作为子宫内膜异位症的生物标志物的微小RNA
阅读：757发布：2020-10-17
专利汇可以提供作为子宫内膜异位症的生物标志物的微小RNA专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了基于与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的表达 水 平，适用于诊断、评估和表征对其有需要的受试者中的子宫内膜异位症的组合物和方法。，下面是作为子宫内膜异位症的生物标志物的微小RNA专利的具体信息内容。
1.一种诊断怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括：
a.提供来自所述受试者的唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品，其中所述唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品包含与子宫内膜异位症相关的miRNA；
b.检测所述与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平；
c.将所检测的与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平与参考值相比较以确定所述唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平；和
d.基于所述唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平诊断患有子宫内膜异位症的受试者，其中对患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的特异性或灵敏度。
2.一种检测miRNA的方法，包括：
a.提供来自受试者的唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品，其中所述样品包含核酸并且其中所述受试者被怀疑患有子宫内膜异位症；
b.对所述核酸实施扩增或测序反应以
检测所述样品中的至少一种miRNA的存在，其中所述至少一种miRNA选自由以下各项组成的组：miR-18、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-214、miR-342、miR-
451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755；和
c.将所述miRNA的存在与参考值相比较。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为液体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为血液、血浆或血清。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为唾液。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是无细胞的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参考值为来自未患有子宫内膜异位症的受试者的样品中的至少一种miRNA的存在。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述miRNA选自由以下各项组成的组：
miR-125、miR-451和miR-3613。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述miRNA为miR-125b。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述miRNA为miR-125b-5p。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述miRNA为miR-451a。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述miRNA为miR-3613-5p。
13.一种方法，包括：
a.提供来自受试者的样品，其中所述样品包含核酸并且其中所述受试者被怀疑患有子宫内膜异位症；
b.对所述核酸实施测序反应以检测所述样品中的至少一种miRNA的存在，其中所述至少一种miRNA选自由以下各项组成的组：miR-18、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-
150、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755；和c.将所述miRNA的存在与参考值相比较。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过高通量或大规模平行测序检测所述至少一种miRNA。
15.一种诊断显示出子宫内膜异位症的症状或者被怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，所述方法包括：
a.检测非以下各项的至少一种miRNA的存在：let-7、miR-135、miR-449a、miR-34c、miR-
200a、miR-200b、miR-141、miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-
3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-6755-3p、miR-3613-5p；和b.当所检测的miRNA水平高于阈值水平时，诊断所述受试者患有子宫内膜异位症，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的特异性或灵敏度。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述miRNA是无细胞的。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有早期子宫内膜异位症的受试者的诊断。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有中度至重度疾病的受试者的诊断。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有III期或IV期子宫内膜异位症的受试者的诊断。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断还包括监控受试者治疗后的miRNA表达水平的变化。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于85％的特异性或灵敏度。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于95％的特异性或灵敏度。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括治疗受试者的子宫内膜异位症。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗是药物治疗以缓解疼痛。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗是激素疗法。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗是激素类避孕药。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗是促性腺激素释放激素激动剂。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗是促性腺激素释放激素拮抗剂。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测包括：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增所述样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所述所产生的cDNA，则所述探针发出信号；和(iii)使用检测器检测由所述探针所发出的信号。
30.一种检测miRNA的方法，包括：
a.提供来自受试者的样品，其中所述样品包含核酸并且其中所述受试者被怀疑患有子宫内膜异位症；
b.对所述核酸实施扩增、微阵列或测序反应；
c.检测所述样品中的至少一种miRNA的存在，其中所述至少一种miRNA选自由以下各项组成的组：miR-126、miR-214、miR-553和miR-4668；和
d.将所述miRNA的存在与参考值相比较。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为液体。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为血液、血浆、唾液或血清。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参考值为来自未患有子宫内膜异位症的受试者的样品中的至少一种miRNA的存在。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过聚合酶链反应(PCR)进行所述检测。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过定量PCR进行所述检测。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测包括将独特引物与至少一种miRNA或者与来源于所述至少一种miRNA的cDNA杂交。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测还包括使用对所述至少一种miRNA特异的至少一种引物或探针或者使用至少一种通用引物对所述至少一种miRNA实施反转录反应。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测包括：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增所述样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与发出信号的插入染料接触；和(iii)使用检测器随时间检测所发出的信号。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测包括：(i)通过使用特异性结合所述至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增所述样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对所述至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所产生的cDNA，则所述探针发出信号；和(iii)使用检测器检测由所述探针所发出的信号。
40.根据前述权利要求所述的方法，其中所述探针附接至荧光团和猝灭剂。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过序列进行检测。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述至少一种miRNA大于参考值至少2倍时，诊断子宫内膜异位症。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述至少一种miRNA小于参考值至少2倍时，诊断子宫内膜异位症。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当miRNA-125b-5p上调、miR-150-5p上调、miR-342-3p上调、miR-145-5p上调、miR-143-3p上调、miR-500a-3p上调或者miR-18a-
5p上调时，诊断子宫内膜异位症。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当至少三种miRNA上调时诊断子宫内膜异位症，其中所述至少三种miRNA来自由以下各项组成的组：miRNA-125b-5p、miR-150-
5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p和miR-18a-5p。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当miR-6755-3p下调或者miR-3613-
5p下调时，诊断子宫内膜异位症。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当miR-125b-5p上调、miR-451a上调并且miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当miR-125b-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者对KRAS变体等位基因的存在为阴性。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所检测的miRNA水平用于确定疾病严重程度。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
52.一种治疗患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括与对比因子相比，对识别为在所述受试者的生物样品中具有选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA的差异水平的受试者施用子宫内膜异位症治疗：miR-18a-5p、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-
150-5p、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755。
53.根据权利要求52所述的方法，还包括当与对比因子相比，当将所述受试者识别为具有选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA的差异水平时诊断所述受试者患有子宫内膜异位症：miR-18a-5p、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150-5p、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755。
54.根据权利要求53所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断包括提供来自所述受试者的生物样品和与对比因子相比，在所述生物样品中检测选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA的差异水平：miR-18a-5p、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150-5p、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-
6755。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述生物样品为体液。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述体液为血液、血浆或血清。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述体液为唾液。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述体液为尿液。
59.一种诊断和治疗被怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括：
a.提供来自所述受试者的唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品，其中所述样品包含与子宫内膜异位症相关的miRNA；
b.检测与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平；
c.将与子宫内膜异位症相关的miRNA的检测水平与参考值比较以确定液体样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平；
d.基于所述唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平诊断患有子宫内膜异位症的受试者，其中对患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的灵敏度或特异性；和
e.向诊断患有子宫内膜异位症的受试者施用治疗。
60.一种诊断和治疗被怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，所述方法包括：
a.检测非let-7、miR-449a、miR-34c、miR-200a、miR-200b、miR-150、miR-18a或miR-141的至少一种miRNA的存在；
b.当所检测的miRNA水平高于阈值水平时，诊断所述受试者患有子宫内膜异位症，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的特异性或灵敏度；和
c.向诊断患有子宫内膜异位症的受试者施用治疗。
61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA包括miR-125b-
5p、miR-451a和miR-3613-5p。
62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA为miR-125b-5p。
63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA为miR-3613-5p。
64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA是无细胞miRNA。
65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA以与对比因子相比至少2倍变化存在。
66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有早期子宫内膜异位症的受试者的诊断。
67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有中度至重度疾病的受试者的诊断。
68.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有III期或IV期子宫内膜异位症的受试者的诊断。
69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断还包括监控受试者治疗后的miRNA表达水平的变化。
70.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于95％的特异性或灵敏度。
71.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中。
72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗是药物治疗以缓解疼痛。
73.根据权利要求1所述的方法，其中治疗选自由以下各项组成的组：激素疗法、激素类避孕药、促性腺激素释放激素激动剂和促性腺激素释放激素拮抗剂。
74.根据权利要求2所述的方法，还包括通过实施聚合酶链反应(PCR)检测至少一种miRNA。
75.根据权利要求2所述的方法，还包括通过实施定量PCR检测至少一种miRNA。
76.根据权利要求2所述的方法，还包括通过以下方法检测所述至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增所述样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与发出信号的插入染料接触；和(iii)使用检测器随时间检测所发出的信号。
77.根据权利要求2所述的方法，还包括通过以下各项检测所述至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增所述样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所产生的cDNA，则所述探针发出信号；和(iii)使用检测器检测所述探针所发出的信号。
78.根据权利要求2所述的方法，还包括通过测序检测所述至少一种miRNA。
79.根据权利要求2所述的方法，还包括通过高通量测序或者大规模平行测序检测所述至少一种miRNA。
80.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种miRNA以大于参考值至少2倍的水平存在。
81.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者对KRAS变体等位基因的存在为阴性。
82.根据权利要求1所述的方法，其中将至少一种miRNA的水平用于确定疾病的严重程度。
83.根据权利要求1或权利要求3所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。
84.根据权利要求2所述的方法，其中当miRNA-125b-5p上调、miR-150-5p上调、miR-
342-3p上调、miR-145-5p上调、miR-143-3p上调、miR-500a-3p上调或者miR-18a-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。
85.根据权利要求2所述的方法，其中当至少三种miRNA上调时诊断子宫内膜异位症，其中所述至少三种miRNA来自由以下各项组成的组：miRNA-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-
3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p和miR-18a-5p。
86.根据权利要求2所述的方法，其中当miR-6755-3p下调或者miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。
87.根据权利要求2所述的方法，其中当miR-125b-5p上调、miR-451a上调并且miR-
3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。
88.根据权利要求2所述的方法，其中当miR-125b-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。
89.一种用于检测样品中微小RNA(“miRNA”)的方法，包括：
a.提供来自受试者的唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品，其中所述样品包含核酸并且其中所述受试者被怀疑患有子宫内膜异位症；
b.对所述核酸实施扩增或测序反应；
c.检测所述样品中的至少一种miRNA的存在，其中所述至少一种miRNA选自由以下各项组成的组：miR-18、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-214、miR-342、miR-
451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755；和
d.将所述miRNA的存在与参考值相比较。
90.一种诊断受试者中子宫内膜异位症的方法，所述方法包括：
a.确定所述受试者的生物样品中的至少一种miRNA的水平，其中所述miRNA为选自由以下各项组成的组中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668，和b.将所述生物样品中所述至少一种miRNA的水平与对比因子中所述至少一种miRNA的水平相比，其中当所述生物样品中所述至少一种miRNA的水平不同于所述对比因子中所述至少一种miRNA的水平时，将所述受试者诊断为患有子宫内膜异位症。
91.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA为miR-125、miR-
451和miR-3613的组合。
92.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
93.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括治疗所述受试者的子宫内膜异位症的步骤。
94.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对比因子为选自阳性对照、阴性对照、正常对照、野生型对照、历史对照和历史标准的至少一种对比因子。
95.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括与所述对比因子中的水平相比，检测所述生物样品中miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214和miR-126中的至少一种的水平的升高。
96.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括与所述对比因子中的水平相比，检测所述生物样品中miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668中的至少一种的水平的降低。
97.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA水平的确定使用了选自由反转录、PCR和微阵列组成的组的至少一种技术。
98.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自由以下各项组成的组：血液、血清、血浆以及它们的任何组合。
99.一种在受试者中诊断或提供子宫内膜异位症预后的方法，所述方法包括以下步骤：
在被怀疑或患有子宫内膜异位症的受试者的生物样品中检测选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA表达的改变：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-
451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。
100.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA为miR-125、miR-451和miR-3613的组合。
101.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、血浆以及它们的任何组合。
102.一种包含选择性结合至少一种miRNA的试剂的试剂盒，其中所述至少一种miRNA为选自由以下各项组成的组中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。
103.根据权利要求97所述的试剂盒，其包含至少三种试剂，其中第一试剂选择性结合miR-125，其中第二试剂选择性结合miR-451，并且其中第三试剂选择性结合miR-3613。
104.一种治疗患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括与对比因子相比，对识别为在所述受试者的生物样品中具有选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA的差异水平的受试者施用子宫内膜异位症治疗：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。
105.一种监控正在治疗子宫内膜异位症的受试者中对子宫内膜异位症治疗的响应的方法，所述方法包括：
a.确定所述受试者的生物样品中的至少一种miRNA的水平，其中所述miRNA为选自由以下各项组成的组中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668，和b.将所述生物样品中所述至少一种miRNA的水平与对比因子中所述至少一种miRNA的水平相比。
106.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA包括let-7、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-7g。
作为子宫内膜异位症的生物标志物的微小RNA
[0001] 相关申请的引用
背景技术
[0003] 微小RNA(miRNA)是一类具有19-24个核苷酸的高度保守的小内源性非编码的、功能性的RNA分子；它们通过与互补位点的碱基配对控制所靶向的RNA的翻译和稳定性并引起信使RNA转录本的抑制或降解(Bartel et al.,2009,Cell,136:215-233)。它们在发育的调节和多种生物过程的细胞内稳态中起关键作用(Hassan et al.,2015,Bone,81:746-756)。它们存在于胞内以及血清中(Corcoran et al.,2011,Clin Chem,57(1):18-32)并且具有使它们成为用于多种疾病诊断的有前景的生物标志物候选的具体特征(Sayed et al.,
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4629-4634,Dorval et al.,2013,Front Mol Neurosci,6:24,Jin et al.,2013,Cell Mol Neurobiol,5:601-613,Liu et al.,2014,World J Gastroenterol,20:12007-12017,Ulivi et al.,2014,Molecules,19:8220-8237,Zhu et al.,2014,Front Genet,5:149,Bandiera et al.,2015,J Hepatol,62:448-457)。无细胞miRNA稳定存在于一些体液中，包括血清和血浆、尿液和唾液(Chen et al.,2008,Cell Res,18:997-1006)。血清miRNA表达在个体间是稳定、可重复的并且一致的。已经将特定表达模式识别为用于包括癌症在内的多种疾病的生物标志物(Schwarzenbach et al.,2014,Nat Rev Clin Oncol,11:145-
156)。当它们从细胞释放至膜囊中的细胞间隙中(Gallo et al.,2012,PLoS One,7:
e30679)或者结合至蛋白质复合物时，miRNA保持稳定(Turchinovich et al.,2011,Nucleic Acids Res,39:7223-7233,Arroyo et al.,2011,Proc Natl Acad Sci U S A,
108:5003-5008)。血液中miRNA水平的改变可以反映正常生理过程期间的变化(Lai et al.,2014,Aging Cell,13:679-689,Redni et al.,2011,Front Genet,2:49)并已与一些病理情况，包括妇科疾病相联系(Zhao et al.,2012,Clin Chem,58:896-905,Murri et al.,2013,J Clin Endocrinol Metab,98:E1835-1844)。
2014,Heart Lung Cir,23:503-510,Coskun et al.,2012,World J Gastroenterol,18:
4629-4634,Dorval et al.,2013,Front Mol Neurosci,6:24,Jin et al.,2013,Cell Mol Neurobiol,5:601-613,Liu et al.,2014,World J Gastroenterol,20:12007-12017,Ulivi et al.,2014,Molecules,19:8220-8237,Zhu et al.,2014,Front Genet,5:149,Bandiera et al.,2015,J Hepatol,62:448-457)。无细胞miRNA稳定存在于一些体液中，包括血清和血浆、尿液和唾液(Chen et al.,2008,Cell Res,18:997-1006)。血清miRNA表达在个体间是稳定、可重复的并且一致的。已经将特定表达模式识别为用于包括癌症在内的多种疾病的生物标志物(Schwarzenbach et al.,2014,Nat Rev Clin Oncol,11:145-
156)。当它们从细胞释放至膜囊中的细胞间隙中(Gallo et al.,2012,PLoS One,7:
e30679)或者结合至蛋白质复合物时，miRNA保持稳定(Turchinovich et al.,2011,Nucleic Acids Res,39:7223-7233,Arroyo et al.,2011,Proc Natl Acad Sci U S A,
108:5003-5008)。血液中miRNA水平的改变可以反映正常生理过程期间的变化(Lai et al.,2014,Aging Cell,13:679-689,Redni et al.,2011,Front Genet,2:49)并已与一些病理情况，包括妇科疾病相联系(Zhao et al.,2012,Clin Chem,58:896-905,Murri et al.,2013,J Clin Endocrinol Metab,98:E1835-1844)。
[0004] 子宫内膜异位症(子宫内膜异位，endometriosis)是常见的妇科学病症，其影响了10％的育龄妇女(Taylor et al.,2011,Reprod Sci,18(9):814-823)。其特征在于子宫内膜细胞在子宫腔外的沉积和增殖(Giudice et al.,2010,N Engl J Med,362:2389-2398,Bulun et al.,2009,N Engl J Med,360:268-279)。在50％的患者中，子宫内膜异位症的主要症状是盆腔疼痛(Eskenazi et al.,1997,Obstet Gynecol Clin North Am,24:235-
258)并且40至50％的患者是不育的(Ozkan et al.,2008,Ann N Y Acad Sci,1127:92-
100,Moradi et al.,2014,BMC Womens Health,14:123)。不幸地是，该疾病目前尚无可用的准确的血清生物标志物。在子宫内膜异位症的诊断和分级中，成像技术(如超声)是不可靠的(Dunselman et al.,2014,Hum Reprod,29:400-412)。通常仅在疾病晚期通过腹腔镜检查对病变直接显示和病变确认来对子宫内膜异位症做出明确诊断。子宫内膜异位症的成功治疗的主要障碍在于不能在早期进行诊断。对于子宫内膜异位症特异性生物标志物的简单血液检查会提供对该疾病更及时和精确的诊断，并且可以获得较早的治疗干预。尽管已做了大量工作来识别这些生物标志物(Wang et al.,2012,Clin Chem Lab Med,50:1423-
1428,Jia et al.,2013,Hum Reprod,28:322-330,Suryawanshi et al.,2013,Clin Cancer Res,19:1213-1224)，但是尚未识别对于这些无创诊断工具的清楚的选择。在一些患有子宫内膜异位症的妇女中，血清CA-125升高，但是它不是特异性的并且具有较差的灵敏度和特异性。如上所描述的，已经作为一些疾病的生物标志物小心地评价了miRNA；它们对于子宫内膜异位症的诊断标志物具有希望。
258)并且40至50％的患者是不育的(Ozkan et al.,2008,Ann N Y Acad Sci,1127:92-
100,Moradi et al.,2014,BMC Womens Health,14:123)。不幸地是，该疾病目前尚无可用的准确的血清生物标志物。在子宫内膜异位症的诊断和分级中，成像技术(如超声)是不可靠的(Dunselman et al.,2014,Hum Reprod,29:400-412)。通常仅在疾病晚期通过腹腔镜检查对病变直接显示和病变确认来对子宫内膜异位症做出明确诊断。子宫内膜异位症的成功治疗的主要障碍在于不能在早期进行诊断。对于子宫内膜异位症特异性生物标志物的简单血液检查会提供对该疾病更及时和精确的诊断，并且可以获得较早的治疗干预。尽管已做了大量工作来识别这些生物标志物(Wang et al.,2012,Clin Chem Lab Med,50:1423-
1428,Jia et al.,2013,Hum Reprod,28:322-330,Suryawanshi et al.,2013,Clin Cancer Res,19:1213-1224)，但是尚未识别对于这些无创诊断工具的清楚的选择。在一些患有子宫内膜异位症的妇女中，血清CA-125升高，但是它不是特异性的并且具有较差的灵敏度和特异性。如上所描述的，已经作为一些疾病的生物标志物小心地评价了miRNA；它们对于子宫内膜异位症的诊断标志物具有希望。
[0005] 尽管在所有育龄妇女中的10％中以及在20-50％的不育妇女中存在子宫内膜异位症，但是对于子宫内膜异位症尚无明确可用的诊断生物标志物。已显示成像技术，如超声和磁共振成像在该疾病的诊断或分级中是不可靠的。目前，对于子宫内膜异位症的明确诊断，通过手术程序的病变直接可视化和组织学确认是必需的，这需要全身麻醉、熟练的手术技术、手术费用以及潜在并发症的风险。因此，用于子宫内膜异位症的新的无创诊断标志物的开发对于该疾病的早期诊断以及正确治疗和管理是至关重要的。因此，本领域需要子宫内膜异位症的无创生物标志物的改善的组合物和方法。本公开满足了该尚未满足的需要。发明内容
[0006] 本公开提供了在怀疑患有子宫内膜异位症的女性受试者中检测、诊断和/或预后子宫内膜异位症的新方法，和治疗子宫内膜异位症的新方法。本文所提供的多种方法总体上涉及检测样品如血液、血清或唾液中的miRNA生物标志物。照此，可以在无创或微创测定中使用该方法以检测子宫内膜异位症并且可以帮助许多女性患者避免创伤性更强的程序，如子宫内膜组织的活组织检查。该方法还可以在患者已发展更严重或危急的症状之前促进早期诊断并且可以促进早期子宫内膜异位症的治疗。
[0007] 在一个方面，本公开提供了诊断怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括：(a)提供来自受试者的唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品，其中唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品包含与子宫内膜异位症相关的miRNA；
(b)检测与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平；(c)将所检测的与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平与参考值相比较以确定唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平；和(d)基于唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平诊断患有子宫内膜异位症的受试者，其中对患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的特异性或灵敏度。
(b)检测与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平；(c)将所检测的与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平与参考值相比较以确定唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平；和(d)基于唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平诊断患有子宫内膜异位症的受试者，其中对患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的特异性或灵敏度。
[0008] 在一些实施方式中，样品为液体。在其他实施方式中，样品为血液、血浆或血清。在其他实施方式中，样品为唾液。在其他实施方式中，样品为无细胞样品。
[0009] 在其他实施方式中，miRNA选自由miR-125、miR-451和miR-3613组成的组。在其他实施方式中，miRNA为miR-125b。在其他实施方式中，miRNA为miR-125b-5p。在其他实施方式中，miRNA为miR-451a。在其他实施方式中，miRNA为miR-3613-5p。在一些实施方式中，至少一种miRNA为let-7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-7g。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，参考值为来自未患有子宫内膜异位症的受试者的样品中的至少一种miRNA的存在。
[0010] 在另一个方面，本公开提供了检测miRNA的方法，包括：(a)提供来自受试者的唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品，其中样品包含核酸并且其中怀疑受试者患有子宫内膜异位症；(b)对核酸实施扩增或测序反应以检测样品中的至少一种miRNA的存在，其中的至少一种miRNA选自由以下各项组成的组：miR-18、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755；和(c)将miRNA的存在与参考值相比较。
[0011] 在一些实施方式中，样品为液体。在其他实施方式中，样品为血液、血浆或血清。在其他实施方式中，样品为唾液。在其他实施方式中，样品为无细胞的。
[0012] 在其他实施方式中，miRNA选自miR-125、miR-451和miR-3613。在其他实施方式中，miRNA为miR-125b。在其他实施方式中，miRNA为miR-125b-5p。在其他实施方式中，miRNA为miR-451a。在其他实施方式中，miRNA为miR-3613-5p。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，参考值为来自未患有子宫内膜异位症的受试者的样品中的至少一种miRNA的存在。
[0013] 在另一个方面，本公开提供了方法，包括：(a)提供来自受试者的样品，其中样品包含核酸并且其中怀疑受试者患有子宫内膜异位症；(b)对核酸实施测序反应以检测样品中的至少一种miRNA的存在，其中的至少一种miRNA选自由以下各项组成的组：miR-18、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755；和(c)将miRNA的存在与参考值相比较。在一些实施方式中，通过高通量或大规模平行测序检测至少一种miRNA。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少一种或以下各项中的全部：
miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
[0014] 在另一个方面，本公开提供了用于诊断显示出子宫内膜异位症的症状或者被怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，该方法包括：(a)检测非以下各项的至少一种miRNA的存在：let-7、miR-135、miR-449a、miR-34c、miR-200a、miR-200b、miR-141、miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-6755-3p或者miR-3613-5p；和(b)当所检测的miRNA水平高于阈值水平时，诊断受试者患有子宫内膜异位症，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的特异性或灵敏度。在一些实施方式中，本公开提供了方法，包括：(a)检测非以下各项的至少一种miRNA的存在：let-7、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、miR-17-5p、miR-20a、miR-22、miR-135a、miR-135b、miR-135、miR-449a、miR-34c、miR-199a、miR-122、miR-145、miR-141、miR-542-3p、miR-9、miR-200a、miR-200a-3p、miR-200b-3p、miR-200b、miR-141、miR-141-3p、miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-6755-3p或者miR-3613-5p。
[0015] 在一些实施方式中，miRNA是无细胞的。在一些实施方式中，miRNA存在于无细胞样品中，如无细胞血浆、血清、唾液和/或尿。
[0016] 在一些实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有早期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有中度至重度疾病的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有III期或IV期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断还包括治疗后监控受试者miRNA表达水平的变化。
[0017] 在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或者大于99％的特异性或灵敏度。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于95％的特异性或灵敏度。
[0018] 在一些实施方式中，该方法还包括治疗受试者的子宫内膜异位症。在其他实施方式中，治疗是药物治疗以缓解疼痛。在其他实施方式中，治疗是激素疗法。在其他实施方式中，治疗是激素类避孕药。在其他实施方式中，治疗是促性腺激素释放激素激动剂。在其他实施方式中，治疗是促性腺激素释放激素拮抗剂。
[0019] 在一些实施方式中，检测包括：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所产生的cDNA，则探针发出信号；和(iii)使用检测器检测探针所发出的信号。
[0020] 在另一个方面，本公开提供了用于检测miRNA的方法，包括：(a)提供来自受试者的样品，其中样品包含核酸并且其中怀疑受试者患有子宫内膜异位症；(b)对核酸实施扩增、微阵列或测序反应；(c)检测样品中的至少一种miRNA的存在，其中的至少一种miRNA选自由以下各项组成的组：miR-126、miR-214、miR-553和miR-4668；和(d)将miRNA的存在与参考值相比较。在一些实施方式中，样品为液体。在其他实施方式中，样品为血液、血浆、唾液或血清。在一些实施方式中，参考值为来自未患有子宫内膜异位症的受试者的样品中的至少一种miRNA的存在。
[0021] 在一些实施方式中，通过聚合酶链反应(PCR)进行检测。在其他实施方式中，通过定量PCR进行检测。在一些实施方式中，通过实时PCR进行检测。在其他实施方式中，检测包括将独特引物与至少一种miRNA或者与来源于至少一种miRNA的cDNA杂交。在其他实施方式中，检测还包括使用对至少一种miRNA特异的至少一种引物或探针或者使用至少一种通用引物对至少一种miRNA实施反转录反应。在其他实施方式中，检测包括：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与发出信号的插入染料接触；和(iii)使用检测器随时间检测所发出的信号。在其他实施方式中，检测包括：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所产生的cDNA，则探针发出信号；和(iii)使用检测器检测探针所发出的信号。在其他实施方式中，探针附接至荧光团和猝灭剂。在其他实施方式中，通过测序进行检测。
[0022] 在一些实施方式中，当至少一种miRNA大于参考值至少2倍时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当至少一种miRNA小于参考值至少2倍时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miRNA-125b-5p上调、miR-150-5p上调、miR-342-3p上调、miR-145-5p上调、miR-143-3p上调、miR-500a-3p上调或者miR-18a-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当至少三种miRNA上调时诊断子宫内膜异位症，其中至少三种miRNA来自由以下各项组成的组：miRNA-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p和miR-18a-5p。在其他实施方式中，当miR-6755-3p下调或者miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miR-125b-5p上调、miR-451a上调并且miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在一些实施方式中，当miR-125b-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。在一些实施方式中，当let-7b上调时，诊断子宫内膜异位症。
[0023] 在一些实施方式中，受试者对KRAS变体等位基因的存在为阴性。在其他实施方式中，所检测的miRNA水平用于确定疾病严重程度。在其他实施方式中，受试者是人类受试者。
[0024] 在其他方面，本公开提供了治疗患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括与对比因子相比，对识别为在受试者的生物样品中具有至少一种选自由以下各项组成的组的miRNA差异水平的受试者施用子宫内膜异位症治疗：miR-18a-5p、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150-5p、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-
4668和miR-6755。在一些实施方式中，该方法还包括当与对比因子相比，将受试者识别为具有选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA差异水平时，诊断受试者患有子宫内膜异位症：miR-18a-5p、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150-5p、miR-214、miR-342、miR-
451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755。
4668和miR-6755。在一些实施方式中，该方法还包括当与对比因子相比，将受试者识别为具有选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA差异水平时，诊断受试者患有子宫内膜异位症：miR-18a-5p、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150-5p、miR-214、miR-342、miR-
451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755。
[0025] 在一些实施方式中，诊断受试者患有子宫内膜异位症包括提供来自受试者的生物样品并且与对比因子相比，在生物样品中检测选自由以下各项组成的组的至少一种miRNA的差异水平：miR-18a-5p、miR-125、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150-5p、miR-214、miR-342、miR-451、miR-500、miR-553、miR-3613、miR-4668和miR-6755。在一些实施方式中，至少一种miRNA为以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-
125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，至少一种miRNA为以下各项中的至少一种或以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，至少一种miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，至少一种miRNA为以下各项中的至少一种或以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，至少一种miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
[0026] 在一些实施方式中，生物样品为体液。在其他实施方式中，体液为血液、血浆或血清。在一些实施方式中，体液为唾液。在一些实施方式中，体液为尿液。
[0027] 在一些实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有早期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有中度至重度疾病的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有III期或IV期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断还包括监控受试者治疗后的miRNA表达水平的变化。
[0028] 在一些实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于95％的特异性或灵敏度。在其他实施方式中，治疗是药物治疗以缓解疼痛。在其他实施方式中，治疗是激素疗法。在其他实施方式中，治疗选自由以下各项组成的组：激素类避孕药、促性腺激素释放激素激动剂和促性腺激素释放激素拮抗剂。
[0029] 在一些实施方式中，该方法还包括通过实施聚合酶链反应(PCR)检测至少一种miRNA。在一些实施方式中，该方法还包括通过实施定量PCR检测至少一种miRNA。在一些实施方式中，该方法还包括通过以下各项检测至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与发出信号的插入染料接触；和(iii)使用检测器随时间检测所发出的信号。在其他实施方式中，该方法还包括通过以下方法检测至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所产生的cDNA，则探针发出信号；和(iii)使用检测器检测探针所发出的信号。在其他实施方式中，该方法还包括通过测序检测至少一种miRNA：在其他实施方式中，该方法还包括通过高通量测序或者大规模平行测序检测至少一种miRNA。
[0030] 在一些实施方式中，至少一种miRNA以大于参考值至少2倍的水平存在。在一些实施方式中，受试者对KRAS变体等位基因的存在为阴性。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。在一些实施方式中，将至少一种miRNA的水平用于确定疾病的严重程度。
[0031] 在一些实施方式中，当miRNA-125b-5p上调、miR-150-5p上调、miR-342-3p上调、miR-145-5p上调、miR-143-3p上调、miR-500a-3p上调或者miR-18a-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当至少三种miRNA上调时诊断子宫内膜异位症，其中至少三种miRNA来自由以下各项组成的组：miRNA-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p和miR-18a-5p。在其他实施方式中，当miR-6755-3p下调或者miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miR-125b-5p上调、miR-451a上调并且miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miR-125b-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。
[0032] 在另一个方面，本公开提供了诊断和治疗被怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括：(a)提供来自受试者的唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品，其中样品包含与子宫内膜异位症相关的miRNA；(b)检测与子宫内膜异位症相关的miRNA的水平；(c)将与子宫内膜异位症相关的miRNA的检测水平与参考值比较以确定液体样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平；(d)基于唾液、痰液、尿液、淋巴液、滑液、脑脊液、大便或粘液样品中与子宫内膜异位症相关的miRNA的相对水平诊断患有子宫内膜异位症的受试者，其中对患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的灵敏度或特异性；和(e)向诊断患有子宫内膜异位症的受试者施用治疗。
[0033] 在一些实施方式中，来自受试者的样品为唾液样品。在一些情况下，来自受试者的样品为尿液样品。在一些情况下，来自受试者的样品为粘液样品。
[0034] 在一些实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有早期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有中度至重度疾病的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有III期或IV期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断还包括监控受试者治疗后的miRNA表达水平的变化。
[0035] 在一些实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于95％的特异性或灵敏度。在其他实施方式中，治疗是药物治疗以缓解疼痛。在其他实施方式中，治疗是激素疗法。在其他实施方式中，治疗选自激素类避孕药、促性腺激素释放激素激动剂和促性腺激素释放激素拮抗剂。
[0036] 在一些实施方式中，该方法还包括通过实施聚合酶链反应(PCR)检测至少一种miRNA。在一些实施方式中，该方法还包括通过实施定量PCR检测至少一种miRNA。在一些实施方式中，该方法还包括通过以下方法检测至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与发出信号的插入染料接触；和(iii)使用检测器随时间检测所发出的信号。在其他实施方式中，该方法还包括通过以下方法检测至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所产生的cDNA，则探针发出信号；和(iii)使用检测器检测探针所发出的信号。在其他实施方式中，该方法还包括通过测序检测至少一种miRNA：在其他实施方式中，该方法还包括通过高通量测序或者大规模平行测序检测至少一种miRNA。
[0037] 在一些实施方式中，至少一种miRNA以大于参考值至少2倍的水平存在。在一些实施方式中，受试者对KRAS变体等位基因的存在为阴性。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。在一些实施方式中，将至少一种miRNA的水平用于确定疾病的严重程度。
[0038] 在一些实施方式中，当miRNA-125b-5p上调、miR-150-5p上调、miR-342-3p上调、miR-145-5p上调、miR-143-3p上调、miR-500a-3p上调或者miR-18a-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当至少三种miRNA上调时诊断子宫内膜异位症，其中至少三种miRNA来自由以下各项组成的组：miRNA-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p和miR-18a-5p。在其他实施方式中，当miR-6755-3p下调或者miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miR-125b-5p上调、miR-451a上调并且miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miR-125b-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。
[0039] 在另一个方面，本公开提供了诊断和治疗被怀疑患有子宫内膜异位症的受试者的方法，该方法包括：(a)检测非let-7、miR-449a、miR-34c、miR-200a、miR-200b、miR-150、miR-18a或miR-141的至少一种miRNA的存在；(b)当所检测的miRNA水平高于阈值水平时，诊断受试者患有子宫内膜异位症，其中患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于90％的特异性或灵敏度；和(c)向诊断患有子宫内膜异位症的受试者施用治疗。
[0040] 在一些实施方式中，至少一种miRNA包括miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在其他实施方式中，至少一种miRNA为miR-125b-5p。在其他实施方式中，至少一种miRNA为miR-3613-5p。在其他实施方式中，至少一种miRNA为无细胞miRNA。在其他实施方式中，至少一种miRNA以与对比因子相比至少2倍变化存在。
[0041] 在一些实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有早期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有中度至重度疾病的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断是患有III期或IV期子宫内膜异位症的受试者的诊断。在其他实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断还包括监控受试者治疗后的miRNA表达水平的变化。
[0042] 在一些实施方式中，患有子宫内膜异位症的受试者的诊断具有大于95％的特异性或灵敏度。在其他实施方式中，治疗是药物治疗以缓解疼痛。在其他实施方式中，治疗是激素疗法。在其他实施方式中，治疗选自由以下各项组成的组：激素类避孕药、促性腺激素释放激素激动剂和促性腺激素释放激素拮抗剂。
[0043] 在一些实施方式中，该方法还包括通过实施聚合酶链反应(PCR)检测至少一种miRNA。在一些实施方式中，该方法还包括通过实施定量PCR检测至少一种miRNA。在一些实施方式中，该方法还包括通过以下方法检测至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与发出信号的插入染料接触；和(iii)使用检测器随时间检测所发出的信号。在其他实施方式中，该方法还包括通过以下方法检测至少一种miRNA：(i)通过使用特异性结合至少一种miRNA的引物或者使用通用引物实施反转录测定扩增样品内的miRNA，由此产生cDNA；(ii)将所产生的cDNA与对至少一种miRNA特异的探针接触，其中一旦结合所产生的cDNA，则探针发出信号；和(iii)使用检测器检测探针所发出的信号。在其他实施方式中，该方法还包括通过测序检测至少一种miRNA：在其他实施方式中，该方法还包括通过高通量测序或者大规模平行测序检测至少一种miRNA。
[0044] 在一些实施方式中，至少一种miRNA以大于参考值至少2倍的水平存在。在一些实施方式中，受试者对KRAS变体等位基因的存在为阴性。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。在一些实施方式中，将至少一种miRNA的水平用于确定疾病的严重程度。
[0045] 在一些实施方式中，当miRNA-125b-5p上调、miR-150-5p上调、miR-342-3p上调、miR-145-5p上调、miR-143-3p上调、miR-500a-3p上调或者miR-18a-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当至少三种miRNA上调时诊断子宫内膜异位症，其中至少三种miRNA来自由以下各项组成的组：miRNA-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p和miR-18a-5p。在其他实施方式中，当miR-6755-3p下调或者miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miR-125b-5p上调、miR-451a上调并且miR-3613-5p下调时，诊断子宫内膜异位症。在其他实施方式中，当miR-125b-5p上调时，诊断子宫内膜异位症。
[0046] 在另一个方面，本公开提供了诊断受试者中子宫内膜异位症的方法。在一些实施方式中，该方法包括确定受试者生物样品中的至少一种miRNA的水平，其中miRNA为选自由以下各项组成的组中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668；并且将生物样品中的至少一种miRNA的水平与对比因子中的至少一种miRNA的水平相比较，其中当生物样品中的至少一种miRNA的水平不同于所述对比因子中的至少一种miRNA的水平时，将受试者诊断为患有子宫内膜异位症。在一些实施方式中，该方法还包括治疗受试者的子宫内膜异位症的步骤。
[0047] 在一些实施方式中，至少一种miRNA为miR-125、miR-451和miR-3613的组合。
[0048] 在一些实施方式中，受试者为人。
[0049] 在一些实施方式中，对比因子为选自阳性对照、阴性对照、正常对照、野生型对照、历史对照和历史标准的至少一种对比因子。
[0050] 在一些实施方式中，本公开提供了诊断受试者中子宫内膜异位症的方法，其中该方法包括与对比因子中的水平相比，检测生物样品中miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214和miR-126中的至少一种的水平的升高。在另一个实施方式中，本公开提供了诊断受试者中子宫内膜异位症的方法，其中该方法包括与对比因子中的水平相比，检测生物样品中miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668中的至少一种的水平的降低。
[0051] 在一些实施方式中，至少一种miRNA水平的确定使用了选自反转录、PCR和微阵列的至少一种技术。
[0052] 在一些实施方式中，生物样品选自血液、血清、血浆以及它们的任何组合。
[0053] 在另一个方面，本公开还提供了受试者中诊断或提供子宫内膜异位症预后的方法，该方法包括以下步骤：在怀疑或患有子宫内膜异位症的受试者的生物样品中检测选自由以下各项组成的组的至少一种基因表达的改变：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。
[0054] 在一些实施方式中，至少一种基因为miR-125、miR-451和miR-3613的组合。
[0055] 在一些实施方式中，生物样品选自血液、血清、血浆以及它们的任何组合。
[0056] 本公开还提供了试剂盒，其包含选择性结合至少一种miRNA的试剂，其中的至少一种miRNA为选自由以下各项组成的组中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。在一些实施方式中，试剂盒包含至少三种试剂，其中第一试剂选择性结合miR-125，其中第二试剂选择性结合miR-451，并且其中第三试剂选择性结合miR-3613。
[0057] 在另一个方面，本公开提供了治疗患有子宫内膜异位症的受试者的方法，包括向受试者施用子宫内膜异位症治疗，该受试者已识别为具有与对比因子相比、在该受试者的生物样品中选自由以下各项组成的组的至少一种的差异水平：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。
[0058] 在另一个方面，本公开提供了监控正在治疗子宫内膜异位症的受试者中对子宫内膜异位症治疗的响应的方法，该方法包括确定受试者的生物样品中的至少一种miRNA的水平，其中miRNA为选自由以下各项组成的组中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668，并且将生物样品中的至少一种miRNA的水平与对比因子中的至少一种miRNA的水平相比较。
附图说明
附图说明
[0059] 当结合附图阅读时，会更好地理解本公开的优选实施方案的下列详细说明。出于说明本公开的目的，在附图中显示了本发明优选的实施方式。然而，应理解本公开不限于附图中所示的实施方式的精确布置和方法。
[0060] 图1是显示微阵列分析中差异表达的miRNA的结果的图像。
[0061] 图2包括图2A和图2B，它是显示如通过实时定量PCR所确定的在子宫内膜异位症和对照组中差异表达的miRNA的结果的一组图像。p-值基于使用Mann-Whitney U检验的分析。
[0062] 图3包括图3A、图3B、图3C和图3D，它是显示差异表达的miRNA的AUC值的结果的一组图像。图3A是显示血清miR-125b-5p、miR-150-5p和miR-342-3p的接受器工作特征(ROC)曲线分析的图像。图3B是显示血清miR-451a、miR-500a-3p、miR-143-3p的ROC曲线分析的图像。图3C是显示血清miR-18a-5p、miR-6755-3p和miR-3613-5p的ROC曲线分析的图像。miR-125b-5p(图3A)显示出0.974的最高AUC。图3D是显示血清miR-125-b-5p、miR-451a和miR-
3613-5p的组合显示出1.000的最高AUC值的图像。
3613-5p的组合显示出1.000的最高AUC值的图像。
[0063] 图4是显示如通过实时定量PCR所确定的，狒狒中子宫内膜异位症和治疗组中miRNA的相对表达结果的图像。p-值基于使用Mann-Whitney U检验的分析。
[0064] 图5是显示子宫内膜异位症和对照组中唾液中miRNA的相对表达结果的图像。
[0065] 图6是显示子宫内膜异位症和对照组中唾液中miRNA的相对表达结果的图像。
[0066] 图7是显示经历腹腔镜检查或剖腹术的确认存在子宫内膜异位症(疾病组)或者显示其他良性病变(对照组)的妇女的血清中miRNA表达水平的图像。
具体实施方式
[0067] 本公开涉及以下发现：特定微小RNA(miRNA)的表达水平与子宫内膜异位症，如增生期期间的子宫内膜异位症有关。因此，在本文所描述的多个实施方式中，本公开的方法涉及诊断受试者患有子宫内膜异位症的方法、评价受试者患有或发展子宫内膜异位症的风险的方法、评价受试者子宫内膜异位症的严重程度的方法、在临床试验中划分患有子宫内膜异位症的受试者的方法和监控受试者中子宫内膜异位症治疗的方法。因此，本公开涉及基于与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的表达水平，用于检测和定量miRNA以用于诊断、评价和鉴定对其有需要的受试者中子宫内膜异位症的组合物和方法。本公开的标志物可以用于筛选、诊断、监控子宫内膜异位症的发病、监控子宫内膜异位症的发展和评价子宫内膜异位症的治疗。本公开的标志物可以用于建立和评价治疗计划。
[0068] 在一些实施方式中，与子宫内膜异位症相关的miRNA是子宫内膜异位症的标志物或生物标志物。在多个实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的一种或多种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-
126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括miR-125b、miR-451和miR-3613的组合。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，所述生物标志物是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-
5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，生物标志物还可以包含miR-451。
126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括miR-125b、miR-451和miR-3613的组合。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，所述生物标志物是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-
5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，生物标志物还可以包含miR-451。
[0069] 在一些实施方式中，与子宫内膜异位症相关的miRNA是子宫内膜异位症的标志物或生物标志物。在多个实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的一种或多种：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-
3p。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p的组合。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-
5p。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，生物标志物还可以包括let-7b。
3p。在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p的组合。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-
5p。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，生物标志物还可以包括let-7b。
[0070] 在一些实施方式中，本公开提供了预测个体发展子宫内膜异位症的风险的标志物。在一些实施方式中，本公开的标志物可以在可以施用预防性疗法从而防止疾病发生时预测风险。
[0071] 在一些实施方式中，本公开的标志物是子宫内膜异位症的无创生物标志物，其使得能够在不使用手术程序的情况下早期检测疾病。例如，患有子宫内膜异位症的受试者的生物样品中特定miRNA表达的改变可以与其他临床参数相关，其他临床参数如盆腔疼痛、不育和疾病复发。因此，本公开的标志物不仅可以用作疾病的生物标志物，而且还可以用作预后和复发的标志物。由于可以避免在诊断子宫内膜异位症和相关并发症的领域中使用的重复手术程序，因此这具有优势。
[0072] 本公开提供了用于子宫内膜异位症的诊断和预后的生物标志物。通常，本公开的方法在通过检测在来自患者的血液、血浆或血清中差异表达(上调或下调)的生物标志物的表达水平来诊断子宫内膜异位症或者提供子宫内膜异位症预后中有用。类似地，这些标志物可以用于诊断患有子宫内膜异位症的患者中生育力的降低或者在经受子宫内膜异位症的患者中提供生育试验的预后。本公开还提供了标识用于治疗或预防子宫内膜异位症的化合物的方法。本公开提供了用于子宫内膜异位症的诊断或预后的试剂盒。
[0073] 定义
[0074] 除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域技术人员通常理解的含义相同。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文所描述的那些类似或等价的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。
[0075] 如本文所使用的，下列术语中的每一个具有在本部分中与之相关的含义。
[0076] 在本文中，使用冠词“一个(a)”和“一种(an)”表示一个或多于一个(即，至少一个)语法上的物品对象。举例来说，“一个要素”表示一个要素或多于一个要素。
[0078] 当在生物体、组织、细胞或其组分的背景中使用时，术语“异常”是指那些生物体、组织、细胞或其组分在至少一个可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、当日时间等)中不同于显示“正常”(预期)各个特征的那些生物体、组织、细胞或其组分。对一种细胞或组织类型正常或预期的特征可以对不同的细胞或组织类型是异常的。
[0079] 如本文所使用的，“反义”是指与靶标序列互补，如(举例来说)与靶标miRNA序列，包括但不限于成熟靶标miRNA序列或其子序列互补的核酸序列。通常，反义序列与整个反义核酸序列全长的靶标序列完全互补。
[0080] 如本文所使用的，术语“体液”(“body fluid”或“bodily fluid”)是指来自动物身体的任何流体。体液的实例包括但不限于血浆、血清、血液、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液、唾液、粘液、痰(phlegm)和痰液(sputum)。可以通过任何适合的方法收集体液样品。体液样品可以立即使用或者可以储存随后使用。本领域中已知的任何适合的储存方法可以用于储存体液样品：例如，可以将样品在约-20℃至约-70℃冷冻。适合的体液是无细胞流体。“无细胞”流体包括其中不存在细胞或者细胞以较低的量存在从而所确定的miRNA水平反映了它在样品的液体部分中的水平，而不是在细胞部分中的水平的体液样品。通常，例如通过离心或过滤处理含有细胞的体液以除去细胞，从而产生这类无细胞体液。通常，无细胞体液不包含完整细胞，但是，一些无细胞体液可以含有细胞片段或细胞碎屑。无细胞流体的实例包括血浆或血清，或者已除去细胞的体液。
[0081] 如本文所使用的，术语“无细胞”是指在核酸如在从身体获得样品之前在身体中直接存在的状况。例如，核酸可以以其中它们不与细胞结合的无细胞状态存在于体液，如血液或唾液中。然而，在进入血流或其他体液之前，无细胞核酸最初可以与细胞，如子宫内膜细胞结合。相反，通常认为仅在体内与细胞结合的核酸不是“无细胞的”。例如，通常认为从细胞样品提取的核酸不是如该术语在本文中所使用的“无细胞的”。
[0082] 如本文所使用的，术语“临床因素”是指开业医生在确定疾病诊断或预后时可以考虑的任何数据。这些因素包括但不限于患者病史、患者的身体检查、全血细胞计数、酶活性分析、细胞检测、细胞遗传学和血细胞的免疫分型。
[0083] 如本文所使用的“互补的”是指两个核酸之间亚单位序列互补性的宽泛概念。当两个分子中的核苷酸位置被通常能够彼此碱基配对的核苷酸所占据时，则认为核酸在该位置彼此互补。因此，当每个分子中至少约50％，优选地至少约60％，并且更优选地至少约80％的相应位置被通常彼此碱基配对的核苷酸(例如，A:T和G:C核苷酸对)所占据时，所述两个核酸彼此基本互补。
[0084] 如本文所使用的，术语“诊断”表示检测疾病或病症或者确定疾病或病症的阶段或程度。通常，疾病或病症的诊断基于指示疾病的一个或多个因素和/或症状的评价。也就是说，可以基于指示疾病或病况存在与否的因素的存在、不存在或量来做出诊断。认为是用于特定疾病诊断的指示的每个因素或症状不需要唯一地相关于特定疾病；即存在可以根据诊断因素或症状推断的识别诊断。同样地，可能存在其中指示特定疾病的因素或症状存在于未患有特定疾病的个体中的情况。可以独立使用或者与医学领域对于特定疾病或病症已知的其他诊断和/或分级方法结合使用所述诊断方法。
[0085] 如本文所使用的，短语“水平差异”是指与对照或参考水平相比，样品中特定标志物，如核酸或蛋白质的量的差异。例如，与参考水平相比，特定生物标志物的量可以在患有疾病的患者样品中以升高的量或者以降低的量存在。在一些实施方式中，“水平差异”可以是与对照相比，存在于样品中的特定生物标志物的量之间至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约
35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％或以上的差异。在一些实施方式中，“水平差异”可以是与对照相比，存在于样品中的生物标志物的量之间的统计学显著的差异。例如，如果所测量的生物标志物的水平在任何对照或参考组的平均值的约1.0倍标准偏差、约1.5倍标准偏差、约2.0倍标准偏差或者约2.5倍标准偏差以外，则差异可以是统计学显著的。
35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％或以上的差异。在一些实施方式中，“水平差异”可以是与对照相比，存在于样品中的生物标志物的量之间的统计学显著的差异。例如，如果所测量的生物标志物的水平在任何对照或参考组的平均值的约1.0倍标准偏差、约1.5倍标准偏差、约2.0倍标准偏差或者约2.5倍标准偏差以外，则差异可以是统计学显著的。
[0086] “疾病”是其中动物不能维持体内平衡、并且其中如果疾病不能得到改善那么动物的健康持续恶化的动物健康状态。
[0087] 相反，在动物中“病症”是其中动物能够维持体内平衡、但是其中动物的健康状态不如没有病症时那样好的健康状态。保持不治疗时，病症不必然引起动物健康状态的进一步降低。
[0088] 如果疾病或病症的病征或症状的严重程度、患者经受这种病征或症状的频率或两者降低，则疾病或病症“缓解”。
[0089] 术语“对比因子”描述了不包含，或者包含正常水平、低水平或高水平的本公开的一种或多种标志物(或生物标志物)的一种或多种标志物(或生物标志物)的表达产物的材料，从而对比因子可以用作样品可以对其进行比较的对照或参考标准。
[0090] 如本文所使用的，术语“调控异常的”和“调控异常”描述了与对比因子样品中的miRNA的表达水平相比，在得自受试者的样品中存在并检测到的miRNA的表达水平的降低(下调)或升高(上调)，对比因子样品如得自一个或多个正常、无风险受试者，或者在不同时间点得自相同受试者的对比因子样品。在一些情况下，将miRNA表达水平与得自不止一个无风险个体的平均值相比较。在其他情况中，将miRNA的表达水平与得自一个正常、无风险受试者的样品中所评估的miRNA水平相比较。
[0091] 短语“确定标志物(或生物标志物)的表达水平”表示使用技术人员可用于检测任何标志物表达产物的足够部分的技术，在核酸或蛋白水平对样品中标志物的表达程度的评价。
[0092] 术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”是可互换使用的并且包括定量和定性测量两者，并且包括确定是否存在特征、性状或特点。估计可以是相对的或绝对的。“对存在性的评估”包括确定所存在的某物的量，以及确定它是否存在。
[0093] “差异提高的表达”或者“上调”是指与对比因子相比，至少10％或以上，例如，20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或以上更高的，和/或1.1倍、1.2倍、1.4倍、
1.6倍、1.8倍、2.0倍或以上更高的表达水平以及它们之间任何和全部的完全或部分增加。
1.6倍、1.8倍、2.0倍或以上更高的表达水平以及它们之间任何和全部的完全或部分增加。
[0094] “差异降低的表达”或者“下调”是指与对比因子相比，至少10％或以上，例如，20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或以下更低的，和/或2.0倍、1.8倍、1.6倍、
1.4倍、1.2倍、1.1倍或以下更低的表达水平以及它们之间任何和全部的完全或部分增加。
1.4倍、1.2倍、1.1倍或以下更低的表达水平以及它们之间任何和全部的完全或部分增加。
[0095] 如本文所使用的“内源的”是指来自生物、细胞、组织或系统或者在它们内部产生的任何材料。
[0096] 如本文所使用的，术语“表达”的定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0097] 如本文所使用的“同源的”是指两个聚合物分子之间，例如，两个核酸分子之间，例如，两个DNA分子或两个RNA分子之间，或者两个多肽分子之间的亚单位序列相似性。当两个分子中的亚单位位置被相同单体亚单位占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接的函数，例如，如果两个化合物序列中的位置的一半(例如，长度10个亚单位的聚合物中的5个位置)是同源的，则所述两个序列是50％同源的，如果所述位置的90％，例如，10个中有9个是匹配或同源的，则所述两个序列具有90％的同源性。举例来说，DNA序列5'-ATTGCC-3'和5'-TATGGC-3'具有50％的同源性。
[0098] 如本文所使用的，与“同一性”同义地使用“同源性”。
[0099] 标志物的“抑制剂(抑制子，inhibitor)”、“激活剂(激活子，activator)”和“调节剂(调节子，modulator)”用于表示使用子宫内膜异位症生物标志物的体外和体内测定所识别的激活、抑制或调节分子。例如，抑制剂是结合至子宫内膜异位症生物标志物、部分或完全阻断活性、降低、防止、迟延激活、失活、弱化或下调子宫内膜异位症生物标志物的活性或表达的化合物。“激活剂”是提高、打开、激活、促进、提高激活、敏化、加强(agonize)或上调子宫内膜异位症生物标志物的活性的化合物，例如，激动剂。抑制剂、激活剂或者调节剂还包括子宫内膜异位症生物标志物的基因修饰的形式，例如，具有改变的活性的形式，以及天然存在的和合成的配基、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核糖酶、RNAi、微小RNA和siRNA分子、小有机分子等。用于抑制剂和激活剂的这些测定包括(例如)在细胞或细胞提取物中体外表达子宫内膜异位症生物标志物、应用假定的调节剂化合物，然后确定的活性的功能影响，如在本文其他地方所述的。
[0100] 如本文所使用的，“说明材料”包括出版物、录像、图表或任何其他表达媒介，其可以用于传达试剂盒中本公开所述的化合物、组合物、载体、方法或递送系统对于引起本文列举的多种疾病或病症的减轻的有用性。任选地或替代地，所述教材可以描述减轻哺乳动物细胞或组织中疾病或病症的一种或多种方法。例如，本公开所述的试剂盒的说明材料可以附在包含本公开所识别的化合物、组合物、载体或递送系统的盒上，或者与包含所识别的化合物、组合物、载体或递送系统的盒一起运输。可替代地，所述说明材料可以与所述盒分开运输，旨在受体协同使用所述说明材料和所述化合物。
[0101] 如本文所使用的，“分离的”表示通过人直接或间接的操作，从天然状态改变或除去。例如，在活的动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态中共存的材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本纯化的形式存在，或者可以在非天然环境中存在，如，例如宿主细胞。
[0102] “测量”(“Measuring”或“measurement”)，或者可替代地“检测”(“detecting”或“detection”)，表示评价临床或受试者来源的样品内，任一种给定物质的存在、不存在、量(其可以是有效量)，包括获得这些物质的定性或定量浓度水平，或者另外评价受试者临床参数的值或分类。
[0103] 如本文所使用的，“微小RNA”或“miRNA”描述了小非编码RNA分子，其长度通常约15至约50个核苷酸，优选地17-23个核苷酸，其可以在通过(例如)称为RNA干扰(RNAi)的方法调控基因表达中起作用。RNAi描述了其中与靶标基因信使RNA(mRNA)中序列互补或反义的RNA序列的存在导致所述靶标基因表达的抑制的现象。miRNA是通过RNA酶III顺序切割、从衍生自初级转录本(pri-miRNA)的约70个或更多核苷酸的发夹前体(pre-miRNA)加工得到的。miRBase是位于www.mirbase.org的综合性微小RNA数据库，出于所有目的将该数据库以其全部内容作为参考并入本文。
[0104] 如本文所使用的，“突变”是指相对于参考序列(其优选地是天然存在的正常或“野生型”序列)核酸或多肽序列的变化，并且包括易位、缺失、插入和取代/点突变。如本文所使用的“突变体”是指包含突变的核酸或蛋白。
[0105] 如本文所使用的“天然存在的”描述了与人工产生的不同的，天然存在的组合物。例如，可以分离自天然来源的生物中存在的并且未人为有意修饰的核苷酸序列是天然存在的。
[0106] “核酸”表示任何核酸，无论是由脱氧核糖核苷或核糖核苷组成，并且无论是由磷酸二酯键或修饰的键，如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥联的氨基磷酸酯、桥联的亚甲基膦酸酯、硫代磷酯、膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥联的硫代磷酯或者砜键以及这些键的组合组成。术语核酸还具体地包括由除了5个生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基组成的核酸。
[0107] 在本文中使用常规表示法来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左端为5'-端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'-方向。
[0108] 将核苷酸在5'至3'方向添加至新生RNA转录本称为转录方向。将作为mRNA具有相同序列的DNA链称为“编码链”。将位于DNA上参考点5'方向的DNA链上的序列称为“上游序列”。将位于DNA上参考点3'方向的DNA链上的序列称为“下游序列”。
[0109] 如本文所使用的，“多核苷酸”包括cDNA、RNA、DNA/RNA杂交体、反义RNA、siRNA、miRNA、基因组DNA、合成形式和混合聚合物(有义链和反义链两者)，并且它可以化学或生物化学修饰以包含非天然或衍生化的、合成的或半合成的核苷酸碱基。野生型或合成基因的改变也包括在本公开的范围内，其包括但不限于一个或多个核苷酸的缺失、插入、替代，或者融合至其他多核苷酸序列。
[0110] 如本文所使用的，用于扩增的“引物”是特异性退火至靶标或标志物核苷酸序列的寡核苷酸。对于通过聚合酶的最优引物延伸，引物的3'核苷酸应在相应核苷酸位置与靶标或标志物序列相同。如本文所使用的，“正向引物”是退火至双链DNA(dsDNA)的反义链的引物。“反向引物”退火至dsDNA的有义链。
[0111] 如本文所使用的，术语“重组DNA”的定义为通过连接来自不同来源的DNA的段(piece)所产生的DNA。
[0112] 如本文所使用的，术语“提供预后”是指提供子宫内膜异位症的可能过程和结局的预测，包括严重程度、持续时间、恢复机会等的预测。该方法还可以用于设计适合的治疗计划，例如，通过指示病况是否仍处于早期或者病况是否进入到积极疗法将无效的阶段。
[0113] 生物标志物的“参考水平”表示指示特定疾病状态、表型或其缺失，以及疾病状态、表型的组合或其缺失的生物标志物水平。生物标志物的“阳性”参考水平表示指示特定疾病状态或表型的水平。生物标志物的“阴性”参考水平表示指示缺少特定疾病状态或表型的水平。
[0114] 如本文所使用的“样品”或“生物样品”表示分离自个体的生物材料。生物样品可以含有适合于检测所期望的生物标志物的任何生物材料，并且可以包含得自个体的细胞和/或非细胞材料。
[0115] 如本文所使用的“标准对照值”是指在生物样品中可检测的特定蛋白质或核酸的预定的量。标准对照值适合于本公开的方法的使用，以用于比较存在于生物样品中的所关心的蛋白质或核酸的量。用作标准对照的所建立的样品提供了对于具有合理匹配背景，例如，性别、年龄、种族和病史的平均、健康的人来说典型的生物样品中所关心的蛋白质或核酸的平均的量。标准对照值可以基于所关心的蛋白质或核酸以及样品(例如，血清)的性质而改变。
[0116] 术语“受试者”、“患者”、“个体”等在本文中是可互换使用的并且表示无论体外或原位受本文所描述的方法作用的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方式中，所述患者、受试者或个体是人。
[0117] 术语“低表达”、“低表达的”或“下调的”可互换地表示与来自未患有子宫内膜异位症的妇女的生物样品相比，在来自子宫内膜异位症妇女的生物样品中以可检测地更低的水平转录或翻译的蛋白质或核酸。该术语包括与对照相比，由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如，细胞器、细胞质、核、细胞表面)以及RNA和蛋白质的稳定性所造成的低表达。可以使用用于检测mRNA(即，Q-PCR、RT-PCR、PCR、杂交)或蛋白质(即，ELISA、免疫组织化学技术)的常规方法来检测低表达。低表达可以是与对照相比小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在某些情况下，低表达为与对照相比，1-、2-、3-、4-、5-、
6-、7-、8-、9-、10倍或更多倍的较低的转录或翻译水平。
6-、7-、8-、9-、10倍或更多倍的较低的转录或翻译水平。
[0118] 术语“过表达”、“过表达的”或“上调的”可互换地表示与来自未患有子宫内膜异位症的妇女的生物样品相比，通常在来自子宫内膜异位症妇女的生物样品中，以可检测地更高的水平转录或翻译的蛋白质或核酸(RNA)。该术语包括与来自未患有子宫内膜异位症的妇女的细胞相比，由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如，细胞器、细胞质、核、细胞表面)以及RNA和蛋白质的稳定性所造成的过表达。可以使用用于检测mRNA(即，Q-PCR、RT-PCR、PCR、杂交)或蛋白质(即，ELISA、免疫组织化学技术)的常规方法来检测过表达。过表达可以是与来自未患有子宫内膜异位症的妇女的细胞相比大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在某些情况下，过表达为与来自未患有子宫内膜异位症的妇女的细胞相比，1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10倍或更多倍的更高的转录或翻译水平。
[0119] 作为在本文中使用的术语“变体”是分别与参考核酸序列或肽序列在序列方面存在差异，但保留了参考分子的必需性质的核酸序列或肽序列。核酸变体序列的变化可以不改变参比核酸所编码的肽的氨基酸序列，或者可以导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。肽变体序列的改变通常是有限或保守的，从而参比肽和变体的序列在整体上非常类似并且在多个区域中相同。变体和参比肽可以在氨基酸序列方面以任何组合相差一个或多个取代、添加、缺失。核酸或肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者可以是未知或非天然存在的变体。可以通过突变技术或通过直接合成制备核酸和肽的非天然存在的变体。
[0120] 如本文所使用的，术语“治疗”、“缓解”和“处置”是可互换使用的。这些术语表示获得有益或所期望的结果，包括但不限于治疗益处和/或预防益处的方法。治疗益处表示正在治疗的潜在病症的根除或改善。另外，通过与潜在病症有关的一种或多种生理学症状的根除或改善来实现治疗益处，从而在所述患者中观察到改善，尽管所述患者仍可以受潜在病症的折磨。对于预防益处，可以将治疗施用于具有发展特定疾病的风险的患者，或者施用于报告一种或多种疾病生理学症状的患者，即使可能尚未作出对该疾病的诊断。
[0121] 除非上下文中另外规定，否则如本文和整个发明公开中所使用的术语“或”一般表示“和/或”。
[0122] 如本文所使用的，术语“循环miRNA”是指体液中的任何miRNA，而不考虑体液是否是传统上所认为的循环系统的一部分。例如，“循环miRNA”将涵盖存在于受试者血液中的miRNA并且还将涵盖存在于受试者唾液、尿液或其他体液中的miRNA。
[0123] 范围：贯穿本公开，本公开的多个方面可以以范围形式存在。应理解以范围形式进行说明仅是为了方便和简洁，并不应将其视作对本公开范围刻板的限制。因此，范围的说明应认为具有具体公开的所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围的说明(如1至6)应认为具有具体公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不考虑范围的宽度，这都是适用的。
[0124] 描述
[0125] 在一个方面，本公开涉及子宫内膜异位症和循环miRNA水平变化之间联系的发现。在一些实施方式中，将循环miRNA水平，单独地以及与常规子宫内膜异位症血清标志物结合，用于改善子宫内膜异位症的检测。在示例性实施方式中，miRNA选自由以下各项组成的组：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668以及它们的任何组合。在示例性实施方式中，miRNA选自由以下各项组成的组：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-
5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-
3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p以及它们的任何组合。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-
342和miR-3613。在一些情况下，本公开所述的miRNA还包括let-7b。
5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-
3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p以及它们的任何组合。在一些实施方式中，miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-
342和miR-3613。在一些情况下，本公开所述的miRNA还包括let-7b。
[0126] 在一个方面，该方法通常提供患者样品中循环miRNA类型的检测、测量和比较。在其他方面，该方法通常提供存在于体液样品(例如，血液、血浆、血清、唾液、尿液)中的miRNA类型的检测、测量和比较。在子宫内膜异位症的背景中，经常难以接近患病细胞。照此，使用相对无创方法，如抽血或采集唾液来检测子宫内膜异位症的方法将非常有益。在多个实施方式中，本发明的方法克服了通过确定患有肝病的患者血浆中miRNA的水平来进行癌症诊断的问题。相对于对照样品中相应miRNA基因产物的水平，得自受试者的样品中miRNA基因产物水平的改变(即升高或降低)指示了受试者中子宫内膜异位症的存在。在一些实施方式中，测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平大于对照样品中相应miRNA基因产物的水平。在另一个实施方式中，测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平小于对照样品中相应miRNA基因产物的水平。
[0127] 其他诊断标志物可以与循环miRNA水平组合以构建预测疾病存在或不存在或阶段的模型。例如，与子宫内膜异位症疾病的诊断有关的临床因素包括但不限于患者病史、身体检查及其他生物标志物。还可以通过患者症状，包括症状类型、症状持续时间和症状程度来告知子宫内膜异位症的诊断。
[0128] 通常，本公开的方法在通过检测在来自患者的血液或血清中差异表达(上调或下调)的生物标志物的表达水平来诊断子宫内膜异位症或者提供子宫内膜异位症预后中有用。这些标志物可以用于区分子宫内膜异位症的阶段或严重程度。这些标志物还可以用于在患有子宫内膜异位症的患者中提供治疗过程的预后。类似地，这些标志物可以用于诊断患有子宫内膜异位症的患者中的不育或者在经受子宫内膜异位症的患者中提供生育试验的预后。本公开的生物标志物可以单独使用或者可以组合用于子宫内膜异位症的诊断或预后。
[0129] 在一些实施方式中，本公开的方法在对经受子宫内膜异位症的患者指定治疗中有用。通过检测本文所发现的生物标志物的表达水平，可以将适合的治疗指定给经受子宫内膜异位症的患者。这些治疗可以包括但不限于激素疗法、化疗、免疫疗法和外科治疗。类似地，本公开的方法可以用于对由于子宫内膜异位症而生育力降低的患者指定治疗。以这种方式，通过确定患者生育力降低的程度，通过本文所发现的生物标志物的检测，可以指定适当的治疗。相关治疗包括但不限于激素疗法、化疗、免疫疗法和外科治疗。
[0130] 本文提供了包含所用的一种或多种标志物的诊断和预后试剂盒。本公开还提供了通过调节所识别的基因亚型的任一种中所发现的标志物的表达水平或活性，用于识别能够预防或治疗子宫内膜异位症或者由子宫内膜异位症所引起的生育力降低的化合物的方法。提供了治疗方法，其中使用靶向本公开的标志物的试剂治疗子宫内膜异位症或者由子宫内膜异位症所引起的生育力降低。
[0131] 在多个实施方式中，本公开的方法涉及评估受试者患有或发展子宫内膜异位症的风险的方法、评价受试者子宫内膜异位症的严重程度的方法、诊断子宫内膜异位症的方法、识别子宫内膜异位症的方法和在临床试验中划分患有子宫内膜异位症的受试者的方法。
[0132] 在本文所描述的本公开的组合物和方法的多个实施方式中，与子宫内膜异位症相关的miRNA为以下miRNA中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。miRNA家族成员的序列可公开得自(www.mirbase.org)上的miRBase。在一些实施方式中，与子宫内膜异位症相关的miRNA为以下miRNA中的至少一种，或者还包含以下miRNA中的一种：let-
7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-7g。在一些实施方式中，与子宫内膜异位症相关的miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-
5p。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-7g。在一些实施方式中，与子宫内膜异位症相关的miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-
5p。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
[0133] 在本文所描述的本公开的组合物和方法的多个实施方式中，与子宫内膜异位症相关的miRNA为以下miRNA中的至少一种：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-
3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。miRNA家族成员的序列可公开得自
(www.mirbase.org)上的miRBase。
3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。miRNA家族成员的序列可公开得自
(www.mirbase.org)上的miRBase。
[0134] 在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的一种或多种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18a、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的本公开的生物标志物包括以下各项中的一种或多种：miR-125b、miR-150、miR-342、miR-
145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的本公开的生物标志物包括miR-125b、miR-451和miR-3613的组合。在其他实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物还包括以下各项中的一种或多种：let-7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-7g。在一些具体情况下，生物标志物还包括let-7b。
在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-
150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，生物标志物还可以包括miR-451。
145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的本公开的生物标志物包括miR-125b、miR-451和miR-3613的组合。在其他实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物还包括以下各项中的一种或多种：let-7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-7g。在一些具体情况下，生物标志物还包括let-7b。
在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-
150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，生物标志物还可以包括miR-451。
[0135] 在一些实施方式中，本公开的生物标志物包括以下各项中的一种或多种：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-
18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的本公开的生物标志物包括以下各项中的一种或多种：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。在优选的实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的本公开的生物标志物包括miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p的组合。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-
3613-5p。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，它们还可以包括miR-451。在一些情况下，它们还可以包括let-7b。
18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的本公开的生物标志物包括以下各项中的一种或多种：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。在优选的实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的本公开的生物标志物包括miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p的组合。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物包括以下各项中的至少两种：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-
3613-5p。在一些实施方式中，用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物包括以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些情况下，它们还可以包括miR-451。在一些情况下，它们还可以包括let-7b。
[0136] 在一些实施方式中，本公开的生物标志物为下调的或者以低于正常水平表达的一种或多种与子宫内膜异位症相关的miRNA。例如，本文描述了在患有子宫内膜异位症的受试者中miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668下调或者以低于正常水平表达。因此，在某些实施方式中，本公开涉及基于miR-6755、miR3613、miR-553和miR-4668中的至少一种的水平降低的检测，用于诊断、评估和表征对其有需要的受试者中子宫内膜异位症的组合物和方法。
[0137] 在一些实施方式中，本公开的生物标志物为下调的或者以低于正常水平表达的一种或多种与子宫内膜异位症相关的miRNA。例如，本文描述了在患有子宫内膜异位症的受试者中miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p下调或者以低于正常水平表达。因此，在某些实施方式中，本公开涉及基于miR-6755-3p、miR3613-5p、miR-553和miR-4668-3p中的至少一种的水平降低的检测，用于诊断、评价和识别对其有需要的受试者中子宫内膜异位症的组合物和方法。
[0138] 在一些实施方式中，本公开的生物标志物为下调的或者以高于正常水平表达的一种或多种与子宫内膜异位症相关的miRNA。例如，本文描述了在患有子宫内膜异位症的受试者中miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214和miR-126上调或者以高于正常水平表达。因此，在某些实施方式中，本公开涉及基于miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214和miR-126中的至少一种的水平升高的检测，用于诊断、评价和识别对其有需要的受试者中子宫内膜异位症的组合物和方法。在一些情况下，在患有子宫内膜异位症的受试者中，以下miRNA中的一种或多种上调或者以高于正常水平表达：let-7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-7g。
[0139] 在一些实施方式中，本公开的生物标志物为下调的或者以高于正常水平表达的一种或多种与子宫内膜异位症相关的miRNA。例如，本文描述了在患有子宫内膜异位症的受试者中miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p和miR-126-3p上调或者以高于正常水平表达。因此，在某些实施方式中，本公开涉及基于miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-
143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p和miR-126-3p中的至少一种的水平升高的检测，用于诊断、评价和识别对其有需要的受试者中子宫内膜异位症的组合物和方法。
143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p和miR-126-3p中的至少一种的水平升高的检测，用于诊断、评价和识别对其有需要的受试者中子宫内膜异位症的组合物和方法。
[0140] 在一些实施方式中，本公开提供了用于检测子宫内膜异位症标志物的方法。在一些实施方式中，本公开提供了用于监控miRNA水平对治疗的反应的方法。在一些实施方式中，本公开提供了在治疗后监控miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-
3613-5p、miR-553和miR-4668-3p中的至少一种的方法。在一些实施方式中，本公开提供了在子宫内膜异位症治疗后监控miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-3613-5p或它们的任何组合的水平的方法。在一些实施方式中，本公开提供了通常除本文所提供的另一种miRNA之外，监控let-7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-
7g的水平的方法。在一些实施方式中，所监控的miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-
5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，所监控的miRNA为以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，所监控的miRNA为以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
3613-5p、miR-553和miR-4668-3p中的至少一种的方法。在一些实施方式中，本公开提供了在子宫内膜异位症治疗后监控miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-3613-5p或它们的任何组合的水平的方法。在一些实施方式中，本公开提供了通常除本文所提供的另一种miRNA之外，监控let-7、let-7a、let-7b、let-7b-3p、let-7b-5p、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f或let-
7g的水平的方法。在一些实施方式中，所监控的miRNA为以下各项中的至少两种：miR-125b-
5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。在一些实施方式中，所监控的miRNA为以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p。在一些实施方式中，所监控的miRNA为以下各项中的至少一种、以下各项中的至少两种或者以下各项中的全部：miR-125b-5p、let-7b、miR-150、miR-342和miR-3613。
[0141] 在一些情况下，该方法可以包括通过测量以下miRNA中的至少一种的水平来诊断子宫内膜异位症：let-7a、let-7b、let-7c、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7g。在一些情况下，该方法可以包括通过测量以下miRNA中至少两种的水平来诊断子宫内膜异位症：let-7a、let-7b、let-7c、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7g。在一些情况下，该方法可以包括通过测量以下miRNA中至少三种的水平来诊断子宫内膜异位症：let-7a、let-7b、let-7c、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7g。
[0142] 在一些实施方式中，本公开提供了检测表1所列miRNA中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或者至少十种的方法。在一些实施方式中，本公开提供了检测与表1所列序列中的至少一种具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少100％同源性的核酸的方法。
[0143] 表1：miRNA序列
[0144]
[0145]
[0146] 因此，本公开可以提供用于检测子宫内膜异位症标志物，通常以相对高灵敏度检测子宫内膜异位症标志物的新的且方便的平台。在一些实施方式中，本公开所述的系统提供了以至少80％的灵敏度，优选地至少90％、优选地至少91％、优选地至少92％、优选地至少93％、优选地至少94％、优选地至少95％、优选地至少96％、优选地至少97％、优选地至少98％、优选地至少99％、优选地至少100％的灵敏度检测子宫内膜异位症标志物的平台。
[0147] 在一些实施方式中，本公开所述的系统提供了检测子宫内膜异位症标志物的平台。在一些实施方式中，本公开所述的系统提供了以至少80％的特异性，优选地至少90％、优选地至少91％、优选地至少92％、优选地至少93％、优选地至少94％、优选地至少95％、优选地至少96％、优选地至少97％、优选地至少98％、优选地至少99％、优选地至少100％的特异性检测子宫内膜异位症标志物的平台。
[0148] 在一些实施方式中，本公开提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的灵敏度；至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、100％的特异性；或者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％、100％的灵敏度和特异性两者检测子宫内膜异位症标志物的系统。在一些实施方式中，本公开提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
100％的准确度检测子宫内膜异位症标志物的系统。
97％、98％、99％、100％的特异性；或者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％、100％的灵敏度和特异性两者检测子宫内膜异位症标志物的系统。在一些实施方式中，本公开提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
100％的准确度检测子宫内膜异位症标志物的系统。
[0149] 因此，本公开可以提供用于检测一种或多种子宫内膜异位症标志物，通常以相对高灵敏度检测一种或多种子宫内膜异位症标志物的新的且方便的方法。在一些实施方式中，该方法以至少80％的灵敏度，优选地至少90％、优选地至少91％、优选地至少92％、优选地至少93％、优选地至少94％、优选地至少95％、优选地至少96％、优选地至少97％、优选地至少98％、优选地至少99％、优选地至少100％的灵敏度检测或诊断子宫内膜异位症。
[0150] 在一些实施方式中，本公开的方法以至少80％的特异性，优选地至少90％、优选地至少91％、优选地至少92％、优选地至少93％、优选地至少94％、优选地至少95％、优选地至少96％、优选地至少97％、优选地至少98％、优选地至少99％、优选地至少100％的特异性检测子宫内膜异位症。在一些实施方式中，本公开提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的灵敏度；至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％、100％的特异性；或者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、100％的灵敏度和特异性两者检测或诊断子宫内膜异位症的方法。在一些实施方式中，本公开提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、100％的准确度诊断子宫内膜异位症的方法。
96％、97％、98％、99％、100％的特异性；或者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、100％的灵敏度和特异性两者检测或诊断子宫内膜异位症的方法。在一些实施方式中，本公开提供了以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、100％的准确度诊断子宫内膜异位症的方法。
[0151] 样品制备
[0152] 无细胞体液测试样品或者含有细胞的样品可以得自个体或患者。获得测试样品的方法对本领域技术人员来说是熟知的并且包括但不限于吸取或抽取血液或其他液体。样品可以包括但不限于全血、血清、血浆、唾液、脑脊液(CSF)、心包液、胸膜液、尿液和眼流体。在其中测试样品含有细胞的一些实施方式中，可以通过本领域中已知的方法(例如，离心)从样品的液体部分中除去细胞以获得无细胞体液。在适合的实施方式中，将血清或血浆用作无细胞体液样品。可以使用本领域熟知的适合的方法从全血制备血浆和血清。在这些实施方式中，可以通过无细胞体液的体积归一化数据。
[0153] 在一些实施方式中，唾液测试样品可以得自受试者。获得唾液样品的方法可以包括但不限于从受试者口中强制排出(例如，吐出)、吸取、通过拭子或其他收集工具去除，或者本领域中已知的任何其他方法。如本文所使用的，术语“唾液”不包括痰液，因为痰液属于粘液或痰样品。在一些实施方式中，可以通过本领域中已知的方法(例如，离心)将唾液分成细胞和非细胞部分。在一些实施方式中，可以从细胞或非细胞部分提取核酸。
[0154] 例如，通过蛋白质含量或细胞数目来归一化数据，从而可以修正含有细胞的样品的样品制备中的差异。在某些实施方式中，可以相对于样品中的总蛋白质含量来归一化样品。可以使用标准程序确定样品中的总蛋白含量，标准程序包括但不限于Bradford测定和Lowry法。在其他实施方式中，可以相对于细胞数目归一化样品。
[0155] 测定
[0156] 本公开涉及以下发现：特定miRNA的表达水平与子宫内膜异位症的存在、发展、进展和严重程度有关。在多个实施方式中，本公开涉及受试者的基因筛选测定以确定受试者中与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的表达水平。本公开提供了评价与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平的方法以及基于与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的表达水平，将受试者诊断为患有子宫内膜异位症或者具有发展子宫内膜异位症的风险的方法。在一些实施方式中，本文所描述的诊断测定是体外测定。
[0157] 在一些实施方式中，本公开的方法是通过确定得自受试者的生物样品中与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平是否降低，用于评价对其有需要的受试者中子宫内膜异位症的存在、发作、进展和严重程度的诊断测定。在多个实施方式中，为了确定得自受试者的生物样品中与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平是否降低，将至少一种miRNA的水平与至少一种对比因子对照，如阳性对照、阴性对照、正常对照、野生型对照、历史对照和历史标准的水平，或者生物样品中的另一种参考分子的水平相比较。在一些实施方式中，本公开所述的诊断测定是体外测定。在其他实施方式中，本公开所述的诊断测定是体内测定。通过所述测定识别的miRNA可以是与子宫内膜异位症相关的任何miRNA。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种：miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-
4668。通过测定识别的miRNA可以是与子宫内膜异位症相关的任何miRNA。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。在本公开的多个实施方式中，与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA为至少两种miRNA、至少三种miRNA、至少四种miRNA、至少五种miRNA、至少六种miRNA、至少七种miRNA、至少八种miRNA。所述诊断测定的结果可以单独使用，或者可以与来自受试者的其他信息，或者来自得自受试者的生物样品的其他信息结合使用。
4668。通过测定识别的miRNA可以是与子宫内膜异位症相关的任何miRNA。在一些实施方式中，miRNA是以下各项中的至少一种：miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p。在本公开的多个实施方式中，与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA为至少两种miRNA、至少三种miRNA、至少四种miRNA、至少五种miRNA、至少六种miRNA、至少七种miRNA、至少八种miRNA。所述诊断测定的结果可以单独使用，或者可以与来自受试者的其他信息，或者来自得自受试者的生物样品的其他信息结合使用。
[0158] 在本公开所述的测定的多个实施方式中，当与对比因子对照相比，至少一种miRNA的水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少
1000％、至少1500％、至少2000％或者至少5000％时，确定与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平下调。
1000％、至少1500％、至少2000％或者至少5000％时，确定与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平下调。
[0159] 在本公开所述的测定的多个实施方式中，当与对比因子对照相比，至少一种miRNA的水平升高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少
1000％、至少1500％、至少2000％或者至少5000％时，确定与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平上调。
1000％、至少1500％、至少2000％或者至少5000％时，确定与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平上调。
[0160] 在本公开的测定的多个实施方式中，当与对比因子对照相比，至少一种miRNA的水平降低至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍或至少500倍时，确定与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平下调。在本公开的测定的多个实施方式中，当与对比因子对照相比，至少一种miRNA的水平升高至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍或至少500倍时，确定与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的水平上调。
[0161] 在本公开的测定方法中，对来自受试者的测试生物样品评价与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的表达水平。所述测试生物样品可以是体外样品或体内样品。在多个实施方式中，受试者是人类受试者，并且可以是任何种族、性别和年龄。代表性的受试者包括怀疑患有子宫内膜异位症的那些受试者、已诊断患有子宫内膜异位症的那些受试者、患有子宫内膜异位症的那些受试者、患过子宫内膜异位症的那些受试者、具有子宫内膜异位症复发风险的那些受试者和具有发展子宫内膜异位症风险的那些受试者。
[0162] 在一些实施方式中，将子宫内膜异位症相关miRNA-结合分子体内用于子宫内膜异位症的诊断。在一些实施方式中，所述子宫内膜异位症相关miRNA-结合分子是与本公开的子宫内膜异位症相关miRNA杂交的核酸。
[0163] 在一些实施方式中，所述测试样品是含有包含与子宫内膜异位症相关的miRNA的核酸的至少片段的样品。如本文所使用的，术语“片段”表示足以将其识别为包含与子宫内膜异位症相关的miRNA的核酸(例如，DNA、mRNA或cDNA)部分。
[0164] 在一些实施方式中，从得自受试者的生物样品制备测试样品。生物样品可以是来自含有包含子宫内膜异位症相关miRNA的核酸的任何来源的样品，如体液(例如，血液、血浆、血清、唾液、尿液等)，或组织，或外来体，或细胞，或它们的组合。可以通过适当的方法获得生物样品，如(举例来说)活组织检查或流体抽取。生物样品可以用作测试样品；可替代地，可以处理生物样品以提高对多肽、核酸或核酸拷贝(例如，包含与子宫内膜异位症相关的miRNA的核酸拷贝)的接近，并且所处理的生物样品可以然后用作测试样品。例如，在多个实施方式中，从生物样品制备核酸以在该方法中使用。可替代地或者另外，如果需要，扩增方法可以用于扩增包含生物样品中全部核酸或核酸片段的核酸以在评价与子宫内膜异位症相关的miRNA的表达水平中用作测试样品。
[0165] 评估测试样品以确定存在于受试者核酸中与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的表达水平。一般地，可以通过确定包含测试样品中所关心的miRNA的核酸的存在或不存在来检测miRNA。
[0166] 在一些实施方式中，可以使用杂交方法，如Northern分析或原位杂交(参见Current Protocols in Molecular Biology,2012,Ausubel,F.等人主编,John Wiley&Sons，包括所有增补版)。例如，可以通过与核酸探针的杂交表明与子宫内膜异位症相关的miRNA的存在。如本文所使用的“核酸探针”可以是核酸探针，如DNA探针或RNA探针。对于核酸探针使用的代表性实例，参见，例如，美国专利号5,288,611和4,851,330。
[0167] 为了检测至少一种所关心的miRNA，通过将测试样品与至少一种核酸探针接触形成杂交样品。用于检测miRNA的优选探针是能够杂交至miRNA的标记的核酸探针。核酸探针可以是(例如)全长核酸分子或其部分，如长度至少10、15或25个核苷酸并且足以在严格条件下特异性杂交至适当miRNA的寡核苷酸。在足以允许核酸探针与所关心的miRNA靶标特异性杂交的条件下维持所述杂交样品。根据情况，可以在高严格性条件或中等严格性条件下进行特异性杂交。在优选的实施方式中，特异性杂交的杂交条件是高严格性的。然后，如果存在，使用标准方法检测特异性杂交。如果核酸探针和测试样品中的miRNA之间发生特异性杂交，则存在于核酸探针中的序列也存在于受试者的miRNA中。在该方法中，还可以同时使用不止一个核酸探针。如本文所描述的，任一种核酸探针的特异性杂交指示了所关心的miRNA的存在。
[0168] 可替代地，在本文所描述的杂交方法中，可以使用肽核酸(PNA)探针来代替核酸探针。PNA是具有肽样无机主链，如N-(2-氨乙基)甘氨酸单元的DNA模拟物，其中有机碱(A、G、C、T或U)通过亚甲基羰基接头附接至甘氨酸氮(参见，例如，1994，Nielsen et al.,Bioconjugate Chemistry 5:1)。可以设计PNA探针以特异性杂交至包含至少一种所关心的miRNA的核酸序列。PNA探针与核酸序列的杂交指示了所关心的miRNA的存在。
[0169] 直接序列分析还可以用于检测所关心的miRNA。可以使用包含核酸的样品，并且如果需要，PCR或其他适当的方法可以用于扩增全部核酸或者核酸片段和/或其侧接序列。
[0170] 在另一个实施方式中，与来自受试者的靶标核酸序列互补的寡核苷酸探针阵列可以用于检测、识别和定量与子宫内膜异位症相关的miRNA。例如，在一些实施方式中，可以使用寡核苷酸阵列。寡核苷酸阵列通常包含在不同的已知位置偶联至基底表面的多个不同的寡核苷酸探针。通常，在现有技术，例如，美国专利号5,143,854和PCT专利公开No.WO 90/15070和92/10092中描述了这些寡核苷酸阵列，也称为“基因芯片”。通常，可以使用机械合成法或引入光刻法和固相寡核苷酸合成法的光引导合成法来产生这些阵列。参见Fodor et al.,Science,251:767-777(1991),Pirrung et al.,美国专利号5,143,854(还参见PCT专利申请号WO 90/15070)和Fodor et al.,PCT专利公开No.WO 92/10092和美国专利号5,
424,186。在(例如)美国专利号5,384,261中描述了使用机械合成法的用于这些阵列合成的技术。
424,186。在(例如)美国专利号5,384,261中描述了使用机械合成法的用于这些阵列合成的技术。
[0171] 在制备了寡核苷酸阵列之后，含有miRNA的样品与所述阵列杂交并对miRNA扫描。通常，通过本文以及(例如)公开的PCT专利申请号WO 92/10092和WO 95/11995和美国专利号5,424,186中所述的方法来进行杂交和扫描，以上专利的全部教导内容作为参考并入本文。
[0172] 简要地，通过熟知的扩增技术，例如，RT、PCR扩增靶标miRNA序列。通常，这包括使用与靶标miRNA互补的引物序列。然后，将扩增的靶标(通常引入标签)与阵列在适当的条件下杂交。一旦完成阵列的杂交和清洗，扫描阵列以确定阵列上靶标序列所杂交的位置。得自扫描的杂交数据通常处于作为阵列上位置的函数的荧光强度的形式。
[0173] 核酸分析的其他方法可以用于检测所关心的miRNA。代表性方法包括直接手动测序(1988,Church and Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1991-1995；1977,Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463-5467；Beavis et al.,美国专利号5,288,644)；自动荧光测序；单链构象多态性测定(SSCP)；钳压变性凝胶电泳(CDGE)；变性梯度凝胶电泳(DGGE))(Sheffield et al.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232-236)、移动性迁移分析(Orita et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2766-2770；Rosenbaum and Reissner,1987,Biophys.Chem.265:1275；1991,Keen et al.,Trends Genet.7:5)；RNA酶保护测定(Myers et al.,1985,Science 230:1242)；Luminex xMAPTM技术；高通量测序(HTS)(Gundry and Vijg,2011,Mutat Res,doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.001)；下一代测序(NGS)(Voelkerding et al.,2009,Clinical Chemistry 55:641-658；Su et al.,2011,Expert Rev Mol Diagn.11:333-343；Ji and Myllykangas,2011,Biotechnol Genet Eng Rev27:135-158)；和/或离子半导体测序(Rusk,2011,Nature Methods doi:10.1038/nmeth.f.330；Rothberg et al.,2011,Nature 475:348-352)。这些及其他方法可以单独或组合用于检测和定量得自受试者的生物样品中的至少一种所关心的miRNA。在本公开的一些实施方式中，将如本文所描述的评价生物样品以检测和定量所关心的miRNA的方法用于诊断、评价和鉴定对其有需要的受试者中的子宫内膜异位症。
[0174] 在一些实施方式中，可以使用下一代测序测定进行测序。如本文所使用的，术语“下一代”是在本领域中良好理解的并且一般是指任何高通量测序方法，包括但不限于以下各项中的一种或多种：大规模平行签名测序、焦磷酸测序(例如，使用Roche 454测序装置)、Illumina(Solexa)测序、通过合成测序(Illumina)、离子激流测序、通过连接测序(例如，SOLiD测序)、单分子实时(SMRT)测序(例如，Pacific Bioscience)、聚合酶测序(polony sequencing)、DNA纳米球测序、heliscope单分子测序(Helicos Biosciences)和纳米孔测序(例如、Oxford Nanopore)。在一些情况下，测序测定使用纳米孔测序。在一些情况下，测序测定包括Sanger测序的一些形式。在一些情况下，测序包括鸟枪法测序；在一些情况下，测序包括桥式PCR。在一些情况下，测序是广谱的。在一些情况下，测序是靶向的。
[0175] 可以用放射性或非放射性化合物，通过本领域技术人员熟知的方法直接或间接标记根据本公开所述的探针和引物，以获得可检测和/或可定量的信号；通过放射性元素或通过非放射性分子来进行本公开所述的引物或所述的探针的标记。在所使用的放射性同位素中，可以提及32P、33P、35S或3H。非放射性实体选自配基，如生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或洋地黄毒苷、半抗原、染料，和发光试剂，如辐射发光、化学发光、生物发光、荧光或磷光试剂。
[0176] 可以使用已知技术从生物样品获得核酸。在本文中，核酸包括RNA，其包括mRNA、miRNA等。核酸可以是双链或单链的(即，有义或反义单链)并且可以与编码多肽的核酸互补。还可以从对新鲜或固定的生物样品实施的提取中获得核酸含量。
[0177] 存在多种本领域中已知的用于检测具体核酸序列的方法，并且连续报道了新的方法。大多数已知的具体核酸检测方法在具体杂交反应中使用了核酸探针。
[0178] 在RNA印迹中，优选地用标签标记核酸探针。该标签可以是放射性同位素、荧光染料或其他熟知的材料。本领域中已知的用于特异性检测身体样品中外源生物核酸的另一种类型的方法是如通过美国专利号6,159,693和专利号6,270,974及相关专利所举例说明的杂交方法。为了简要概括那些方法中的一种，将具有与所关心的靶标核酸的所期望的区域互补的序列的至少10个核苷酸，优选地至少15个核苷酸，更优选地至少25个核苷酸的核酸探针在样品中杂交，经受解聚条件，并且用ATP/荧光素酶系统处理样品，如果存在核酸序列，则将发光。在定量RNA印迹中，可以将多态性核酸的水平与核酸的野生型水平相比较。
[0179] 用于检测杂交核酸的其他方法利用了聚合酶链反应(PCR)。PCR方法在本领域中是熟知的(美国专利号4,683,195、专利号4,683,202和专利号4,800,159)。为了简要概括PCR，使与核酸扩增靶标核酸序列的相对链互补的核酸引物退火为变性样品。DNA聚合酶(通常热稳定的)从所述杂交引物延伸DNA双螺旋。重复该过程以扩增核酸靶标。如果核酸引物未杂交至该样品，则没有相应的扩增PCR产物。
[0180] 在PCR中，可以用如之前所讨论的标签标记核酸探针。最优选地，使用涉及所述靶标核酸的至少一种引物进行所述双螺旋的检测。在PCR的另一个实施方式中，杂交双螺旋的检测包括电泳凝胶分离，和之后的染料-基显像。
[0181] 通过PCR的核酸扩增程序是熟知的并且在美国专利号4,683,202中描述。简要地，引物在彼此不同的位点并且以相反的方向退火至靶标核酸。通过热稳定性聚合酶的酶促作用，使退火至靶标序列的引物延伸。然后，通过加热使延伸产物从靶标序列变性，并重复该过程。该程序对两条链的连续循环提供了引物侧接区域的指数扩增。
[0182] 然后，使用PCR-类型的技术，即PCR技术或任何其他相关技术进行扩增。然后，将与所述靶标核酸序列互补的两条引物与聚合酶一起加入核酸含量，并且所述聚合酶扩增所述底物之间的DNA区域。
[0183] 扩增可以表示提高核酸序列拷贝数的任何方法。例如，可以(例如)在一种或多种聚合酶链反应中通过聚合酶进行扩增。可以使用本领域中已知的方法进行扩增。这些方法通常取决于核酸或其互补形式的多拷贝的产物催化的形成。这些方法中的一种是聚合酶链反应(PCR)，其包括AFLP(扩增片段长度多态性)PCR、等位基因特异的PCR、Alu PCR、组装PCR、不对称PCR、菌落PCR、解旋酶依赖性PCR、热启动PCR、反向PCR、原位PCR、序列间特异性PCR或IS SR PCR、数字PCR、微滴式数字PCR、线性指数PCR或Late PCR、长PCR、巢式PCR、实时PCR、双螺旋PCR、多路PCR、定量PCR或单细胞PCR。还可以使用其他扩增方法，包括连接酶链式反应(LCR)、核酸序列基扩增(NASBA)、线性扩增、等温线性扩增、Q-β-复制酶法、3SR、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)或者滚环扩增(RCA)。
[0184] 茎环RT-PCR是在本公开的方法中用于扩增和定量所关心的miRNA的PCR方法(参见Caifu et al.,2005,Nucleic Acids Research 33:e179；Mestdagh et al.,2008,Nucleic Acids Research 36:e143；Varkonyi-Gasic et al.,2011,Methods Mol Biol.744:145-57)。简要地，该方法包括两个步骤：RT和实时PCR。首先，茎环RT引物杂交至miRNA分子，然后通过反转录酶反转录。然后，使用常规实时PCR定量RT产物。
[0185] 在严格条件下的特异性杂交的表达是指本公开的方法中的杂交步骤，其中作为探针或引物所选择的寡核苷酸序列具有足够的长度并且足够清楚，从而最大程度降低了扩增期间可能发生的非特异性结合的量。可以通过任何适合的方法，如化学合成方法制备本文所描述的寡核苷酸探针或引物。
[0186] 通常，在防止非特异性结合但允许与探针或引物具有显著同源性水平的该模板核酸的结合的严格性条件下，通过寡核苷酸探针或引物与模板核酸退火来完成杂交。
[0187] 使用引物组的扩增步骤的解链温度(Tm)在严格性条件中，它在约50℃至约95℃的范围内。典型的杂交和清洗严格性条件部分基于模板核酸或寡核苷酸探针的大小(即，核苷酸长度的数目)、碱基组成以及一价和二价阳离子浓度(Ausubel et al.,1994,主编,Current Protocols in Molecular Biology)。
[0188] 在优选的实施方式中，用于确定根据本公开的定量和定性谱的方法的特征在于：所述扩增是使用能够在严格条件下与核酸序列部分或者多态性核酸序列特异性杂交的标记探针，优选地标记水解-探针进行的实时扩增。每当每个扩增循环发生时，所述标记探针能够发出可检测信号。
[0189] 实时扩增，如实时PCR在本领域中是熟知的，并且多种已知的技术将以最好的方式用于实施本发明方法。使用多种类别的探针，如水解探针、杂交相邻探针或分子信标来实施这些技术。使用水解探针或分子信标的技术基于荧光淬灭剂/报告子系统的使用，并且杂交相邻探针基于荧光受体/供体分子的使用。
[0190] 具有荧光淬灭剂/报告子系统的水解探针是市面上可获得的，并且例如，通过Applied Biosystems group(美国)商品化。可以使用多种荧光染料，如FAM染料(6-羧基荧光素)或者任何其他染料亚磷酰胺试剂。
[0191] Tm在应用于本公开所述的水解-探针中的任一种的严格条件中，它在约50℃至95℃的范围内。优选地，本公开所述的水解-探针中任一种的Tm在约55℃至约80℃的范围内。最优选地，应用于本公开所述的水解-探针中任一种的Tm为约75℃。
[0192] 在另一个优选的实施方式中，用于确定根据本公开的定量和定性谱的方法的特征在于：所述扩增产物可以延伸，其中相对于它们的长度来分离所述延伸的产物。测量对延伸产物所获得的信号，并且相对于延伸产物长度建立标记强度的定量和定性谱。
[0193] 延伸步骤，也称为径流反应(run-off reaction)，使得能够确定扩增产物的长度。可以使用常规方法，例如，使用凝胶，如用于分离的聚丙烯酰胺凝胶、DNA测序仪和适合的软件来确定长度。由于一些突变显示出长度不均一性，因此可以通过延伸产物的长度变化来确定一些突变。
[0194] 在一个方面，本公开包括与所关心的miRNA的核酸序列互补的引物，并且更具体地，引物包括与所关心的miRNA的序列基本互补的12个或以上的连续核苷酸。优选地，在本公开中起重要作用的引物包括足够互补以杂交至约12至25个核苷酸的核酸序列的核苷酸序列。更优选地，引物与靶标核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸。在另一个方面，引物的长度可以在长度上优选地相差约15至28个核苷酸长度(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸长度)。
[0195] 确定疗法或预后的有效性
[0196] 在一个方面，将患者生物样品中一种或多种循环miRNA的水平用于监控疾病的治疗或预后的有效性。在一些实施方式中，可以将得自治疗患者的测试样品中的一种或多种循环miRNA的水平与治疗开始前得自该患者的参考样品的水平相比较。治疗的临床监控通常需要每位患者用作其自己的基线对照。在一些实施方式中，在施用治疗后的多个时间点获得测试样品。在这些实施方式中，测试样品中一种或多种循环miRNA的水平的测量提供了对体内治疗效果的程度和持续时间的指示。
[0197] 生物标志物水平的测量使得能够监控疾病治疗过程。可以通过随时间检测得自受试者的样品中处于有效量的一种或多种生物标志物并比较所检测的生物标志物的量来监控疾病治疗方案的有效性。例如，可以在受试者接收治疗之前获得第一样品，并且在受试者治疗之后或期间采集一个或多个后续样品。样品中生物标志物水平的变化可以提供关于疗法有效性的指示。
[0198] 在一些实施方式中，本公开提供了用于监控miRNA水平对治疗的反应的方法。例如，在某些实施方式中，本公开提供了通过测量本文所描述的一种或多种miRNA的水平，确定受试者中治疗效力的方法。在一些实施方式中，可以随时间测量一种或多种miRNA的水平，其中将治疗开始之后一个时间点的水平与治疗开始之后另一个时间点的水平相比较。在一些实施方式中，可以随时间测量一种或多种miRNA的水平，其中将治疗开始之后一个时间点的水平与治疗开始之前的水平相比较。在一些实施方式中，本公开提供了在治疗后监控miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214、miR-
126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668中的至少一种的方法。在一些实施方式中，本公开提供了在子宫内膜异位症治疗后监控miR-125、miR-150、miR-3613或它们的任何组合的水平的方法。
126、miR-6755、miR-3613、miR-553和miR-4668中的至少一种的方法。在一些实施方式中，本公开提供了在子宫内膜异位症治疗后监控miR-125、miR-150、miR-3613或它们的任何组合的水平的方法。
[0199] 在一些实施方式中，本公开提供了在治疗后监控miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p、miR-
126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p中的至少一种的方法。在一些实施方式中，本公开提供了在子宫内膜异位症治疗后监控miR-125、miR-150、miR3613或它们的任何组合的水平的方法。
126-3p、miR-6755-3p、miR-3613-5p、miR-553和miR-4668-3p中的至少一种的方法。在一些实施方式中，本公开提供了在子宫内膜异位症治疗后监控miR-125、miR-150、miR3613或它们的任何组合的水平的方法。
[0200] 在一些实施方式中，本公开提供了用于评价子宫内膜异位症治疗效力的方法。例如，在一些实施方式中，该方法表明当与对照患病受试者或未接受治疗的群体相比，治疗受试者的样品中miR-125的水平降低时，治疗是有效的。在一些实施方式中，该方法表明当与对照患病受试者或未接受治疗的群体相比，治疗受试者的样品中miR-150的水平升高时，治疗是有效的。在一些实施方式中，该方法表明当与对照患病受试者或未接受治疗的群体相比，治疗受试者的样品中miR-3613的水平升高时，治疗是有效的。
[0201] 在一些实施方式中，本公开提供了用于评价子宫内膜异位症治疗效力的方法。例如，在一些实施方式中，该方法表明当与对照患病受试者或未接受治疗的群体相比，治疗受试者的样品中miR-125b-5p的水平降低时，治疗是有效的。在一些实施方式中，该方法表明当与对照患病受试者或未接受治疗的群体相比，治疗受试者的样品中miR-150-5p的水平升高时，治疗是有效的。在一些实施方式中，该方法表明当与对照患病受试者或未接受治疗的群体相比，治疗受试者的样品中miR-3613-5p的水平升高时，治疗是有效的。
[0202] 为了识别适合于特定受试者的治疗剂或药物，来自受试者的测试样品也可以暴露于治疗剂或药物，并且可以确定一种或多种生物标志物的水平。可以将生物标志物水平与来源于治疗或者暴露于治疗剂或药物前后的受试者的样品相比较，或者可以与来源于由于这种治疗或暴露，对于疾病已显示出改善的一个或多个受试者的样品相比较。因此，在一个方面，本公开提供了相对于受试者评价疗法效力的方法，包括在来自受试者的第一样品中进行生物标志物组的第一测量；对于受试者，实施疗法；在来自受试者的第二样品中进行生物标志物组的第二测量，并比较所述第一和第二测量以评价疗法的效力。
[0203] 另外，可以通过检测来自得自受试者的样品的处于有效量的一种或多种生物标志物并将受试者来源的样品暴露于确定受试者来源的样品中生物标志物的量的测试化合物来识别适合于施用于特定受试者的治疗剂。因此，可以基于得自受试者的样品中生物标志物的量并与参考值相比较来选择在患有子宫内膜异位症的受试者中使用的治疗或治疗方案。可以同时评价两种或更多种治疗或治疗方案以确定哪种治疗或治疗方案将对于在受试者中用于延迟疾病发生或减缓疾病进展最有效。在多个实施方式中，将对是否开始或继续疾病治疗做出建议。
[0204] 预后可以表示为可以预期患者存活的时间量。可替代地，预后可以表示疾病达到缓解的可能性或者可以预期疾病保持缓解的时间量。可以用多种方式表示预后；例如，预后可以表示为一年、五年、十年等以后患者将存活的机会百分比。可替代地，预后可以表示为由于病况或疾病，患者可以预期存活的平均年数。可以将患者的预后考虑为相对性表示，其中多种因素影响最终结局。例如，对于患有某些病况的患者，可以将预后恰当地表示为病况可以可治疗或可治愈的可能性，或者疾病将达到缓解的可能性，然而对于患有更严重病况的患者，预后可以更恰当地表示为存活特定时间段的可能性。另外，临床因素相对于基线水平的变化可以影响患者的预后并且临床因素水平的变化程度可以与不良事件的严重程度相关。通常，通过比较两个或更多个群体并且确定置信区间和/或p值来确定统计显著性。
[0205] 可以进行循环miRNA水平的多次确定，并且可以将活性的时间变化用于确定预后。例如，比较测定由多个时间点处患者中无细胞体液的循环miRNA组成，并且两个或更多个时间点处循环miRNA值的比较可以指示特定预后。
[0206] 在某些实施方式中，一个或多个循环miRNA的活性水平用作不良预后的指示。根据该方法，可以通过将所测量的循环miRNA水平与来自健康个体的相当的样品中所确定的水平或者与已知对应于良好或不良结局的水平相比较来进行预后的确定。所获得的循环miRNA水平可以取决于一些因素，其包括但不限于实施测定的实验室、所使用的测定方法、所使用的体液样品的类型和患者经受的疾病类型。根据该方法，可以从患有特定病症的一系列患者收集数据以确定循环miRNA对于该病症的适当参考范围。本领域的技术人员能够实施将所确定的水平与所观察的患者结局相比较的回顾性研究，并且能够建立可以用于表示患有特定病症的患者的预后的水平范围。例如，最低范围中的水平将指示更良好的预后，而最高范围中的循环miRNA水平将指示不良的预后。因此，在该方面，术语“升高的水平”是指位于参考值范围以上的水平。在一些实施方式中，具有“高”或“升高”水平的患者具有高于患有该疾病的患者群体中的中值活性的水平。在某些实施方式中，对于患有特定疾病的患者，“高”或“升高”水平是指高于患有该病症的患者的中值并且处于患有该病症的患者的前40％中的水平，或者处于患有该病症的患者的前20％中的水平，或者处于患有该病症的患者的前10％中的水平，或者处于患有该病症的患者的前5％中的水平。
[0207] 由于来自患者的测试样品中的循环miRNA的水平以连续方式与患者预后相关，因此可以使用统计分析进行预后的确定以将所确定的循环miRNA水平与患者的预后相关。技术人员能够设计适当的统计方法。例如，该方法可以在预后的确定中使用X2检验、Kaplan-Meier法、对数-秩检验、多变量逻辑回归分析、Cox比例风险模型等。可以在组织数据和实施统计分析中使用计算机和计算机软件程序。Giles et al.,British Journal of Hemotology,121:578-585所述的方法是示例性的。如Giles等人中所述，可以通过交叉表和费希尔精确检验评价类别变量(例如，miRNA水平和临床特征)之间的关系。可以使用Kaplan and Meier的方法估计未调整的存活概率。Cox比例风险回归模型也可以用于评价患者特征(如miRNA水平)预测存活的能力，其中通过Grambsch-Therneau检验、Schoenfeld残差图、鞅残差图(martingale residual plot)和似然比统计量评价“拟合良好性”(参见Grambsch et al.,1995)。在一些实施方式中，可以将该方法改变为通过个人电脑或个人数字助理(PDA)可以使用的简单的计算机程序。可以通过使用在Microsoft Excel内开发的visual basic for applications(VBA)计算机程序，基于它们的循环miRNA水平，实施患者存活时间的预测。核心构建和分析可以基于Cox比例风险模型。可以通过获得基础风险率和参数估计来开发VBA应用。可以使用统计程序，如SAS比例风险回归(PHREG)程序实施这些统计分析。然后，考虑患者的协变量，估值可以用于获得1至24个月的存活概率。所述程序可以利用估计的概率来产生给定患者的预测存活曲线的图示。在某些实施方式中，该程序还提供了
6-个月、1-年和18-个月的存活概率。图形界面可以通过用户友好的方式用于输入患者特征。在本公开的一些实施方式中，当确定患者预后时，考虑了多种预后因素，包括循环miRNA水平。例如，可以基于体液中miRNA的存在和选自细胞遗传学、体能状态、年龄、性别和先前的诊断的一种或多种预后因素来确定子宫内膜异位症受试者的预后。在另一个实例中，可以基于循环miRNA和选自细胞遗传学、体能状态、年龄、性别和先前的诊断的一种或多种预后因素来确定癌症患者的预后。在某些实施方式中，可以在算法中将其他预后因素与循环miRNA水平或其他生物标志物组合，从而以更大的准确度确定预后。
6-个月、1-年和18-个月的存活概率。图形界面可以通过用户友好的方式用于输入患者特征。在本公开的一些实施方式中，当确定患者预后时，考虑了多种预后因素，包括循环miRNA水平。例如，可以基于体液中miRNA的存在和选自细胞遗传学、体能状态、年龄、性别和先前的诊断的一种或多种预后因素来确定子宫内膜异位症受试者的预后。在另一个实例中，可以基于循环miRNA和选自细胞遗传学、体能状态、年龄、性别和先前的诊断的一种或多种预后因素来确定癌症患者的预后。在某些实施方式中，可以在算法中将其他预后因素与循环miRNA水平或其他生物标志物组合，从而以更大的准确度确定预后。
[0208] 治疗
[0209] 本公开提供了用于子宫内膜异位症的治疗或预防的治疗性分子。在一些实施方式中，治疗性分子包括但不限于本公开的标志物的抑制剂、激活剂和调节剂。例如，如果基因在子宫内膜异位症中下调，则将期望使用激活剂作为疗法形式将所述下调基因的表达提高至正常水平。激活剂是提高、打开、激活、有利于、提高激活、强化、加强(agonize)或上调子宫内膜异位症生物标志物的活性的化合物。可替代地，如果基因在子宫内膜异位症中上调，则将期望使用抑制剂作为疗法形式将所述上调基因的表达降低至正常水平。抑制剂是(例如)结合至子宫内膜异位症生物标志物，或者使子宫内膜异位症生物标志物的活性或表达部分或完全阻断、降低、防止，迟延激活、失活、弱化或下调的化合物。
[0210] 用于提高或降低本公开的标志物的表达水平的方法和材料是熟知的并且在本领域技术人员的技术范围内。已知的方法和材料的非限制性列表包括：饮食、维生素、食物增补剂、基因疗法、反义寡核苷酸、药物和激素药物治疗。
[0211] 本公开提供了通过靶向本文所描述的miRNA治疗子宫内膜异位症的方法。例如，在一些实施方式中，本公开提供了治疗受试者中子宫内膜异位症的方法，包括施用提高本文所描述的一种或多种miRNA的表达或水平的试剂。例如，在一些实施方式中，该方法包括施用提高miR-6755、miR3613、miR-553和miR-4668中的一种或多种的表达或水平的试剂。在一些实施方式中，本公开提供了治疗受试者中子宫内膜异位症的方法，包括施用降低本文所描述的一种或多种miRNA的表达或水平的试剂。例如，在一些实施方式中，该方法包括施用降低miR-125、miR-150、miR-342、miR-145、miR-143、miR-500、miR-451、miR-18、miR-214和miR-126中的一种或多种的表达或水平的试剂。
[0212] 本公开提供了通过靶向本文所描述的miRNA治疗子宫内膜异位症的方法。例如，在一些实施方式中，本公开提供了治疗受试者中子宫内膜异位症的方法，包括施用提高本文所描述的一种或多种miRNA的表达或水平的试剂。例如，在一些实施方式中，该方法包括施用提高miR-6755-3p、miR3613-5p、miR-553和miR-4668-3p中的一种或多种的表达或水平的试剂。在一些实施方式中，本公开提供了治疗受试者中子宫内膜异位症的方法，包括施用降低本文所描述的一种或多种miRNA的表达或水平的试剂。例如，在一些实施方式中，该方法包括施用降低miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-214-3p和miR-126-3p中的一种或多种的表达或水平的试剂。
[0213] 一旦将患者诊断为患有子宫内膜异位症或者具有患子宫内膜异位症的风险，则可以使用本领域中已知的方法治疗所述患者。对于子宫内膜异位症熟知的治疗包括但不限于止痛药、激素治疗、化疗和外科治疗。用于子宫内膜异位症治疗的止痛药包括简单的止痛剂，如在本领域中熟知的对乙酰氨基酚、COX-2抑制剂、阿司匹林及其他非甾族抗炎药物，和麻醉止痛剂，如在本领域中熟知的吗啡、可待因、羟考酮等两者。激素治疗包括但不限于口服避孕药、孕酮，如在本领域中熟知的地屈孕酮、醋酸甲羟孕酮、长效醋酸甲羟孕酮、炔诺酮、左炔诺孕酮等、黄体酮和黄体酮-样物质、GnRH激动剂，如亮丙瑞林、布舍瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、地洛瑞林、那法瑞林和曲普瑞林、雄激素和合成雄激素，如达那唑，和芳香酶抑制剂。外科治疗包括但不限于腹腔镜手术、子宫切除术和卵巢切除术。特别适合于在本公开中使用的其他治疗在本领域中是熟知的。在一些实施方式中，可以使用抑制素治疗患者，其包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗素伐他汀和辛伐他汀。
[0214] 试剂盒
[0215] 本公开还涉及在本公开的方法中有用的试剂盒。这类试剂盒包含在本文所描述的任何方法中有用的组分，其包括(例如)杂交探针或引物(例如，标记的探针或引物)、用于检测标记分子的试剂、寡核苷酸阵列、限制性内切酶、抗体、等位基因特异性寡核苷酸、用于扩增受试者的核酸的方式、用于反转录受试者的RNA的方式、用于分析受试者的核酸序列的方式和说明材料。例如，在一些实施方式中，试剂盒包含对于与子宫内膜异位症相关的至少一种miRNA的检测和定量有用的组分。在本公开优选的实施方式中，试剂盒包含用于检测如本文在其他处所述的与子宫内膜异位症相关的一种或多种miRNA的组分。
[0216] 本公开还提供了用于诊断子宫内膜异位症或者由子宫内膜异位症所引起的生育力降低的试剂盒，其包含用于已知在子宫内膜异位症中差异表达的一种或多种核酸生物标志物的探针。在一个具体的实施方式中，试剂盒包含用于所选择的生物标志物的定量扩增的试剂。可替代地，试剂盒可以包含微阵列。在一些实施方式中，试剂盒包含2种或以上的探针。在其他实施方式中，试剂盒可以含有3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25种或以上的探针。
[0217] 本公开还涉及在本公开的方法中有用的试剂盒。这些试剂盒包含在本文其他处所述的任何方法中有用的组分的多种组合，所述组分包括(例如)用于定量分析本公开的生物标志物(例如，多肽和/或核酸)的材料、用于评价本公开的生物标志物(例如，多肽和/或核酸)的活性的材料和说明材料。例如，在一些实施方式中，试剂盒包含用于生物样品中所期望的核酸的定量的组分。
[0218] 在其他实施方式中，试剂盒包含用于监控施用于对其有需要的受试者的治疗的有效性的测定的组分，其包含说明材料和用于确定在治疗施用期间或之后，得自受试者的生物样品中本公开的生物标志物的水平是否受到调节的组分。在多个实施方式中，为了确定得自受试者的生物样品中本公开的生物标志物的水平是否受到调节，将生物标志物的水平与包含在试剂盒中的至少一种对比因子对照(如阳性对照、阴性对照、历史对照、历史标准)的水平或者生物样品中另一种参考分子的水平相比较。在某些实施方式中，确定生物标志物和参考分子的比例以帮助监控治疗。
[0219] 实验性实施例
[0220] 通过参考以下实验性实施例，进一步详细描述了本公开。这些实施例仅以说明的目的提供，并且除非另外说明，否则不意欲进行限制。因此，本公开决不应视为受限于以下实施例，而应视为由于本文所提供的教导内容，涵盖了显而易见的任何和全部变化。
[0221] 无需进一步描述，据信使用以上说明以及以下说明性实施例，本领域的技术人员可以制备和使用本公开并实践所主张的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本公开优选的实施方式，并且不应将其视为以任何方式限制本公开的其他内容。
[0222] 实施例1：血清微小RNA作为子宫内膜异位症的诊断标志物；综合阵列基分析[0223] 患有和未患有子宫内膜异位症的妇女的正位和异位子宫内膜组织的微阵列研究显示了一些miRNA的差异表达(Ohlsson et al.,2009,Mol Endocrinol,23:265-275,Petracco et al.,2011,J Clin Endocrinol Metab,96:E1925-1933)。它们通过调控基因表达在子宫内膜异位症和相关不育的病理发生中起重要作用(Teague et al.,2010,Hum Reprod Update,16:142-165)。组织miRNA从病理组织脱落至循环中，并且在循环和组织水平之间已显示出强烈的相关性(Resnick et al.,2009,Gynecol Oncol,112:55-59)。已在子宫内膜异位症患者血清中识别了一些差异表达的miRNA(jia et al.,2013,Hum Reprod,28:322-330,Wang et al.,2013,J Clin Endocrinol Metab,98:281-289)。先前已表明let-7b和miR-135a在来自子宫内膜异位症患者的血清中差异表达并且是疾病有用的生物标志物(Cho et al.,2015,Fertil Steril,103(5):1252-1260)。在本研究中，已表明其他miRNA是该疾病的标志物。本研究是患有子宫内膜异位症的妇女的血清中全局miRNA谱的综合评价，并且识别了用作疾病的无创生物标志物的一些miRNA。
[0224] 现将描述在这些实验中使用的材料和方法。
[0225] 研究群体
[0226] 从患有和未患有子宫内膜异位症的48位妇女采集血清样品。该研究群体选自在2010年6月至2013年3月间，出于多种良性指征经历腹腔镜检查的患者，多种良性指征包括骨盆肿块、盆腔疼痛、不育和子宫内膜异位症。对患者提供知情同意以参与本研究。入选标准为年龄20至50岁，手术前至少3个月未进行激素疗法、无其他炎性疾病。排除标准包括经绝后状态、在手术3个月内使用了上述激素或促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂、子宫内膜异位症、子宫内膜癌、增生或子宫内膜息肉、传染性疾病、慢性或急性炎性疾病、恶性肿瘤、自身免疫病和心血管疾病。通过Roche/Hitachi Modular Analytics E170系统(Roche Diagnostics)，使用CA-125II电化学发光免疫测定(ECLIA)测量全部患者中治疗前的血清CA-125水平。在手术期间，切除所有可能的子宫内膜异位症病变并检查做出最后诊断。在切除组织的病理学确认之后，将患者分配至子宫内膜异位症组。使用美国生殖医学会(American Society of Reproductive Medicine，ASRM)修订的分类(Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis.Fertil Steril 1996,67:817-821)，确定子宫内膜异位症程度。24位患者患有组织学确认的腹膜和/或卵巢子宫内膜异位症，患有中度至重度疾病(III期和IV期)。24位患者作为对照参与，其包括10例皮样囊肿(n＝10)、浆液性卵巢囊腺瘤(n＝5)、粘液性囊腺瘤(n＝3)、单纯卵巢囊肿(n＝5)和管周囊肿(n＝1)。
[0227] 样品采集和RNA提取
[0228] 在手术之前禁食8小时之后采集血液样品(10ml)。使用不包含添加剂的无菌管。将样品立即离心，并且将血清在-80℃冷冻以用于进一步分析。将来自每个个体的样品的一半混合用于微阵列分析，并将样品剩余的一半用于微小RNA的个体分析。根据生产商的说明书，使用miRVana RNA分离试剂盒(Applied Biosystems)，从400μl血清中提取总RNA，并用50ml无核酸酶的水洗脱。使用Nano Drop ND-2000-分光光度计(Nano drop Technologies,USA)确定RNA的得率。
[0229] miRNA微阵列表达谱
[0230] 将来自患有子宫内膜异位症的妇女和对照的混合样品的总RNA用于微小RNA微阵列谱绘制。使用所述微小RNA标记总RNA(100ng)。完全标记和Hyb试剂盒(Affymetrix,USA)以及人微小RNA微阵列上杂交试剂盒(Release 16.0,Affymetrix)含有1205种人的和144种人的病毒微小RNA的60000个探针。使用Affymetrix微阵列扫描仪(Affymetrix)检测杂交信号并且使用Affymetrix特征提取软件(Affymetrix)分析所扫描的图像。
[0231] 用于miRNA的定量实时聚合酶链反应
[0232] 按照生产商的说明，使用Invitrogen NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis MIRC-50试剂盒(Life Technologies)。将来自每个样品的总RNA(25ng)反转录，并且使用miR-125b-5p(SEQ ID NO:37)、miR-150-5p(SEQ ID NO:38)、miR-342-3p(SEQ ID NO:39)、miR-145-5p(SEQ ID NO:40)、miR-143-3p(SEQ ID NO:41)、miR-500a-3p(SEQ ID NO:42)、miR-451a(SEQ ID NO:43)、miR-18a-5p(SEQ ID NO:44)、miR-6755-3p(SEQ ID NO:45)、miR-3613-5p(SEQ ID NO:46)、miR-553(SEQ ID NO:47)、miR-4668-3p(SEQ ID NO:48)的特异性正向引物以及与锚定引物互补的通用反向引物，使用iQ SYBR Green supermix试剂盒(Bio-Rad Laboratories)定量miRNA。
[0233]
[0234]
[0235] 反应混合物包含4μl cDNA、5μl iQSYBR Green Supermix、0.5μl正向引物、0.5μl通用定量聚合酶链反应引物，最终反应体积10μl。通过尿嘧啶-N-糖基化酶在50℃激活2分钟，在95℃初始变性15分钟，然后将在95℃保持15秒和在59℃退火50秒循环50次来起始热循环条件。通过使用Bio-Rad iCycleri Qsystem的定量和解链曲线程序(Bio-Rad Laboratories)，获得阈值循环和解链曲线。将锚定反-转录引物用作阴性对照的模板，并且将U6(U6正向，CTCGCTTCGGCAGCACA)(SEQ ID NO:51)小核RNA用作对照以确定相关miRNA的表达(Kuwabara et al.,2011,Circ Cardiovasc Genet,4:446-454)。使用比较循环阈值(Ct)法(被称为2ΔΔCT法)，确定相关mRNA水平。
[0236] 统计分析
[0237] 使用学生t检验和费希尔精确检验来确定子宫内膜异位症和对照组之间临床特征差异的统计显著性。使用Mann-Whitney U检验比较组间血清miRNA的表达水平。建立接受器工作特征(ROC)曲线和ROC曲线下面积(AUC)来评价用于区分子宫内膜异位症和对照的血浆微小RNA的诊断值。基于ROC分析，计算血浆miRNA的最佳统计截止值，然后评价所选截止点的灵敏度和特异性。使用SPSS 16.0(SPSS Inc,Chicago,IL)进行所有统计分析。认为P<0.05是统计学显著的。
[0238] 现将描述实验结果。
[0239] 临床特征
[0240] 患有子宫内膜异位症的妇女的平均(±SD)年龄为33.08±6.63岁，对照为32.16±9.46岁(p>0.05)。其他临床参数，包括妊娠、产次、酒精使用及其他合并症之间也无统计学显著差异。通过VAS(视觉模拟量表)确定的子宫内膜异位症组的盆腔疼痛强度高于对照组(分别为5.4±3.4，2.1±2.4，p<0.001)。子宫内膜异位症组中的CA-125值显著高于对照组，但差异度大(分别为103.3±121.7，17.5±6.3，p<0.003)。患有子宫内膜异位症的所有妇女患有卵巢子宫内膜异位症，她们中的16位患有腹膜疾病并且她们中的8位患有深部浸润型子宫内膜异位症。
[0241] 研究群体血清中循环miRNA的表达
[0242] 将Affymetrix miRNA 4.0阵列用于检测混合样品的miRNA谱，并从这些阵列研究中分析了总计36,354个miRNA。这些miRNA中，11,653个下调，10,010个上调。选择子宫内膜异位症和对照组之间它们的表达具有大于10倍变化的差异表达的miRNA(图1)。如图1所示，miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p上调，而miR-3613-5p和miR-6755-3p下调。
[0243] 使用实时定量聚合酶链反应评价了miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p、miR-6755-3p、miR-3613-5p在患有和未患有子宫内膜异位症的妇女的血清中的相对表达。如图2A和图2B所示，在患有子宫内膜异位症的妇女中，miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-145-5p、miR-143-3p、miR-500a-3p、miR-451a、miR-18a-5p的表达水平上调(p<0.05)，而miR-6755-3p和miR-
3613-5p的水平下调(p<0.05)。还确定了这些miRNA经过月经周期的变化。在子宫内膜异位症组中，分别有8个和16个增殖和分泌样品。在对照组中，有13个增殖样品和11个分泌样品。
在子宫内膜异位症患者中，这些miRNA不存在差异月经周期阶段特异性表达(p>0.05)。
3613-5p的水平下调(p<0.05)。还确定了这些miRNA经过月经周期的变化。在子宫内膜异位症组中，分别有8个和16个增殖和分泌样品。在对照组中，有13个增殖样品和11个分泌样品。
在子宫内膜异位症患者中，这些miRNA不存在差异月经周期阶段特异性表达(p>0.05)。
[0244] 子宫内膜异位症中循环miRNA的诊断值的评价
[0245] 实施了两组之间差异表达的血清miRNA的ROC曲线分析。表2和图3中显示了差异表达的miRNA的AUC值。在差异表达的miRNA中，miR-125b-5p的表达水平具有最高的AUC(0.974，95％置信区间[CI]，0.00-1.00，p<0.001)，对于0.0688的截止值，灵敏度和特异性分别为100％和96％。通过对患病相对于对照样品的数据应用逻辑回归模型，改善了诊断子宫内膜异位症中的miRNA表达。由于所有生物标志物的分布不是正常偏斜的，因此将变量对数转化(图3A-图3C)。对于单独的miR-125b-5p，观察到高AUC。当组合预测因子125b-5p、451a和3613-5p时，实现了AUC进一步升高至1.000(图3D)。当组合这三种微小RNA时，灵敏度和特异性达到100％。因此，微小RNA的组合显示出优于任何单个微小RNA的改善的可诊断性。选择以下逻辑模型：miRNA组合＝118.406+108.751×log10(125b-5p)+41.015×log10(451a)–57.935×log10(3613-5p)。表3中所示的微阵列数据显示了最高的miRNA命中数和子宫内膜异位症(E1)上调vs.对照(C1)、E1下调vs.C1的比较。
[0246] 微小RNA作为子宫内膜异位症的生物标志物的使用
[0247] 在该研究中，显示了作为子宫内膜异位症生物标志物的差异表达的循环miRNA。结果显示在微阵列数据中所识别的miRNA中，miR-125b-5p的表达具有最高的AUC水平。子宫内膜异位症与6.7年的平均诊断迟延有关，这导致疾病发展和生活质量受损(Nnoaham et al.,2011,Fertil Steril,96:366-373)。子宫内膜异位症的早期诊断将使得能够立即治疗、改善生活质量并潜在地保持生育力。已在血清、血浆和尿液中作为该疾病的潜在生物标志物研究了一些生长因子和细胞因子(Cho et al.,2012,Hum Reprod,27:515-522,Reis et al.,2012,Hum Reprod,27:1445-1450)；然而，这些中无一足够灵敏和特异，从而能够转化为子宫内膜异位症的临床诊断工具(May et al.,2010,Hum Reprod,16:651-674)。
[0248] 对于将miRNA转运至血浆的机制以及它们对远端器官的生物学影响的了解甚少。正常的子宫内膜以及成对的正位和异位子宫内膜样品具有差异miRNA表达模式(Jia et al.,2013,Hum Reprod,28:322-330)。此外，已在检查一些癌症的研究中证明了血清/血浆和组织的miRNA谱之间的强烈关系(Resnick et al.,2009,Gynecol Oncol,112:55-59,Wang et al.,2013,J Clin Endocrinol Metab,98:281-289)。除了它们作为生物标志物的作用之外，循环miRNA对远端组织具有调控作用。在本文中所识别的循环miRNA是子宫内膜异位症和子宫内膜之间的通讯方式。此外，它们具有全身性作用，从而改变远端器官系统。
在动物模型中已表明远离腹膜腔的子宫内膜异位症影响子宫基因表达(Naqvi et al.,
2016,Reprod Sci,23:186-191)。循环miRNA是子宫内膜异位症影响子宫的信号转导机制。
在动物模型中已表明远离腹膜腔的子宫内膜异位症影响子宫基因表达(Naqvi et al.,
2016,Reprod Sci,23:186-191)。循环miRNA是子宫内膜异位症影响子宫的信号转导机制。
[0249] 已表明miRNA通过调控异常细胞分化、侵袭和炎症来促进子宫内膜异位症的病理发生(Petracco et al.,2011,J Clin Endocrinol Metab,96:E1925-E1933,Teague et al.,2010,Hum Reprod Update,16:142-165,Naqvi et al.,2016,Reprod Sci,23:186-191)。还已表明在子宫内膜异位症中识别了多个单个循环miRNA(Jia et al.,2013,Hum Reprod,28:322-330,Wang et al.,2013,J Clin Endocrinol Metab,98:281-289,Cho et al.,2015,Fertil Steril,103(5):1252-1260)。Jia et al.报道在患有子宫内膜异位症的妇女中血浆miR-17-5p、miR-20a和miR-22下调(Jia et al.,2013,Hum Reprod,28:322-
330)，然而，这些miRNA未达到截止阈值并且未在该研究中进一步检验。所识别的miRNA的差异是由于年龄、种族、疾病严重程度或医学疗法的使用的差异所造成的。
330)，然而，这些miRNA未达到截止阈值并且未在该研究中进一步检验。所识别的miRNA的差异是由于年龄、种族、疾病严重程度或医学疗法的使用的差异所造成的。
[0250] 在患有子宫内膜异位症的妇女的循环中的所有miRNA的第一综合分析中，识别出miR-125b-5p是子宫内膜异位症最佳的单一候选生物标志物。在患有子宫内膜异位症的妇女的血清中，miR-125b-5p显著上调，并且在任何单一miRNA中，它具有最高的AUC以及灵敏度和特异性(AUC＝0.974，95％置信区间[CI]，0.00-1.00，p<0.001)(分别为100％和96％)。miR-125b-5p已显示出在癌症侵袭和病理发生中的作用并在肺癌中起致癌基因的作用(Wang et al.,2015,Mol Med Rep,11(5):3880-3887)。它在乳腺癌患者血清中上调并且与化学治疗耐药性有关，不起反应的患者具有较高的表达水平(Wang et al.,2012,PLoS One,7:e34210,Matamala et al.,2015,Clin Chem,61(8):1098-1106)，同时在HBV阳性肝细胞癌患者的血清中发现了显著较高的水平(Giray et al.,2014,Mol Biol Rep,41(7):
4513-4519)。还已表明miR-125b-5p通过Osx表达的调节来调控hBMSCs的成骨分化(Chen et al.,2014,Mol Med Rep,9(5):1820-1826)。在该研究中，大多数病例患有具有有助于该表型的侵袭性和miRNA 125的重度子宫内膜异位症。在该研究中发现的其他miRNA也有助于该疾病的病原学。miR-451a在成神经细胞瘤和骨肉瘤中具有肿瘤抑制功能(Liu et al.,
2016,Mol Med Rep,doi:10.3892/mmr.4770,Xu et al.,2014,Cell Biochem Biophys,69(1):163-168)和在子宫内膜异位症组织中发现的用于限制子宫内膜异位症病变细胞存活的升高的水平(Graham et al.,2015,Hum Reprod,30(3):642-652)。
4513-4519)。还已表明miR-125b-5p通过Osx表达的调节来调控hBMSCs的成骨分化(Chen et al.,2014,Mol Med Rep,9(5):1820-1826)。在该研究中，大多数病例患有具有有助于该表型的侵袭性和miRNA 125的重度子宫内膜异位症。在该研究中发现的其他miRNA也有助于该疾病的病原学。miR-451a在成神经细胞瘤和骨肉瘤中具有肿瘤抑制功能(Liu et al.,
2016,Mol Med Rep,doi:10.3892/mmr.4770,Xu et al.,2014,Cell Biochem Biophys,69(1):163-168)和在子宫内膜异位症组织中发现的用于限制子宫内膜异位症病变细胞存活的升高的水平(Graham et al.,2015,Hum Reprod,30(3):642-652)。
[0251] 总之，本研究显示了循环miRNA、具体是miR-125b-5p在子宫内膜异位症中的差异表达。这些发现还支持血浆miRNA谱在该疾病的诊断中的临床应用。考虑到疾病生物标志物的缺乏和诊断的迟延，miRNA在早期检测和干预中是有用的。此外，循环miRNA的作用为子宫内膜异位症的全身性作用提供了更好的理解并且使得能够进行更新的治疗。
[0252] 表2.差异表达的miRNA的AUC、95％置信区间(CI)和P值
[0253]
[0254] 表3.最高命中数的微阵列数据
[0255]miR-125b-5p 77.07 E1 上调 vs C1
miR-214-3p 62.5954 E1 上调 vs C1
miR-150-5p 57.2203 E1 上调 vs C1
miR-342-3p 41.5546 E1 上调 vs C1
miR-145-5p 38.1178 E1 上调 vs C1
miR-143-3p 29.4994 E1 上调 vs C1
miR-126-3p 27.3483 E1 上调 vs C1
miR-500a-3p 18.0946 E1 上调 vs C1
miR-451a 16.8822 E1 上调 vs C1
miR-18a-5p 14.4632 E1 上调 vs C1
miR-6755-3p -12.4883 E1 下周 vs C1
miR-553 -18.6982 E1 下调 vs C1
miR-3613-5p -102.613 E1 下调 vs C1
miR-4668-3p -124.901 E1 下调 vs C1
miR-214-3p 62.5954 E1 上调 vs C1
miR-150-5p 57.2203 E1 上调 vs C1
miR-342-3p 41.5546 E1 上调 vs C1
miR-145-5p 38.1178 E1 上调 vs C1
miR-143-3p 29.4994 E1 上调 vs C1
miR-126-3p 27.3483 E1 上调 vs C1
miR-500a-3p 18.0946 E1 上调 vs C1
miR-451a 16.8822 E1 上调 vs C1
miR-18a-5p 14.4632 E1 上调 vs C1
miR-6755-3p -12.4883 E1 下周 vs C1
miR-553 -18.6982 E1 下调 vs C1
miR-3613-5p -102.613 E1 下调 vs C1
miR-4668-3p -124.901 E1 下调 vs C1
[0256] 实施例2：狒狒中子宫内膜异位症病变中miRNA的相对表达
[0257] 如图4所示，通过实时定量PCR确定了狒狒中子宫内膜异位症病变中miRNA的相对表达。将miR-125b-5p、miR-150-5p和miR-3613-5p的相对表达水平与抑制素治疗之后各自miRNA的相对表达水平进行比较。观察到在抑制素治疗的动物中病变缩小。未治疗动物样品中miR-125b-5p的表达水平显示出具有高于采集自治疗动物的样品的相对表达水平。此外，观察到与来自治疗动物的样品中miR-3613-5p的水平相比，在来自对照未治疗动物的样品中，miR-3613-5p的相对水平较低。最后，观察到与来自治疗动物的样品中miR-150-5p的水平相比，在来自对照未治疗动物的样品中，miR-150-5p的相对水平较低。
[0258] 实施例3：唾液微小RNA作为子宫内膜异位症的诊断标志物
[0259] 步骤1：唾液中RNA的提取
[0260] 采集唾液样品(200μL)并转移到1.5mL管中。将无RNA酶的水以小于200μL的体积加入至样品中以使总样品体积达到200μL。将1mL QIAzol裂解剂(Qiagen)加入至该样品。将所述管简单涡旋，并且使该样品在室温下培育五分钟。然后，将200μL氯仿加入至所述裂解液并涡旋约15秒。然后，将样品混合物在室温下培育2分钟并以12,000×g在低温室(约4℃)中离心15分钟。将约560μL水相转移到新的1.5mL管中。将840μL 100％的乙醇加入至560μL水相以获得1400μL的总体积。然后，将700μL混合物转移至具有2mL收集管的RNeasy MiniElute离心柱中。将所述具有收集管的离心柱在9,000×g离心15秒。弃去流过液，并将剩余的700μL混合物转移到所述具有收集管的离心柱中并以9,000×g再次离心15秒。弃去流过液，并将700μL缓冲液RWT加入至每个离心柱，然后以9,000×g离心15秒。弃去流过液，并将500μL缓冲液RPE加入至每个离心柱，然后以9,000×g离心15秒。弃去流过液，并将另外500μL缓冲液RPE加入至所述离心柱，然后再次以9,000×g离心15秒。然后，将500μL80％的乙醇加入至所述离心柱并以9,000×g离心2分钟。随后弃去流过液和收集管，并将所述离心柱转移到新的2mL收集管中。将所述离心柱的盖保持打开，然后以12,000×g离心5分钟以使膜干燥。然后，将所述离心柱放置在1.5mL管中。将14μL无RNA酶的水加入至所述离心柱并使其以12,000×g离心1分钟以洗脱总RNA。弃去离心柱，并将RNA储存在-80℃。
[0261] 步骤2：cDNA的制备
[0262] 将TaqMan Advanced miRNA cDNA合成试剂盒以下列四个顺序步骤用于制备cDNA(ThermoFisher，产品目录号：A28007)：A、B、C和D。
[0263] 在每个反应中，以下列含量实施步骤A：0.5μL 10×Poly A缓冲液；0.5μL 10mM ATP；0.3μL Poly A酶，5U/μL；1.7μL无RNA酶的水；2.0μL样品。将板或管密封并简单涡旋。将所述板或管离心以使内容物沉淀并消除任何气泡。将所述板或管置于热循环仪中并以下列设置培育：
[0265] 2.在65℃终止反应10分钟。
[0266] 3.在4℃保持。
[0267] 在每个反应中，以下列含量实施步骤B：3.0μL 5×DNA连接酶缓冲液；4.5μL 50％PEG 8000；0.6μL 25×连接接头；1.5μL RNA连接酶；0.4μL无RNA酶的水。将连接反应混合物涡旋以彻底混合内容物，然后简单离心以使内容物沉淀并消除气泡。将10μL连接反应混合物转移到含有poly(A)加尾反应产物的反应板的每个孔中或者每个反应管中。将反应板或管密封，然后简单涡旋或振荡(通过EppendorfTM MixMateTM，1,900RPM，1分钟)以彻底混合内容物。将所述反应板或管简单离心以使内容物沉淀。将所述板或管置于热循环仪上。
[0268] 在每个反应中，以下列含量实施步骤C：6μL 5×RT缓冲液；1.2μL dNTP混合物(每种25mM)；1.5μL 20×通用RT引物；3μL 10×RT酶混合物；3.3μL无RNA酶的水。将RT反应混合物涡旋以彻底混合内容物，然后简单离心以使内容物沉淀并消除气泡。将15μL所述RT反应混合物转移到含有接头连接反应产物的反应板的每个孔中或者每个反应管中。总体积为每孔或管30μL。然后，将所述反应板或管密封并简单涡旋以彻底混合内容物。然后，将所述反应板或管简单离心以使内容物沉淀。将所述板或管置于热循环仪中并以下列设置培育：
[0269] 1.在42℃反转录15分钟
[0270] 2.在85℃终止反应5分钟
[0271] 3.在4℃保持。
[0272] 在每个反应中，以下列含量实施步骤D：25μL 2×miR-Amp Master混合物；2.5μL 20×miR-Amp引物混合物；17.5μL无RNA酶的水。将miR-Amp反应混合物涡旋以彻底混合内容物，然后简单离心以使内容物沉淀并消除气泡。将45μL miR-Amp反应混合物转移到新的反应板的每个孔中或新的反应管中。将5μL RT反应产物加入至每个反应孔或反应管中。每个孔或管中的总体积为50μL。将所述反应板或管密封，然后简单涡旋以彻底混合内容物。然后，将所述反应板或管简单离心以使内容物沉淀以混合。将所述反应板或管置于热循环仪中，然后使用以下设置，最大升温速度(MAX ramp speed)和标准循环进行培育：
[0273] 1.在95℃酶激活5分钟，1个循环
[0274] 2.在95℃变性3秒，14个循环
[0275] 3.在60℃退火/延伸30秒，14个循环
[0276] 4.在99℃终止反应10分钟，1个循环。
[0277] 5.在4℃保持。
[0278] 步骤3：微小RNA的扩增
[0279] RT-PCR规程：
[0280] 1. 95℃，3分钟
[0281] 2. 95℃，15s
[0282] 3. 59℃，5s
[0283] 4. 72℃，55s
[0284] 5.将步骤2-4重复39个循环
[0285] 6. 55℃解链曲线，10s
[0286] 7. 95℃，5s
[0287] 8.在4℃保持
[0288] 在图5和图6中显示了对照组和子宫内膜异位症组之间差异表达的唾液miRNA的相对表达。数据代表每个组中的15个样品。miR 125b-5p、Let7b和miR150-5p的变化倍数分别为25、7和1.8倍。当将子宫内膜异位症组与对照组相比较时，这些变化倍数是统计学显著的，因为对于以上miR，p-值小于0.05(p<0.05)。p-值如下所示：miR 125b-5p(p<0.001)、Let7b(p<0.025)和miR 150-5p(p<0.047)。观察到miR-3613-5p的统计学显著的下调。
[0289] 实施例4：手术诊断之前，用于诊断子宫内膜异位症的血清微小RNA
[0290] 将对于良性妇科指征进行腹腔镜检查或剖腹术的生殖年龄妇女招募到前瞻性病例对照研究中。如果手术确认存在子宫内膜异位症，则将患者划分到疾病组，如果手术显示其他良性病变，则划分到对照组。招募了23位对照患者和17位子宫内膜异位症患者，它们满足本研究中的入选标准。对照包括4位皮样囊肿患者，3位囊腺瘤患者，6位纤维瘤患者，2位具有慢性骨盆感染迹象的患者和8位无异常病变患者。与对照相比，子宫内膜异位症患者中的微小RNA 125b和150的表达水平显著更高(分别地，微小RNA 125：X vs Y；p＝0.028，微小RNA 150：Z vs W；p＝0.014)。通过手术评价，对4位患有盆腔疼痛并且怀疑子宫内膜异位症的患者未发现患有子宫内膜异位症。这些患者中125b和150的表达与对照一致，并且不同于通过手术确认的子宫内膜异位症患者中的表达。
[0291] 按照生产商的规程，使用miRNeasy微型试剂盒(Qiagen)，从血清提取总微小RNA。使用TaqMan Advanced miRNA cDNA合成试剂盒(ThermoFisher)进行cDNA的制备。实施定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)以确定微小RNA 125b-5p和150-5p的表达水平。使用Mann-Whitney U检验，比较对照和子宫内膜异位症组之间血清微小RNA的表达水平。研究结果(图
7)显示与对照相比，子宫内膜异位症患者中微小RNA 125b-5p和150-5p显著升高。
7)显示与对照相比，子宫内膜异位症患者中微小RNA 125b-5p和150-5p显著升高。
[0292] 实施例5：子宫内膜异位症的诊断和治疗
[0293] 在本预知实施例中，从具有子宫内膜异位症的症状的女性患者中采集血液或唾液样品。然后，确定样品中微小RNA 125b-5p的量，并且如果所述量高于阈值，则将患者诊断为子宫内膜异位症。用治疗有效量的化合物治疗所述患者。通过口服、静脉内或肌内施用，向所述患者施用所述化合物。所述化合物导致子宫内膜异位症的症状减少。对所述患者每个月治疗约1次。在治疗1个月、治疗6个月和治疗1年之后，评价患者子宫内膜异位症的症状的减少。
[0294] 尽管在本文中已显示和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员显而易见的是仅通过举例说明提供这些实施方式。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到多种改变、变化和替换。应理解可以在本发明的实践中使用本文所描述的本公开的实施方式的多种替代。旨在以下列权利要求定义本发明的范围和处于这些权利要求范围内的方法和结构，并且以此同样涵盖了它们的等价形式。
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