100nM ωCTX GVIA(●，n＝5)。无化合物的对照(■)含有外部施用的100nM ωCTX GVIA(n＝3)。
图10A提供描述siRNA驱动的FKBP52和CACNB1减少对神经突起生长的影响的 图。
图10B提供描述siRNA驱动的FKBP52和CACNB1减少对神经元存活的影响的图。
图10C展示蛋白质免疫印迹，其证实siRNA处理在24小时后减少皮层神经元中核 纤层蛋白(lamin)A/C、CACNB1或FKBP52蛋白的表达。
图11A-11B提供人Ca2+通道β1亚基同功异形体1的氨基酸序列和核苷酸序列(分 别为SEQ ID NO：1-2)。
图11C-11D提供人Ca2+通道β1亚基同功异形体2的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：3-4)。
图11E-11F提供人Ca2+通道β1亚基同功异形体3的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO： 5-6)。
图11G-11H提供小鼠(小家鼠(Mus musculus))Ca2+通道β1亚基同功异形体A的 氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：7-8)。
图11I-11J提供小鼠(小家鼠)Ca2+通道β1亚基同功异形体B的氨基酸序列(SEQ ID NO：9-10)。
图12A-12B提供人FKBP52的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO：11-12)。
图12C-12D提供小鼠(小家鼠)FKBP52的氨基酸序列(SEQ ED NO：13-14)。
具体实施方式
本发明至少部分是基于以下发现：免疫亲和素配体(例如，在mTOR结合区经修饰 的雷帕霉素类似物)与免疫亲和素FKBP52和/或电压门控L型钙通道β1亚基相互作用， 例如结合。通过这些化合物抑制FKBP52和/或CACNB1将刺激神经突起生长和/或神经 元存活。因此，相信这些组分之间的相互作用(和复合物形成)能抑制β1亚基的活性， 并刺激神经突起生长，从而暗示诸如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物等免疫亲和 素配体所展现的对于电压门控L型钙通道的某种神经营养和/或神经保护活性。
另外，申请者已在随附实例中展示，至少一种本文所揭示的免疫亲和素配体(雷帕 霉素类似物II)展示相对于FKBP12结合对FKBP52的结合选择性明显增加，比雷帕霉 素高至少600倍。在不受理论束缚的情况下，相信抑制FKBP52活性将可能通过活化类 固醇(例如糖皮质激素受体)来介导神经突起生长。此外，用本文所揭示的免疫亲和素 配体处理皮层神经元会引起钙信号转导路径的全面下调以及L型钙通道的部分抑制。也 通过选择性降低培养过程中β1亚基和FKBP52的表达来检测对于神经元细胞的神经突 起生长的明显作用。
本文所揭示的资料表明，在mTOR结合区对雷帕霉素进行修饰可明显提供对于 FKBP52具有独特选择性且具有有效神经营养活性的非免疫抑制性化合物。如通过在 FKBP52 siRNA处理的皮层神经元中所观察到的神经突起生长所证实，FKBP52似乎可 能通过活化类固醇受体(包括糖皮质激素受体)来介导免疫亲和素配体介导的神经突起 生长。另外，这些雷帕霉素类似物部分抑制L型Ca2+通道并降低各种Ca2+信号转导蛋白 的转录的能力表明，这些类似物能保护神经元免于经历Ca2+诱导的神经元细胞死亡，这 与其对神经元存活的影响相符。
钙通道存在于包括神经元和心血管组织在内的各种组织中，并且在动物的多个重要 过程中具有重要作用，包括神经递质释放、肌肉收缩、起搏活动以及激素和其它物质的 分泌。钙经由电压门控钙通道进入神经元细胞中将介导多种细胞和生理反应，包括(但 不限于)：调节诸如蛋白激酶C和钙调蛋白依赖性蛋白激酶II等钙依赖性酶的活性；控 制膜电位并引起诸如兴奋性和反复触发模式(repetitive firing pattern)等电学特性；和 增加神经递质的释放。这些过程都涉及到人类病症，诸如神经病症和心血管病症。因此， 如本文中较详细描述，通过形成免疫亲和素-钙通道复合物来抑制电压依赖型钙通道的功 能的方法可用于治疗、预防和/或缓解钙通道病症的症状。
为了能更易于了解本发明，本文和实施方式通篇将较为详细地描述某些术语。
钙通道为允许Ca2+离子从细胞外液受控进入细胞中的跨膜多亚基蛋白质。最常见的 钙通道类型为电压依赖型。动物体内诸如中枢神经系统(CNS)神经元、周围神经细胞 和肌细胞(包括骨骼肌、心肌以及静脉和动脉平滑肌细胞)等“可兴奋”细胞具有电压 依赖型钙通道。电压门控钙通道允许Ca2+离子流入细胞中，并且通常需要去极化以使具 有所述通道的细胞内侧与浸泡细胞的细胞外环境之间的电位差达到某种程度。根据电压 门控钙通道的电生理学和药理学特性，已将其分为L-、N-、P/Q-、R-和T型(评述于凯 特萝(Catterall)，2000；霍格纳德(Huguenard)1996；多芬A.C.(Dolphin，A.C.)(2003) 药理学评述(Pharmacological Reviews)55：607-627中)。L-、N-和P/Q型通道可在正 电位(高电压门控)处活化。T型(或低电压门控)通道描述一大类在负电位处瞬时活 化且对静息电位的变化高度敏感的分子。
高电压门控钙通道是由四种不同的多肽构成：α1、α2δ、β和γ(斯蒂(Stea)等人，1994； 凯特萝(Catterall)，2000中评述)。β亚基(本文中也称为“CACB1”)为由至少四种已 知的单独基因编码的可溶性细胞内蛋白，所述基因各自加工成多个剪接变异体。在各实 施例中，β亚基具有以下一个或多个特征：(i)天然存在的哺乳动物(例如，人类或啮 齿动物)β1亚基的氨基酸序列或其片段，例如，如图11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10)或其片段；(ii)与图11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10)实 质上同源的氨基酸序列或其片段；(iii)由天然存在的哺乳动物(例如，人类或啮齿动物) β1亚基核苷酸序列或其片段编码的氨基酸序列，例如由如图11A-11J中所示的核苷酸序 列(SEQ ID NO：1-10)或其片段编码的氨基酸序列；(iv)由与图11A-11J中所示的核 苷酸序列(SEQ ID NO：1-10)或其片段实质上同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(v) 由天然存在的β1亚基核苷酸序列的简并核苷酸序列或其片段(例如，图11A-11J中所示 的核苷酸序列(SEQ ID NO：1-10)或其片段)编码的氨基酸序列；或(vi)在严格条件 (例如，高严格度条件)下与上述核苷酸序列中的一种序列杂交的核苷酸序列。在一些 实施例中，β亚基或其功能性变异体(例如片段)展现天然存在的序列的一种或多种活 性，包括(但不限于)：(i)形成如本文所述的复合物；(ii)与α亚基相互作用(例如， 结合)；(iii)促进电压门控钙通道(例如α1亚基)定位或穿梭到细胞质膜；(iv)调节 所述通道的门控(例如，改变活化和失活动力学，引起I-V曲线向左移动，和在单通道 水平上，诱导通道开放可能性的增加)；或(v)控制一种或多种本文所述的基因(例如， 钙流入通道、NMDA受体、纤溶酶原活化剂(PLAU)、SHT3R通道)的转录活性。
在其它实施例中，β亚基具有与以下文献中所揭示的序列实质上一致的序列：鲍威 尔(Powers)等人，(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267(32)：22967-22972；柯林 (Collin)等人，(1993)循环研究杂志(Circ.Res.)72(6)：1337-1344；霍根K.(Hogan，K.) 等人，(1999)神经科学通讯(Neurosci.Lett.)277(2)，111-114；弗维尔(Foell)等人，(2004) 生理学与基因组学(Physiol.Genomics)17(2)，183-200(人类β1和β2亚基)；托贝(Toba) 等人，(2005)欧洲神经科学杂志(Eur.J.Neurosci.)22(1)，79-92(鼠科β1亚基同功异 形体)；谢里科夫(Serikov)等人，(2002)生物化学与生物物理学研究(Biochem.Biophys. Res.Commun.)293(5)，1405-1411；浦瑞南(Pragnell)等人，(1991)欧洲生物化学学会 联盟通讯(FEBS Lett.)291(2)，253-258；卡西尔(Cahill)等人，(2000)神经科学杂志 (J.Neurosci.)20(5)，1685-1693(2000)(牛β1、2和3亚基)；罗森菲尔德(Rosenfeld) 等人，(1993)神经学年鉴(Ann.Neurol.)33(1)，113-120；塔韦奥克(Taviaux)等人，(1997) 人类遗传学(Hum.Genet.)100(2)，151-154(人类β2和β4亚基基因)；柯利拉菲特 (Colecraft)等人，(2002)生理学杂志(J.Physiol.)(伦敦(Lond.))541(第2部分)，435-452 (人类β2a、2c、2d和2e亚基)；奥帕托瓦斯基(Opatowsky)等人，(2003)生物化学杂志 (J.Biol.Chem.)278(52)，52323-52332(大鼠β2亚基)；雅玛达(Yamada)等人，(2001) 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(50)，47163-47170(2001)(大鼠β2亚基)；斯特劳斯 伯格(Strausberg)等人，(2002)美国国家科学院院刊(PNAS U.S.A.)99(26)，16899-16903 (人类β3亚基、鼠科β4亚基)；村上(Murakami)等人，(1996)欧洲生物化学杂志(Eur. J.Biochem.)236(1)，138-143(1996)(鼠科钙通道β3亚基)；雅玛达(Yamada)等人，(1995) 基因组学(Genomics)27(2)，312-319(人类钙通道α1亚基(CACNL1A2)和β亚基 (CACNLB3)基因)；陈(Chen)等人，(2004)自然(Nature)429(6992)，675-680(人类β4 亚基)；海尔顿(Helton)等人，(2002)神经科学杂志(J.Neurosci.)22(5)，1573-1582(2002) (β4亚基)；贝都(Badou)等人，(2005)科学(Science)307(5706)，117-121(2005)(钙 通道β4亚基)；所有参考文献的内容都以引用的方式并入本文中。其它β亚基序列揭示 于基因库登录号：NP..666235、Q9Y698、Q02641、Q9MZL3和P54288_2中。
免疫亲和素为可溶性胞浆蛋白，其与免疫亲和素配体形成复合物，而所述复合物又 充当信号转导中所涉及的其它细胞靶的配体。免疫亲和素的种类包括亲环素和FK506 结合蛋白(例如，FKBP)，诸如FKBP-12和FBBP-52。环孢菌素A(Cyclosporin A)是 结合亲环素的大环内酯类免疫亲和素配体。应了解，诸如美立霉素、FK506、FK520和 雷帕霉素等其它大环内酯类免疫亲和素配体也结合FKBP。FK506、FK520和雷帕霉素 与FKBP的结合通常是通过聚酮分子的结构类似的区段(称为“FKBP结合结构域”)发 生。
已在人类基因组中发现对应于超过两打FKBP的基因序列(道南(Dornan)等人，医 药化学当前论题(Curr.Top.Med.Chem.)3，1392-1409(2003))。这些基因序列在中枢神 经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)组织中的表达比在免疫组织中高10-50倍(莱 昂斯(Lyons)等人，神经科学杂志(J.Neurosci.)15，2985-2994(1995))，并且在神经 疾病发作后，这些序列的表达也会增加(纪平(Kihira)等人，神经病理学(Neuropathology) 22，269-274(2002))。有趣的是，据报导，FKBP12、FKBP12.6和FKBP 52都为通道门 控FKBP蛋白，其调节雷诺定受体(RYR)(黄(Huang)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl.Acad.Sci.USA.)103，3456-3461(2006))、肌醇1，4，5-三磷酸受体(IP3R)(卡梅隆 (Cameron)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)92，1784-1788 (1995))和瞬时受体电位通道(TRPC)(辛金斯(Sinkins)等人，生物化学杂志(J.Biol. Chem.)279，34521-34529(2004))。FKBP52和FKBP51与介导雌激素、雄激素和糖皮 质激素下游反应的三类类固醇受体复合物缔合(斯泰纳(Steiner)等人，美国国家科学 院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)94，2019-2024(1997))。核FKBP25经由与组蛋白 去乙酰酶、酪蛋白激酶II、核仁素(nucleolin)和转录因子YY1缔合来调控基因表达(姚 (Yao)和杨(Yang)，癌症药靶研究最新进展(Curr.Cancer Drug Targets)5，595-610 (2005))。FKBP38组成性失活并位于线粒体和内质网中。有趣的是，FKBP38与Bcl-2 结合需要高含量的Ca2+和钙调蛋白(CaM)(埃德里奇(Edlich)等人，欧洲分子生物学 杂志(EMBO J.)24，2688-2699(2005))。免疫亲和素配体通过破坏天然含FKBP复合 物(古德(Gold)药物代谢研究(Drug Metab.Rev.)31，649-663(1999)；埃德里奇(Edlich) 等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)281，14961-14970(2006))并通过形成诸如 FKBP12-FK506-钙神经素(calcineurin)或FKBP12-雷帕霉素-雷帕霉素的哺乳动物靶 (mTOR)等新复合物(基辛格(Kissinger)等人，自然(Nature)378，641-644(1995)； 崔(Choi)等人，科学(Science)273，239-42(1996))来引起各种下游生物活性。
FKBP52是免疫亲和素FK506结合种类的成员。FK506与糖皮质激素受体(GR)相 关FKBP52的结合导致响应地塞米松(dexamethasone)而增加GR的核转位以及GR介 导的基因表达的增强(桑切斯(Sanchez)和宁(Ning)(1996)方法：酶学方法指南 (Methods：A Companion to Meth.Enzymol.)9：188-200)。诸如FKBP52和CyP40等免疫 亲和素以及诸如PP5、p60和Mas70p等非免疫亲和素蛋白具有一个或多个结合hsp90的 三角四肽重复(TPR)结合结构域的TPR结构域(拉塔伊恰克(Ratajczak)等人，(1993) 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：13187-13192)。蛋白质中TPR结构域的数量似乎与 其hsp90结合亲和力相关。邻接TPR结构域的区域也参与结合，例如FKBP52的残基 232-271(拉塔伊恰克(Ratajczak)和卡雷罗(Carrello)(1996)，同上文)。
在一些实施例中，免疫亲和素具有以下一个或多个特征：(i)天然存在的哺乳动物 (例如，人类或啮齿动物)FKBP52的氨基酸序列或其片段，例如，如图12A-12D中所 示的氨基酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段；(ii)与图12A-12D中所示的氨基酸序 列(SEQ ID NO：11-14)实质上同源的氨基酸序列或其片段；(iii)由天然存在的哺乳动 物(例如，人类或啮齿动物)FKBP52核苷酸序列或其片段编码的氨基酸序列，例如由 如图12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段编码的氨基酸序列； (iv)由与图12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段实质上同源的 核苷酸序列编码的氨基酸序列；(v)由天然存在的FKBP52核苷酸序列的简并核苷酸序 列或其片段(例如，图12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段) 编码的氨基酸序列；或(vi)在严格条件(例如，高严格度条件)下与上述核苷酸序列 中的一种序列杂交的核苷酸序列。在一些实施例中，FKBP52或其功能性变异体(例如 片段)展现天然存在的序列的一种或多种活性，包括(但不限于)：形成如本文所述的 复合物；结合FK506；响应地塞米松而增加糖皮质激素受体的核转位；增强糖皮质激素 受体介导的基因表达；和/或结合热休克蛋白，例如hsp90。
FKBP52的例示性氨基酸和核苷酸序列揭示于以下文献中：桑切斯(Sanchez)等人， (1990)生物化学(Biochemistry)29(21)，5145-5152；和皮蒂(Peattie)等人，(1992)美 国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Set U.S.A.)89(22)，10974-10978，两篇文献的内容 都以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，本发明的β亚基或免疫亲和素多肽包括(但不限于)来自任何动 物物种(包括人类、啮齿动物)的天然多肽的片段以及其(人类和非人类)多肽和其片 段的变异体(例如，功能性变异体)，条件是所述多肽具有与个别天然多肽相同的生物 活性。在一个实施例中，“片段”包含在成熟天然多肽的序列内的区域。非全长β亚基 或免疫亲和素(例如FKBP52)的任何形式都可用于本发明的方法和组合物中，条件是： 其仍具有功能，例如，保留天然存在的序列的至少一种活性(例如，保留形成如本文所 述的复合物的能力)。非全长β亚基可通过在宿主细胞中表达编码全长β亚基蛋白的多 聚核苷酸的相应片段而产生。这些相应多聚核苷酸片段也为本发明的一部分。可通过标 准分子生物学技术产生如上文所述的经修饰多聚核苷酸，所述技术包括适当需要的缺失 突变体的构造、定点突变诱发法或使用适当寡聚核苷酸引物进行的聚合酶链反应。
多肽或其片段的“变异体”(诸如，β1亚基或FKBP52的变异体)包括嵌合蛋白、 经标记蛋白(例如，放射性标记的蛋白)、融合蛋白、突变蛋白、具有类似(例如，实 质上类似)序列的蛋白质(例如，具有氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失、 插入的蛋白质)、蛋白质片段、模拟物，只要所述变异体具有天然蛋白质的至少一部分 氨基酸序列或具有大部分序列与天然蛋白一致的氨基酸序列的至少一部分即可。“功能 性变异体”包括保留天然蛋白质的至少一种功能(例如，保留使免疫亲和素配体与如本 文所述的复合物相互作用和/或形成所述复合物的能力)的变异体。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”为编码多肽的第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的融 合物，其中所述第一与第二氨基酸序列并非作为单一多肽链的一部分天然存在。
如本文所使用，术语“实质上类似”(或“实质上”或“充分”“同源”或“一致”) 在本文中用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足量与第二氨基酸或核苷酸序列一致或 相同(例如，具有类似侧链，例如保守氨基酸取代)的氨基酸残基或核苷酸，以致第一 与第二氨基酸或核苷酸序列具有类似活性。与本文所揭示的序列类似或同源(例如，至 少约85％序列一致性)的序列也为本申请案的一部分。在一些实施例中，序列一致性可 为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。另外，当 核酸区段在选择性杂交条件(例如，高严格度杂交条件)下与所述链的互补序列杂交时， 会存在显著一致性。核酸可存在于全细胞中、细胞溶解产物中或以部分纯化或实质上纯 形式存在。
两个序列之间“同源性”或“序列一致性”(所述术语在本文中可互换使用)的计 算如下进行。比对序列以达到最佳比较的目的(例如，为了实现最佳比对，可在第一和 第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位，并且出于比较的目的，可忽略非同 源序列)。通常，为进行比较而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％、优 选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％且甚至更优选至少70％、80％、90％、 100％。随后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的 位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在此位置处 一致(如本文所使用，氨基酸或核酸“一致性”与氨基酸或核酸“同源性”等效)。两 个序列之间的一致性百分比随所述序列所共有的一致位置的数量而变化，其中需考虑为 获得两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数量和各空位的长度。
序列的比较和两个序列之间一致性百分比的测定可使用数学算法实现。在一个实施 例中，使用尼德曼(Needleman)和伍斯奇(Wunsch)((1970)分子生物学(J.Mol.Biol.) 48：444-453)算法来测定两个氨基酸序列之间的一致性百分比，所述算法已并入GCG软 件包中的市售GAP程序中，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、 10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一实施例中，使用 GCG软件包中的市售GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、3070 或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个核苷酸序列之间的一致 性百分比。测定同源性百分比通常使用的参数为Blossum 62得分矩阵，其中空位罚分为 12，空位延伸罚分为4且移码空位罚分为5。还可使用E.梅耶斯(E.Meyers)和W.米勒 (W.Miller)((1989)生物科学中的计算机应用(CABIOS)4：11-17)算法来测定两个氨 基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比，所述算法已并入ALIGN程序(2.0版)中，其 使用PAM120残基权重表，空位长度罚分为12且空位罚分为4。
如本文所使用，术语“在严格条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。所属领域技术 人员已知严格条件，并且所述条件可见于现代分子生物学规程(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威立父子出版公司(John Wiley & Sons)，纽约(N.Y.)(1989)， 6.3.1-6.3.6中。此文献中描述了水性和非水性方法并且可使用任一种方法。严格杂交条 件的实例为在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后在50℃下以0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。另一严格杂交条件的实例为在约45℃下在6X SSC中 杂交，随后在55℃下以0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。另一严格杂交条件的实 例为在约45℃下在6X SSC中杂交，随后在60℃下以0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或 多次。通常，严格杂交条件为在约45℃下在6X SSC中杂交，随后在65℃下以0.2X SSC、 0.1％SDS洗涤1次或20次以上。更常见的是，所使用的高严格度条件为在65℃下在 0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，随后在65℃下以0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或多次。
应了解，本文所揭示的多肽的变异体可能具有其它保守或非必需氨基酸取代，这不 会明显影响抗原结合或其它免疫球蛋白功能。“保守氨基酸取代”为氨基酸残基由具有 类似侧链的氨基酸残基置换的取代。所属领域中已确定具有类似侧链的氨基酸残基家 族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、 酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如， 苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨 酸)。
“非必需”氨基酸残基为可由杂交抗体的野生型序列发生改变并且不会消除或更优 选实质上不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基则会引起所述变化。
免疫亲和素配体
免疫亲和素配体与免疫亲和素结合以活化其它细胞靶，主要是免疫和神经系统中的 细胞靶。数种免疫亲和素为免疫抑制性的，例如环孢菌素A、FK506和雷帕霉素，而其 它较低免疫抑制性免疫亲和素则展现神经营养活性。举例来说，美立霉素为实质上非免 疫抑制性的，并且在活体外展现明显的神经保护活性(何M.(He，M.)等人，US 2005/0272133，2005年12月8日公开；和格拉斯安尼E.(Graziani，E.)等人，US 2005/0197356，2005年9月8日公开)。通过本发明方法鉴别或用于本发明方法中的免 疫亲和素配体优选为实质上非免疫抑制性的，但保留所需活性，例如神经营养活性。优 选的免疫亲和素配体能增加如本文所述的复合物的形成，和/或降低FKBP和/或钙通道 活性。
在一些实施例中，免疫亲和素配体在mTOR结合结构域处经修饰。据悉，雷帕霉素 的mTOR结合结构域位于大环核心，图1A中约1-7位和27-36位处。举例来说，免疫 亲和素配体可在雷帕霉素主链的1位和4位具有杂原子取代基(图1A)。在其它实施例 中，雷帕霉素类似物在1位、2位、3位和/或4位具有环状结构(图1A)。所述雷帕霉 素类似物揭示于2006年6月22日自U.S.S.N.11/300,839公开的共同转让的共同代决的 公开申请案U.S.2006/0135549中，所述申请案的标题为“雷帕霉素类似物和其在治疗神 经病症、增生性病症和炎症性病症方面的用途(Rapamycin Analogues and the Uses Thereof in the Treatment of Neurological，Proliferative，and Inflammatory Disorders)”，其完 整内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，雷帕霉素类似物具有式I：
在上述式中，R1与R2为不同的独立基团，并且选自OR3和N(R3′)(R3″)；或R1与R2 不同，经由单键连接且选自O和NR3。R3、R3′和R3″独立地选自H、C1到C6烷基、C1 到C6经取代烷基、C3到C8环烷基、经取代C3到C8环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳 基和经取代杂芳基。R4和R4′(a)独立地选自H、OH、O(C1到C6烷基)、O(经取代C1 到C6烷基)、O(酰基)、O(芳基)、O(经取代芳基)和卤素；或(b)一起形成与O键结的 双键。R5、R6和R7独立地选自H、OH和OCH3。R8与R9经由(i)单键连接且都为CH2， 或经由(ii)双键连接且都为CH。R15选自C＝O、CHOH和CH2，且n为1或2；或其 医药学上可接受的盐、前药或代谢物。
在其它实施例中，R1与R2经由单键连接且选自O和NR3。在另一实施例中，R1为 O且R2为NR3。
在一个实施例中，R3′或R3″为芳基或经取代芳基，或经取代苯环。在另一实施例中， R3′或R3″处的经取代苯基包括具有以下结构的环：
R10、R11、R12、R13和R14独立地选自H、C1到C6烷基、经取代C1到C6烷基、芳 基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、卤素、酰基、OH、O(烷基)、O(经取代烷基)、 O(芳基)、O(经取代芳基)、O(酰基)、NH2、NH(烷基)、NH(经取代烷基)、NH(芳基)、 NH(经取代芳基)和NH(酰基)。
在其它实施例中，R3、R3′或R3″为任选经1或2个选自C1到C6烷基和卤素的取代 基取代的苯基。在其它实施例中，R3、R3′或R3″为任选经1或2个甲基或氯基取代基取 代的苯基，例如苯基和3-甲基，4-氯苯基。
在一个实施例中，R4或R4′为OH或O(酰基)，例如其中所述酰基为任选经烷基取代 的-C(O)-，具体说来，其中烷基可为直链或支链并且例如任选经诸如芳香族杂环(诸如 吡啶基)等杂环取代。实例为：
在其它实施例中，式I的雷帕霉素类似物包括R5、R6和R7为OCH3的雷帕霉素类 似物，雷帕霉素主链的17-22位的含氮环为哌啶环或R15为羰基的雷帕霉素类似物。
在一个实施例中，雷帕霉素类似物具有式Ia：
其中R1、R2、R8和R9如上文所述加以定义。
在另一实施例中，雷帕霉素类似物具有下式Ib：
在式Ib中，R独立地选自H、C1到C6烷基、经取代C1到C6烷基、芳基、经取代 芳基、杂芳基、经取代杂芳基、卤素、酰基、OH、O(烷基)、O(经取代烷基)、O(芳基)、 O(经取代芳基)、O(酰基)、NH2、NH(烷基)、NH(经取代烷基)、NH(芳基)、NH(经取代 芳基)和NH(酰基)，并且m为1到5。
特定雷帕霉素类似物描述于本文中，并且包括：9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基 环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基 -6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基 -4，9，10，12，13，14，15，16，17，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-二十一氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；37-(4-氯-3-甲基苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙 基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；37-(2，6-二氯苯基)-9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二 甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十 九氢-3H-23，27-环氧基-18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷 -1，5，11，28，29(6H，31H)-戊酮；9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙 基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊酮 与2，2-二甲基-3-(吡啶-2-基)-丙酸的酯；37-(2，6-二氯苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3- 甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；或其医药学上可接受的盐、前药或代谢物。本发明不限于这些说明性化合物。
在另一实施例中，特定化合物包括下述各物：
雷帕霉素I 雷帕霉素II
本申请案通篇所提及的雷帕霉素类似物I和II是从上图左式开始，分别由第一和第 二化学结构表示。
雷帕霉素类似物还包括R1与R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R3为苯基， R4为OH，R5-R7为OCH3且R8和R9为HC＝CH的化合物；R1为OR3，R2为N(R3′)(R3″)， R3为H，R3′为H，R3″为苯基，R4为OH，R5-R7为OCH3且R8和R9为H2C-CH2的化合 物；R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R3为苯基，R4为OH，R5-R7为OCH3 且R8和R9为H2C-CH2的化合物；R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R4为 OH，R5-R7为OCH3，R8和R9为HC＝CH且R3为下式的化合物：
R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R4为OH，R5-R7为OCH3，R8和R9 为HC＝CH且R3为下式的化合物：
R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R3为苯基，R5-R7为OCH3，R8和R9 为HC＝CH且R4为下式的化合物：
以及R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R4为OH，R5-R7为OCH3，R8 和R9为H2C-CH2且R3为下式的化合物：
所述化合物可含有一个或多个不对称碳原子，并且一些化合物可含有一个或多个不 对称(手性)中心且因此能产生光学异构体和非对映异构体。尽管并未关于立体化学予 以展示，但当所述化合物可含有一个或多个手性中心时，优选至少一个手性中心具有S- 立体化学。因此，所述化合物包括所述光学异构体和非对映异构体；以及外消旋和拆分 的对映异构纯的立体异构体；以及R与S立体异构体的其它混合物，和其医药学上可接 受的盐、水合物、代谢物和前药。
术语“烷基”在本文中用于指具有1到10个碳原子且合意地约1到8个碳原子的 直链和支链饱和脂肪族烃基。术语“烯基”在本文中用于指具有一个或多个碳碳双键且 含有约2到10个碳原子的直链和支链烷基。在一个实施例中，术语烯基是指具有1或2 个碳碳双键且具有2到约6个碳原子的烷基。术语“炔基”在本文中用于指具有一个或 多个碳碳三键且具有2到8个碳原子的直链和支链烷基。在另一实施例中，术语炔基是 指具有1或2个碳碳三键且具有2到6个碳原子的烷基。
术语“环烷基”在本文中用于指具有环状结构且具有约4到10个碳原子或约5到8 个碳原子的如前文所述的烷基。
术语“经取代烷基”、“经取代烯基”和“经取代炔基”分别是指具有一个或多个取 代基的烷基、烯基和炔基，所述取代基包括(不限于)卤素、CN、OH、NO2、氨基、 芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷基羧基和芳基硫基，所述基团可任选经 例如1到4个包括以下基团的取代基取代：卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷 基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳基 硫基。这些取代基可连接到烷基、烯基或炔基的任一碳上，只要所述连接构成稳定化学 部分即可。
如本文所使用，术语“芳基”是指例如具有6-20个碳原子的芳香族系统，其可包括 单环或者稠合或键联在一起的多个芳香环(例如，2个或3个)，其中所述稠合或键联环 的至少一部分形成共轭芳香族系统。芳基可包括(但不限于)苯基、萘基、联苯、蒽基、 四氢萘基、菲基、茚、苯并萘基、芴基和咔唑基。
术语“经取代芳基”是指经一个或多个包括以下基团的取代基取代的芳基：卤素、 CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷 基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳基硫基，所述基团可任选经取代。在一个实施例中， 经取代芳基是经1到4个包括以下基团的取代基取代：卤素、CN、OH、NO2、氨基、 烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基 烷基和芳基硫基。
如本文所使用，术语“杂环”是指稳定的4元到7元单环或多环杂环，其为饱和、 部分饱和或完全不饱和的，包括芳香族基团，诸如吡啶基。杂环具有碳原子和一个或多 个包括氮、氧和硫原子的杂原子。在一个实施例中，杂环在环主链中具有1到4个杂原 子。当杂环在环主链中含有氮或硫原子时，所述氮或硫原子可经氧化。术语“杂环”还 指杂环与芳基环稠合得到的例如具有9到20个环成员的多环。杂环可经由杂原子或碳 原子与芳基环连接，条件是所得杂环结构在化学上稳定。所属领域中已知多种杂环基团， 并且所述基团包括(不限于)含氧环、含氮环、含硫环、含混合杂原子的环、含杂原子 的稠环和其组合。含氧环包括(但不限于)呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、吡哺酮基和 二氧杂环己烯基环。含氮环包括(不限于)吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、吡啶基、 哌啶基、2-氧代哌啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、氮杂卓基、三嗪基、吡咯 烷基和氮杂卓基环。含硫环包括(不限于)噻吩基和二硫醇基环。含混合杂原子的环包 括(但不限于)氧硫杂环戊烯基(oxathiolyl)、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁三唑基、 二噁唑基、噁噻唑基、氧硫杂环戊烯基、噁嗪基、噁噻嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、硫 代吗啉基亚砜、氧杂卓基(oxepinyl)、硫杂卓基(thiepinyl)和二氮杂卓基环。含杂原 子的稠环包括(但不限于)苯并呋喃基、硫茚(thionaphthene)、吲哚基、氮茚基 (benazazolyl)、purindinyl、吡喃并吡咯基、异吲唑基、茚洛秦基(indoxazinyl)、苯并噁 唑基、邻苯甲内酰胺基(anthranilyl)、苯并吡喃基、喹啉基、异喹啉基、benzodiazonyl、 萘啶基(naphthylridinyl)、苯并噻吩基、吡啶并吡啶基、苯并噁嗪基、氧杂蒽基(xanthenyl)、 吖啶基和嘌呤基环。
如本文所使用，术语“经取代杂环”是指具有一个或多个包括以下基团的取代基的 杂环基团：卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧 基、烷基氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳基硫基，所述基团可任选经取代。 在一个实施例中，经取代杂环基团是经1到4个取代基取代。
术语“酰基”是指-C(O)-基团，其在碳原子处经取代。酰基可经取代，或为末端酰 基，诸如HC(O)-基团。取代基可包括上文关于烷基所述的任一取代基，即一个或多个包 括(不限于)卤素、CN、OH、NO2、氨基、芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、烷基羰 基、烷基羧基和芳基硫基的取代基，所述基团可任选经取代。实例包括-C(O)-烷氧基(例 如，-OMe或-OEt)或-C(O)-烷基，其中烷基可为直链或支链且任选经例如杂环基(诸如 吡啶基)取代。
如本文所使用，术语“烷氧基”是指O(烷基)基团，其中连接点是通过氧原子且所 述烷基任选经取代。
如本文所使用，术语“芳氧基”是指O(芳基)基团，其中连接点是通过氧原子且所 述芳基任选经取代。
如本文所使用，术语“烷基氧基”是指烷基OH基团，其中连接点是通过所述烷基。
如本文所使用，术语“芳基硫基”是指S(芳基)基团，其中连接点是通过硫原子且 所述芳基可任选经取代。
如本文所使用，术语“烷基羰基”是指C(O)(烷基)基团，其中连接点是通过羰基部 分的碳原子且所述烷基任选经取代。
如本文所使用，术语“烷基羧基”是指C(O)O(烷基)基团，其中连接点是通过羧基 部分的碳原子且所述烷基任选经取代。
如本文所使用，术语“氨基烷基”是指仲胺和叔胺，其中连接点是通过氮原子且所 述烷基任选经取代。所述烷基可为相同或不同的。
如本文所使用，术语“卤素”是指氯、溴、氟或碘基。
雷帕霉素类似物可由雷帕霉素原料制备。雷帕霉素原料优选包括(不限于)雷帕霉 素、去甲雷帕霉素(norrapamycin)、去氧雷帕霉素、去甲基雷帕霉素或去甲氧基雷帕霉 素，或其医药学上可接受的盐、前药或代谢物。然而，所属领域技术人员将能够容易地 选择可用于制备本发明的新颖雷帕霉素类似物的适当雷帕霉素原料。
术语“去甲基雷帕霉素”是指一类缺少一个或多个甲基的雷帕霉素化合物。可根据 本发明使用的去甲基雷帕霉素的实例包括：29-去甲基雷帕霉素(美国专利第6,358,969 号)、7-O-去甲基-雷帕霉素(美国专利第6,399,626号)、17-去甲基雷帕霉素(美国专利 第6,670,168号)和32-O-去甲基雷帕霉素等。
术语“去甲氧基雷帕霉素”是指一类缺少一个或多个甲氧基的雷帕霉素化合物，且 包括(不限于)32-去甲氧基雷帕霉素。
雷帕霉素类似物可通过将雷帕霉素原料与亲双烯体组合来制备。术语“亲双烯体” 是指与1，3-二烯反应得到[4+2]环加成产物的分子。本发明所用的亲双烯体优选为任选经 取代的亚硝基苯。多种亚硝基苯可用于本发明中，并且其包括亚硝基苯、2，6-二氯亚硝 基苯和1-氯-2-甲基-4-亚硝基苯等。所属领域技术人员将能够容易地选择将有效制备本 发明的雷帕霉素类似物的亚硝基苯的量。优选利用过量的亚硝基苯，并且更优选亚硝基 苯与雷帕霉素原料的比例为5∶1。然而，如所属领域技术人员所测定，也可利用甚至1∶1、 2∶1或3∶1的亚硝基苯与雷帕霉素的比例。
亚硝基苯与雷帕霉素原料是在溶剂中组合。所述溶剂优选能在接触时即溶解亚硝基 苯和/或雷帕霉素，或当反应进行时溶解亚硝基苯和雷帕霉素。可用于本发明中的溶剂包 括(不限于)二甲基甲酰胺、二噁烷(诸如对二噁烷)、氯仿、醇(诸如甲醇和乙醇)、 乙酸乙酯、水、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷和甲苯，或其组合。然而，所属领域技术人 员将能够容易地根据雷帕霉素原料和亚硝基苯的溶解性以及溶剂与所述物质的反应性 来选择适当溶剂。所用溶剂的量视反应规模而定，且具体说来，视反应混合物中存在的 雷帕霉素原料和亚硝基苯的量而定。所属领域技术人员将能够易于测定所需溶剂的量。
通常，将含有亚硝基苯、雷帕霉素原料和溶剂的溶液保持在高温下，且优选保持在 不会促进雷帕霉素和亚硝基苯分解的温度下。在一个实施例中，将所述溶液保持在约30 ℃到约70℃且优选约50℃的温度下。将所述组分加热一段足以允许雷帕霉素与亚硝基 苯发生反应的时间。所属领域技术人员使用已知技术将能够易于监测在加热过程中反应 的进程，并由此测定进行反应所需的时间量。在一个优选实施例中，将雷帕霉素和亚硝 基苯与对二噁烷组合，并保持在约50℃的温度下。
雷帕霉素类似物的分离和纯化在所属领域技术人员的技术范围内，并包括色谱法， 包括(不限于)高效液相色谱(HPLC)，诸如反相HPLC和正相HPLC，以及尺寸排阻 色谱；和再结晶。
获得雷帕霉素类似物后，即可使其还原以形成较为饱和的雷帕霉素类似物。所属领 域技术人员将能够容易地选择用于本发明的适当还原剂。优选可使用氢化试剂来实现雷 帕霉素类似物的还原。所属领域技术人员将能够容易地选择用于本发明的适当氢化试 剂。通常利用支撑物、优选碳支撑物等承载的过渡金属催化剂或过渡金属在存在氢气的 情况下进行还原。在优选实施例中，在存在氢气的情况下，使用碳载钯金属进行还原。
雷帕霉素类似物的还原通常是在溶剂中进行。多种溶剂可用于还原，且包括(不限 于)醇，诸如甲醇。然而，所属领域技术人员将能够视氢化催化剂和所还原的雷帕霉素 类似物而定容易地选择用于本发明的适当溶剂。溶剂的量视反应规模而定且具体说来， 视所还原的雷帕霉素类似物的量而定。
所属领域技术人员可易于测定本发明中所用的氢化试剂的量。然而，所属领域技术 人员将能够测定并调整进行还原和形成较为饱和的本发明的雷帕霉素类似物所需的氢 化试剂的量。此外，可利用多种设备来进行本发明的氢化，并且所述设备包括帕尔设备 (Parr apparatus)等。用于氢化的具体设备的选择将在所属领域技术人员的技术范围内。
制备本发明的雷帕霉素类似物的优选方法概述于下文的方案1中：
方案1
其中R1、R2、R4、R4′、R6、R7、R15和n在上文中经定义。
可利用由医药学上或生理学上可接受的酸或碱得到的医药学上可接受的盐、前药或 代谢物形式的雷帕霉素类似物。这些盐包括(但不限于)以下与诸如盐酸、硫酸、硝酸、 磷酸等矿物酸或无机酸以及诸如乙酸、草酸、琥珀酸和马来酸等有机酸形成的盐。其它 盐包括与诸如钠、钾、钙或镁等碱金属或碱土金属形成的酯、氨基甲酸酯形式和其它常 规“前药”形式的盐，当所述盐以此类形式投与时，其会在活体内转化成活性部分。
雷帕霉素类似物的其它合成途径和特征提供于上文所参考的2006年6月22日公开 的共同转让的共同代决的公开申请案US 2006/0135549的实例1-3中，所述申请案的标 题为“雷帕霉素类似物和其在治疗神经病症、增生性病症和炎症性病症方面的用途”。
可用于本发明方法中的雷帕霉素类似物的其它实例揭示于2006年6月22日自 U.S.S.N.11/300,941公开的共同持有的公开申请案U.S.2006/0135550中，所述申请案的 标题为“雷帕霉素衍生物和其在治疗神经病症方面的用途(Rapamycin Derivatives and the Uses Thereof in the Treatment of Neurological Disorders)”，其完整内容以引用的方式并入 本文中。
在其它实施例中，免疫亲和素配体为美立霉素类似物。可用于本发明方法中的美立 霉素类似物的实例包括揭示于例如U.S.2005/0197379、U.S.2005/0272133、U.S. 2005/0197356、WO 2005/084673、WO 2005/085257以及以下共同持有的临时申请案中 的美立霉素类似物：2005年3月23日申请的U.S.S.N.60/664,483，其标题为“美立霉 素衍生物和其用途(Meridamycin Derivatives and Uses Thereof)”(通过USPTO PAIR公 开可用)；和2006年3月7日申请的U.S.S.N.60/779,940，其标题为“用于治疗神经变 性病症的美立霉素类似物(Meridamycin Analogues for the Treatment of Neurodegenerative Disorders)”。(所有专利的完整内容都以引用的方式并入本文中。)所揭示的免疫亲和素 配体的某种神经营养作用可通过形成本文所述的复合物来介导。在一个实施例中，美立 霉素类似物具有U.S.2005/0197379中的化合物I的化学式。
已证实，若干上述雷帕霉素和美立霉素类似物在所培养的皮层、多巴胺能和脊髓神 经元中具有有效的神经营养(例如，神经保护、神经再生和/或刺激神经突起生长)活性。
免疫亲和素复合物
一方面，本发明涉及免疫亲和素复合物的发现。在一些实施例中，所述复合物包括 免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)、免疫亲和素(例 如，FKBP52)或其功能性变异体和钙通道亚基(例如，电压门控L型钙通道β1亚基) 或其功能性变异体。
如本文所使用，术语“结合”和“复合物形成”是指两个或两个以上分子(例如多 肽、大环内酯类等)的直接或间接缔合。直接缔合可例如包括在生理条件下的共价、静 电、疏水、离子和/或氢键相互作用。间接缔合包括例如两个或两个以上分子是复合物的 一部分但不具有直接相互作用。在一个实施例中，分子之间的缔合足以在生理条件下保 持稳定复合物。
本发明的复合物可以经分离、重组或纯化形式获得。作为“蛋白质”或“复合物” 的修饰语的术语“经纯化”或“经分离”是指一种或多种蛋白质的制剂，所述蛋白质实 质上不含通常在细胞或细胞溶解产物中与其缔合的其它蛋白质。举例来说，短语“实质 上不含”涵盖包含小于40％、30％、20％(以干重计)的污染蛋白质且通常包含小于5％ 的污染蛋白质的制剂。当提及用于产生重构蛋白质混合物的组分蛋白质制剂时，“经纯 化”或“经分离”意思指：所述分子是在实质上不存在诸如其它蛋白质(尤其可实质上 掩蔽、减小、混乱或改变纯制剂形式的组分蛋白质的特性或其在标的重构混合物中的功 能的其它蛋白质)等其它生物大分子的情况下存在。如本文所使用，术语“经纯化”或 “经分离”优选指存在至少80干重％、通常在85干重％的范围内、更通常95-99干重％ 或更高百分比的相同类型的生物大分子(但也可存在水、缓冲剂和其它小分子、尤其分 子量低于5000的分子)。在一个实施例中，所述复合物或蛋白质实质上不含纯化材料， 例如基质或其它材料。在其它实施例中，所述复合物或蛋白质与纯化材料缔合。
术语“重组”“蛋白质”或“复合物”是指形成复合物的蛋白质，其可通过重组DNA 技术产生。一般说来，将编码所表达蛋白质的DNA插入适当表达载体中，接着使用所 述表达载体来转化宿主细胞(在本文中也称为“重组细胞”)以产生异源蛋白质。此外， 关于编码重组蛋白的重组基因的短语“源自”意欲包括在“重组蛋白”的含义内，所述 蛋白质含有天然蛋白质的氨基酸序列，或通过天然存在的蛋白质的突变(包括取代、插 入和缺失)所产生的与天然蛋白质的氨基酸序列类似的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供一种复合物，其是例如通过从包含所述复合物的组分 的细胞(例如，天然存在的细胞或重组细胞，例如免疫亲和素处理的细胞)提取而制备 得到。可通过所属领域中已知的任何方法实现细胞提取。举例来说，可通过诸如离心、 凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱和/或亲和纯化等一系列常规蛋白质纯化步骤，从细 胞提取出复合物。通常优先选择不会解离复合物的纯化步骤和条件。如随附实例中所述， 可使用溶解缓冲液(例如，6ml；50mM Tris(pH 7.4)、250mM NaCl、5mM EDTA、 50mM NaF、1mM Na3VO4、1％Nonidet P40(NP40)、0.1％巯基乙醇和2％蛋白酶抑制 剂混合物)。举例来说，可如傅雷兹(Fretz)等人((1991)美国化学学会杂志(J.Am.Chem. Soc.)113：1409)所述，制备将免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素类似物)连接到树脂 的亲和基质。在一个实施例中，可使用亲和凝胶10(Affi-gel10)树脂，通过氨基-苯基- 丁酸来制备亲和基质(图1)。简单地说，可通过用诸如二碳酸二烯丙酯等保护基处理来 保护氨基-苯基-丁酸的氨基。可在CH2Cl2中利用PhOP(O)Cl2DMF复合物来活化所得复 合物的酸基。反应中止后，可例如通过HPLC纯化酯产物，并例如通过MS和NMR加 以表征。在去除烯丙基氧基羰基后，可将产物的氨基连接到亲和凝胶10(Affigel-10) 基质。可洗涤所得亲和凝胶-免疫亲和素配体亲和基质并加以储存。提取后，可将细胞溶 解产物的等分试样与诸如亲和凝胶10-免疫亲和素配体等亲和珠粒混合。可例如在4-20％ SDS-PAGE凝胶上对珠粒进行分析。可消化蛋白质谱带，并通过例如FT-ICR-MS分析进 一步分析。
在其它实施例中，可通过纯化诸如大肠杆菌(E.coli)等细胞中表达的重组多肽， 并在活体外重构复合物来制备复合物。在某些实施例中，复合物的一种或多种组成多肽 是由细胞的内源基因表达。在某些实施例中，复合物为重组复合物，其中一种或多种组 成多肽是由重组核酸表达。在某些实施例中，本发明还包括经标记的蛋白质复合物，其 中所述复合物中至少一种多肽经标记。举例来说，所述标记为可检测标记，其可选自例 如放射性同位素、荧光化合物、酶和酶辅因子中的一者或多者。在另一实施例中，标记 促进多肽的纯化、分离或检测。标记可为聚组氨酸、FLAG、Glu-Glu、谷胱甘肽硫转移 酶(GST)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白质A、蛋白质G和免疫球蛋白重链恒定区。 在一个实施例中，经标记蛋白质为FKBP52。在另一实施例中，经标记蛋白质为钙通道 亚基。可通过适当的亲和纯化(例如，如上文所述，或通过在六组氨酸标签的情况下使 复合物与镍或铜树脂接触，在GST标签的情况下使复合物与谷胱甘肽树脂接触)来纯化 经标记复合物或其组分。
在某些实施例中，本发明的复合物为水溶性形式(“可溶性复合物”)。举例来说， 可溶性复合物可包括免疫亲和素和/或钙通道亚基的可溶性细胞质部分。在其它实施例 中，复合物可能不易溶于水或为膜缔合形式。举例来说，包含具有跨膜结构域的蛋白质 的复合物通常不可溶于水。可例如制备包含脂质、清洁剂和/或其它组分的脂质微团、清 洁剂微团或混合微团形式的不可溶复合物。也可制备作为细胞的膜部分的不可溶复合 物。膜部分可为粗膜部分，其中所述膜部分是例如通过离心或过滤简单地与细胞的可溶 部分分离。可进一步例如通过针对复合物的一种或多种蛋白质中存在的亲和标签的亲和 纯化来纯化膜部分。当复合物以脂质双层形式存在时，所述脂质双层可例如为小泡(任 选倒转，即其中通常在细胞外的表面向内面向小泡的内部)或平坦双层。
结晶形式的复合物也在本发明的范围内。
在一个实施例中，使复合物交联。可使用交联试剂来制备交联复合物，所述交联试 剂可为多官能或双官能试剂。所述试剂包括二胺类的化合物，诸如六亚甲基二胺、二氨 基辛烷、乙二胺、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼盐酸盐(MPBH)、4-(N-马来酰亚 胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼盐酸盐(M2C2H)和3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼(PDPH) 和其它胺烯烃。此类交联剂的实例为戊二醛、琥珀醛、辛二醛和乙二醛。其它多官能交 联剂包括卤基-三嗪，例如氰尿酰氯；卤基-嘧啶，例如2，4，6-三氯/溴-嘧啶；脂肪族或芳 香族单-或二羧酸的酸酐或卤化物，例如，马来酸酐、(甲基)丙烯酰氯、氯乙酰氯；N- 羟甲基化合物，例如N-羟甲基-氯乙酰胺；二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，例如亚苯基-1，4- 二异氰酸酯；和氮丙啶。其它交联剂包括环氧化物，诸如二环氧化物、三环氧化物和四 环氧化物。关于其它可用交联试剂的代表性清单，例如参看皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook)，皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company)，洛克路德 (Rockford)，111.(1997)；以及S.S.王(S.S.Wong)，蛋白质连结和交联化学(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)，CRC出版社，佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton，Fla.)(1991)。
另外，可使用可逆交联剂。可逆交联剂的实例描述于T.W.格林(T.W.Green)，有 机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，约翰威立父子出版公司 (John Wiley & Sons)(编)(1981)中。用于可逆保护基的任一种策略都可并入适于在产生 能够可逆、受控溶解的碳水化合物交联糖蛋白晶体的过程中的至少一种交联的交联剂 中。各种方法列于应用化学国际版(英文)(Angewandte Chmie Intl.Ed.Engl.)，35，第 2056页(1996)中有关本主题的沃曼(Waldmann)评述中。其它类型的可逆交联剂为含二 硫键的交联剂。
本发明另外提供调节(例如，增加)本文所述的复合物的形成和/或稳定性的方法。 所述方法包括：使免疫亲和素(例如FKBP52，例如人FKBP52)或其功能性变异体和 电压门控L型钙通道亚基(例如β1亚基，例如人β1亚基)或其功能性变异体与免疫亲 和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)在允许形成所述复合物的 条件下接触。接触步骤可在活体外，例如在细胞溶解产物或重构系统中发生。或者，可 对例如人类或动物个体(例如，活体内动物模型)等个体中存在的细胞(例如，神经元 或心血管细胞)执行所述方法。
本发明的方法还可用于培养的细胞。举例来说，可在活体外培养细胞(例如，纯化 或重组细胞)，并且可通过将免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素或美立霉素类似物)加 入培养基中来实现接触步骤。通常，所述细胞为哺乳动物细胞，例如人类细胞。在一些 实施例中，所述细胞为神经元细胞或心血管细胞。在一些实施例中，所述细胞为重组细 胞，例如宿主细胞。所述方法包括(i)将一种或多种编码免疫亲和素和/或钙通道亚基 的多聚核苷酸引入细胞中；(ii)使所述细胞与免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷 帕霉素或美立霉素类似物)接触；(iii)由此形成复合物。
宿主细胞
另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含一个或多个编码本文所揭示的复合物 的一种或多种多肽成分的核酸。在一个实施例中，宿主细胞含有第一核酸，其包括编码 免疫亲和素(例如FKBP52，例如，如本文所述的哺乳动物FKBP52)或其功能性变异 体的核苷酸序列；和/或第二核酸，其包括编码电压门控L型钙通道亚基(例如β1亚基， 例如，如本文所述的哺乳动物β1亚基)或其功能性变异体的核苷酸序列。在一个实施 例中，第一核酸包含编码如图13A-13B所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：6-7)的核苷酸 序列或与所述序列实质上一致的序列。在其它实施例中，第二核酸包含编码如图12A-12E 所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-5)的核苷酸序列或与所述序列实质上一致的序列。
“宿主细胞”、“重组细胞”和“重组宿主细胞”为在本文中可互换使用的术语。应 了解，所述术语不仅指特定个体细胞，而且还指所述细胞的子代或潜在子代。由于在传 代过程中可能因突变或环境影响而发生某些修饰，故所述子代事实上可能与母细胞不一 致，但其仍包括在如本文所使用的术语的范围内。
术语“重组核酸”包括包含至少两个在自然界中不会一起存在的序列的任何核酸。 可例如在活体外通过使用分子生物学方法，或例如在活体内通过利用同源或非同源重组 在新染色体位置插入核酸来产生重组核酸。
在一些实施例中，可例如使用宿主细胞来纯化、制造或研究蛋白质或蛋白质复合物。 可例如任选使用宿主细胞在分析方案(诸如下文所述的分析方案)中测试化合物。
在某些实施例中，本发明复合物的多肽的重组表达可单独进行，并且可由此形成复 合物。在另一实施例中，所述本发明复合物的多肽的重组表达可在同一细胞中进行，并 且可由此形成复合物。
用于重组表达的适当宿主细胞包括细菌，诸如大肠杆菌、梭状芽孢杆菌属 (Clostridium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)；酵母；植物细胞；昆虫细胞(诸如)； 和哺乳动物细胞，诸如成纤维细胞、淋巴细胞、U937细胞(或其它前单核细胞细胞系) 和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
为进行宿主细胞表达，可将重组核酸操作性连接到表达构筑体中的一个或多个调控 序列。调控核苷酸序列通常应适于用于表达的宿主细胞。对于多种宿主细胞，多类适当 的表达载体和适当的调控序列为所属领域中已知。通常，所述一个或多个调控核苷酸序 列可包括(但不限于)启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始 和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化子序列。本发明涵盖如所属领域中 已知的组成性或可诱导启动子。所述启动子可为天然存在的启动子，或组合一个以上启 动子元件的杂合启动子。表达构筑体可存在于细胞附加体(诸如质粒)上，或表达构筑 体可插入染色体中。在优选实施例中，表达载体含有允许选择经转化宿主细胞的可选择 标记基因。可选择标记基因为所属领域众所周知，并将随所使用的宿主细胞变化。
表达载体还可包括融合结构域(通常由表达载体提供)，因此本发明的重组多肽表 达为具有所述融合结构域的融合多肽的形式。融合结构域的主要优点在于：其有助于鉴 别和/或纯化所述融合多肽，并且还能增强蛋白质表达水平和总产率。
抗体
另一方面，本发明提供一种结合本文所揭示的复合物的抗体，或其抗原结合片段。 在某些实施例中，所述抗体能增加本文所揭示的复合物的形成和/或稳定性。在其它实施 例中，所述抗体或其抗原结合片段能减少或抑制本文所揭示的复合物的形成和/或稳定 性。例示性抗体分子包括完全免疫球蛋白分子或其含有例如抗原结合位点的部分(包括 所属领域中称为F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2、人类化嵌合抗体和F(v)的免疫球蛋白分子的部 分)。可通过所属领域中已知的方法产生多克隆或单克隆抗体。(柯勒(Kohler)和米尔 斯坦(Milstein)(1975)自然(Nature)256，495-497；坎贝尔(Campbell)″单克隆 抗体技术，啮齿动物和人类杂交瘤的制备和表征(Monoclonal Antibody Technology，the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas)″，伯顿(Burdon)等 人(编)(1985)″生物化学和分子生物学技术(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)″，第13卷，爱思唯尔科技出版公司(Elsevier Science Publishers)，阿 姆斯特丹(Amsterdam)；哈洛维(Harlow)和拉尼(Lane)(编)(1988)″抗体试验室手 册(Antibodies A Laboratory Manual)″，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽 约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y)；所有所述文献的内容都以引用的方式并入本文中。
可使用本发明的经纯化复合物或其多肽组分使动物免疫，从而获得与复合物特异性 反应的多克隆和单克隆抗体。可使用完整复合物或全长多肽组分作为免疫原，或使用其 片段来获得所述抗体。也可使用较小的多肽片段来使动物免疫。另外，肽免疫原可在羧 基末端含有半胱氨酸残基，并且与诸如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)等半抗原连结。可通 过用硫酸酪氨酸残基置换酪氨酸残基来产生其它肽免疫原。所属领域中已知合成所述肽 的方法，如例如奥斯贝尔(Ausbel)等人(编)(1987)现代分子生物学规程(In Current Protocols In Molecular Biology)，约翰威立父子出版公司(John Wiley and Sons)(纽约 州纽约(New York，N.Y.))中所述。
可通过如以下文献中所揭示的所属领域中已知的技术来产生经修饰抗体或其抗原 结合片段：例如，伍德(Wood)等人，国际公开案WO 91/00906；库契拉帕底(Kucherlapati) 等人，国际公开案WO 91/10741；朗伯格(Lonberg)等人，国际公开案WO 92/03918；肯 (Kay)等人，国际公开案WO 92/03917；朗伯格(Lonberg)等人(1994)自然(Nature) 368：856-59；格林(Green)等人(1994)自然-遗传学(Nat.Genet.)7：13-21；莫里森 (Morrison)等人(1994)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)81：6851-55； 布鲁格曼(Bruggeman)等人(1993)免疫学时代(Year Immunol.)7：33-40；图瓦卢 (Tuaillon)等人(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)90：3720-24； 布鲁格曼(Bruggeman)等人(1991)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)21：1323-1326； 拉瑞克(Larrick)等人(1991)生物技术(Biotechniques)11：152-56；罗宾逊(Robinson) 等人，国际专利申请案PCT/US86/02269；阿卡拉(Akira)等人，欧洲专利申请案184,187； 朝美(Taniguchi)，欧洲专利申请案171,496；莫里森(Morrison)等人，欧洲专利申请 案173,494；纽伯格(Neuberger)等人，国际公开案WO 86/01533；卡比利(Cabilly) 等人，美国专利第4,816,567号；贝特(Better)等人(1988)科学(Science)240：1041-43； 刘(Liu)等人(1987)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)84：3439-43； 刘(Liu)等人(1987)免医学杂志(J.Immunol.)139：3521-26；孙(Sun)等人(1987) 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)84：214-18；西村(Nishimura)等 人(1987)癌症研究(Canc.Res.)47：999-1005；伍德(Wood)等人(1985)自然(Nature) 314：446-49；席瓦(Shaw)等人(1988)美国癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.) 80：1553-59；莫里森(Morrison)(1985)科学(Science)229：1202-07；奥伊(Oi)等 人(1986)生物技术(BioTechniques)4：214；和奎恩(Queen)等人，美国专利第5,585,089 号、第5,693,761号和第5,693,762号，所有所述文献的内容都以引用的方式并入本文中。 这些方法包括分离、处理和表达编码来自重链或轻链中至少一者的全部或部分免疫球蛋 白Fv可变区的核酸序列。所属领域技术人员已知所述核酸的来源，并且例如可从产生 抗预定靶的抗体的杂交瘤获得所述核酸来源。随后，可将编码重组抗体的重组DNA或 其片段克隆到适当表达载体中。
用于鉴别调节复合物形成的测试化合物的分析
另一方面，本发明提供一种用于鉴别测试化合物的方法或分析，所述测试化合物可 调节(例如，抑制或增加)包括测试化合物、免疫亲和素和钙通道亚基的复合物的形成 和/或稳定性。所述方法或所述分析包括：使包括免疫亲和素或其功能性变异体和β亚基 或其功能性变异体的样本与测试化合物在允许形成复合物的条件下接触；相对于参考样 本(例如，未暴露于测试试剂的对照样本，或暴露于雷帕霉素的对照样本)，检测与测 试化合物接触的样本中复合物的存在。在存在测试化合物的情况下复合物的含量相对于 参考样本中复合物含量的变化(例如，增加或降低)表明，所述测试化合物能影响(例 如，增加或降低)所述复合物的形成和/或稳定性。优选测试化合物使复合物的形成相对 于参考样本增加例如约1.5、2、5、10倍或更高。
可例如从细菌、放线菌(例如，吸水链霉菌)、酵母或其它有机体(例如，天然产 物)获得测试化合物；以化学方法产生(例如，小分子，包括肽模拟物)或通过重组产 生测试化合物。举例来说，可由天然存在或以遗传学方式修饰的链霉菌属产生聚酮，如 例如U.S.2005/0272133、U.S.2005/0197379中所述。或者，可通过化学合成得到经修饰 形式的本文所揭示的雷帕霉素和美立霉素类似物。
本发明的复合物允许产生新的经修饰大环内酯，例如经修饰形式的本文所揭示的雷 帕霉素和美立霉素类似物。可使用经纯化复合物来测定三维晶体结构，所述结构可用于 建立分子间相互作用模型。举例来说，可测定复合物的晶体结构，并且可通过使用所属 领域中已知的技术进行合理药物设计来产生结构的修饰。多种计算机程序可用于合理药 物设计、计算机建模、模型构建，如U.S.2005/0288489A1(其内容以引用的方式并入本 文中)中所述。
多种分析形式可满足此目的，并且根据本揭示案，所属领域技术人员仍将能够理解 本文中未明确描述的分析。接近诸如形成蛋白质复合物、酶促活性等条件的分析形式可 以多种不同形式发生，且其包括基于例如经纯化蛋白质或细胞溶解产物等无细胞系统的 分析，以及利用完整细胞的基于细胞的分析。可使用简易的结合分析来检测抑制或增强 复合物的各组分之间的相互作用或复合物与底物的结合的化合物。
在某些实施例中，本发明提供重构蛋白质制剂，其包括复合物的多肽以及所述复合 物的一种或多种相互作用多肽。在一个实施例中，将所有组分或复合物同时加入反应混 合物中。在其它实施例中，通过依次添加各组分，例如形成免疫亲和素与钙通道的混合 物，并添加免疫亲和素配体，来制备反应混合物。或者，可将免疫亲和素配体加入免疫 亲和素或钙通道中。可使用各组分的任何次序或组合。本发明的分析包括经标记的活体 外蛋白质-蛋白质结合分析、蛋白质结合的免疫分析等。在一个实施例中，样本为细胞溶 解产物或重构系统。重构复合物可包含至少半纯化蛋白质的重构混合物。半纯化是指已 预先将重构混合物中所用的蛋白质与其它细胞蛋白分离。举例来说，相比细胞溶解产物， 复合物形成中所涉及的蛋白质是以相对于混合物中的所有其它蛋白质至少50％的纯度 存在于混合物中，且更优选以90-95％纯度存在。在某些实施例中，通过混合高纯度蛋 白质来得到重构蛋白质混合物，因此重构混合物中实质上不含可能干扰或以其它方式改 变测量复合物组装和/或解体的能力的其它蛋白质(诸如细胞来源的蛋白质)。在某些实 施例中，可在适于容纳反应物的任何容器中实现在存在和不存在候选化合物的情况下进 行的分析。实例包括微量滴定盘、试管和微量离心管。
在某些实施例中，可发生药物筛选分析，所述分析将根据测试化合物干扰本发明复 合物的组装、稳定性或功能的能力来检测测试化合物。复合物的检测和定量提供一种测 定化合物抑制(或增强)各组分之间的相互作用的功效的方式。可通过由使用各种浓度 的测试化合物获得的数据产生剂量反应曲线来评定化合物的功效。此外，还可进行对照 分析来提供基线以供比较。在对照分析中，复合物的形成是在不存在测试化合物的情况 下定量。
在某些实施例中，可通过多种技术来检测复合物中任何两个多肽之间的缔合或复合 物与底物多肽之间的缔合，所述技术中的多者已在上文中有效描述。举例来说，可例如 使用可检测标记的蛋白质(例如，放射性标记、荧光标记或酶标记)，藉由免疫分析或 藉由色谱检测来定量对于复合物形成的调节。还可使用表面等离子共振系统(诸如，自 拜厄克国际公司(Biacore International AB)(瑞典乌普萨拉(Uppsala，Sweden))可得的 表面等离子共振系统)来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
在某些实施例中，可将复合物的一种多肽固定以促进使复合物与未复合形式的一种 多肽分离，并且适应分析的自动化。本文中已描述亲和基质或珠粒，其含有允许复合物 的其它组分与不可溶基质结合的免疫亲和素配体(或复合物的其它组分)。在有助于形 成复合物的条件下培育测试化合物。培育后，洗涤珠粒以去除任何未结合的相互作用蛋 白质，并直接测定基质珠粒所结合的放射性标记(例如，将珠粒放入闪烁检测器中)， 或例如当使用微量滴定盘时，在使复合物解离后在上清液中测定所述放射性标记。或者， 在洗掉未结合的蛋白质后，可将复合物自基质解离，通过SDS-PAGE凝胶进行分离，并 使用标准电泳技术，由所述凝胶测定基质结合部分中所见的相互作用多肽的含量。
另外，可使用培养的细胞(例如，经纯化的培养细胞或重组细胞)来进行分析。举 例来说，可使用双杂交分析(也称为相互作用陷阱分析(interaction trap assay))来检测 复合物中任何两个多肽的相互作用，且随后检测抑制或增强蛋白质之间的结合的测试化 合物(也参看，美国专利第5,283,317号；W094/10300；泽沃斯(Zervos)等人，(1993)细 胞(Cell)72：223-232；玛杜拉(Madura)等人，(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 268：12046-12054；巴瑞尔(Barrel)等人，(1993)生物技术(Biotechniques)14：920-924； 和岩渊(Iwabuchi)等人，(1993)肿瘤学(Oncogene)8：1693-1696)，所有所述文献的 内容都以引用的方式并入本文中。
在测试化合物和天然提取物文库的许多药物筛选程序中，都需要高通量分析以便使 在指定时间段内所调查的化合物的数量最大化。以无细胞系统(诸如，可利用纯化或半 纯化蛋白质或溶解产物产生的无细胞系统)进行的本发明的分析通常优选作为“初步” 筛选，这是因为，所述分析的产生能允许快速显现并相对容易地检测测试化合物所介导 的分子靶的变化。此外，在活体外系统中通常可忽略测试化合物的细胞毒性和/或生物可 用性作用，而分析的焦点主要集中于，在与其它蛋白质的结合亲和力的变化或分子靶的 酶促特性改变方面可能表现的药物对分子靶的作用。
在某些实施例中，蛋白质复合物的活性可包括(不限于)蛋白质复合物形成，这可 通过免疫沉淀和共沉淀蛋白质的分析或者亲和纯化和共纯化蛋白质的分析来评定。还可 使用基于荧光共振能量转移(FRET)的分析来测定复合物的形成。彼此极为接近的具 有适当发射和激发光谱的荧光分子可展现FRET。对荧光分子加以选择以使一个分子(供 体分子)的发射光谱与另一分子(受体分子)的激发光谱重叠。通过在供体激发光谱范 围内的适当强度的光来激发供体分子。随后，供体以荧光形式发射所吸收的能量。通过 受体分子使其产生的荧光能淬灭。FRET可表现为来自供体的荧光信号的强度的降低、 其激发态的寿命的缩短和/或在受体的较长波长(较低能量)特征下再发射荧光。当以物 理方式分离荧光蛋白时，FRET效应有所减小或经消除。基于FRET的分析描述于美国 专利第5,981,200号中，所述专利的内容以引用的方式并入本文中。
一般说来，当筛选分析为结合分析(蛋白质-蛋白质结合、化合物-蛋白质结合等) 时，一个或多个分子可与标记连接，其中所述标记可直接或间接提供可检测信号。各种 标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、粒子(例如，磁 性粒子)等。特异性结合分子包括诸如生物素与抗生蛋白链菌素、地高辛(digoxin)与 抗地高辛等对。对于特异性结合的成员，通常利用能根据已知程序进行检测的分子来标 记互补成员。
筛选分析中可包括多种其它试剂。这些试剂包括如盐、中性蛋白(例如白蛋白)、 清洁剂等用于促进最佳蛋白质-蛋白质结合和/或减少非特异性或背景相互作用的试剂。 可使用改善分析功效的试剂，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗菌化合物等。各组 分的混合物是以提供必要结合的任何次序添加。培育是在任何适当温度下，通常在介于 4与40℃之间的温度下进行。对培育期加以选择以得到最佳活性，但也可对其进行优化 以促进快速高通量的筛选。
在某些实施例中，可进一步分析测试化合物以鉴别出调节钙通道活性的化合物。举 例来说，可通过在将具有功能性钙通道(例如，异源通道)的真核细胞暴露于含有测试 化合物和钙通道选择性离子的溶液时，测试所述细胞的钙通道活性，并将所测量的钙通 道活性与在不含有测试化合物的溶液中的相同细胞或实质上一致的对照细胞的钙通道 活性相比较，来测量测试化合物的作用。在一个实施例中，将细胞保持在具有当钙通道 打开时足以提供内部电流的钙通道选择性离子浓度的溶液中。所属领域技术人员已知实 践所述分析的方法。举例来说，关于应用非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞和乙酰胆 碱受体的类似方法，参看密示纳(Mishina)等人，(1985)自然(Nature)313：364；诺 达(Noda)等人，(1986)自然(Nature)322：826-828；克罗迪奥(Claudio)等人，(1987) 科学(Science)238：1688-1694。
这些分析都是基于表达功能性钙通道的细胞，并且功能性(诸如以电生理学方式) 测量测试化合物通过异源功能性通道增强、拮抗或以其它方式调节钙通道选择性离子 (诸如Ca++或Ba++)流动幅度和持续时间的能力。在一个实施例中，可直接(诸如，以 电生理学方式)测定流过细胞的重组钙通道的电流量；或在另一实施例中，可通过监测 在细胞内发生并且以钙(或其它)离子依赖性方式受到直接影响的独立反应，来测定所 述电流量。
可将评定钙通道活性的任何方法与本文所述的方法组合使用。举例来说，在用于测 试化合物调节钙通道活性的能力的方法的一个实施例中，通过所述化合物在对钙通道选 择性离子敏感并且使用表达异源钙通道且还含有可操作性连接到编码指示蛋白的结构 基因的转录控制元件以供表达的真核细胞的反应中所作的调节，来测量电流量。用于转 录指示基因的转录控制元件在细胞中会对钙通道选择性离子(诸如Ca2+和Ba+)作出响 应。所述基于转录的分析的细节例如描述于PCT国际专利申请案第PCT/US91/5625号 中。
在其它实施例中，可利用所属领域技术人员已知且在本文中例示说明的测量钙通道 活性的电生理学方法达成所述目的。可使用任何所述方法以便检测功能性钙通道的形成 并表征所得电流的动力学和其它特征。在其它实施例中，可将药理学研究与电生理学测 量组合，以便进一步表征钙通道。
一般说来，可通过检测给定的测试化合物影响以下一种或多种作用的能力来分析所 述化合物在神经系统中的活性：促进神经突起生长；保护神经元免于被化学处理损害； 促进神经元或神经元细胞生长；恢复丧失或受损的与神经系统的神经组织或器官有关的 运动、功能或认知能力；或使神经元再生。举例来说，可通过所属领域中已知的方法来 分离和培养经分离的神经元细胞培养物(例如，多巴胺能、皮层、DRG细胞培养物)(例 如，参看庞(Pong)等人，(1997)神经化学杂志(J.Neurochem.)69：986-994；庞(Pong) 等人，(2001)实验神经学(Exp Neurol.)171(1)：84-97)。可使用如(例如)US 2005/0197356 (描述展示分别测量所培养的多巴胺能神经元和皮层神经元中3H-多巴胺吸收和神经丝 蛋白含量的改变的实例)中所述的技术认可的技术，检测并定量测定神经元活性、分化、 存活的改变。或者，可在所培养的神经细胞系(例如，神经母细胞瘤细胞系、嗜铬细胞 瘤细胞(PC12细胞)、F11)中表征神经元活性。活体外活性可用于鉴别可用于治疗和/ 或缓解多种人类神经变性病况的药剂，所述神经变性病况包括(但不限于)帕金森氏病； 阿兹海默氏病；肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、外伤性损伤、 脊髓损伤、多发性硬化、糖尿病性神经病、与诸如化疗等药物治疗有关的神经病、局部 缺血或局部缺血诱发的损伤、中风等。
检测神经元活性的方法例如包括神经保护分析，其中将测试化合物防止谷氨酸神经 毒性的能力。还可分析感觉神经元培养物(DRG)的神经突起生长，并分析其神经营养 活性。用免疫亲和素配体处理所培养的细胞，且随后分析新的神经突起纤维的存在。免 疫组织化学可有助于如与对照相比较时神经突起的观测和定量。
已研发出多种动物模型和细胞培养分析，并且其可取决于与疾病治疗(包括上文所 述的人类疾病)的临床相关性。以下各参考文献可用作这些分析的来源，并且所有所述 参考文献都是以全文引用的方式特别地并入本文中以达成所述目的：斯坦纳(Steiner) 等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Set U.S.A.)94：2019-2024(1997)；汉密尔 顿(Hamilton)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorgan.Med.Chem.Lett.) 7：1785-1790(1997)；麦克马洪(McMahon)等人，神经生物学新观点(Curr.Opin. Neurobiol.)5：616-624(1995)；盖希(Gash)等人，自然(Nature)380：252-255(1996)； 杰拉奇(Gerlach)等人，欧洲药理学杂志-分子药理学部分(Eur.J.Pharmacol-Mol. Pharmacol)208：273-286(1991)；安普费尔(Apfel)等人，脑研究(Brain Res.)634：7-12 (1994)；王(Wang)等人，药理学和实验治疗学研究(J.Pharmacol Exp.Therap.) 282：1084-1093(1997)；古德(Gold)等人，实验神经学(Exp.Neurol.)147：269-278(1997)； 霍伏尔(Hoffer)等人，神经传导杂志(J.Neural Transm.)[增刊]49：1-10(1997)；和李 恩斯(Lyons)等人，美国国家科学院院刊(PNAS)91：3191-3195(1994)。
治疗和预防用途
另一方面，本发明提供调节表达免疫亲和素(例如，FKBP52)或其功能性变异体 和电压门控L型钙通道亚基(例如，β1亚基)或其功能性变异体的细胞(例如哺乳动物 细胞)的功能(例如，钙通道活性(例如，电压门控钙通道活性))的方法。在一个实 施例中，钙通道或FKBP52活性或表达受到抑制。在钙通道活性受到抑制的实施例中， 优选刺激神经突起生长和/或存活。通常，用于本发明方法中的细胞为哺乳动物细胞，例 如人类细胞(例如，神经元或心血管细胞)。在一些实施例中，所述方法包括使细胞与 免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)在允许形成本文所 述的复合物的条件下接触，由此抑制钙通道活性。
在相关实施例中，所述方法包括使细胞(例如，多巴胺能、胆碱能、皮层和脊髓神 经元细胞)与钙通道β亚基(例如，电压门控L型钙通道β1亚基)的拮抗剂接触。所 述拮抗剂也可为钙通道β亚基的活性和/或表达的抑制剂。如本文所使用，术语“拮抗剂” 是指降低、抑制或以其它方式减小钙通道β亚基(例如，β1亚基)的一种或多种生物活 性的试剂。拮抗作用未必表示完全消除钙通道β亚基的生物活性。在一个实施例中，所 述拮抗剂为免疫亲和素配体，例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物。通常， 免疫亲和素配体是以足以形成包括配体、免疫亲和素或其功能性变异体和钙通道亚基或 其功能性变异体的复合物和/或使所述复合物稳定的量投与。在其它实施例中，拮抗剂为 钙通道β亚基的转录抑制剂，例如，如本文中较详细描述的核酸抑制剂(例如RNAi)。
本发明的方法可以在培养基中的细胞进行。或者，作为例如活体内(例如治疗或预 防)方案的一部分，可对个体中存在的细胞(例如，神经元细胞或心血管细胞)、或在 动物个体(例如，活体内动物模型))内执行所述方法。
因此，本发明涵盖治疗或预防个体的与钙通道功能障碍有关的病症的方法。所述方 法包括：对个体投与足以形成包括免疫亲和素配体、免疫亲和素或其功能性变异体和钙 通道亚基或其功能性变异体的复合物和/或使所述复合物稳定的量的免疫亲和素配体(例 如，雷帕霉素或美立霉素类似物)，由此治疗或预防所述病症。所述方法可任选包括以 下步骤：鉴别(例如，评估、诊断、筛选和/或选择)具有患一种或多种与涉及钙通道功 能障碍的病症有关的症状的风险或具有所述症状的个体。所述个体可为例如罹患神经变 性病症或心血管病症的哺乳动物，例如人类。举例来说，所述个体为罹患选自以下一者 或多者的病症的人类(例如，人类患者)：中风、帕金森氏病、偏头痛、小脑性共济失 调、心绞痛、癫痫、高血压、局部缺血或心律失常。
如本文所使用，术语“个体”意欲包括人类和非人类动物。优选人类动物包括患有 以异常钙通道活性为特征的病症的人类患者。术语“非人类动物”包括脊椎动物，例如 哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、啮齿动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖 动物、爬行动物等。所述个体可为例如罹患神经变性病症或心血管病症的哺乳动物，例 如人类。
短语免疫亲和素配体的“治疗有效量”是指在对个体(例如，人类患者)投与单次 或多次剂量后，能有效治疗个体的药剂的量。术语“治疗”包括治愈病症、降低病症的 一种或多种症状的严重程度、缓解病症的一种或多种症状，或延长个体的存活期超过在 不存在所述治疗的情况下所预期的存活期。类似地，短语免疫亲和素配体的“预防有效 量”是指在对个体(例如，人类患者)投与单次或多次剂量后，能有效预防或延迟病症 (例如，如本文所述的病症)的发作或复发的发生的药剂的量。
可单独投与免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素类似物)，或可将其与一种或多种药 剂(例如治疗剂)组合投与。在此情况中，术语“组合”意思指：各药剂是实质上同时 (同时或依次)给与。如果依次给与，则在开始投与第二化合物时，优选仍能在治疗部 位检测到有效浓度的两种化合物中的第一化合物。在一个实施例中，第二药剂为钙通道 拮抗剂，例如L型钙通道拮抗剂。L型钙通道拮抗剂的实例包括二氢吡啶；苯基烷基胺 (例如，维拉帕米(verapamil)、加洛帕米(gallpamil)和噻帕米(thiapamil))；苯并硫 氮杂卓；二苯基丁基哌啶类抗精神分裂症神经安定药(例如匹莫齐特(pimozide)、 fluspiridine、五氟利多(penfluridol)和氯哌莫齐(clopimozide))；以及硝苯地平 (nifedipine)、卡马西平(carbamazepine)、地尔硫卓(diltiazem)、尼卡地平(nicardipine)、 尼莫地平(nimodipine)和尼群地平(nitredipine)。
与钙通道功能障碍有关的例示性病症包括：中风；帕金森氏病；偏头痛(例如，先 天性偏头痛)；小脑性共济失调；心绞痛；癫痫；高血压；局部缺血(例如，心肌缺血)； 心律失常；中风；头部外伤或脊髓损伤，或其它脑部、周围神经、中枢神经或神经肌肉 系统损伤；慢性、神经性或急性疼痛；情绪障碍；精神分裂症；抑郁症；焦虑症；精神 病；药物成瘾；酒精依赖和尿失禁。
与钙(Ca2+)离子通道功能障碍有关的其它病况的实例包括(但不限于)恶性高热 症、中央轴突症(central core disease)、儿茶酚胺多形性室速(cathecolaminergic polymorphic ventricular tachycardia)和2型致心律失常性右心室心肌病(ARVD-2)。可 使用本发明方法治疗的神经病症的实例包括：阿兹海默氏病；亨廷顿氏病(Huntington′s disease)；脊髓损伤；外伤性脑损伤；路易体痴呆(Lewy body dementia)；皮克氏病(Pick′s disease)；尼曼-匹克病(Niewmann-Pick disease)；淀粉样血管病；淀粉样脑血管病；全 身性淀粉样变性病；冰岛型遗传性脑出血伴淀粉样变(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis of the Dutch type)；包涵体肌炎；轻度认知障碍；唐氏综合症(Down′s syndrome)；和神经肌肉病症，包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化，和肌营养 不良，包括裘馨氏肌营养不良(Duchenne dystrophy)、贝克型肌营养不良(Becker muscular dystrophy)、面肩胛臂(兰迪二氏(Landouzy-Dejerine))肌营养不良和肢带型肌营养不 良(LGMD)。免疫亲和素配体还可用作神经保护和/或神经再生试剂，例如以便在一种 上述病况和/或损伤、中风或其它外伤发作后保留某种神经和/或神经肌肉或其它功能。
可治疗的其它心血管病症的实例包括(但不限于)充血性心力衰竭；心律失常综合 症，包括阵发性心动过速、迟后去极化、室性心动过速、猝死心动过速、运动诱发的心 律失常、长QT综合症和双向性心动过速；血栓性病症，包括动脉心血管血栓性病症、 静脉心血管血栓性病症和心室中的血栓性病症；动脉粥样硬化；再狭窄；周围动脉疾病； 冠状动脉旁路移植手术；颈动脉疾病；动脉炎；心肌炎；心血管炎症；血管炎症；冠心 病(CHD)；不稳定型心绞痛(UA)；难治性不稳定型心绞痛；稳定型心绞痛(SA)；慢 性稳定型心绞痛；急性冠状动脉综合症(ACS)；首次或复发型心肌梗塞；急性心肌梗 塞(AMI)；心肌梗塞；非Q波心肌梗塞；非STE心肌梗塞；冠状动脉疾病；缺血性心 脏病；缺血性猝死；短暂性缺血发作；中风；周围动脉闭塞病；静脉血栓；深静脉血栓 症；血栓性静脉炎；动脉栓塞；冠状动脉血栓症；脑动脉血栓症；脑栓塞；肾栓塞；肺 栓塞；由以下因素引起的血栓症：(a)人工瓣膜或其它植入物、(b)留置导管、(c)支 架、(d)心肺旁路、(e)血液透析或(f)将血液暴露于促进血栓症的人工表面的其它程 序；由动脉粥样硬化、手术或手术并发症、长期固定、动脉纤颤、先天性血栓形成体质、 癌症、糖尿病、药物或激素作用和妊娠并发症引起的血栓症；心律失常，包括室上性心 律失常、房性心律失常、房性早搏、心房纤颤；心脏病：心血管药物手册(Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine)，第2卷集，第6版，2001，尤金布朗瓦尔德 (Eugene Braunwald)，道格拉斯P.泽普斯(Douglas P.Zipes)，皮特里布(Peter Libby)， 道格拉斯D.泽普斯(Douglas D.Zipes)以及其药物制备中所列的其它疾病。
在另一实施例中，心血管疾病是选自以下一种或多种疾病：动脉粥样硬化；冠心病 (CHD)；再狭窄；周围动脉疾病；冠状动脉旁路移植手术；颈动脉疾病；动脉炎；心肌 炎；心血管炎症；血管炎症；不稳定型心绞痛(UA)；难治性不稳定型心绞痛；稳定型 心绞痛(SA)；慢性稳定型心绞痛；急性冠状动脉综合症(ACS)；心肌梗塞；或急性心 肌梗塞(AMI)，包括首次或复发型心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高心肌梗塞 和ST段抬高心肌梗塞。
免疫亲和素配体的量或剂量需求可视病况、所呈现的症状的严重程度和所治疗的特 定个体而变化。所属领域技术人员将能够容易地测定遵循本文所述的方法所需的免疫亲 和素配体的量。优选免疫亲和素配体的剂量足以形成包括所述配体、免疫亲和素或其功 能性变异体和钙通道亚基或其功能性变异体的复合物和/或使所述复合物稳定。在一些实 施例中，可遵循本发明的教示，在活体外测试所述剂量。在一个实施例中，投与约0.5 到200mg、约0.5到100mg、约0.5到约75mg。在另一实施例中，投与约1到约25mg。 在另一实施例中，投与约0.5到约10mg，尤其当与另一药剂组合使用时如此投与。在 另一实施例中，投与约2到约5mg。在另一实施例中，投与约5到约15mg。
治疗可以低于产生所需作用所需的剂量并且通常低于免疫亲和素配体的最佳剂量 的配体剂量起始。此后，可增加剂量直到在所述情况下达到最佳作用。确切剂量将由投 药医生根据由所治疗的个别个体获得的经验确定。一般说来，最适宜投与通常会提供有 效结果而不引起任何不利或有害副作用的浓度的组合物。
在某些组合物中，使用核酸拮抗剂来减少编码钙通道β亚基(例如，β1亚基)的内 源基因的表达。在一个实施例中，核酸拮抗剂为靶向编码钙通道β亚基的mRNA的 siRNA。还可使用其它类型的拮抗性核酸，例如dsRNA、核糖酶、三螺旋形成剂或反义 核酸。在一些实施例中，可将核酸拮抗剂导向钙通道β亚基的下游效应靶。
siRNA为任选包括突出端的小双链RNA(dsRNA)。举例来说，siRNA的双链区为 约18到25个核苷酸长，例如约19、20、21、22、23或24个核苷酸长。通常，siRNA 序列与靶mRNA完全互补。具体说来，可使用dsRNA和siRNA使哺乳动物细胞(例如， 人类细胞)的基因表达沉默。siRNA还包括具有29个碱基对的茎和2个核苷酸的3′突 出端的短发夹RNA(shRNA)。例如，参看克莱门斯(Clemens)等人，(2000)美国国家 科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)97：6499-6503；比利(Billy)等人，(2001)美 国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98：14428-14433；巴希尔(Elbashir)等 人，(2001)自然(Nature.)411：494-8；杨(Yang)等人，(2002)美国国家科学院院刊(Proc. Natl.Acad.Sci.USA)99：9942-9947；塞科拉斯(Siolas)等人，(2005)，自然生物技术(Nat. Biotechnol.)23(2)：227-31；20040086884；U.S.20030166282；20030143204；20040038278 和20030224432。
反义试剂可例如包括约8个到约80个核碱基(即，约8个到约80个核苷酸)，例 如约8个到约50个核碱基或约12个到约30个核碱基。反义化合物包括核糖酶、外部 引导序列(EGS)寡聚核苷酸(寡聚酶)，和与靶核酸杂交并调节其表达的其它短催化性 RNA或催化性寡聚核苷酸。反义化合物可包括与靶基因序列互补的至少8个连续核碱基 的伸长。寡聚核苷酸无需与其靶核酸序列100％互补以实现特异性杂交。当寡聚核苷酸 与靶的结合干扰靶分子的正常功能，从而引起失效，并且存在足够的互补程度以在需要 特异性结合的条件下(即，在活体内分析或治疗性治疗的情况下，在生理条件下；或在 活体外分析的情况下，在进行所述分析的条件下)避免寡聚核苷酸与非靶分子序列的非 特异性结合时，认为寡聚核苷酸可特异性杂交。
反义寡聚核苷酸与mRNA(例如，编码钙通道β亚基的mRNA)的杂交可干扰mRNA 的一种或多种正常功能。mRNA受干扰的功能包括所有关键功能，诸如所述RNA转位 到蛋白质翻译位点；由所述RNA翻译蛋白质；得到一种或多种mRNA物质的RNA剪 接；和所述RNA可能涉及的催化活性。反义寡聚核苷酸与RNA的杂交还可干扰特定蛋 白质与RNA的结合。
例示性反义化合物包括与靶核酸(例如，编码钙通道β亚基的mRNA)特异性杂交 的DNA或RNA序列。互补区可延伸约8个到约80个核碱基。所述化合物可包括一个 或多个经修饰核碱基。经修饰核碱基可例如包括5-取代的嘧啶，诸如5-碘尿嘧啶、5-碘 胞嘧啶和C5-丙炔基嘧啶(诸如C5-丙炔基胞嘧啶和C5-丙炔基尿嘧啶)。其它适当的经 修饰核碱基包括N4-(C1-C12)烷基氨基胞嘧啶和N4，N4-(C1-C12)二烷基氨基胞嘧啶。经修饰 核碱基还可包括7-取代的8-氮杂-7-去氮嘌呤和7-取代的7-去氮嘌呤，诸如7-碘-7-去氮 嘌呤、7-氰基-7-去氮嘌呤、7-氨基羰基-7-去氮嘌呤。这些核碱基的实例包括6-氨基-7- 碘-7-去氮嘌呤、6-氨基-7-氰基-7-去氮嘌呤、6-氨基-7-氨基羰基-7-去氮嘌呤、2-氨基-6- 羟基-7-碘-7-去氮嘌呤、2-氨基-6-羟基-7-氰基-7-去氮嘌呤和2-氨基-6-羟基-7-氨基羰基-7- 去氮嘌呤。此外，包括N6-甲基氨基腺嘌呤和N6，N6-二甲基氨基腺嘌呤在内的N6-(C1-C12) 烷基氨基嘌呤和N6，N6-(C1-C12)二烷基氨基嘌呤也为适当的经修饰核碱基。类似地，其它 6-取代的嘌呤(例如包括6-硫鸟嘌呤)也可构成适当的经修饰核碱基。其它适当的核碱 基包括2-硫尿嘧啶、8-溴腺嘌呤、8-溴鸟嘌呤、2-氟腺嘌呤和2-氟鸟嘌呤。任一上述经 修饰核碱基的衍生物也是适当的。任一前述化合物的取代基可包括C1-C30烷基、C2-C30 烯基、C2-C30炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、卤基、氨基、酰胺基、硝基、硫基、磺酰 基、羧基、烷氧基、烷基羰基、烷氧羰基等。
也可获得有关其它类型的核酸试剂的说明。例如，参看美国专利第4,987,071号、 第5,116,742号和第5,093,246号；伍尔夫(Woolf)等人，(1992)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)；反义RNA和DNA(Antisense RNA and DNA)，D.A.弥尔顿(D.A. Melton)编，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)(1988)；89：7305-9；汉斯霍夫(Haselhoff)和杰拉奇(Gerlach)(1988)自 然(Nature)334：585-59；海伦尼C.(Helene，C.)(1991)抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)6：569-84；海伦尼(Helene)(1992)纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.) 660：27-36；和马赫尔(Maher)(1992)生物分析(Bioassays)14：807-15。
医药组合物
一方面，本发明包括制备含有一种或多种免疫亲和素配体的医药组合物的方法。在 其它实施例中，揭示含有本文所述的复合物的医药组合物。如本文所使用，含有“一种 免疫亲和素配体”或“所述免疫亲和素配体”的组合物意欲涵盖含有一种或多种免疫亲 和素配体的组合物。所述组合物可通过若干不同途径投与哺乳动物个体，且合意地以固 体或液体形式经口投与。
可通过将免疫亲和素配体与一种或多种上述组分掺合来形成含有免疫亲和素配体 的固体形式，包括片剂、胶囊和囊片。在一个实施例中，组合物的各组分是以干法或湿 法掺合。在另一实施例中，各组分是通过干法制粒。在另一实施例中，将各组分悬浮或 溶解于液体中，并加入适于投与哺乳动物个体的形式中。
可通过将免疫亲和素配体溶解或悬浮于适于投与哺乳动物个体的液体中，来形成含 有免疫亲和素配体的液体形式。
可使用医药有效量的免疫亲和素配体来调配适于所需递送途径的任何形式的含有 免疫亲和素配体的本文所述的组合物。举例来说，可通过诸如经口、皮肤、透皮、支气 管内、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、不经肠、腹膜内、鼻内、阴道、直肠、舌下、颅 内、硬膜外、气管内等途径，或通过持续释放来递送本发明的组合物。优选经口递送。
还可使用本发明的口服剂量的片剂组合物来制造含有所属领域技术人员已知的免 疫亲和素配体衍生物(包括(但不限于)酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、醚、肟、碳酸酯等) 的口服剂量的片剂。
免疫亲和素配体的医药有效量可视特定化合物、递送模式、所治疗的病况的严重程 度和组合物中所用的任何其它活性成分而变化。还可调整给药方案以提供最佳治疗反 应。可每日递送若干分次剂量，例如1天2到4次的分次剂量；或可递送单次剂量。然 而，如治疗情况的紧急性所指示，可按比例降低或增加剂量。在一个实施例中，递送是 基于每日、每周或每月。在另一实施例中，递送是基于每日递送。然而，可在定期递送 的基础上降低或增大每日剂量。
可将免疫亲和素配体与一种或多种医药学上可接受的载剂或赋形剂组合，所述载剂 或赋形剂包括(不限于)与本发明的组合物可相容的固体和液体载剂。所述载剂包括佐 剂、糖浆、酏剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、制粒剂、崩解剂、软化剂、 金属螯合剂、pH值调节剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂和其组合等。在一个实施例 中，将免疫亲和素配体与金属螯合剂、pH值调节剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、 润滑剂和粘合剂组合。佐剂可包括(不限于)调味剂、着色剂、防腐剂和补充抗氧化剂， 所述抗氧化剂可包括维生素E、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)和丁基化羟基苯甲 醚(BHA)。
粘合剂可包括(不限于)纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、 羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、微晶纤维素、非晶 体纤维素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(povidone)，PVP)、明胶、阿 拉伯胶(gum arabic和acacia)、聚乙二醇、淀粉、糖(诸如蔗糖、高岭土、右旋糖和乳 糖)、胆固醇、黄芪胶、硬脂酸、明胶、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、 鲸蜡酯蜡、糖酐酯(dextrate)、糊精、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸 甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇和明 胶等。在一个实施例中，粘合剂为聚维酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素或明胶。 在另一实施例中，所述粘合剂为聚维酮。
润滑剂可包括硬脂酸镁、轻质无水硅酸、滑石、硬脂酸、月桂基硫酸钠和硬脂酰富 马酸钠等。在一个实施例中，润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸或硬脂酰富马酸钠。在另一实 施例中，润滑剂为硬脂酸镁。
制粒剂可包括(不限于)二氧化硅、微晶纤维素、淀粉、碳酸钙、果胶、交联聚维 酮(crospovidone和polyplasdone)等。
崩解剂可包括交联羧甲基纤维素钠、淀粉、羧甲基纤维素、经取代羟丙基纤维素、 碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉或交联聚维酮等。在一个实 施例中，崩解剂为交联羧甲基纤维素钠。
软化剂可包括(不限于)硬脂醇、貂油、鲸蜡醇、油醇、月桂酸异丙酯、聚乙二醇、 橄榄油、凡士林、棕榈酸、油酸和肉豆蔻酸肉豆蔻酯。
表面活性剂可包括聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)或月桂基 硫酸钠。在一个实施例中，表面活性剂为月桂基硫酸钠。
金属螯合剂可包括生理学上可接受的螯合剂，包括依地酸(edetic acid)、苹果酸或 富马酸。在一个实施例中，金属螯合剂为依地酸。
还可利用pH值调节剂将含有免疫亲和素配体的溶液的pH值调整到约4到约6。在 一个实施例中，将含有免疫亲和素配体的溶液的pH值调整到约pH 4.6。pH值调节剂可 包括生理学上可接受的试剂，包括柠檬酸、抗坏血酸、富马酸或苹果酸和其盐。在一个 实施例中，pH值调节剂为柠檬酸。
可根据本发明使用的填充剂包括无水乳糖、微晶纤维素、甘露糖醇、磷酸钙、预胶 化淀粉或蔗糖。在一个实施例中，填充剂为无水乳糖。在另一实施例中，填充剂为微晶 纤维素。
在一个实施例中，通过片剂、囊片或胶囊、微胶囊、可分散散剂、颗粒剂、悬浮液、 糖浆、酏剂和气雾剂经口递送含有免疫亲和素配体的组合物。合意地，当经口递送含有 免疫亲和素的组合物时，通过片剂和硬质或液体填充胶囊来进行递送。在另一实施例中， 可经静脉内、肌肉内、皮下、不经肠和腹膜内递送无菌可注射溶液、悬浮液、分散液和 可流动以致易于注射的散剂形式的含有免疫亲和素配体的组合物。所述可注射组合物在 制造和储存条件下为无菌且稳定的，并且不具有诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。 在另一实施例中，可经直肠递送常规栓剂形式的含有免疫亲和素配体的组合物。在另一 实施例中，可经阴道内递送常规栓剂、乳膏、凝胶、环或经涂布宫内节育器(IUD)形 式的含有免疫亲和素配体的组合物。
在另一实施例中，可经由涂布或浸渍支撑结构(即，能够支撑医药学上可接受的载 剂或赋形剂且含有本发明化合物的框架，例如用于脉管系统中的血管支架或分流管、冠 状动脉支架、周围血管支架、导管、动-静脉移植物、旁路移植物和药物递送球囊)来递 送含有免疫亲和素配体的组合物。在一个实施例中，适于使用的涂层包括(但不限于) 聚合物涂层，其由实质上溶解本发明化合物的任何聚合材料构成。所属领域技术人员已 知支撑结构和涂布或浸渍方法，例如美国专利第6,890,546号中所述的支撑结构和方法， 且其并不限制本发明。
在另一实施例中，可经鼻内或支气管内递送气雾剂形式的含有免疫亲和素配体的组 合物。
这些游离碱或医药学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液或悬浮液是在适当混 有诸如羟丙基纤维素等表面活性剂的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇和其于油中 的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物 生长。
适于注射使用的医药形式包括无菌水溶液或水性分散液，以及供即时制备无菌可注 射溶液或分散液的无菌散剂。在所有情况下，所述形式都为无菌的且可流动以致易于注 射。其在制造和储存条件下稳定，并能防止诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。载剂 为例如含有水、乙醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适当混合物和植物油 的溶剂或分散介质。
本发明还提供含有免疫亲和素配体的试剂盒或包装。本发明的试剂盒可包括所述配 体和如上文所论述的适于投与哺乳动物个体的载剂。所述试剂盒还可含有制备免疫亲和 素配体所需的试剂。包含复合物、其组分和/或试剂和使用说明的试剂盒也在本发明的范 围内。
提供以下实例以说明本发明，且所述实例并不限制本发明的范围。所属领域技术人 员将了解，尽管以下实例中对特定试剂和条件进行略述，但仍可进行意欲涵盖在本发明 的精神和范围内的修改。
实例1.雷帕霉素I和II的合成
FK506和雷帕霉素与其个别蛋白质靶的复合物产生免疫抑制活性，这在慢性神经变 性治疗过程中是不合需要的(兰姆(Lam)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270， 26511-22(1995))。因此，为了研发非免疫抑制性免疫亲和素配体，由雷帕霉素与亚硝基 苯在C1，C3二烯处发生[4+2]环加成，以便在存留完整FKBP结合部分的同时破坏与 mTOR的相互作用(如下文较为详细地描述)，从而来制备雷帕霉素类似物I和II(图 1A)。
雷帕霉素类似物I的合成
化学试剂都购自西格玛-阿德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St. Louis，MO，USA))。
在缓慢加热下，将雷帕霉素(0.3g，0.328mmol)溶解于5mL甲苯中。向此溶液 中逐滴加入亚硝基苯(0.1g，3eq)于5mL甲苯中的溶液。在70℃下，将反应混合物 搅拌16小时，且随后经由反相高效液相色谱(HPLC)(柱：250×20mm YMC ODS-A， 具有50×20的保护装置；流动相：80％到85％甲醇∶水，持续40分钟，流速＝20mL/min) 色谱分离产物，得到0.139g产物(42％产率，tR＝12.1min，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-AS-3 120埃，流动相/梯度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)到5％ 水，持续6分钟，在5％下保持9分钟，流速＝0.30mL/min)。1H-NMR(500MHz，CD3CN)： δ7.29(m，2H，H57)，7.02(m，2H，H56)，6.90(m，1H，H58)，6.25(m，1H，H2)，5.65(m，1H， H3)，5.25(m，1H，H29)，5.16(m，1H，H5)，5.12(m，1H，H25)，5.07(m，1H，H4)，4.37(m，1H， H22)，4.09(m，1H，H31)，3.95(m，1H，H32)，3.74(m，1H，H9)，3.69(m，1H，H1)，3.59(m， 1H，31-OH)，3.44(m，1H，H28)，3.44(m，1H，H28)，3.33(s，3H，Me54)，3.29(m，3H，Me53)， 3.27(m，1H，H42)，3.07(m，1H，H34)，3.06(s，3H，Me52)，2.94(m，1H，H18)，2.86(m，1H， H41)，2.84(m，1H，H26)，2.64(m，1H，H26′)，2.14(m，1H，H21)，2.09(m，1H，H12)，2.05(m， 1H，H40)，2.01(m，1H，H36)，.2.00(m，1H，H35)，1.87(m，1H，H37)，1.85(m，1H，H43)， 1.81(m，1H，H21′)，1.78(s，3H，Me48)，1.74(m，1H，H19)，1.74(m，1H，H20)，1.69(m，1H， H8)，1.64(m，1H，H44)，1.63(m，1H，H8′)，1.60(m，1H，H11)，1.55(m，1H，H44′)，1.51(s， 3H，Me45)，1.43(m，2H，H10)，1.42(m，1H，H19′)，1-39(m，1H，H20′)，1.37(m，1H，H39)， 1.27(m，1H，H38)，1.12(d，3H，Me50)，1.06(d，3H，Me47)，1.04(m，1H，H38′)，1.03(d，3H， Me49)，0.89(d，3H，Me51)，0.83(d，3H，Me46)，0.63(m，1H，H40′)；13C-NMR(125MHz， CD3CN)：δ215.4(s，C33)，209.5(s，C27)，198.5(s，C15)，170.6(s，C23)，166.4(s，C16)， 149.2(s，C55)，139.9(s，C6)，138.7(s，C30)，130.0(d，C57)，128.0(d，C3)，127.9(d，C29)， 127.2(d，C5)，127.0(d，C2)，121.5(d，C58)，116.1(d，C56)，99.5(s，C13)，87.3(d，C32)， 85.2(d，C41)，84.8(d，C7)，78.2(d，C31)，77.0(d，C25)，74.5(d，C42)，68.4(d，C4)，68.3(d， C9)，60.3(d，CI)，58.6(q，C53)，57.4(d，C22)，56.9(q，C54)，56.1(q，C52)，46.9(d，C28)， 42.8(d，C34)，41.7(t，C26)，39.5(t，C18)，39.5(t，C8)，38.6(t，C35)，38.5(t，C38)，37.5(d， C36)，35.6(d，C12)，35.3(t，C40)，33.9(d，C37)，33.8(d，C39)，32.9(t，C43)，32.2(t，CIO)， 32.2(t，C44)，28.2(t，C21)，27.7(t，C11)，25.1(t，C19)，21.6(t，C20)，18.5(q，C50)，18.0(q， C49)，16.7(q，C51)，16.3(q，C46)，16.0(q，C47)，12.4(q，C48)，10.8(q，C45)；FT-ICRMS (m/z)：[M+H]+ C57H85N2O14的计算值：1021.59954；实验值：1021.59780。
雷帕霉素类似物II的合成
在18mm试管中，将雷帕霉素类似物I(0.29g，0.284mmol)溶解于7mL甲醇中， 并加入一勺尖的Pd/C催化剂(阿德里奇公司(Aldrich))。在2.0个大气压的H2下，在 帕尔设备上将混合物氢化15分钟。经由反相HPLC(柱：250×20mm YMC ODS-A， 具有50×20的保护装置；流动相：80％甲醇∶水，持续15分钟，随后达到85％持续5分 钟，随后在85％下保持20分钟，流速＝20mL/min)色谱分离产物，得到0.089g产物 (31％产率，tR＝12.6min，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-AS-3120埃，流动相/梯 度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)到5％水，持续6分钟，在5％下保 持9分钟，流速＝0.30mL/min)。1H-NMR(500MHz，CD3CN)：.δ7.25(m，2H，H57)，6.91(m， 2H，H56)，6.79(m，1H，H58)，5.44(m，1H，H29)，5.35(m，1H，H5)，5.24(m，1H，H25)，5.11 (m，1H，H22)，4.50(m，1H，H4)，4.42(m，1H，13-OH)，4.00(m，1H，H31)，3.80(m，1H，H9)， 3.77(m，1H，H32)，3.67(m，1H，H7)，3.57(m，1H，31-OH)，3.43(m，1H，H28)，3.35(m，1H， H18)，3.35(s，3H，Me54)，3.34(m，1H，H1)，3.32(m，1H，H18′)，3.32(s，3H，Me53)，3.27(m， 1H，H42)，3.16(m，1H，H34)，3.08(s，3H，Me52)，3.00(m，1H，42-OH)，2.87(m，1H，H41)， 2.79(m，1H，H26)，2.71.(m，1H，H26′)，2.29(m，1H，H21)，2.18(m，1H，H36)，2.10(m，1H， H40)，1.95(m，1H，H35)，1.95(m，1H，H37)，1.86(m，1H，H43)，1.85(m，1H，H2)，1.85(m， 1H，H3)，1.82(m，1H，H12)，1.79(m，1H，H2′)，1.77(m，1H，H20)，1.71(m，1H，H8)，1.69 (m，1H，H19)，1.68(m，1H，H21′)，1.66(s，3H，Me48)，1.64(m，1H，H44)，1.63(m，1H，H8′)， 1.61(m，1H，H10)，1.60(m，2H，H11)，1.50(m，1H，Me45)，1.46(m，1H，H3′)，1.43(m，1H， H19′)，1.39(m，1H，H20)，1.39(m，1H，H39)，1.35(m，1H，H10′)，1.29(m，1H，H38)，1.26 (m，1H，H43′)，1.13(d，3H，Me47)，1.12(m，1H，H38′)，1.07(d，3H，Me49)，1.03(m，1H， H35′)，1.03(d，3H，Me46)，1.00(m，1H，H44′)，0.97(d，3H，Me50)，0.91(d，3H，Me51)，0.66 (m，1H，H40′)；13C-NMR(125MHz，CD3CN)：δ216.1(s，C33)，210.3(s，C27)，198.3(s，C15)， 170.3(s，C23)，168.3(s，C16)，149.9(s，C55)，139.9(s，C30)，139.4(s，C6)，130.2(d，C57)， 129.4(d，C5)，128.1(d，C29)，119.7(d，C58)，114.2(d，C56)，98.4(s，C13)，88.5(d，C32)， 85.4(d，C41)，85.0(d，C7)，77.7(d，C31)，76.3(d，C25)，74.8(d，C42)，72.3(d，C4)，68.5(d， C9)，60.0(d，C1)，59.2(q，C53)，57.1(q，C54)，56.0(q，C52)，52.0(d，C22)，46.5(d，C28)， 45.1(t，C18)，42.7(d，C34)，42.1(t，C26)，40.8(t，C35)，39.1(t，C38)，38.3(t，C8)，35.7(t， C40)，35.0(d，C12)，34.3(d，C37)，34.1(d，C39)，33.1(t，C43)，32.5(t，C44)，32.1(t，CIO)， 32.0(d，C36)，29.1(t，C11)，28.0(t，C21)，26.8(t，C3)，25.9(t，C19)，21.7(t，C20)，20.6(t， C2)，19.0(q，C49)，17.5(q，C47)，17.4(q，C50)，16.8(q，C46)，16.4(q，C51)，13.1(q，C48)， 10.4(q，C45)；FT-ICRMS(m/z)：[M+H]+ C57H87N2O14的计算值：1023.61519；实验值： 1023.61722。
雷帕霉素类似物I和II的生物活性
方法
神经突起生长的测量
使用2％多聚甲醛将皮层神经元固定5分钟，随后使用4％多聚甲醛固定5分钟。在 阻断溶液(PBS中的0.2％曲通-X(Triton-X)+1.5％正常山羊血清)中培育细胞，随后 加入初级抗体(抗神经元III类β微管蛋白)(TUJ1)(科文斯革新抗体公司(Covance Innovative Antibodies)，加利福尼亚州伯克利(Berkeley，CA))和二级抗体(Alexa Fluor 488山羊抗小鼠)(分子探针公司(Molecular Probes)，加利福尼亚州卡尔斯巴(Carlsbad， CA))。各步骤都在室温下进行1小时。在埃雷斯肯HCS读取器(ArrayScan HCS Reader) (赛罗米公司(Cellomics)，宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh，PA))上，使用神经元细 胞压型生物分析软件(Neuronal Profiling Bioapplication)来分析各条件下的总神经突起 生长。
神经元存活分析(神经丝蛋白ELISA)
在37℃下，将培养物用4％多聚甲醛固定30分钟。通过用含有0.3％曲通X-100和 5％胎牛血清(FBS)的PBS培育45分钟来阻断非特异性结合。随后，在4℃下将培养 物与抗神经丝蛋白(200kD)单克隆抗体(1∶1000，克隆RT-97，嘉美功公司(Chemicon)， 加利福尼亚州特曼库拉(Temecula，CA))一起培育整夜。洗涤后，施用过氧化酶连结的 二级抗体(1∶1000，维特莱布公司(Vector Labs)，加利福尼亚州伯林格姆(Burlingame， CA))并保持2小时。三次洗涤后，将过氧化酶底物K-BlueMax(尼奥公司(Neogen)， 肯塔基州勒辛顿(Lexington，KY)；杨(Young)等人，1999)加入培养物中，并在回转 式振荡器上培育10分钟。过氧化酶底物极易溶于K-BlueMax溶液中。随后，易于使用 美国分子仪器公司(Molecular Devices)的Spectramax Plus比色板读取器在650nm下测 量光学密度。
免疫抑制分析
通过使用RosetteSep，根据制造商的说明(干细胞技术有限公司(StemCell Technologies，Inc.)，英属哥伦比亚温哥华市(Vancouver，British Columbia)))进行负选 择而从周围血淋巴细胞纯化人CD4+T细胞。如布莱尔(Blair)等人，免疫学杂志(J. Immunol.)，160：12，1998中所述，用抗CD3Ab(1μg/107个微球)和抗CD28Ab(0.5μg/107 个微球)涂布甲苯磺酰基活化的磁性微球(戴诺公司(Dynal)，纽约长岛(Great Neck， NY))。使用鼠科IgG使微球的结合能力达到饱和(总蛋白质＝5μg/107个微球)。将涂有 蛋白质的微球加入纯CD4+T细胞(2×106个细胞/毫升，比率：1个珠粒∶1个细胞)中， 并在RPMI、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺培养基中活化72小时。采集细胞，洗涤并 在新鲜培养基中培养整夜，并如本纳特(Bennett)等人，免疫学杂志(J.Immunol.) 170：711，2003中所述，用IL-2进行再刺激。简单说来，对整夜静止的细胞进行重新计数， 将其涂于(105个细胞/孔)平底96孔微量滴定盘上，并在存在增加浓度的化合物的情况 下，用1ng/mL人IL-2(安迪生物科技公司(R&D Systems)，明尼苏达州明尼阿波利斯 (Minneapolis，MN))进行刺激。在培养物再刺激后72小时，用每孔1μCi氚化的胸苷对 板进行脉冲标记，并培育6-16小时的时期。
结论
如上文所述，由雷帕霉素与亚硝基苯在C1，C3二烯处发生[4+2]环加成，以便在存留 完整的化合物FKBP结合部分的同时破坏与mTOR的相互作用，从而制备雷帕霉素类似 物I和II(图1A)。与雷帕霉素(IC50＝0.005μM)相比，化合物II在达到1μM时也未 检测到对于IL-2刺激的CD4+T细胞增殖的抑制。此外，已发现，如通过神经丝蛋白 ELISA所测量，化合物I在所培养的大鼠皮层神经元中能促进神经元存活(图1B)，并 且在皮层神经元(图1C)和F-11细胞(图1D)中都能促进神经突起生长。重要的是， 在缺血性中风的瞬时中脑动脉闭塞模型中，10mg/kg和30mg/kg的化合物2分别使梗塞 体积明显降低24％和23％(参看US 06/0135549的实例9)。已知这些化合物的治疗潜力， 故鉴别这些化合物的细胞靶以评估其在促进神经元存活和神经突起生长方面的作用。
实例2.亲和基质的化学合成和制备
为鉴别靶蛋白，根据傅雷兹(Fretz)等人(同上文)所公开的方法，通过使雷帕霉 素类似物I、雷帕霉素类似物II和美立霉素类似物经由氨基-苯基-丁酸与亲和凝胶10树 脂连接来制备含有所述化合物的亲和基质(图2)。简单说来，通过在室温下用二噁烷∶ 水(3∶1，50ml)中的二碳酸二烯丙酯(1200μM)处理3小时而用烯丙基氧基羰基保护 氨基-苯基-丁酸(1200mg)的氨基。在4℃下，用CH2Cl2(1ml)中的PhOP(O)Cl2DMF 复合物活化所得4-(对N-Alloc-氨基苯基)丁酯(80mg)的酸基，并在室温下，在存在吡 啶(90μM)的情况下，使所述酸基与雷帕霉素类似物I(80mg)的42-羟基反应30分 钟。用甲醇中止反应，并通过HPLC纯化酯产物(纯度为99％)，且通过MS和NMR加 以表征。通过用THF(1.2ml)中的Pd(PPh3)4(2mg)和双甲酮(7mg)处理来去除酯 产物(40mg)的烯丙基氧基羰基，随后在存在THF中的2％吡啶的情况下，使产物的 氨基与亲和凝胶-10基质(4ml)连接。用乙醇、水和乙醇胺50mM Hepes(pH 8.0)缓 冲液洗涤所得亲和凝胶-雷帕霉素类似物I亲和基质，并将其储存于40％乙醇中。
使用类似方法来制备含有雷帕霉素类似物II、美立霉素类似物(U.S.2005/0197379 中作为化合物I揭示)、FK506和雷帕霉素的亲和基质。
实例3.靶蛋白的亲和沉淀
使用实例2中所制备的基质，从F-11(大鼠背根神经节神经元(DRG)与小鼠神经 母细胞瘤的杂合物)细胞沉淀出靶蛋白(普拉提卡D.(Platika，D.)等人，(1985)美国国 家科学院院干(Proc.Natl.Acad.Sci USA)82：3499-3503)。
实验A
在具有5％CO2的37℃恒温箱中，使F11细胞在75cm2透气培养瓶中补充有10％ FBS和1％pen/Strep的DMEM培养基中生长。当80％汇合时，采集细胞，并用PBS缓 冲液洗涤。将溶解缓冲液(6ml；50mM Tris(pH 7.4)、250mM NaCl、5mM EDTA、 50mM NaF、1mM Na3VO4、1％诺纳德P40(NP40)、0.1％巯基乙醇和2％蛋白酶抑制剂 混合物)加入109个细胞中。通过迫使细胞通过26号针使其破裂，并且在4℃下离心15 min，随后收集S-100上清液。在4℃下，将等分试样(2ml)与亲和珠粒(100-150μl； 诸如亲和凝胶10、亲和凝胶10-FK506和亲和凝胶10-雷帕霉素类似物I)混合整夜。用 溶解缓冲液(2ml)且随后用PBS(2ml)洗涤后，在4-20％SDS-PAGE凝胶上对珠粒 进行分析。图2展示以下泳道：F11细胞溶解产物、空白(蛋白质与亲和凝胶-10珠粒结 合)、FK506(蛋白质与亲和凝胶-10-FK506珠粒结合)、雷帕霉素类似物II(蛋白质与 亲和凝胶-10-雷帕霉素类似物I珠粒结合)、标记(蛋白质标准品)。切下蛋白质谱带(图 3)且在30℃下，用消化缓冲液(30μl；0.2％NH4HCO3)中的胰蛋白酶(0.3μg)消化 整夜。在C18树脂上纯化所得肽，并提交用于FT-ICR-MS分析。手动编辑FT-ICR-MS 数据并用于搜索蛋白质数据库。结果展示于图4中并具有以下得分。FK506结合蛋白 (FKBP52)(P30416，得分：94，期望值：9.6e-05)；59kDa谱带的MS数据：2753.35；1710.94； 2215.13；2363.15；1298.71；1215.59；1000.51；1000.46；1790.93；1381.70；2746.36；1316.71； 和1171.60。电压依赖性L型钙通道β亚基(Q8R3Z5-03-00-00，得分：133，期望值： 1e-09)；52kDa谱带的MS数据：651.38；663.39；779.54；853.55；1014.50；1347.75；1217.78； 1346.67；1297.75；1231.77；877.52；853.47；919.48；1014.56；1041.63；1217.74；1231.74； 1296.84；869.58(主要)。
使约60kDa谱带的13个片段与FKBP52蛋白的部分序列匹配，其中p值为9.6e-5； 并使约50kDa谱带的19个片段与电压门控L型钙通道的β1亚基(CACB1)的部分序 列匹配。其它极少量组分为骨架蛋白(肌动蛋白和肌球蛋白)。因此，鉴别出免疫亲和 素FKBP52和CACB1为雷帕霉素类似物I的结合候选物。
实验B
在另一实验中，在具有5％CO2的37℃恒温箱中，使F11细胞在75cm2透气培养瓶 中补充有10％FBS和1％pen/Strep的DMEM培养基中生长。当80％汇合时，采集细胞， 并用PBS缓冲液洗涤。向3×108个细胞中加入溶解缓冲液(2ml；50mM Tris(pH 7.4)、 250mM NaCl、5mM EDTA、50mM NaF、1mM Na3VO4、1％诺纳德P40、0.1％巯基乙 醇和2％蛋白酶抑制剂混合物)，并在4℃下离心15分钟，随后收集其S-100上清液。在 4℃下，将等分试样(2ml)与亲和珠粒(100-150μl)一起培育。用溶解缓冲液(2ml) 且随后用PBS缓冲液(2ml)洗涤后，通过SDS-PAGE对珠粒进行分析。切下蛋白质谱 带(图3)且在30℃下，用消化缓冲液(30μl；0.2％NH4HCO3)中的胰蛋白酶(0.3μg) 消化。将所得肽(2μl)装载到FT-ICR-MS的纳米电喷雾针尖中，并与甲醇(2μl)中 的1％甲酸混合。在纳米电喷雾针尖与玻璃毛细管之间施加约-800V的高电压。使用HP Tuning Mix对所得质谱数据进行外部校准，并将其用于NCBI蛋白质数据库中的Mascot 搜索。根据置信度(p值)选择合理的蛋白质候选物。对于蛋白质免疫印迹分析，通过 SDS-PAGE分离出沉淀的蛋白质，通过电印迹(100V，1hr)将其转印到PVDF膜上， 用抗CACNB1或抗FKBP4抗体进行免疫印迹，并通过3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB) 染色使其显现。
结论
如图5A所示，在雷帕霉素类似物I和II的下拉部分中都发现三个强谱带(220kDa、 60kDa和50kDa)和两个极弱谱带(25kDa和12kDa)。使用各谱带的FT-ICR-MS谱 来进行NCBI数据库的Mascot搜索(参看下表1)。FKBP52(古德B.G.(Gold，B.G.)药 物代谢研究(Drug Metab.Rev.)31，649-663(1999))和电压门控L型钙通道(VGCC) 的β1亚基(CACNB1)(奥帕托瓦斯基Y.(Opatowsky Y.)等人，神经元(Neuron)42， 387-399(2004))。电压依赖性钙通道β亚基功能核心和其与α1相互作用结构域的复合物 的结构分析已鉴别作为雷帕霉素类似物I和II的主要靶，并通过蛋白质免疫印迹确定其 存在(图5B)。在弱谱带中鉴别出FKBP25和FKBP12，而在所有部分中都发现肌球蛋 白和肌动蛋白，这表明其与树脂非特异性结合。
表1.结合雷帕霉素类似物I和II的蛋白质的FT-ICR-MS分析
MS数据 鉴别出的蛋白质 2753.35，1710.94，2215.13，2363.15，1298.71，1215.59，1000.51， 1000.46，1790.93，1381.70，2746.36，1316.71，1171.60 主要谱带，59kDa FKBP52，P＝1e-09 651.38，663.39，779.54，853.55，1014.50，1347.75，869.58(主要)，877.52， 853.47，919.48，1014.56，1041.63，1217.74，1231.74，1296.84，1346.67 主要谱带，52kDa CACNB1，P＝1e-09 616.32，701.42，802.42，888.15，908.97，980.48，1010.56，1132.55， 1405.67，1424.71，1611.90，1764.81，2328.12，2366.15，2342.22， 2365.15，2442.22，2458.17，2493.20，2525.20，3101.49，3277.66， 3235.66，3275.65， 次要谱带(＜5％)， 25kDa， FKBP25，P＝ 3.8e-12 739.47，881.58，1190.68，1314.66，1011.69，1533.69，903.6 次要谱带(＜5％)， 12kDa， FKBP12，P＝0.03
实例4.通过蛋白质免疫印迹和动力学分析表征沉淀的靶
方法
克隆和表达重组基因以及结合分析
使用英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴(Carlsbad，CA))所开发的通 路克隆方法(Gateway cloning method)，将cacnb4/CACNB4、fkbp3/FKBP25、 fkbp4/FKBP52、ppid、ppif和fkbp8/FKBP38基因克隆到pDEST17(N-His6标签)载体中。 由pDEST17-CACNB1使用QuikChange定点突变诱发试剂盒(吉泰公司(Stratagene)， 加利福尼亚州拉霍亚(LaJolla，CA))产生His6-CACNB1：TGG548TAA。在Ni-NTA柱(凯 杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia，CA))上纯化His6标记的蛋白质。 通过SDS-PAGE分析，蛋白质展现高于95％的纯度，并新鲜使用所述蛋白质。在存在2 mM Ca2+和5μM CaM的情况下测试FKBP38(阿尔德里奇F.(Edlich，F.)等人，生物化 学杂志(J.Biol.Chem.)281，14961-14970(2006))。通过SDS-PAGE，根据与空白亲和 凝胶10珠粒相比较，保留在雷帕霉素类似物II基质上的蛋白质的量来测量与雷帕霉素 类似物II的结合。在使各纯化蛋白质(10μM)与[14C]-雷帕霉素类似物I(10μM， 241Ci/mol)在37℃下反应后，通过定量经由TopTip P-4柱与所述蛋白质共洗脱的14C 放射性来测量与雷帕霉素类似物I的结合。通过用雷帕霉素类似物I(1μM)滴定 His6-CACNB1：TGG548TAA蛋白(0-8μM)来测量雷帕霉素类似物I所诱导的蛋白质荧 光淬灭。
动力学分析
通过测定0.1ml含有50mM Hepes(pH 7.4)、0.1％Tween-20、(0-10μM)免疫亲 和素配体、3nM[3H]-FK506(87Ci/mmol)和(5nM)酶的反应混合物中保留在螯合 Ni的FLASH板上的3H FK506的量，来测量免疫亲和素配体与His6标记的FKBP12和 FKBP52蛋白的结合。在25℃下，一式三份进行反应达30分钟。使用卡列拉斯(Carreras) (分析生物化学(Anal.Biochem.)298，57-61(2001))所描述的方法计算Kd。
以下在本文所述实例中所用的材料是从以下市售来源获得：抗体是来自艾宾公司 (Abeam)(马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA))。培养基、人ORF克隆(cacnb1、cacnb4、 fkbp3、fkbp4、fkbp8、ppiF和ppiD)、质粒(pDEST17)和系统都来自 英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴(Carlsbad，CA))。蛋白质纯化试剂盒来自皮尔斯公 司(Pieres)(伊利诺斯州洛克夫(Rockford，IL))或凯杰公司(Qiagen)(加利福尼亚州 瓦伦西亚(Valencia，CA))。TOPTip P-4柱来自格莱金公司(Glygen)(马里兰州哥伦比 亚(Columbia，MD))。螯合Ni的Flash板和[3H]-FK506来自珀金爱尔默生命科学公司 (PerkinElmer Life Science)(马萨诸塞州波士顿(Boston，MA))。PCR试剂和亲和凝胶 10来自伯乐公司(BioRad)(加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules，CA))。大鼠基因组 2302.0来自(加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara，CA))。 FT-ICR-MS分析是在布鲁克公司(Bruker)(马萨诸塞州毕莱卡(Billerica，MA))的装 备有主动防护9.4特斯拉超导磁体(actively shielded 9.4 Tesla superconducting magnet) (英国麦吉克科技有限公司(Magnex Scientific Ltd.，UK))和外部布鲁克APOLLO ESI 源的APEXII FT-ICR质谱仪上进行。
结论
表2展示FK506和雷帕霉素以可相当的亲和力与FKBP12和FKBP52结合 (Kd(FKBP12)/Kd(FKBP52)分别为0.46和0.23)。相比之下，与FKBP12相比，化合物2 展示明显优选与FKBP52结合(Kd(FKBP12)/Kd(FKBP52)＝229)。由于化合物2具有与 雷帕霉素相同的供FKBP结合的甲基哌啶部分，并且修饰位点在远端，故这是出乎意料 的。X射线结构已展示，FKBP52和FKBP12的异构酶结构域极为类似(吴(Wu)等人， 美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)101，8348-53(2004))，并且其活性位点 残基的序列比对展示仅一个氨基酸的差异(FKBP12中的His87相对于FKBP52中的 Ser118)(道南(Dornan)等人，医药化学当前论题(Curr.Top.Med.Chem.)3，1392-1409 (2003))。已知雷帕霉素和其类似物因关于酰胺键旋转而以一组主要和次要的分解构象体 形式存在(凯斯勒(Kessler)等人，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)76，117-130(1993))。 另一部分NO-苯基部分影响大环内酯构象体的总群体，而所述群体又影响免疫亲和素选 择性。这一观察似乎与化合物2对不同但同源的免疫亲和素的结合亲和力存在明显差异 相一致，似乎与所报导的雷帕霉素与FK506之间关于FKBP25的结合亲和力的明显差异 相符(盖勒特(Galat)等人，生物技术(Biochemistry)31，2427-2434(1992))。这展示 增强与特定FKBP结合的雷帕霉素的非骨架修饰。
为进一步验证化合物对免疫亲和素和相关亲环素的特异性，已测量化合物1和化合 物2与经纯化的重组FKBP25、FKBP38、亲环素F(PPID)、亲环素D(PPIF)的结合。 这些靶是根据化合物2的活体内活性(见下页)进行选择，因为据报导，这些靶在中风 模型中极为重要(阿尔德里奇(Edlich)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)281， 14961-14970(2006)；拜尼斯(Baines)等人，自然(Nature)434，658-662(2005)；阿 尔德里奇(Edlich)等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)24，2688-2699(2005))。[14C]-1 与各种推定的靶的结合结果展示于图5C中。在10μM浓度下，[14C]-1与FKBP结合良 好，与PPID结合较弱，并且与PPIF和FKBP38/Ca2+/CaM的结合可忽略不计。化合物2 还以类似的选择性概况结合FKBP52、FKBP25和FKBP12(图5D，表2)。
表2.免疫亲和素配体与FKBP12和FKBP52的结合
化合物 FKBP 12(Kd，nM) FKBP 52(Kd，nM) FK506 0.33±0.03(Lit.0.430) 0.72±0.07 雷帕霉素类似物II 110±11 0.48±0.04 雷帕霉素类似物I 4.7±0.4 0.55±0.05 雷帕霉素 0.33±0.03 1.4±0.1 GPI-1046 ＞110 ＞12
利用亲和纯化鉴别其它主要结合蛋白并通过蛋白质免疫印迹分析来证实(图6A)， CACNB1为一种与原代神经元中L型Ca2+通道相关的β亚基。为进一步验证这一作为化 合物1和2的结合搭配物的特定亚基，测定化合物与VGCC β4亚基(CACNB4)和C 末端截短的CACNB1的结合(图6B)。通过从CACNB1去除51个C末端残基，制备得 到重组His6-CACNB1：TGG548TAA蛋白。由于全长CACNB4的序列与CACNB1同源， 故也测试与全长CACNB4的结合(奥帕托瓦斯基Y.(Opatowsky，Y.)等人，神经元 (Neuron)42，387-399(2004))。在10μM浓度下，[14C]-化合物1与突变 His6-CACNB1：TGG548TAA结合较弱，且与CACNB4的结合可忽略不计。为进一步确认 化合物1与His6-CACNB1：TGG548TAA突变体的结合，测量由化合物1所诱导的蛋白质 荧光淬灭。图6C展示线性剂量反应曲线，表明化合物1与CACNB1结合。化合物2还 以类似选择性概况结合CACNB1(图6D)
也使用相应抗体，通过蛋白质免疫印迹来确认雷帕霉素类似物I的药物靶或结合候 选物(免疫亲和素FKBP52和CACB1)的存在。通过4-20％SDS-PAGE凝胶来分离亲 和珠粒上的蛋白质，并在100V下将其转印到PVDF膜上并保持1小时。利用阻断溶液、 初级抗体(抗FKBP52或抗Ca2+通道β1亚基抗体；1∶200稀释)和二级抗体(过氧化酶 连结的抗兔IgG抗体；1∶1000稀释)使膜显现印迹。如图8所示，在TMB染色后观测 靶蛋白的存在。
蛋白质免疫印迹分析证实，两种蛋白质都与雷帕霉素类似物I结合，但都不与空白 珠粒结合。在雷帕霉素类似物I珠粒和FK506珠粒部分中检测到FKBP52，但在空白珠 粒中未检测到。仅在雷帕霉素类似物I珠粒部分中检测到电压依赖性L型钙通道β1亚 基。这表明雷帕霉素类似物I特异性结合FKBP52和电压门控L型钙通道β1亚基。
实例5.新颖复合物FKBP52-雷帕霉素类似物1-Ca2+通道β1亚基的形成
使用共免疫沉淀来研究FKBP52、雷帕霉素类似物I与电压门控钙通道β1亚基的复 合物的形成。简单说来，在4℃下，将F11细胞溶解产物的等分试样(1.8ml)分别与0、 5和50μM雷帕霉素类似物I混合5小时。将抗FKBP52抗体以1∶200稀释度加入各等 分试样中，并在4℃下培育5小时。随后加入蛋白质A珠粒(50-100μM)以使缔合抗 FKBP52抗体的复合物沉淀。用PBS缓冲液洗涤珠粒上免疫沉淀的蛋白质，在4-20％ SDS-PAGE凝胶上进行分离，将其转印到PVDF中，并用抗Ca2+通道β1亚基抗体(1∶500 稀释)进行免疫印迹，以检测β1亚基。
结论
结果展现于图7中。在不存在雷帕霉素类似物I的情况下，Ca2+通道β1亚基不与 FKBP52一起沉淀，这表明Ca2+通道β1亚基不与FKBP52缔合。在存在雷帕霉素类似物 I(5μM)的情况下，大量Ca2+通道β1亚基与FKBP52共免疫沉淀，表明形成复合物。 然而，过量的雷帕霉素类似物I(50μM)会降低沉淀的β1亚基的量，表明形成较少量 的复合物，这可能是由于在有限量的溶解产物中FKBP52和β1亚基上的化合物结合位 点达到饱和所引起。
实例6.复合物形成与神经突起生长相关
使用神经丝蛋白ELISA来测量在不存在或存在雷帕霉素类似物I的情况下生长的 F11细胞的神经突起生长。简单说来，使F11细胞在不补充有10％FBS、1％pen/Strep 和雷帕霉素类似物I(0、5或50μM)的DMEM中生长96小时。在37℃下，将细胞用 4％多聚甲醛固定30分钟。通过用含有0.3％曲通X-100和5％胎牛血清(FBS)的PBS 培育45分钟来阻断非特异性结合。随后，在4℃下将培养物与抗神经丝蛋白(200kD) 单克隆抗体(1∶1000)一起培育整夜。洗涤后，施用过氧化酶连结的抗小鼠二级抗体 (1∶1000)并保持2小时。三次洗涤后，将过氧化酶底物K-BlueMax加入培养物中并培 育10分钟。在650nm下测定光学密度。
结论
结果展现于图8中。用5μM雷帕霉素类似物I处理的细胞展现比用50μM雷帕霉 素类似物I或无化合物对照处理的细胞高4-5倍的神经丝蛋白含量，表明在5μM雷帕霉 素类似物I下存在强神经突起生长。这与在存在相同浓度的雷帕霉素类似物I的情况下 的复合物形成直接相关。
实例7.在用雷帕霉素类似物处理后，F-11细胞中钙通道电生理学特性的评估
方法。全细胞膜片钳记录
使用膜片钳技术的全细胞配置，从而在室温下使用EPC-9放大器(HEKA仪器科技 公司(HEKA，Instrutech Corp.))，利用来自HEKA的采集和分析程序Pulse-PulseFit(德 国兰博瑞(Lambrecht，Germany))来记录细胞中的钙电流。电极是使用P-S7拉制器(萨 特仪器公司(Sutter Instrument))制造。当填充记录溶液(140mM CsCl、10mM EGTA、 10mM HEPES、5mM MgCl2、2M ATP、1mM cAMP，pH 7.2)时，电极的电阻为2-5MΩ。 标准的浸渍记录溶液为含有10mM HEPES、10mM右旋糖和4mM BaCl2的无Ca2+和 Mg2+的HBSS(pH 7.4)。在3kHz下过滤电流，并记录保持在-90mV下的细胞的内部 Ca2+电流，其中以10mV自-80mV去极化阶跃至60mV，历时50ms。
结论
CACNB1为一种与原代神经元中的L型Ca2+通道缔合的β1亚基(毕奇勒(Pichler) 等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，13877-13882(1997))。已知β1b、β3和β4 亚基能增强L型Ca2+通道电流，而β2亚基则起到负面作用(奥帕托瓦斯基(Opatowsky) 等人，神经元(Neuron)42，387-399(2004)；斯奇杰特(Schjott)等人，生物化学杂志 (J.Biol.Chem.)278，33936-33942(2003))。如果雷帕霉素类似物与β1亚基的结合能抑 制此亚基的功能，则预期L型Ca2+电流会降低。因此，测量在用雷帕霉素类似物1处理 后，F-11细胞中Ca2+通道的电生理学特性。
所记录的F-11细胞中的全细胞Ca2+电流不会受化合物1的短时间浸浴液应用(10 min应用；在此时间内，FK506抑制Ca2+电流)影响，因此将细胞暴露于5μM 1达2 小时，且随后将其与媒剂处理的对照相比较。此处理范例使所述细胞中所检测的Ca2+电 流明显降低，以致电流密度从6.5+/-0.5pA/pF降低到3.2+/-0.3pA/pF，降幅达49％(图 9A)。还发现，FK506对Ca2+电流产生与关于Ca2+电流的钙神经素依赖性作用所述类似 的作用(电流降低到2.9+/-0.1pA/pF，降幅达55％)(安恒(Yasutsune)等人，英国药理 学杂志(British Journal of Pharmacology)126(3)，717-729(1999)；福柯尼尔J.(Fauconnier， J.)等人，美国生理学杂志：心脏和循环生理学(Am J Physiol Heart Circ Physiol.)288， H778-H786(2005))。在与大量化合物1组合的情况下，这需要在随后的实验中借助于记 录膜片移液管将所述化合物直接加入细胞中。
从实现全细胞配置时开始(时间0)，经由扩散进入细胞中的化合物1的内部施用立 即对Ca2+电流产生抑制作用，在数分钟内达到电流阻断的稳态水平。有趣的是，化合物 在F-11中的作用是极有价值的，但作为DRG与神经母细胞瘤细胞的杂合物，已知N- 和L型Ca2+通道的表达谱随个别F-11细胞而不同(伯兰德L M.(Boland，L M.)等人，生 理学杂志(Journal of Physiology)420，223-245(1990))。如通过用BAY-K5552(L型阻 断剂)进行抑制所测定，一些细胞(图9C)主要含有L型Ca2+通道，而其它细胞(图 9D)主要含有受ωCTX MVIIA(N型阻断剂)抑制的N型通道。图9C展示在响应 BAY-K5552的细胞中，用化合物1处理能降低Ca2+电流，而图9D中说明不响应化合物 1的细胞如何含有对ωCTX MVIIA敏感的Ca2+电流。在图9C的情况下，内部施用化合 物1(10μM)能在10分钟内使Ca2+电流平均降低46+/-1.8％(图9C)。在明显响应coCTX MVIIA的细胞中未发现电流的明显降低(图9D)。在所培养的大鼠海马神经元上进行雷 帕霉素类似物对Ca2+电流的作用的进一步验证。当阻断N型Ca2+通道并将化合物2(10 μM)加入内部移液管溶液中时，10分钟后，电流缓慢抑制达74.5+/-8.8(图9E、F)。 这一作用至少部分归因于L型通道的抑制，因为N-和L型Ca2+通道的阻断使所述抑制 降低到仅为细胞中残余电流的21.3+/-4.4％(图9F)。
实例8.用雷帕霉素类似物处理后的转录谱
方法
转录谱
由E16大鼠胚胎制备皮层神经元。在涂板24小时后，用10μM免疫亲和素配体和 相应媒剂处理培养物。处理4小时、12小时、24小时和48小时后，溶解细胞。用 微型试剂盒提取各样本的总RNA。使用系统 由2μg各RNA样本合成双链cDNA，纯化，在活体外转录，以在 存在生物素标记的UTP和CTP的情况下使用T7RNA聚合酶来制备生物素标记的 cRNA。如制造商所推荐，将分成片段的cRNA与大鼠基因组2302.0 (加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara，CA))杂交。根据制造商的方 案，在Fluidics Station 450上对杂交阵列进行染色，且随后在扫描仪上 进行扫描。使用MAS 5.0软件产生原始数据。在英杰提公司(Ingenuity) 中分析转录谱。
结论
为进一步分析雷帕霉素类似物结合的下游结果，获得用10μM雷帕霉素类似物I或 II处理的大鼠皮层神经元培养物的转录谱数据。
转录谱表明，在雷帕霉素类似物I或II处理后，Ca2+信号转导路径完全下调(参看 表3A)。雷帕霉素类似物I引起诸如VGCC、瞬时受体电位通道、谷氨酸受体的N-甲基 D-天冬氨酸亚型(NMDA)和SHT3R通道等主要质膜Ca2+流入通道的下调。在这些通 道中，Ca2+经由NMDA通道流入为导致细胞凋亡的主要事件(高希(Ghosh)等人，科 学(Science)268，239-247(1995))。已知能裂解NMDA肽并活化Ca2+流入的纤溶酶原 活化剂(PLAU)(塔尼利斯(Traynelis)等人，自然医药(Nat.Med.)7，17-18(2001)) 明显下调(经雷帕霉素类似物I处理的情况下下调-40倍；经雷帕霉素类似物II处理的 情况下下调-10倍)；这很可能降低通过NMDA通道的钙流入。另外，IP3受体的下调可 能降低内部储存的Ca2+释放，并且钙调蛋白和钙调蛋白激酶的下调(例如PNCK，-20 倍)将减少胞浆Ca2+信号转导。所观察到的Ca2+流入和Ca2+信号转导路径的减弱对于治 疗中风和外伤性脑损伤极为重要，这是因为，一般认为神经元中Ca2+过载是引发Ca2+ 依赖性过程，从而最终导致神经元死亡的关键事件(高希(Ghosh)等人，科学(Science) 268，239-247(1995))。此外，细胞Ca2+含量降低可通过Bcl2(阿尔德里奇(Edlich)等 人，生物化学杂志(J.Bial.Chem.)281，14961-14970(2006))或PPID缔合的线粒体透 性转运孔(白恩斯(Baines)等人，自然(Nature)434，658-662(2005))的 FKBP38/Ca2+/CaM活化来抑制细胞凋亡。
观察到胆固醇生物合成基因的明显上调(例如LSS，+13倍)，表明类固醇受体活化 (王(Wang)等人，脂质研究杂志(J.Lipid Res.)47，778-786(2006))(参看表3B)。 已报导类固醇激素或格尔德霉素(geldanamycin)能刺激神经突起生长，由于类固醇受 体可通过FK506活化，故雷帕霉素类似物I和II与FKBP52的结合可能活化类固醇受体 并促进神经突起生长。
表3A：钙信号转导路径基因
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 ACTA1 肌动蛋白，α1，骨 骼肌 -1.6 ＜0.001 -1.53 ＜0.001 细胞质 其它 ACTA2 肌动蛋白，α2，平 滑肌，主动脉 1.37 0.089 1.41 ＜0.001 细胞质 其它 AKAP5 - -1.5 0.17 -2.56 0.003 质膜 其它 ASPH 天冬氨酸β-羟化 酶 -3.27 ＜0.001 -3.19 ＜0.001 细胞质 酶 ATP2A2 ATPase，Ca++转 运，心肌，慢肌2 2 ＜0.001 1.85 ＜0.001 细胞质 转运蛋白 ATP2B1 ATPase，Ca++转 运，质膜1 1.81 0.003 1.53 0.016 质膜 转运蛋白 ATP2B3 ATPase，Ca++转 运，质膜3 -1.45 0.019 -1.54 0.009 质膜 转运蛋白 ATP2C1 ATPase，Ca++转 运，2C型，成员1 -1.32 0.002 -1.38 ＜0.001 细胞质 转运蛋白 CABIN1 钙神经素结合蛋 白1 1.34 0.01 1.33 0.011 核 其它
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 CACNA1 B 钙通道，电压依赖 性，L型α1B亚基 -1.45 0.001 -1.77 ＜0.001 质膜 离子通道 CACNA1 C 钙通道，电压依赖 性，L型α1C亚基 1.82 0.001 1.48 0.001 质膜 离子通道 CACNA1 D 钙通道，电压依赖 性，L型α1D亚基 -1.28 0.21 -1.72 0.017 质膜 离子通道 CACNA2 D1 钙通道，电压依赖 性，α2/δ亚基1 5.73 0.009 3.47 0.03 质膜 离子通道 CACNB1 钙通道，电压依赖 性，β1亚基 -1.14 0.051 -1.32 0.026 质膜 离子通道 CACNG2 钙通道，电压依赖 性，γ亚基2 -2 ＜0.001 -1.8 ＜0.001 质膜 离子通道 CACNG3 钙通道，电压依赖 性，γ亚基3 -2.46 0.001 -3.73 ＜0.001 质膜 离子通道 CALM1 钙调蛋白1(磷酸 化酶激酶，δ) -1.63 ＜0.001 -1.74 ＜0.001 质膜 其它 CALM2 钙调蛋白2(磷酸 化酶激酶，δ) -1.33 0.007 -1.22 0.028 质膜 其它 CALM3 钙调蛋白3(磷酸 化酶激酶，δ) -1.52 0.005 -1.34 0.01 质膜 其它 CALR 钙网蛋白 1.19 0.016 1.18 0.023 核 转录调控因 子 CAMK1 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶I -1.43 0.006 -1.6 0.001 细胞质 激酶 CAMK4 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶IV -1.33 0.46 -1.42 0.049 核 激酶 CAMK1G 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶IG -2.26 ＜0.001 -2.47 ＜0.001 质膜 激酶 CAMK2A 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶(CaM 激酶)IIα -4.13 0.06 -2.03 0.004 细胞质 激酶 CAMK2B 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶(CaM 激酶)IIβ -1.88 ＜0.001 -1.82 ＜0.001 细胞质 激酶 CAMK2D 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶(CaM 激酶)IIδ -1.48 0.002 -1.45 0.004 细胞质 激酶 CHP 钙结合蛋白P22 1.54 0.001 1.65 0.001 细胞质 转运蛋白 CREBBP CREB结合蛋白 (鲁宾斯坦-泰比 5.84 0.004 4.14 0.009 核 转录调控因 子
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 综合症 (Rubinstein-Tayb i syndrome)) DSCR1 唐氏综合症临界 区基因1 -1.82 ＜0.001 -1.93 ＜0.001 核 转录调控因 子 DSCR1L 1 唐氏综合症临界 区基因1样1 -4.73 ＜0.001 -4.44 0.001 未知 其它 GRIM 谷氨酸受体，离子 移变型AMPA1 -2.16 0.001 -2.78 0.008 质膜 离子通道 GRIA2 谷氨酸受体，离子 移变型AMPA2 2.71 0.002 2.74 ＜0.001 质膜 离子通道 GRIN1 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基D- 天冬氨酸1 -2.8 0.001 -2.41 ＜0.001 质膜 离子通道 GRIN2B 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基D- 天冬氨酸2B -1.57 0.052 -1.94 0.008 质膜 离子通道 GRIN3A 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基-D- 天冬氨酸3A -2.94 0.063 1.84 0.013 质膜 离子通道 GRINA 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基D- 天冬氨酸相关蛋 白1(结合谷氨酸) -1.2 0.009 -1.21 0.007 未知 离子通道 HDAC5 组蛋白脱乙酰基 酶5 1.8 0.014 1.78 0.016 核 转录调控因 子 HDAC6 组蛋白脱乙酰基 酶6 -1.13 0.015 -1.18 0.005 核 转录调控因 子 HDAC7A 组蛋白脱乙酰基 酶7A 1.27 0.007 1.24 0.011 核 转录调控因 子 HTR3A 5-羟基色胺(血清 素)受体3A -1.64 0.005 -1.57 0.005 质膜 离子通道 ITPR3 肌醇1，4，5-三磷酸 受体，3型 -1.93 0.002 -1.85 0.019 细胞质 离子通道 MAPK1 丝裂原活化蛋白 激酶1 1.38 0.009 1.29 0.029 细胞质 激酶 MAPK3 丝裂原活化蛋白 激酶3 -1.19 0.046 -1.31 0.01 细胞质 激酶 MYH1 肌球蛋白，重肽 (heavy -2.17 0.008 -2.18 0.006 细胞质 酶
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 polypeptide)1，骨 骼肌，成人 MYH6 肌球蛋白，重肽6， 心肌，α (肥厚性心肌症 1) -5.93 0.017 -7.18 0.02 细胞质 其它 MYH7 肌球蛋白，重肽7， 心肌，β -5.88 ＜0.001 -6.11 ＜0.001 细胞质 其它 MYL6B 肌球蛋白，轻肽 6B，碱性，平滑肌 和非肌肉 -1.68 ＜0.001 -1.69 0.001 细胞质 其它 PPP3CB 蛋白磷酸化酶3 (先前为2B)，催 化亚基，β同功异 形体(钙神经素 Aβ) -1.27 ＜0.001 -1.3 ＜0.001 未知 磷酸化酶 PPP3CC 蛋白磷酸化酶3 (先前为2B)，催 化亚基，γ同功异 形体(钙神经素 Aγ) -1.27 0.007 -1.18 0.037 未知 磷酸化酶 PPP3R1 蛋白磷酸化酶3 (先前为2B)，调 控亚基B，19kDa， α同功异形体(钙 神经素B，I型) -1.44 0.039 -1.49 0.031 细胞质 磷酸化酶 PRKAG1 蛋白激酶，AMP 活化，γ1非催化亚 基 -1.24 0.005 -1.21 0.012 未知 激酶 PRKAR1 A 蛋白激酶，cAMP 依赖性，调控，I 型，α(组织特异 性消失基因1) -1.1 0.001 1.08 0.015 细胞质 激酶 PRKAR1 B 蛋白激酶，cAMP 依赖性，调控，I 型，β -3.18 ＜0.001 -3.36 ＜0.001 细胞质 激酶 PRKAR2 A 蛋白激酶， cAMP依赖性，调 控，II型，α -1.23 0.26 -1.56 0.047 细胞质 激酶 PRKAR2 蛋白激酶， -1.5 ＜0.001 -1.56 ＜0.001 细胞质 激酶
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 B cAMP依赖性，调 控，II型，β RAP1B RAP1B，RAS致 癌基因家族成员 -1.33 0.002 -1.29 ＜0.001 细胞质 酶 TPM1 原肌球蛋白1(α) -2.83 0.002 -2.55 ＜0.001 细胞质 其它 TPM3 原肌球蛋白3 -1.99 0.001 -2.04 ＜0.001 细胞质 其它 TRPC1 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 C，成员1 -1.08 0.33 -1.21 0.033 质膜 离子通道 TRPC3 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 C，成员3 -1.95 0.003 -2.4 0.015 质膜 离子通道 TRPC4 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 C，成员4 -5.42 0.023 -4.56 0.005 质膜 离子通道 TRPV6 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 V，成员6 1.73 ＜0.001 1.65 ＜0.001 质膜 离子通道
表3B：固醇生物合成路径基因
基因符号 基因名 2相对 于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对于 DMSO的 改变倍数 1相对于 DMSO的 p值 位置 家族 CYP27B1 细胞色素 P450，家族27， 亚家族B，多 肽1 -1.38 0.008 -1.27 0.055 细胞质 酶 DHCR7 7-脱氢胆固醇 还原酶 1.73 0.001 1.84 ＜0.001 细胞质 酶 EBP 依莫帕米 (emopamil) 结合蛋白(固 醇异构酶) 1.32 0.034 1.45 0.012 细胞质 酶 FDFT1 法呢基-二磷 酸法呢基转移 酶1 1.89 0.001 1.94 ＜0.001 细胞质 酶
基因符号 基因名 2相对 于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对于 DMSO的 改变倍数 1相对于 DMSO的 p值 位置 家族 FDPS 法呢基二磷酸 合成酶(法呢 基焦磷酸合成 酶，二甲基烯 丙基 转移酶，香叶 基转移酶) 2.07 ＜0.001 2.34 ＜0.001 细胞质 酶 HMGCR 3-羟基-3-甲基 戊二酰-辅酶A 还原酶 2.26 ＜0.001 2.24 ＜0.001 细胞质 酶 IDI1 异戊烯基-二 磷酸δ异构酶 1 2.85 ＜0.001 3.24 ＜0.001 细胞质 酶 LSS 羊毛固醇合成 酶(2，3-氧鲨烯 -羊毛固醇环 化酶) 13.19 0.009 13.3 0.009 细胞质 酶 MVD 甲羟戊酸(二 磷酸)脱羧酶 1.81 0.005 1.94 0.004 细胞质 酶 MVK 甲羟戊酸激酶 (甲羟戊酸尿 症) 1.6 0.001 1.6 ＜0.001 细胞质 激酶 NQO1 NAD(P)H脱 氢酶，苯醌1 1.64 0.001 1.8 ＜0.001 细胞质 酶 PMVK 磷酸甲羟戊酸 激酶 1.25 0.024 1.33 0.009 细胞质 激酶 SC5DL 固醇-C5-去饱 和酶(ERG3 δ-5-去饱和酶 同系物，真菌) 样 1.94 ＜0.001 2.01 0.001 细胞质 酶 SQLE 鲨烯环氧酶 1.9 ＜0.001 1.92 ＜0.001 细胞质 酶
实例10.电压门控L型钙通道β1亚基的减少刺激神经突起生长
使用RNAi技术来降低CACB1(Ca2+通道β1亚基)和FKBP4(TFKBP52)基因的 转录水平，并通过生长表型来检查生物作用。
方法
神经元培养物
简单说来，由胚龄为15天(E15)的大鼠胚胎(斯普拉-道来大鼠(Sprague-Dawley)， 查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories)，马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington， MA))制备皮层神经元培养物。收集胚胎，去除其脑部，并在无Ca2+和Mg2+的冰冷的 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中解剖皮层。将解剖的皮层组织碎片汇集在一起，并转移 到伊尔氏平衡盐溶液(Earle′s balanced salt solution)(沃斯辛顿生物化学品公司 (Worthington Biochemical)，新泽西州弗里霍尔德(Freehold，NJ))中含有20IU/ml木瓜 蛋白酶的酶解离培养基中，且在37℃下培育30分钟。酶促解离后，抽吸出木瓜蛋白酶 溶液，并在含有2,000IU/ml DNase和10mg/ml卵类粘蛋白(ovomucoid)蛋白酶抑制剂 的完全培养基[具有B-27补充(吉凯公司(Gibco)，纽约长岛(Grand Island，NY))、100 IU/ml青霉素(penicillin)、100μg/ml链霉素(streptomycin)、3.3μg/ml蚜肠霉素 (aphidicolin)、0.5mM谷氨酸的Neurobasal培养基]中，用烧边的巴氏移液管(fire-polished Pasteur pipette)机械地湿磨组织。
原代皮层神经元中siRNA的瞬时转染
对于各条件，利用200ng siGLO层粘连蛋白A/C siRNA(达哈麦肯RNA技术公司 (Dharmacon RNA Technologies)，科罗拉多州博尔德(Boulder，CO))、L型钙通道β1亚 基siRNA(GGAGAAGUACAAUAAUGACTT(SEQ ID NO：15)(有义链)和 GUCAUUAUUGUACUUCUCCTT(SEQ ID NO：16)(反义链))或FKBP4siRNA (CCUAGCUAUGCUUUUGGCATT(SEQ ID NO：17)(有义链)和 UGCCAAAGCAUAGCUAGGTT(SEQ ID NO：18)(反义链))(安比隆公司(Ambion， Inc.)，得克萨斯州奥斯汀(Austin，TX))，使用程序DC-104在96孔Shuttle核转染系统 (艾玛斯生物系统公司(amaxa biosystems)，马里兰州盖瑟斯伯格(Gaithersburg，MD)) 上转染5×105个皮层神经元。将25μl各转染反应物加入涂有聚D-赖氨酸的96孔(每 一实验4个孔)中。将转染过的皮层神经元保持培养24小时。
蛋白质免疫印迹
将用零乱的siRNA、层粘连蛋白A/C、CACNB1或FKBP52siRNA处理的皮层神经 元溶解于含有蛋白酶抑制剂混合液和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并使用布莱克福 德分析(Bradford assay)(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories)，加利福尼亚州赫拉 克勒斯(Hercules，CA))测量蛋白质浓度。将每一条件下2μg蛋白质装载到各孔中，并 经由SDS-PAGE分离。将蛋白质转移到硝基纤维素上并与抗层粘连蛋白A/C(奥普斯特 公司(Upstate))、CACNB1(艾比姆公司(abeam)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA)) 或FKBP52(圣塔克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.))的抗体一起培 育并以肌动蛋白(西格玛公司(Sigma))作为装载对照。显现谱带，并使用奥德赛红外 成像系统(Odyssey Infrared Imaging System)和奥德赛软件(利克生物科技公司(Li-Cor Biosciences)，内布拉斯州林肯(Lincoln，NE))进行定量。蛋白质表达敲除(knock down) 是计算为随零乱siRNA表达百分比变化的与肌动蛋白的比率。
结论
为进一步证实雷帕霉素类似物I或II对FKBP52和CACNB1的抑制有助于神经突 起生长和神经元存活，利用针对层粘连蛋白A/C(用作对照)、FKBP52、CACNB1或 FKBP52+CACNB1的siRNA转染大鼠皮层神经元，并在24小时后测量总神经突起生 长。总神经突起生长在CACNB1 siRNA处理的神经元中相比对照基本上没有变化，但在 FKBP52 siRNA-(对照的125±12％)和FKBP52+CACNB1 siRNA处理(对照的126± 14％)的神经元中明显增加(图10A)，表明FKBP52的抑制作用刺激神经突起生长。同 时，还通过ELISA分析来定量神经丝蛋白表达，从而评定siRNA对神经元存活的影响。 神经元存活百分比在CACNB1 siRNA处理的细胞中相比对照有所降低(对照的80± 3％)，且在FKBP52 siRNA处理的细胞中略有增加(对照的112±2％)，且在FKBP52+ CACNB1 siRNA处理的细胞中明显增加(对照的152±2％)(图10B)，表明减少FKBP52 和CACNB1能促进神经元存活。进行蛋白质免疫印迹来验证：siRNA处理在24小时后 降低皮层神经元中层粘连蛋白A/C、CACNB1或FKBP52蛋白的表达。代表性印迹展示 于图10C中。层粘连蛋白A/C的表达降低79.21±13.68％，CACNB1的表达降低70.79± 20.79％，且FKBP52的表达降低86.83±7.03％(n＝3)。
这些实验表明，雷帕霉素类似物I与FKBP52和电压门控L型钙通道β1亚基形成 新颖复合物。复合物的形成抑制β1亚基的活性，并刺激神经突起生长。其还表明，通 过修饰雷帕霉素的mTOR结合区所制备的两种实质上非免疫抑制性的免疫亲和素配体 雷帕霉素类似物I和II(艾伯汉姆(Abraham)等人，免疫学研究年鉴(Annu.Rev.Immunol.) 14，483-510(1996))展现有效的神经突起生长活性。亲和纯化揭示，二者都与免疫亲和 素FKBP52和L型电压依赖性Ca2+通道的β1亚基(CACNB1)结合。雷帕霉素类似物 II对于FKBP52(相对于FKBP12)的结合选择性比雷帕霉素高687倍。此外，用所述化 合物处理的大鼠皮层神经元展现Ca2+信号转导路径的全面下调，并且在经处理的F-11 细胞中观察到L型Ca2+通道的部分抑制。大鼠皮层神经元中FKBP52和/或CACNB1的 遗传减少促进神经突起生长和神经元存活。在不受理论束缚的情况下，申请者相信，免 疫亲和素配体能通过调节Ca2+信号转导潜在地保护神经元免于经历Ca2+诱导的细胞死 亡，并通过经由FKBP52结合活化类固醇受体来促进神经突起生长。这一新颖神经保护 作用机制为许多疾病的治疗提供有价值前景。
本申请案通篇引用的所有参考文献、未决专利申请案和公开的专利都以引用的方式 清楚地并入本文中。
等效物
所属领域技术人员将仅使用常规实验就能认识到或能够确定本文所述的本发明的 特定实施例的许多等效物。预期所述等效物也涵盖于以下权利要求书中。
序列表
<110>惠氏公司
<120>免疫亲和素配体以及调节免疫亲和素和钙通道活性的方法
<130>20433-004WO1
<160>18
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>598
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Val Gln Lys Thr Ser Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
20 25 30
Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Ser Phe Val Arg Gln Gly Ser Ala Glu Ser Tyr Thr
50 55 60
Ser Arg Pro Ser Asp Ser Asp Val Ser Leu Glu Glu Asp Arg Glu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
85 90 95
Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
Glu Pro Lys Asp Phe Leu His Ile Lys Glu Lys Tyr Asn Asn Asp Trp
130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
145 150 155 160
Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Lys Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Ala Lys Gln Lys Gln Lys Ser Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp
210 215 220
Val Val Pro Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys
225 230 235 240
Gly Tyr Glu Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu
245 250 255
Lys His Arg Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Ile Ser Leu Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile
275 280 285
Ile Ile Glu Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser
290 295 300
Glu Ile Glu Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ala Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser
325 330 335
Leu Ala Pro Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu
340 345 350
Gln Arg Leu Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn
355 360 365
Val Gln Ile Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met
370 375 380
Phe Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His
385 390 395 400
Leu Ala Glu Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser
405 410 415
Ser Thr Pro Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala
420 425 430
Leu Ala Ala Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Gly Pro Tyr Leu
435 440 445
Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Glu Arg Ala Thr Gly Glu His Ala Ser
450 455 460
Met His Glu Tyr Pro Gly Glu Leu Gly Gln Pro Pro Gly Leu Tyr Pro
465 470 475 480
Ser Ser His Pro Pro Gly Arg Ala Gly Thr Leu Arg Ala Leu Ser Arg
485 490 495
Gln Asp Thr Phe Asp Ala Asp Thr Pro Gly Ser Arg Asn Ser Ala Tyr
500 505 510
Thr Glu Leu Gly Asp Ser Cys Val Asp Met Glu Thr Asp Pro Ser Glu
515 520 525
Gly Pro Gly Leu Gly Asp Pro Ala Gly Gly Gly Thr Pro Pro Ala Arg
530 535 540
Gln Gly Ser Trp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Leu Thr
545 550 555 560
Asp Asn Arg Asn Arg Gly Arg Asn Lys Ala Arg Tyr Cys Ala Glu Gly
565 570 575
Gly Gly Pro Val Leu Gly Arg Asn Lys Asn Glu Leu Glu Gly Trp Gly
580 585 590
Arg Gly Val Tyr Ile Arg
595
<210>2
<211>3687
<212>DNA
<213>智人
<400>2
gagggaaggc aggaaggagg cagccgaagg ccgagctggg tggctggacc gggtgctggc 60
tgcgccgcgc tgctttcggc tcccacggcc tctcccatgc gctgagggag cccggctggg 120
ccgggccggc ggcgggaggg gaggctcctc tccatggtcc agaagaccag catgtcccgg 180
ggcccttacc caccctccca ggagatcccc atggaggtct tcgaccccag cccgcagggc 240
aaatacagca agaggaaagg gcgattcaaa cggtcagatg ggagcacgtc ctcggatacc 300
acatccaaca gctttgtccg ccagggctca gcggagtcct acaccagccg tccatcagac 360
tctgatgtat ctctggagga ggaccgggaa gccttaagga aggaagcaga gcgccaggca 420
ttagcgcagc tcgagaaggc caagaccaag ccagtggcat ttgctgtgcg gacaaatgtt 480
ggctacaatc cgtctccagg ggatgaggtg cctgtgcagg gagtggccat caccttcgag 540
cccaaagact tcctgcacat caaggagaaa tacaataatg actggtggat cgggcggctg 600
gtgaaggagg gctgtgaggt tggcttcatt cccagccccg tcaaactgga cagccttcgc 660
ctgctgcagg aacagaagct gcgccagaac cgcctcggct ccagcaaatc aggcgataac 720
tccagttcca gtctgggaga tgtggtgact ggcacccgcc gccccacacc ccctgccagt 780
gccaaacaga agcagaagtc gacagagcat gtgcccccct atgacgtggt gccttccatg 840
aggcccatca tcctggtggg accgtcgctc aagggctacg aggttacaga catgatgcag 900
aaagctttat ttgacttctt gaagcatcgg tttgatggca ggatctccat cactcgtgtg 960
acggcagata tttccctggc taagcgctca gttctcaaca accccagcaa acacatcatc 1020
attgagcgct ccaacacacg ctccagcctg gctgaggtgc agagtgaaat cgagcgaatc 1080
ttcgagctgg cccggaccct tcagttggtc gctctggatg ctgacaccat caatcaccca 1140
gcccagctgt ccaagacctc gctggccccc atcattgttt acatcaagat cacctctccc 1200
aaggtacttc aaaggctcat caagtcccga ggaaagtctc agtccaaaca cctcaatgtc 1260
caaatagcgg cctcggaaaa gctggcacag tgcccccctg aaatgtttga catcatcctg 1320
gatgagaacc aattggagga tgcctgcgag catctggcgg agtacttgga agcctattgg 1380
aaggccacac acccgcccag cagcacgcca cccaatccgc tgctgaaccg caccatggct 1440
accgcagccc tggctgccag ccctgcccct gtctccaacc tccagggacc ctaccttgct 1500
tccggggacc agccactgga acgggccacc ggggagcacg ccagcatgca cgagtaccca 1560
ggggagctgg gccagccccc aggcctttac cccagcagcc acccaccagg ccgggcaggc 1620
acgctacggg cactgtcccg ccaagacact tttgatgccg acacccccgg cagccgaaac 1680
tctgcctaca cggagctggg agactcatgt gtggacatgg agactgaccc ctcagagggg 1740
ccagggcttg gagaccctgc agggggcggc acgcccccag cccgacaggg atcctgggag 1800
gacgaggaag aagactatga ggaagagctg accgacaacc ggaaccgggg ccggaataag 1860
gcccgctact gcgctgaggg tgggggtcca gttttggggc gcaacaagaa tgagctggag 1920
ggctggggac gaggcgtcta cattcgctga gaggcagggg ccacacggcg ggaggaaggg 1980
ctctgagccc aggggagggg agggagcgag gggctcacac ctgacatgta ttcgcctcca 2040
gggggcgctg tctccctcct ttcagatgcc tttgctcaaa gcttggggtt tctttggtgt 2100
taccatccca gctcccggga ggcccttaag ccccagctgt cggtttttac ctgcctgttg 2160
tggatggatg ggggataccc acctttctga agtgtcccct ttctcccatc ttaaggggct 2220
ctcctccctc accctcctag agaaaaggtg cacttcctta actctttcta ctcggggccc 2280
taagtgacgg tcctaagtgg gatggctctc cttctcccaa gctgcagtac tggggaaggg 2340
ctgggcgctt ttcctggaaa gggaggccac agattctttc ccatgggggc tctcttcccc 2400
agaccccaga tccaaggtcc ctcaccctgc ctgccccttc ctcccagctt cctggcagca 2460
tcgtctggtc ggtgaaagcc atagcatgga caccccatgg ggagcttgtc ttggggaggg 2520
ttctgggtgg aagctggcag gcatacagca ccctctaccc tccgtggcca tggcaacgtc 2580
cagggcccag aaccctgagg agtgagcggc cgagacgctg ctccccaccc cccacctcca 2640
tgcctcagcc tttgcctacc ccaggaatga gcttggcctc caacatccct tgcctgctgc 2700
cattagtaga gggggcccct ctgcatctga gccccccatc cctgtgccac ctgggtgtgg 2760
agcccatgga acactctggt ccgcctcatt ttaaaccaaa aaactgctcc ttcaccctca 2820
ccctgaggcc ccaggggaga ggacccgtgg gatggtgccc aggggttgcc ttgggacctc 2880
ggatctcctc tggggggctt ggctgctgct gttgctgctc tgtatttgcc tctcgtgatt 2940
ctgtttgtta cccatgttca cttcccccag gagaggcctt ggtaccccct ctcccctggg 3000
gcatcccttt gccttggcat ccctgtagcc cagcaaccct gcccctcccc agcatcccag 3060
ctgggccaga gagagccgag tgtgccaaca aggactgggg cctgcccggc tgcccgcctc 3120
agggatgggc acctcatgcc tgtctcgcca cctcctgtgc caatgtccca ccctccacct 3180
gggggtgggg tgcagcttcc acttactgat tagaagacac cactgccctc ccttcccccc 3240
tccctgtctg gtgtcctgtg cccccatctg tctgtctata tttgtctgta ctcccctagg 3300
agaagtattt tgccatatat aaaaccactg tcctgtcctt tgtggctgcc tcccaagcct 3360
gcttctttgt cctcgccaca tagtcgtcag cgtaggcacc tgggagctgc tgatatgcac 3420
ggggagttga aagggtgggt gcctgaagat gttgtgccct gagtcattga ctcaaaagaa 3480
aagatgatcc tttgattttg gccctctgat gtattgtgcc caagccagga gctgcttggg 3540
cagtcccagc tccacactgg ccctgagccc cttcacttac ctgtctctcc acaagtagag 3600
ccaaaggcaa tgggaagctc aatgttgctc agtgggtgag atccagaccc actggtgcaa 3660
tgtcttaaat acacatgact gtttttc 3687
<210>3
<211>523
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Met Val Gln Lys Thr Ser Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
20 25 30
Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Ser Phe Val Arg Gln Gly Ser Ala Glu Ser Tyr Thr
50 55 60
Ser Arg Pro Ser Asp Ser Asp Val Ser Leu Glu Glu Asp Arg Glu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
85 90 95
Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
Glu Pro Lys Asp Phe Leu His Ile Lys Glu Lys Tyr Asn Asn Asp Trp
130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
145 150 155 160
Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Lys Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Gly Asn Glu Met Thr Asn Leu Ala Phe Glu Leu Asp Pro Leu Glu
210 215 220
Leu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Leu Gly Glu Gln Ser Gly Ser Ala Lys
225 230 235 240
Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Thr Pro Pro Pro His Gly Lys Arg Ile
245 250 255
Pro Phe Phe Lys Lys Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp Val Val Pro
260 265 270
Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys Gly Tyr Glu
275 280 285
Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu Lys His Arg
290 295 300
Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp Ile Ser Leu
305 310 315 320
Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile Ile Ile Glu
325 330 335
Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser Glu Ile Glu
340 345 350
Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala Leu Asp Ala
355 360 365
Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser Leu Ala Pro
370 375 380
Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu Gln Arg Leu
385 390 395 400
Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn Val Gln Ile
405 410 415
Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met Phe Asp Ile
420 425 430
Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His Leu Ala Glu
435 440 445
Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser Ser Thr Pro
450 455 460
Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala Leu Ala Ala
465 470 475 480
Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Val Gln Val Leu Thr Ser Leu
485 490 495
Arg Arg Asn Leu Gly Phe Trp Gly Gly Leu Glu Ser Ser Gln Arg Gly
500 505 510
Ser Val Val Pro Gln Glu Gln Glu His Ala Met
515 520
<210>4
<211>1847
<212>DNA
<213>智人
<400>4
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tgcgccgcgc tgctttcggc tcccacggcc tctcccatgc gctgagggag cccggctggg 120
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ggcccttacc caccctccca ggagatcccc atggaggtct tcgaccccag cccgcagggc 240
aaatacagca agaggaaagg gcgattcaaa cggtcagatg ggagcacgtc ctcggatacc 300
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cccaaagact tcctgcacat caaggagaaa tacaataatg actggtggat cgggcggctg 600
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agctttattt tgtaaaaaaa taagatgagc ggcaaaaaaa aaaaaaa 1847
<210>5
<211>478
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Met Val Gln Lys Thr Ser Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
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Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
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Ser Arg Pro Ser Asp Ser Asp Val Ser Leu Glu Glu Asp Arg Glu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
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Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
Glu Pro Lys Asp Phe Leu His Ile Lys Glu Lys Tyr Asn Asn Asp Trp
130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
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Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Lys Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Ala Lys Gln Lys Gln Lys Ser Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp
210 215 220
Val Val Pro Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys
225 230 235 240
Gly Tyr Glu Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu
245 250 255
Lys His Arg Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Ile Ser Leu Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile
275 280 285
Ile Ile Glu Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser
290 295 300
Glu Ile Glu Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ala Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser
325 330 335
Leu Ala Pro Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu
340 345 350
Gln Arg Leu Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn
355 360 365
Val Gln Ile Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met
370 375 380
Phe Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His
385 390 395 400
Leu Ala Glu Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser
405 410 415
Ser Thr Pro Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala
420 425 430
Leu Ala Ala Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Val Gln Val Leu
435 440 445
Thr Ser Leu Arg Arg Asn Leu Gly Phe Trp Gly Gly Leu Glu Ser Ser
450 455 460
Gln Arg Gly Ser Val Val Pro Gln Glu Gln Glu His Ala Met
465 470 475
<210>6
<211>1700
<212>DNA
<213>智人
<400>6
gagggaaggc aggaaggagg cagccgaagg ccgagctggg tggctggacc gggtgctggc 60
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<210>7
<211>524
<212>PRT
<213>小鼠
<400>7
Met Val Gln Lys Ser Gly Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
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Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
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Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
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Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
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Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
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130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
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Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Thr Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Ser Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Gly Asn Glu Met Thr Asn Phe Ala Phe Glu Leu Asp Pro Leu Glu
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Leu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Leu Gly Glu His Gly Gly Ser Ala Lys
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Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Thr Pro Pro Pro His Gly Lys Arg Ile
245 250 255
Pro Phe Phe Lys Lys Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp Val Val Pro
260 265 270
Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys Gly Tyr Glu
275 280 285
Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu Lys His Arg
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Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp Ile Ser Leu
305 310 315 320
Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile Ile Ile Glu
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Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser Glu Ile Glu
340 345 350
Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala Leu Asp Ala
355 360 365
Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser Leu Ala Pro
370 375 380
Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu Gln Arg Leu
385 390 395 400
Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn Val Gln Ile
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Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met Phe Asp Ile
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Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His Leu Ala Glu
435 440 445
Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser Ser Thr Pro
450 455 460
Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala Leu Ala Ala
465 470 475 480
Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Val Gln Val Leu Thr Ser Leu
485 490 495
Arg Arg Asn Leu Ser Phe Trp Gly Gly Leu Glu Ala Ser Pro Arg Gly
500 505 510
Gly Asp Ala Val Ala Gln Pro Gln Glu His Ala Met
515 520
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<211>1892
<212>DNA
<213>小鼠
<400>8
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tttacatcaa gatcacatct cccaaggtac tgcagaggct catcaaatcc cgagggaagt 1440
ctcaatccaa acacctcaat gtccaaatag cagcctcgga gaagctggca cagtgtcccc 1500
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<210>9
<211>597
<212>PRT
<213>小鼠
<400>9
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
Lys His Arg Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Ile Ser Leu Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile
275 280 285
Ile Ile Glu Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser
290 295 300
Glu Ile Glu Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ala Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser
325 330 335
Leu Ala Pro Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu
340 345 350
Gln Arg Leu Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn
355 360 365
Val Gln Ile Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met
370 375 380
Phe Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His
385 390 395 400
Leu Ala Glu Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser
405 410 415
Ser Thr Pro Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala
420 425 430
Leu Ala Ala Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Gly Pro Tyr Leu
435 440 445
Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Asp Arg Ala Thr Gly Glu His Ala Ser
450 455 460
Val His Glu Tyr Pro Gly Glu Leu Gly Gln Pro Pro Gly Leu Tyr Pro
465 470 475 480
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485 490 495
Gln Asp Thr Phe Asp Ala Asp Thr Pro Gly Ser Arg Asn Ser Ala Tyr
500 505 510
Thr Glu Pro Gly Asp Ser Cys Val Asp Met Glu Thr Asp Pro Ser Glu
515 520 525
Gly Pro Gly Pro Gly Asp Pro Ala Gly Gly Gly Thr Pro Pro Ala Arg
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545 550 555 560
Asn Arg Asn Arg Gly Arg Asn Lys Ala Arg Tyr Cys Ala Glu Gly Gly
565 570 575
Gly Pro Val Leu Gly Arg Asn Lys Asn Glu Leu Glu Gly Trp Gly Gln
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595
<210>10
<211>1794
<212>DNA
<213>小鼠
<400>10
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gaggtcttcg accccagccc acagggcaag tacagcaaga ggaaagggcg gttcaaaagg 120
tcagacggga gtacgtcctc ggatacaaca tccaacagct tcgtccgcca gggctcagca 180
gagtcctaca cgagccgacc atcagactct gatgtgtctc tggaggagga ccgcgaagcc 240
ttaaggaagg aggcagagcg ccaggcctta gcccagctcg agaaagccaa gaccaaacca 300
gtggcttttg ctgttcggac aaatgttggc tacaatccgt ctccagggga tgaggtgcct 360
gtacagggag tggccatcac ctttgagccc aaggacttcc tacacatcaa ggagaagtac 420
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ctcagctcca gcaagtcagg tgacaactcc agttccagtc tgggagatgt ggtgactggc 600
acccgccgcc ccacaccccc tgccagtgcc aaacagaagc agaaatcgac agagcacgtg 660
cccccctatg acgtggtgcc ttccatgagg cccatcatcc tggtgggacc gtcgctcaag 720
ggctatgagg tgacagacat gatgcagaaa gcgttgtttg acttcctcaa gcatcggttt 780
gatggcagga tttccatcac ccgggtaaca gctgacattt ccctggccaa acgctccgtc 840
ctcaacaacc ccagcaaaca catcatcatt gagcgctcca acacgcgttc cagcctggct 900
gaggtacaga gtgaaattga gaggatcttc gagctggccc ggaccttgca gctggtcgcc 960
ttggacgctg acaccatcaa ccacccagcc cagctctcta aaacgtcgct ggcccccatc 1020
attgtttaca tcaagatcac atctcccaag gtactgcaga ggctcatcaa atcccgaggg 1080
aagtctcaat ccaaacacct caatgtccaa atagcagcct cggagaagct ggcacagtgt 1140
ccccccgaaa tgtttgacat aatcctggac gagaaccaat tggaagatgc ctgcgagcac 1200
ctggctgagt acttggaagc ctactggaag gccacacatc cgcctagcag cacgccaccc 1260
aatccgctgc tgaaccgcac catggctacc gcagctctgg ctgccagccc tgcccccgtc 1320
tccaacctcc agggacccta ccttgcttcc ggggaccagc cgctggaccg ggccactggg 1380
gaacatgcca gtgtgcacga gtaccccggg gaattgggcc agcccccagg cctttacccc 1440
agcaaccacc cacttggccg ggcaggcacc ctgcgggcgc tatcccgcca agacaccttt 1500
gatgctgaca cccccggcag ccgaaattct gcctacacgg agccgggaga ctcgtgtgtg 1560
gacatggaga cagacccctc agagggccca gggcctggag accctgcagg gggaggcaca 1620
ccaccagccc ggcagggctc ctgggaagac gaggaagact atgaggagga gatgaccgac 1680
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<210>11
<211>457
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Met Thr Thr Asp Glu Gly Ala Lys Asn Asn Glu Glu Ser Pro Thr Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Glu Gln Gly Glu Asp Ile Thr Ser Lys Lys Asp Arg Gly
20 25 30
Val Leu Lys Ile Val Lys Arg Val Gly Asn Gly Glu Glu Thr Pro Met
35 40 45
Ile Gly Asp Lys Val Tyr Val His Tyr Lys Gly Lys Leu Ser Asn Gly
50 55 60
Lys Lys Phe Asp Ser Ser His Asp Arg Asn Glu Pro Phe Val Phe Ser
65 70 75 80
Leu Gly Lys Gly Gln Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ala Thr
85 90 95
Met Lys Lys Gly Glu Ile Cys His Leu Leu Cys Lys Pro Glu Tyr Ala
100 105 110
Tyr Gly Ser Ala Gly Ser Leu Pro Lys Ile Pro Ser Asn Ala Thr Leu
115 120 125
Phe Phe Glu Ile Glu Leu Leu Asp Phe Lys Gly Glu Asp Leu Phe Glu
130 135 140
Asp Gly Gly Ile Ile Arg Arg Thr Lys Arg Lys Gly Glu Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Asn Pro Asn Glu Gly Ala Thr Val Glu Ile His Leu Glu Gly Arg Cys
165 170 175
Gly Gly Arg Met Phe Asp Cys Arg Asp Val Ala Phe Thr Val Gly Glu
180 185 190
Gly Glu Asp His Asp Ile Pro Ile Gly Ile Asp Lys Ala Leu Glu Lys
195 200 205
Met Gln Arg Glu Glu Gln Cys Ile Leu Tyr Leu Gly Pro Arg Tyr Gly
210 215 220
Phe Gly Glu Ala Gly Lys Pro Lys Phe Gly Ile Glu Pro Asn Ala Glu
225 230 235 240
Leu Ile Tyr Glu Val Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Ala Lys Glu Ser
245 250 255
Trp Glu Met Asp Thr Lys Glu Lys Leu Glu Gln Ala Ala Ile Val Lys
260 265 270
Glu Lys Gly Thr Val Tyr Phe Lys Gly Gly Lys Tyr Met Gln Ala Val
275 280 285
Ile Gln Tyr Gly Lys Ile Val Ser Trp Leu Glu Met Glu Tyr Gly Leu
290 295 300
Ser Glu Lys Glu Ser Lys Ala Ser Glu Ser Phe Leu Leu Ala Ala Phe
305 310 315 320
Leu Asn Leu Ala Met Cys Tyr Leu Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Lys Ala
325 330 335
Val Glu Cys Cys Asp Lys Ala Leu Gly Leu Asp Ser Ala Asn Glu Lys
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Gly Leu Tyr Arg Arg Gly Glu Ala Gln Leu Leu Met Asn Glu Phe Glu
355 360 365
Ser Ala Lys Gly Asp Phe Glu Lys Val Leu Glu Val Asn Pro Gln Asn
370 375 380
Lys Ala Ala Arg Leu Gln Ile Ser Met Cys Gln Lys Lys Ala Lys Glu
385 390 395 400
His Asn Glu Arg Asp Arg Arg Ile Tyr Ala Asn Met Phe Lys Lys Phe
405 410 415
Ala Glu Gln Asp Ala Lys Glu Glu Ala Asn Lys Ala Met Gly Lys Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Gly Val Thr Asn Glu Lys Gly Thr Asp Ser Gln Ala Met
435 440 445
Glu Glu Glu Lys Pro Glu Gly His Val
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<210>12
<211>3781
<212>DNA
<213>智人
<400>12
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ccccgcggcg acaggttctc tacttaaaag acaatgacta ctgatgaagg tgccaagaac 180
aatgaagaaa gccccacagc cactgttgct gagcagggag aggatattac ctccaaaaaa 240
gacaggggag tattaaagat tgtcaaaaga gtggggaatg gtgaggaaac gccgatgatt 300
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cagcgggaag aacaatgtat tttatatctt ggaccaagat atggttttgg agaggcaggg 840
aagcctaaat ttggcattga acctaatgct gagcttatat atgaagttac acttaagagc 900
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cagtatggga agatagtgtc ctggttagag atggaatatg gtttatcaga aaaggaatcg 1080
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tcggcccctc ctcaatgggc tttcccccaa ctcaggacag aacagtgttt aatgtaaagt 1620
ttgttatagt ctatgtgatt ctggaagcaa atggcaaaac cagtagcttc ccaaaaacag 1680
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caaacagaaa tgactgtggt gtggagggag tgagcoagca gcttaagtcc agctcatttc 1800
agtttctatc aaccttcaag tatccaattc agggtccctg gagatcatcc taacaatgtg 1860
gggctgttag gttttacctt tgaactttca tagcactgca gaaacctttt aaaaaaaaat 1920
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gaacctcaga ggccacttgc ttgctgactt agcctcctcc caaagtcccc ctcctcagcc 2160
agcctccttg tgagagtggc tttctaccac acacagcctg tccctggggg agtaattctg 2220
tcattcctaa aacacccttc agcaatgata atgagcagat gagagtttct ggattagctt 2280
ttcctatttt cgatgaagtt ctgagatact gaaatgtgaa aagagcaatc agaattgtgc 2340
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atttagatgc acttttttgt gtgttcttta aataaatcca aaaaaaatgt gaaaaaaaaa 3780
a 3781
<210>13
<211>456
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
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1 5 10 15
Thr Met Thr Glu Gln Gly Glu Asp Ile Thr Thr Lys Lys Asp Arg Gly
20 25 30
Val Leu Lys Ile Val Lys Arg Val Gly Thr Ser Asp Glu Ala Pro Met
35 40 45
Phe Gly Asp Lys Val Tyr Val His Tyr Lys Gly Met Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Lys Phe Asp Ser Ser His Asp Arg Lys Lys Pro Phe Ala Phe Ser
65 70 75 80
Leu Gly Gln Gly Gln Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ser Thr
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Met Lys Lys Gly Glu Ile Cys His Leu Leu Cys Lys Pro Glu Tyr Ala
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Asp Ser Gly Val Ile Arg Arg Ile Lys Arg Lys Gly Glu Gly Tyr Ser
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Asn Pro Asn Glu Gly Ala Thr Val Lys Val His Leu Glu Gly Cys Cys
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Gly Gly Arg Thr Phe Asp Cys Arg Asp Val Val Phe Val Val Gly Glu
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Gly Glu Asp His Asp Ile Pro Ile Gly Ile Asp Lys Ala Leu Val Lys
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Met Gln Arg Glu Glu Gln Cys Ile Leu Tyr Leu Gly Pro Arg Tyr Gly
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Leu Met Tyr Glu Val Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Ala Lys Glu Ser
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<211>456
<212>PRT
<213>小鼠
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ggagaaguac aauaaugact t 21
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
gucauuauug uacuucucct t 21
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<212>DNA
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ccuagcuaug cuuuuggcat t 21
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
ugccaaagca uagcuaggtt 20
另外，申请者已在随附实例中展示，至少一种本文所揭示的免疫亲和素配体(雷帕 霉素类似物II)展示相对于FKBP12结合对FKBP52的结合选择性明显增加，比雷帕霉 素高至少600倍。在不受理论束缚的情况下，相信抑制FKBP52活性将可能通过活化类 固醇(例如糖皮质激素受体)来介导神经突起生长。此外，用本文所揭示的免疫亲和素 配体处理皮层神经元会引起钙信号转导路径的全面下调以及L型钙通道的部分抑制。也 通过选择性降低培养过程中β1亚基和FKBP52的表达来检测对于神经元细胞的神经突 起生长的明显作用。
本文所揭示的资料表明，在mTOR结合区对雷帕霉素进行修饰可明显提供对于 FKBP52具有独特选择性且具有有效神经营养活性的非免疫抑制性化合物。如通过在 FKBP52 siRNA处理的皮层神经元中所观察到的神经突起生长所证实，FKBP52似乎可 能通过活化类固醇受体(包括糖皮质激素受体)来介导免疫亲和素配体介导的神经突起 生长。另外，这些雷帕霉素类似物部分抑制L型Ca2+通道并降低各种Ca2+信号转导蛋白 的转录的能力表明，这些类似物能保护神经元免于经历Ca2+诱导的神经元细胞死亡，这 与其对神经元存活的影响相符。
钙通道存在于包括神经元和心血管组织在内的各种组织中，并且在动物的多个重要 过程中具有重要作用，包括神经递质释放、肌肉收缩、起搏活动以及激素和其它物质的 分泌。钙经由电压门控钙通道进入神经元细胞中将介导多种细胞和生理反应，包括(但 不限于)：调节诸如蛋白激酶C和钙调蛋白依赖性蛋白激酶II等钙依赖性酶的活性；控 制膜电位并引起诸如兴奋性和反复触发模式(repetitive firing pattern)等电学特性；和 增加神经递质的释放。这些过程都涉及到人类病症，诸如神经病症和心血管病症。因此， 如本文中较详细描述，通过形成免疫亲和素-钙通道复合物来抑制电压依赖型钙通道的功 能的方法可用于治疗、预防和/或缓解钙通道病症的症状。
为了能更易于了解本发明，本文和实施方式通篇将较为详细地描述某些术语。
钙通道为允许Ca2+离子从细胞外液受控进入细胞中的跨膜多亚基蛋白质。最常见的 钙通道类型为电压依赖型。动物体内诸如中枢神经系统(CNS)神经元、周围神经细胞 和肌细胞(包括骨骼肌、心肌以及静脉和动脉平滑肌细胞)等“可兴奋”细胞具有电压 依赖型钙通道。电压门控钙通道允许Ca2+离子流入细胞中，并且通常需要去极化以使具 有所述通道的细胞内侧与浸泡细胞的细胞外环境之间的电位差达到某种程度。根据电压 门控钙通道的电生理学和药理学特性，已将其分为L-、N-、P/Q-、R-和T型(评述于凯 特萝(Catterall)，2000；霍格纳德(Huguenard)1996；多芬A.C.(Dolphin，A.C.)(2003) 药理学评述(Pharmacological Reviews)55：607-627中)。L-、N-和P/Q型通道可在正 电位(高电压门控)处活化。T型(或低电压门控)通道描述一大类在负电位处瞬时活 化且对静息电位的变化高度敏感的分子。
高电压门控钙通道是由四种不同的多肽构成：α1、α2δ、β和γ(斯蒂(Stea)等人，1994； 凯特萝(Catterall)，2000中评述)。β亚基(本文中也称为“CACB1”)为由至少四种已 知的单独基因编码的可溶性细胞内蛋白，所述基因各自加工成多个剪接变异体。在各实 施例中，β亚基具有以下一个或多个特征：(i)天然存在的哺乳动物(例如，人类或啮 齿动物)β1亚基的氨基酸序列或其片段，例如，如图11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10)或其片段；(ii)与图11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-10)实 质上同源的氨基酸序列或其片段；(iii)由天然存在的哺乳动物(例如，人类或啮齿动物) β1亚基核苷酸序列或其片段编码的氨基酸序列，例如由如图11A-11J中所示的核苷酸序 列(SEQ ID NO：1-10)或其片段编码的氨基酸序列；(iv)由与图11A-11J中所示的核 苷酸序列(SEQ ID NO：1-10)或其片段实质上同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(v) 由天然存在的β1亚基核苷酸序列的简并核苷酸序列或其片段(例如，图11A-11J中所示 的核苷酸序列(SEQ ID NO：1-10)或其片段)编码的氨基酸序列；或(vi)在严格条件 (例如，高严格度条件)下与上述核苷酸序列中的一种序列杂交的核苷酸序列。在一些 实施例中，β亚基或其功能性变异体(例如片段)展现天然存在的序列的一种或多种活 性，包括(但不限于)：(i)形成如本文所述的复合物；(ii)与α亚基相互作用(例如， 结合)；(iii)促进电压门控钙通道(例如α1亚基)定位或穿梭到细胞质膜；(iv)调节 所述通道的门控(例如，改变活化和失活动力学，引起I-V曲线向左移动，和在单通道 水平上，诱导通道开放可能性的增加)；或(v)控制一种或多种本文所述的基因(例如， 钙流入通道、NMDA受体、纤溶酶原活化剂(PLAU)、SHT3R通道)的转录活性。
在其它实施例中，β亚基具有与以下文献中所揭示的序列实质上一致的序列：鲍威 尔(Powers)等人，(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267(32)：22967-22972；柯林 (Collin)等人，(1993)循环研究杂志(Circ.Res.)72(6)：1337-1344；霍根K.(Hogan，K.) 等人，(1999)神经科学通讯(Neurosci.Lett.)277(2)，111-114；弗维尔(Foell)等人，(2004) 生理学与基因组学(Physiol.Genomics)17(2)，183-200(人类β1和β2亚基)；托贝(Toba) 等人，(2005)欧洲神经科学杂志(Eur.J.Neurosci.)22(1)，79-92(鼠科β1亚基同功异 形体)；谢里科夫(Serikov)等人，(2002)生物化学与生物物理学研究(Biochem.Biophys. Res.Commun.)293(5)，1405-1411；浦瑞南(Pragnell)等人，(1991)欧洲生物化学学会 联盟通讯(FEBS Lett.)291(2)，253-258；卡西尔(Cahill)等人，(2000)神经科学杂志 (J.Neurosci.)20(5)，1685-1693(2000)(牛β1、2和3亚基)；罗森菲尔德(Rosenfeld) 等人，(1993)神经学年鉴(Ann.Neurol.)33(1)，113-120；塔韦奥克(Taviaux)等人，(1997) 人类遗传学(Hum.Genet.)100(2)，151-154(人类β2和β4亚基基因)；柯利拉菲特 (Colecraft)等人，(2002)生理学杂志(J.Physiol.)(伦敦(Lond.))541(第2部分)，435-452 (人类β2a、2c、2d和2e亚基)；奥帕托瓦斯基(Opatowsky)等人，(2003)生物化学杂志 (J.Biol.Chem.)278(52)，52323-52332(大鼠β2亚基)；雅玛达(Yamada)等人，(2001) 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(50)，47163-47170(2001)(大鼠β2亚基)；斯特劳斯 伯格(Strausberg)等人，(2002)美国国家科学院院刊(PNAS U.S.A.)99(26)，16899-16903 (人类β3亚基、鼠科β4亚基)；村上(Murakami)等人，(1996)欧洲生物化学杂志(Eur. J.Biochem.)236(1)，138-143(1996)(鼠科钙通道β3亚基)；雅玛达(Yamada)等人，(1995) 基因组学(Genomics)27(2)，312-319(人类钙通道α1亚基(CACNL1A2)和β亚基 (CACNLB3)基因)；陈(Chen)等人，(2004)自然(Nature)429(6992)，675-680(人类β4 亚基)；海尔顿(Helton)等人，(2002)神经科学杂志(J.Neurosci.)22(5)，1573-1582(2002) (β4亚基)；贝都(Badou)等人，(2005)科学(Science)307(5706)，117-121(2005)(钙 通道β4亚基)；所有参考文献的内容都以引用的方式并入本文中。其它β亚基序列揭示 于基因库登录号：NP..666235、Q9Y698、Q02641、Q9MZL3和P54288_2中。
免疫亲和素为可溶性胞浆蛋白，其与免疫亲和素配体形成复合物，而所述复合物又 充当信号转导中所涉及的其它细胞靶的配体。免疫亲和素的种类包括亲环素和FK506 结合蛋白(例如，FKBP)，诸如FKBP-12和FBBP-52。环孢菌素A(Cyclosporin A)是 结合亲环素的大环内酯类免疫亲和素配体。应了解，诸如美立霉素、FK506、FK520和 雷帕霉素等其它大环内酯类免疫亲和素配体也结合FKBP。FK506、FK520和雷帕霉素 与FKBP的结合通常是通过聚酮分子的结构类似的区段(称为“FKBP结合结构域”)发 生。
已在人类基因组中发现对应于超过两打FKBP的基因序列(道南(Dornan)等人，医 药化学当前论题(Curr.Top.Med.Chem.)3，1392-1409(2003))。这些基因序列在中枢神 经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)组织中的表达比在免疫组织中高10-50倍(莱 昂斯(Lyons)等人，神经科学杂志(J.Neurosci.)15，2985-2994(1995))，并且在神经 疾病发作后，这些序列的表达也会增加(纪平(Kihira)等人，神经病理学(Neuropathology) 22，269-274(2002))。有趣的是，据报导，FKBP12、FKBP12.6和FKBP 52都为通道门 控FKBP蛋白，其调节雷诺定受体(RYR)(黄(Huang)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl.Acad.Sci.USA.)103，3456-3461(2006))、肌醇1，4，5-三磷酸受体(IP3R)(卡梅隆 (Cameron)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)92，1784-1788 (1995))和瞬时受体电位通道(TRPC)(辛金斯(Sinkins)等人，生物化学杂志(J.Biol. Chem.)279，34521-34529(2004))。FKBP52和FKBP51与介导雌激素、雄激素和糖皮 质激素下游反应的三类类固醇受体复合物缔合(斯泰纳(Steiner)等人，美国国家科学 院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)94，2019-2024(1997))。核FKBP25经由与组蛋白 去乙酰酶、酪蛋白激酶II、核仁素(nucleolin)和转录因子YY1缔合来调控基因表达(姚 (Yao)和杨(Yang)，癌症药靶研究最新进展(Curr.Cancer Drug Targets)5，595-610 (2005))。FKBP38组成性失活并位于线粒体和内质网中。有趣的是，FKBP38与Bcl-2 结合需要高含量的Ca2+和钙调蛋白(CaM)(埃德里奇(Edlich)等人，欧洲分子生物学 杂志(EMBO J.)24，2688-2699(2005))。免疫亲和素配体通过破坏天然含FKBP复合 物(古德(Gold)药物代谢研究(Drug Metab.Rev.)31，649-663(1999)；埃德里奇(Edlich) 等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)281，14961-14970(2006))并通过形成诸如 FKBP12-FK506-钙神经素(calcineurin)或FKBP12-雷帕霉素-雷帕霉素的哺乳动物靶 (mTOR)等新复合物(基辛格(Kissinger)等人，自然(Nature)378，641-644(1995)； 崔(Choi)等人，科学(Science)273，239-42(1996))来引起各种下游生物活性。
FKBP52是免疫亲和素FK506结合种类的成员。FK506与糖皮质激素受体(GR)相 关FKBP52的结合导致响应地塞米松(dexamethasone)而增加GR的核转位以及GR介 导的基因表达的增强(桑切斯(Sanchez)和宁(Ning)(1996)方法：酶学方法指南 (Methods：A Companion to Meth.Enzymol.)9：188-200)。诸如FKBP52和CyP40等免疫 亲和素以及诸如PP5、p60和Mas70p等非免疫亲和素蛋白具有一个或多个结合hsp90的 三角四肽重复(TPR)结合结构域的TPR结构域(拉塔伊恰克(Ratajczak)等人，(1993) 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：13187-13192)。蛋白质中TPR结构域的数量似乎与 其hsp90结合亲和力相关。邻接TPR结构域的区域也参与结合，例如FKBP52的残基 232-271(拉塔伊恰克(Ratajczak)和卡雷罗(Carrello)(1996)，同上文)。
在一些实施例中，免疫亲和素具有以下一个或多个特征：(i)天然存在的哺乳动物 (例如，人类或啮齿动物)FKBP52的氨基酸序列或其片段，例如，如图12A-12D中所 示的氨基酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段；(ii)与图12A-12D中所示的氨基酸序 列(SEQ ID NO：11-14)实质上同源的氨基酸序列或其片段；(iii)由天然存在的哺乳动 物(例如，人类或啮齿动物)FKBP52核苷酸序列或其片段编码的氨基酸序列，例如由 如图12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段编码的氨基酸序列； (iv)由与图12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段实质上同源的 核苷酸序列编码的氨基酸序列；(v)由天然存在的FKBP52核苷酸序列的简并核苷酸序 列或其片段(例如，图12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：11-14)或其片段) 编码的氨基酸序列；或(vi)在严格条件(例如，高严格度条件)下与上述核苷酸序列 中的一种序列杂交的核苷酸序列。在一些实施例中，FKBP52或其功能性变异体(例如 片段)展现天然存在的序列的一种或多种活性，包括(但不限于)：形成如本文所述的 复合物；结合FK506；响应地塞米松而增加糖皮质激素受体的核转位；增强糖皮质激素 受体介导的基因表达；和/或结合热休克蛋白，例如hsp90。
FKBP52的例示性氨基酸和核苷酸序列揭示于以下文献中：桑切斯(Sanchez)等人， (1990)生物化学(Biochemistry)29(21)，5145-5152；和皮蒂(Peattie)等人，(1992)美 国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Set U.S.A.)89(22)，10974-10978，两篇文献的内容 都以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，本发明的β亚基或免疫亲和素多肽包括(但不限于)来自任何动 物物种(包括人类、啮齿动物)的天然多肽的片段以及其(人类和非人类)多肽和其片 段的变异体(例如，功能性变异体)，条件是所述多肽具有与个别天然多肽相同的生物 活性。在一个实施例中，“片段”包含在成熟天然多肽的序列内的区域。非全长β亚基 或免疫亲和素(例如FKBP52)的任何形式都可用于本发明的方法和组合物中，条件是： 其仍具有功能，例如，保留天然存在的序列的至少一种活性(例如，保留形成如本文所 述的复合物的能力)。非全长β亚基可通过在宿主细胞中表达编码全长β亚基蛋白的多 聚核苷酸的相应片段而产生。这些相应多聚核苷酸片段也为本发明的一部分。可通过标 准分子生物学技术产生如上文所述的经修饰多聚核苷酸，所述技术包括适当需要的缺失 突变体的构造、定点突变诱发法或使用适当寡聚核苷酸引物进行的聚合酶链反应。
多肽或其片段的“变异体”(诸如，β1亚基或FKBP52的变异体)包括嵌合蛋白、 经标记蛋白(例如，放射性标记的蛋白)、融合蛋白、突变蛋白、具有类似(例如，实 质上类似)序列的蛋白质(例如，具有氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失、 插入的蛋白质)、蛋白质片段、模拟物，只要所述变异体具有天然蛋白质的至少一部分 氨基酸序列或具有大部分序列与天然蛋白一致的氨基酸序列的至少一部分即可。“功能 性变异体”包括保留天然蛋白质的至少一种功能(例如，保留使免疫亲和素配体与如本 文所述的复合物相互作用和/或形成所述复合物的能力)的变异体。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”为编码多肽的第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的融 合物，其中所述第一与第二氨基酸序列并非作为单一多肽链的一部分天然存在。
如本文所使用，术语“实质上类似”(或“实质上”或“充分”“同源”或“一致”) 在本文中用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足量与第二氨基酸或核苷酸序列一致或 相同(例如，具有类似侧链，例如保守氨基酸取代)的氨基酸残基或核苷酸，以致第一 与第二氨基酸或核苷酸序列具有类似活性。与本文所揭示的序列类似或同源(例如，至 少约85％序列一致性)的序列也为本申请案的一部分。在一些实施例中，序列一致性可 为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。另外，当 核酸区段在选择性杂交条件(例如，高严格度杂交条件)下与所述链的互补序列杂交时， 会存在显著一致性。核酸可存在于全细胞中、细胞溶解产物中或以部分纯化或实质上纯 形式存在。
两个序列之间“同源性”或“序列一致性”(所述术语在本文中可互换使用)的计 算如下进行。比对序列以达到最佳比较的目的(例如，为了实现最佳比对，可在第一和 第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位，并且出于比较的目的，可忽略非同 源序列)。通常，为进行比较而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％、优 选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％且甚至更优选至少70％、80％、90％、 100％。随后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的 位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在此位置处 一致(如本文所使用，氨基酸或核酸“一致性”与氨基酸或核酸“同源性”等效)。两 个序列之间的一致性百分比随所述序列所共有的一致位置的数量而变化，其中需考虑为 获得两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数量和各空位的长度。
序列的比较和两个序列之间一致性百分比的测定可使用数学算法实现。在一个实施 例中，使用尼德曼(Needleman)和伍斯奇(Wunsch)((1970)分子生物学(J.Mol.Biol.) 48：444-453)算法来测定两个氨基酸序列之间的一致性百分比，所述算法已并入GCG软 件包中的市售GAP程序中，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、 10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一实施例中，使用 GCG软件包中的市售GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、3070 或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个核苷酸序列之间的一致 性百分比。测定同源性百分比通常使用的参数为Blossum 62得分矩阵，其中空位罚分为 12，空位延伸罚分为4且移码空位罚分为5。还可使用E.梅耶斯(E.Meyers)和W.米勒 (W.Miller)((1989)生物科学中的计算机应用(CABIOS)4：11-17)算法来测定两个氨 基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比，所述算法已并入ALIGN程序(2.0版)中，其 使用PAM120残基权重表，空位长度罚分为12且空位罚分为4。
如本文所使用，术语“在严格条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。所属领域技术 人员已知严格条件，并且所述条件可见于现代分子生物学规程(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威立父子出版公司(John Wiley & Sons)，纽约(N.Y.)(1989)， 6.3.1-6.3.6中。此文献中描述了水性和非水性方法并且可使用任一种方法。严格杂交条 件的实例为在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后在50℃下以0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。另一严格杂交条件的实例为在约45℃下在6X SSC中 杂交，随后在55℃下以0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。另一严格杂交条件的实 例为在约45℃下在6X SSC中杂交，随后在60℃下以0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或 多次。通常，严格杂交条件为在约45℃下在6X SSC中杂交，随后在65℃下以0.2X SSC、 0.1％SDS洗涤1次或20次以上。更常见的是，所使用的高严格度条件为在65℃下在 0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，随后在65℃下以0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或多次。
应了解，本文所揭示的多肽的变异体可能具有其它保守或非必需氨基酸取代，这不 会明显影响抗原结合或其它免疫球蛋白功能。“保守氨基酸取代”为氨基酸残基由具有 类似侧链的氨基酸残基置换的取代。所属领域中已确定具有类似侧链的氨基酸残基家 族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、 酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如， 苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨 酸)。
“非必需”氨基酸残基为可由杂交抗体的野生型序列发生改变并且不会消除或更优 选实质上不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基则会引起所述变化。
免疫亲和素配体
免疫亲和素配体与免疫亲和素结合以活化其它细胞靶，主要是免疫和神经系统中的 细胞靶。数种免疫亲和素为免疫抑制性的，例如环孢菌素A、FK506和雷帕霉素，而其 它较低免疫抑制性免疫亲和素则展现神经营养活性。举例来说，美立霉素为实质上非免 疫抑制性的，并且在活体外展现明显的神经保护活性(何M.(He，M.)等人，US 2005/0272133，2005年12月8日公开；和格拉斯安尼E.(Graziani，E.)等人，US 2005/0197356，2005年9月8日公开)。通过本发明方法鉴别或用于本发明方法中的免 疫亲和素配体优选为实质上非免疫抑制性的，但保留所需活性，例如神经营养活性。优 选的免疫亲和素配体能增加如本文所述的复合物的形成，和/或降低FKBP和/或钙通道 活性。
在一些实施例中，免疫亲和素配体在mTOR结合结构域处经修饰。据悉，雷帕霉素 的mTOR结合结构域位于大环核心，图1A中约1-7位和27-36位处。举例来说，免疫 亲和素配体可在雷帕霉素主链的1位和4位具有杂原子取代基(图1A)。在其它实施例 中，雷帕霉素类似物在1位、2位、3位和/或4位具有环状结构(图1A)。所述雷帕霉 素类似物揭示于2006年6月22日自U.S.S.N.11/300,839公开的共同转让的共同代决的 公开申请案U.S.2006/0135549中，所述申请案的标题为“雷帕霉素类似物和其在治疗神 经病症、增生性病症和炎症性病症方面的用途(Rapamycin Analogues and the Uses Thereof in the Treatment of Neurological，Proliferative，and Inflammatory Disorders)”，其完 整内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，雷帕霉素类似物具有式I：
在上述式中，R1与R2为不同的独立基团，并且选自OR3和N(R3′)(R3″)；或R1与R2 不同，经由单键连接且选自O和NR3。R3、R3′和R3″独立地选自H、C1到C6烷基、C1 到C6经取代烷基、C3到C8环烷基、经取代C3到C8环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳 基和经取代杂芳基。R4和R4′(a)独立地选自H、OH、O(C1到C6烷基)、O(经取代C1 到C6烷基)、O(酰基)、O(芳基)、O(经取代芳基)和卤素；或(b)一起形成与O键结的 双键。R5、R6和R7独立地选自H、OH和OCH3。R8与R9经由(i)单键连接且都为CH2， 或经由(ii)双键连接且都为CH。R15选自C＝O、CHOH和CH2，且n为1或2；或其 医药学上可接受的盐、前药或代谢物。
在其它实施例中，R1与R2经由单键连接且选自O和NR3。在另一实施例中，R1为 O且R2为NR3。
在一个实施例中，R3′或R3″为芳基或经取代芳基，或经取代苯环。在另一实施例中， R3′或R3″处的经取代苯基包括具有以下结构的环：
R10、R11、R12、R13和R14独立地选自H、C1到C6烷基、经取代C1到C6烷基、芳 基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、卤素、酰基、OH、O(烷基)、O(经取代烷基)、 O(芳基)、O(经取代芳基)、O(酰基)、NH2、NH(烷基)、NH(经取代烷基)、NH(芳基)、 NH(经取代芳基)和NH(酰基)。
在其它实施例中，R3、R3′或R3″为任选经1或2个选自C1到C6烷基和卤素的取代 基取代的苯基。在其它实施例中，R3、R3′或R3″为任选经1或2个甲基或氯基取代基取 代的苯基，例如苯基和3-甲基，4-氯苯基。
在一个实施例中，R4或R4′为OH或O(酰基)，例如其中所述酰基为任选经烷基取代 的-C(O)-，具体说来，其中烷基可为直链或支链并且例如任选经诸如芳香族杂环(诸如 吡啶基)等杂环取代。实例为：
在其它实施例中，式I的雷帕霉素类似物包括R5、R6和R7为OCH3的雷帕霉素类 似物，雷帕霉素主链的17-22位的含氮环为哌啶环或R15为羰基的雷帕霉素类似物。
在一个实施例中，雷帕霉素类似物具有式Ia：
其中R1、R2、R8和R9如上文所述加以定义。
在另一实施例中，雷帕霉素类似物具有下式Ib：
在式Ib中，R独立地选自H、C1到C6烷基、经取代C1到C6烷基、芳基、经取代 芳基、杂芳基、经取代杂芳基、卤素、酰基、OH、O(烷基)、O(经取代烷基)、O(芳基)、 O(经取代芳基)、O(酰基)、NH2、NH(烷基)、NH(经取代烷基)、NH(芳基)、NH(经取代 芳基)和NH(酰基)，并且m为1到5。
特定雷帕霉素类似物描述于本文中，并且包括：9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基 环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基 -6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基 -4，9，10，12，13，14，15，16，17，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-二十一氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；37-(4-氯-3-甲基苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙 基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；37-(2，6-二氯苯基)-9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二 甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十 九氢-3H-23，27-环氧基-18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷 -1，5，11，28，29(6H，31H)-戊酮；9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙 基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊酮 与2，2-二甲基-3-(吡啶-2-基)-丙酸的酯；37-(2，6-二氯苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3- 甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基 -4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H-23，27-环氧基 -18，15-(环氧基亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(6H，31H)-戊 酮；或其医药学上可接受的盐、前药或代谢物。本发明不限于这些说明性化合物。
在另一实施例中，特定化合物包括下述各物：
雷帕霉素I 雷帕霉素II
本申请案通篇所提及的雷帕霉素类似物I和II是从上图左式开始，分别由第一和第 二化学结构表示。
雷帕霉素类似物还包括R1与R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R3为苯基， R4为OH，R5-R7为OCH3且R8和R9为HC＝CH的化合物；R1为OR3，R2为N(R3′)(R3″)， R3为H，R3′为H，R3″为苯基，R4为OH，R5-R7为OCH3且R8和R9为H2C-CH2的化合 物；R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R3为苯基，R4为OH，R5-R7为OCH3 且R8和R9为H2C-CH2的化合物；R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R4为 OH，R5-R7为OCH3，R8和R9为HC＝CH且R3为下式的化合物：
R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R4为OH，R5-R7为OCH3，R8和R9 为HC＝CH且R3为下式的化合物：
R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R3为苯基，R5-R7为OCH3，R8和R9 为HC＝CH且R4为下式的化合物：
以及R1和R2经由单键连接，R1为O，R2为NR3，R4为OH，R5-R7为OCH3，R8 和R9为H2C-CH2且R3为下式的化合物：
所述化合物可含有一个或多个不对称碳原子，并且一些化合物可含有一个或多个不 对称(手性)中心且因此能产生光学异构体和非对映异构体。尽管并未关于立体化学予 以展示，但当所述化合物可含有一个或多个手性中心时，优选至少一个手性中心具有S- 立体化学。因此，所述化合物包括所述光学异构体和非对映异构体；以及外消旋和拆分 的对映异构纯的立体异构体；以及R与S立体异构体的其它混合物，和其医药学上可接 受的盐、水合物、代谢物和前药。
术语“烷基”在本文中用于指具有1到10个碳原子且合意地约1到8个碳原子的 直链和支链饱和脂肪族烃基。术语“烯基”在本文中用于指具有一个或多个碳碳双键且 含有约2到10个碳原子的直链和支链烷基。在一个实施例中，术语烯基是指具有1或2 个碳碳双键且具有2到约6个碳原子的烷基。术语“炔基”在本文中用于指具有一个或 多个碳碳三键且具有2到8个碳原子的直链和支链烷基。在另一实施例中，术语炔基是 指具有1或2个碳碳三键且具有2到6个碳原子的烷基。
术语“环烷基”在本文中用于指具有环状结构且具有约4到10个碳原子或约5到8 个碳原子的如前文所述的烷基。
术语“经取代烷基”、“经取代烯基”和“经取代炔基”分别是指具有一个或多个取 代基的烷基、烯基和炔基，所述取代基包括(不限于)卤素、CN、OH、NO2、氨基、 芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷基羧基和芳基硫基，所述基团可任选经 例如1到4个包括以下基团的取代基取代：卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷 基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳基 硫基。这些取代基可连接到烷基、烯基或炔基的任一碳上，只要所述连接构成稳定化学 部分即可。
如本文所使用，术语“芳基”是指例如具有6-20个碳原子的芳香族系统，其可包括 单环或者稠合或键联在一起的多个芳香环(例如，2个或3个)，其中所述稠合或键联环 的至少一部分形成共轭芳香族系统。芳基可包括(但不限于)苯基、萘基、联苯、蒽基、 四氢萘基、菲基、茚、苯并萘基、芴基和咔唑基。
术语“经取代芳基”是指经一个或多个包括以下基团的取代基取代的芳基：卤素、 CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷 基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳基硫基，所述基团可任选经取代。在一个实施例中， 经取代芳基是经1到4个包括以下基团的取代基取代：卤素、CN、OH、NO2、氨基、 烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基 烷基和芳基硫基。
如本文所使用，术语“杂环”是指稳定的4元到7元单环或多环杂环，其为饱和、 部分饱和或完全不饱和的，包括芳香族基团，诸如吡啶基。杂环具有碳原子和一个或多 个包括氮、氧和硫原子的杂原子。在一个实施例中，杂环在环主链中具有1到4个杂原 子。当杂环在环主链中含有氮或硫原子时，所述氮或硫原子可经氧化。术语“杂环”还 指杂环与芳基环稠合得到的例如具有9到20个环成员的多环。杂环可经由杂原子或碳 原子与芳基环连接，条件是所得杂环结构在化学上稳定。所属领域中已知多种杂环基团， 并且所述基团包括(不限于)含氧环、含氮环、含硫环、含混合杂原子的环、含杂原子 的稠环和其组合。含氧环包括(但不限于)呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、吡哺酮基和 二氧杂环己烯基环。含氮环包括(不限于)吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、吡啶基、 哌啶基、2-氧代哌啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、氮杂卓基、三嗪基、吡咯 烷基和氮杂卓基环。含硫环包括(不限于)噻吩基和二硫醇基环。含混合杂原子的环包 括(但不限于)氧硫杂环戊烯基(oxathiolyl)、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁三唑基、 二噁唑基、噁噻唑基、氧硫杂环戊烯基、噁嗪基、噁噻嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、硫 代吗啉基亚砜、氧杂卓基(oxepinyl)、硫杂卓基(thiepinyl)和二氮杂卓基环。含杂原 子的稠环包括(但不限于)苯并呋喃基、硫茚(thionaphthene)、吲哚基、氮茚基 (benazazolyl)、purindinyl、吡喃并吡咯基、异吲唑基、茚洛秦基(indoxazinyl)、苯并噁 唑基、邻苯甲内酰胺基(anthranilyl)、苯并吡喃基、喹啉基、异喹啉基、benzodiazonyl、 萘啶基(naphthylridinyl)、苯并噻吩基、吡啶并吡啶基、苯并噁嗪基、氧杂蒽基(xanthenyl)、 吖啶基和嘌呤基环。
如本文所使用，术语“经取代杂环”是指具有一个或多个包括以下基团的取代基的 杂环基团：卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧 基、烷基氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳基硫基，所述基团可任选经取代。 在一个实施例中，经取代杂环基团是经1到4个取代基取代。
术语“酰基”是指-C(O)-基团，其在碳原子处经取代。酰基可经取代，或为末端酰 基，诸如HC(O)-基团。取代基可包括上文关于烷基所述的任一取代基，即一个或多个包 括(不限于)卤素、CN、OH、NO2、氨基、芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、烷基羰 基、烷基羧基和芳基硫基的取代基，所述基团可任选经取代。实例包括-C(O)-烷氧基(例 如，-OMe或-OEt)或-C(O)-烷基，其中烷基可为直链或支链且任选经例如杂环基(诸如 吡啶基)取代。
如本文所使用，术语“烷氧基”是指O(烷基)基团，其中连接点是通过氧原子且所 述烷基任选经取代。
如本文所使用，术语“芳氧基”是指O(芳基)基团，其中连接点是通过氧原子且所 述芳基任选经取代。
如本文所使用，术语“烷基氧基”是指烷基OH基团，其中连接点是通过所述烷基。
如本文所使用，术语“芳基硫基”是指S(芳基)基团，其中连接点是通过硫原子且 所述芳基可任选经取代。
如本文所使用，术语“烷基羰基”是指C(O)(烷基)基团，其中连接点是通过羰基部 分的碳原子且所述烷基任选经取代。
如本文所使用，术语“烷基羧基”是指C(O)O(烷基)基团，其中连接点是通过羧基 部分的碳原子且所述烷基任选经取代。
如本文所使用，术语“氨基烷基”是指仲胺和叔胺，其中连接点是通过氮原子且所 述烷基任选经取代。所述烷基可为相同或不同的。
如本文所使用，术语“卤素”是指氯、溴、氟或碘基。
雷帕霉素类似物可由雷帕霉素原料制备。雷帕霉素原料优选包括(不限于)雷帕霉 素、去甲雷帕霉素(norrapamycin)、去氧雷帕霉素、去甲基雷帕霉素或去甲氧基雷帕霉 素，或其医药学上可接受的盐、前药或代谢物。然而，所属领域技术人员将能够容易地 选择可用于制备本发明的新颖雷帕霉素类似物的适当雷帕霉素原料。
术语“去甲基雷帕霉素”是指一类缺少一个或多个甲基的雷帕霉素化合物。可根据 本发明使用的去甲基雷帕霉素的实例包括：29-去甲基雷帕霉素(美国专利第6,358,969 号)、7-O-去甲基-雷帕霉素(美国专利第6,399,626号)、17-去甲基雷帕霉素(美国专利 第6,670,168号)和32-O-去甲基雷帕霉素等。
术语“去甲氧基雷帕霉素”是指一类缺少一个或多个甲氧基的雷帕霉素化合物，且 包括(不限于)32-去甲氧基雷帕霉素。
雷帕霉素类似物可通过将雷帕霉素原料与亲双烯体组合来制备。术语“亲双烯体” 是指与1，3-二烯反应得到[4+2]环加成产物的分子。本发明所用的亲双烯体优选为任选经 取代的亚硝基苯。多种亚硝基苯可用于本发明中，并且其包括亚硝基苯、2，6-二氯亚硝 基苯和1-氯-2-甲基-4-亚硝基苯等。所属领域技术人员将能够容易地选择将有效制备本 发明的雷帕霉素类似物的亚硝基苯的量。优选利用过量的亚硝基苯，并且更优选亚硝基 苯与雷帕霉素原料的比例为5∶1。然而，如所属领域技术人员所测定，也可利用甚至1∶1、 2∶1或3∶1的亚硝基苯与雷帕霉素的比例。
亚硝基苯与雷帕霉素原料是在溶剂中组合。所述溶剂优选能在接触时即溶解亚硝基 苯和/或雷帕霉素，或当反应进行时溶解亚硝基苯和雷帕霉素。可用于本发明中的溶剂包 括(不限于)二甲基甲酰胺、二噁烷(诸如对二噁烷)、氯仿、醇(诸如甲醇和乙醇)、 乙酸乙酯、水、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷和甲苯，或其组合。然而，所属领域技术人 员将能够容易地根据雷帕霉素原料和亚硝基苯的溶解性以及溶剂与所述物质的反应性 来选择适当溶剂。所用溶剂的量视反应规模而定，且具体说来，视反应混合物中存在的 雷帕霉素原料和亚硝基苯的量而定。所属领域技术人员将能够易于测定所需溶剂的量。
通常，将含有亚硝基苯、雷帕霉素原料和溶剂的溶液保持在高温下，且优选保持在 不会促进雷帕霉素和亚硝基苯分解的温度下。在一个实施例中，将所述溶液保持在约30 ℃到约70℃且优选约50℃的温度下。将所述组分加热一段足以允许雷帕霉素与亚硝基 苯发生反应的时间。所属领域技术人员使用已知技术将能够易于监测在加热过程中反应 的进程，并由此测定进行反应所需的时间量。在一个优选实施例中，将雷帕霉素和亚硝 基苯与对二噁烷组合，并保持在约50℃的温度下。
雷帕霉素类似物的分离和纯化在所属领域技术人员的技术范围内，并包括色谱法， 包括(不限于)高效液相色谱(HPLC)，诸如反相HPLC和正相HPLC，以及尺寸排阻 色谱；和再结晶。
获得雷帕霉素类似物后，即可使其还原以形成较为饱和的雷帕霉素类似物。所属领 域技术人员将能够容易地选择用于本发明的适当还原剂。优选可使用氢化试剂来实现雷 帕霉素类似物的还原。所属领域技术人员将能够容易地选择用于本发明的适当氢化试 剂。通常利用支撑物、优选碳支撑物等承载的过渡金属催化剂或过渡金属在存在氢气的 情况下进行还原。在优选实施例中，在存在氢气的情况下，使用碳载钯金属进行还原。
雷帕霉素类似物的还原通常是在溶剂中进行。多种溶剂可用于还原，且包括(不限 于)醇，诸如甲醇。然而，所属领域技术人员将能够视氢化催化剂和所还原的雷帕霉素 类似物而定容易地选择用于本发明的适当溶剂。溶剂的量视反应规模而定且具体说来， 视所还原的雷帕霉素类似物的量而定。
所属领域技术人员可易于测定本发明中所用的氢化试剂的量。然而，所属领域技术 人员将能够测定并调整进行还原和形成较为饱和的本发明的雷帕霉素类似物所需的氢 化试剂的量。此外，可利用多种设备来进行本发明的氢化，并且所述设备包括帕尔设备 (Parr apparatus)等。用于氢化的具体设备的选择将在所属领域技术人员的技术范围内。
制备本发明的雷帕霉素类似物的优选方法概述于下文的方案1中：
方案1
其中R1、R2、R4、R4′、R6、R7、R15和n在上文中经定义。
可利用由医药学上或生理学上可接受的酸或碱得到的医药学上可接受的盐、前药或 代谢物形式的雷帕霉素类似物。这些盐包括(但不限于)以下与诸如盐酸、硫酸、硝酸、 磷酸等矿物酸或无机酸以及诸如乙酸、草酸、琥珀酸和马来酸等有机酸形成的盐。其它 盐包括与诸如钠、钾、钙或镁等碱金属或碱土金属形成的酯、氨基甲酸酯形式和其它常 规“前药”形式的盐，当所述盐以此类形式投与时，其会在活体内转化成活性部分。
雷帕霉素类似物的其它合成途径和特征提供于上文所参考的2006年6月22日公开 的共同转让的共同代决的公开申请案US 2006/0135549的实例1-3中，所述申请案的标 题为“雷帕霉素类似物和其在治疗神经病症、增生性病症和炎症性病症方面的用途”。
可用于本发明方法中的雷帕霉素类似物的其它实例揭示于2006年6月22日自 U.S.S.N.11/300,941公开的共同持有的公开申请案U.S.2006/0135550中，所述申请案的 标题为“雷帕霉素衍生物和其在治疗神经病症方面的用途(Rapamycin Derivatives and the Uses Thereof in the Treatment of Neurological Disorders)”，其完整内容以引用的方式并入 本文中。
在其它实施例中，免疫亲和素配体为美立霉素类似物。可用于本发明方法中的美立 霉素类似物的实例包括揭示于例如U.S.2005/0197379、U.S.2005/0272133、U.S. 2005/0197356、WO 2005/084673、WO 2005/085257以及以下共同持有的临时申请案中 的美立霉素类似物：2005年3月23日申请的U.S.S.N.60/664,483，其标题为“美立霉 素衍生物和其用途(Meridamycin Derivatives and Uses Thereof)”(通过USPTO PAIR公 开可用)；和2006年3月7日申请的U.S.S.N.60/779,940，其标题为“用于治疗神经变 性病症的美立霉素类似物(Meridamycin Analogues for the Treatment of Neurodegenerative Disorders)”。(所有专利的完整内容都以引用的方式并入本文中。)所揭示的免疫亲和素 配体的某种神经营养作用可通过形成本文所述的复合物来介导。在一个实施例中，美立 霉素类似物具有U.S.2005/0197379中的化合物I的化学式。
已证实，若干上述雷帕霉素和美立霉素类似物在所培养的皮层、多巴胺能和脊髓神 经元中具有有效的神经营养(例如，神经保护、神经再生和/或刺激神经突起生长)活性。
免疫亲和素复合物
一方面，本发明涉及免疫亲和素复合物的发现。在一些实施例中，所述复合物包括 免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)、免疫亲和素(例 如，FKBP52)或其功能性变异体和钙通道亚基(例如，电压门控L型钙通道β1亚基) 或其功能性变异体。
如本文所使用，术语“结合”和“复合物形成”是指两个或两个以上分子(例如多 肽、大环内酯类等)的直接或间接缔合。直接缔合可例如包括在生理条件下的共价、静 电、疏水、离子和/或氢键相互作用。间接缔合包括例如两个或两个以上分子是复合物的 一部分但不具有直接相互作用。在一个实施例中，分子之间的缔合足以在生理条件下保 持稳定复合物。
本发明的复合物可以经分离、重组或纯化形式获得。作为“蛋白质”或“复合物” 的修饰语的术语“经纯化”或“经分离”是指一种或多种蛋白质的制剂，所述蛋白质实 质上不含通常在细胞或细胞溶解产物中与其缔合的其它蛋白质。举例来说，短语“实质 上不含”涵盖包含小于40％、30％、20％(以干重计)的污染蛋白质且通常包含小于5％ 的污染蛋白质的制剂。当提及用于产生重构蛋白质混合物的组分蛋白质制剂时，“经纯 化”或“经分离”意思指：所述分子是在实质上不存在诸如其它蛋白质(尤其可实质上 掩蔽、减小、混乱或改变纯制剂形式的组分蛋白质的特性或其在标的重构混合物中的功 能的其它蛋白质)等其它生物大分子的情况下存在。如本文所使用，术语“经纯化”或 “经分离”优选指存在至少80干重％、通常在85干重％的范围内、更通常95-99干重％ 或更高百分比的相同类型的生物大分子(但也可存在水、缓冲剂和其它小分子、尤其分 子量低于5000的分子)。在一个实施例中，所述复合物或蛋白质实质上不含纯化材料， 例如基质或其它材料。在其它实施例中，所述复合物或蛋白质与纯化材料缔合。
术语“重组”“蛋白质”或“复合物”是指形成复合物的蛋白质，其可通过重组DNA 技术产生。一般说来，将编码所表达蛋白质的DNA插入适当表达载体中，接着使用所 述表达载体来转化宿主细胞(在本文中也称为“重组细胞”)以产生异源蛋白质。此外， 关于编码重组蛋白的重组基因的短语“源自”意欲包括在“重组蛋白”的含义内，所述 蛋白质含有天然蛋白质的氨基酸序列，或通过天然存在的蛋白质的突变(包括取代、插 入和缺失)所产生的与天然蛋白质的氨基酸序列类似的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供一种复合物，其是例如通过从包含所述复合物的组分 的细胞(例如，天然存在的细胞或重组细胞，例如免疫亲和素处理的细胞)提取而制备 得到。可通过所属领域中已知的任何方法实现细胞提取。举例来说，可通过诸如离心、 凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱和/或亲和纯化等一系列常规蛋白质纯化步骤，从细 胞提取出复合物。通常优先选择不会解离复合物的纯化步骤和条件。如随附实例中所述， 可使用溶解缓冲液(例如，6ml；50mM Tris(pH 7.4)、250mM NaCl、5mM EDTA、 50mM NaF、1mM Na3VO4、1％Nonidet P40(NP40)、0.1％巯基乙醇和2％蛋白酶抑制 剂混合物)。举例来说，可如傅雷兹(Fretz)等人((1991)美国化学学会杂志(J.Am.Chem. Soc.)113：1409)所述，制备将免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素类似物)连接到树脂 的亲和基质。在一个实施例中，可使用亲和凝胶10(Affi-gel10)树脂，通过氨基-苯基- 丁酸来制备亲和基质(图1)。简单地说，可通过用诸如二碳酸二烯丙酯等保护基处理来 保护氨基-苯基-丁酸的氨基。可在CH2Cl2中利用PhOP(O)Cl2DMF复合物来活化所得复 合物的酸基。反应中止后，可例如通过HPLC纯化酯产物，并例如通过MS和NMR加 以表征。在去除烯丙基氧基羰基后，可将产物的氨基连接到亲和凝胶10(Affigel-10) 基质。可洗涤所得亲和凝胶-免疫亲和素配体亲和基质并加以储存。提取后，可将细胞溶 解产物的等分试样与诸如亲和凝胶10-免疫亲和素配体等亲和珠粒混合。可例如在4-20％ SDS-PAGE凝胶上对珠粒进行分析。可消化蛋白质谱带，并通过例如FT-ICR-MS分析进 一步分析。
在其它实施例中，可通过纯化诸如大肠杆菌(E.coli)等细胞中表达的重组多肽， 并在活体外重构复合物来制备复合物。在某些实施例中，复合物的一种或多种组成多肽 是由细胞的内源基因表达。在某些实施例中，复合物为重组复合物，其中一种或多种组 成多肽是由重组核酸表达。在某些实施例中，本发明还包括经标记的蛋白质复合物，其 中所述复合物中至少一种多肽经标记。举例来说，所述标记为可检测标记，其可选自例 如放射性同位素、荧光化合物、酶和酶辅因子中的一者或多者。在另一实施例中，标记 促进多肽的纯化、分离或检测。标记可为聚组氨酸、FLAG、Glu-Glu、谷胱甘肽硫转移 酶(GST)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白质A、蛋白质G和免疫球蛋白重链恒定区。 在一个实施例中，经标记蛋白质为FKBP52。在另一实施例中，经标记蛋白质为钙通道 亚基。可通过适当的亲和纯化(例如，如上文所述，或通过在六组氨酸标签的情况下使 复合物与镍或铜树脂接触，在GST标签的情况下使复合物与谷胱甘肽树脂接触)来纯化 经标记复合物或其组分。
在某些实施例中，本发明的复合物为水溶性形式(“可溶性复合物”)。举例来说， 可溶性复合物可包括免疫亲和素和/或钙通道亚基的可溶性细胞质部分。在其它实施例 中，复合物可能不易溶于水或为膜缔合形式。举例来说，包含具有跨膜结构域的蛋白质 的复合物通常不可溶于水。可例如制备包含脂质、清洁剂和/或其它组分的脂质微团、清 洁剂微团或混合微团形式的不可溶复合物。也可制备作为细胞的膜部分的不可溶复合 物。膜部分可为粗膜部分，其中所述膜部分是例如通过离心或过滤简单地与细胞的可溶 部分分离。可进一步例如通过针对复合物的一种或多种蛋白质中存在的亲和标签的亲和 纯化来纯化膜部分。当复合物以脂质双层形式存在时，所述脂质双层可例如为小泡(任 选倒转，即其中通常在细胞外的表面向内面向小泡的内部)或平坦双层。
结晶形式的复合物也在本发明的范围内。
在一个实施例中，使复合物交联。可使用交联试剂来制备交联复合物，所述交联试 剂可为多官能或双官能试剂。所述试剂包括二胺类的化合物，诸如六亚甲基二胺、二氨 基辛烷、乙二胺、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼盐酸盐(MPBH)、4-(N-马来酰亚 胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼盐酸盐(M2C2H)和3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼(PDPH) 和其它胺烯烃。此类交联剂的实例为戊二醛、琥珀醛、辛二醛和乙二醛。其它多官能交 联剂包括卤基-三嗪，例如氰尿酰氯；卤基-嘧啶，例如2，4，6-三氯/溴-嘧啶；脂肪族或芳 香族单-或二羧酸的酸酐或卤化物，例如，马来酸酐、(甲基)丙烯酰氯、氯乙酰氯；N- 羟甲基化合物，例如N-羟甲基-氯乙酰胺；二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，例如亚苯基-1，4- 二异氰酸酯；和氮丙啶。其它交联剂包括环氧化物，诸如二环氧化物、三环氧化物和四 环氧化物。关于其它可用交联试剂的代表性清单，例如参看皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook)，皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company)，洛克路德 (Rockford)，111.(1997)；以及S.S.王(S.S.Wong)，蛋白质连结和交联化学(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)，CRC出版社，佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton，Fla.)(1991)。
另外，可使用可逆交联剂。可逆交联剂的实例描述于T.W.格林(T.W.Green)，有 机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，约翰威立父子出版公司 (John Wiley & Sons)(编)(1981)中。用于可逆保护基的任一种策略都可并入适于在产生 能够可逆、受控溶解的碳水化合物交联糖蛋白晶体的过程中的至少一种交联的交联剂 中。各种方法列于应用化学国际版(英文)(Angewandte Chmie Intl.Ed.Engl.)，35，第 2056页(1996)中有关本主题的沃曼(Waldmann)评述中。其它类型的可逆交联剂为含二 硫键的交联剂。
本发明另外提供调节(例如，增加)本文所述的复合物的形成和/或稳定性的方法。 所述方法包括：使免疫亲和素(例如FKBP52，例如人FKBP52)或其功能性变异体和 电压门控L型钙通道亚基(例如β1亚基，例如人β1亚基)或其功能性变异体与免疫亲 和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)在允许形成所述复合物的 条件下接触。接触步骤可在活体外，例如在细胞溶解产物或重构系统中发生。或者，可 对例如人类或动物个体(例如，活体内动物模型)等个体中存在的细胞(例如，神经元 或心血管细胞)执行所述方法。
本发明的方法还可用于培养的细胞。举例来说，可在活体外培养细胞(例如，纯化 或重组细胞)，并且可通过将免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素或美立霉素类似物)加 入培养基中来实现接触步骤。通常，所述细胞为哺乳动物细胞，例如人类细胞。在一些 实施例中，所述细胞为神经元细胞或心血管细胞。在一些实施例中，所述细胞为重组细 胞，例如宿主细胞。所述方法包括(i)将一种或多种编码免疫亲和素和/或钙通道亚基 的多聚核苷酸引入细胞中；(ii)使所述细胞与免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷 帕霉素或美立霉素类似物)接触；(iii)由此形成复合物。
宿主细胞
另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含一个或多个编码本文所揭示的复合物 的一种或多种多肽成分的核酸。在一个实施例中，宿主细胞含有第一核酸，其包括编码 免疫亲和素(例如FKBP52，例如，如本文所述的哺乳动物FKBP52)或其功能性变异 体的核苷酸序列；和/或第二核酸，其包括编码电压门控L型钙通道亚基(例如β1亚基， 例如，如本文所述的哺乳动物β1亚基)或其功能性变异体的核苷酸序列。在一个实施 例中，第一核酸包含编码如图13A-13B所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：6-7)的核苷酸 序列或与所述序列实质上一致的序列。在其它实施例中，第二核酸包含编码如图12A-12E 所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-5)的核苷酸序列或与所述序列实质上一致的序列。
“宿主细胞”、“重组细胞”和“重组宿主细胞”为在本文中可互换使用的术语。应 了解，所述术语不仅指特定个体细胞，而且还指所述细胞的子代或潜在子代。由于在传 代过程中可能因突变或环境影响而发生某些修饰，故所述子代事实上可能与母细胞不一 致，但其仍包括在如本文所使用的术语的范围内。
术语“重组核酸”包括包含至少两个在自然界中不会一起存在的序列的任何核酸。 可例如在活体外通过使用分子生物学方法，或例如在活体内通过利用同源或非同源重组 在新染色体位置插入核酸来产生重组核酸。
在一些实施例中，可例如使用宿主细胞来纯化、制造或研究蛋白质或蛋白质复合物。 可例如任选使用宿主细胞在分析方案(诸如下文所述的分析方案)中测试化合物。
在某些实施例中，本发明复合物的多肽的重组表达可单独进行，并且可由此形成复 合物。在另一实施例中，所述本发明复合物的多肽的重组表达可在同一细胞中进行，并 且可由此形成复合物。
用于重组表达的适当宿主细胞包括细菌，诸如大肠杆菌、梭状芽孢杆菌属 (Clostridium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)；酵母；植物细胞；昆虫细胞(诸如)； 和哺乳动物细胞，诸如成纤维细胞、淋巴细胞、U937细胞(或其它前单核细胞细胞系) 和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
为进行宿主细胞表达，可将重组核酸操作性连接到表达构筑体中的一个或多个调控 序列。调控核苷酸序列通常应适于用于表达的宿主细胞。对于多种宿主细胞，多类适当 的表达载体和适当的调控序列为所属领域中已知。通常，所述一个或多个调控核苷酸序 列可包括(但不限于)启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始 和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化子序列。本发明涵盖如所属领域中 已知的组成性或可诱导启动子。所述启动子可为天然存在的启动子，或组合一个以上启 动子元件的杂合启动子。表达构筑体可存在于细胞附加体(诸如质粒)上，或表达构筑 体可插入染色体中。在优选实施例中，表达载体含有允许选择经转化宿主细胞的可选择 标记基因。可选择标记基因为所属领域众所周知，并将随所使用的宿主细胞变化。
表达载体还可包括融合结构域(通常由表达载体提供)，因此本发明的重组多肽表 达为具有所述融合结构域的融合多肽的形式。融合结构域的主要优点在于：其有助于鉴 别和/或纯化所述融合多肽，并且还能增强蛋白质表达水平和总产率。
抗体
另一方面，本发明提供一种结合本文所揭示的复合物的抗体，或其抗原结合片段。 在某些实施例中，所述抗体能增加本文所揭示的复合物的形成和/或稳定性。在其它实施 例中，所述抗体或其抗原结合片段能减少或抑制本文所揭示的复合物的形成和/或稳定 性。例示性抗体分子包括完全免疫球蛋白分子或其含有例如抗原结合位点的部分(包括 所属领域中称为F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2、人类化嵌合抗体和F(v)的免疫球蛋白分子的部 分)。可通过所属领域中已知的方法产生多克隆或单克隆抗体。(柯勒(Kohler)和米尔 斯坦(Milstein)(1975)自然(Nature)256，495-497；坎贝尔(Campbell)″单克隆 抗体技术，啮齿动物和人类杂交瘤的制备和表征(Monoclonal Antibody Technology，the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas)″，伯顿(Burdon)等 人(编)(1985)″生物化学和分子生物学技术(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)″，第13卷，爱思唯尔科技出版公司(Elsevier Science Publishers)，阿 姆斯特丹(Amsterdam)；哈洛维(Harlow)和拉尼(Lane)(编)(1988)″抗体试验室手 册(Antibodies A Laboratory Manual)″，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽 约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y)；所有所述文献的内容都以引用的方式并入本文中。
可使用本发明的经纯化复合物或其多肽组分使动物免疫，从而获得与复合物特异性 反应的多克隆和单克隆抗体。可使用完整复合物或全长多肽组分作为免疫原，或使用其 片段来获得所述抗体。也可使用较小的多肽片段来使动物免疫。另外，肽免疫原可在羧 基末端含有半胱氨酸残基，并且与诸如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)等半抗原连结。可通 过用硫酸酪氨酸残基置换酪氨酸残基来产生其它肽免疫原。所属领域中已知合成所述肽 的方法，如例如奥斯贝尔(Ausbel)等人(编)(1987)现代分子生物学规程(In Current Protocols In Molecular Biology)，约翰威立父子出版公司(John Wiley and Sons)(纽约 州纽约(New York，N.Y.))中所述。
可通过如以下文献中所揭示的所属领域中已知的技术来产生经修饰抗体或其抗原 结合片段：例如，伍德(Wood)等人，国际公开案WO 91/00906；库契拉帕底(Kucherlapati) 等人，国际公开案WO 91/10741；朗伯格(Lonberg)等人，国际公开案WO 92/03918；肯 (Kay)等人，国际公开案WO 92/03917；朗伯格(Lonberg)等人(1994)自然(Nature) 368：856-59；格林(Green)等人(1994)自然-遗传学(Nat.Genet.)7：13-21；莫里森 (Morrison)等人(1994)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)81：6851-55； 布鲁格曼(Bruggeman)等人(1993)免疫学时代(Year Immunol.)7：33-40；图瓦卢 (Tuaillon)等人(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)90：3720-24； 布鲁格曼(Bruggeman)等人(1991)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)21：1323-1326； 拉瑞克(Larrick)等人(1991)生物技术(Biotechniques)11：152-56；罗宾逊(Robinson) 等人，国际专利申请案PCT/US86/02269；阿卡拉(Akira)等人，欧洲专利申请案184,187； 朝美(Taniguchi)，欧洲专利申请案171,496；莫里森(Morrison)等人，欧洲专利申请 案173,494；纽伯格(Neuberger)等人，国际公开案WO 86/01533；卡比利(Cabilly) 等人，美国专利第4,816,567号；贝特(Better)等人(1988)科学(Science)240：1041-43； 刘(Liu)等人(1987)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)84：3439-43； 刘(Liu)等人(1987)免医学杂志(J.Immunol.)139：3521-26；孙(Sun)等人(1987) 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)84：214-18；西村(Nishimura)等 人(1987)癌症研究(Canc.Res.)47：999-1005；伍德(Wood)等人(1985)自然(Nature) 314：446-49；席瓦(Shaw)等人(1988)美国癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.) 80：1553-59；莫里森(Morrison)(1985)科学(Science)229：1202-07；奥伊(Oi)等 人(1986)生物技术(BioTechniques)4：214；和奎恩(Queen)等人，美国专利第5,585,089 号、第5,693,761号和第5,693,762号，所有所述文献的内容都以引用的方式并入本文中。 这些方法包括分离、处理和表达编码来自重链或轻链中至少一者的全部或部分免疫球蛋 白Fv可变区的核酸序列。所属领域技术人员已知所述核酸的来源，并且例如可从产生 抗预定靶的抗体的杂交瘤获得所述核酸来源。随后，可将编码重组抗体的重组DNA或 其片段克隆到适当表达载体中。
用于鉴别调节复合物形成的测试化合物的分析
另一方面，本发明提供一种用于鉴别测试化合物的方法或分析，所述测试化合物可 调节(例如，抑制或增加)包括测试化合物、免疫亲和素和钙通道亚基的复合物的形成 和/或稳定性。所述方法或所述分析包括：使包括免疫亲和素或其功能性变异体和β亚基 或其功能性变异体的样本与测试化合物在允许形成复合物的条件下接触；相对于参考样 本(例如，未暴露于测试试剂的对照样本，或暴露于雷帕霉素的对照样本)，检测与测 试化合物接触的样本中复合物的存在。在存在测试化合物的情况下复合物的含量相对于 参考样本中复合物含量的变化(例如，增加或降低)表明，所述测试化合物能影响(例 如，增加或降低)所述复合物的形成和/或稳定性。优选测试化合物使复合物的形成相对 于参考样本增加例如约1.5、2、5、10倍或更高。
可例如从细菌、放线菌(例如，吸水链霉菌)、酵母或其它有机体(例如，天然产 物)获得测试化合物；以化学方法产生(例如，小分子，包括肽模拟物)或通过重组产 生测试化合物。举例来说，可由天然存在或以遗传学方式修饰的链霉菌属产生聚酮，如 例如U.S.2005/0272133、U.S.2005/0197379中所述。或者，可通过化学合成得到经修饰 形式的本文所揭示的雷帕霉素和美立霉素类似物。
本发明的复合物允许产生新的经修饰大环内酯，例如经修饰形式的本文所揭示的雷 帕霉素和美立霉素类似物。可使用经纯化复合物来测定三维晶体结构，所述结构可用于 建立分子间相互作用模型。举例来说，可测定复合物的晶体结构，并且可通过使用所属 领域中已知的技术进行合理药物设计来产生结构的修饰。多种计算机程序可用于合理药 物设计、计算机建模、模型构建，如U.S.2005/0288489A1(其内容以引用的方式并入本 文中)中所述。
多种分析形式可满足此目的，并且根据本揭示案，所属领域技术人员仍将能够理解 本文中未明确描述的分析。接近诸如形成蛋白质复合物、酶促活性等条件的分析形式可 以多种不同形式发生，且其包括基于例如经纯化蛋白质或细胞溶解产物等无细胞系统的 分析，以及利用完整细胞的基于细胞的分析。可使用简易的结合分析来检测抑制或增强 复合物的各组分之间的相互作用或复合物与底物的结合的化合物。
在某些实施例中，本发明提供重构蛋白质制剂，其包括复合物的多肽以及所述复合 物的一种或多种相互作用多肽。在一个实施例中，将所有组分或复合物同时加入反应混 合物中。在其它实施例中，通过依次添加各组分，例如形成免疫亲和素与钙通道的混合 物，并添加免疫亲和素配体，来制备反应混合物。或者，可将免疫亲和素配体加入免疫 亲和素或钙通道中。可使用各组分的任何次序或组合。本发明的分析包括经标记的活体 外蛋白质-蛋白质结合分析、蛋白质结合的免疫分析等。在一个实施例中，样本为细胞溶 解产物或重构系统。重构复合物可包含至少半纯化蛋白质的重构混合物。半纯化是指已 预先将重构混合物中所用的蛋白质与其它细胞蛋白分离。举例来说，相比细胞溶解产物， 复合物形成中所涉及的蛋白质是以相对于混合物中的所有其它蛋白质至少50％的纯度 存在于混合物中，且更优选以90-95％纯度存在。在某些实施例中，通过混合高纯度蛋 白质来得到重构蛋白质混合物，因此重构混合物中实质上不含可能干扰或以其它方式改 变测量复合物组装和/或解体的能力的其它蛋白质(诸如细胞来源的蛋白质)。在某些实 施例中，可在适于容纳反应物的任何容器中实现在存在和不存在候选化合物的情况下进 行的分析。实例包括微量滴定盘、试管和微量离心管。
在某些实施例中，可发生药物筛选分析，所述分析将根据测试化合物干扰本发明复 合物的组装、稳定性或功能的能力来检测测试化合物。复合物的检测和定量提供一种测 定化合物抑制(或增强)各组分之间的相互作用的功效的方式。可通过由使用各种浓度 的测试化合物获得的数据产生剂量反应曲线来评定化合物的功效。此外，还可进行对照 分析来提供基线以供比较。在对照分析中，复合物的形成是在不存在测试化合物的情况 下定量。
在某些实施例中，可通过多种技术来检测复合物中任何两个多肽之间的缔合或复合 物与底物多肽之间的缔合，所述技术中的多者已在上文中有效描述。举例来说，可例如 使用可检测标记的蛋白质(例如，放射性标记、荧光标记或酶标记)，藉由免疫分析或 藉由色谱检测来定量对于复合物形成的调节。还可使用表面等离子共振系统(诸如，自 拜厄克国际公司(Biacore International AB)(瑞典乌普萨拉(Uppsala，Sweden))可得的 表面等离子共振系统)来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
在某些实施例中，可将复合物的一种多肽固定以促进使复合物与未复合形式的一种 多肽分离，并且适应分析的自动化。本文中已描述亲和基质或珠粒，其含有允许复合物 的其它组分与不可溶基质结合的免疫亲和素配体(或复合物的其它组分)。在有助于形 成复合物的条件下培育测试化合物。培育后，洗涤珠粒以去除任何未结合的相互作用蛋 白质，并直接测定基质珠粒所结合的放射性标记(例如，将珠粒放入闪烁检测器中)， 或例如当使用微量滴定盘时，在使复合物解离后在上清液中测定所述放射性标记。或者， 在洗掉未结合的蛋白质后，可将复合物自基质解离，通过SDS-PAGE凝胶进行分离，并 使用标准电泳技术，由所述凝胶测定基质结合部分中所见的相互作用多肽的含量。
另外，可使用培养的细胞(例如，经纯化的培养细胞或重组细胞)来进行分析。举 例来说，可使用双杂交分析(也称为相互作用陷阱分析(interaction trap assay))来检测 复合物中任何两个多肽的相互作用，且随后检测抑制或增强蛋白质之间的结合的测试化 合物(也参看，美国专利第5,283,317号；W094/10300；泽沃斯(Zervos)等人，(1993)细 胞(Cell)72：223-232；玛杜拉(Madura)等人，(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 268：12046-12054；巴瑞尔(Barrel)等人，(1993)生物技术(Biotechniques)14：920-924； 和岩渊(Iwabuchi)等人，(1993)肿瘤学(Oncogene)8：1693-1696)，所有所述文献的 内容都以引用的方式并入本文中。
在测试化合物和天然提取物文库的许多药物筛选程序中，都需要高通量分析以便使 在指定时间段内所调查的化合物的数量最大化。以无细胞系统(诸如，可利用纯化或半 纯化蛋白质或溶解产物产生的无细胞系统)进行的本发明的分析通常优选作为“初步” 筛选，这是因为，所述分析的产生能允许快速显现并相对容易地检测测试化合物所介导 的分子靶的变化。此外，在活体外系统中通常可忽略测试化合物的细胞毒性和/或生物可 用性作用，而分析的焦点主要集中于，在与其它蛋白质的结合亲和力的变化或分子靶的 酶促特性改变方面可能表现的药物对分子靶的作用。
在某些实施例中，蛋白质复合物的活性可包括(不限于)蛋白质复合物形成，这可 通过免疫沉淀和共沉淀蛋白质的分析或者亲和纯化和共纯化蛋白质的分析来评定。还可 使用基于荧光共振能量转移(FRET)的分析来测定复合物的形成。彼此极为接近的具 有适当发射和激发光谱的荧光分子可展现FRET。对荧光分子加以选择以使一个分子(供 体分子)的发射光谱与另一分子(受体分子)的激发光谱重叠。通过在供体激发光谱范 围内的适当强度的光来激发供体分子。随后，供体以荧光形式发射所吸收的能量。通过 受体分子使其产生的荧光能淬灭。FRET可表现为来自供体的荧光信号的强度的降低、 其激发态的寿命的缩短和/或在受体的较长波长(较低能量)特征下再发射荧光。当以物 理方式分离荧光蛋白时，FRET效应有所减小或经消除。基于FRET的分析描述于美国 专利第5,981,200号中，所述专利的内容以引用的方式并入本文中。
一般说来，当筛选分析为结合分析(蛋白质-蛋白质结合、化合物-蛋白质结合等) 时，一个或多个分子可与标记连接，其中所述标记可直接或间接提供可检测信号。各种 标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、粒子(例如，磁 性粒子)等。特异性结合分子包括诸如生物素与抗生蛋白链菌素、地高辛(digoxin)与 抗地高辛等对。对于特异性结合的成员，通常利用能根据已知程序进行检测的分子来标 记互补成员。
筛选分析中可包括多种其它试剂。这些试剂包括如盐、中性蛋白(例如白蛋白)、 清洁剂等用于促进最佳蛋白质-蛋白质结合和/或减少非特异性或背景相互作用的试剂。 可使用改善分析功效的试剂，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗菌化合物等。各组 分的混合物是以提供必要结合的任何次序添加。培育是在任何适当温度下，通常在介于 4与40℃之间的温度下进行。对培育期加以选择以得到最佳活性，但也可对其进行优化 以促进快速高通量的筛选。
在某些实施例中，可进一步分析测试化合物以鉴别出调节钙通道活性的化合物。举 例来说，可通过在将具有功能性钙通道(例如，异源通道)的真核细胞暴露于含有测试 化合物和钙通道选择性离子的溶液时，测试所述细胞的钙通道活性，并将所测量的钙通 道活性与在不含有测试化合物的溶液中的相同细胞或实质上一致的对照细胞的钙通道 活性相比较，来测量测试化合物的作用。在一个实施例中，将细胞保持在具有当钙通道 打开时足以提供内部电流的钙通道选择性离子浓度的溶液中。所属领域技术人员已知实 践所述分析的方法。举例来说，关于应用非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞和乙酰胆 碱受体的类似方法，参看密示纳(Mishina)等人，(1985)自然(Nature)313：364；诺 达(Noda)等人，(1986)自然(Nature)322：826-828；克罗迪奥(Claudio)等人，(1987) 科学(Science)238：1688-1694。
这些分析都是基于表达功能性钙通道的细胞，并且功能性(诸如以电生理学方式) 测量测试化合物通过异源功能性通道增强、拮抗或以其它方式调节钙通道选择性离子 (诸如Ca++或Ba++)流动幅度和持续时间的能力。在一个实施例中，可直接(诸如，以 电生理学方式)测定流过细胞的重组钙通道的电流量；或在另一实施例中，可通过监测 在细胞内发生并且以钙(或其它)离子依赖性方式受到直接影响的独立反应，来测定所 述电流量。
可将评定钙通道活性的任何方法与本文所述的方法组合使用。举例来说，在用于测 试化合物调节钙通道活性的能力的方法的一个实施例中，通过所述化合物在对钙通道选 择性离子敏感并且使用表达异源钙通道且还含有可操作性连接到编码指示蛋白的结构 基因的转录控制元件以供表达的真核细胞的反应中所作的调节，来测量电流量。用于转 录指示基因的转录控制元件在细胞中会对钙通道选择性离子(诸如Ca2+和Ba+)作出响 应。所述基于转录的分析的细节例如描述于PCT国际专利申请案第PCT/US91/5625号 中。
在其它实施例中，可利用所属领域技术人员已知且在本文中例示说明的测量钙通道 活性的电生理学方法达成所述目的。可使用任何所述方法以便检测功能性钙通道的形成 并表征所得电流的动力学和其它特征。在其它实施例中，可将药理学研究与电生理学测 量组合，以便进一步表征钙通道。
一般说来，可通过检测给定的测试化合物影响以下一种或多种作用的能力来分析所 述化合物在神经系统中的活性：促进神经突起生长；保护神经元免于被化学处理损害； 促进神经元或神经元细胞生长；恢复丧失或受损的与神经系统的神经组织或器官有关的 运动、功能或认知能力；或使神经元再生。举例来说，可通过所属领域中已知的方法来 分离和培养经分离的神经元细胞培养物(例如，多巴胺能、皮层、DRG细胞培养物)(例 如，参看庞(Pong)等人，(1997)神经化学杂志(J.Neurochem.)69：986-994；庞(Pong) 等人，(2001)实验神经学(Exp Neurol.)171(1)：84-97)。可使用如(例如)US 2005/0197356 (描述展示分别测量所培养的多巴胺能神经元和皮层神经元中3H-多巴胺吸收和神经丝 蛋白含量的改变的实例)中所述的技术认可的技术，检测并定量测定神经元活性、分化、 存活的改变。或者，可在所培养的神经细胞系(例如，神经母细胞瘤细胞系、嗜铬细胞 瘤细胞(PC12细胞)、F11)中表征神经元活性。活体外活性可用于鉴别可用于治疗和/ 或缓解多种人类神经变性病况的药剂，所述神经变性病况包括(但不限于)帕金森氏病； 阿兹海默氏病；肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、外伤性损伤、 脊髓损伤、多发性硬化、糖尿病性神经病、与诸如化疗等药物治疗有关的神经病、局部 缺血或局部缺血诱发的损伤、中风等。
检测神经元活性的方法例如包括神经保护分析，其中将测试化合物防止谷氨酸神经 毒性的能力。还可分析感觉神经元培养物(DRG)的神经突起生长，并分析其神经营养 活性。用免疫亲和素配体处理所培养的细胞，且随后分析新的神经突起纤维的存在。免 疫组织化学可有助于如与对照相比较时神经突起的观测和定量。
已研发出多种动物模型和细胞培养分析，并且其可取决于与疾病治疗(包括上文所 述的人类疾病)的临床相关性。以下各参考文献可用作这些分析的来源，并且所有所述 参考文献都是以全文引用的方式特别地并入本文中以达成所述目的：斯坦纳(Steiner) 等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Set U.S.A.)94：2019-2024(1997)；汉密尔 顿(Hamilton)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorgan.Med.Chem.Lett.) 7：1785-1790(1997)；麦克马洪(McMahon)等人，神经生物学新观点(Curr.Opin. Neurobiol.)5：616-624(1995)；盖希(Gash)等人，自然(Nature)380：252-255(1996)； 杰拉奇(Gerlach)等人，欧洲药理学杂志-分子药理学部分(Eur.J.Pharmacol-Mol. Pharmacol)208：273-286(1991)；安普费尔(Apfel)等人，脑研究(Brain Res.)634：7-12 (1994)；王(Wang)等人，药理学和实验治疗学研究(J.Pharmacol Exp.Therap.) 282：1084-1093(1997)；古德(Gold)等人，实验神经学(Exp.Neurol.)147：269-278(1997)； 霍伏尔(Hoffer)等人，神经传导杂志(J.Neural Transm.)[增刊]49：1-10(1997)；和李 恩斯(Lyons)等人，美国国家科学院院刊(PNAS)91：3191-3195(1994)。
治疗和预防用途
另一方面，本发明提供调节表达免疫亲和素(例如，FKBP52)或其功能性变异体 和电压门控L型钙通道亚基(例如，β1亚基)或其功能性变异体的细胞(例如哺乳动物 细胞)的功能(例如，钙通道活性(例如，电压门控钙通道活性))的方法。在一个实 施例中，钙通道或FKBP52活性或表达受到抑制。在钙通道活性受到抑制的实施例中， 优选刺激神经突起生长和/或存活。通常，用于本发明方法中的细胞为哺乳动物细胞，例 如人类细胞(例如，神经元或心血管细胞)。在一些实施例中，所述方法包括使细胞与 免疫亲和素配体(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物)在允许形成本文所 述的复合物的条件下接触，由此抑制钙通道活性。
在相关实施例中，所述方法包括使细胞(例如，多巴胺能、胆碱能、皮层和脊髓神 经元细胞)与钙通道β亚基(例如，电压门控L型钙通道β1亚基)的拮抗剂接触。所 述拮抗剂也可为钙通道β亚基的活性和/或表达的抑制剂。如本文所使用，术语“拮抗剂” 是指降低、抑制或以其它方式减小钙通道β亚基(例如，β1亚基)的一种或多种生物活 性的试剂。拮抗作用未必表示完全消除钙通道β亚基的生物活性。在一个实施例中，所 述拮抗剂为免疫亲和素配体，例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素类似物。通常， 免疫亲和素配体是以足以形成包括配体、免疫亲和素或其功能性变异体和钙通道亚基或 其功能性变异体的复合物和/或使所述复合物稳定的量投与。在其它实施例中，拮抗剂为 钙通道β亚基的转录抑制剂，例如，如本文中较详细描述的核酸抑制剂(例如RNAi)。
本发明的方法可以在培养基中的细胞进行。或者，作为例如活体内(例如治疗或预 防)方案的一部分，可对个体中存在的细胞(例如，神经元细胞或心血管细胞)、或在 动物个体(例如，活体内动物模型))内执行所述方法。
因此，本发明涵盖治疗或预防个体的与钙通道功能障碍有关的病症的方法。所述方 法包括：对个体投与足以形成包括免疫亲和素配体、免疫亲和素或其功能性变异体和钙 通道亚基或其功能性变异体的复合物和/或使所述复合物稳定的量的免疫亲和素配体(例 如，雷帕霉素或美立霉素类似物)，由此治疗或预防所述病症。所述方法可任选包括以 下步骤：鉴别(例如，评估、诊断、筛选和/或选择)具有患一种或多种与涉及钙通道功 能障碍的病症有关的症状的风险或具有所述症状的个体。所述个体可为例如罹患神经变 性病症或心血管病症的哺乳动物，例如人类。举例来说，所述个体为罹患选自以下一者 或多者的病症的人类(例如，人类患者)：中风、帕金森氏病、偏头痛、小脑性共济失 调、心绞痛、癫痫、高血压、局部缺血或心律失常。
如本文所使用，术语“个体”意欲包括人类和非人类动物。优选人类动物包括患有 以异常钙通道活性为特征的病症的人类患者。术语“非人类动物”包括脊椎动物，例如 哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、啮齿动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖 动物、爬行动物等。所述个体可为例如罹患神经变性病症或心血管病症的哺乳动物，例 如人类。
短语免疫亲和素配体的“治疗有效量”是指在对个体(例如，人类患者)投与单次 或多次剂量后，能有效治疗个体的药剂的量。术语“治疗”包括治愈病症、降低病症的 一种或多种症状的严重程度、缓解病症的一种或多种症状，或延长个体的存活期超过在 不存在所述治疗的情况下所预期的存活期。类似地，短语免疫亲和素配体的“预防有效 量”是指在对个体(例如，人类患者)投与单次或多次剂量后，能有效预防或延迟病症 (例如，如本文所述的病症)的发作或复发的发生的药剂的量。
可单独投与免疫亲和素配体(例如，雷帕霉素类似物)，或可将其与一种或多种药 剂(例如治疗剂)组合投与。在此情况中，术语“组合”意思指：各药剂是实质上同时 (同时或依次)给与。如果依次给与，则在开始投与第二化合物时，优选仍能在治疗部 位检测到有效浓度的两种化合物中的第一化合物。在一个实施例中，第二药剂为钙通道 拮抗剂，例如L型钙通道拮抗剂。L型钙通道拮抗剂的实例包括二氢吡啶；苯基烷基胺 (例如，维拉帕米(verapamil)、加洛帕米(gallpamil)和噻帕米(thiapamil))；苯并硫 氮杂卓；二苯基丁基哌啶类抗精神分裂症神经安定药(例如匹莫齐特(pimozide)、 fluspiridine、五氟利多(penfluridol)和氯哌莫齐(clopimozide))；以及硝苯地平 (nifedipine)、卡马西平(carbamazepine)、地尔硫卓(diltiazem)、尼卡地平(nicardipine)、 尼莫地平(nimodipine)和尼群地平(nitredipine)。
与钙通道功能障碍有关的例示性病症包括：中风；帕金森氏病；偏头痛(例如，先 天性偏头痛)；小脑性共济失调；心绞痛；癫痫；高血压；局部缺血(例如，心肌缺血)； 心律失常；中风；头部外伤或脊髓损伤，或其它脑部、周围神经、中枢神经或神经肌肉 系统损伤；慢性、神经性或急性疼痛；情绪障碍；精神分裂症；抑郁症；焦虑症；精神 病；药物成瘾；酒精依赖和尿失禁。
与钙(Ca2+)离子通道功能障碍有关的其它病况的实例包括(但不限于)恶性高热 症、中央轴突症(central core disease)、儿茶酚胺多形性室速(cathecolaminergic polymorphic ventricular tachycardia)和2型致心律失常性右心室心肌病(ARVD-2)。可 使用本发明方法治疗的神经病症的实例包括：阿兹海默氏病；亨廷顿氏病(Huntington′s disease)；脊髓损伤；外伤性脑损伤；路易体痴呆(Lewy body dementia)；皮克氏病(Pick′s disease)；尼曼-匹克病(Niewmann-Pick disease)；淀粉样血管病；淀粉样脑血管病；全 身性淀粉样变性病；冰岛型遗传性脑出血伴淀粉样变(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis of the Dutch type)；包涵体肌炎；轻度认知障碍；唐氏综合症(Down′s syndrome)；和神经肌肉病症，包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化，和肌营养 不良，包括裘馨氏肌营养不良(Duchenne dystrophy)、贝克型肌营养不良(Becker muscular dystrophy)、面肩胛臂(兰迪二氏(Landouzy-Dejerine))肌营养不良和肢带型肌营养不 良(LGMD)。免疫亲和素配体还可用作神经保护和/或神经再生试剂，例如以便在一种 上述病况和/或损伤、中风或其它外伤发作后保留某种神经和/或神经肌肉或其它功能。
可治疗的其它心血管病症的实例包括(但不限于)充血性心力衰竭；心律失常综合 症，包括阵发性心动过速、迟后去极化、室性心动过速、猝死心动过速、运动诱发的心 律失常、长QT综合症和双向性心动过速；血栓性病症，包括动脉心血管血栓性病症、 静脉心血管血栓性病症和心室中的血栓性病症；动脉粥样硬化；再狭窄；周围动脉疾病； 冠状动脉旁路移植手术；颈动脉疾病；动脉炎；心肌炎；心血管炎症；血管炎症；冠心 病(CHD)；不稳定型心绞痛(UA)；难治性不稳定型心绞痛；稳定型心绞痛(SA)；慢 性稳定型心绞痛；急性冠状动脉综合症(ACS)；首次或复发型心肌梗塞；急性心肌梗 塞(AMI)；心肌梗塞；非Q波心肌梗塞；非STE心肌梗塞；冠状动脉疾病；缺血性心 脏病；缺血性猝死；短暂性缺血发作；中风；周围动脉闭塞病；静脉血栓；深静脉血栓 症；血栓性静脉炎；动脉栓塞；冠状动脉血栓症；脑动脉血栓症；脑栓塞；肾栓塞；肺 栓塞；由以下因素引起的血栓症：(a)人工瓣膜或其它植入物、(b)留置导管、(c)支 架、(d)心肺旁路、(e)血液透析或(f)将血液暴露于促进血栓症的人工表面的其它程 序；由动脉粥样硬化、手术或手术并发症、长期固定、动脉纤颤、先天性血栓形成体质、 癌症、糖尿病、药物或激素作用和妊娠并发症引起的血栓症；心律失常，包括室上性心 律失常、房性心律失常、房性早搏、心房纤颤；心脏病：心血管药物手册(Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine)，第2卷集，第6版，2001，尤金布朗瓦尔德 (Eugene Braunwald)，道格拉斯P.泽普斯(Douglas P.Zipes)，皮特里布(Peter Libby)， 道格拉斯D.泽普斯(Douglas D.Zipes)以及其药物制备中所列的其它疾病。
在另一实施例中，心血管疾病是选自以下一种或多种疾病：动脉粥样硬化；冠心病 (CHD)；再狭窄；周围动脉疾病；冠状动脉旁路移植手术；颈动脉疾病；动脉炎；心肌 炎；心血管炎症；血管炎症；不稳定型心绞痛(UA)；难治性不稳定型心绞痛；稳定型 心绞痛(SA)；慢性稳定型心绞痛；急性冠状动脉综合症(ACS)；心肌梗塞；或急性心 肌梗塞(AMI)，包括首次或复发型心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高心肌梗塞 和ST段抬高心肌梗塞。
免疫亲和素配体的量或剂量需求可视病况、所呈现的症状的严重程度和所治疗的特 定个体而变化。所属领域技术人员将能够容易地测定遵循本文所述的方法所需的免疫亲 和素配体的量。优选免疫亲和素配体的剂量足以形成包括所述配体、免疫亲和素或其功 能性变异体和钙通道亚基或其功能性变异体的复合物和/或使所述复合物稳定。在一些实 施例中，可遵循本发明的教示，在活体外测试所述剂量。在一个实施例中，投与约0.5 到200mg、约0.5到100mg、约0.5到约75mg。在另一实施例中，投与约1到约25mg。 在另一实施例中，投与约0.5到约10mg，尤其当与另一药剂组合使用时如此投与。在 另一实施例中，投与约2到约5mg。在另一实施例中，投与约5到约15mg。
治疗可以低于产生所需作用所需的剂量并且通常低于免疫亲和素配体的最佳剂量 的配体剂量起始。此后，可增加剂量直到在所述情况下达到最佳作用。确切剂量将由投 药医生根据由所治疗的个别个体获得的经验确定。一般说来，最适宜投与通常会提供有 效结果而不引起任何不利或有害副作用的浓度的组合物。
在某些组合物中，使用核酸拮抗剂来减少编码钙通道β亚基(例如，β1亚基)的内 源基因的表达。在一个实施例中，核酸拮抗剂为靶向编码钙通道β亚基的mRNA的 siRNA。还可使用其它类型的拮抗性核酸，例如dsRNA、核糖酶、三螺旋形成剂或反义 核酸。在一些实施例中，可将核酸拮抗剂导向钙通道β亚基的下游效应靶。
siRNA为任选包括突出端的小双链RNA(dsRNA)。举例来说，siRNA的双链区为 约18到25个核苷酸长，例如约19、20、21、22、23或24个核苷酸长。通常，siRNA 序列与靶mRNA完全互补。具体说来，可使用dsRNA和siRNA使哺乳动物细胞(例如， 人类细胞)的基因表达沉默。siRNA还包括具有29个碱基对的茎和2个核苷酸的3′突 出端的短发夹RNA(shRNA)。例如，参看克莱门斯(Clemens)等人，(2000)美国国家 科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)97：6499-6503；比利(Billy)等人，(2001)美 国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98：14428-14433；巴希尔(Elbashir)等 人，(2001)自然(Nature.)411：494-8；杨(Yang)等人，(2002)美国国家科学院院刊(Proc. Natl.Acad.Sci.USA)99：9942-9947；塞科拉斯(Siolas)等人，(2005)，自然生物技术(Nat. Biotechnol.)23(2)：227-31；20040086884；U.S.20030166282；20030143204；20040038278 和20030224432。
反义试剂可例如包括约8个到约80个核碱基(即，约8个到约80个核苷酸)，例 如约8个到约50个核碱基或约12个到约30个核碱基。反义化合物包括核糖酶、外部 引导序列(EGS)寡聚核苷酸(寡聚酶)，和与靶核酸杂交并调节其表达的其它短催化性 RNA或催化性寡聚核苷酸。反义化合物可包括与靶基因序列互补的至少8个连续核碱基 的伸长。寡聚核苷酸无需与其靶核酸序列100％互补以实现特异性杂交。当寡聚核苷酸 与靶的结合干扰靶分子的正常功能，从而引起失效，并且存在足够的互补程度以在需要 特异性结合的条件下(即，在活体内分析或治疗性治疗的情况下，在生理条件下；或在 活体外分析的情况下，在进行所述分析的条件下)避免寡聚核苷酸与非靶分子序列的非 特异性结合时，认为寡聚核苷酸可特异性杂交。
反义寡聚核苷酸与mRNA(例如，编码钙通道β亚基的mRNA)的杂交可干扰mRNA 的一种或多种正常功能。mRNA受干扰的功能包括所有关键功能，诸如所述RNA转位 到蛋白质翻译位点；由所述RNA翻译蛋白质；得到一种或多种mRNA物质的RNA剪 接；和所述RNA可能涉及的催化活性。反义寡聚核苷酸与RNA的杂交还可干扰特定蛋 白质与RNA的结合。
例示性反义化合物包括与靶核酸(例如，编码钙通道β亚基的mRNA)特异性杂交 的DNA或RNA序列。互补区可延伸约8个到约80个核碱基。所述化合物可包括一个 或多个经修饰核碱基。经修饰核碱基可例如包括5-取代的嘧啶，诸如5-碘尿嘧啶、5-碘 胞嘧啶和C5-丙炔基嘧啶(诸如C5-丙炔基胞嘧啶和C5-丙炔基尿嘧啶)。其它适当的经 修饰核碱基包括N4-(C1-C12)烷基氨基胞嘧啶和N4，N4-(C1-C12)二烷基氨基胞嘧啶。经修饰 核碱基还可包括7-取代的8-氮杂-7-去氮嘌呤和7-取代的7-去氮嘌呤，诸如7-碘-7-去氮 嘌呤、7-氰基-7-去氮嘌呤、7-氨基羰基-7-去氮嘌呤。这些核碱基的实例包括6-氨基-7- 碘-7-去氮嘌呤、6-氨基-7-氰基-7-去氮嘌呤、6-氨基-7-氨基羰基-7-去氮嘌呤、2-氨基-6- 羟基-7-碘-7-去氮嘌呤、2-氨基-6-羟基-7-氰基-7-去氮嘌呤和2-氨基-6-羟基-7-氨基羰基-7- 去氮嘌呤。此外，包括N6-甲基氨基腺嘌呤和N6，N6-二甲基氨基腺嘌呤在内的N6-(C1-C12) 烷基氨基嘌呤和N6，N6-(C1-C12)二烷基氨基嘌呤也为适当的经修饰核碱基。类似地，其它 6-取代的嘌呤(例如包括6-硫鸟嘌呤)也可构成适当的经修饰核碱基。其它适当的核碱 基包括2-硫尿嘧啶、8-溴腺嘌呤、8-溴鸟嘌呤、2-氟腺嘌呤和2-氟鸟嘌呤。任一上述经 修饰核碱基的衍生物也是适当的。任一前述化合物的取代基可包括C1-C30烷基、C2-C30 烯基、C2-C30炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、卤基、氨基、酰胺基、硝基、硫基、磺酰 基、羧基、烷氧基、烷基羰基、烷氧羰基等。
也可获得有关其它类型的核酸试剂的说明。例如，参看美国专利第4,987,071号、 第5,116,742号和第5,093,246号；伍尔夫(Woolf)等人，(1992)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)；反义RNA和DNA(Antisense RNA and DNA)，D.A.弥尔顿(D.A. Melton)编，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)(1988)；89：7305-9；汉斯霍夫(Haselhoff)和杰拉奇(Gerlach)(1988)自 然(Nature)334：585-59；海伦尼C.(Helene，C.)(1991)抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)6：569-84；海伦尼(Helene)(1992)纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.) 660：27-36；和马赫尔(Maher)(1992)生物分析(Bioassays)14：807-15。
医药组合物
一方面，本发明包括制备含有一种或多种免疫亲和素配体的医药组合物的方法。在 其它实施例中，揭示含有本文所述的复合物的医药组合物。如本文所使用，含有“一种 免疫亲和素配体”或“所述免疫亲和素配体”的组合物意欲涵盖含有一种或多种免疫亲 和素配体的组合物。所述组合物可通过若干不同途径投与哺乳动物个体，且合意地以固 体或液体形式经口投与。
可通过将免疫亲和素配体与一种或多种上述组分掺合来形成含有免疫亲和素配体 的固体形式，包括片剂、胶囊和囊片。在一个实施例中，组合物的各组分是以干法或湿 法掺合。在另一实施例中，各组分是通过干法制粒。在另一实施例中，将各组分悬浮或 溶解于液体中，并加入适于投与哺乳动物个体的形式中。
可通过将免疫亲和素配体溶解或悬浮于适于投与哺乳动物个体的液体中，来形成含 有免疫亲和素配体的液体形式。
可使用医药有效量的免疫亲和素配体来调配适于所需递送途径的任何形式的含有 免疫亲和素配体的本文所述的组合物。举例来说，可通过诸如经口、皮肤、透皮、支气 管内、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、不经肠、腹膜内、鼻内、阴道、直肠、舌下、颅 内、硬膜外、气管内等途径，或通过持续释放来递送本发明的组合物。优选经口递送。
还可使用本发明的口服剂量的片剂组合物来制造含有所属领域技术人员已知的免 疫亲和素配体衍生物(包括(但不限于)酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、醚、肟、碳酸酯等) 的口服剂量的片剂。
免疫亲和素配体的医药有效量可视特定化合物、递送模式、所治疗的病况的严重程 度和组合物中所用的任何其它活性成分而变化。还可调整给药方案以提供最佳治疗反 应。可每日递送若干分次剂量，例如1天2到4次的分次剂量；或可递送单次剂量。然 而，如治疗情况的紧急性所指示，可按比例降低或增加剂量。在一个实施例中，递送是 基于每日、每周或每月。在另一实施例中，递送是基于每日递送。然而，可在定期递送 的基础上降低或增大每日剂量。
可将免疫亲和素配体与一种或多种医药学上可接受的载剂或赋形剂组合，所述载剂 或赋形剂包括(不限于)与本发明的组合物可相容的固体和液体载剂。所述载剂包括佐 剂、糖浆、酏剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、制粒剂、崩解剂、软化剂、 金属螯合剂、pH值调节剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂和其组合等。在一个实施例 中，将免疫亲和素配体与金属螯合剂、pH值调节剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、 润滑剂和粘合剂组合。佐剂可包括(不限于)调味剂、着色剂、防腐剂和补充抗氧化剂， 所述抗氧化剂可包括维生素E、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)和丁基化羟基苯甲 醚(BHA)。
粘合剂可包括(不限于)纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、 羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、微晶纤维素、非晶 体纤维素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(povidone)，PVP)、明胶、阿 拉伯胶(gum arabic和acacia)、聚乙二醇、淀粉、糖(诸如蔗糖、高岭土、右旋糖和乳 糖)、胆固醇、黄芪胶、硬脂酸、明胶、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、 鲸蜡酯蜡、糖酐酯(dextrate)、糊精、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸 甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇和明 胶等。在一个实施例中，粘合剂为聚维酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素或明胶。 在另一实施例中，所述粘合剂为聚维酮。
润滑剂可包括硬脂酸镁、轻质无水硅酸、滑石、硬脂酸、月桂基硫酸钠和硬脂酰富 马酸钠等。在一个实施例中，润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸或硬脂酰富马酸钠。在另一实 施例中，润滑剂为硬脂酸镁。
制粒剂可包括(不限于)二氧化硅、微晶纤维素、淀粉、碳酸钙、果胶、交联聚维 酮(crospovidone和polyplasdone)等。
崩解剂可包括交联羧甲基纤维素钠、淀粉、羧甲基纤维素、经取代羟丙基纤维素、 碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉或交联聚维酮等。在一个实 施例中，崩解剂为交联羧甲基纤维素钠。
软化剂可包括(不限于)硬脂醇、貂油、鲸蜡醇、油醇、月桂酸异丙酯、聚乙二醇、 橄榄油、凡士林、棕榈酸、油酸和肉豆蔻酸肉豆蔻酯。
表面活性剂可包括聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)或月桂基 硫酸钠。在一个实施例中，表面活性剂为月桂基硫酸钠。
金属螯合剂可包括生理学上可接受的螯合剂，包括依地酸(edetic acid)、苹果酸或 富马酸。在一个实施例中，金属螯合剂为依地酸。
还可利用pH值调节剂将含有免疫亲和素配体的溶液的pH值调整到约4到约6。在 一个实施例中，将含有免疫亲和素配体的溶液的pH值调整到约pH 4.6。pH值调节剂可 包括生理学上可接受的试剂，包括柠檬酸、抗坏血酸、富马酸或苹果酸和其盐。在一个 实施例中，pH值调节剂为柠檬酸。
可根据本发明使用的填充剂包括无水乳糖、微晶纤维素、甘露糖醇、磷酸钙、预胶 化淀粉或蔗糖。在一个实施例中，填充剂为无水乳糖。在另一实施例中，填充剂为微晶 纤维素。
在一个实施例中，通过片剂、囊片或胶囊、微胶囊、可分散散剂、颗粒剂、悬浮液、 糖浆、酏剂和气雾剂经口递送含有免疫亲和素配体的组合物。合意地，当经口递送含有 免疫亲和素的组合物时，通过片剂和硬质或液体填充胶囊来进行递送。在另一实施例中， 可经静脉内、肌肉内、皮下、不经肠和腹膜内递送无菌可注射溶液、悬浮液、分散液和 可流动以致易于注射的散剂形式的含有免疫亲和素配体的组合物。所述可注射组合物在 制造和储存条件下为无菌且稳定的，并且不具有诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。 在另一实施例中，可经直肠递送常规栓剂形式的含有免疫亲和素配体的组合物。在另一 实施例中，可经阴道内递送常规栓剂、乳膏、凝胶、环或经涂布宫内节育器(IUD)形 式的含有免疫亲和素配体的组合物。
在另一实施例中，可经由涂布或浸渍支撑结构(即，能够支撑医药学上可接受的载 剂或赋形剂且含有本发明化合物的框架，例如用于脉管系统中的血管支架或分流管、冠 状动脉支架、周围血管支架、导管、动-静脉移植物、旁路移植物和药物递送球囊)来递 送含有免疫亲和素配体的组合物。在一个实施例中，适于使用的涂层包括(但不限于) 聚合物涂层，其由实质上溶解本发明化合物的任何聚合材料构成。所属领域技术人员已 知支撑结构和涂布或浸渍方法，例如美国专利第6,890,546号中所述的支撑结构和方法， 且其并不限制本发明。
在另一实施例中，可经鼻内或支气管内递送气雾剂形式的含有免疫亲和素配体的组 合物。
这些游离碱或医药学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液或悬浮液是在适当混 有诸如羟丙基纤维素等表面活性剂的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇和其于油中 的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物 生长。
适于注射使用的医药形式包括无菌水溶液或水性分散液，以及供即时制备无菌可注 射溶液或分散液的无菌散剂。在所有情况下，所述形式都为无菌的且可流动以致易于注 射。其在制造和储存条件下稳定，并能防止诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。载剂 为例如含有水、乙醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适当混合物和植物油 的溶剂或分散介质。
本发明还提供含有免疫亲和素配体的试剂盒或包装。本发明的试剂盒可包括所述配 体和如上文所论述的适于投与哺乳动物个体的载剂。所述试剂盒还可含有制备免疫亲和 素配体所需的试剂。包含复合物、其组分和/或试剂和使用说明的试剂盒也在本发明的范 围内。
提供以下实例以说明本发明，且所述实例并不限制本发明的范围。所属领域技术人 员将了解，尽管以下实例中对特定试剂和条件进行略述，但仍可进行意欲涵盖在本发明 的精神和范围内的修改。
实例1.雷帕霉素I和II的合成
FK506和雷帕霉素与其个别蛋白质靶的复合物产生免疫抑制活性，这在慢性神经变 性治疗过程中是不合需要的(兰姆(Lam)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270， 26511-22(1995))。因此，为了研发非免疫抑制性免疫亲和素配体，由雷帕霉素与亚硝基 苯在C1，C3二烯处发生[4+2]环加成，以便在存留完整FKBP结合部分的同时破坏与 mTOR的相互作用(如下文较为详细地描述)，从而来制备雷帕霉素类似物I和II(图 1A)。
雷帕霉素类似物I的合成
化学试剂都购自西格玛-阿德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St. Louis，MO，USA))。
在缓慢加热下，将雷帕霉素(0.3g，0.328mmol)溶解于5mL甲苯中。向此溶液 中逐滴加入亚硝基苯(0.1g，3eq)于5mL甲苯中的溶液。在70℃下，将反应混合物 搅拌16小时，且随后经由反相高效液相色谱(HPLC)(柱：250×20mm YMC ODS-A， 具有50×20的保护装置；流动相：80％到85％甲醇∶水，持续40分钟，流速＝20mL/min) 色谱分离产物，得到0.139g产物(42％产率，tR＝12.1min，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-AS-3 120埃，流动相/梯度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)到5％ 水，持续6分钟，在5％下保持9分钟，流速＝0.30mL/min)。1H-NMR(500MHz，CD3CN)： δ7.29(m，2H，H57)，7.02(m，2H，H56)，6.90(m，1H，H58)，6.25(m，1H，H2)，5.65(m，1H， H3)，5.25(m，1H，H29)，5.16(m，1H，H5)，5.12(m，1H，H25)，5.07(m，1H，H4)，4.37(m，1H， H22)，4.09(m，1H，H31)，3.95(m，1H，H32)，3.74(m，1H，H9)，3.69(m，1H，H1)，3.59(m， 1H，31-OH)，3.44(m，1H，H28)，3.44(m，1H，H28)，3.33(s，3H，Me54)，3.29(m，3H，Me53)， 3.27(m，1H，H42)，3.07(m，1H，H34)，3.06(s，3H，Me52)，2.94(m，1H，H18)，2.86(m，1H， H41)，2.84(m，1H，H26)，2.64(m，1H，H26′)，2.14(m，1H，H21)，2.09(m，1H，H12)，2.05(m， 1H，H40)，2.01(m，1H，H36)，.2.00(m，1H，H35)，1.87(m，1H，H37)，1.85(m，1H，H43)， 1.81(m，1H，H21′)，1.78(s，3H，Me48)，1.74(m，1H，H19)，1.74(m，1H，H20)，1.69(m，1H， H8)，1.64(m，1H，H44)，1.63(m，1H，H8′)，1.60(m，1H，H11)，1.55(m，1H，H44′)，1.51(s， 3H，Me45)，1.43(m，2H，H10)，1.42(m，1H，H19′)，1-39(m，1H，H20′)，1.37(m，1H，H39)， 1.27(m，1H，H38)，1.12(d，3H，Me50)，1.06(d，3H，Me47)，1.04(m，1H，H38′)，1.03(d，3H， Me49)，0.89(d，3H，Me51)，0.83(d，3H，Me46)，0.63(m，1H，H40′)；13C-NMR(125MHz， CD3CN)：δ215.4(s，C33)，209.5(s，C27)，198.5(s，C15)，170.6(s，C23)，166.4(s，C16)， 149.2(s，C55)，139.9(s，C6)，138.7(s，C30)，130.0(d，C57)，128.0(d，C3)，127.9(d，C29)， 127.2(d，C5)，127.0(d，C2)，121.5(d，C58)，116.1(d，C56)，99.5(s，C13)，87.3(d，C32)， 85.2(d，C41)，84.8(d，C7)，78.2(d，C31)，77.0(d，C25)，74.5(d，C42)，68.4(d，C4)，68.3(d， C9)，60.3(d，CI)，58.6(q，C53)，57.4(d，C22)，56.9(q，C54)，56.1(q，C52)，46.9(d，C28)， 42.8(d，C34)，41.7(t，C26)，39.5(t，C18)，39.5(t，C8)，38.6(t，C35)，38.5(t，C38)，37.5(d， C36)，35.6(d，C12)，35.3(t，C40)，33.9(d，C37)，33.8(d，C39)，32.9(t，C43)，32.2(t，CIO)， 32.2(t，C44)，28.2(t，C21)，27.7(t，C11)，25.1(t，C19)，21.6(t，C20)，18.5(q，C50)，18.0(q， C49)，16.7(q，C51)，16.3(q，C46)，16.0(q，C47)，12.4(q，C48)，10.8(q，C45)；FT-ICRMS (m/z)：[M+H]+ C57H85N2O14的计算值：1021.59954；实验值：1021.59780。
雷帕霉素类似物II的合成
在18mm试管中，将雷帕霉素类似物I(0.29g，0.284mmol)溶解于7mL甲醇中， 并加入一勺尖的Pd/C催化剂(阿德里奇公司(Aldrich))。在2.0个大气压的H2下，在 帕尔设备上将混合物氢化15分钟。经由反相HPLC(柱：250×20mm YMC ODS-A， 具有50×20的保护装置；流动相：80％甲醇∶水，持续15分钟，随后达到85％持续5分 钟，随后在85％下保持20分钟，流速＝20mL/min)色谱分离产物，得到0.089g产物 (31％产率，tR＝12.6min，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-AS-3120埃，流动相/梯 度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)到5％水，持续6分钟，在5％下保 持9分钟，流速＝0.30mL/min)。1H-NMR(500MHz，CD3CN)：.δ7.25(m，2H，H57)，6.91(m， 2H，H56)，6.79(m，1H，H58)，5.44(m，1H，H29)，5.35(m，1H，H5)，5.24(m，1H，H25)，5.11 (m，1H，H22)，4.50(m，1H，H4)，4.42(m，1H，13-OH)，4.00(m，1H，H31)，3.80(m，1H，H9)， 3.77(m，1H，H32)，3.67(m，1H，H7)，3.57(m，1H，31-OH)，3.43(m，1H，H28)，3.35(m，1H， H18)，3.35(s，3H，Me54)，3.34(m，1H，H1)，3.32(m，1H，H18′)，3.32(s，3H，Me53)，3.27(m， 1H，H42)，3.16(m，1H，H34)，3.08(s，3H，Me52)，3.00(m，1H，42-OH)，2.87(m，1H，H41)， 2.79(m，1H，H26)，2.71.(m，1H，H26′)，2.29(m，1H，H21)，2.18(m，1H，H36)，2.10(m，1H， H40)，1.95(m，1H，H35)，1.95(m，1H，H37)，1.86(m，1H，H43)，1.85(m，1H，H2)，1.85(m， 1H，H3)，1.82(m，1H，H12)，1.79(m，1H，H2′)，1.77(m，1H，H20)，1.71(m，1H，H8)，1.69 (m，1H，H19)，1.68(m，1H，H21′)，1.66(s，3H，Me48)，1.64(m，1H，H44)，1.63(m，1H，H8′)， 1.61(m，1H，H10)，1.60(m，2H，H11)，1.50(m，1H，Me45)，1.46(m，1H，H3′)，1.43(m，1H， H19′)，1.39(m，1H，H20)，1.39(m，1H，H39)，1.35(m，1H，H10′)，1.29(m，1H，H38)，1.26 (m，1H，H43′)，1.13(d，3H，Me47)，1.12(m，1H，H38′)，1.07(d，3H，Me49)，1.03(m，1H， H35′)，1.03(d，3H，Me46)，1.00(m，1H，H44′)，0.97(d，3H，Me50)，0.91(d，3H，Me51)，0.66 (m，1H，H40′)；13C-NMR(125MHz，CD3CN)：δ216.1(s，C33)，210.3(s，C27)，198.3(s，C15)， 170.3(s，C23)，168.3(s，C16)，149.9(s，C55)，139.9(s，C30)，139.4(s，C6)，130.2(d，C57)， 129.4(d，C5)，128.1(d，C29)，119.7(d，C58)，114.2(d，C56)，98.4(s，C13)，88.5(d，C32)， 85.4(d，C41)，85.0(d，C7)，77.7(d，C31)，76.3(d，C25)，74.8(d，C42)，72.3(d，C4)，68.5(d， C9)，60.0(d，C1)，59.2(q，C53)，57.1(q，C54)，56.0(q，C52)，52.0(d，C22)，46.5(d，C28)， 45.1(t，C18)，42.7(d，C34)，42.1(t，C26)，40.8(t，C35)，39.1(t，C38)，38.3(t，C8)，35.7(t， C40)，35.0(d，C12)，34.3(d，C37)，34.1(d，C39)，33.1(t，C43)，32.5(t，C44)，32.1(t，CIO)， 32.0(d，C36)，29.1(t，C11)，28.0(t，C21)，26.8(t，C3)，25.9(t，C19)，21.7(t，C20)，20.6(t， C2)，19.0(q，C49)，17.5(q，C47)，17.4(q，C50)，16.8(q，C46)，16.4(q，C51)，13.1(q，C48)， 10.4(q，C45)；FT-ICRMS(m/z)：[M+H]+ C57H87N2O14的计算值：1023.61519；实验值： 1023.61722。
雷帕霉素类似物I和II的生物活性
方法
神经突起生长的测量
使用2％多聚甲醛将皮层神经元固定5分钟，随后使用4％多聚甲醛固定5分钟。在 阻断溶液(PBS中的0.2％曲通-X(Triton-X)+1.5％正常山羊血清)中培育细胞，随后 加入初级抗体(抗神经元III类β微管蛋白)(TUJ1)(科文斯革新抗体公司(Covance Innovative Antibodies)，加利福尼亚州伯克利(Berkeley，CA))和二级抗体(Alexa Fluor 488山羊抗小鼠)(分子探针公司(Molecular Probes)，加利福尼亚州卡尔斯巴(Carlsbad， CA))。各步骤都在室温下进行1小时。在埃雷斯肯HCS读取器(ArrayScan HCS Reader) (赛罗米公司(Cellomics)，宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh，PA))上，使用神经元细 胞压型生物分析软件(Neuronal Profiling Bioapplication)来分析各条件下的总神经突起 生长。
神经元存活分析(神经丝蛋白ELISA)
在37℃下，将培养物用4％多聚甲醛固定30分钟。通过用含有0.3％曲通X-100和 5％胎牛血清(FBS)的PBS培育45分钟来阻断非特异性结合。随后，在4℃下将培养 物与抗神经丝蛋白(200kD)单克隆抗体(1∶1000，克隆RT-97，嘉美功公司(Chemicon)， 加利福尼亚州特曼库拉(Temecula，CA))一起培育整夜。洗涤后，施用过氧化酶连结的 二级抗体(1∶1000，维特莱布公司(Vector Labs)，加利福尼亚州伯林格姆(Burlingame， CA))并保持2小时。三次洗涤后，将过氧化酶底物K-BlueMax(尼奥公司(Neogen)， 肯塔基州勒辛顿(Lexington，KY)；杨(Young)等人，1999)加入培养物中，并在回转 式振荡器上培育10分钟。过氧化酶底物极易溶于K-BlueMax溶液中。随后，易于使用 美国分子仪器公司(Molecular Devices)的Spectramax Plus比色板读取器在650nm下测 量光学密度。
免疫抑制分析
通过使用RosetteSep，根据制造商的说明(干细胞技术有限公司(StemCell Technologies，Inc.)，英属哥伦比亚温哥华市(Vancouver，British Columbia)))进行负选 择而从周围血淋巴细胞纯化人CD4+T细胞。如布莱尔(Blair)等人，免疫学杂志(J. Immunol.)，160：12，1998中所述，用抗CD3Ab(1μg/107个微球)和抗CD28Ab(0.5μg/107 个微球)涂布甲苯磺酰基活化的磁性微球(戴诺公司(Dynal)，纽约长岛(Great Neck， NY))。使用鼠科IgG使微球的结合能力达到饱和(总蛋白质＝5μg/107个微球)。将涂有 蛋白质的微球加入纯CD4+T细胞(2×106个细胞/毫升，比率：1个珠粒∶1个细胞)中， 并在RPMI、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺培养基中活化72小时。采集细胞，洗涤并 在新鲜培养基中培养整夜，并如本纳特(Bennett)等人，免疫学杂志(J.Immunol.) 170：711，2003中所述，用IL-2进行再刺激。简单说来，对整夜静止的细胞进行重新计数， 将其涂于(105个细胞/孔)平底96孔微量滴定盘上，并在存在增加浓度的化合物的情况 下，用1ng/mL人IL-2(安迪生物科技公司(R&D Systems)，明尼苏达州明尼阿波利斯 (Minneapolis，MN))进行刺激。在培养物再刺激后72小时，用每孔1μCi氚化的胸苷对 板进行脉冲标记，并培育6-16小时的时期。
结论
如上文所述，由雷帕霉素与亚硝基苯在C1，C3二烯处发生[4+2]环加成，以便在存留 完整的化合物FKBP结合部分的同时破坏与mTOR的相互作用，从而制备雷帕霉素类似 物I和II(图1A)。与雷帕霉素(IC50＝0.005μM)相比，化合物II在达到1μM时也未 检测到对于IL-2刺激的CD4+T细胞增殖的抑制。此外，已发现，如通过神经丝蛋白 ELISA所测量，化合物I在所培养的大鼠皮层神经元中能促进神经元存活(图1B)，并 且在皮层神经元(图1C)和F-11细胞(图1D)中都能促进神经突起生长。重要的是， 在缺血性中风的瞬时中脑动脉闭塞模型中，10mg/kg和30mg/kg的化合物2分别使梗塞 体积明显降低24％和23％(参看US 06/0135549的实例9)。已知这些化合物的治疗潜力， 故鉴别这些化合物的细胞靶以评估其在促进神经元存活和神经突起生长方面的作用。
实例2.亲和基质的化学合成和制备
为鉴别靶蛋白，根据傅雷兹(Fretz)等人(同上文)所公开的方法，通过使雷帕霉 素类似物I、雷帕霉素类似物II和美立霉素类似物经由氨基-苯基-丁酸与亲和凝胶10树 脂连接来制备含有所述化合物的亲和基质(图2)。简单说来，通过在室温下用二噁烷∶ 水(3∶1，50ml)中的二碳酸二烯丙酯(1200μM)处理3小时而用烯丙基氧基羰基保护 氨基-苯基-丁酸(1200mg)的氨基。在4℃下，用CH2Cl2(1ml)中的PhOP(O)Cl2DMF 复合物活化所得4-(对N-Alloc-氨基苯基)丁酯(80mg)的酸基，并在室温下，在存在吡 啶(90μM)的情况下，使所述酸基与雷帕霉素类似物I(80mg)的42-羟基反应30分 钟。用甲醇中止反应，并通过HPLC纯化酯产物(纯度为99％)，且通过MS和NMR加 以表征。通过用THF(1.2ml)中的Pd(PPh3)4(2mg)和双甲酮(7mg)处理来去除酯 产物(40mg)的烯丙基氧基羰基，随后在存在THF中的2％吡啶的情况下，使产物的 氨基与亲和凝胶-10基质(4ml)连接。用乙醇、水和乙醇胺50mM Hepes(pH 8.0)缓 冲液洗涤所得亲和凝胶-雷帕霉素类似物I亲和基质，并将其储存于40％乙醇中。
使用类似方法来制备含有雷帕霉素类似物II、美立霉素类似物(U.S.2005/0197379 中作为化合物I揭示)、FK506和雷帕霉素的亲和基质。
实例3.靶蛋白的亲和沉淀
使用实例2中所制备的基质，从F-11(大鼠背根神经节神经元(DRG)与小鼠神经 母细胞瘤的杂合物)细胞沉淀出靶蛋白(普拉提卡D.(Platika，D.)等人，(1985)美国国 家科学院院干(Proc.Natl.Acad.Sci USA)82：3499-3503)。
实验A
在具有5％CO2的37℃恒温箱中，使F11细胞在75cm2透气培养瓶中补充有10％ FBS和1％pen/Strep的DMEM培养基中生长。当80％汇合时，采集细胞，并用PBS缓 冲液洗涤。将溶解缓冲液(6ml；50mM Tris(pH 7.4)、250mM NaCl、5mM EDTA、 50mM NaF、1mM Na3VO4、1％诺纳德P40(NP40)、0.1％巯基乙醇和2％蛋白酶抑制剂 混合物)加入109个细胞中。通过迫使细胞通过26号针使其破裂，并且在4℃下离心15 min，随后收集S-100上清液。在4℃下，将等分试样(2ml)与亲和珠粒(100-150μl； 诸如亲和凝胶10、亲和凝胶10-FK506和亲和凝胶10-雷帕霉素类似物I)混合整夜。用 溶解缓冲液(2ml)且随后用PBS(2ml)洗涤后，在4-20％SDS-PAGE凝胶上对珠粒 进行分析。图2展示以下泳道：F11细胞溶解产物、空白(蛋白质与亲和凝胶-10珠粒结 合)、FK506(蛋白质与亲和凝胶-10-FK506珠粒结合)、雷帕霉素类似物II(蛋白质与 亲和凝胶-10-雷帕霉素类似物I珠粒结合)、标记(蛋白质标准品)。切下蛋白质谱带(图 3)且在30℃下，用消化缓冲液(30μl；0.2％NH4HCO3)中的胰蛋白酶(0.3μg)消化 整夜。在C18树脂上纯化所得肽，并提交用于FT-ICR-MS分析。手动编辑FT-ICR-MS 数据并用于搜索蛋白质数据库。结果展示于图4中并具有以下得分。FK506结合蛋白 (FKBP52)(P30416，得分：94，期望值：9.6e-05)；59kDa谱带的MS数据：2753.35；1710.94； 2215.13；2363.15；1298.71；1215.59；1000.51；1000.46；1790.93；1381.70；2746.36；1316.71； 和1171.60。电压依赖性L型钙通道β亚基(Q8R3Z5-03-00-00，得分：133，期望值： 1e-09)；52kDa谱带的MS数据：651.38；663.39；779.54；853.55；1014.50；1347.75；1217.78； 1346.67；1297.75；1231.77；877.52；853.47；919.48；1014.56；1041.63；1217.74；1231.74； 1296.84；869.58(主要)。
使约60kDa谱带的13个片段与FKBP52蛋白的部分序列匹配，其中p值为9.6e-5； 并使约50kDa谱带的19个片段与电压门控L型钙通道的β1亚基(CACB1)的部分序 列匹配。其它极少量组分为骨架蛋白(肌动蛋白和肌球蛋白)。因此，鉴别出免疫亲和 素FKBP52和CACB1为雷帕霉素类似物I的结合候选物。
实验B
在另一实验中，在具有5％CO2的37℃恒温箱中，使F11细胞在75cm2透气培养瓶 中补充有10％FBS和1％pen/Strep的DMEM培养基中生长。当80％汇合时，采集细胞， 并用PBS缓冲液洗涤。向3×108个细胞中加入溶解缓冲液(2ml；50mM Tris(pH 7.4)、 250mM NaCl、5mM EDTA、50mM NaF、1mM Na3VO4、1％诺纳德P40、0.1％巯基乙 醇和2％蛋白酶抑制剂混合物)，并在4℃下离心15分钟，随后收集其S-100上清液。在 4℃下，将等分试样(2ml)与亲和珠粒(100-150μl)一起培育。用溶解缓冲液(2ml) 且随后用PBS缓冲液(2ml)洗涤后，通过SDS-PAGE对珠粒进行分析。切下蛋白质谱 带(图3)且在30℃下，用消化缓冲液(30μl；0.2％NH4HCO3)中的胰蛋白酶(0.3μg) 消化。将所得肽(2μl)装载到FT-ICR-MS的纳米电喷雾针尖中，并与甲醇(2μl)中 的1％甲酸混合。在纳米电喷雾针尖与玻璃毛细管之间施加约-800V的高电压。使用HP Tuning Mix对所得质谱数据进行外部校准，并将其用于NCBI蛋白质数据库中的Mascot 搜索。根据置信度(p值)选择合理的蛋白质候选物。对于蛋白质免疫印迹分析，通过 SDS-PAGE分离出沉淀的蛋白质，通过电印迹(100V，1hr)将其转印到PVDF膜上， 用抗CACNB1或抗FKBP4抗体进行免疫印迹，并通过3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB) 染色使其显现。
结论
如图5A所示，在雷帕霉素类似物I和II的下拉部分中都发现三个强谱带(220kDa、 60kDa和50kDa)和两个极弱谱带(25kDa和12kDa)。使用各谱带的FT-ICR-MS谱 来进行NCBI数据库的Mascot搜索(参看下表1)。FKBP52(古德B.G.(Gold，B.G.)药 物代谢研究(Drug Metab.Rev.)31，649-663(1999))和电压门控L型钙通道(VGCC) 的β1亚基(CACNB1)(奥帕托瓦斯基Y.(Opatowsky Y.)等人，神经元(Neuron)42， 387-399(2004))。电压依赖性钙通道β亚基功能核心和其与α1相互作用结构域的复合物 的结构分析已鉴别作为雷帕霉素类似物I和II的主要靶，并通过蛋白质免疫印迹确定其 存在(图5B)。在弱谱带中鉴别出FKBP25和FKBP12，而在所有部分中都发现肌球蛋 白和肌动蛋白，这表明其与树脂非特异性结合。
表1.结合雷帕霉素类似物I和II的蛋白质的FT-ICR-MS分析
MS数据 鉴别出的蛋白质 2753.35，1710.94，2215.13，2363.15，1298.71，1215.59，1000.51， 1000.46，1790.93，1381.70，2746.36，1316.71，1171.60 主要谱带，59kDa FKBP52，P＝1e-09 651.38，663.39，779.54，853.55，1014.50，1347.75，869.58(主要)，877.52， 853.47，919.48，1014.56，1041.63，1217.74，1231.74，1296.84，1346.67 主要谱带，52kDa CACNB1，P＝1e-09 616.32，701.42，802.42，888.15，908.97，980.48，1010.56，1132.55， 1405.67，1424.71，1611.90，1764.81，2328.12，2366.15，2342.22， 2365.15，2442.22，2458.17，2493.20，2525.20，3101.49，3277.66， 3235.66，3275.65， 次要谱带(＜5％)， 25kDa， FKBP25，P＝ 3.8e-12 739.47，881.58，1190.68，1314.66，1011.69，1533.69，903.6 次要谱带(＜5％)， 12kDa， FKBP12，P＝0.03
实例4.通过蛋白质免疫印迹和动力学分析表征沉淀的靶
方法
克隆和表达重组基因以及结合分析
使用英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴(Carlsbad，CA))所开发的通 路克隆方法(Gateway cloning method)，将cacnb4/CACNB4、fkbp3/FKBP25、 fkbp4/FKBP52、ppid、ppif和fkbp8/FKBP38基因克隆到pDEST17(N-His6标签)载体中。 由pDEST17-CACNB1使用QuikChange定点突变诱发试剂盒(吉泰公司(Stratagene)， 加利福尼亚州拉霍亚(LaJolla，CA))产生His6-CACNB1：TGG548TAA。在Ni-NTA柱(凯 杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia，CA))上纯化His6标记的蛋白质。 通过SDS-PAGE分析，蛋白质展现高于95％的纯度，并新鲜使用所述蛋白质。在存在2 mM Ca2+和5μM CaM的情况下测试FKBP38(阿尔德里奇F.(Edlich，F.)等人，生物化 学杂志(J.Biol.Chem.)281，14961-14970(2006))。通过SDS-PAGE，根据与空白亲和 凝胶10珠粒相比较，保留在雷帕霉素类似物II基质上的蛋白质的量来测量与雷帕霉素 类似物II的结合。在使各纯化蛋白质(10μM)与[14C]-雷帕霉素类似物I(10μM， 241Ci/mol)在37℃下反应后，通过定量经由TopTip P-4柱与所述蛋白质共洗脱的14C 放射性来测量与雷帕霉素类似物I的结合。通过用雷帕霉素类似物I(1μM)滴定 His6-CACNB1：TGG548TAA蛋白(0-8μM)来测量雷帕霉素类似物I所诱导的蛋白质荧 光淬灭。
动力学分析
通过测定0.1ml含有50mM Hepes(pH 7.4)、0.1％Tween-20、(0-10μM)免疫亲 和素配体、3nM[3H]-FK506(87Ci/mmol)和(5nM)酶的反应混合物中保留在螯合 Ni的FLASH板上的3H FK506的量，来测量免疫亲和素配体与His6标记的FKBP12和 FKBP52蛋白的结合。在25℃下，一式三份进行反应达30分钟。使用卡列拉斯(Carreras) (分析生物化学(Anal.Biochem.)298，57-61(2001))所描述的方法计算Kd。
以下在本文所述实例中所用的材料是从以下市售来源获得：抗体是来自艾宾公司 (Abeam)(马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA))。培养基、人ORF克隆(cacnb1、cacnb4、 fkbp3、fkbp4、fkbp8、ppiF和ppiD)、质粒(pDEST17)和系统都来自 英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴(Carlsbad，CA))。蛋白质纯化试剂盒来自皮尔斯公 司(Pieres)(伊利诺斯州洛克夫(Rockford，IL))或凯杰公司(Qiagen)(加利福尼亚州 瓦伦西亚(Valencia，CA))。TOPTip P-4柱来自格莱金公司(Glygen)(马里兰州哥伦比 亚(Columbia，MD))。螯合Ni的Flash板和[3H]-FK506来自珀金爱尔默生命科学公司 (PerkinElmer Life Science)(马萨诸塞州波士顿(Boston，MA))。PCR试剂和亲和凝胶 10来自伯乐公司(BioRad)(加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules，CA))。大鼠基因组 2302.0来自(加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara，CA))。 FT-ICR-MS分析是在布鲁克公司(Bruker)(马萨诸塞州毕莱卡(Billerica，MA))的装 备有主动防护9.4特斯拉超导磁体(actively shielded 9.4 Tesla superconducting magnet) (英国麦吉克科技有限公司(Magnex Scientific Ltd.，UK))和外部布鲁克APOLLO ESI 源的APEXII FT-ICR质谱仪上进行。
结论
表2展示FK506和雷帕霉素以可相当的亲和力与FKBP12和FKBP52结合 (Kd(FKBP12)/Kd(FKBP52)分别为0.46和0.23)。相比之下，与FKBP12相比，化合物2 展示明显优选与FKBP52结合(Kd(FKBP12)/Kd(FKBP52)＝229)。由于化合物2具有与 雷帕霉素相同的供FKBP结合的甲基哌啶部分，并且修饰位点在远端，故这是出乎意料 的。X射线结构已展示，FKBP52和FKBP12的异构酶结构域极为类似(吴(Wu)等人， 美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)101，8348-53(2004))，并且其活性位点 残基的序列比对展示仅一个氨基酸的差异(FKBP12中的His87相对于FKBP52中的 Ser118)(道南(Dornan)等人，医药化学当前论题(Curr.Top.Med.Chem.)3，1392-1409 (2003))。已知雷帕霉素和其类似物因关于酰胺键旋转而以一组主要和次要的分解构象体 形式存在(凯斯勒(Kessler)等人，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)76，117-130(1993))。 另一部分NO-苯基部分影响大环内酯构象体的总群体，而所述群体又影响免疫亲和素选 择性。这一观察似乎与化合物2对不同但同源的免疫亲和素的结合亲和力存在明显差异 相一致，似乎与所报导的雷帕霉素与FK506之间关于FKBP25的结合亲和力的明显差异 相符(盖勒特(Galat)等人，生物技术(Biochemistry)31，2427-2434(1992))。这展示 增强与特定FKBP结合的雷帕霉素的非骨架修饰。
为进一步验证化合物对免疫亲和素和相关亲环素的特异性，已测量化合物1和化合 物2与经纯化的重组FKBP25、FKBP38、亲环素F(PPID)、亲环素D(PPIF)的结合。 这些靶是根据化合物2的活体内活性(见下页)进行选择，因为据报导，这些靶在中风 模型中极为重要(阿尔德里奇(Edlich)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)281， 14961-14970(2006)；拜尼斯(Baines)等人，自然(Nature)434，658-662(2005)；阿 尔德里奇(Edlich)等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)24，2688-2699(2005))。[14C]-1 与各种推定的靶的结合结果展示于图5C中。在10μM浓度下，[14C]-1与FKBP结合良 好，与PPID结合较弱，并且与PPIF和FKBP38/Ca2+/CaM的结合可忽略不计。化合物2 还以类似的选择性概况结合FKBP52、FKBP25和FKBP12(图5D，表2)。
表2.免疫亲和素配体与FKBP12和FKBP52的结合
化合物 FKBP 12(Kd，nM) FKBP 52(Kd，nM) FK506 0.33±0.03(Lit.0.430) 0.72±0.07 雷帕霉素类似物II 110±11 0.48±0.04 雷帕霉素类似物I 4.7±0.4 0.55±0.05 雷帕霉素 0.33±0.03 1.4±0.1 GPI-1046 ＞110 ＞12
利用亲和纯化鉴别其它主要结合蛋白并通过蛋白质免疫印迹分析来证实(图6A)， CACNB1为一种与原代神经元中L型Ca2+通道相关的β亚基。为进一步验证这一作为化 合物1和2的结合搭配物的特定亚基，测定化合物与VGCC β4亚基(CACNB4)和C 末端截短的CACNB1的结合(图6B)。通过从CACNB1去除51个C末端残基，制备得 到重组His6-CACNB1：TGG548TAA蛋白。由于全长CACNB4的序列与CACNB1同源， 故也测试与全长CACNB4的结合(奥帕托瓦斯基Y.(Opatowsky，Y.)等人，神经元 (Neuron)42，387-399(2004))。在10μM浓度下，[14C]-化合物1与突变 His6-CACNB1：TGG548TAA结合较弱，且与CACNB4的结合可忽略不计。为进一步确认 化合物1与His6-CACNB1：TGG548TAA突变体的结合，测量由化合物1所诱导的蛋白质 荧光淬灭。图6C展示线性剂量反应曲线，表明化合物1与CACNB1结合。化合物2还 以类似选择性概况结合CACNB1(图6D)
也使用相应抗体，通过蛋白质免疫印迹来确认雷帕霉素类似物I的药物靶或结合候 选物(免疫亲和素FKBP52和CACB1)的存在。通过4-20％SDS-PAGE凝胶来分离亲 和珠粒上的蛋白质，并在100V下将其转印到PVDF膜上并保持1小时。利用阻断溶液、 初级抗体(抗FKBP52或抗Ca2+通道β1亚基抗体；1∶200稀释)和二级抗体(过氧化酶 连结的抗兔IgG抗体；1∶1000稀释)使膜显现印迹。如图8所示，在TMB染色后观测 靶蛋白的存在。
蛋白质免疫印迹分析证实，两种蛋白质都与雷帕霉素类似物I结合，但都不与空白 珠粒结合。在雷帕霉素类似物I珠粒和FK506珠粒部分中检测到FKBP52，但在空白珠 粒中未检测到。仅在雷帕霉素类似物I珠粒部分中检测到电压依赖性L型钙通道β1亚 基。这表明雷帕霉素类似物I特异性结合FKBP52和电压门控L型钙通道β1亚基。
实例5.新颖复合物FKBP52-雷帕霉素类似物1-Ca2+通道β1亚基的形成
使用共免疫沉淀来研究FKBP52、雷帕霉素类似物I与电压门控钙通道β1亚基的复 合物的形成。简单说来，在4℃下，将F11细胞溶解产物的等分试样(1.8ml)分别与0、 5和50μM雷帕霉素类似物I混合5小时。将抗FKBP52抗体以1∶200稀释度加入各等 分试样中，并在4℃下培育5小时。随后加入蛋白质A珠粒(50-100μM)以使缔合抗 FKBP52抗体的复合物沉淀。用PBS缓冲液洗涤珠粒上免疫沉淀的蛋白质，在4-20％ SDS-PAGE凝胶上进行分离，将其转印到PVDF中，并用抗Ca2+通道β1亚基抗体(1∶500 稀释)进行免疫印迹，以检测β1亚基。
结论
结果展现于图7中。在不存在雷帕霉素类似物I的情况下，Ca2+通道β1亚基不与 FKBP52一起沉淀，这表明Ca2+通道β1亚基不与FKBP52缔合。在存在雷帕霉素类似物 I(5μM)的情况下，大量Ca2+通道β1亚基与FKBP52共免疫沉淀，表明形成复合物。 然而，过量的雷帕霉素类似物I(50μM)会降低沉淀的β1亚基的量，表明形成较少量 的复合物，这可能是由于在有限量的溶解产物中FKBP52和β1亚基上的化合物结合位 点达到饱和所引起。
实例6.复合物形成与神经突起生长相关
使用神经丝蛋白ELISA来测量在不存在或存在雷帕霉素类似物I的情况下生长的 F11细胞的神经突起生长。简单说来，使F11细胞在不补充有10％FBS、1％pen/Strep 和雷帕霉素类似物I(0、5或50μM)的DMEM中生长96小时。在37℃下，将细胞用 4％多聚甲醛固定30分钟。通过用含有0.3％曲通X-100和5％胎牛血清(FBS)的PBS 培育45分钟来阻断非特异性结合。随后，在4℃下将培养物与抗神经丝蛋白(200kD) 单克隆抗体(1∶1000)一起培育整夜。洗涤后，施用过氧化酶连结的抗小鼠二级抗体 (1∶1000)并保持2小时。三次洗涤后，将过氧化酶底物K-BlueMax加入培养物中并培 育10分钟。在650nm下测定光学密度。
结论
结果展现于图8中。用5μM雷帕霉素类似物I处理的细胞展现比用50μM雷帕霉 素类似物I或无化合物对照处理的细胞高4-5倍的神经丝蛋白含量，表明在5μM雷帕霉 素类似物I下存在强神经突起生长。这与在存在相同浓度的雷帕霉素类似物I的情况下 的复合物形成直接相关。
实例7.在用雷帕霉素类似物处理后，F-11细胞中钙通道电生理学特性的评估
方法。全细胞膜片钳记录
使用膜片钳技术的全细胞配置，从而在室温下使用EPC-9放大器(HEKA仪器科技 公司(HEKA，Instrutech Corp.))，利用来自HEKA的采集和分析程序Pulse-PulseFit(德 国兰博瑞(Lambrecht，Germany))来记录细胞中的钙电流。电极是使用P-S7拉制器(萨 特仪器公司(Sutter Instrument))制造。当填充记录溶液(140mM CsCl、10mM EGTA、 10mM HEPES、5mM MgCl2、2M ATP、1mM cAMP，pH 7.2)时，电极的电阻为2-5MΩ。 标准的浸渍记录溶液为含有10mM HEPES、10mM右旋糖和4mM BaCl2的无Ca2+和 Mg2+的HBSS(pH 7.4)。在3kHz下过滤电流，并记录保持在-90mV下的细胞的内部 Ca2+电流，其中以10mV自-80mV去极化阶跃至60mV，历时50ms。
结论
CACNB1为一种与原代神经元中的L型Ca2+通道缔合的β1亚基(毕奇勒(Pichler) 等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，13877-13882(1997))。已知β1b、β3和β4 亚基能增强L型Ca2+通道电流，而β2亚基则起到负面作用(奥帕托瓦斯基(Opatowsky) 等人，神经元(Neuron)42，387-399(2004)；斯奇杰特(Schjott)等人，生物化学杂志 (J.Biol.Chem.)278，33936-33942(2003))。如果雷帕霉素类似物与β1亚基的结合能抑 制此亚基的功能，则预期L型Ca2+电流会降低。因此，测量在用雷帕霉素类似物1处理 后，F-11细胞中Ca2+通道的电生理学特性。
所记录的F-11细胞中的全细胞Ca2+电流不会受化合物1的短时间浸浴液应用(10 min应用；在此时间内，FK506抑制Ca2+电流)影响，因此将细胞暴露于5μM 1达2 小时，且随后将其与媒剂处理的对照相比较。此处理范例使所述细胞中所检测的Ca2+电 流明显降低，以致电流密度从6.5+/-0.5pA/pF降低到3.2+/-0.3pA/pF，降幅达49％(图 9A)。还发现，FK506对Ca2+电流产生与关于Ca2+电流的钙神经素依赖性作用所述类似 的作用(电流降低到2.9+/-0.1pA/pF，降幅达55％)(安恒(Yasutsune)等人，英国药理 学杂志(British Journal of Pharmacology)126(3)，717-729(1999)；福柯尼尔J.(Fauconnier， J.)等人，美国生理学杂志：心脏和循环生理学(Am J Physiol Heart Circ Physiol.)288， H778-H786(2005))。在与大量化合物1组合的情况下，这需要在随后的实验中借助于记 录膜片移液管将所述化合物直接加入细胞中。
从实现全细胞配置时开始(时间0)，经由扩散进入细胞中的化合物1的内部施用立 即对Ca2+电流产生抑制作用，在数分钟内达到电流阻断的稳态水平。有趣的是，化合物 在F-11中的作用是极有价值的，但作为DRG与神经母细胞瘤细胞的杂合物，已知N- 和L型Ca2+通道的表达谱随个别F-11细胞而不同(伯兰德L M.(Boland，L M.)等人，生 理学杂志(Journal of Physiology)420，223-245(1990))。如通过用BAY-K5552(L型阻 断剂)进行抑制所测定，一些细胞(图9C)主要含有L型Ca2+通道，而其它细胞(图 9D)主要含有受ωCTX MVIIA(N型阻断剂)抑制的N型通道。图9C展示在响应 BAY-K5552的细胞中，用化合物1处理能降低Ca2+电流，而图9D中说明不响应化合物 1的细胞如何含有对ωCTX MVIIA敏感的Ca2+电流。在图9C的情况下，内部施用化合 物1(10μM)能在10分钟内使Ca2+电流平均降低46+/-1.8％(图9C)。在明显响应coCTX MVIIA的细胞中未发现电流的明显降低(图9D)。在所培养的大鼠海马神经元上进行雷 帕霉素类似物对Ca2+电流的作用的进一步验证。当阻断N型Ca2+通道并将化合物2(10 μM)加入内部移液管溶液中时，10分钟后，电流缓慢抑制达74.5+/-8.8(图9E、F)。 这一作用至少部分归因于L型通道的抑制，因为N-和L型Ca2+通道的阻断使所述抑制 降低到仅为细胞中残余电流的21.3+/-4.4％(图9F)。
实例8.用雷帕霉素类似物处理后的转录谱
方法
转录谱
由E16大鼠胚胎制备皮层神经元。在涂板24小时后，用10μM免疫亲和素配体和 相应媒剂处理培养物。处理4小时、12小时、24小时和48小时后，溶解细胞。用 微型试剂盒提取各样本的总RNA。使用系统 由2μg各RNA样本合成双链cDNA，纯化，在活体外转录，以在 存在生物素标记的UTP和CTP的情况下使用T7RNA聚合酶来制备生物素标记的 cRNA。如制造商所推荐，将分成片段的cRNA与大鼠基因组2302.0 (加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara，CA))杂交。根据制造商的方 案，在Fluidics Station 450上对杂交阵列进行染色，且随后在扫描仪上 进行扫描。使用MAS 5.0软件产生原始数据。在英杰提公司(Ingenuity) 中分析转录谱。
结论
为进一步分析雷帕霉素类似物结合的下游结果，获得用10μM雷帕霉素类似物I或 II处理的大鼠皮层神经元培养物的转录谱数据。
转录谱表明，在雷帕霉素类似物I或II处理后，Ca2+信号转导路径完全下调(参看 表3A)。雷帕霉素类似物I引起诸如VGCC、瞬时受体电位通道、谷氨酸受体的N-甲基 D-天冬氨酸亚型(NMDA)和SHT3R通道等主要质膜Ca2+流入通道的下调。在这些通 道中，Ca2+经由NMDA通道流入为导致细胞凋亡的主要事件(高希(Ghosh)等人，科 学(Science)268，239-247(1995))。已知能裂解NMDA肽并活化Ca2+流入的纤溶酶原 活化剂(PLAU)(塔尼利斯(Traynelis)等人，自然医药(Nat.Med.)7，17-18(2001)) 明显下调(经雷帕霉素类似物I处理的情况下下调-40倍；经雷帕霉素类似物II处理的 情况下下调-10倍)；这很可能降低通过NMDA通道的钙流入。另外，IP3受体的下调可 能降低内部储存的Ca2+释放，并且钙调蛋白和钙调蛋白激酶的下调(例如PNCK，-20 倍)将减少胞浆Ca2+信号转导。所观察到的Ca2+流入和Ca2+信号转导路径的减弱对于治 疗中风和外伤性脑损伤极为重要，这是因为，一般认为神经元中Ca2+过载是引发Ca2+ 依赖性过程，从而最终导致神经元死亡的关键事件(高希(Ghosh)等人，科学(Science) 268，239-247(1995))。此外，细胞Ca2+含量降低可通过Bcl2(阿尔德里奇(Edlich)等 人，生物化学杂志(J.Bial.Chem.)281，14961-14970(2006))或PPID缔合的线粒体透 性转运孔(白恩斯(Baines)等人，自然(Nature)434，658-662(2005))的 FKBP38/Ca2+/CaM活化来抑制细胞凋亡。
观察到胆固醇生物合成基因的明显上调(例如LSS，+13倍)，表明类固醇受体活化 (王(Wang)等人，脂质研究杂志(J.Lipid Res.)47，778-786(2006))(参看表3B)。 已报导类固醇激素或格尔德霉素(geldanamycin)能刺激神经突起生长，由于类固醇受 体可通过FK506活化，故雷帕霉素类似物I和II与FKBP52的结合可能活化类固醇受体 并促进神经突起生长。
表3A：钙信号转导路径基因
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 ACTA1 肌动蛋白，α1，骨 骼肌 -1.6 ＜0.001 -1.53 ＜0.001 细胞质 其它 ACTA2 肌动蛋白，α2，平 滑肌，主动脉 1.37 0.089 1.41 ＜0.001 细胞质 其它 AKAP5 - -1.5 0.17 -2.56 0.003 质膜 其它 ASPH 天冬氨酸β-羟化 酶 -3.27 ＜0.001 -3.19 ＜0.001 细胞质 酶 ATP2A2 ATPase，Ca++转 运，心肌，慢肌2 2 ＜0.001 1.85 ＜0.001 细胞质 转运蛋白 ATP2B1 ATPase，Ca++转 运，质膜1 1.81 0.003 1.53 0.016 质膜 转运蛋白 ATP2B3 ATPase，Ca++转 运，质膜3 -1.45 0.019 -1.54 0.009 质膜 转运蛋白 ATP2C1 ATPase，Ca++转 运，2C型，成员1 -1.32 0.002 -1.38 ＜0.001 细胞质 转运蛋白 CABIN1 钙神经素结合蛋 白1 1.34 0.01 1.33 0.011 核 其它
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 CACNA1 B 钙通道，电压依赖 性，L型α1B亚基 -1.45 0.001 -1.77 ＜0.001 质膜 离子通道 CACNA1 C 钙通道，电压依赖 性，L型α1C亚基 1.82 0.001 1.48 0.001 质膜 离子通道 CACNA1 D 钙通道，电压依赖 性，L型α1D亚基 -1.28 0.21 -1.72 0.017 质膜 离子通道 CACNA2 D1 钙通道，电压依赖 性，α2/δ亚基1 5.73 0.009 3.47 0.03 质膜 离子通道 CACNB1 钙通道，电压依赖 性，β1亚基 -1.14 0.051 -1.32 0.026 质膜 离子通道 CACNG2 钙通道，电压依赖 性，γ亚基2 -2 ＜0.001 -1.8 ＜0.001 质膜 离子通道 CACNG3 钙通道，电压依赖 性，γ亚基3 -2.46 0.001 -3.73 ＜0.001 质膜 离子通道 CALM1 钙调蛋白1(磷酸 化酶激酶，δ) -1.63 ＜0.001 -1.74 ＜0.001 质膜 其它 CALM2 钙调蛋白2(磷酸 化酶激酶，δ) -1.33 0.007 -1.22 0.028 质膜 其它 CALM3 钙调蛋白3(磷酸 化酶激酶，δ) -1.52 0.005 -1.34 0.01 质膜 其它 CALR 钙网蛋白 1.19 0.016 1.18 0.023 核 转录调控因 子 CAMK1 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶I -1.43 0.006 -1.6 0.001 细胞质 激酶 CAMK4 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶IV -1.33 0.46 -1.42 0.049 核 激酶 CAMK1G 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶IG -2.26 ＜0.001 -2.47 ＜0.001 质膜 激酶 CAMK2A 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶(CaM 激酶)IIα -4.13 0.06 -2.03 0.004 细胞质 激酶 CAMK2B 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶(CaM 激酶)IIβ -1.88 ＜0.001 -1.82 ＜0.001 细胞质 激酶 CAMK2D 钙/钙调蛋白依赖 性蛋白激酶(CaM 激酶)IIδ -1.48 0.002 -1.45 0.004 细胞质 激酶 CHP 钙结合蛋白P22 1.54 0.001 1.65 0.001 细胞质 转运蛋白 CREBBP CREB结合蛋白 (鲁宾斯坦-泰比 5.84 0.004 4.14 0.009 核 转录调控因 子
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 综合症 (Rubinstein-Tayb i syndrome)) DSCR1 唐氏综合症临界 区基因1 -1.82 ＜0.001 -1.93 ＜0.001 核 转录调控因 子 DSCR1L 1 唐氏综合症临界 区基因1样1 -4.73 ＜0.001 -4.44 0.001 未知 其它 GRIM 谷氨酸受体，离子 移变型AMPA1 -2.16 0.001 -2.78 0.008 质膜 离子通道 GRIA2 谷氨酸受体，离子 移变型AMPA2 2.71 0.002 2.74 ＜0.001 质膜 离子通道 GRIN1 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基D- 天冬氨酸1 -2.8 0.001 -2.41 ＜0.001 质膜 离子通道 GRIN2B 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基D- 天冬氨酸2B -1.57 0.052 -1.94 0.008 质膜 离子通道 GRIN3A 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基-D- 天冬氨酸3A -2.94 0.063 1.84 0.013 质膜 离子通道 GRINA 谷氨酸受体，离子 移变型N-甲基D- 天冬氨酸相关蛋 白1(结合谷氨酸) -1.2 0.009 -1.21 0.007 未知 离子通道 HDAC5 组蛋白脱乙酰基 酶5 1.8 0.014 1.78 0.016 核 转录调控因 子 HDAC6 组蛋白脱乙酰基 酶6 -1.13 0.015 -1.18 0.005 核 转录调控因 子 HDAC7A 组蛋白脱乙酰基 酶7A 1.27 0.007 1.24 0.011 核 转录调控因 子 HTR3A 5-羟基色胺(血清 素)受体3A -1.64 0.005 -1.57 0.005 质膜 离子通道 ITPR3 肌醇1，4，5-三磷酸 受体，3型 -1.93 0.002 -1.85 0.019 细胞质 离子通道 MAPK1 丝裂原活化蛋白 激酶1 1.38 0.009 1.29 0.029 细胞质 激酶 MAPK3 丝裂原活化蛋白 激酶3 -1.19 0.046 -1.31 0.01 细胞质 激酶 MYH1 肌球蛋白，重肽 (heavy -2.17 0.008 -2.18 0.006 细胞质 酶
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 polypeptide)1，骨 骼肌，成人 MYH6 肌球蛋白，重肽6， 心肌，α (肥厚性心肌症 1) -5.93 0.017 -7.18 0.02 细胞质 其它 MYH7 肌球蛋白，重肽7， 心肌，β -5.88 ＜0.001 -6.11 ＜0.001 细胞质 其它 MYL6B 肌球蛋白，轻肽 6B，碱性，平滑肌 和非肌肉 -1.68 ＜0.001 -1.69 0.001 细胞质 其它 PPP3CB 蛋白磷酸化酶3 (先前为2B)，催 化亚基，β同功异 形体(钙神经素 Aβ) -1.27 ＜0.001 -1.3 ＜0.001 未知 磷酸化酶 PPP3CC 蛋白磷酸化酶3 (先前为2B)，催 化亚基，γ同功异 形体(钙神经素 Aγ) -1.27 0.007 -1.18 0.037 未知 磷酸化酶 PPP3R1 蛋白磷酸化酶3 (先前为2B)，调 控亚基B，19kDa， α同功异形体(钙 神经素B，I型) -1.44 0.039 -1.49 0.031 细胞质 磷酸化酶 PRKAG1 蛋白激酶，AMP 活化，γ1非催化亚 基 -1.24 0.005 -1.21 0.012 未知 激酶 PRKAR1 A 蛋白激酶，cAMP 依赖性，调控，I 型，α(组织特异 性消失基因1) -1.1 0.001 1.08 0.015 细胞质 激酶 PRKAR1 B 蛋白激酶，cAMP 依赖性，调控，I 型，β -3.18 ＜0.001 -3.36 ＜0.001 细胞质 激酶 PRKAR2 A 蛋白激酶， cAMP依赖性，调 控，II型，α -1.23 0.26 -1.56 0.047 细胞质 激酶 PRKAR2 蛋白激酶， -1.5 ＜0.001 -1.56 ＜0.001 细胞质 激酶
基因符号 基因名 2相对于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对 于 DMSO 的改变 倍数 1相对于 DMSO 的p值 位置 家族 B cAMP依赖性，调 控，II型，β RAP1B RAP1B，RAS致 癌基因家族成员 -1.33 0.002 -1.29 ＜0.001 细胞质 酶 TPM1 原肌球蛋白1(α) -2.83 0.002 -2.55 ＜0.001 细胞质 其它 TPM3 原肌球蛋白3 -1.99 0.001 -2.04 ＜0.001 细胞质 其它 TRPC1 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 C，成员1 -1.08 0.33 -1.21 0.033 质膜 离子通道 TRPC3 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 C，成员3 -1.95 0.003 -2.4 0.015 质膜 离子通道 TRPC4 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 C，成员4 -5.42 0.023 -4.56 0.005 质膜 离子通道 TRPV6 瞬时受体电位阳 离子通道，亚家族 V，成员6 1.73 ＜0.001 1.65 ＜0.001 质膜 离子通道
表3B：固醇生物合成路径基因
基因符号 基因名 2相对 于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对于 DMSO的 改变倍数 1相对于 DMSO的 p值 位置 家族 CYP27B1 细胞色素 P450，家族27， 亚家族B，多 肽1 -1.38 0.008 -1.27 0.055 细胞质 酶 DHCR7 7-脱氢胆固醇 还原酶 1.73 0.001 1.84 ＜0.001 细胞质 酶 EBP 依莫帕米 (emopamil) 结合蛋白(固 醇异构酶) 1.32 0.034 1.45 0.012 细胞质 酶 FDFT1 法呢基-二磷 酸法呢基转移 酶1 1.89 0.001 1.94 ＜0.001 细胞质 酶
基因符号 基因名 2相对 于 DMSO 的改变 倍数 2相对于 DMSO的p 值 1相对于 DMSO的 改变倍数 1相对于 DMSO的 p值 位置 家族 FDPS 法呢基二磷酸 合成酶(法呢 基焦磷酸合成 酶，二甲基烯 丙基 转移酶，香叶 基转移酶) 2.07 ＜0.001 2.34 ＜0.001 细胞质 酶 HMGCR 3-羟基-3-甲基 戊二酰-辅酶A 还原酶 2.26 ＜0.001 2.24 ＜0.001 细胞质 酶 IDI1 异戊烯基-二 磷酸δ异构酶 1 2.85 ＜0.001 3.24 ＜0.001 细胞质 酶 LSS 羊毛固醇合成 酶(2，3-氧鲨烯 -羊毛固醇环 化酶) 13.19 0.009 13.3 0.009 细胞质 酶 MVD 甲羟戊酸(二 磷酸)脱羧酶 1.81 0.005 1.94 0.004 细胞质 酶 MVK 甲羟戊酸激酶 (甲羟戊酸尿 症) 1.6 0.001 1.6 ＜0.001 细胞质 激酶 NQO1 NAD(P)H脱 氢酶，苯醌1 1.64 0.001 1.8 ＜0.001 细胞质 酶 PMVK 磷酸甲羟戊酸 激酶 1.25 0.024 1.33 0.009 细胞质 激酶 SC5DL 固醇-C5-去饱 和酶(ERG3 δ-5-去饱和酶 同系物，真菌) 样 1.94 ＜0.001 2.01 0.001 细胞质 酶 SQLE 鲨烯环氧酶 1.9 ＜0.001 1.92 ＜0.001 细胞质 酶
实例10.电压门控L型钙通道β1亚基的减少刺激神经突起生长
使用RNAi技术来降低CACB1(Ca2+通道β1亚基)和FKBP4(TFKBP52)基因的 转录水平，并通过生长表型来检查生物作用。
方法
神经元培养物
简单说来，由胚龄为15天(E15)的大鼠胚胎(斯普拉-道来大鼠(Sprague-Dawley)， 查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories)，马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington， MA))制备皮层神经元培养物。收集胚胎，去除其脑部，并在无Ca2+和Mg2+的冰冷的 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中解剖皮层。将解剖的皮层组织碎片汇集在一起，并转移 到伊尔氏平衡盐溶液(Earle′s balanced salt solution)(沃斯辛顿生物化学品公司 (Worthington Biochemical)，新泽西州弗里霍尔德(Freehold，NJ))中含有20IU/ml木瓜 蛋白酶的酶解离培养基中，且在37℃下培育30分钟。酶促解离后，抽吸出木瓜蛋白酶 溶液，并在含有2,000IU/ml DNase和10mg/ml卵类粘蛋白(ovomucoid)蛋白酶抑制剂 的完全培养基[具有B-27补充(吉凯公司(Gibco)，纽约长岛(Grand Island，NY))、100 IU/ml青霉素(penicillin)、100μg/ml链霉素(streptomycin)、3.3μg/ml蚜肠霉素 (aphidicolin)、0.5mM谷氨酸的Neurobasal培养基]中，用烧边的巴氏移液管(fire-polished Pasteur pipette)机械地湿磨组织。
原代皮层神经元中siRNA的瞬时转染
对于各条件，利用200ng siGLO层粘连蛋白A/C siRNA(达哈麦肯RNA技术公司 (Dharmacon RNA Technologies)，科罗拉多州博尔德(Boulder，CO))、L型钙通道β1亚 基siRNA(GGAGAAGUACAAUAAUGACTT(SEQ ID NO：15)(有义链)和 GUCAUUAUUGUACUUCUCCTT(SEQ ID NO：16)(反义链))或FKBP4siRNA (CCUAGCUAUGCUUUUGGCATT(SEQ ID NO：17)(有义链)和 UGCCAAAGCAUAGCUAGGTT(SEQ ID NO：18)(反义链))(安比隆公司(Ambion， Inc.)，得克萨斯州奥斯汀(Austin，TX))，使用程序DC-104在96孔Shuttle核转染系统 (艾玛斯生物系统公司(amaxa biosystems)，马里兰州盖瑟斯伯格(Gaithersburg，MD)) 上转染5×105个皮层神经元。将25μl各转染反应物加入涂有聚D-赖氨酸的96孔(每 一实验4个孔)中。将转染过的皮层神经元保持培养24小时。
蛋白质免疫印迹
将用零乱的siRNA、层粘连蛋白A/C、CACNB1或FKBP52siRNA处理的皮层神经 元溶解于含有蛋白酶抑制剂混合液和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并使用布莱克福 德分析(Bradford assay)(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories)，加利福尼亚州赫拉 克勒斯(Hercules，CA))测量蛋白质浓度。将每一条件下2μg蛋白质装载到各孔中，并 经由SDS-PAGE分离。将蛋白质转移到硝基纤维素上并与抗层粘连蛋白A/C(奥普斯特 公司(Upstate))、CACNB1(艾比姆公司(abeam)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA)) 或FKBP52(圣塔克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.))的抗体一起培 育并以肌动蛋白(西格玛公司(Sigma))作为装载对照。显现谱带，并使用奥德赛红外 成像系统(Odyssey Infrared Imaging System)和奥德赛软件(利克生物科技公司(Li-Cor Biosciences)，内布拉斯州林肯(Lincoln，NE))进行定量。蛋白质表达敲除(knock down) 是计算为随零乱siRNA表达百分比变化的与肌动蛋白的比率。
结论
为进一步证实雷帕霉素类似物I或II对FKBP52和CACNB1的抑制有助于神经突 起生长和神经元存活，利用针对层粘连蛋白A/C(用作对照)、FKBP52、CACNB1或 FKBP52+CACNB1的siRNA转染大鼠皮层神经元，并在24小时后测量总神经突起生 长。总神经突起生长在CACNB1 siRNA处理的神经元中相比对照基本上没有变化，但在 FKBP52 siRNA-(对照的125±12％)和FKBP52+CACNB1 siRNA处理(对照的126± 14％)的神经元中明显增加(图10A)，表明FKBP52的抑制作用刺激神经突起生长。同 时，还通过ELISA分析来定量神经丝蛋白表达，从而评定siRNA对神经元存活的影响。 神经元存活百分比在CACNB1 siRNA处理的细胞中相比对照有所降低(对照的80± 3％)，且在FKBP52 siRNA处理的细胞中略有增加(对照的112±2％)，且在FKBP52+ CACNB1 siRNA处理的细胞中明显增加(对照的152±2％)(图10B)，表明减少FKBP52 和CACNB1能促进神经元存活。进行蛋白质免疫印迹来验证：siRNA处理在24小时后 降低皮层神经元中层粘连蛋白A/C、CACNB1或FKBP52蛋白的表达。代表性印迹展示 于图10C中。层粘连蛋白A/C的表达降低79.21±13.68％，CACNB1的表达降低70.79± 20.79％，且FKBP52的表达降低86.83±7.03％(n＝3)。
这些实验表明，雷帕霉素类似物I与FKBP52和电压门控L型钙通道β1亚基形成 新颖复合物。复合物的形成抑制β1亚基的活性，并刺激神经突起生长。其还表明，通 过修饰雷帕霉素的mTOR结合区所制备的两种实质上非免疫抑制性的免疫亲和素配体 雷帕霉素类似物I和II(艾伯汉姆(Abraham)等人，免疫学研究年鉴(Annu.Rev.Immunol.) 14，483-510(1996))展现有效的神经突起生长活性。亲和纯化揭示，二者都与免疫亲和 素FKBP52和L型电压依赖性Ca2+通道的β1亚基(CACNB1)结合。雷帕霉素类似物 II对于FKBP52(相对于FKBP12)的结合选择性比雷帕霉素高687倍。此外，用所述化 合物处理的大鼠皮层神经元展现Ca2+信号转导路径的全面下调，并且在经处理的F-11 细胞中观察到L型Ca2+通道的部分抑制。大鼠皮层神经元中FKBP52和/或CACNB1的 遗传减少促进神经突起生长和神经元存活。在不受理论束缚的情况下，申请者相信，免 疫亲和素配体能通过调节Ca2+信号转导潜在地保护神经元免于经历Ca2+诱导的细胞死 亡，并通过经由FKBP52结合活化类固醇受体来促进神经突起生长。这一新颖神经保护 作用机制为许多疾病的治疗提供有价值前景。
本申请案通篇引用的所有参考文献、未决专利申请案和公开的专利都以引用的方式 清楚地并入本文中。
等效物
所属领域技术人员将仅使用常规实验就能认识到或能够确定本文所述的本发明的 特定实施例的许多等效物。预期所述等效物也涵盖于以下权利要求书中。
序列表
<110>惠氏公司
<120>免疫亲和素配体以及调节免疫亲和素和钙通道活性的方法
<130>20433-004WO1
<160>18
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>598
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Val Gln Lys Thr Ser Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
20 25 30
Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Ser Phe Val Arg Gln Gly Ser Ala Glu Ser Tyr Thr
50 55 60
Ser Arg Pro Ser Asp Ser Asp Val Ser Leu Glu Glu Asp Arg Glu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
85 90 95
Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
Glu Pro Lys Asp Phe Leu His Ile Lys Glu Lys Tyr Asn Asn Asp Trp
130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
145 150 155 160
Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Lys Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Ala Lys Gln Lys Gln Lys Ser Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp
210 215 220
Val Val Pro Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys
225 230 235 240
Gly Tyr Glu Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu
245 250 255
Lys His Arg Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Ile Ser Leu Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile
275 280 285
Ile Ile Glu Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser
290 295 300
Glu Ile Glu Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ala Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser
325 330 335
Leu Ala Pro Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu
340 345 350
Gln Arg Leu Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn
355 360 365
Val Gln Ile Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met
370 375 380
Phe Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His
385 390 395 400
Leu Ala Glu Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser
405 410 415
Ser Thr Pro Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala
420 425 430
Leu Ala Ala Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Gly Pro Tyr Leu
435 440 445
Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Glu Arg Ala Thr Gly Glu His Ala Ser
450 455 460
Met His Glu Tyr Pro Gly Glu Leu Gly Gln Pro Pro Gly Leu Tyr Pro
465 470 475 480
Ser Ser His Pro Pro Gly Arg Ala Gly Thr Leu Arg Ala Leu Ser Arg
485 490 495
Gln Asp Thr Phe Asp Ala Asp Thr Pro Gly Ser Arg Asn Ser Ala Tyr
500 505 510
Thr Glu Leu Gly Asp Ser Cys Val Asp Met Glu Thr Asp Pro Ser Glu
515 520 525
Gly Pro Gly Leu Gly Asp Pro Ala Gly Gly Gly Thr Pro Pro Ala Arg
530 535 540
Gln Gly Ser Trp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Leu Thr
545 550 555 560
Asp Asn Arg Asn Arg Gly Arg Asn Lys Ala Arg Tyr Cys Ala Glu Gly
565 570 575
Gly Gly Pro Val Leu Gly Arg Asn Lys Asn Glu Leu Glu Gly Trp Gly
580 585 590
Arg Gly Val Tyr Ile Arg
595
<210>2
<211>3687
<212>DNA
<213>智人
<400>2
gagggaaggc aggaaggagg cagccgaagg ccgagctggg tggctggacc gggtgctggc 60
tgcgccgcgc tgctttcggc tcccacggcc tctcccatgc gctgagggag cccggctggg 120
ccgggccggc ggcgggaggg gaggctcctc tccatggtcc agaagaccag catgtcccgg 180
ggcccttacc caccctccca ggagatcccc atggaggtct tcgaccccag cccgcagggc 240
aaatacagca agaggaaagg gcgattcaaa cggtcagatg ggagcacgtc ctcggatacc 300
acatccaaca gctttgtccg ccagggctca gcggagtcct acaccagccg tccatcagac 360
tctgatgtat ctctggagga ggaccgggaa gccttaagga aggaagcaga gcgccaggca 420
ttagcgcagc tcgagaaggc caagaccaag ccagtggcat ttgctgtgcg gacaaatgtt 480
ggctacaatc cgtctccagg ggatgaggtg cctgtgcagg gagtggccat caccttcgag 540
cccaaagact tcctgcacat caaggagaaa tacaataatg actggtggat cgggcggctg 600
gtgaaggagg gctgtgaggt tggcttcatt cccagccccg tcaaactgga cagccttcgc 660
ctgctgcagg aacagaagct gcgccagaac cgcctcggct ccagcaaatc aggcgataac 720
tccagttcca gtctgggaga tgtggtgact ggcacccgcc gccccacacc ccctgccagt 780
gccaaacaga agcagaagtc gacagagcat gtgcccccct atgacgtggt gccttccatg 840
aggcccatca tcctggtggg accgtcgctc aagggctacg aggttacaga catgatgcag 900
aaagctttat ttgacttctt gaagcatcgg tttgatggca ggatctccat cactcgtgtg 960
acggcagata tttccctggc taagcgctca gttctcaaca accccagcaa acacatcatc 1020
attgagcgct ccaacacacg ctccagcctg gctgaggtgc agagtgaaat cgagcgaatc 1080
ttcgagctgg cccggaccct tcagttggtc gctctggatg ctgacaccat caatcaccca 1140
gcccagctgt ccaagacctc gctggccccc atcattgttt acatcaagat cacctctccc 1200
aaggtacttc aaaggctcat caagtcccga ggaaagtctc agtccaaaca cctcaatgtc 1260
caaatagcgg cctcggaaaa gctggcacag tgcccccctg aaatgtttga catcatcctg 1320
gatgagaacc aattggagga tgcctgcgag catctggcgg agtacttgga agcctattgg 1380
aaggccacac acccgcccag cagcacgcca cccaatccgc tgctgaaccg caccatggct 1440
accgcagccc tggctgccag ccctgcccct gtctccaacc tccagggacc ctaccttgct 1500
tccggggacc agccactgga acgggccacc ggggagcacg ccagcatgca cgagtaccca 1560
ggggagctgg gccagccccc aggcctttac cccagcagcc acccaccagg ccgggcaggc 1620
acgctacggg cactgtcccg ccaagacact tttgatgccg acacccccgg cagccgaaac 1680
tctgcctaca cggagctggg agactcatgt gtggacatgg agactgaccc ctcagagggg 1740
ccagggcttg gagaccctgc agggggcggc acgcccccag cccgacaggg atcctgggag 1800
gacgaggaag aagactatga ggaagagctg accgacaacc ggaaccgggg ccggaataag 1860
gcccgctact gcgctgaggg tgggggtcca gttttggggc gcaacaagaa tgagctggag 1920
ggctggggac gaggcgtcta cattcgctga gaggcagggg ccacacggcg ggaggaaggg 1980
ctctgagccc aggggagggg agggagcgag gggctcacac ctgacatgta ttcgcctcca 2040
gggggcgctg tctccctcct ttcagatgcc tttgctcaaa gcttggggtt tctttggtgt 2100
taccatccca gctcccggga ggcccttaag ccccagctgt cggtttttac ctgcctgttg 2160
tggatggatg ggggataccc acctttctga agtgtcccct ttctcccatc ttaaggggct 2220
ctcctccctc accctcctag agaaaaggtg cacttcctta actctttcta ctcggggccc 2280
taagtgacgg tcctaagtgg gatggctctc cttctcccaa gctgcagtac tggggaaggg 2340
ctgggcgctt ttcctggaaa gggaggccac agattctttc ccatgggggc tctcttcccc 2400
agaccccaga tccaaggtcc ctcaccctgc ctgccccttc ctcccagctt cctggcagca 2460
tcgtctggtc ggtgaaagcc atagcatgga caccccatgg ggagcttgtc ttggggaggg 2520
ttctgggtgg aagctggcag gcatacagca ccctctaccc tccgtggcca tggcaacgtc 2580
cagggcccag aaccctgagg agtgagcggc cgagacgctg ctccccaccc cccacctcca 2640
tgcctcagcc tttgcctacc ccaggaatga gcttggcctc caacatccct tgcctgctgc 2700
cattagtaga gggggcccct ctgcatctga gccccccatc cctgtgccac ctgggtgtgg 2760
agcccatgga acactctggt ccgcctcatt ttaaaccaaa aaactgctcc ttcaccctca 2820
ccctgaggcc ccaggggaga ggacccgtgg gatggtgccc aggggttgcc ttgggacctc 2880
ggatctcctc tggggggctt ggctgctgct gttgctgctc tgtatttgcc tctcgtgatt 2940
ctgtttgtta cccatgttca cttcccccag gagaggcctt ggtaccccct ctcccctggg 3000
gcatcccttt gccttggcat ccctgtagcc cagcaaccct gcccctcccc agcatcccag 3060
ctgggccaga gagagccgag tgtgccaaca aggactgggg cctgcccggc tgcccgcctc 3120
agggatgggc acctcatgcc tgtctcgcca cctcctgtgc caatgtccca ccctccacct 3180
gggggtgggg tgcagcttcc acttactgat tagaagacac cactgccctc ccttcccccc 3240
tccctgtctg gtgtcctgtg cccccatctg tctgtctata tttgtctgta ctcccctagg 3300
agaagtattt tgccatatat aaaaccactg tcctgtcctt tgtggctgcc tcccaagcct 3360
gcttctttgt cctcgccaca tagtcgtcag cgtaggcacc tgggagctgc tgatatgcac 3420
ggggagttga aagggtgggt gcctgaagat gttgtgccct gagtcattga ctcaaaagaa 3480
aagatgatcc tttgattttg gccctctgat gtattgtgcc caagccagga gctgcttggg 3540
cagtcccagc tccacactgg ccctgagccc cttcacttac ctgtctctcc acaagtagag 3600
ccaaaggcaa tgggaagctc aatgttgctc agtgggtgag atccagaccc actggtgcaa 3660
tgtcttaaat acacatgact gtttttc 3687
<210>3
<211>523
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Met Val Gln Lys Thr Ser Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
20 25 30
Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Ser Phe Val Arg Gln Gly Ser Ala Glu Ser Tyr Thr
50 55 60
Ser Arg Pro Ser Asp Ser Asp Val Ser Leu Glu Glu Asp Arg Glu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
85 90 95
Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
Glu Pro Lys Asp Phe Leu His Ile Lys Glu Lys Tyr Asn Asn Asp Trp
130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
145 150 155 160
Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Lys Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Gly Asn Glu Met Thr Asn Leu Ala Phe Glu Leu Asp Pro Leu Glu
210 215 220
Leu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Leu Gly Glu Gln Ser Gly Ser Ala Lys
225 230 235 240
Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Thr Pro Pro Pro His Gly Lys Arg Ile
245 250 255
Pro Phe Phe Lys Lys Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp Val Val Pro
260 265 270
Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys Gly Tyr Glu
275 280 285
Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu Lys His Arg
290 295 300
Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp Ile Ser Leu
305 310 315 320
Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile Ile Ile Glu
325 330 335
Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser Glu Ile Glu
340 345 350
Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala Leu Asp Ala
355 360 365
Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser Leu Ala Pro
370 375 380
Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu Gln Arg Leu
385 390 395 400
Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn Val Gln Ile
405 410 415
Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met Phe Asp Ile
420 425 430
Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His Leu Ala Glu
435 440 445
Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser Ser Thr Pro
450 455 460
Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala Leu Ala Ala
465 470 475 480
Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Val Gln Val Leu Thr Ser Leu
485 490 495
Arg Arg Asn Leu Gly Phe Trp Gly Gly Leu Glu Ser Ser Gln Arg Gly
500 505 510
Ser Val Val Pro Gln Glu Gln Glu His Ala Met
515 520
<210>4
<211>1847
<212>DNA
<213>智人
<400>4
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tgcgccgcgc tgctttcggc tcccacggcc tctcccatgc gctgagggag cccggctggg 120
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ggcccttacc caccctccca ggagatcccc atggaggtct tcgaccccag cccgcagggc 240
aaatacagca agaggaaagg gcgattcaaa cggtcagatg ggagcacgtc ctcggatacc 300
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cccaaagact tcctgcacat caaggagaaa tacaataatg actggtggat cgggcggctg 600
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agctttattt tgtaaaaaaa taagatgagc ggcaaaaaaa aaaaaaa 1847
<210>5
<211>478
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Met Val Gln Lys Thr Ser Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
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Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
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Ser Arg Pro Ser Asp Ser Asp Val Ser Leu Glu Glu Asp Arg Glu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
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Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
Glu Pro Lys Asp Phe Leu His Ile Lys Glu Lys Tyr Asn Asn Asp Trp
130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
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Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Lys Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Ala Lys Gln Lys Gln Lys Ser Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp
210 215 220
Val Val Pro Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys
225 230 235 240
Gly Tyr Glu Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu
245 250 255
Lys His Arg Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Ile Ser Leu Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile
275 280 285
Ile Ile Glu Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser
290 295 300
Glu Ile Glu Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ala Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser
325 330 335
Leu Ala Pro Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu
340 345 350
Gln Arg Leu Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn
355 360 365
Val Gln Ile Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met
370 375 380
Phe Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His
385 390 395 400
Leu Ala Glu Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser
405 410 415
Ser Thr Pro Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala
420 425 430
Leu Ala Ala Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Val Gln Val Leu
435 440 445
Thr Ser Leu Arg Arg Asn Leu Gly Phe Trp Gly Gly Leu Glu Ser Ser
450 455 460
Gln Arg Gly Ser Val Val Pro Gln Glu Gln Glu His Ala Met
465 470 475
<210>6
<211>1700
<212>DNA
<213>智人
<400>6
gagggaaggc aggaaggagg cagccgaagg ccgagctggg tggctggacc gggtgctggc 60
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<210>7
<211>524
<212>PRT
<213>小鼠
<400>7
Met Val Gln Lys Ser Gly Met Ser Arg Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Gln
1 5 10 15
Glu Ile Pro Met Glu Val Phe Asp Pro Ser Pro Gln Gly Lys Tyr Ser
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Lys Arg Lys Gly Arg Phe Lys Arg Ser Asp Gly Ser Thr Ser Ser Asp
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Leu Arg Lys Glu Ala Glu Arg Gln Ala Leu Ala Gln Leu Glu Lys Ala
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Lys Thr Lys Pro Val Ala Phe Ala Val Arg Thr Asn Val Gly Tyr Asn
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Pro Ser Pro Gly Asp Glu Val Pro Val Gln Gly Val Ala Ile Thr Phe
115 120 125
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130 135 140
Trp Ile Gly Arg Leu Val Lys Glu Gly Cys Glu Val Gly Phe Ile Pro
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Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser Leu Arg Leu Leu Gln Glu Gln Thr Leu
165 170 175
Arg Gln Asn Arg Leu Ser Ser Ser Lys Ser Gly Asp Asn Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Asp Val Val Thr Gly Thr Arg Arg Pro Thr Pro Pro Ala
195 200 205
Ser Gly Asn Glu Met Thr Asn Phe Ala Phe Glu Leu Asp Pro Leu Glu
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Leu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Leu Gly Glu His Gly Gly Ser Ala Lys
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Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Thr Pro Pro Pro His Gly Lys Arg Ile
245 250 255
Pro Phe Phe Lys Lys Thr Glu His Val Pro Pro Tyr Asp Val Val Pro
260 265 270
Ser Met Arg Pro Ile Ile Leu Val Gly Pro Ser Leu Lys Gly Tyr Glu
275 280 285
Val Thr Asp Met Met Gln Lys Ala Leu Phe Asp Phe Leu Lys His Arg
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Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp Ile Ser Leu
305 310 315 320
Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile Ile Ile Glu
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Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser Glu Ile Glu
340 345 350
Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala Leu Asp Ala
355 360 365
Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser Leu Ala Pro
370 375 380
Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu Gln Arg Leu
385 390 395 400
Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn Val Gln Ile
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Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met Phe Asp Ile
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Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His Leu Ala Glu
435 440 445
Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser Ser Thr Pro
450 455 460
Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala Leu Ala Ala
465 470 475 480
Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Val Gln Val Leu Thr Ser Leu
485 490 495
Arg Arg Asn Leu Ser Phe Trp Gly Gly Leu Glu Ala Ser Pro Arg Gly
500 505 510
Gly Asp Ala Val Ala Gln Pro Gln Glu His Ala Met
515 520
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<211>1892
<212>DNA
<213>小鼠
<400>8
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tttacatcaa gatcacatct cccaaggtac tgcagaggct catcaaatcc cgagggaagt 1440
ctcaatccaa acacctcaat gtccaaatag cagcctcgga gaagctggca cagtgtcccc 1500
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<210>9
<211>597
<212>PRT
<213>小鼠
<400>9
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
Lys His Arg Phe Asp Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Ile Ser Leu Ala Lys Arg Ser Val Leu Asn Asn Pro Ser Lys His Ile
275 280 285
Ile Ile Glu Arg Ser Asn Thr Arg Ser Ser Leu Ala Glu Val Gln Ser
290 295 300
Glu Ile Glu Arg Ile Phe Glu Leu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Val Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ala Asp Thr Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Ser Lys Thr Ser
325 330 335
Leu Ala Pro Ile Ile Val Tyr Ile Lys Ile Thr Ser Pro Lys Val Leu
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Gln Arg Leu Ile Lys Ser Arg Gly Lys Ser Gln Ser Lys His Leu Asn
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Val Gln Ile Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ala Gln Cys Pro Pro Glu Met
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Phe Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gln Leu Glu Asp Ala Cys Glu His
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Leu Ala Glu Tyr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Thr His Pro Pro Ser
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Ser Thr Pro Pro Asn Pro Leu Leu Asn Arg Thr Met Ala Thr Ala Ala
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Leu Ala Ala Ser Pro Ala Pro Val Ser Asn Leu Gln Gly Pro Tyr Leu
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Ala Ser Gly Asp Gln Pro Leu Asp Arg Ala Thr Gly Glu His Ala Ser
450 455 460
Val His Glu Tyr Pro Gly Glu Leu Gly Gln Pro Pro Gly Leu Tyr Pro
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Ser Asn His Pro Leu Gly Arg Ala Gly Thr Leu Arg Ala Leu Ser Arg
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Gln Asp Thr Phe Asp Ala Asp Thr Pro Gly Ser Arg Asn Ser Ala Tyr
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595
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<213>小鼠
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ctcaacaacc ccagcaaaca catcatcatt gagcgctcca acacgcgttc cagcctggct 900
gaggtacaga gtgaaattga gaggatcttc gagctggccc ggaccttgca gctggtcgcc 960
ttggacgctg acaccatcaa ccacccagcc cagctctcta aaacgtcgct ggcccccatc 1020
attgtttaca tcaagatcac atctcccaag gtactgcaga ggctcatcaa atcccgaggg 1080
aagtctcaat ccaaacacct caatgtccaa atagcagcct cggagaagct ggcacagtgt 1140
ccccccgaaa tgtttgacat aatcctggac gagaaccaat tggaagatgc ctgcgagcac 1200
ctggctgagt acttggaagc ctactggaag gccacacatc cgcctagcag cacgccaccc 1260
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tccaacctcc agggacccta ccttgcttcc ggggaccagc cgctggaccg ggccactggg 1380
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Leu Ile Tyr Glu Val Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Ala Lys Glu Ser
245 250 255
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Glu Lys Gly Thr Val Tyr Phe Lys Gly Gly Lys Tyr Met Gln Ala Val
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Ile Gln Tyr Gly Lys Ile Val Ser Trp Leu Glu Met Glu Tyr Gly Leu
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Leu Asn Leu Ala Met Cys Tyr Leu Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Lys Ala
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Gly Leu Tyr Arg Arg Gly Glu Ala Gln Leu Leu Met Asn Glu Phe Glu
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a 3781
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<212>PRT
<213>小鼠
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ugccaaagca uagcuaggtt 20
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