自由漂浮链：浆膜癌干细胞
阅读：773发布：2020-10-13
专利汇可以提供自由漂浮链：浆膜癌干细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及浆膜癌干细胞(CSC)的克隆纯群体、产生和培养CSC的方法、以及它们的应用。CSC形成自由漂浮链(细胞的自由漂浮链)，其具有透明质烷和蛋白聚糖的糖萼外被。此发现已导致开发了用于 治疗 浆膜癌和卵巢癌的方法，其中通过靶向糖萼形成的去除或抑制，包括利用化疗疗法并连同糖萼 抑制剂 一起的联合疗法。本发明还提供了药物筛选测定，用于确定有效对抗这些CSC以及其它浆膜癌细胞的化合物。提供了利用自由漂浮链基因标签、蛋白、和表面 抗原 来监测患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法。，下面是自由漂浮链：浆膜癌干细胞专利的具体信息内容。
1.一种用于产生浆膜癌干细胞的方法，所述方法包括
(a)在产生腹膜内(ip)肿瘤的条件下，用一定量的哺乳动物浆膜上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的、非人哺乳动物；
(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；
(c)将所述腹水分流成包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一流分以及包含浆膜球形体的第二流分；
(d)从所述第一流分中去除所述白细胞以获得富含自由漂浮链的流分；
(e)在产生粘附间充质细胞以及富集浆膜癌干细胞的浆膜自由漂浮链的悬浮液的条件下，培养所述富含自由漂浮链的流分一定时间。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
(f)收集所述浆膜自由漂浮链的悬浮液；
(g)分离所述浆膜自由漂浮链与可能已经形成的任何浆膜球形体；
(h)在产生包含至少50-100%的浆膜癌干细胞的自由漂浮浆膜自由漂浮链的培养物的条件下，在悬浮液中连续传代所述自由漂浮链一定时间。
3.一种用于产生浆膜癌干细胞的方法，所述方法包括
(a)在产生腹膜内(ip)肿瘤的条件下，用一定量的哺乳动物浆膜上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的非人哺乳动物；
(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；
(c)将所述腹水分流成包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一腹水流分以及包含浆膜球形体的第二腹水流分；
(d)在产生粘附间充质细胞以及自由漂浮的自由漂浮链和肿瘤球形体的悬浮培养物的条件下，培养所述第二流分一定时间；以及
(e)将所述悬浮培养物分流成包含富集浆膜癌干细胞的自由漂浮的自由漂浮链的第一培养流分以及包含富集浆膜癌干细胞的自由漂浮肿瘤球形体的第二培养流分。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括
(f)在产生自由漂浮链和肿瘤球形体的另外的悬浮培养物的条件下，培养所述第二培养流分一定时间；
(g)将所述另外的悬浮培养物分流成自由漂浮链流分和肿瘤球形体流分；
(h)在产生包含至少10-30%浆膜癌干细胞的自由漂浮肿瘤球形体的悬浮培养物的条件下，使用所述自由漂浮肿瘤球形体流分重复步骤(f)和(g)一定时间。
5.一种用于分离浆膜自由漂浮链的方法，所述方法包括
(a)在产生腹膜内(ip)肿瘤的条件下，用一定量的哺乳动物浆膜上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的非人哺乳动物；
(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；
(c)将所述腹水分流成包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一流分以及包含浆膜球形体的第二流分；以及
(d)从所述第一流分中去除所述白细胞以获得富含自由漂浮链的流分。
6.一种用来分离浆膜球形体的方法，所述方法包括
(a)在产生腹膜内(ip)肿瘤的条件下，用一定量的哺乳动物浆膜上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的非人哺乳动物；
(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；
(c)将所述腹水分流成包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一流分以及包含浆膜球形体的第二流分；以及
(d)分离所述浆膜球形体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在注射所述细胞一段足以产生ip肿瘤的时间以前、同时或以后，诱导腹膜内炎症。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非人哺乳动物是缺乏T细胞、B细胞和/或天然杀伤细胞的小鼠。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述小鼠是NOD/SCID小鼠、NSG小鼠或NOG小鼠。
10.根据权利要求1、3、5或6中任一项所述的方法，其中，分流包括通过30-60μm过滤器过滤所述腹水以获得包含所述浆膜自由漂浮链和白细胞的流过流分以及包含浆膜球形体的保留流分。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，浆膜是卵巢的。
12.分离的克隆纯浆膜癌干细胞。
13.一种浆膜癌干细胞的克隆纯、自我更新群体，包含细胞的对称分裂的自由漂浮链，其中所述链包含约四(4)至约七十二(72)个细胞，或更多，并被包含透明质烷的糖萼包围，以及其中所述细胞是E-钙黏着蛋白阴性的，具有相对于浆膜上皮肿瘤细胞的增加的植活潜力，保留连续再克隆潜力，并且在体外呈现至少50%再克隆能力。
14.根据权利要求12或13所述的浆膜癌干细胞，其中，所述细胞是卵巢癌干细胞。
15.一种用来筛查测试化合物对浆膜癌干细胞的抗增殖效应的方法，所述方法包括(a)培养任何一种或多种的解离的浆膜自由漂浮链细胞、解离的浆膜球形体细胞和解离的浆膜癌黏附细胞，所述细胞能够发荧光或发光；
(b)使所述细胞接触所述测试化合物；
(c)通过检测由所述培养物发射的荧光或发光来检测所述细胞是否增殖自由漂浮链、球形体和黏附细胞；以及
(d)确定所述测试化合物是否抑制所述自由漂浮链、球形体或黏附细胞的增殖。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括
(e)确定所述测试化合物是否相对于球形体或黏附细胞不同地抑制所述自由漂浮链的增殖。
17.一种用来筛查测试化合物对浆膜癌干细胞的形态效应的方法，所述方法包括(a)培养任何一种或多种的解离的浆膜自由漂浮链细胞、解离的浆膜球形体细胞和解离的浆膜癌黏附细胞，所述细胞能够发荧光或发光；
(b)使所述细胞接触所述测试化合物；
(c)通过检测由所述培养物发射的荧光或发光来检测所述细胞是否增殖自由漂浮链、球形体和黏附细胞；以及
(d)确定所述测试化合物是否抑制所述自由漂浮链、球形体或黏附细胞的增殖。
18.根据权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括
(e)确定所述测试化合物是否相对于球形体或黏附细胞不同地改变所述自由漂浮链的形态。
19.一种用来筛查测试化合物的抗增殖效应或形态效应的方法，所述方法包括(a)解离浆膜自由漂浮链并制备单细胞的同质群体；
(b)在产生具有建立的糖萼外被的自由漂浮链的条件下接种和培养所述细胞一定时间；
(c)使所述培养物接触至少一种测试化合物足够的时间，以允许未经处理的培养物增殖但没有达到汇合；以及
(d)确定在所述经处理的培养物中所述测试化合物是否抑制所述自由漂浮链的增殖或改变所述自由漂浮链的形态。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，在接种约3、4、5、6或7天以后，使所述培养物接触所述测试化合物。
21.根据权利要求19或20所述的方法，所述方法进一步包括，在步骤(b)以后但在步骤(c)以前，用一定量的透明质酸酶、胶原酶或两者，温育所述培养物一定时间，以足以去除或破坏所述自由漂浮链的所述糖萼外被。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述温育时间是在37°C下约10分钟。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，通过在染色或没有染色的情况下人工计数细胞，测量荧光信号、发光信号，或通过alamarBlue染色和检测，来确定化合物的增殖效应。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中，在384孔或1536孔板中进行培养以便于高通量筛查。
25.一种用来筛查测试化合物的抗增殖效应或形态效应的方法，所述方法包括(a)解离浆膜球形体和制备单细胞的同质群体；
(b)在产生具有足够数量和大小并具有建立的糖萼外被的球形体的条件下，接种和培养所述细胞一定时间；
(c)使所述培养物接触至少一种测试化合物足够的时间以使未经处理的培养物增殖但没有达到汇合；以及
(d)确定在所述经处理的培养物中所述测试化合物是否抑制所述球形体的增殖或改变所述球形体的形态。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，在接种约8至约14天以后，使所述培养物接触所述测试化合物。
27.根据权利要求25或26所述的方法，所述方法进一步包括，在步骤(b)以后但在步骤(c)以前，用一定量的透明质酸酶、胶原酶或两者，温育所述培养物一定时间，以足以去除或破坏所述球形体的所述糖萼外被。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述温育时间是在37°C下的约10分钟。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中，通过在染色或没有染色的情况下人工计数细胞，测量荧光信号、发光信号，来确定化合物的增殖效应。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中，在384孔或1536孔板中进行培养以便于高通量筛查。
31.一种用来在接受化学疗法或放射治疗的患者中治疗浆膜癌的方法，所述方法包括给予一定量的透明质烷合酶抑制剂、透明质酸酶、胶原酶、或它们的组合一定时间，以增强所述疗法或治疗，或改善或增加患者存活时间，或引起症状的缓解。
32.一种用来在患者中治疗浆膜癌的方法，所述方法包括共同给予一定量的放射治疗以及透明质烷合酶抑制剂、透明质酸酶、胶原酶、或它们的组合一定时间，以引起症状的缓解和/或癌症消除或减小的其它度量。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中，所述透明质烷合酶抑制剂、透明质酸酶或胶原酶中的任何一种被聚乙二醇化或用其它方式修饰以增加其体内半衰期。
34.一种用来在患者中抑制癌干细胞自我更新或形成的方法，所述方法包括给予所述患者一定量的糖萼形成的抑制剂或降解糖萼的试剂一定时间，以在所述患者中抑制糖萼形成或降解CSC的糖萼，从而抑制所述CSC的自我更新或形成，或引起CSC的分化并使它们容易受到杀伤，防止所述自由漂浮链进行球形体形成，或它们的任何组合。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述抑制剂或试剂被聚乙二醇化或用其它方式修饰以增加其体内半衰期。
36.一种用于编码哺乳动物HAS2剪接变体的分离的核酸。
37.根据权利要求36所述的核酸，具有编码HAS2剪接变体的mRNA或cDNA序列。
38.根据权利要求37所述的核酸，其中，所述核酸包含相邻核苷酸序列，以5’至3’次序，基本上包括HAS2基因的外显子2的全部或部分以及外显子3的全部。
39.根据权利要求36所述的分离的核酸，其中，所述HAS2剪接变体基本上包括人HAS2编码序列的氨基酸215至552。
40.一种载体，包含权利要求36-39中任一项所述的核酸。
41.一种细胞，包含权利要求40所述的载体。
42.一种分离的核酸探针，用于特异性检测哺乳动物HAS2剪接变体RNA或选自在表17和18中确定的突变的任何一种或多种HAS2突变。
43.一种分离的哺乳动物HAS2蛋白，由HAS2剪接变体mRNA或相应cDNA编码。
44.一种由根据权利要求36-39中任一项所述的核酸编码的分离的HAS2蛋白。
45.一种分离的核酸，编码哺乳动物突变体HAS2或哺乳动物突变体HAS2剪接变体。
46.一种载体，包含根据权利要求45所述的核酸。
47.一种细胞，包含根据权利要求46所述的载体。
48.一种用于在主体中监测和/或分期浆膜癌的方法，所述方法包括
(a)从获自癌症患者的腹水制备自由漂浮链；
(b)检测所述自由漂浮链是否具有一个或多个HAS2突变和/或表达一种或多种HAS2剪接变体；以及
(c)将所述突变和/或变体与在所述患者中的癌症的存在和/或进展相关联。
49.一种用来在患者样品中确定或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括(a)从患者获得细胞样品；
(b)可选地，除尽所述样品的白细胞；
(c)由所述样品的其余部分制备DNA、RNA或两者；
(d)检测所述DNA、RNA或两者是否具有HAS2突变或表达HAS2剪接变体，其中突变或剪接变体的鉴定表明在所述样品中存在浆膜癌干细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，所述方法进一步包括量化具有HAS2突变或表达HAS2剪接变体的DNA、RNA或两者的量，并将所述量与在所述患者中癌症的存在和/或癌症的进展相关联。
51.一种用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者获得细胞样品；
(b)除尽所述样品的白细胞；
(c)使所述样品和一系列的可检测的表面抗原抗体反应；
(d)将所述经反应的细胞分类成单细胞或多细胞样品；以及
(e)检测任何所述单细胞或多细胞样品是否对于CD49f、CD90、CD166、PDGFRA、和GM2蛋白的存在是阳性的，以及对于CD34、CD133、MUC16和EPCAM蛋白的存在是阴性的，其中所述蛋白的存在和不存在将所述经反应的细胞确定为包含浆膜癌干细胞或将单细胞确定为浆膜癌干细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，分选是通过荧光激活细胞分选术(FACS)。
53.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者获得细胞样品；
(b)除尽所述样品的白细胞；
(c)从所述样品的其余部分中提取RNA；
(d)针对人mRNA转录组的表达水平来分析所述RNA；以及
(e)将具有表面基因组相关自由漂浮链基因标签的样品鉴定为那些具有上调HAS2和PDGFRA、下调MUC16和EPCAM以及具有上调的至少7种另外的表11所列基因的样品，其中具有那些特征则表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
54.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者的细胞样品中获得整合膜蛋白流分，其中所述细胞样品已可选地除尽白细胞；
(b)通过质谱法来分析所述膜流分的蛋白质含量；
(c)将具有表面基因组相关自由漂浮链蛋白质标签的样品鉴定为那些其中光谱数据表明存在至少40种表16所列蛋白的样品，其中那些蛋白质的存在表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，通过相分配过程并利用曲通X-114来制备所述整合膜蛋白流分。
56.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者获得细胞样品；
(b)除尽所述样品的白细胞；
(c)从所述样品的其余部分中提取RNA；
(d)针对人miRNA的表达水平来分析所述RNA；以及
(e)将具有miRNA相关自由漂浮链标签的样品鉴定为那些具有下调miRNA的let-7和
200家族、下调hsa-miR-23b和hsa-miR-27b、以及具有上调的至少4种另外的表8所列的miRNA的样品，其中具有那些特征表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
57.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者获得细胞样品；
(b)除尽所述样品的白细胞；
(c)从所述样品的其余部分中提取RNA；
(d)针对人mRNA转录组的表达水平来分析所述RNA；以及
(e)将具有自由漂浮链基因标签的样品鉴定为那些具有上调的HAS2和PDGFRA以及具有上调的至少5种另外的表5所列的基因的样品，其中具有那些特征表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
58.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者获得细胞样品；
(b)可选地，除尽所述样品的白细胞；
(c)从所述样品的其余部分中提取RNA；
(d)针对人mRNA转录组的表达水平来分析所述RNA；以及
(e)将具有自由漂浮链簇限定基因标签的样品鉴定为那些具有在表7清单1中的上调的9种基因中的至少6种基因以及具有在表7清单2中的上调的至少5种基因的样品，其中具有自由漂浮链簇限定基因标签表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
59.一种用于在主体中确定浆膜癌干细胞的方法，所述方法包括
(a)在组织样品中检测来自表5的10种或更多种基因的表达水平，其中相对于在浆膜间充质单层细胞中的表达，按照表5的基因的增大或减小的表达表明浆膜癌干细胞的存在。
60.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者样品中获得分离的外染色体；
(b)通过质谱法、通过抗体结合或其它方式，来分析所述外染色体的蛋白质含量；
(c)将具有外染色体自由漂浮链蛋白质标签的样品鉴定为那些其中光谱数据或其它数据表明存在CD63、COL1A2和至少5种另外的表13所列的蛋白质的样品，其中所述蛋白质的存在表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
61.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者样品中获得分离的外染色体；
(b)使所述外染色体与对于CD63、COL1A2和至少5种另外的表13所列的蛋白具有特异性的一种或多种抗体进行反应；以及
(c)将具有外染色体自由漂浮链蛋白质标签的样品确定为那些其中对于CD63、COL1A2和至少5种另外的表13所列的蛋白质的存在呈阳性的样品，其中所述蛋白质的存在表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
62.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从其中已除去细胞、细胞碎片和外染色体的患者样品中获得上清流分；
(b)通过质谱法来分析所述上清流分的蛋白质含量；
(c)将具有分泌体自由漂浮链蛋白质标签的样品确定为那些其中光谱数据表明存在至少20种表15所列蛋白的样品，其中那些蛋白的存在表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
63.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从其中已除去细胞、细胞碎片和外染色体的患者样品中获得上清流分；
(b)通过质谱法来分析所述上清流分的蛋白质含量；
(c)将具有糖萼标签的样品确定为那些其中光谱数据表明存在至少6种在如表4所列糖萼中发现的蛋白质以及不存在ELN、FN1和至少2种在如表4所列的自由漂浮链中下调的蛋白质的样品，其中那些蛋白质的存在和不存在表明所述患者样品包含浆膜癌干细胞。
64.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从患者获得细胞样品或来自细胞样品的细胞裂解液，其中所述样品已除尽白细胞；
(b)用一系列的人酪氨酸激酶受体特异性抗体和泛磷酸酪氨酸抗体温育所述样品或所述裂解液；以及
(c)检测是否所述样品或裂解液对于激活磷蛋白是阳性的，其中所述激活磷蛋白选自由PDGFRA和至少6种蛋白组成的组，而所述蛋白选自由PDGFRβ、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰岛素-R、IGF1R、DTK/TYRO3、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt-3、c-rRET、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、TrkA/NTRK1、VEGFR3、EphA1、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和EphB6组成的组，其中检测出所述激活磷蛋白将所述患者样品确定为包含浆膜癌干细胞。
65.一种用来在患者样品中确定和/或监测浆膜癌干细胞的存在的方法，所述方法包括
(a)从其中已除去细胞和细胞碎片的患者样品中获得上清流分；
(b)使所述样品和抗COL1A2抗体反应；
(c)检测是否所述抗体结合透明质烷和胶原蛋白的小于20,000道尔顿的低分子量复合物，其中检测出所述复合物表明所述样品包含浆膜癌干细胞。
66.根据权利要求49-65中任一项所述的方法，其中，所述样品是哺乳动物浆膜液、腹水、血液或肿瘤组织。
67.根据权利要求48、49、50、53、或56-59中任一项所述的方法，其中，通过微阵列分析、通过RNA或DNA测序技术、通过RT-PCR或通过Q-RT-PCR，来完成核酸的检测或表达水平的确定。
68.一种用来在浆膜癌患者中检测浆膜癌、监测癌症治疗方案的效力、对需要治疗的患者进行分类、监测药物疗效、预测患者对癌症治疗方案的反应的方法，所述方法包括(a)对来自患者的样品定期进行权利要求48-67所述的一种或多种方法，以及(b)关联来自所述方法的结果与所述患者的状态，从而检测浆膜癌、监测癌症治疗方案的效力、对需要治疗的患者进行分类、监测药物疗效或预测患者对癌症治疗方案的反应。
69.一种用来治疗浆膜癌的方法，所述方法包括(a)将抗癌治疗方案给予浆膜癌患者；
(b)定期审查对来自所述患者的样品进行权利要求48-67所述的一种或多种方法所获得的结果，以及(c)根据需要并符合所述结果来改变所述治疗方案。
70.一种用来筛查转移性抑制剂或转移性效应物的方法，所述方法包括(a)用自由漂浮链或自由漂浮链细胞的制剂静脉注射免疫减弱的、非人哺乳动物，(b)将一种或更多种测试化合物给予所述哺乳动物，其中能够在注射以前、以后或同时进行给予，以及(c)相对于对照哺乳动物评估在所述哺乳动物中肿瘤生产和/或肿瘤位置的时间进程，从而确定抑制自由漂浮链细胞的转移的化合物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，肿瘤生产的减少或肿瘤位置的变化将所述一种或多种化合物确定为转移性抑制剂或转移性效应物。
72.一种体内筛查药物疗效的方法，所述方法包括
(a)用自由漂浮链或自由漂浮链细胞的制剂腹膜内注射免疫减弱的、非人哺乳动物；
(b)将一种或多种测试化合物给予所述哺乳动物，其中能够在注射以前、以后或同时进行给予；以及
(c)相对于对照哺乳动物，评估
(i)在所述哺乳动物中肿瘤生产的时间进程，
(ii)在所述哺乳动物中浆膜液生产的时间进程，
(iii)在所述哺乳动物中肿瘤的形态，和/或
(iv)在所述哺乳动物的腹水中浆膜癌干细胞生产的量和/或时间进程，
从而确定药物化合物在治疗浆膜癌中的潜在或实际效力。
73.一种用来从源自原发性浆膜肿瘤的自由漂浮链或从转移性肿瘤细胞生产球形体的方法，所述方法包括在包含一定量的Matrigel的第一含血清培养基中培养所述自由漂浮链或所述细胞的悬浮液一定时间，以足以诱导球形体形成和产生球形体培养体系，以及定期用不含额外的Matrigel的含血清培养基来补充所述培养体系。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，第一含血清培养基与Matrigel的比例是50:1并且每周补充所述培养体系。
75.一种用来从浆膜液生产自由漂浮链的方法，所述方法包括(a)从癌症患者获得浆膜液的样品，(b)从所述液中收获细胞，(c)在补充有无细胞浆膜液的含血清培养基中培养所述细胞，(d)将由所述细胞产生的悬浮培养物定期传代到补充有无细胞浆膜液的新鲜的含血清培养基中，从而获得自由漂浮链。
76.根据权利要求75所述的方法，其中，所述浆膜液来自相同癌症患者并且以1:1的比例补充培养基。
77.根据权利要求75或76所述的方法，其中，每周传代所述细胞。
78.一种PCR引物组，包含用于哺乳动物基因的PCR引物，其中所述基因选自由下述组成的组
(a)CD49f、CD90、CD166、PDGFRA和GM2基因；
(b)CD49f、CD90、CD166、PDGFRA、GM2、CD34、CD133、MUC16和EPCAM基因；
(c)HAS2、PDGFRA和至少10种表11所列的上调基因；
(d)HAS2、PDGFRA、MUC16、EPCAM和至少10种表11所列的上调基因；
(e)至少40种表16所列的蛋白的基因；
(f)let-7和200miRNA家族、hsa-miR-23b和hsa-miR-27b、以及至少4种另外的表8所列的miRN；
(g)HAS2、PDGFRA和至少5种另外的表5所列的基因；
(h)在表7的清单1中的9种基因和至少5种在表7的清单2中的基因；
(i)来自表5的10种或更多种基因；
(j)CD63、COL1A2和至少5种另外的表13所列的蛋白的基因；
(k)至少20种表15所列蛋白的基因；
(l)至少6种如列于表4中的糖萼蛋白的基因；
(m)ELN、FN1、至少6种如在表4中所列的糖萼蛋白的基因，和至少2种在表4中列出的下调的蛋白的基因；以及
(n)PDGFRA和至少6种蛋白的基因，其中所述蛋白选自由PDGFRβ、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰岛素-R、IGF1R、DTK/TYRO3、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt-3、c-rRET、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、TrkA/NTRK1、VEGFR3、EphA1、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和EphB6组成的组。
79.一种用来制备具有糖萼外被、用于电子显微镜检查的细胞的方法，所述方法包括(a)将所述细胞等分在适用于电子显微镜的阳离子表面上；
(b)使所述细胞沉降于和粘附于所述阳离子表面；
(c)将固定剂、和可选的一种或多种染色剂加入所述细胞的等分部分中，然后在固定所述细胞和糖萼的条件下温育一定时间；以及
(d)从所述表面，冲洗所述固定剂和，如果使用的话，染色剂。
80.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，浆膜是卵巢浆膜。
81.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞、核酸、载体、蛋白质或基因，其中哺乳动物是人、鼠科动物、猪、牛科动物或绵羊。
自由漂浮链：浆膜癌干细胞
[0001] 本申请要求2009年11月5日提交的美国临时申请序列号61/258,570和2010年1月7日提交的美国序列号61/293,113的优先权，其各自的全部内容以引用方式结合于本文。
技术领域
[0002] 本发明涉及浆膜癌干细胞(CSC)的克隆纯群体、产生和培养CSC的方法、以及它们的应用。CSC形成自由漂浮链(细胞的自由漂浮链)，其具有透明质酸和蛋白聚糖的糖萼外被。此发现已导致用于治疗浆膜和卵巢癌的方法的开发，其中通过靶向糖萼形成的去除或抑制，包括利用化疗疗法并连同糖萼抑制剂一起的联合疗法。本发明还提供了药物筛选测定，用于确定有效对抗这些CSC以及其它浆膜癌细胞的化合物。提供了应用自由漂浮链基因标签、蛋白质和表面抗原的方法，用于监测患者样品中浆膜癌干细胞的存在。
背景技术
[0003] 癌症干细胞(CSC)假说提示，在癌症中，正常组织干细胞变成恶性的或更加分化的组织可以被转化并发展干细胞特性。人CSC通常定义为恶性细胞的“稀有”群体，其可以进行无限制的自我更新并具有对称分裂能力。当被连续移植时，这些“肿瘤原始细胞”或癌症干细胞可以再生原始肿瘤的所有成分。
[0004] 癌症干细胞的概念对我们对如何治疗癌症的理解已产生重大影响。不幸的是，除非可以根除CSC，否则它们可以再次增殖并生成癌症，从而导致复发。认为CSC特别耐化学疗法和放射疗法，这使得特别难以消除它们，甚至用可以有效地破坏大部分肿瘤并产生缓解的治疗也是如此。
[0005] CSC假说取决于具有肿瘤起始能力的细胞的前瞻性纯化，而与频率无关。癌症干细胞假说认识到，相对于更加分化的肿瘤细胞，CSC的发生率可以显着不同，从0.001%至100%，其取决于肿瘤类型、肿瘤的发展阶段(例如，转移性的与非转移性的)，或如果对选自原发性肿瘤的肿瘤细胞系进行了研究，则在从一开始就具有高CSC含量。
[0006] 针对CSC，已开发了若干体外测定，如在半固体培养基中的克隆、致癌球形体（oncospheroid）形成、有限稀释连续再克隆、基质集落形成。然而，体外CSC测定受限于未知和可能变量“平板效率”的问题，其取决于提供例如，生长因子、形态发生素和/或交互生态位成分的适当组合和浓度。目前的用于人CSC的“金标准”是在免疫缺陷小鼠(裸鼠、SCID鼠或NOD-SCID鼠)中的肿瘤起始有限稀释测定，然而，这些受体具有先天免疫抗性(天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞)。另外，任何体内测定具有“接种效率”，其取决于细胞如何有效地定位于它们的正确的“生态位”。如果将CSC注入缺乏适当“生态位”或微环境(间充质微环境，内皮微环境)的非同位部位(例如，皮下)，则它们的数目可以被低估，这是由于死亡或终末分化。如果静脉注射，例如，在转移性模型中，CSC离开脉管系统并发现适当生态位的能力可以通过归巢受体(例如，整联蛋白)和趋化因子受体(例如，CXCR4)的可变表达来确定，而与细胞的干细胞状态无关。如果CSC依赖于生长因子或形态发生素(例如，IL-6、GM-CSF、M-CSF、IL-3HGF)的旁分泌刺激，则可以存在物种特异性。在大多数组织中已确立了转运扩增祖细胞群体的存在并且这样的群体可以产生数十亿的分化细胞。因此，除非可以证明再传代能力，否则肿瘤发展的原初体内测定并不是先验的CSC测定。
[0007] 在妇女的癌症死亡中卵巢癌症名列第五并且比任何其它妇科癌引起更多死亡。据估计，在美国，每年将诊断22,430例新病例，并具有15,280例死亡[Jemal,2008]。在至少两个重要方面，卵巢癌仍然是令人困惑的。首先，此癌症的起源的组织学区域仍然是模糊的，其次，由癌症病理学家一般公认的可辨认的癌前病变尚未确定。大多数(80%)患者显示癌细胞存在于整个腹腔的晚期疾病，从而直接导致高死亡率(5年存活率为15-45%)。相比之下，对于癌限于卵巢的早期疾病而言，存活率是~95%。鉴于在早期疾病和后期疾病之间在存活结果方面的差异，便于在早期检出卵巢癌的策略将有希望显著改善存活。不幸的是，目前用于检测早期卵巢癌的筛查方法是不适当的。
[0008] 患有晚期卵巢癌的患者的中位总生存期已从1975年的大约1年提高到目前的超过3年，并且对于具有最佳减体治疗的疾病并用基于紫杉烷和铂的组合化学疗法加以治疗的亚类，存活期现超过5年[Ozols;Markman,2003]。然而，病程缓解和复发之一，其需要间歇性再治疗。理解了CSC的生物特性和上述细胞存活的机制，因而针对转移和再生肿瘤的多轮化学疗法是重要的，以发现早期检测方法和根除卵巢癌。
[0010] 在浆膜(腹膜、胸膜、和心包)腔内的渗漏液中癌细胞的存在是晚期癌症的临床表现并伴有较差的存活期。在渗漏液中的肿瘤细胞最常来源于卵巢、胸、和肺的原发癌，以及来源于恶性间皮瘤，此解剖部位的一种原生肿瘤[Di Maria,2007;Davidson,2007]。不同于大多数的实体瘤，尤其是在原发部位，在渗漏液中的癌细胞不适合于手术清除，并且它们的根除失败是治疗失败的主要原因之一[Davidson,2007]。
[0011] 肿瘤球形体(还称作致癌球形体)的形成是肿瘤细胞适应在渗出液中生长的机制。在来自浆膜癌患者的胸膜、心包积液和腹水样品中发现肿瘤球形体。在卵巢癌中最好说明了肿瘤球形体的病理生理意义，这是因为在腹膜腹水中显著比例的癌细胞存在为球形体。在癌症治疗方面的进展将取决于可以靶向CSC的新治疗剂的鉴定，其中上述CSC存在为个别实体或存在为这些多细胞球形体。另外，筛查系统将便于开发对处于静止GO状态的周期运行干细胞和CSC具有毒性的化合物。
[0012] 虽然最近一些报道已报道了从卵巢癌来分离细胞的亚群体，当移植到免疫缺陷小鼠中时，其似乎富集能够诱发肿瘤的细胞[Szotek,2006;Zhang,2008;Bapat,2005]，但没有报道这样的克隆纯细胞，其可以在组织培养体系中保持在它们的干细胞状态。用来保持和扩大克隆纯细胞而没有分化的体外体系的缺乏已阻碍浆膜癌干细胞的基因表达谱和蛋白质组学分析。另外，用于CSC扩大的体外培养体系的缺乏已放慢了高通量药物筛查方法的开发，其中上述方法具有确定特异性地靶向CSC的新化合物的潜力。
发明内容
[0013] 在一个方面，本发明提供了用来浆膜癌干细胞的方法，该方法包括(a)在腹膜内(ip)肿瘤的条件下用一定量的浆膜上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的、非人哺乳动物；(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；(c)将腹水分流成包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一流分以及包含浆膜球形体的第二流分；(d)从所述第一流分去除白细胞以获得富含自由漂浮链流分；以及(e)在产生粘附间充质细胞以及富集有浆膜癌干细胞的浆膜自由漂浮链的悬浮液的条件下，培养富含自由漂浮链流分一定时间。此方法可以进一步包括(f)收集浆膜自由漂浮链的悬浮液，；(g)分离浆膜自由漂浮链与可能已经形成的任何浆膜球形体；以及(h)在产生包含至少50至100%浆膜癌干细胞的自由漂浮浆膜自由漂浮链的稳定培养物的条件下，在悬浮液中连续传代这些自由漂浮链一定时间。
[0014] 在另一个方面，本发明涉及用来产生浆膜癌干细胞的方法，该方法包括(a)在产生腹膜内(ip)肿瘤的条件下用一定量的浆膜上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的、非人哺乳动物；(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；(c)将腹水分流分包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一腹水流分以及包含浆膜球形体的第二腹水流分；(d)在产生粘附间充质细胞以及自由漂浮链和肿瘤球形体的悬浮培养物的条件下培养第二流分一定时间；以及(e)将悬浮培养物分流成包含富集有浆膜癌干细胞的自由漂浮链的第一培养流分和包含富集有浆膜癌干细胞的自由漂浮肿瘤球形体的第二培养流分。此方法可以进一步包括(f)在产生自由漂浮链和肿瘤球形体的另外的悬浮培养物的条件下培养所述第二培养流分一定时间；(g)将所述另外的悬浮培养物分流成自由漂浮链和肿瘤球形体流分；以及(h)在产生包含至少10-30%浆膜癌干细胞(如通过体外再克隆能力所确定的)的自由漂浮肿瘤球形体的(稳定)悬浮培养物的条件下，对自由漂浮球形体流分重复步骤(f)和(g)一定时间。
[0015] 在又一个方面，本发明涉及用来分离浆膜自由漂浮链的方法，该方法包括(a)在产生腹膜内(ip)肿瘤的条件下用一定量的浆膜上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的、非人哺乳动物；(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；(c)将腹水分流成包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一流分以及包含浆膜球形体的第二流分；以及(d)从所述第一流分去除白细胞以获得富含自由漂浮链流分。按照本发明，可以通过以下步骤来分离球形体：(a)在产生腹膜内(ip)肿瘤的条件下用一定量的卵巢上皮肿瘤细胞腹膜内注射免疫减弱的、非人哺乳动物；(b)从携带ip肿瘤的非人哺乳动物收获腹水；(c)将腹水分流成包含浆膜自由漂浮链和白细胞的第一流分以及包含浆膜球形体的第二流分；以及(d)分离浆膜球形体。
[0016] 在本发明的前述方法中，可以在利用本领域已知的方法注射细胞以前、同时或以后诱导腹膜内炎症。用于这些方法的免疫减弱的非人哺乳动物包括缺乏T细胞、B细胞和/或天然杀伤(NK)细胞的小鼠。在优选的实施方式中，有用的小鼠包括但不限于NOD/SCID小鼠、NSG小鼠和NOG小鼠。如在实施例中所示，通过30-60μm过滤器、以及甚至更优选地通过40μm过滤器进行过滤，来方便地完成腹水的分流，以获得包含自由漂浮链和白细胞的流过流分以及包含较大的球形体的保留流分。
[0017] 利用这些方法，可以获得在自由漂浮链中的分离的克隆纯浆膜癌干细胞。这些克隆纯浆膜癌干细胞是细胞的自我更新群体，其包含细胞的对称分裂的自由漂浮链并具有约三至四(3-4)至约七十二(72)个细胞、或更多细胞。上述链由透明质烷（透明质酸糖胺多糖，hyaluronan）、胶原蛋白和其它细胞外成分的糖萼所包围。这些细胞是E-钙黏着蛋白阴性，具有相对于浆膜上皮肿瘤细胞的增加的植活潜力，以及具有至少50%的体外再克隆能力。在某些实施方式中，浆膜细胞是卵巢细胞。这些自由漂浮链被称为自由漂浮链或浆膜癌干细胞。
[0018] 本发明的另一方面提供了用来筛查测试化合物的抗增殖效应的方法，其中通过(a)培养解离的浆膜自由漂浮链细胞、解离的浆膜球形体细胞或解离的浆膜癌黏附细胞的任何一种，所有上述细胞能够发荧光或发光；(b)使细胞接触测试化合物；(c)通过检测由培养物发射的荧光或发光来检测细胞是否作为响应进行增殖；以及(d)确定测试化合物是否已抑制自由漂浮链、球形体或黏附细胞的增殖。在一些实施方式中，上述方法包括确定测试化合物是否相对于球形体或黏附细胞不同地抑制自由漂浮链的增殖。另外，这些方法可以适应于筛查化合物对浆膜癌干细胞的形态效应，其中通过使步骤(c)检测形态变化(例如，如自由漂浮链到球形体的变化、球形体到自由漂浮链的变化、自由漂浮链到上皮单层的变化、自由漂浮链到间充质单层的变化、球形体到上皮单层的变化、球形体到间充质单层的变化，或细胞形态形状的改变，在特定细胞周期阶段的阻滞等)。这些方法可以容易适应于高通量筛查(HTS)，其中通过例如在384或1536孔板中生长细胞，并利用用于操作试剂的机器人系统进行测定，然后收集和分析数据。上述系统在本领域中是已知的。
[0019] 在用测试化合物进行筛查测定时，发现，细胞的敏感性，在许多但不是所有情况下，取决于在自由漂浮链和球形体上建立的糖萼的存在。因此，如果在接种细胞以后立即或不久(通常在1天内)添加测试化合物，则细胞对化合物是敏感的。然而，如果若干天(通过3-7天)以后添加化合物，则糖萼具有足够的时间来重新建立，并且细胞会变得越来越耐化合物。在一些情况下，抗性可以是若干数量级大于化合物对细胞的最敏感效应。如果除去糖萼，则这种效应是可逆的，从而使细胞变得再次对化合物敏感的。获得的抗药性超时提示，它涉及细胞外周糖萼的再合成和组织。因此，糖萼可以提供对化合物的选择性屏障，其取决于它们的化学性能(尺寸、极性、疏水性、扩散)。这些观测结果导致本发明的两个另外的方面：(1)另一种筛查方法和(2)用于治疗浆膜癌的新方法。
[0020] 因此，本发明的又一方面提供了用来筛查测试化合物的抗增殖或形态效应的方法，该方法包括(a)解离浆膜自由漂浮链和制备单细胞的同质群体；(b)在产生具有建立的糖萼外被的自由漂浮链的条件下接种和培养那些细胞一定时间；(c)使培养物接触至少一种测试化合物一定时间，其将足以使未经处理的培养物可以增殖而没有达到汇合，即，在筛查测定过程中，培养物应仍然是亚汇合的；以及(d)确定在经处理的培养物中测试化合物是否抑制自由漂浮链的增殖或改变自由漂浮链的形态。在一种优选实施方式中，在接种后第3、4、5、6或7天，并且更优选在第5或6天，将测试化合物加入培养物。在这种方法的一种变通方式中，在步骤(b)以后但在步骤(c)以前，可以用一定量的透明质酸酶、胶原酶或两者温育培养物一定时间，以足以去除或破坏所述自由漂浮链的糖萼外被。通过在37°C下进行上述处理约5-30分钟，并且优选约10分钟。在测定的其余时间中并不需要除去这些酶。上述酶的修饰和聚乙二醇化变体也可以用于本发明的方法。这些测定也可以容易地适应于HTS格式（如上述）。为了确定测试化合物是否影响增殖，可以在有或没有染色或荧光信号、发光信号或测得吸光率的情况下来人工计数细胞。由于自由漂浮链存在于悬浮液中，所以检测方法需要相应地加以调整并且可以由本领域技术人员来进行。一种优选的检测方法是利用 染色，接着测量培养物的荧光或吸光率，其正比于在培养物中存在的活细胞并且独立于细胞是粘连的或在悬浮液中。
[0021] 还提供了用于浆膜球形体的类似的测定系统。对于球形体，在产生足够数量和大小并具有建立的糖萼外被的球形体的条件下，培养解离的细胞一定时间。由于球形体是许多细胞的较大聚集体，所以和自由漂浮链相比，它需要更长时间来重新建立外被。球形体的时间范围通常是约8至约14天，以致在上述时间范围内添加测试化合物，并且优选在接种后的第11天。
[0022] 本发明的又一个方面涉及用于在接受化学疗法或放射治疗的患者中治疗浆膜癌的方法，该方法包括给予一定量的透明质烷合酶抑制剂、透明质酸酶、胶原酶、或其它酶或其它制剂（其可以除去或降解糖萼）一定时间，以增强所述治疗方案或治疗，或改善或增加患者的存活时间，或引起症状的缓解。上述方法包括共同给予放射治疗或化学疗法和透明质烷合酶抑制剂或酶或其它制剂（其可以除去或降解糖萼）。这些酶和制剂可以被聚乙二醇化或用其它方式被修饰以增加它们的体内半衰期。
[0023] 另一种实施方式涉及用于在患者中抑制癌症干细胞自我更新或形成的方法，该方法包括将一定量的糖萼形成的抑制剂或降解糖萼的制剂给予所述患者一定时间，从而抑制CSC的自我更新或形成或引起CSC的分化并使它们容易受到杀伤。这样的方法可以防止自由漂浮链进行球形体形成，其本身又可以防止CSC获得对标准癌症治疗方案的抗性。
[0024] 本发明的另一个方面涉及在自由漂浮链和在患者样品中发现HAS2剪接变体和HAS2的突变形式。因此，本发明提供了编码哺乳动物HAS2剪接变体的分离的核酸，包括mRNA和cDNA以及以5’至3’的次序包含相邻核苷酸序列的核酸，其基本上包括HAS2基因的全部或部分的外显子2和全部的外显子3，即，缺乏外显子1的剪接变体。一种mRNA HAS2剪接变体编码一种蛋白质，其开始于野生型（wt）人HAS2的氨基酸215并结束于正常停止信号，即，氨基酸552。本发明还包括包含本发明的任何核酸的载体，包含这些载体的细胞，以及利用重组表达系统来产生编码的蛋白，和编码的蛋白。本发明的其它实施方式涉及分离的核酸探针，其具体用于检测哺乳动物HAS2剪接变体RNA或任何一种或多种HAS2突变，包括SNP突变，并且优选检测在表17和18中确定的突变。因此本发明还包括野生型HAS2和HAS2剪接变体的突变和等位基因形式。
[0025] 本发明的又一个方面涉及用于在主体中监测和/或分期浆膜癌的方法，该方法包括(a)从获自癌症患者的腹水制备自由漂浮链；(b)检测自由漂浮链是否具有一种或多种HAS2突变和/或表达一种或多种HAS2剪接变体；以及(c)关联那些突变和/或变体与在所述患者中癌症的存在和/或进展。另外，可以在患者样品中确定或监测浆膜癌干细胞的存在，其中通过(a)从患者获得细胞样品；(b)可选地，除尽样品的白细胞；(c)从样品的其余部分制备DNA、RNA或两者；以及(d)检测DNA、RNA或两者是否具有HAS2突变或表达HAS2剪接变体，其中突变或剪接变体的鉴定表明在样品中存在浆膜癌干细胞。通过量化上述DNA或RNA的量，可以关联上述调查结果与在患者中浆膜癌的存在和/或浆膜癌的进展。
[0026] 自由漂浮链的广泛表征已导致发现多种方式来确定自由漂浮链，包括通过鉴定特异性表面抗原、自由漂浮链基因标签、表面基因组相关自由漂浮链基因标签（signature）、表面基因组相关自由漂浮链蛋白质标签、miRNA相关自由漂浮链标签、自由漂浮链簇限定基因（catena cluster-defining gene）标签、外染色体自由漂浮链蛋白质标签、分泌体自由漂浮链蛋白质标签、糖萼标签、激活磷蛋白表达，以及鉴定结合于抗COL1A2抗体的胶原蛋白和透明质烷的低分子量复合物。这些性能已导致各种方法来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在并为浆膜癌治疗提供个性化药物方式的能力，包括回应浆膜癌干细胞的存在来改变治疗方案的能力。
[0027] 可以用来自哺乳动物的浆膜液、腹水、血液或肿瘤组织并利用各种检测技术来实施这些方法，上述检测技术包括但不限于检测在这些测定中的核酸或确定它们的表达水平，其中通过微阵列分析、通过RNA或DNA测序技术、通过RT-PCR或通过Q-RT-PCR。蛋白质检测方法包括但不限于质谱法、Western印迹法、抗体结合FACS和在技术人员的知识范围内的其它技术或后来开发的技术。
[0028] 另外，基于确定和/或监测浆膜癌干细胞，此信息便于开发本发明的另外方法，包括用来检测浆膜癌、监测癌症治疗方案的效力、分类需要治疗的患者、监测药物疗效、在浆膜癌患者中预测患者对癌症治疗方案的反应的方法，该方法包括用来自患者的样品定期进行这些方法的一种或多种，并关联结果与患者的状态，从而检测浆膜癌、监测癌症治疗方案的效力、分类需要治疗的患者、监测药物疗效或预测患者对癌症治疗方案的反应。类似地，本发明涉及用来治疗浆膜癌的方法，该方法包括(a)将抗癌治疗方案给予浆膜癌患者；(b)定期审查用来自所述患者的样品进行这些方法的一种或多种所获得的结果，以及(c)根据需要并符合（as consistent）结果或由结果所预测的，改变治疗方案。
[0029] 本发明的又一个方面涉及利用体内动物模型来筛查转移性抑制剂或转移性效应物的方法。该方法包括(a)用自由漂浮链或自由漂浮链细胞的制剂静脉注射免疫减弱的、非人哺乳动物，(b)在注射以前、以后或同时，将一种或多种测试化合物给予哺乳动物，以及(c)相对于对照哺乳动物，评估在哺乳动物中的肿瘤生产和/或肿瘤位置的时间进程，从而确定能够抑制自由漂浮链细胞的转移的化合物尤其确定那些减少或抑制肿瘤生产或肿瘤位置变化的化合物。
[0030] 本发明的又一个方面提供了利用动物模型来筛查药物疗效的另一种体内方法。该方法包括(a)用自由漂浮链或自由漂浮链细胞的制剂腹膜内注射免疫减弱的、非人哺乳动物；(b)在注射以前、以后或同时，将一种或多种测试化合物给予哺乳动物；以及(c)相对于对照哺乳动物，评估(i)在所述哺乳动物中肿瘤生产的时间进程，(ii)在所述哺乳动物中浆膜液生产的时间进程，(iii)在所述哺乳动物中肿瘤的形态，(iv)在所述哺乳动物的腹水中浆膜癌干细胞生产的量和/或时间进程，或它们的任何组合，从而确定药物化合物治疗浆膜癌的潜在或实际效力。
[0031] 在另一个方面，本发明涉及从源自原发性浆膜肿瘤的自由漂浮链或从转移性肿瘤细胞来生产球形体的方法，该方法包括在补充有一定量的Matrigel（基质胶）（足以诱导球形体形成和产生球形体培养体系）的第一含血清培养基中培养自由漂浮链或细胞的悬浮液一定时间。这些培养物定期补充不含额外的Matrigel的含血清培养基（通常在每周一次的基础上）。优选地，第一含血清培养基与Matrigel的比例为50:1。
[0032] 本发明的又一个方面涉及从患者的浆膜液来生产自由漂浮链的方法。在此方法中，从癌症患者获得浆膜液的样品，从浆膜液收获细胞以及在补充有无细胞浆膜液的含血清培养基中培养那些细胞。将在悬浮培养物中的细胞定期传代到（转移到，passaging）补充有无细胞浆膜液的新鲜的含血清培养基中，从而获得自由漂浮链。在一种优选实施方式中，浆膜液来自相同癌症患者并以1:1的比例补充培养基。
[0033] 本发明还提供了PCR引物组，该PCR引物组包括通过自由漂浮链的广泛表征所确定的用于哺乳动物基因的PCR引物。本发明的另一方面提供了用来制备用于电子显微镜检查的自由漂浮链细胞和球形体、或任何具有糖萼外被的细胞的方法。
[0034] 最后，如果适用，在任何上述方法和产物中，浆膜可以是卵巢浆膜。同样地，表示为哺乳动物的那些方法、细胞、核酸、载体、蛋白质或基因包括或可以是人、鼠科动物、猪、牛科动物或绵羊哺乳动物（如果适用）。附图说明
[0035] 图1示出NSG小鼠的原位卵巢癌模型。用50,000个Ovcar3-GTL细胞i.p.注射NSG小鼠。用PBS(磷酸盐缓冲盐水)或用36mg/kg的脂化寡核苷酸(oligo)i.p.注射小鼠，一周三次，时间为12周。在经PBS处理组(▲)中肿瘤生长在12周以后达到平衡。经寡核苷酸处理小鼠(◆)具有连续的肿瘤生长。
[0036] 图2是生物发光图像，其示出巯基乙酸盐对腹膜内肿瘤生长的影响。用106个Ovcar3-GTL细胞i.p.注射NSG小鼠。四周以后，用PBS或1mL巯基乙酸盐溶液i.p.注射小鼠。在第8周获得图像。
[0037] 图3示出来自用50,000个Ovcar3-GTL细胞i.p注射的NSG小鼠的腹水并在用脂化寡核苷酸处理以后的第8周收获的细胞流分的照片。使腹水通过40μm过滤器。
(a)>40μm流分包含较大的预成形球形体；(b)流过流分包含细胞的较小的预成形链(自由漂浮链)；以及(c)蔗聚糖（ficoll，菲可）分流从自由漂浮链流分除去RBC。在(b)中，糖萼明显分隔在腹水中的自由漂浮链与RBC。
(a)>40μm流分包含较大的预成形球形体；(b)流过流分包含细胞的较小的预成形链(自由漂浮链)；以及(c)蔗聚糖（ficoll，菲可）分流从自由漂浮链流分除去RBC。在(b)中，糖萼明显分隔在腹水中的自由漂浮链与RBC。
[0038] 图4是用于富集自由漂浮链的体外培养体系的示意图。(a)在组织培养处理板上并在10%FCS中培养来自腹水的Ovcar3-GTL肿瘤细胞；(b)和(c)每周再传代悬浮流分；(d)在连续传代以后，使培养物富集自由漂浮链。
[0039] 图5示出自由漂浮链的免疫荧光染色：(a)紧密连接蛋白ZO-1和E-钙黏着蛋白，以及(b)巨蛋白(高尔基体标记)和人波形蛋白。图片(c)是在培养物中发展的非连接自由漂浮链的照片。在(a)中，在细胞连接处的明亮的点状染色是来自ZO-1。在(b)中，明亮的球状染色来自巨蛋白以及浅灰色染色来自波形蛋白。
[0040] 图6示出源自Ovcar3-GTL的自由漂浮链培养物（伴随球形体形成）的照片。通过以高细胞密度卷起(箭头所指)，Ovcar3-GTL自由漂浮链形成球形体。
[0041] 图7是球形体和自由漂浮链形成的照片和示意图。Ovcar3-GTL球形体形成（sphere-forming）细胞(红色)堆积在间充质单层(白色)上[阶段1-2]，并通过芽殖形成有组织的球形体[阶段3]。自由漂浮链(蓝色)在内部被观测到[阶段4]或迁移出发展中的球形体[阶段5]。已发展的球形体脱离自单层并在悬浮液中继续生长[阶段6]，其中更多自由漂浮链被挤入悬浮液。
[0042] 图8以图形方式示出来自对Ovcar3-GTL自由漂浮链、球形体和单层进行的体外促克隆形成测定的克隆发生百分比(分别为左、中和右条)。为了第一促克隆形成测定，将自由漂浮链/球形体混合培养物分离成>40um(球形体)和<40um(自由漂浮链和小球形体)流分。在第2周对克隆的数目加以评分。在第三单细胞再克隆传代以后，自由漂浮链、球形体和单层分别具有55%、10%和1%的克隆发生。
[0043] 图9以图形方式示出在免疫缺陷小鼠中的引发肿瘤的有限稀释测定的结果，其用来评估在自由漂浮链和球形体中的CSC。左图片示出来自用相同数目的解离的Ovcar3-GTL单层细胞、解离的Ovcar3-GTL自由漂浮链细胞和未解离的Ovcar3球形体(球体)i.p.注射小鼠的NOD-SCID(实心条)和NSG(空心条)的生物发光。右图片示出来自用不同数量的相同单层和自由漂浮链细胞i.p.注射的NSG小鼠的生物发光。
[0044] 图10示出生物发光图像，其来自在NSG小鼠中的皮下有限稀释实验，其中NSG小TM鼠注射有在Matrigel 中的200、20和2个源自Ovcar3的自由漂浮链细胞。在注射以后的第3周获得图像。
[0045] 图11示出，在悬浮培养物中生长的间充质细胞可以产生自由漂浮链和球形体。顶部图片示出Ovcar3(上皮细胞)、Ovcar5(间充质细胞)和A2780(间充质)细胞的典型的培养的单层。中间图片示出来自悬浮培养物的Ovcar5细胞，其中(a)凝集在单层细胞上，(b)具有囊性结构的球形体，(c)在悬浮液中的自由漂浮链，以及(d)挤出自由漂浮链的球形体。底部图片示出来自A2780-G悬浮培养物的细胞，其中：(e)集体的变形过渡和(f)自由漂浮链。
[0046] 图12以图形方式示出自由漂浮链-球形体概念的模型。
[0047] 图13是条形图，其示出通过亚汇合的Ovcar3-GTL上皮单层和自由漂浮链分泌进入培养基的CA125(MUC16)的量（如通过ELISA测得的）。
[0048] 图14示出利用RBC进行的颗粒排除测定的照片，其中：(a)机械解离的Ovcar3-GTL自由漂浮链和(b)经透明质酸酶处理的Ovcar3-GTL自由漂浮链。
[0049] 图15是显示糖萼的自由漂浮链的一系列扫描电镜(SEM)图像。艾茜蓝(AB)用来可视化透明质烷糖链以及西吡氯铵(CPC)用来可视化蛋白聚糖。自由漂浮链和糖萼示于(a)中，其中条表示10μm。相对于在(a)中的图像，在(b)中相同图像被放大2x，在(c)中相同图像被放大5x以及在(d)中相同图像被放大10x。箭头指向在自由漂浮链中的单细胞。
[0050] 图16是自由漂浮链和糖萼（仅用艾茜蓝染色）的放大的SEM图像，其示出在细胞上的透明质烷外被以及糖萼的网络样特性。透明质酸集中在不同点。
[0051] 图17是在用透明质酸酶进行处理以除去糖萼外被以后自由漂浮链的SEM图像。用艾茜蓝和CPC进行染色。
[0052] 图18是在用透明质酸酶进行处理以除去糖萼外被以后自由漂浮链的SEM图像。存在于样品中的其它细胞是RBC。在没有染色的情况下获得图像。
[0053] 图19示出自由漂浮链细胞的没有染色的SEM显微照片(a,b,c)。(a)自由漂浮链的SEM，其示出在两个细胞之间具有广泛的微绒毛连接的附着区域。(b)通过纳米管加以连接的两个自由漂浮链细胞。注意，微绒毛将细胞附着于表面(invadopodia)。通过微绒毛和较大质膜泡来表征细胞。(c)具有长(20-30um)伪足的自由漂浮链细胞的SEM，其中上述伪足延伸超出透明质酸糖萼10-15um。
[0054] 图20是在图19(a)中的照片的大致3倍放大，其中有尾白色箭头指向微绒毛，黑色箭头指向伪足以及无尾白色箭头指向表面泡（surface blebs）。
[0055] 图21是SEM，其示出侧视图：(a)在自由漂浮链表面上的喷发“火山”和(b)火山的放大，其示出颗粒从火山的火山口的释放。
[0056] 图22是表格，其示出在Ovcar3上皮单层、Ovcar5间充质单层以及在Ovcar3和Ovcar5自由漂浮链中透明质烷合成途径的差别调节（如通过微阵列分析确定的）。下调基因为灰色；上调基因为黑色。在自由漂浮链柱(*)中的数值表示通过454深度测序确定的mRNA拷贝数。
[0057] 图23是斑点印迹，其示出在上皮(Ovcar3单层)、间充质(Ovcar5单层)和自由漂浮链细胞(Ovcar3和Ovcar5)中的RTK磷酸化模式（如借助于Human Phospho-RTK Array Kit确定的）。
[0058] 图24示出对于Ovcar3自由漂浮链(CSC 65%)和Ovcar3上皮单层(CSC1%)所选CD蛋白的差异表达。
[0059] 图25说明野生型(wt)HAS2基因的基因组结构，其示出内含子和外显子结构并指出限定每个元件和核苷酸(顶部)。底部图片示出称作Greenwich变体的HAS2剪接的mRNA结构，其中上述变体包含外显子1和部分外显子2的框内缺失。
具体实施方式
[0060] 1.概述
[0061] 本发明提供了浆膜癌干细胞(CSC)的克隆纯群体、以及制备和培养这些CSC的方法。由于可获得纯CSC，所以细胞的广泛表征是可能的，并已导致澄清了细胞标记物、细胞的形态、特异表达基因的鉴定、表面基因组标志的鉴定、分泌体标志物，并且根据此信息，可以引向开发疗法和新治疗方案的途径。经纯化的CSC获得为细胞的自由漂浮链（free-floating chains），其在本文中被称为自由漂浮链(catenae)，具有自我更新和分化的能力。除浆膜自由漂浮链以外，本发明还提供了经纯化的浆膜球形体和分离这些细胞实体的方法，从而便于在分子水平中球形体的类似的表征研究。
[0062] 浆膜腔是包括和包围身体的腹膜腔、胸膜腔、和心包腔的封闭体腔，填充有流体(浆膜液)并由浆膜加以限制。浆膜癌包括在浆膜腔内产生的原发癌和通过其它癌细胞转移到浆膜腔所产生的继发癌。在不同浆膜部位的主要浆膜癌包括那些在(1)胸腔积液中的浆膜癌，即间皮瘤、支气管源性肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌、输卵管癌、子宫颈癌和肉瘤；那些在(2)腹腔积液中的浆膜癌，即卵巢癌、输卵管癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌和膀胱癌；以及那些在(3)心包积液中的浆膜癌，即间皮瘤、支气管源性肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌、输卵管癌、子宫颈癌和肉瘤。上述清单并不是详尽的，并且转移到任何浆膜腔并形成肿瘤的任何其它癌症可以看作为“浆膜癌”。
[0063] 2.其它定义
[0064] 浆膜细胞是源自浆膜腔或在浆膜腔内发现的、或形成浆膜或附着于浆膜的任何细胞，并且包括但不限于卵巢细胞、内皮细胞、胃细胞、肠细胞、肛门细胞、胰腺细胞、肝细胞、肺细胞和心脏细胞。
[0065] 如在本文中所使用的，NSG和NSG小鼠是指NOD scid-γ(NSG，NOD scid gamma)小scid tm1Wjl鼠，或等效小鼠，可获自The Jackson Laboratory，以及其是NOD.Cg-Prkdc Il2rg /SzJ 小鼠品系。小鼠的NOG品系类似于NSG小鼠，但具有截短的IL-2受体γ链而不
是NSG小鼠的无效等位基因。
是NSG小鼠的无效等位基因。
[0066] 如在本文中所使用的，“化学疗法”包括任何形式的癌症治疗，其中出于任何及所有与癌症相关的目的，将一种或多种药物给予癌症患者，上述药物包括但不限于抑制或杀伤肿瘤细胞(或其它恶性细胞)和癌症干细胞的细胞毒性剂以及以细胞静止方式作用于上述细胞的制剂。上述药物包括但不限于小分子、抗体、蛋白质、核酸、目标途径抑制剂等。为免生疑问，如在本文中所使用的，化学疗法还包括途径抑制剂疗法，如当主体具有在特定基因中的基因突变并被给予靶向上述基因或代谢或调节途径（上述基因形成其一部分）的治疗剂时所发生的。
[0067] 缩写“ip”和“i.p.”可互换用于腹膜内的或腹膜内地。
[0068] 如在本文中所使用的，‘聚乙二醇化的”是指连接于感兴趣的蛋白或其它分子的聚乙二醇基团(PEG)。聚乙二醇化是指将PEG附着于蛋白或其它分子的过程。用于上述修饰的方法在本领域中是已知的。
[0069] 3.自由漂浮链（catenae）
[0070] 克隆纯浆膜CSC是能够分化的自我更新浆膜细胞，并且根据此准则，满足干细胞的定义。CSC包括细胞的自由漂浮链，其具有每链3至4个细胞至约72个细胞，但这不是精确的上限，因为偶尔观测到更长的自由漂浮链。自由漂浮链被包含透明质烷的糖萼包围并抵抗附着于组织培养板。如在本发明的方法中所描述的，可以在悬浮培养物中无限地增殖自由漂浮链。每个自由漂浮链是克隆的并且沿着相同轴对称地进行细胞分裂，其中观测到偶尔分支。对称分裂的能力独立于细胞在链中的位置，这意味着，在分裂结束和中间时，细胞沿着链轴对称和独立地分裂。这种在培养物中分裂和增殖的能力确立了，自由漂浮链细胞是自我更新的。
[0071] 经由紧密接头，细胞彼此连接，其中上述接头对于ZO-1，染色为阳性，但对于E-钙黏着蛋白的存在则为阴性。定时间隔照相已表明，自由漂浮链并不彼此融合，但似乎相互排斥。
[0072] 当体外评估时，在有限稀释测定中，自由漂浮链显示至少50%的连续再克隆能力。相对于浆膜上皮肿瘤细胞，单独的自由漂浮链细胞具有大大增加的体内植活潜力。在适当的条件下，在小鼠癌症模型中，一个或两个自由漂浮链细胞可以导致肿瘤的植活。例如，在皮下植入有在Matrigel中的单个自由漂浮链细胞的某些小鼠模型(NSG小鼠)中体内植活为50-100%。和上皮单层相比，自由漂浮链移入好10,000倍以上。这种在体内移植以后形成肿瘤的能力确立了，自由漂浮链具有分化潜力。另外，形成的肿瘤与从其最初获得细胞的那些肿瘤具有类似形态。
[0073] 类似地，在适当的条件下，自由漂浮链具有体外产生上皮和间充质单层的能力。已经发现，去除糖萼(例如，通过透明质酸酶处理)会引起自由漂浮链在悬浮培养物中停止生长，沉降于组织培养板上并开始分化成上皮和间充质细胞的混合培养物。
[0074] 在培养物中生长的自由漂浮链将持续产生自由漂浮链，即，自由漂浮链能够在培养物中连续传代为非连接细胞。然而，在适当的条件下，如当培养物趋于饱和时，自由漂浮链可以聚拢并形成球形体。这种卷起作用可以提供物理屏障方式，以当球形体包含约10-30%CSC时使CSC免受不利条件的影响。
[0075] 自由漂浮链可以产生自浆膜上皮癌细胞或浆膜间充质癌细胞(下文详细讨论)。上皮细胞具有极化形态并且是E-钙黏着蛋白阳性和波形蛋白阴性。间充质细胞呈现纺锤形态并且是E-钙黏着蛋白阴性和波形蛋白阳性。自由漂浮链细胞是圆形的，并且和间充质细胞一样是E-钙黏着蛋白阴性和波形蛋白阳性。
[0076] 自由漂浮链的透明质烷的糖萼外被是主要形态特征并且可以通过用透明质酸酶进行处理来除去。围绕自由漂浮链细胞，糖萼延伸多达大致20μm。当糖萼存在时，自由漂浮链在悬浮培养物中生长并且并不相互作用于细胞外基质成分。当酶促去除糖萼时，自由漂浮链细胞连接于表面，形成丝足延伸并呈现多谱系分化潜力。机械解离的自由漂浮链细胞保留在悬浮液中并快速增殖以形成自由漂浮链。
[0077] 自由漂浮链细胞的扫描电子显微术(SEM)已显示除糖萼以外的各种细胞外周结构，包括微绒毛、纳米管、伪足、触角和丝足。在一些情况下，微绒毛已在遍及细胞上被观测到，并且在其它情况下它们倾向于位于细胞连接处，这提示在细胞间粘附中的作用。纳米管是CSC的新颖细胞特点并且似乎参与细胞间通讯，从而可能便于在细胞之间生物分子的通过。伪足、触角和丝足可能在纳米管的形成中发挥作用以及便于监测附着面的环境和细胞因子、生长因子和免疫细胞的存在。
[0078] 此外，SEM已显示，自由漂浮链细胞具有表面泡和结构，其似乎爆发从细胞表面并释放较小颗粒。这些喷发结构显示为“火山”或内陷的“火山口”。释放的颗粒在外观和尺寸方面类似于表面泡并且似乎是外染色体。
[0079] 透射电镜术(TEM)表明，自由漂浮链细胞具有为干细胞的特征的未分化细胞形态(高核质比例)。TEM还便于观测细胞之间的紧密接头并且显示存在完整功能的线粒体。观测到表面泡相邻于细胞膜并包含核糖体。
[0080] 具有细胞的克隆纯群体便于卵巢自由漂浮链(即，卵巢CSC)的分子表征。利用基因表达，本发明提供了与表5中所示的卵巢间充质单层癌细胞相关的卵巢自由漂浮链的基因标签。基因标签具有26个上调基因和69个下调基因，并具有透明质烷合酶(HAS2)，在自由漂浮链/CSC中最高表达的基因。第二最高表达的基因是PDGFRA，其表明PDGF途径在自由漂浮链/CSC中的显著作用。
[0081] 利用差异miRNA表达分析，发现，和卵巢上皮单层相比，在卵巢自由漂浮链中miR-200家族(miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c 和miR-429)以及Let-7家 族miRNA被显著下调。另外，和卵巢间充质单层相比，在卵巢自由漂浮链中，hsa-miR-23b和hsa-miR-27b被显著下调。
[0082] 利用受体酪氨酸激酶(RTK)磷酸化测定，表明，卵巢自由漂浮链细胞和卵巢间充质癌细胞具有性质相似的磷酸-RTK分布。
[0083] 利用细胞表面标记分析并借助于市售抗体和FACS，卵巢自由漂浮链对于标记CD49f(α6-整联蛋白)、CD90、GM2和CD166是阳性的，而对于标记EpCam(CD326)、Muc16(CA125)和CD44则是阴性的。
[0084] 4.球形体
[0085] 浆膜球形体是由上万细胞构成的较大细胞结构，并被观测为不会通过40μm过滤器的实体。球形体可能在转移和肿瘤形成中发挥作用。球形体还在悬浮培养物中自我更新并具有分化能力。当体外评估时，在有限稀释测定中，球形体具有约10%的连续再克隆能力。
[0086] 通过“卷起”过程，球形体发展自自由漂浮链，这提示在细胞培养的汇合阶段在营养匮乏期间，球形体为自由漂浮链存活提供保护性环境。另外，细胞可以积聚在附着间充质单层上并开始球形体。这种细胞团块在相对于附着面的垂直方向生长，类似于来自附着细胞的“芽殖”，然后发展成具有有组织的囊性结构的球形体。球形体最终脱离自附着单层并在悬浮液中持续快速增殖，同时保持球体形态。此过程的示意图示于图7。发展中的球形体将新鲜自由漂浮链挤入悬浮液，其反过来又可以快速增殖以形成新的自由漂浮链。
[0087] 5.自由漂浮链和球形体的制备
[0088] 本发明涉及用于制备自由漂浮链和球形体的方法。本文描述两种主要方法。在一种方法中，将浆膜上皮或间充质癌细胞腹膜内(ip)注入动物肿瘤模型(优选小鼠)，优选在添加炎症刺激的条件下。在用来发展腹水和/或实体瘤的足够时间以后，从携带ip肿瘤的动物收获腹水，并将其分离成两种或更多种大小流分，优选两种流分。较小尺寸的流分包含自由漂浮链和单细胞，通常白细胞。可以容易去除白细胞并在悬浮培养物中连续传代剩余细胞以获得克隆浆膜自由漂浮链的自我更新群体。较大流分包括保留在过滤器上的球形体。收集这些球形体并在悬浮培养物中连续传代以获得球形体的自我更新群体。
[0089] 浆膜上皮细胞的来源可以是来自原发性浆膜癌细胞、或永生化上皮或间充质浆膜癌细胞系。原发性癌细胞或细胞系可以是来自原发癌或转移性肿瘤。优选地，浆膜癌细胞是卵巢癌细胞。
[0090] 如在本文中所使用的，动物肿瘤模型是这样的动物，其能够便于肿瘤形成并且是高度免疫缺陷的，即，缺乏至少B细胞和T细胞并且优选还缺乏NK细胞。例如，优选的动物是NOD-SCID ILR γ(-/-)小鼠(本文中称作“NSG”小鼠)，其缺乏B细胞、T细胞和NK细胞。NOD-SCID小鼠缺乏B细胞和T细胞，并且虽然是有用的，但需要注射更多数目的细胞以发展肿瘤。
[0091] 炎症刺激包括在动物中刺激炎症的任何制剂、药物或因子(在本文中统称为炎性剂)，并且优选i.p.给予。炎性剂包括但不限于脂化寡核苷酸、巯乙酸盐；chemerin；巨噬细胞迁移诱导趋化因子如趋化因子(C-C基序)配体1(CCL1)、CCL2、CCL4、CCL7、CCL8、CCL12、CCL13、CCL15、CCL16、CCL23和CCL25；巨噬细胞激活趋化因子如CCL14；细菌来源的各种制剂，包括酿酒硫乙酸盐肉汤(3%.)、热灭活BCG(来自牛分枝杆菌的细胞壁)、吡喃共聚物、小隐孢子虫热杀死全细胞、小隐孢子虫的吡啶提取物、来自鼠伤寒沙门氏杆菌的脱毒内毒素；以及偏过碘酸钠。脂化寡核苷酸通常是约8至约30个核苷酸的较小低聚物并且以序列独立方式起作用。脂质成分可以是任何方便基团如豆蔻酸酯、棕榈酸酯等。本领域技术人员可以确定用于给予炎性剂的适当剂量。
[0092] 可以通过使腹水通过一个或多个过滤器来完成尺寸分流。有用的过滤器尺寸为约20-60μm，其中较大尺寸便于更多球形体通过。优选的过滤器尺寸为40μm。
[0093] 在另一种方法中，可以通过体外培养技术从永生化浆膜间充质癌细胞来产生自由漂浮链和球形体。在此方法中，间充质细胞生长为单层，收获培养上清，并通过温和离心作用(例如，在300g下1-5分钟)来沉淀悬浮细胞。将沉淀的细胞重悬浮于新鲜培养基(通常以先前培养密度的十分之一)，并转移到新鲜悬浮培养烧瓶供生长。重复此周期若干次以产生浆膜自由漂浮链和球形体的自我更新群体。通常，生长细胞直到它们达到约200,000个细胞/mL的细胞密度或可以被每周传代。同样地，此过程似乎去除由间充质单层产生的抑制因子，其可以防止自由漂浮链和球形体形成。可以尺寸分流（如上述）这些培养物以分开自由漂浮链和球形体。
[0094] 用于这些方法的生长培养基是补充有10%胎牛血清(FCS)的任何方便的培养基。通常在37°C和5%CO2下生长细胞。用于自由漂浮链的优选的生长培养基是M5，其包含
10%FCS(Hyclone)和1%P/S(Pen-Strep Solution，10,000U/mL青霉素G和10mg/mL链霉素；
Gemini Bio-Products)，以后称为M5-FCS。M5培养基是DME:F12、6g/L HEPES和2.2g/L碳酸氢钠。还可以在补充有胰岛素的无血清、无蛋白培养基中生长自由漂浮链。一种这样的优选培养基是包含1%P/S和0.1U/mL重组胰岛素的M5。胰岛素源应相同于细胞源，即，如果正培养人自由漂浮链，那么无血清培养基补充有重组人胰岛素等。
10%FCS(Hyclone)和1%P/S(Pen-Strep Solution，10,000U/mL青霉素G和10mg/mL链霉素；
Gemini Bio-Products)，以后称为M5-FCS。M5培养基是DME:F12、6g/L HEPES和2.2g/L碳酸氢钠。还可以在补充有胰岛素的无血清、无蛋白培养基中生长自由漂浮链。一种这样的优选培养基是包含1%P/S和0.1U/mL重组胰岛素的M5。胰岛素源应相同于细胞源，即，如果正培养人自由漂浮链，那么无血清培养基补充有重组人胰岛素等。
[0095] 用于球形体的优选生长培养基是ES培养基，并且优选补充的mTeSR1培养基[Ludwig et al.2006]。
[0096] 6.用于确定CSC的基因标签和其它方法
[0097] 在表5中提供的基因表达信息可以作为用于鉴定卵巢CSC的诊断标记。例如，可以利用基因微阵列、RNA测序、RT-PCR、Q-RT-PCR、454深度测序、或本领域技术人员已知的其它方法，来测定来自患者的腹水或卵巢组织样品，以确定表5中的一种或多种基因的表达水平。可以对这些水平和在正常组织、卵巢间充质癌细胞或卵巢上皮癌细胞中发现的表达水平进行比较。表达水平还可以用作标记，用于监测疾病状态、疾病进展、尤其是转移，或用作用于评估候选药物或制剂对细胞或在患者中的影响的标签。监测特定基因标记的表达的测定可以利用监测相关基因的表达水平的变化的任何可获得的方式。如在本文中所使用的，如果制剂能够上调或下调在细胞中的基因的mRNA表达水平，则认为上述制剂可以调节基因的表达。
[0098] 本发明提供了以下方法来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在。
[0099] 关于自由漂浮链表面基因组，提供了一种方法来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在，该方法包括(a)从患者获得细胞样品；(b)除尽样品的白细胞；(c)反应样品和一系列的可检测的表面抗原抗体；(d)将经反应的细胞分类成单细胞或多细胞样品；以及(e)检测任何所述单细胞或多细胞样品是否对于CD49f、CD90、CD166、PDGFRA、和GM2蛋白质的存在是阳性的，以及对于CD34、CD133、MUC16和EPCAM蛋白质的存在是阴性的，其中所述蛋白质的存在和不存在可以将经反应的细胞确定为包含浆膜癌干细胞或将单细胞确定为浆膜癌干细胞。
[0100] 例如，通过荧光激活细胞分选术(FACS)并利用适当可区分标记抗体，可以分拣细胞，包括至单细胞水平。
[0101] 可替换地，表面体（surfacesome）特点可以用于用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者获得细胞样品；(b)除尽样品的白细胞；(c)从样品的其余部分中提取RNA；(d)针对人mRNA转录组的表达水平来分析RNA；以及(e)将具有表面基因组相关自由漂浮链基因标签的样品确定为那些具有上调HAS2和PDGFRA、下调MUC16和EPCAM并且具有上调的至少7种另外的表11所列的基因的样品，其中具有那些特点表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
[0102] 同样地，表面基因组性能可以用于用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者的细胞样品获得整合膜蛋白流分，其中细胞样品已可选地除尽白细胞；(b)通过质谱法来分析所述膜流分的蛋白质含量；(c)将具有表面基因组相关自由漂浮链蛋白质标签的样品确定（identify，鉴定）为那些其中光谱数据表明存在表16所列的至少40种蛋白质的样品，其中那些蛋白质的存在表明患者样品包含浆膜癌干细胞。用来制备完整膜流分的一种方法是分离细胞并利用借助于曲通X-114（Triton X-114）的相分配过程来制备可以通过质谱法加以分析的洗涤剂可溶性流分。
[0103] 基于来自已表征的自由漂浮链miRNA的信息，本发明提供了用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者获得细胞样品；(b)除尽样品的白细胞；(c)从样品的其余部分提取RNA；(d)针对人miRNA的表达水平来分析RNA；以及(e)将具有miRNA相关自由漂浮链标签的样品确定为那些样品，其具有下调的miRNA的let-7和200家族、下调的hsa-miR-23b和hsa-miR-27b，并且具有上调的表8所列的至少4种另外的miRNA，其中具有那些特征表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
[0104] 利用所述自由漂浮链mRNA的表达的分析，确立了自由漂浮链基因标签。因此，本发明的另一种实施方式还涉及用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者获得细胞样品；(b)除尽样品的白细胞；(c)从样品的其余部分提取RNA；(d)针对人mRNA转录组（transcriptome）的表达水平来分析RNA；以及(e)将具有自由漂浮链基因标签的样品确定为那些具有上调的HAS2和PDGFRA并且具有上调的表5所列的至少5种另外的基因的样品，其中具有那些特性表明患者样品包含浆膜癌干细胞。另一种实施方式使用自由漂浮链簇限定基因标签并提供用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者获得细胞样品；(b)可选地，除尽样品的白细胞；(c)从样品的其余部分提取RNA；(d)针对人mRNA转录组的表达水平来分析RNA；以及(e)将具有自由漂浮链簇限定基因标签的样品确定为那些样品，其具有上调的至少6种基因（在表7清单1中的9种基因）并具有上调的在表7清单2中的至少5种基因，其中具有自由漂浮链簇限定基因标签表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
[0105] 在本发明的一种相关方法中，通过下述方法可以确定在主体中的浆膜癌干细胞，该方法包括(a)在组织样品中检测来自表5的10种或更多种基因的表达水平，其中相对于在浆膜间充质单层细胞中的表达，按照表5的基因的增大或减小表达表明浆膜癌干细胞的存在。
[0106] 自由漂浮链外染色体和分泌体特别可用于确定和/或监测浆膜癌干细胞的方法。例如，在一种实施方式中，外染色体自由漂浮链蛋白质标签可以用于用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者样品获得分离的外染色体；(b)通过质谱法、通过抗体结合或通过其它方法来分析所述外染色体的蛋白质含量；
(c)将具有外染色体自由漂浮链蛋白质标签的样品确定为那些样品，其中光谱数据或其它数据表明CD63、COL1A2和表13所列的至少5种另外的蛋白质的存在，其中所述蛋白质的存在表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
(c)将具有外染色体自由漂浮链蛋白质标签的样品确定为那些样品，其中光谱数据或其它数据表明CD63、COL1A2和表13所列的至少5种另外的蛋白质的存在，其中所述蛋白质的存在表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
[0107] 在另一种实施方式中，外染色体自由漂浮链蛋白质标签可以用于用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者样品获得分离的外染色体；(b)反应所述外染色体和一和或多种抗体，其中上述抗体对于CD63、COL1A2和表13所列的至少5种另外的蛋白质是特异的；以及(c)将具有外染色体自由漂浮链蛋白质标签的样品确定为那些样品，其中对于CD63、COL1A2和表13所列的至少5种另外的蛋白质的存在是阳性的，其中所述蛋白质的存在表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
[0108] 在又一种实施方式中，分泌体自由漂浮链蛋白质标签可以用于用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者样品获得上清流分，其中从患者样品已除去细胞、细胞碎片和外染色体；(b)通过质谱法来分析所述上清流分的蛋白质含量；(c)将具有分泌体自由漂浮链蛋白质标签的样品确定为那些样品，其中光谱数据表明表15所列的至少20种蛋白质的存在，其中那些蛋白质的存在表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
[0109] 又一种实施方案使用糖萼标记和提供了用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者样品获得上清流分，其中从患者样品已除去细胞、细胞碎片和外染色体；(b)通过质谱法来分析所述上清流分的蛋白质含量；(c)将具有糖萼标记的样品确定为那些样品，其中光谱数据表明存在如表4所列的在糖萼中发现的至少6种蛋白质以及不存在ELN、FN1和如表4所列的在自由漂浮链中下调的至少2种蛋白，其中那些蛋白质的存在和不存在表明患者样品包含浆膜癌干细胞。
[0110] 基于酪氨酸激酶受体(RTK)的磷酸化，本发明的另一种实施方式涉及用来确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在的方法，该方法包括(a)从患者获得细胞样品或来自细胞样品的细胞裂解液，其中所述样品已除尽白细胞；(b)用一系列的人酪氨酸激酶受体特异性抗体和泛磷酸酪氨酸抗体温育所述样品或所述裂解液；以及(c)检测所述样品或裂解液是否对于激活磷蛋白是阳性的，其中上述磷蛋白选自由PDGFRA和至少6种蛋白质组成的组，而其中上述蛋白质选自由PDGFRβ、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰岛素-R、IGF1R、DTK/TYRO3、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt-3、c-rRET、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、TrkA/NTRK1、VEGFR3、EphA1、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和EphB6组成的组，其中所述激活磷蛋白的检出可以将患者样品确定为包含浆膜癌干细胞。
[0111] 基于糖萼的组成和表征，通过一种方法，可以确定和/或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在，上述方法包括(a)从患者样品获得上清流分，其中从患者样品已除去细胞和细胞碎片；(b)反应样品和抗COL1A2抗体；(c)检测所述抗体是否结合透明质酸和胶原蛋白的小于20,000道尔顿的低分子量复合物，其中检出所述复合物表明所述样品包含浆膜癌干细胞。
[0112] 用于此部分的方法的样品可以是哺乳动物浆膜液、腹水、血液或肿瘤组织。优选地，哺乳动物是人。
[0113] 可以通过本领域技术人员已知的方法来进行检测、确定、分析等的各种步骤。例如，借助于适当方法，可以通过微阵列分析、通过RNA或DNA测序技术、通过RT-PCR、通过Q-RT-PCR等来完成核酸的检测或确定表达水平。
[0114] 另外，上述方法形成本发明的另外的实施方式的基础。例如，本发明提供了一种方法，用来在浆膜癌患者中检测浆膜癌、监测癌症治疗方案的效力、对需要治疗的患者进行分类、监测药物疗效、预测患者对癌症治疗方案的反应，上述方法包括(a)对来自患者的样品定期进行上述方法的一种或多种(例如，如在原始权利要求48-67中所陈述的)以及(b)关联结果与患者的状态，从而检测浆膜癌、监测癌症治疗方案的效力、对需要治疗的患者进行分类、监测药物疗效或预测患者对癌症治疗方案的反应。
[0115] 本发明的另一方面提供了PCR引物组，用于确定浆膜CSC，其中通过在本领域已知的用于DNA、RNA或两者的众多的PCR扩增方法的任何一种。本领域技术人员可以从人类基因组的已知序列选择适当的序列，用于PCR引物。本发明的用于哺乳动物基因的PCR引物组是以下组合(每个组合是PCR引物组，用于组内指定基因的扩增和检测)：
[0116] (a)CD49f、CD90、CD166、PDGFRA和GM2基因；
[0117] (b)CD49f、CD90、CD166、PDGFRA、GM2、CD34、CD133、MUC16和EPCAM基因；
[0118] (c)HAS2、PDGFRA和表11所列的至少10种上调基因；
[0119] (d)HAS2、PDGFRA、MUC16、EPCAM和表11所列的至少10种上调基因；
[0120] (e)表16所列的至少40种蛋白质的基因；
[0121] (f)let-7和200miRNA家族、hsa-miR-23b和hsa-miR-27b、以及表8所列的至少4种另外的miRNA；
[0122] (g)HAS2、PDGFRA和表5所列的至少5种另外的基因；
[0123] (h)表7清单1中的9种基因和表7清单2中的至少5种基因；
[0124] (i)来自表5的10种或更多种基因；
[0125] (j)CD63、COL1A2和用于表13所列的蛋白质的至少5种另外的基因；
[0126] (k)表15所列的至少20种蛋白质的基因；
[0127] (l)如表4所列的至少6种糖萼蛋白质的基因；
[0128] (m)ELN、FN1、如表4所列的至少6种糖萼蛋白质的基因、和在表4中列为下调的至少2种蛋白质的基因；以及
[0129] (n)PDGFRA和至少6种蛋白质的基因，上述蛋白质选自由PDGFRβ、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰岛素-R、IGF1R、DTK/TYRO3、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt-3、c-rRET、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、TrkA/NTRK 1、VEGFR3、EphA1、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和EphB6组成的组。
[0130] 7.药物筛查方法
[0131] 在一种实施方式中，本发明的方法包括用来筛查测试化合物的抗增殖效应的方法，该方法包括(a)培养解离的浆膜自由漂浮链或浆膜球形体细胞，通过荧光或发光，其是可检测的；(b)使所述自由漂浮链或球形体接触测试化合物；(c)通过相对于对照培养物，测量由培养物产生的荧光或发光，来检测所述自由漂浮链或球形体的增殖；以及(d)确定测试化合物是否抑制所述自由漂浮链或球形体的增殖。
[0132] 类似地，用于筛查测试化合物对浆膜癌干细胞的抗增殖效应的另一种方法包括(a)培养解离的浆膜自由漂浮链细胞、解离的浆膜球形体细胞和解离的浆膜癌黏附细胞，通过荧光或发光，其各自是可检测的（平行地）；(b)使所述细胞接触所述测试化合物；(c)通过相对于对照培养物，测量由培养物产生的荧光或发光，来检测自由漂浮链、球形体和黏附细胞的增殖；(d)确定，相对于球形体和单层，测试化合物是否不同地抑制自由漂浮链的增殖。
[0133] 在本发明的这些方法中，可以方便地在多孔板如96孔、384孔或1536孔板中生长细胞。用来添加培养基、接种平板、添加测试化合物和对结果进行评分的各种操作可以通过手动或自动机械操作并借助于为此目的设计的仪器来完成。类似地，可以手动或通过自动化或机器人分析仪来确定测定结果。为了检测抗增殖效应，可以在离散的时间点评估或连续监测（当适合于测定时）来自细胞培养物的荧光信号。
[0134] 在另一种实施方式中，本发明提供了用来筛查测试化合物(或制剂)对浆膜自由漂浮链、球形体和单层的表型或其它效应的方法。以和上述测定类似的方式（除检测方法之外）进行这些方法以评估测试化合物的抗增殖效应。在这些实施方式中，检测方法取决于待评估的和明显可检测的特定性能。对于分化抑制剂，检测方法可以评估在暴露于化合物以后自由漂浮链细胞在培养物中是否未能分化。
[0135] 在用测试化合物进行筛查测定中，发现，糖萼的完整性可以在药物敏感性或抗性方面发挥重要作用。虽然一些化合物可以容易穿透糖萼，但其它化合物则不能。对于在患者中最终不再是有效的用于化学疗法的化合物，由可能的重新存在引起的药物或化疗已失去效力的知识意味着，如果可以除去浆膜癌干细胞的糖萼，则上述药物可以保持效力，因而被再次使用。这种认识使得需要另一种方式来筛查测试化合物或药物、知道化疗疗法等，以在这些细胞实体具有建立的和/或显著的糖萼的条件下，能够抑制自由漂浮链和球形体的增殖或改变其形态。
[0136] 因此，本发明的另一种实施方式提供了用来筛查测试化合物的抗增殖或形态效应的方法，该方法包括(a)解离浆膜自由漂浮链并制备单细胞的同质群体；(b)在产生具有建立的糖萼外被的自由漂浮链的条件下接种和培养那些细胞一定时间；(c)使培养物接触至少一种测试化合物一定时间，其将足以允许未经处理的培养物增殖而没有达到汇合，即，在筛查测定期间，培养物将保持亚汇合；以及(d)确定在经处理的培养物中测试化合物是否抑制自由漂浮链的增殖或改变自由漂浮链的形态。在一种优选实施方式中，在接种后的第3、4、5、6或7天，将测试化合物加入培养物，并且更优选在第5或6天。在这种方法的一种变通方式中，以步骤(b)以后但在步骤(c)以前，可以用一定量的透明质酸酶、胶原酶或两者温育培养物一定时间，以足以去除或破坏所述自由漂浮链的糖萼外被。通过在37°C下进行上述处理约5-30分钟，并且优选约10分钟。在测定的其余部分期间，并不需要除去这些酶。在本发明的方法中还可以使用酶的修饰和聚乙二醇化变体。这些测定还可以容易适应于HTS格式（如上述）。为了确定测试化合物是否影响增殖，可以在有或没有染色或测得荧光信号、发光信号或吸光率的情况下人工计数细胞。由于自由漂浮链存在于悬浮液中，所以检测方法需要相应加以调整并且可以由本领域技术人员来进行。一种优选的检测方法是利用 染色，接着测量培养物的荧光或吸光率，其正比于在培养物中存在的活
细胞并且与细胞是粘连的或在悬浮液中无关。
细胞并且与细胞是粘连的或在悬浮液中无关。
[0137] 还提供了用于浆膜球形体的类似的测定系统。对于球形体，在产生足够数量和大小的具有建立的糖萼外被的球形体的条件下，培养解离的细胞一定时间。和自由漂浮链相比，由于球形体是许多细胞的较大聚集体，所以它需要更长时间来重新建立外被。球形体的时间范围通常是约8至约14天，所以在上述时间范围内添加测试化合物，并且优选在接种后的第11天。
[0138] 因此，这些方法便于相对于具有未受干扰的保护性细胞外周外被的浆膜(包括卵巢)癌症干细胞(自由漂浮链)来筛查化合物的毒性和化学性能，并且是一种体外系统，和常规筛查方法相比，其更相关于临床环境。体内和体外数据提示，自由漂浮链是适应于生长在悬浮液中、在腹水中的卵巢癌干细胞，以及糖萼形成（不限于一种机制）可能是癌症干细胞在腹水中的生长和扩大以及继续作为癌症干细胞所需要的。数据还解释了在具有腹膜转移的晚期卵巢癌和其它浆膜癌类型中对治疗的抗性。在此筛查中，确定为对具有完整的细胞外周外被的自由漂浮链具有毒性的任何化合物可潜在地用于晚期卵巢癌的治疗。
[0139] 8.治疗方法
[0140] A.靶向糖萼
[0141] 自由漂浮链的透明质酸糖萼外被是主要形态特点。靶向此特点（为除去），可以提供一种方法来治疗浆膜癌、将癌症维持在可管理的疾病状态、在其它标准癌症护理（例如，连同化学疗法或放射治疗一起）以后或期间根除癌症干细胞以及延长在发生复发或转移以前的时间。
[0142] 可以通过各种途径，包括透明质烷的降解、防止透明质烷结合于它的受体(例如：CD44、RHAMM)、防止透明质烷输出或相互作用于透明质烷的蛋白质(例如：Aggregan、Versican)，来靶向透明质烷和/或其它糖萼成分。另外，通过靶向产生透明质烷的合成途径成分可以抑制或减少透明质烷表达，其中通过各种技术，包括RNAi或反义技术或添加酶抑制剂。可以通过抑制其化学结构的若干部分的形成(例如：靶向重复双糖单元或糖苷键)来破坏透明质烷合成。另外，可以通过在DNA、RNA、或蛋白质水平上靶向透明质烷合酶(HAS)(例如，酶抑制剂)来抑制透明质烷合成。HAS抑制剂的实例包括但不限于4-甲基伞形酮(4-MU或MU)、4-甲基七叶亭(ME)、布雷菲德菌素A、甘露糖、相对于透明质烷合酶的siRNA、相对于透明质烷合酶的胞外或胞内域的抗体、透明质酸酶(细菌或动物来源，天然或重组的)、以及任何上述实例的聚乙二醇化或化学修饰衍生物(视情况而定)。
[0143] 可以通过抗体、小分子、酶或其它方式来靶向透明质烷以达到降解和除去的目的。最常见通过透明质酸酶，一种糖蛋白，来降解透明质烷。透明质酸酶已被视为在治疗癌症方面具有潜在治疗应用。可以用于动物的这种酶或修饰在本文中可以首次用来选择性地靶向浆膜癌干细胞。例如，通常用标准疗法，包括手术、化学疗法、放射疗法、或它们的组合，来治疗卵巢癌。上述治疗可以包括铂为基础的疗法、托泊替康、口服依托泊苷、多西他赛、吉西他滨、5-FU、亚叶酸、脂质体多柔比星。
[0144] 本发明提供了这些治疗的补充，以在治疗期间除去或抑制糖萼形成。例如，在一种治疗方案中，除去原发癌(通过任何方式或治疗)，接着透明质酸酶治疗以根除耐治疗或逃避治疗的任何自由漂浮链或CSC。还可以和癌症治疗的标准疗程同时进行透明质酸酶治疗。另外，上述两种治疗方式可以接着是另外回合的标准疗法(例如，化疗)（如果需要的话）。
[0145] 本发明设想其它护理方法，其根除自由漂浮链、破坏自由漂浮链的形态、迫使自由漂浮链分化、或降低自由漂浮链的克隆发生，该方法包括透明质酸酶治疗作为治疗的一部分。
[0146] 本发明的某些实施方式提供了在接受化疗方案或放射治疗的患者中治疗浆膜癌的方法，该方法包括给予一定量的透明质烷合酶抑制剂、透明质烷途径的另一种抑制剂、或降解透明质烷的酶一定时间，以增强或补充治疗方案或治疗或改善患者的存活时间。可以在化学疗法方案或放射治疗以前、以后或同时给予抑制剂。此方法可以接着是另外回合的化学疗法或放射疗法。
[0147] 本方法会缓解癌症症状，例如，包括肿瘤消退、较少的胃气胀或腹水形成。这些方法还抑制在患者中的癌症干细胞自我更新和/或形成，不限于一种机制，其中通过抑制所述CSC的糖萼形成，从而抑制自我更新并引起CSC的分化。这种分化可以使细胞再次可以接受本领域已知的标准癌症治疗方案。
[0148] 浆膜癌包括但不限于卵巢癌和出现在浆膜腔中的任何癌症，不管是原发性或继发性(例如，转移性)起源。
[0149] 催化透明质烷分解(降解透明质酸)的酶包括透明质酸酶(例如，EC3.2.1.35)。人类具有6种相关基因，包括HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、MGEA5和PH-20/SPAM1。任何透明质酸酶可以用于本发明。用于本发明的优选的透明质酸酶是源自基因PH20的重组人透明质酸酶Hylenex(Halozyme Theraputics)。聚乙二醇化PH20透明质酸酶也是有用的。
[0150] 透明质酸酶可以是人、其它动物或细菌来源、以及人工制得(重组/合成的)。它可以被修饰(聚乙二醇化，添加低聚物的转运体，用来修饰酶的其它众所周知的方式)并可以以向患者递送有效剂量的任何剂型加以提供。确定剂量和制定化疗疗法的方法是本领域技术人员已知的。
[0151] 在另一个方面，本发明涉及用来在患者中抑制癌症干细胞自我更新或形成的方法，该方法包括将一定量的糖萼形成的抑制剂或降解糖萼的制剂给予所述患者一定时间，以在患者中抑制糖萼形成或降解CSC的糖萼，从而抑制所述CSC的自我更新或形成、引起CSC的分化、使CSC容易受到其它化疗方案的杀伤、或防止自由漂浮链进行球形体形成。
[0152] 在本发明的方法中使用的抑制剂和酶可以提供为以注射用无菌溶液、混悬剂或其它方便制剂的形式供腹膜内或浆膜内递送的药物组合物。腹膜内递送是特别有用的。当口服给予时，抑制剂和酶可以，例如，具有丸剂、片剂、包衣片剂、胶囊剂、颗粒剂或酏剂的形式。还可以直肠给予，例如以栓剂的形式，或胃肠外给予，例如以注射用无菌溶液或混悬剂的形式静脉内给予、肌内给予、鞘内给予或皮下给予，或局部给予，例如以溶液或透皮贴剂的形式，或用其它方式给予，例如以气雾剂或鼻腔喷雾剂的形式。取决于给予的特性，药物组合物可以进一步包含，例如，药用添加剂、赋形剂、载体等，其可以改善，例如，可制造性、给予、味道、摄入、摄取等。
[0153] B.其它治疗方法
[0154] 本发明的其它治疗方法包括用来治疗浆膜癌的方法，该方法包括(a)将抗癌治疗方案给予浆膜癌患者；(b)审查用来自所述患者的样品定期进行上述部分5中的一种或多种方法所获得的结果，以及(c)根据需要并与提供自那些方法的信息一致来改变治疗方案，即，通过监测在患者中存在的浆膜癌干细胞，开业医生可以作出告知和个性化的决定：何种治疗方案将用于特定患者。
[0155] 9.潜在疗法
[0156] 除自由漂浮链的基因标签信息以外，基因表达分析还给出关于活跃于自由漂浮链细胞中的分子途径的重大信息。基于此信息，表1提供了活跃于自由漂浮链中的一系列途径和靶向那些途径的化合物，作为用于浆膜CSC、以及更特别是用于卵巢CSC的潜在有效疗法。已测试了下划线化合物相对于自由漂浮链的效力。
[0157] 表1：靶向自由漂浮链途径的化合物
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163] 10.HAS2突变、PFGRA突变和HAS2剪接变体
[0164] 在Ovcar3自由漂浮链中HAS2和PDGFRA是最高表达的基因。已意外发现，在自由漂浮链中HAS2基因出现为剪接变体，在自由漂浮链和患者肿瘤样品中的HAS2和PDGFRA基因中发现突变。
[0165] 因此，本发明提供了编码哺乳动物HAS2剪接变体的分离的核酸，包括用于其的mRNA和cDNA以及包含相邻核苷酸序列的核酸，以5’至3’次序，其基本上包括HAS2基因的全部或部分的外显子2和全部的外显子3，即缺乏外显子1的剪接变体。一种mRNA HAS2剪接变体编码一种蛋白质，其开始于野生型人HAS2的氨基酸215并结束于正常停止信号，即，氨基酸552。本发明还包括包含本发明的任何核酸的载体，包含这些载体的细胞，利用重组表达系统来产生编码的蛋白质，以及编码的蛋白质。本发明的其它实施方式涉及分离的核酸探针，其具体用于检测哺乳动物HAS2剪接变体RNA或任何一种或多种HAS2突变，包括SNP突变，并且优选检测在表17和18中确定的突变。因此本发明还包括野生型HAS2和HAS2剪接变体的突变和等位基因形式。
[0166] 本发明的又一个方面涉及用于在主体中监测和/或分期浆膜癌的方法，该方法包括(a)从获自癌症患者的腹水制备自由漂浮链；(b)检测自由漂浮链是否具有一种或多种HAS2突变和/或表达一种或多种HAS2剪接变体；以及(c)关联那些突变和/或变体与在所述患者中癌症的存在和/或进展。另外，可以确定或监测在患者样品中浆膜癌干细胞的存在，其中通过(a)从患者获得细胞样品；(b)可选地，除尽样品的白细胞；(c)从样品的其余部分制备DNA、RNA或两者；以及(d)检测DNA、RNA或两者是否具有HAS2突变或表达HAS2剪接变体，其中突变或剪接变体的鉴定表明在样品中浆膜癌干细胞的存在。通过量化上述DNA或RNA的量，可以关联调查结果与患者中浆膜癌的存在和/或浆膜癌的进展。
[0167] 这些相关性包括以下能力：早期检测癌症和它的疾病阶段以及对浆膜癌的存在、癌症干细胞的存在、肿瘤的自由漂浮链含量、肿瘤的侵袭性、肿瘤的转移潜力、和肿瘤的转移风险作出最初诊断。同样地，患者的HAS2状态可以用来针对透明质酸酶联合治疗对患者进行分级以及用来关联无病存活和对治疗的反应。可以将基于HAS2的PCR测定纳入临床试验以跟踪化学疗法对癌症干细胞的影响并在试验早期确定治疗是有效的或无效的。
[0168] 用于上述测定的样品可以优选为腹水，但也可以使用外周血。DNA或RNA可以直接扩增自腹水或血液样品并用于PCR方法。用于野生型和变体mRNA的特异性FISH(荧光原位杂交)探针可以用于血涂片或在诊断载玻片上旋转的腹水样品上。还可以确定在相同细胞中这些探针的存在。
[0169] 和实体瘤相比，HAS2剪接变体似乎更多地表达在腹水样品中。临床上，具有腹水是较差预后，所以在变体表达和临床结果之间存在相关性。
[0170] 本领域技术人员将明了，可以对以上描述的本发明进行各种省略、补充和改进而不偏离本发明的范围，并且所有这样的改进和变化是在如由所附权利要求所限定的本发明的范围内。引用的所有参考专利、专利申请或其它文献的全部内容以引用方式结合于本文。
[0171] 实施例
[0172] 实施例1：体内原位卵巢癌模型的开发
[0173] Ovcar3细胞系(获自NCI、NCI-60组)最初源自患有晚期卵巢腺癌并具有腹膜转移的患者的腹水[Hamilton，1983]。在M5-FCS培养基中维持细胞系。
[0174] 通过用表达eGFP-HSV-TK-荧光素酶(GTL)融合基因的逆转录病毒载体进行转导来获得表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的Ovcar3[Ponomarev,2004]。转导效率为~10%。在Flow Cytometry Core Facility(MSKCC)，通过FACS，针对最高GFP表达来分选转导的Ovcar3细胞。GFP分选的Ovcar3细胞被称为Ovcar3-GTL。将Ovcar3-GTL细胞维持在M5-FCS培养基中。在经组织培养物处理的平板上 形成上皮单层。
[0175] 通过用异氟烷(Baxter Healthcare)麻醉小鼠，并以75mg/kg体重的剂量眶后注射给予在PBS中的D-荧光素(Xenogen)，来进行生物发光成像。在注射荧光素以后2分钟借助于电荷耦合装置相机(IVIS,Xenogen)开始成像。在每个时间点，从每只动物获得背侧和/或腹面图像，以更好地确定光子发射的起源。数据表示为光子发射(光子/秒/cm2/球面度)。利用t检验来确定统计显着性。通过比较在3-5只小鼠的组之间的光子发射的曲线下面积(AUC)并利用双样本威尔科克森秩和检验，对荧光素酶生物成像模型进行统计分析。
[0176] 选择腹膜内(i.p.)注射策略来建立尽可能接近晚期卵巢癌的临床表现的系统，6
以及表示从其最初获得Ovcar3细胞系的部位的系统。对于这种异种移植模型，用10x10 个Ovcar3-GTL细胞i.p.注射10-12周龄雌性NOD--SCID小鼠。在注射以前，在37°C下，用在0.02EDTA中的0.05%胰蛋白酶进行处理5分钟(Mediatech)，以将Ovcar3-GTL单层细胞解离成单细胞。用i.p.注射PBS，每周三次，来处理小鼠。在用荧光素注射小鼠以后，通过由表达荧光素酶的Ovcar3-GTL细胞发射的可见光的连续全身非侵入性成像，来跟踪肿瘤分布。
以及表示从其最初获得Ovcar3细胞系的部位的系统。对于这种异种移植模型，用10x10 个Ovcar3-GTL细胞i.p.注射10-12周龄雌性NOD--SCID小鼠。在注射以前，在37°C下，用在0.02EDTA中的0.05%胰蛋白酶进行处理5分钟(Mediatech)，以将Ovcar3-GTL单层细胞解离成单细胞。用i.p.注射PBS，每周三次，来处理小鼠。在用荧光素注射小鼠以后，通过由表达荧光素酶的Ovcar3-GTL细胞发射的可见光的连续全身非侵入性成像，来跟踪肿瘤分布。
[0177] 由于需要注射大量的肿瘤细胞(5百万-1千万)以获得肿瘤发展和由NOD-SCID小鼠中的剩余免疫力引起的肿瘤生长的生长缓慢特性，所以更加免疫抑制的小鼠用于进一步的实验。
[0178] NOD-SCID IL2Rγ-/-(NSG)小鼠已开发为比NOD-SCID小鼠更加免疫抑制的品系。NSG小鼠缺乏天然杀伤(NK)细胞以及T和B淋巴细胞。因为在NOD/SCID小鼠中的剩余免疫力可能已干扰人癌细胞的生长，所以在人卵巢癌异种移植实验中比较了NSG小鼠和NOD/SCID小鼠。当将Ovcar3-GTL细胞i.p.注入NSG小鼠时，获得的植活（engraftment，植入）少至25,000个细胞。和NOD-SCID小鼠相比，上述植活好200倍。此外，跟踪腹膜内肿瘤生长数月，并且最终小鼠显示腹胀（表明腹水形成）以及体重减轻。这些观测结果表明，体内小鼠模型概括了具有腹膜转移的卵巢癌的许多方面（如在诊所中所看到的）。
[0179] 在细胞接种以前NSG小鼠的亚致死剂量照射对肿瘤植活具有负面影响。观测到，在没有照射的情况下，Ovcar3-GTL细胞的植活直接正比于所注射的细胞数目。然而，在细胞注射以前，小鼠的300拉德的亚致死剂量照射导致相同水平的植活，而与所注射的细胞数目无关。
[0180] 利用NSG小鼠来代替NOD-SCID小鼠是一种主要的技术进步（对于植活效率）并显著克服NOD-SCID小鼠的剩余免疫力的抗肿瘤活性的问题。借助于在NSG小鼠中的更高植活效率，此原位系统提供了早期卵巢癌的极好模型并便于跟踪疾病发展到后期阶段。
[0181] 实施例2：炎性反应刺激肿瘤生长
[0182] 当NSG小鼠被i.p.植入Ovcar3-GTL细胞和i.p.注射PBS（每3天一次，时间为13周）时，腹膜内肿瘤生长达到“平衡”，如图1所示。在NSG小鼠中，在处于平衡状态以后，肿瘤尺寸被维持在相同水平，时间达数月。然而，在卵巢NSG模型中，腹膜肿瘤生长总是更加迅速和广泛的，并且和PBS注射组相比，在注射有脂化N3'→P5'氨基磷酸酯寡核苷酸(“寡核苷酸”)的组中，具有更大容积的腹水(图1)。寡核苷酸是具有如下结构和序列的
13聚体：5'-棕榈酰-TAGGTGTAAGCAA-3′。
13聚体：5'-棕榈酰-TAGGTGTAAGCAA-3′。
[0183] 对寡核苷酸序列的BLAST搜索发现了与若干鼠科动物和人基因的匹配。因此，体内寡核苷酸的肿瘤促进作用可能是由于在肿瘤细胞中或在小鼠腹膜环境的细胞中基因表达的一些变化。可替换地，脂化材料的重复注射可以诱发涉及腹膜巨噬细胞的经典炎症。如果它是由错配化合物的脂质成分引起的炎性反应，那么另一种炎性渗出物，如巯乙酸盐，还6
将增加腹膜内肿瘤生长。为了测试这一点，使NSG小鼠i.p.注射10 个Ovcar3-GTL细胞并在4周后i.p.注射1mL流体巯乙酸盐(Hardy Diagnostics)或PBS。和经PBS处理的小鼠相比，在经巯乙酸盐处理的小鼠中肿瘤生长会增加(图2)。这些结果提示，在腹膜中诱导炎症会促进腹膜内卵巢肿瘤生长。
将增加腹膜内肿瘤生长。为了测试这一点，使NSG小鼠i.p.注射10 个Ovcar3-GTL细胞并在4周后i.p.注射1mL流体巯乙酸盐(Hardy Diagnostics)或PBS。和经PBS处理的小鼠相比，在经巯乙酸盐处理的小鼠中肿瘤生长会增加(图2)。这些结果提示，在腹膜中诱导炎症会促进腹膜内卵巢肿瘤生长。
[0184] 实施例3：从NSG腹水分离肿瘤细胞和自由漂浮链的鉴定
[0185] 文件表明，来自卵巢癌症患者的腹膜腹水包含肿瘤细胞[Bardiès,1992;Becker,1993;Filipovich,1997;Makhija，1999]，这提示来自患有腹膜内肿瘤的NSG小鼠的腹水也应包含肿瘤。为了确定肿瘤细胞是否存在，处死来自实施例1的经寡核苷酸处理的组的携带肿瘤的动物，供分析肿瘤和腹水组成。用寡核苷酸处理的NSG小鼠发展了连接于腹膜壁的实体瘤(网膜饼)和血性腹水。
[0186] 通过用5ml的PBS进行腹腔灌洗，从腹胀小鼠收获腹水。来自注射寡核苷酸的小鼠的腹水包含较大的自由漂浮球形体，其在室温下在温育5分钟以后沉降到锥形管的底部。在来自卵巢癌症患者的临床腹水样品中经常观测到癌症球形体并且已表明包含癌症干细胞[Szotek,2006;Zhang,2008;Bapat,2005;Bardiès,1992;Becker,1993;Filipovich,1997;Makhija,1999]。肿瘤球形体还关联于肿瘤的化学疗法和放射疗法抗性[Gorlach,1994;Bjorge,1997;Chignola,1995;Tunggal,1999;Olive,1994]。
[0187] 为了测试在携带Ovcar3-GTL细胞的NSG小鼠的腹水中的球形体是否包含肿瘤细胞和CSC以及为了分离球形体，通过40μm粗滤器(BDFalcon)来过滤腹水以选择卵巢癌球形体(直径>40μm)。利用菲可(1.077g/mL,Accu-Prep,Axis-Shield PoC AS)并通过对不连续密度梯度的离心作用，从在流过流分（flow-through fraction）(直径<40μm)中的肿瘤细胞中除去红细胞(RBC)和淋巴细胞。这些流分的细胞含量示于图3。
[0188] 大多数球形体（具有大于40微米的直径）留在过滤器的顶部并被收获供随后的实验(图3a)。流过流分包含直径小于40微米的细胞结构，其导致意外的发现。
[0189] 用显微镜观测到流过流分包含细胞的自由漂浮链，其包括彼此连接并排列在一个轴上的4-8个个体细胞(图3b)。链受到保护性外被(糖萼)的包围，其中保护性外被从细胞表面延伸多达20微米。糖萼防止与RBC或其它类型的造血细胞的相互作用。包含链的单个细胞大于RBC并且在菲可（Ficoll）梯度上与它们分开(图3c)。
[0190] 为了确定自由漂浮链是源自人Ovcar3-GTL细胞或源自小鼠细胞，用兔抗GFP抗体和小鼠抗人波形蛋白抗体(Vector Labs)来染色细胞。将自由漂浮链固定于涂布有多聚左旋赖氨酸的载玻片(Sigma)上。对球形体进行石蜡包埋，切片并封固在涂布有多聚左旋赖氨酸的载玻片上。在用一抗处理以后，用Tyramide Alexa Fluor 568(Invitrogen)作为二抗来处理细胞，利用Discovery XT处理器(Ventana Medical Systems)来获得荧光图像，然后通过MetaMorph 7.0软件(Molecular Devices)加以分析。必要时，将假彩色指定为阳性信号。
[0191] 对于GFP和人特异性波形蛋白，链染色为阳性，这表明它们的细胞起源于人卵巢肿瘤细胞。这些细胞结构的不寻常的形态，即，肿瘤细胞的这些链，表明是新颖的多细胞实体并被称为"自由漂浮链"(来自链的拉丁文)。
[0192] 实施例4：自由漂浮链的体外扩大
[0193] 在经组织培养物处理的烧瓶中，在有包含10%FCS的培养基存在的条件下，在没有腹膜内体内通道的培养物中生长的Ovcar3-GTL细胞通常形成附着上皮单层。甚至在无血清（serum-free）培养基存在的条件下，这些单层也不在低附着平板上形成自由漂浮肿瘤球形体。
[0194] 当在相同条件下体外培养源自Ovcar3-GTL的肿瘤细胞（分离为自由漂浮链或球形体，如在实施例3中所描述的）时，仅连接于烧瓶的一小部分的细胞形成附着单层。此外，附着单层具有间充质形态而不是上皮形态。此外，细胞群堆积在这些间充质单层上而细胞的其余部分则作为自由漂浮球形体和自由漂浮链留在悬浮液中。然而，没有丢弃悬浮流分，而是开发了一种培养体系来保持和扩大收集自患有卵巢癌的NSG小鼠的腹水的肿瘤细胞。
[0195] 为了开发上述培养体系，在经组织培养物处理的烧瓶(BD Falcon)中，并在M5-FCS培养基中，分开培养<40μm(非球形体)流分和未解离的肿瘤球形体(>40μm流分)(参见实施例1)。每周收集悬浮细胞并通过40μm粗滤器过滤以分开较大肿瘤球形体与<40μm流分，然后传入具有新鲜培养基的新烧瓶。在自由漂浮肿瘤球形体的5-6次连续传代以后，建立了作为自由漂浮球形体繁殖的稳定的球形体培养物。类似地，自由漂浮的<40μm流分的连续传代产生细胞的自由漂浮链(自由漂浮链)的稳定培养物。悬浮培养体系的示意图示于图4。
[0196] 在除去悬浮流分以后，对在每个传代的剩余单层供给新鲜培养基，并在培养基更换几天以后，在附着单层培养物中观测到堆积在间充质单层上的细胞群。这些小的、圆形和反光细胞最终脱离自单层并形成在悬浮液中的新的自由漂浮链和球形体。
[0197] 在悬浮流分的每个传代，球形体和自由漂浮链留在悬浮液中并且仅少数细胞形成单层。随着增加的传代数，悬浮培养物富集有自由漂浮链，一些自由漂浮链通常包括多达约72个细胞，但并不限于这种精确的上限(图5c)。
[0198] 在体内腹膜传代以后，上皮Ovcar3-GTL细胞变成间充质Ovcar3-GTL细胞的观测结果提示，自由漂浮链的发展过程涉及上皮-间充质转换(EMT)。此阶段以后接着是小的、圆形和反光阿米巴样细胞"堆积"在间充质细胞的顶部(图4)，一种描述为间充质-阿米巴样转换(MAT)的机制[Friedl,2003]。自由漂浮链转换是新形式的细胞转换，其中细胞保留在悬浮液中，沿着相同分化轴对称分化，并保留在细胞之间的ZO-1紧密接头。
[0199] 为了测试自由漂浮链的形成是在悬浮液中细胞聚集的结果或是来自单细胞（通过增殖）的克隆扩大的结果，通过胶原酶IV处理(在37°C下5mg/ml胶原酶IV(Invitrogen)处理10分钟)将自由漂浮链解离成单细胞，然后通过时间推移显微术并利用装备有MetaMorph图像采集软件的PerkinElmer Ultra VIEW ERS Spinning Disk共焦系统来跟踪细胞36小时。利用MetaMorph 7.0软件(Molecular Devices)来分析图像和产生影片。
[0200] 为了时间推移研究，将解离的自由漂浮链接种在96孔板的M5-FCS培养基中。然后将平板放置在具有调节的CO2和温度的封装倒置显微镜下并覆上薄层48小时，然后每10分钟获取图像。
[0201] 单个细胞在悬浮液中是非常能动的并观测到互相排斥，这提示，自由漂浮链形成并不是由聚集引起。例如，在36小时内，通过在相同轴上的对称分裂，2细胞链发展成9细胞链，这表明自由漂浮链是克隆的并且细胞快速增殖(倍增时间<18小时)以形成自由漂浮链。因而，自由漂浮链形成并不是起因于细胞聚集而是悬浮细胞的克隆和对称扩大的结果。还观测到，单细胞可以脱离自自由漂浮链以形成新自由漂浮链。自由漂浮链的快速细胞周期进展并不损害这些结构的线性。分裂并不限于在链末端的细胞。通过有丝分裂，在自由漂浮链中的任何细胞可以经常同时分裂为多种不同细胞。
[0202] 为了评估在这些新型细胞实体中细胞-细胞连接的分子结构，用抗-E-钙黏着蛋白(黏着连接标记；BD Transduction Lab)和ZO-l(紧密接头标记；Zymed)来免疫染色自由漂浮链(通常如上所述)。对于E-钙黏着蛋白，自由漂浮链染色为阴性，但对于ZO-l则为阳性(图5a)。E-钙黏着蛋白染色的丢失提示，黏着连接并不参与自由漂浮链形成。ZO-l染色定位于接头处，这提示，自由漂浮链细胞可以通过紧密接头彼此连接。自由漂浮链的波形蛋白抗体染色示于图5c。
[0203] 在自由漂浮链形成期间，当细胞沿着"自由漂浮链"轴对称分裂时，高尔基体标记(巨蛋白)定位于细胞接头，以及当分裂是垂直于自由漂浮链轴时，则定位于相反端，如利用抗巨蛋白抗体进行的免疫荧光染色所示(图5c)。这些实验表明，自由漂浮单细胞沿着相同分裂轴的对称快速分裂会形成自由漂浮链，其中通过紧密接头，细胞保持连接。
[0204] 实施例5：球形体形成
[0205] 亚汇合自由漂浮链培养物主要包含细胞的自由漂浮链。然而，在以后阶段，当存在高密度的自由漂浮链时，则观测到自由漂浮球形体(图6)。通过“卷起”过程，球形体发展自自由漂浮链，这提示，在细胞培养的汇合阶段，营养匮乏会为自由漂浮链存活提供保护性环境。
[0206] 为了了解在球形体和自由漂浮链之间的相互作用，通过时间推移显微术（如在实施例4中所描述的）来跟踪单个球形体。为了这些实验，通过胶原酶IV处理(在37°C下5mg/ml胶原酶IV(Invitrogen)处理10分钟)，将来自悬浮培养物的球形体解离成单细胞。
将形成细胞的单球形体接种于96孔板中并在显微术以前培养2周。每20分钟获取DIC和GFP荧光图像，其中恒定暴露时间为72小时。
将形成细胞的单球形体接种于96孔板中并在显微术以前培养2周。每20分钟获取DIC和GFP荧光图像，其中恒定暴露时间为72小时。
[0207] 在球形体形成的初始阶段期间，细胞积聚在附着间充质单层上。细胞团块在相对于附着面的垂直方向上生长，类似于来自附着细胞的“芽殖”，然后发展成具有有组织的囊性结构的球形体。球形体最终脱离自附着单层并在悬浮液中持续快速增殖，同时维持球体形态。此过程的示意图示于图7。还发现发展中的球形体将新鲜自由漂浮链挤入悬浮液。那些自由漂浮链快速增殖以形成新的漂浮的自由漂浮链。
[0208] 如在实施例4中所描述的进行石蜡包埋球形体的免疫荧光染色，其中利用抗Ki-67(Vector Labs)、抗磷酸组蛋白H3(Ser 10)(Upstate)、抗β-联蛋白(Sigma)、抗非典型PKC(aPKC)、抗E-钙黏着蛋白(BD transduction Lab)、和抗ZO-l(Zymed)作为一抗。
[0209] 通过细胞的有组织的移动并同步于细胞分裂和再现（recapitulate）原始Ovcar3-GTL腺癌表型，来产生在球形体中的腺体结构。对于Ki-67，大多数细胞染色为阳性，这表明这些细胞正主动增殖。如针对自由漂浮链所观测到的，球形体细胞也是E-钙黏着蛋白阴性的，并在细胞-细胞连接处检测到ZO-l。β-联蛋白和aPKC定位于在球形体中的每个细胞的细胞膜。在球形体的中部存在内腔，但不存在尖端-基部极性，如通过在球形体中的ZO-l、β-联蛋白和aPKC的均匀染色（而不是它们的染色限于衬于内腔的细胞）所确定的。
[0210] 这些实验确立了在自由漂浮链和球形体之间的生物连接，其表明，自由漂浮链可以卷起以形成球形体，以及球形体可以将自由漂浮链挤入悬浮液。这些形态学状态似乎是动态和可互换的。在来自注射有人卵巢癌细胞的小鼠的腹水中最初观测到自由漂浮链和肿瘤球形体在一起，这提示，自由漂浮链和球形体形成可以是在腹膜腔中卵巢癌发展的中心。
[0211] 实施例6：自由漂浮链和球形体自我更新
[0212] 通过人卵巢上皮细胞系，Ovcar3-GTL，的体内腹膜传代，获得自由漂浮链和球形体。自由漂浮链形成（通过显着快速的细胞分裂）的非寻常生物特性促进我们研究自由漂浮链在肿瘤发生中的作用。
[0213] 先前描述的卵巢癌球形体包含克隆发生CSC，其具有广泛的自我更新能力[Bapat,2005]。在此研究中在自由漂浮链和球形体之间的形态关系以及所观测到的在悬浮培养物中的每个自由漂浮链的克隆特性表明在自由漂浮链和癌症干细胞(CSC)之间的功能性联系。
[0214] 通过在多孔细胞培养板中平板接种来自自由漂浮链或球形体的单细胞，体外测试了自由漂浮链和球形体的克隆发生。在37°C下通过5mg/ml胶原酶IV(Invitrogen)处理10分钟，将自由漂浮链和球形体解离成单细胞；在37°C下用在0.02mM EDTA中的0.05%胰蛋白酶处理5分钟，将Ovcar3-GTL单层解离成单细胞(Mediatech)。利用MoFlo细胞分选仪，进行单细胞FACS分选。在通过DAPI排除死细胞以后，将GFP+单细胞沉积到96孔经组织培养物处理的板(BD Falcon)，其包含M5-FCS培养基，用于Ovcar3-GTL自由漂浮链和单层；或包含无血清mTeSRl培养基(Stem Cell Technology)，用于Ovcar3-GTL球形体。通过倒置相差显微镜(Nikon)，在第14天直观评分孔的生长。汇集来自第一促克隆形成测定的集落，并通过胶原酶IV处理，解离成单细胞，然后经受单细胞FACS分选，供用于第二和第三体外促克隆形成测定。
[0215] 体外促克隆形成测定表明，自由漂浮链高度富集有促克隆形成的候选CSC，这是因为在解离和单细胞平板接种以后，55-65%的自由漂浮链细胞再克隆，主要形成新的自由漂浮链(图8)。球形体细胞的再克隆潜力也较高(10-30%)，主要形成新的球形体，并具有很少自由漂浮链。由于来自已发展的球形体的单细胞主要导致球形体，它提示，稳定的修饰可以控制在自由漂浮链和球形体之间的形态变换。
[0216] 已体外稳定维持自由漂浮链和球形体24个月而没有丧失它们的克隆发生。汇集来自第一促克隆形成测定的集落，通过胶原酶IV处理，解离成单细胞，然后经受单细胞FACS分选，供用于第二和第三体外促克隆形成测定。这种高克隆发生的模式继续存在于第三单细胞再克隆传代，其中自由漂浮链形成自由漂浮链(再克隆潜力在包含FCS的培养基中为55%，在无血清、ES培养基中为45%)以及球形体形成球形体(10%的再克隆潜力)。相比之下，当在包含FCS的培养基中Ovcar3-GTL上皮单层细胞生长为单层时，1%的细胞能够再克隆；而在无血清培养基中，没有获得再克隆。还将单层细胞分选到经Matrigel涂布的孔并保留1%克隆发生。
[0217] 因此，这些体外促克隆形成实验表明，相对于上皮单层，自由漂浮链和球形体均富集有促克隆形成细胞。自由漂浮链细胞富集有促克隆形成细胞，其具有广泛的自我更新能力，在24个月内经多次传代，克隆发生为65%。
[0218] 实施例7：自由漂浮链和球形体体内分化
[0219] 在免疫缺陷小鼠中的引发肿瘤的有限稀释测定用来评估在自由漂浮链和球形体中的CSC。
[0220] 通过在8-12周龄雌性NSG和NOD-SCID小鼠中的腹膜内移植，其中利用来自6
Ovcar3-GTL自由漂浮链和球形体的第三单细胞再克隆传代的10 个细胞，来评估自由漂浮
6
链和球形体细胞的CSC特性。在这些实验中，对三只未照射小鼠的组i.p.注射10 个解离的
6
自由漂浮链细胞或10 个解离的Ovcar3-GTL单层细胞。对另一组未照射NSG小鼠i.p.注
6
射10 个未解离的球形体。如在实施例1中所描述的，在第2周和第2周，对小鼠进行成像。
监测小鼠的腹胀和乏力。
Ovcar3-GTL自由漂浮链和球形体的第三单细胞再克隆传代的10 个细胞，来评估自由漂浮
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链和球形体细胞的CSC特性。在这些实验中，对三只未照射小鼠的组i.p.注射10 个解离的
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自由漂浮链细胞或10 个解离的Ovcar3-GTL单层细胞。对另一组未照射NSG小鼠i.p.注
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射10 个未解离的球形体。如在实施例1中所描述的，在第2周和第2周，对小鼠进行成像。
监测小鼠的腹胀和乏力。
[0221] 对于相同数目的注射细胞，在NSG和NOD-SCID小鼠中，解离的自由漂浮链和未解离的球形体的移入均好于Ovcar3-GTL单层(图9)。另外，和在NOD-SCID小鼠中相比，在NSG小鼠中，所有细胞类型的移入显著更好(图9，左图片)，这提示，在NOD-SCID小鼠中的剩余免疫力对高度促克隆形成细胞的植活仍然起着负面作用。
[0222] 类似地，在NSG小鼠中，利用解离的OvCar3-GTL自由漂浮链和单层，进行引发肿瘤6
的有限稀释实验(图9，右图片)。对三只小鼠的组注射10、20,000或200个细胞。少至
200个自由漂浮链细胞在7天内形成腹膜内肿瘤，而20,000个单层细胞到14天时则没有形成腹膜内肿瘤，这提示，和上皮单层相比，富集至少100倍的自由漂浮链CSC。在注射有200个自由漂浮链细胞的3/3小鼠中在2周内观测到较大肿瘤，而当注射有20,000个单层细胞时在2周内仅1/3小鼠具有较小肿瘤。
的有限稀释实验(图9，右图片)。对三只小鼠的组注射10、20,000或200个细胞。少至
200个自由漂浮链细胞在7天内形成腹膜内肿瘤，而20,000个单层细胞到14天时则没有形成腹膜内肿瘤，这提示，和上皮单层相比，富集至少100倍的自由漂浮链CSC。在注射有200个自由漂浮链细胞的3/3小鼠中在2周内观测到较大肿瘤，而当注射有20,000个单层细胞时在2周内仅1/3小鼠具有较小肿瘤。
[0223] 腹膜内注射20个自由漂浮链细胞在到6个月时并不导致肿瘤形成。在腹膜环境中，自分泌因子的稀释可以延迟由有限数目引发的肿瘤的生长。为了确定自分泌因子是否正发挥作用以及为了克服可能的稀释效应，借助于100μL Matrigel，将200、20或2个解离的自由漂浮链细胞s.c.注射进入NSG小鼠。在第3周的生物成像表明，在皮下模型中，2个自由漂浮链细胞能够形成肿瘤(图10)。当皮下肿瘤达到>0.5cm的直径时，肿瘤样品被评分为移入。
[0224] 通过将自由漂浮链细胞悬浮在以1:1与Matrigel混合的包含血清的培养基中，在NSG小鼠中，单自由漂浮链细胞的腹膜内注射能够在3周内形成可检测的腹膜肿瘤。类似地，在NSG小鼠中，皮下注射在以1:1与Matrigel混合的包含血清的培养基中的单自由漂浮链细胞也能够在3周内形成可检测的皮下肿瘤。在腹膜内注射中Matrigel的使用可以增加植活效率。
[0225] 形态上，获自上述测定的腹水球形体和附着肿瘤维持浆液性卵巢腺癌具有限定的乳头状结构的特点。在球形体中，一些细胞经历形态回复(分化)，即，从阿米巴样形态转换到间充质形态，并伴有复杂孢囊和导管结构的分化和发育。
[0226] 这些实验证明了，自由漂浮链是由卵巢CSC构成的新型细胞实体，其具有广泛的自我更新能力(经24个月，克隆发生为65%)和多谱系分化潜力(复杂孢囊和导管结构)。自由漂浮链的不寻常的细胞形态还伴有它的极快的倍增时间(<18小时)和高克隆发生(~65%)。
[0227] 实施例8：借助于卵巢癌干细胞的体内转移性模型
[0228] 在NSG小鼠中静脉内注射300,000个GFP/荧光素酶标记自由漂浮链细胞导致多种肿瘤。通过生物发光成像，在6周以后，观测到肿瘤定位在股骨关节和腹膜。尸体剖检和组织病理学证实了在多种组织内存在肿瘤细胞。在若干组织（如肝）中的浸润液是严重到足以干扰正常器官功能。在所检查组织中，涎腺没有肿瘤细胞，然而，瘤形成是存在的并包围下切牙之一。
[0229] 病理检查显示在多个拓扑部位具有多灶性粘液分化的癌。在皮下组织中存在中等量的黄色、胶状液。腹部明显膨胀。直径为0.5cm的可自由移动的适度坚固的灰白色团块存在于相邻于右后膝关节的软组织中。整个肺叶分散有多灶性（精确到1mm直径）、半透明的、略微凸起病灶。散布的、直径0.3cm至2.3x1.2x1.2cm的适度坚固的、淡红-棕褐色小结几乎超越（efface）正常肝脏结构。存在很少量的粘附于肝的荚膜表面的清晰的、粘性液体。右卵巢被放大，测得直径为0.7cm。在右子宫角的近端方面，存在直径为0.4cm的红色病灶。相邻于左肾的颅极，存在直径为1.0cm的、半透明的、波动的小结。
[0230] 总之，自由漂浮链细胞静脉内注射到NSG小鼠导致侵入卵巢和子宫但不侵入输卵管；肿瘤形成以及后踝和后膝关节；侵入肺；较大转移到肝；围绕肝的粘性物质；起因于肝功能不良的皮下组织黄色水肿；以及粘性腹水形成。
[0231] 实施例9：移入腹膜内肿瘤的组成
[0232] 在实施例7中的植活实验表明，和分化的上皮单层相比，自由漂浮链和球形体均高度富集在肿瘤原始细胞中。为了了解在自由漂浮链和球形体之间的形态差异如何反映在它们产生的腹膜内肿瘤的组成中，分析了注射有Ovcar3-GTL自由漂浮链或未解离的球形体的小鼠的腹水和实体瘤。在第4周，收获自自由漂浮链注射小鼠的腹水包含自由漂浮球形体，而在第4周，收获自注射有未解离的球形体的小鼠的腹水则包含显着更少的自由漂浮球形体。自由漂浮链或未解离的球形体的注射导致网膜饼的形成。这些结果提示，自由漂浮链和球形体表示在腹膜腔中卵巢癌发展的不同阶段，其中自由漂浮链的广泛增殖导致球形体形成，其反过来又连接于间皮衬里并生长为进入网膜饼中的实性块。
[0233] 实施例10：来自间充质卵巢细胞系的自由漂浮链形成
[0234] 用Ovcar3-GTL单层进行的体内实验导致以下假说：上皮卵巢癌细胞经历上皮到间充质转换(EMT)，接着间充质到自由漂浮链转换，以产生自由漂浮链和球形体。Ovcar3上皮细胞单层的体外培养并不经历间充质到自由漂浮链转换。然而，在体内腹膜传代以后，当在并不支持单层的从间充质到自由漂浮链转换的条件下生长时，那些细胞自发地进行间充质到自由漂浮链转换，以产生自由漂浮链和球形体的悬浮培养物。这些结果提示，具有基因稳定的EMT的恶性间充质细胞能够进行间充质到自由漂浮链转换，因而自发地产生自由漂浮链和球形体，而不需要体内腹膜传代。
[0235] 为了确定在没有体内传代的情况下，间充质细胞是否可以产生自由漂浮链和球形体，即，那些细胞是否和腹膜传代的Ovcar3-GTL细胞体外所进行的一样将自发地经历间充质到自由漂浮链转换，如在实施例4中所描述的，连续传代来自Ovcar5-GL和A2780-G单层的在培养基中的悬浮细胞，以富集自由漂浮链和球形体并发展每种实体的悬浮培养物。
[0236] Ovcar5细胞系获自NCI(NCI-60组)。通过用表达eGFP-荧光素酶(GL)融合基因的慢病毒载体进行的转导来获得表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的Ovcar5。针对最高GFP表达，通过FACS，来分选转导的Ovcar5细胞。GFP分选的Ovcar5细胞被称为Ovcar5-GL。A2780-GFP细胞系，在本文中还称作A2780-G，由Dr D.Spriggs(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)提供。
[0237] 在经组织培养物处理的烧瓶的M5-FCS培养基中培养A2780-G和Ovcar5-GL单层细胞系。在这些条件下，大多数细胞生长为间充质单层并具有自由漂浮悬浮细胞专长细流分。为了富集形成自由漂浮链和形成球形体的细胞，通过去除悬浮流分，来从单层分离悬浮细胞。通过在300xg下的离心作用5分钟来沉淀悬浮细胞，然后用新鲜培养基加以重悬浮。将细胞再平板接种到新烧瓶并每周传代悬浮流分直到培养物富集有自由漂浮链和球形体。
因而，体外自发地发生间充质到自由漂浮链转换而不需要体内传代(图11)。单细胞体外促克隆形成测定表明，Ovcar5-GL单层包含5%促克隆形成细胞，而Ovcar5-GL自由漂浮链则具有30%的促克隆形成细胞。
因而，体外自发地发生间充质到自由漂浮链转换而不需要体内传代(图11)。单细胞体外促克隆形成测定表明，Ovcar5-GL单层包含5%促克隆形成细胞，而Ovcar5-GL自由漂浮链则具有30%的促克隆形成细胞。
[0238] 实施例11：分泌的间充质单层抑制因子可以防止自由漂浮链自我更新并促进分化
[0239] 由于在发生间充质到自由漂浮链转换以前，来自间充质肿瘤细胞的悬浮流分必须传代若干次，它提示，连续传代的过程可以去除或削弱可能的抑制因子，该抑制因子会防止在间充质单层培养物中的自发的自由漂浮链转换。如果存在这样的因子(或多种因子)，那么在共培养体系中间充质肿瘤细胞将抑制自由漂浮链，在上述共培养体系中在相同烧瓶中培养两种类型的细胞并且不断分泌上述因子。
[0240] 在具有用来对室进行分离的0.22μm过滤器的跨孔板（transwell plate）中，用Ovcar5-GL或A2780-G间充质单层共培养自由漂浮链。将间充质细胞放置在底室中的亚汇合水平，并将自由漂浮链细胞放置在顶室。在悬浮液中作为自由漂浮链的自由漂浮链生长受到显着抑制并且自由漂浮链作为单细胞留在悬浮液中或连接于组织培养烧瓶，然后分化成间充质细胞。如果将经调节的间充质培养基加热至70°C并加入自由漂浮链培养物，则会丧失抑制活性。这些结果提示，分化的间充质癌细胞分泌不耐热的抑制因子，其可以防止在悬浮液中癌症干细胞的无节制扩大。
[0241] 实施例12：来自早期传代浆膜肿瘤细胞系的自由漂浮链形成
[0242] SKOV-6和CAOV-2细胞系(来自Dr.Lloyd Old,MSKCC)源自患有乳头状浆液性卵巢腺癌的患者的腹水并且在使用以前没有被大量传代。解冻来自传代5-10次的冷冻细胞并维持在M5-FCS培养基中。如在实施例4中所描述的，通过SKOV-6和CAOV-2细胞系的悬浮流分的连续传代，来获得自由漂浮链。
[0243] 在早期传代培养物中，发现，许多圆形和反光细胞堆积在间充质单层上或作为在悬浮液中的自由漂浮链。悬浮流分的连续传代会富集间充质到阿米巴样转换事件以及在CAOV-2和SKOV-6细胞中的自由漂浮链形成。
[0244] 实施例13：来自癌症患者腹水的自由漂浮链和球形体形成
[0245] 1.自由漂浮链形成
[0246] 来自包含肿瘤细胞的胸膜、心包或腹水的浆膜癌样品获自患有转移性癌症的癌症患者。通过在1200rpm下离心作用10分钟来收获肿瘤细胞。除去浆膜液并在-20°C下存储。将收获的肿瘤细胞放入组织培养烧瓶，该组织培养烧瓶包含来自相同患者并以1:1与含血清培养基混合的浆膜液。在显微镜下，肿瘤细胞的自由漂浮链是立即可观测的。链留在悬浮液中许多周。在37°C下培养肿瘤细胞若干周，并在每周，分离在悬浮液中的细胞的自由漂浮链与附着细胞，然后再平板接种进入具有浆膜液和含血清培养基的相同组合的新烧瓶。在这些研究中，当皮下注射，来自原发性浆膜肿瘤样品的少至100个的这些自由漂浮细胞能够在NSG小鼠中在3个月内形成肿瘤。当腹膜内注射时，这些细胞在NSG小鼠中在3-6个月内形成腹膜肿瘤，并具有多达10ml的包含自由漂浮肿瘤链的腹水、肝转移并具有连接于腹膜壁的实体瘤。来自异种移植的腹水样品的随后体外培养确定了非连接的自由漂浮细胞。
[0247] 2.从在原发性浆膜肿瘤样品中的自由漂浮链生成球形体
[0248] 为了产生球形体，将来自生长在悬浮液中的原发性浆膜肿瘤样品的自由漂浮链重悬浮于以50:1混合与Matrigel的含血清培养基并在37°C下培养。来自这些原发性浆膜肿瘤样品的自由漂浮链卷起以在约第5天形成有组织的肿瘤球形体。培养物每周补充有包含血清的培养基并在2周以后，观测到肿瘤球形体将自由漂浮链挤入培养物。借助于这种细胞培养方法，可以体外维持肿瘤球形体数周。
[0249] 实施例14：自由漂浮链-球形体CSC概念的模型
[0250] 数据表明，自由漂浮链是克隆获得的，而不是通过不同细胞类型的聚集来发展。自由漂浮链在形态和分化状态方面是均匀的，即，它们是克隆纯CSC。虽然链迁移和间充质到自由漂浮链转换关联于肿瘤侵袭性，但自由漂浮链可以提供用于快速、对称CSC扩大的机制。CSC扩大并不是如在球形体中那样有效地发生，并且因为球形体包含按比例比自由漂浮链更少的CSC，所以它提示，球形体可以结构上用来保护CSC并使那些CSC可以进入静止期。
[0251] 图12提供了自由漂浮链-球形体概念和CSC在卵巢癌发展中的作用的模型。卵巢(或输卵管)上皮(绿色)的最初转化的进展是经由上皮-间充质和间充质-自由漂浮链转换。在每轮对称分裂以后，自由漂浮链细胞(红色)失去与细胞外基质或腹膜间皮的所有附着，但仍然彼此连接。在这一点上，自由漂浮链主要由CSC构成。自由漂浮链可以释放单细胞，其生成二级自由漂浮链，或形成球形体。自由漂浮链还可以卷起和形成球形体，和生长为2D单层或实体瘤的肿瘤相比，其包含>10倍更高频率的CSC。球形体可以释放新的自由漂浮链或可以连接于腹膜的间皮壁以形成网膜饼。自由漂浮链可以释放自实体瘤（通过间充质-自由漂浮链转换）并可以重新进入腹膜腹水或穿透进入血管，从而导致更远转移。
[0252] 实施例15：筛查自由漂浮链的药物敏感性
[0253] 1.方法
[0254] 在平底384孔微量滴定板(Corning)中测试源自Ovcar3-GTL的自由漂浮链的自增殖能力。将Ovcar3-GTL自由漂浮链的培养物机械或酶促解离成单细胞。对于机械解离，大力吸移自由漂浮链培养物，加入相同容积的M5-FCS培养基，以降低粘度，然后沉淀细胞。对于酶促解离，在37°C下用5mg/ml胶原酶IV(Invitrogen)温育自由漂浮链培养物10分钟，接着离心作用，以沉淀细胞。将细胞重悬浮于M5-FCS以产生单细胞的均匀培养物，以指定细胞密度将其接种于50μL等分部分/孔中并在添加测试化合物或其它试剂以前生长指定时间。。
[0255] 为了评估细胞生长，在显微镜下观测细胞并利用血细胞计数器人工计数，或用来处理细胞，其中通过将1/10容积的alamarBlue试剂直接加入培养基，在37°C下温育培养物另外48小时，然后测量荧光或吸光率。两种光谱方法给出可比较的结果。荧光或吸光率的量正比于活细胞的数目并对应于细胞代谢活动。荧光测量比吸光率测量更敏感并且通过读板器来测量，其中利用540–570nm的荧光激发波长(峰激发为570nm)并在580–610nm处读发射(峰发射为585nm)。在570nm处并利用600nm作为参比波长，来监测 的吸光率。较大的荧光发射强度(或吸光率)值关联于来自细胞的总代
谢活性的增加。
谢活性的增加。
[0256] 由于在细胞接种以前，通过自由漂浮链的机械或酶促解离，显著去除了细胞外周糖萼的成分，所以确定了添加化合物以确保自由漂浮链具有建立的糖萼的最佳时间，并且发现为在接种以后的3-6天。为了这些实验，如上所述，每孔接种25个Ovcar3-GTL自由漂浮链或250个Ovcar3-GTL自由漂浮链细胞。以接种以后的第1至6天，以12pM至100μM的浓度添加测试化合物(整个平板)。在添加测试化合物5天以后，将 加入培养物，并在48小时以后测量培养物吸光率。就药物敏感性而言，在25和250个细胞之间没有观测到显著差异。
[0257] 2.增殖结果
[0258] 在表2中示出23种测试化合物对OvCar3-GTL自由漂浮链的结果。此表列出测试化合物的名称（identity），测得的IC5（0 以μM为单位），接种1天以后添加测试化合物的样品(主要是缺乏糖萼的细胞)，和在接种6天以后添加测试化合物的样品(具有建立的或大量的糖萼的细胞)。表的最后一列提供从第1天到第6天抗药性的增加倍数。
[0259] 结果表明，在6天内，自由漂浮链变得耐23种制剂中的21种。仅硼替佐米和鱼藤素没有显示差异敏感性。在6天内，糖萼的形成，例如，赋予自由漂浮链对紫杉醇、弗迪隆和9-10dEpoB8,000,000倍以上的抗性。这些结果表明，在细胞接种1天以后添加化合物可以导致化合物毒性的高估。
[0260] 测试了另外6种化合物，甚至在高浓度下，其也没有显示对自由漂浮链细胞的任何影响。不管是接种1天或6天以后添加，化合物，4-甲基伞形酮(4-MU)、Y27632、9-氨基喜树碱(9-AC)、LNMMA、维拉帕米和达沙替尼均呈现100μM的IC50。
[0261] 通过在384孔板中接种100个Ovcar3单层(上皮)或25个Ovcar5单层(间充质)细胞，在卵巢癌单层细胞上平行地测试了上述总共29化合物。在细胞接种4天以后添加药物并通过alamarBlue染色分析了细胞生存力。一般情况下，当和单层相比时，具有建立的糖萼的自由漂浮链细胞平均4-8倍更耐这些化合物。然而，对于一些化合物，这种抗性是更加突出的，包括紫杉醇、异噁唑-弗迪隆、弗迪隆和9-10dEpoB（如表3所示）。上述4种化合物对于Ovcar3和Ovcar5单层细胞是高度抑制的，具有从亚纳摩尔至不大于50nM的IC50值，而自由漂浮链细胞(IC50100μM)是至少2000倍更耐这些化合物。
[0262] 还测试了上述29种化合物对建立的肿瘤球形体的影响。为了这些测定，在384孔板中接种100个形成球形体的细胞并培养11天，以便于在添加药物以前形成肿瘤球形体。在添加化合物5天以后，用alamarBlue来染色细胞并加以评分（如上述）。总体上，球形体显示和具有建立的糖萼的自由漂浮链相同模式的抗药性。在藤素的情况下，球形体形成赋予对细胞的另外15倍的抗性，即，自由漂浮链具有0.025μM的IC50，而球形体IC50为0.4μM。
[0263] 表2
[0264] Ovcar3-GTL自由漂浮链药物敏感性
[0265]
[0266]
[0267] 表3
[0268] 单层与自由漂浮链的药物敏感性
[0269]
[0270] 3.形态结果
[0271] 在显微镜下观测自由漂浮链细胞表明，在用高浓度化合物(100μM托泊替康、25μM雷帕霉素、50μM洛伐他汀酸、100μM异噁唑-弗迪隆、100μM弗迪隆、100μM ara-C、
100μM 9-10dEpoB、100μM紫杉醇)处理的培养物中存在较大的活单细胞，即，在有丝分裂时被阻滞的细胞。
100μM 9-10dEpoB、100μM紫杉醇)处理的培养物中存在较大的活单细胞，即，在有丝分裂时被阻滞的细胞。
[0272] 用雷帕霉素处理的自由漂浮链形成具有界限分明的边缘的紧密球形体。这些球形体在有高浓度雷帕霉素(>50uM)存在的条件下继续生长并保留它们的球形体形态。当用SAHA(HDAC抑制剂)处理自由漂浮链细胞时也观测到紧密球形体的形成。
[0273] 用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的自由漂浮链呈现导致形成融合链的形态变化，这提示，5-FU可以干扰自由漂浮链的紧密和黏着连接。在卵巢癌腹水和转移性乳癌患者样品中观测到类似的结构。细胞-细胞连接的变化也可以是一种抗性机制，其中细胞激活信号通路（通过增加细胞-细胞附着）或更加严格控制分子在细胞之间的转运。
[0274] 当用高浓度维拉帕米处理时，自由漂浮链细胞丧失它们的极性并形成自由漂浮的不规则细胞聚集体。当接种后第5天用聚乙二醇化或非聚乙二醇化牛睾丸透明质酸酶处理自由漂浮链细胞并培养直到第10天时，观测到类似的形态变化。在体外，当通过透明质酸酶除去/破坏外被时，自由漂浮链细胞失去它们的极性并形成不规则聚集体。
[0275] 实施例16：糖萼分析
[0276] 在高细胞密度下，自由漂浮链和球形体培养物变得越来越粘稠。在没有传代的情况下，自由漂浮链培养物变得如此粘性，以致甚至在用胶原酶-IV长期温育和/或剧烈机械解离以后也难以收获悬浮细胞，这提示，围绕自由漂浮链和球形体的糖萼外被的存在正产生粘性(或粘液)培养基。检查细胞和培养基中黏蛋白和透明质烷的存在。
[0277] 黏蛋白CA125(MUC16基因的蛋白产物)，一种用于不同类型的癌症的生物标记，的最初FACS分析表明，CA125并不表达在自由漂浮链的表面。同样地，ELISA实验表明，自由漂浮链并不分泌CA125(图13)。相比之下，Ovcar3-GTL上皮细胞对于CA125是98%阳性的（通过FACS）并分泌800单位/ml的CA125进入培养基。为了ELISA，通过在300xg下旋转培养物5分钟以除去细胞来收集细胞上清，然后通过CA125ELISA并利用自动化仪器，ADVIA Centaur XP Immunoassay System(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.)进行测定。
[0278] 透明质烷是在细胞外基质中发现的一种糖胺聚糖并用来提供在若干生物过程（包括肿瘤发展）中的微环境线索[Toole,2004]。用在去离子水中的几滴10mg/mL透明质酸酶(Sigma)来处理如上述所制备的上清。上述处理快速降低了上清的粘度，这表明，透明质烷是粘性培养基的主要成分。
[0279] 为了可视化包围自由漂浮链的糖萼，利用红细胞(RBC)进行颗粒排斥实验。通过吸移或通过使用透明质酸酶的简短温育来机械解离自由漂浮链（像以前一样）。添加来自人外周血的RBC并在培养基中温育混合物过夜。在光学显微镜下观测细胞，以检查分开自由漂浮链细胞和RBC的糖萼的存在。与RBC混合的机械解离的自由漂浮链具有从细胞表面延伸多达25μm的糖萼外被(图14，左图片)，从而防止直接的自由漂浮链-RBC细胞接触，而经透明质酸酶处理的自由漂浮链完全缺乏糖萼，从而便于RBC-自由漂浮链相互作用(图14，右图片)。
[0280] 由于糖萼形成关联与间充质到阿米巴样转换，所以对于作为自由漂浮链的卵巢CSC(和其它浆膜CSC)的对称扩大来说，糖萼完整性的保持可能是必要的。例如,，糖萼可以防止整联蛋白与细胞外基质的相互作用，这提示，糖萼的除去将暴露细胞表面蛋白质并便于与细胞外基质或其它附着面的相互作用。
[0281] 为了研究在破坏糖萼以后自由漂浮链细胞如何生长，借助于透明质酸酶处理，将自由漂浮链解离成单细胞，并在有或没有10%透明质酸酶溶液(l0mg/ml)的条件下平板接种于经组织培养物处理的烧瓶中，以防止糖萼的形成。平行地，在没有透明质酸酶存在的条件下，机械解离自由漂浮链并平板接种。
[0282] 机械解离的自由漂浮链留在悬浮液中，其中它们快速增殖以形成细胞的自由漂浮链。借助于透明质酸酶的简短处理解离成单细胞并在没有透明质酸酶的条件下平板接种的自由漂浮链不再形成自由漂浮链，而是增殖为在悬浮液中的不规则聚集体。相比之下，经透明质酸酶连续处理的细胞连接于组织培养板并形成上皮和间充质单层。结果提示，在没有保护性外被的情况下，卵巢CSC能够相互作用于附着面并回应下游分化刺激。
[0283] 在这些培养物中不同类型的单层细胞的存在证实了来自自由漂浮链的卵巢CSC的多谱系分化潜力。和间充质细胞相比，较少观测到上皮单层，这表明，和对于间充质癌细胞相比，需要更多的分化信号以产生上皮癌细胞。
[0284] 实施例17：自由漂浮链糖萼组成
[0285] 1.低分子量透明质烷-胶原蛋白复合物
[0286] 自由漂浮链糖萼具有两种主要成分，即，透明质烷和胶原蛋白，其相互作用并形成稳定复合物。Western印迹分析表明，胶原蛋白和透明质烷的低分子量复合物(小于20kDa)是通过抗COL1A2抗体可检测的。简要地，通过离心作用，将自由漂浮链细胞培养物的上清流分与细胞分开。在SDS-PAGE凝胶中流动上清并用抗COL1A2抗体加以印迹。这种复合物对透明质酸酶处理是敏感的，但不受1、2或4型胶原酶处理的影响。这种透明质烷-胶原蛋白复合物对于自由漂浮链糖萼的形成以及由糖萼赋予自由漂浮链细胞的抗药性或转移性潜力可能是重要的。
[0287] 2.细胞外基质基因自由漂浮链的表达
[0288] 分离自由漂浮链的细胞外基质并分析在自由漂浮链糖萼中蛋白质的存在，如通过自由漂浮链细胞的分泌体的深度测序和质谱法所证实的。
[0289] 自由漂浮链并不表达细胞外基质的两种成分，弹性蛋白种和纤连蛋白。层粘连蛋白和胶原蛋白是自由漂浮链糖萼（连同透明质烷一起）的主要成分。通过HAPLN1(透明质烷蛋白聚糖连接蛋白1)、HABP1(透明质烷结合蛋白1)和HABP4(透明质烷结合蛋白1)蛋白质，来连接和稳定透明质烷和蛋白聚糖。糖萼的每种成分对于外被的完整性是必不可少的并且组成的任何变化会影响细胞形态和相关特性。当自由漂浮链细胞卷起并形成肿瘤球形体时，LUM(lumican)、DCN(装饰蛋白)和JAM2(连接粘附分子2)、COL6A1(胶原蛋白，VI型，α1)、COL6A2(胶原蛋白，VI型，α2)、SGCG(sarcoglycan，γ)基因被上调，但HAPLN1、VCAN(多功能蛋白聚糖)和GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)基因被下调。因此，球形体的糖萼不同于自由漂浮链糖萼。
[0290] 表4列出被上调并存在于自由漂浮链中的细胞外基质蛋白质(左列)和在自由漂浮链中被下调的蛋白质(右列)。分析自由漂浮链分泌体流分是否存在这些基因产物，并在上述流分中没有检测到下调基因。
[0291] 表4：在自由漂浮链中的细胞外基质蛋白
[0292]
[0293] 实施例18：经透明质酸酶处理的自由漂浮链的克隆发生
[0294] 借助于透明质酸酶来解离自由漂浮链细胞，从而便于连接于组织培养板并在有透明质酸酶存在的条件下生长7天。在这些条件下，细胞保持连接于组织培养板。收获细胞，然后在存在和不存在透明质酸酶的条件下经受体外克隆发生测定。平行地，在存在和不存在透明质酸酶的条件下，使机械解离的自由漂浮链经受体外克隆发生测定。
[0295] 附着细胞明显慢于自由漂浮链进行增殖并主要形成附着集落，其仅具有少数"堆积"在间充质和上皮单层上的细胞。如果在促克隆形成测定中包括透明质酸酶，则进一步减小集落大小。这些结果表明，由透明质烷构成的糖萼参与维持自由漂浮链的自由漂浮链形态和癌症干细胞特性。
[0296] 实施例19：组合药物筛查
[0297] 围绕自由漂浮链的糖萼赋予对一些治疗剂的抗性，如紫杉醇、弗迪隆和9,10-dEpoB，但并不赋予对其它治疗剂的抗性，如鱼藤素和硼替佐米(参见，实施例15)。因为透明质烷和胶原蛋白是自由漂浮链糖萼的主要成分，所以我们测试了用透明质酸酶和/或胶原酶对自由漂浮链细胞的处理是否改变自由漂浮链细胞的抗药性。
[0298] 1.聚乙二醇化
[0299] 透明质酸酶和胶原酶具有体内较短的半衰期并且通过附着聚乙二醇(PEG；过程称作聚乙二醇化)的这些酶的修饰已表明可以增加酶的稳定性：从数分钟至若干小时。为了聚乙二醇化这些酶，使用了α-甲氧基-ω-羧酸琥珀酰亚胺酯聚乙二醇(PEG MW
20,000)(MeO-PEG-NHS)，并通过混合100mg MeO-PEG-NHS与0.5mL 10mg/mL牛睾丸透明质酸酶(25000U/mL)和15ml PBS。在4°下并在旋转器上温育混合物48小时。为了胶原酶的聚乙二醇化，0.5mL的10mg/mL胶原酶1(2500U/mL)代替透明质酸酶。
20,000)(MeO-PEG-NHS)，并通过混合100mg MeO-PEG-NHS与0.5mL 10mg/mL牛睾丸透明质酸酶(25000U/mL)和15ml PBS。在4°下并在旋转器上温育混合物48小时。为了胶原酶的聚乙二醇化，0.5mL的10mg/mL胶原酶1(2500U/mL)代替透明质酸酶。
[0301] 为了检查聚乙二醇化是否抑制酶活性，用聚乙二醇化或非聚乙二醇化透明质酸酶来处理自由漂浮链[如上所述]。两种处理均引起自由漂浮链细胞的聚集。将胶原酶1加入自由漂浮链培养物并不影响那些细胞的形态，以及类似地，将聚乙二醇化胶原酶1的添加并不影响自由漂浮链形态。
[0302] 2.药物筛查
[0303] 将25个自由漂浮链细胞接种到384孔板。在5天以后，在37°C下，用聚乙二醇化透明质酸酶、聚乙二醇化胶原酶或两者来处理细胞10分钟。在没有去除酶的情况下，添加经一系列稀释的紫杉醇，接着在第9天添加alamarBlue，并在两天后测得吸光率。在有聚乙二醇化胶原酶存在的条件下，对于仅紫杉醇的IC50没有变化。在添加紫杉醇以前，用聚乙二醇化透明质酸酶处理培养物会降低IC50达2.5倍并且用组合聚乙二醇化酶进行处理会降低IC50达16倍（对于紫杉醇），该数值可比较于当在细胞接种1天后将紫杉醇加入平板时，即，当自由漂浮链细胞缺乏任何大量的糖萼时，所获得的数值。
[0304] 实施例20：基膜基质对自由漂浮链形态的影响
[0305] 通过机械解离或通过透明质酸酶处理将Ovcar3-GTL自由漂浮链解离成单细胞并在涂布有基膜基质(Matrigel)的平板上培养。在有1mM 4-甲基伞形酮(4-MU)和50μM Y27632存在的条件下生长类似组的培养物，前者是透明质烷合酶2(HAS2)抑制剂而后者则是Rho-ROCK抑制剂。在4天以后成像培养物。
[0306] 在没有透明质酸酶处理的条件下，自由漂浮链保留它们的糖萼，并不相互作用于细胞外基质成分并形成如预期的细胞的自由漂浮链。用仅透明质酸酶处理的细胞连接于细胞外基质并生长为附着的不规则聚集体。当在有4-MU和Y27632存在的条件下经透明质酸酶预处理的细胞生长时，培养物并不变成粘性的并且附着细胞形成丝足延伸。同样地，在有4-MU和Y27632存在的条件下生长的机械解离细胞的培养物并不变成粘性的；而是，细胞连接于平板并形成丝足延伸。
[0307] 小GTP酶，Rho，和它的靶蛋白，Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)，已被确认为间充质到阿米巴样转换(MAT)的调节剂。在MAT期间，Rho-ROCK活性的上调有助于产生足够的肌动球蛋白，强迫使肿瘤细胞可以变形胶原蛋白纤维，以及推动通过细胞外基质[Wyckoff，2006]。在自由漂浮链培养物中，Rho-ROCK活性的抑制引起细胞附着并诱导丝足延伸的形成，这表明回复到间充质形态。
[0308] 实施例21：在SEM和TEM下的自由漂浮链形态
[0309] 通过电子显微镜检查并利用标准方法来可视化自由漂浮链的糖萼外被的最初尝试是不成功的。因而，开发了新协议，以通过扫描电子显微术(SEM)来可视化自由漂浮链细胞的细胞外周结构。
[0310] 简要地，在M5-FCS培养基中，生长自由漂浮链。将等分部分的自由漂浮链培养物放置在多聚左旋赖氨酸涂布的塑料盖玻片上并使细胞可以在潮湿室中在室温下黏附1小时。在没有洗去细胞的悬浮液的情况下，将固定剂(在0.75M二甲砷酸缓冲液中的2.5%戊二醛/2%多聚甲醛)直接加到盖玻片上并在潮湿室中在室温下温育1小时。用这种技术，将细胞的带负电荷的细胞外粘性外被连接于带正电荷表面。细胞被捕获在透明质烷、蛋白聚糖和胶原蛋白的广泛的细胞外网状结构中。通过在洗涤步骤以前将固定剂直接加入附着细胞-糖萼混合物，来保持细胞和细胞外外被的结构。当使用时，连同固定剂一起包括染色剂；艾茜蓝(AB)用来染色糖(在这种情况下为透明质烷链)以及西吡氯铵(CPC)用来染色蛋白聚糖。这种染料的组合有助于同时可视化糖萼的所有成分。
[0311] 在固定步骤以后，用二甲砷酸缓冲液冲洗制剂并用渐变系列的乙醇溶液（50%、75%、95%至无水乙醇）脱水。在Denton Critical Point Dryer Model JCP-1中临界点干燥样品，并在Denton Vacuum Desk 1V溅射系统中用金/钯溅射涂布样品。利用Zeiss Field Emission Electronmicroscope Supra25来拍摄样品。
[0312] 通过TEM来可视化细胞内结构和细胞器。
[0313] 本方法成功建立了协议：将自由漂浮链细胞黏附到盖玻片上，同时保留它们的细胞外周外被，并确定与自由漂浮链有关的特化结构。
[0314] 图15以不同放大率示出自由漂浮链的一系列SEM图像，其显示在AB和CPC染色以后的广泛的糖萼。图16示出仅用AB染色的自由漂浮链和糖萼的放大的SEM图像，其显示在细胞上的透明质烷外被，透明质烷集中在不同点以及透明质烷外被的网络样特性。
[0315] 用透明质酸酶处理自由漂浮链以除去糖萼外被，然后借助于AB和CPC染色并通过SEM加以观测。如图17所示，可以看到糖萼的残迹。
[0316] 图18是在用透明质酸酶进行处理以除去糖萼外被以后未染色自由漂浮链的SEM图像。在样品中存在的其它细胞是RBC(包括光滑和突起RBC)。注意自由漂浮链的不寻常表面。
[0317] 自由漂浮链结构包括微绒毛、表面泡、伪足和纳米管、火山和火山口，如在图19-21所示的SEM图像中可以看到的。图19(a)示出在细胞之间具有广泛的微绒毛连接的未染色自由漂浮链的SEM显微照片。在图19(b)中，两个自由漂浮链细胞是通过纳米管加以连接并且细胞似乎经由微绒毛(invadopodia)连接于表面。在这些细胞中还可以看到较大质膜泡。图19(c)示出具有长伪足(20-30μm)的未染色自由漂浮链细胞，其中上述伪足延伸超出由透明质烷糖萼占据的10-15μm空间。
[0318] 在光显微照片(未示出)中，用细胞膜亲脂性染料染色的自由漂浮链细胞显示点状（punctuate）染色和显示坚实的连续染色（使用相对于透明质烷的抗体）。还观测到突破表面并突出通过透明质烷染色的表面泡。通过用细胞膜亲脂性染料染色可以可视化延伸通过透明质烷糖萼的伪足并且已观测到伪足折叠以形成套索形状的结构。
[0319] 在图20（其是图19(a)中照片的放大照片）中，以放大形式示出在自由漂浮链表面上的各种结构，并且具有用来突出显示微绒毛、伪足和表面泡的箭头。自由漂浮链微绒毛的SEM图像示出它们的分段特性并且许多SEM图像示出在自由漂浮链细胞上存在的广泛的表面泡。
[0320] 借助于TEM，可以可视化通过细胞的平面的结构。上述图像示出连续于自由漂浮链细胞的细胞膜但还相邻于细胞的泡。上述泡在含量方面似乎是均匀的并缺乏较大细胞器。另外，自由漂浮链细胞图像示出未分化细胞形态，这表明它的干性，即，高细胞核/细胞浆比例，以及在细胞表面微绒毛形成连续边界。
[0321] 在自由漂浮链细胞上火山样结构的出现是不寻常的发现。在图21中的SEM图像示出侧视图：(a)在自由漂浮链表面上的喷发“火山”和(b)火山的放大，它示出颗粒自火山的火山口的释放并且其似乎是外染色体。在细胞的自顶向下视图中，存在明显的表面火山口，其可能是内泡和外部细胞膜的融合。这种火山口具有围绕它的边缘的离散边界样外观以及在火山口内部的较小的、囊泡样颗粒。在此细胞上还观测到表面泡。
[0322] 实施例22：在自由漂浮链中的基因表达
[0323] 为了基因表达研究，利用 Reagent(Invitrogen)提取RNA。利用Affymetrix U133plus 2.0阵列并借助于3个生物平行测定/样品来确定基因表达。利用Genespring GX软件(Agilent)来分析数据。分析了Ovcar3、Ovcar5和A2780球形体、自由漂浮链和单层以及SV-40永生化正常卵巢上皮单层(NOE；T-80细胞)。基因注释可以参见www.ncbi.nlm.nih.gov/gene。
[0324] 在Ovcar3-GTL自由漂浮链和Ovcar3GL单层之间总共2121种基因进行差异表达。和单层相比，在自由漂浮链中，在这些基因中，1125种基因被上调以及996种基因被下调。
在NOE T-80细胞和Ovcar3-GL单层之间差异表达总共378种基因。和T-80细胞相比，在Ovcar3-GTL单层中，在这些基因中的101种基因被上调以及277种基因被下调。
在NOE T-80细胞和Ovcar3-GL单层之间差异表达总共378种基因。和T-80细胞相比，在Ovcar3-GTL单层中，在这些基因中的101种基因被上调以及277种基因被下调。
[0325] 比较了在Ovcar3和Ovcar5自由漂浮链中的基因表达与在Ovcar5间充质单层中的基因表达。在这种间充质到阿米巴样/自由漂浮链转换中，即，在自由漂浮链/CSC中的差异表达(表5)，组合的转录组分析确定了26种上调基因和69种下调基因。最多上调基因是透明质烷合酶(HAS2)。第二最高表达的基因是PDGFRA，这表明对自由漂浮链/CSC中的PDGF途径的显著作用。
[0326] 表5：在自由漂浮链中的差异表达的基因
[0327]
[0328]
[0329] HAS2是负责糖基氨基聚糖透明质烷(HA)的生产的三种合酶的一种。当和Ovcar3上皮单层相比时，在自由漂浮链，用于透明质烷-结合蛋白的若干基因也被上调，包括HA-结合“连接”蛋白质C1QBP、HABP4和HAPLN1以及蛋白聚糖多功能蛋白聚糖/VCAN(图22)。在自由漂浮链中，HA受体CD44和HMMR被差异下调。在间充质或上皮单层中，并不以显着水平表达HAS2。
[0330] 干细胞-相关基因Lin-28、Bmi-1、RBPMS和ZFX均表达在自由漂浮链中。RBPMS表达在造血干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、白血病干细胞、白血病和生殖细胞肿瘤中。当和上皮单层相比时，在自由漂浮链和球形体中，ZFX锌指转录调节剂（其已表明可以控制胚胎干细胞和造血干细胞的自我更新）也被上调。
[0331] 端粒酶逆转录酶成分hTERT、TERF1、TERF2和端锚聚合酶是端粒酶途径的一部分，相对于正常卵巢上皮，在癌症和在Ovcar3-GTL单层肿瘤细胞中其被上调。然而，自由漂浮链甚至比球形体或单层更高地表达这些基因，这表明抗端粒酶疗法可以有效地靶向在卵巢癌中的CSC。
[0332] 与表面基因组有关的另外的基因表达数据描述在实施例27中。
[0333] 实施例23：在其它组织中上调的自由漂浮链-特定（特异性，specific）基因的表达
[0334] Amazonia!(Le Carrour et al.,2010)提供了公开的人转录组（transcriptome）数据的网络图谱（web atlas），其可以被查询以确定特定基因的组织表达模式。以这种方式分析了来自表5的上调的自由漂浮链基因。发现具有受限制的组织表达模式的那些基因、以及上述表达的组织或细胞类型列在表6中。相对于Amazonia!数据，其余上调的自由漂浮链基因并不显示组织受限的表达模式(在表6中，没有被组织或细胞类型所指示)。发现许多上调自由漂浮链基因在人胚胎干细胞(hESCs)和在人的诱导的多能性干细胞(hIPSC)中但不在正常成年组织和细胞类型(在该组中Amazonia!数据库包括组织特异性干细胞)中表达。发现在hESC中表达的基因包括HAS2、HAPLN1、NTS、和LOC643401。在自由漂浮链中被下调的基因在正常成年组织和细胞类型中具有广泛的表达模式而没有在胚胎干细胞中表达。
[0335] 表6：上调的自由漂浮链基因的组织基因表达
[0336]上调自由漂浮链基因 组织或细胞表达
HAS2 hESC,hIPSC
PDGFRA
HAPLN1 hESC,hIPSC
MGST1
S100A4
FAS
TP53I3
NSBP1
CLIC4
GLRX
RGS2 OOCYTE
DDB2
WTAP OOCYTE
MAP2K6
RPS27L OOCYTE
FDXR ADRENAL GLAND
NTS hESC,hIPSC
SPATA18 TESTIS
ARG2 OOCYTE
COL4A3BP
RNF145
ANAPC7
PHF14 OOCYTE
HAS2 hESC,hIPSC
PDGFRA
HAPLN1 hESC,hIPSC
MGST1
S100A4
FAS
TP53I3
NSBP1
CLIC4
GLRX
RGS2 OOCYTE
DDB2
WTAP OOCYTE
MAP2K6
RPS27L OOCYTE
FDXR ADRENAL GLAND
NTS hESC,hIPSC
SPATA18 TESTIS
ARG2 OOCYTE
COL4A3BP
RNF145
ANAPC7
PHF14 OOCYTE
[0337]上调自由漂浮链基因 组织或细胞表达
MAB21L2 COLON,INTESTINE
LOC643401 hESC,hIPSC
C6orf54
MAB21L2 COLON,INTESTINE
LOC643401 hESC,hIPSC
C6orf54
[0338] 实施例24：在The Cancer Geneome Atlas中基因表达分布（profile，图谱）的分析
[0339] 366位晚期卵巢癌症患者和10个正常卵巢样品的基因表达分布可获自The Cancer Genome Atlas(TCGA；http://tcga.cancer.gov)并分析了表5中的上调和下调的自由漂浮链基因的表达。这些基因表达分布表示在肿瘤样品表达数据中分离的RNA中mRNA的微阵列分析。然后相对于在TCGA数据库中的这些肿瘤基因表达分布，查询了自由漂浮链-特定基因。
[0340] 这种分析使得能够按照已表达自由漂浮链基因的特定组来鉴定患者群并开始确定用于卵巢癌症患者的一种类型的自由漂浮链基因标签。例如，如在表7的清单1中所示的9种上调自由漂浮链基因，其包括COL1A2（其也已通过质谱法被确定为在自由漂浮链中以相对于Ovcar5和A2780间充质细胞的更高量加以分泌），确定了一组(或簇)83位患者，其共表达高水平的在9种这些基因中的至少6种，并提示此患者组群具有较高比例的自由漂浮链细胞(即，卵巢癌干细胞)。在此患者群中表达的另外的自由漂浮链-特定基因示于表7的清单2。在表7中的清单3确定了在簇患者样品中和在正常卵巢样品均表达的自由漂浮链基因。在清单4中的基因是卵巢癌标记基因，当和分化的肿瘤相比时，其在自由漂浮链细胞中被显著下调。
[0341] 表7：TCGA基因表达和簇（cluster，群集）分析
[0342]
[0343]
[0344] 实施例25：在自由漂浮链中的差异miRNA表达
[0345] 为了miRNA分析，利用 Reagent(Invitrogen)来提取RNA。通过利用Agilent Human microRNA Array Vl.0，其包含相对于所有人miRNA(~500)并基于Sanger mirBase release 9.1(Feb 2007)的探针，来确定miRNA表达。进行两个生物平行测定/样品，以分析miRNA表达。利用Genespring GX软件(Agilent)来分析数据。
[0346] 和Ovcar3单层相比，在自由漂浮链中上调和下调的miRNA的结果总结于表8。
[0347] 和Ovcar3单层相比，在自由漂浮链中，26种miRNA被下调。这些miRNA包括通过Lin28和Lin28B加以调节的let-7家族miRNA。和正常卵巢上皮和Ovcar3上皮单层细胞相比，在自由漂浮链中Lin28mRNA和蛋白被显著上调。当和球形体相比时，在自由漂浮链中它是最多上调基因。LIN28B，LIN28的一种紧密同系物，在自由漂浮链与Ovcar3上皮中被显著和差异上调。
[0348] 和Ovcar3上皮单层相比，在自由漂浮链中，miR-200家族的所有5种成员(miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-429)被显著下调。据报道，miR-200家族的抑制足以诱导EMT，并在60种肿瘤细胞系的NCI组的分析中，miR200家族表达在上皮卵巢癌细胞系中但在间充质卵巢细胞系中会丧失(Gregory et al.2008;Park et al.2008)。在此研究中的数据是与在各种肿瘤细胞类型中miR-200b、miR-200c、let-7b、let-7c、let-7d、和let-7e的显著下调的其它报告一致的，其中上述各种肿瘤细胞类型已经历EMT，其伴随延伸的成纤维样（fibroblastoid）形态、E-钙黏着蛋白的更低表达、和ZEB1的更高表达(Park et al.2008)。
[0349] 另外，和间充质单层相比，在自由漂浮链中hsa-miR-23b和hsa-miR-27b被显著下调。目标预测分析表明，HAS2是hsa-miR-23b的靶。另外，透明质烷蛋白聚糖连接蛋白-1(HAPLN1)和血小板衍生生长因子受体α(PDGFRA，还写作PDGRα)均是hsa-miR-27b的靶。因而，结果表明在自由漂浮链细胞中的三种最多上调基因(HAS2、HAPLN1、PDGFRA)和hsa-miR-23b以及hsa-miR-27b的下调之间的显著相关性。
[0350] 表8：相对于上皮单层细胞，在自由漂浮链细胞中的人miRNA基因表达变化[0351]人miRNA 在自由漂浮链中的表达
1 363 上调
2 630 上调
3 18b 上调
4 214 上调
5 367 上调
6 302a 上调
7 302a* 上调
8 302b 上调
9 302c 上调
10 138 上调
11 422a 上调
12 493-3p 上调
13 Let-7a 下调
14 Let-7c 下调
15 Let-7d 下调
16 Let-7f 下调
17 Let-7g 下调
1 363 上调
2 630 上调
3 18b 上调
4 214 上调
5 367 上调
6 302a 上调
7 302a* 上调
8 302b 上调
9 302c 上调
10 138 上调
11 422a 上调
12 493-3p 上调
13 Let-7a 下调
14 Let-7c 下调
15 Let-7d 下调
16 Let-7f 下调
17 Let-7g 下调
[0352]人miRNA 在自由漂浮链中的表达
18 Let-7i 下调
19 125b 下调
20 141 下调
21 200a 下调
22 200b 下调
23 200c 下调
24 30a-5p 下调
25 31 下调
26 429 下调
27 517c 下调
28 521 下调
29 23b 下调
30 27b 下调
31 128a 下调
32 145 下调
18 Let-7i 下调
19 125b 下调
20 141 下调
21 200a 下调
22 200b 下调
23 200c 下调
24 30a-5p 下调
25 31 下调
26 429 下调
27 517c 下调
28 521 下调
29 23b 下调
30 27b 下调
31 128a 下调
32 145 下调
[0353] 实施例26：在上皮、间充质和自由漂浮链细胞中的RTK磷酸化
[0354] 根据制造商的指示，人磷酸-RTK（phospho-RTK）Array Kit(R&DSystems)用来确定一系列的42种受体酪氨酸激酶(RTK)蛋白质在Ovcar3-GTL和Ovcar5-GL自由漂浮链或单层中磷酸化状态。在该测定中，硝酸纤维素膜点阵（dot array）具有相对于每种RTK的胞外域的捕获抗体，用上述阵列温育细胞裂解液，然后利用化学发光，共轭于HRP的泛磷酸酪氨酸抗体用来可视化激活(磷酸化)蛋白质。为此，在有10%FCS存在的条件下生长细胞。42种RTK蛋白质的清单提供在表9中并且这些蛋白质的34种的结果示于图23。
[0355] 在Ovcar3上皮单层中，EGFR和DTK(AXL受体家族)被磷酸化。相比之下，在间充质Ovcar5单层中，多种信号通路被激活(22/44种测试受体)(图23)，包括PDGFRβ、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰岛素-R、IGF 1R、DTK/TYRO3、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt-3、c-rRET、ROR 1、ROR2、Tie-1、Tie-2、TrkA/NTRK1、VEGFR3、EphA1、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和EphB6。源自Ovcar3和Ovcar5的自由漂浮链细胞具有至少性质相似的磷酸-RTK分布，以及对于Ovcar5问充质单层，在Ovcar5单层中的17/22种磷酸化受体也活跃于两种类型的自由漂浮链中。然而，在两种来源的自由漂浮链之间以及在这些单层和间充质单层之间，在特定受体的磷酸化程度方面存在差异。例如，PDGFRα的磷酸化用来区分变形自由漂浮链细胞与Ovcar5问充质单层。该数据支持以下概念：多种RTK磷酸化关联于上皮-间充质转换。
[0356] 表9：人磷酸-RTK Array Kit的RTK蛋白质含量
[0357]
[0358] 实施例27：自由漂浮链表面表型
[0359] 1.FACS表面体(surfacesome)分析
[0360] 对胶原酶IV-解离的Ovcar3-GTL自由漂浮链和球形体或对胰蛋白酶-解离的单层进行多参数流式细胞仪评价。通过分散酶处理接着淋巴样细胞和造血细胞除尽(利用CD45+-磁珠去除)来解离原发性卵巢癌腹水样品。在包含适当抗体和MACS缓冲剂的100μL的总容积中染色细胞。
[0361] 为 了 分 析，使 用 了 以 下 抗 体：CD45-APC-Cy7( 克 隆2D1)、CD34-APC( 克隆8G12)、CD44-PE( 克 隆 G44-26)、CD49f-PE(克 隆 GoH3) 和CD90-APC( 克 隆 SE10)( 均 来 自 BD Pharmingen)；CD133-APC( 克 隆 AC133)、CD133-PE( 克 隆 293C3) 和CD326-FITC、-PE、-APC(克隆HEA-125)(均来自Miltenyi Biotec)和CXCR4-PE(克隆12G5)(R&D Systems,Inc)以及表10中所列抗体。为了死细胞排除，添加DAPI(Invitrogen)。用FACS Calibur(Becton-Dickinson)进行所有流式细胞仪分析，利用MoFlo细胞分选仪来获4
得1-25x10 个事件/样品。利用FlowJo 7.2.2软件(Tree Star,Inc)来分析数据。
得1-25x10 个事件/样品。利用FlowJo 7.2.2软件(Tree Star,Inc)来分析数据。
[0362] 自由漂浮链对于CD49f(α6整联蛋白)和CD90d(Thy-1)是>95%阳性的，对于CD34和CD133(具有两种不同抗体)是阴性的。
[0363] 源自Ovcar3-GTL和Ovcar5-GL细胞系的自由漂浮链具有非常类似的表型。如在间充质单层中所观测到的，大多数表面抗原，包括Epcam(CD326)和Muc16(CA125)，在自由漂浮链上是不存在的。GM2染色98%的Ovcar5-GL自由漂浮链和74%的Ovcar3-GTL自由漂浮链。
[0364] 在自由漂浮链和间充质细胞之间的仅有的显著差异是黏蛋白1(CA15-3)的表达。黏蛋白1染色65%的间充质单层细胞但仅6%的Ovcar3-GTL自由漂浮链，以及75%的Ovcar5-GL自由漂浮链是黏蛋白1阳性的。黏蛋白1还染色75%的Ovcar3上皮单层细胞。表面基因组（surfaceome）数据总结在表10中。
[0365] 2.CD基因表达分析
[0366] 通过基因阵列分析并利用Affymetrix 人类基因组U133Plus2.0Array（如在实施例22中所描述的）来确定自由漂浮链特异性细胞表面蛋白。所选CD蛋白的表达示于图24：Ovcar3自由漂浮链(CSC 65%)和Ovcar3上皮单层(CSC 1%)。上调
5-150倍的基因为深灰色(红色)以及下调5-150倍的基因为中等或浅灰色(绿色)。
5-150倍的基因为深灰色(红色)以及下调5-150倍的基因为中等或浅灰色(绿色)。
[0367] 在CSC中上调的受体包括CD220(胰岛素R)、CD221(IGF1R)、CD222(IGF2R)、CD295(瘦 素 R)、CD331(FGFR1)、CD71(转 铁 蛋 白 受 体)、CD166(甘 露 糖 受 体 )、CDC323(JAM3)、CALCRL(降钙素受体样)和PDGFRA。在自由漂浮链上选择性上调的其它CD标记是CD90(Thy1)和CD49f(α6整联蛋白)。这种转录组（transcriptome）分析进一步表明，和Ovcar3-GTL上皮单层相比，在自由漂浮链中，CD49f、CD90、CD99、CD166(其一种剪切形式是在自由漂浮链分泌体中)、IGF1R(CD221)、IGF2R(CD222)和CALCRL(降钙素类受体)被强烈上调(>5-100倍)。
[0368] 在自由漂浮链上被下调但高度表达在Ovcar3-GTL单层上的CD基因包括CD58、CD74、CD109、CD118、CD146、CD148、CD167、CD168、CD200、CD205、CD322/JAM2和JAM3(连接粘附分子)、CD326/Ep-CAM。在分化的癌细胞和癌症干细胞之间CD133并没有被差异表达。
[0369] 3.对应于人表面基因组基因的自由漂浮链-特定（specific）基因表达
[0370] 利用在De Cunha et al.,2009中描述的预测的人表面基因组基因的清单，相对于间充质和上皮卵巢癌单层、低度恶性潜在(LMP)卵巢患者样品和正常卵巢，检查了自由漂浮链细胞的细胞表面蛋白的表达。此分析确定了28种细胞表面蛋白，其中，和其它细胞类型相比，在自由漂浮链中，跨膜结构域被差异上调，以及和其它细胞类型相比，在自由漂浮链细胞中，细胞表面蛋白被差异下调(表11)。
[0371] 表10：自由漂浮链和单层的表面基因组FACS分析
[0372]
[0373]
[0374] 表11：在预测的人表面体基因集（gene set）中差异表达的自由漂浮链-特异性表面蛋白
[0375]上调基因 下调基因
1 C10orf57 ATP11C
2 CLCN5 CACHD1
3 CYP51A1 CD44
4 GPR98 CD9
5 GRAMD1C CDH1
6 HAS2 CLDN3
7 HHAT CLDN4
8 INSIG2 CTAG1A
9 ITM2A EPCAM
10 LPGAT1 EPHA2
11 MCOLN3 FOLR1
1 C10orf57 ATP11C
2 CLCN5 CACHD1
3 CYP51A1 CD44
4 GPR98 CD9
5 GRAMD1C CDH1
6 HAS2 CLDN3
7 HHAT CLDN4
8 INSIG2 CTAG1A
9 ITM2A EPCAM
10 LPGAT1 EPHA2
11 MCOLN3 FOLR1
[0376]上调基因 下调基因
12 MFAP3L MSLN
13 MXRA8 MUC16
14 NPFFR2 PROM1
15 PCDHB8 SGMS2
16 PDGFRA SLC34A2
17 PTDSS2 TM9SF3
18 SEMA6A WT1
19 SGCB
20 SIDT1
21 SLC38A7
22 STRA6
23 TMEM35
24 TNFRSF19
25 TRPM6
26 XK
27 ZDHHC13
28 ZPLD1
12 MFAP3L MSLN
13 MXRA8 MUC16
14 NPFFR2 PROM1
15 PCDHB8 SGMS2
16 PDGFRA SLC34A2
17 PTDSS2 TM9SF3
18 SEMA6A WT1
19 SGCB
20 SIDT1
21 SLC38A7
22 STRA6
23 TMEM35
24 TNFRSF19
25 TRPM6
26 XK
27 ZDHHC13
28 ZPLD1
[0377] 实施例28：在无血清培养基中培养自由漂浮链
[0378] 在规定条件下(即，没有血清)，培养自由漂浮链的能力具有若干优点，包括便于鉴定自分泌途径、鉴定分泌的蛋白、以及分离和表征外染色体（均没有来自血清成分的污染）。
[0379] 在M5-FCS培养基中维持自由漂浮链细胞。当细胞达到200,000个细胞/mL的密度时，在300xg下沉淀细胞，用PBS洗涤两次以除去残余血清蛋白，然后重悬浮在包含1%P/S和0.1U/ml重组胰岛素的无血清M5培养基(4.7μg/mL最终浓度)中供生长。在有胰岛素存在的条件下，自由漂浮链细胞维持它们的形态并以与在含有血清条件中的细胞可比较的速率增殖。
[0380] 实施例29：来自自由漂浮链的分泌的和外染色体蛋白的分析
[0381] 1.细胞流分的分离
[0382] 为了从自由漂浮链制备分泌的和外染色体流分，在包含胰岛素的无血清培养基（如在实施例28中所描述的）中生长自由漂浮链5天，直到培养物接近汇合。在4°C下进行所有离心作用以保持蛋白质完整性。通过在300xg下离心作用10分钟来除去细胞。进一步在2,000xg下20分钟和在10,000xg下30分钟旋转沉降上清流分以除去细胞碎片。使这种上清经受在100,000xg下超离心作用2.5小时。通过10kDa分子量截止过滤器，200倍浓缩包含由自由漂浮链(即，自由漂浮链分泌体)分泌的可溶性蛋白的新上清流分。用PBS洗涤获自超离心作用的沉淀物两次，每次洗涤以后是另一轮在相同条件下的超离心作用，然后保持在4°C下供进一步分析。从Ovcar5和A2780人卵巢癌细胞系（其生长为附着间充质单层）分离外染色体，然后利用相同方法从两个卵巢癌症患者腹水样品分离外染色体。
[0383] 2.外染色体的表征
[0384] 将分离的外染色体连接于涂布有多聚左旋赖氨酸的载玻片，用多聚甲醛和戊二醛固定，然后通过SEM加以可视化。外染色体是圆形、直径为30-100nm的结构。通过SEM来可视化透明质烷-蛋白聚糖外被（如在实施例21中所描述的）。观测到外染色体连接于糖萼外被并且可以通过透明质酸酶（hyaluronidase）处理来释放。
[0385] 我们还通过透射电镜术(TEM)分析了自由漂浮链外染色体以进一步了解它们的结构。
[0386] 为了TEM，将外染色体连接于涂布有福尔姆（Formvar）碳的EM网格，然后在室温下用2%乙酸双氧铀溶液染色15分钟。在TEM下，自由漂浮链外染色体呈现具有空心中部的杯或茶碟形结构。
[0387] 在蔗糖密度梯度方法中，自由漂浮链外染色体是在梯度上的1.11-1.19g/ml之间。
[0388] 3.外染色体的FACS分析
[0389] 在室温下，将如上所述分离的外染色体吸附于4μM乳胶醛/硫酸盐珠(Invitrogen)2小时。用1M甘氨酸进行洗涤以防止抗体非特异性结合于珠上的非占据部位，然后进行另外的洗涤，接着用荧光色素偶联的抗体进行温育。利用FACS分析，自由漂浮链外染色体对于CD63是阳性的，但对于CD45和CD9则是阴性的。
[0390] 另外，用10uM佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)对自由漂浮链细胞的处理会诱导外染色体释放，而blebbistatin则抑制外染色体释放。上述外染色体分离接着FACS分析便于定量和定性地快速分析卵巢癌干细胞外染色体。这种测量癌症干细胞特异性外染色体的协议可以用于癌症干细胞的早期检测或在治疗期间利用腹水或外周血浆样品来监测癌症干细胞含量。
[0391] 4.外染色体蛋白质含量
[0392] 通过质谱法来分析自由漂浮链外染色体的蛋白质含量。将外染色体重新悬浮于还原性样品缓冲液(Invitrogen)，用于进行标准凝胶电泳，然后在4-12%聚丙烯酰胺凝胶电泳中通过电泳来分离外染色体蛋白。通过考马斯蓝(Simply Blue-Invitrogen；一种相容于质谱法的染色剂)来可视化蛋白质。将包含外染色体蛋白的蛋白质泳道切割成15片，从每片提取蛋白质，然后通过质谱法来分析蛋白质含量。
[0393] 表12列出在>95%置信度下具有3种以上指定的肽序列的蛋白，如通过自由漂浮链外染色体的质谱法所确定的。表13列出，相对于卵巢间充质单层外染色体，在自由漂浮链外染色体中以更高(阳性)量存在的蛋白质。在此实施例中列于这些表和其它表中的登录号是来自International ProteinIndex(Kersey et al.2004)。自由漂浮链外染色体的组成类似于由Simpson et al.2008描述的人外染色体的组成。
[0394] 表12：通过自由漂浮链外染色体的质谱法确定的蛋白质
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]
[0399]
[0400]
[0401] 表13：相对于卵巢间充质单层外染色体，以更大量存在于自由漂浮链外染色体中的蛋白质
[0402]
[0403]
[0404] 5.分泌体蛋白质含量
[0405] 利用质谱分析法，我们确定了由自由漂浮链细胞在包含胰岛素的无血清蛋白培养基中分泌的210种蛋白质。表14列出通过自由漂浮链分泌体的质谱法确定的具有大于10种指定的肽序列的蛋白质(>95%置信度)。通过质谱法还分析了两种其它卵巢间充质癌细胞系(A2780和Ovcar5)的分泌体。表15列出，相对于分化的间充质单层细胞，由自由漂浮链细胞以更高量产生的蛋白质，如通过基因表达或质谱分析法确定的。
[0406] 自由漂浮链分泌体的质谱分析法还表明，和间充质卵巢癌单层相比，自由漂浮链产生多达500倍以上的COL1A2(1型胶原蛋白α2)。
[0407] 表14：通过自由漂浮链分泌体的质谱法确定的蛋白质
[0408]
[0409]
[0410]
[0411]
[0412]
[0413]
[0414]
[0415] 表15：相对于卵巢间充质单层分泌体，以更大量存在于自由漂浮链分泌体中的蛋白质
[0416]
[0417]
[0418] 6.自由漂浮链细胞表面蛋白
[0419] 通过相分配并利用非离子型洗涤剂曲通X-114（Triton X-114），从自由漂浮链细胞分离膜蛋白。在包含胰岛素的无血清蛋白培养基中培养自由漂浮链细胞5天（如在实施例28中所描述的）。在室温下，通过在1500rpm下的离心作用来沉淀细胞10分钟。通过相分配技术(Bordier 1981)来从细胞裂解液分离Triton X-114可溶性膜蛋白(自由漂浮链表面基因组)，然后经受质谱法。表16列出在自由漂浮链细胞中具有3种以上指定的肽序列的蛋白质(>95%置信度)。
[0420] 表16：通过自由漂浮链膜蛋白的质谱法确定的蛋白质
[0421]
[0422]
[0423]
[0424]
[0425]
[0426]
[0427]
[0428] 实施例30：HAS2剪接变体的鉴定
[0429] 如在实施例22中所描述的制备自由漂浮链mRNA，转化为cDNA，然后用Genome Sequencer FLX系统和软件并根据制造商的指示进行454深度测序和分析。相对于野生型(wt)HAS2序列，读自自由漂浮链mRNA的序列比对显示具有来自5’UTR和外显子3的更大覆盖率的异质分布。这些结果提示存在在自由漂浮链中表达的HAS2剪接变体。
[0430] 为了确定剪接变体，基于人HAS2基因序列(NCBI登录号NM_005328)，一组正向和反向PCR引物分别制备自HAS2mRNA 5’UTR和3’UTR区。正向引物位于位置487-509并具有序列CGGGACCACACAGACAGGCTGAG(SEQ ID NO.1)。反向引物位于位置2202-2227并具有序列GTGTGACTGCAAACGTCAAAACATGG (SEQ ID NO.2)。野生型HAS2mRNA的预期的PCR扩增产物是1741个bp。利用采用自由漂浮链mRNA的RT-PCR，扩增产物产生预期的1741个bp片段以及大致1100个bp的另外的片段。较小片段被确定为缺乏HAS2基因的外显子1的1115个bp片段。这种HAS2剪接变体已被指定为Greenwich变体。Greenwich变体包含框内缺失并编码一种蛋白质，其开始于野生型HAS2基因的氨基酸215并结束于在正常C端的氨基酸552，如图25所示。此蛋白的翻译开始于在外显子2中的核苷酸位置557，其是在剪接位点以后的第一个蛋氨酸。
[0431] HAS2是膜结合蛋白，其是具有多个膜、胞质和胞外域的预测结构，如在UniProtKB/Swiss-Prot 数 据 库，ID No.Q92819(http://www.uniprot.org/uniprot/Q92819)中所示。HAS2剪接变体开始于第一胞质域的中部并保留若干预测的跨膜域。
[0432] 实施例31：在卵巢癌细胞系和在原发性肿瘤中HAS2和PDGFRA的表达
[0433] 通过RT-PCR并利用实施例30的PCR引物组，分析了制备自Ovcar3单层、Ovcar5单层和A2780单层的mRNA中是否存在HAS2转录物。在任何这些细胞系中，既没有检测到野生型也没有检测到剪接变体转录物。
[0434] 样品获自来自晚期卵巢癌患者的腹膜实体瘤。在220个测试样品中，5个具有在HAS2基因中的杂合性错义突变。5个突变中的4个位于外显子1中，并靠近外显子1-外显子2接头(在位置954、981、1099和1136；连接发生知核苷酸1165)。上述突变可以导致在自由漂浮链HAS2mRNA中观测到的可变剪接。第五突变位于在外显子3中的位置2009。HAS2位于8号染色体上以及核苷酸位于突变处，并且正链的正常等位基因列于以下表17中。提取自Ovcar3自由漂浮链细胞的mRNA的突变分析示于表18。细胞RNA的分析显示两种等位基因的大致同等表现度，而主动翻译的mRNA的分析显示突变体mRNA的优先翻译(96%突变体至4%wt)。
[0435] 在表17和18中，染色体位点是指在8号染色体的正(+)链上的核苷酸位置；还提供了相应的mRNA位点或位置。
[0436] 表17：在患者样品中的HAS2突变
[0437]
[0438] 表18：在分离的自由漂浮链中的HAS2突变
[0439]
[0440] SOLiD RNA测序系统(Applied Biosystems)用来获得在自由漂浮链细胞中PDGFRA mRNA的突变分布并确定了5种同源突变(表19)。这些突变是总共100%的多核糖体PDGFRA mRNA。在表19中，染色体位点是指在4号染色体的+链上的核苷酸位置；还提供了相应的mRNA位置。
[0441] 表19：在分离的自由漂浮链中的PDGFRA突变
[0442]
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