治疗、诊断或检测与LIV-1过量表达相关的癌症的方法
阅读：599发布：2020-10-16
专利汇可以提供治疗、诊断或检测与LIV-1过量表达相关的癌症的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 尤其提供了 治疗 癌症的方法、治疗癌症的组合物以及用于诊断和/或检测癌症的方法和组合物。具体而言，本发明提供了用于治疗、诊断和检测与LIV-1过量表达相关的癌症的方法和组合物。，下面是治疗、诊断或检测与LIV-1过量表达相关的癌症的方法专利的具体信息内容。
1、包含LIV-1调节剂和一种或多种可药用载体的组合物，其中 LIV-1调节剂选自：分离的双链RNA(dsRNA)；包含SEQ ID NO：1序列的 至少10个连续核苷酸的分离的寡核苷酸；和结合LIV-1结构域中的表位 的抗体，所述LIV-1结构域选自：LIV-1的N-端细胞外结构域、在跨膜结 构域(TM)2和3之间的LIV-1细胞外结构域、在TM 4和5之间的LIV-1 细胞外结构域、在TM 6和7之间的LIV-1细胞外结构域、和LIV-1的C- 端细胞外结构域。
2、权利要求1的组合物，其中寡核苷酸是dsRNA、siRNA、shRNA 或反义寡核苷酸。
3、权利要求1的组合物，其具有选自以下的一种或多种活性：增加 癌细胞凋亡、抑制癌细胞生长、抑制肿瘤形成、抑制癌细胞存活、抑制癌 细胞增殖、抑制癌细胞转移、抑制细胞迁移、抑制血管生成、抑制LIV-1 信号传导、抑制LIV-1介导的细胞-细胞粘附、抑制LIV-1介导的细胞-细 胞膜相互作用、抑制LIV-1介导的细胞-细胞外基质相互作用、抑制LIV-1 介导的细胞-细胞外基质降解、和抑制LIV-1表达。
4、权利要求1的组合物，其中组合物是无菌可注射的。
5、权利要求1的组合物，其中LIV-1调节剂抑制癌细胞生长、癌细 胞存活、肿瘤形成和癌细胞增殖中的一种或多种。
6、权利要求1的组合物，其中所述的LIV-1调节剂抑制细胞周期蛋 白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR和 EGFR磷酸化中的一种或多种。
7、权利要求1的组合物，其中所述的LIV-1调节剂调节整联蛋白介 导的活性。
8、权利要求1的组合物，其中所述的LIV-1调节剂抑制SNAIL途 径中的一个或多个基因。
9、权利要求1的组合物，其中所述的LIV-1调节剂抑制Snail核定 位。
10、权利要求1的组合物，其中所述的LIV-1调节剂上调E-钙粘着 蛋白、VE-钙粘着蛋白、Muc-1中的一种或多种。
11、权利要求1的组合物，其中所述的LIV-1调节剂上调水闸蛋白、 封闭蛋白、桥粒斑蛋白、胱天蛋白酶、p21、p53、BID(bcl-相互作用死亡 激动剂)、DFF40(DNA片段化因子)和细胞角蛋白中的一种或多种。
12、权利要求1的组合物，其中LIV-1调节剂抑制锌转运。
13、权利要求1的组合物，其中LIV-1调节剂降低细胞质锌水平。
14、权利要求1的组合物，其中LIV-1调节剂是以至少1×108Ka的 亲和力结合至LIV-1多肽的单克隆抗体。
15、权利要求14的组合物，其中LIV-1多肽具有SEQ ID NO：2的序 列。
16、权利要求14的组合物，其中单克隆抗体调节一种或多种LIV-1 相关生物学活性。
17、权利要求14的组合物，其中单克隆抗体抑制癌细胞生长、癌细 胞存活、肿瘤形成和癌细胞增殖中的一种或多种。
18、权利要求1的组合物，其中单克隆抗体是单克隆抗体、多克隆抗 体、嵌合抗体、人类抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、多特 异性抗体或Fab片段。
19、权利要求14的组合物，其中单克隆抗体结合至LIV-1的一个或 多个表位，所述的表位具有选自SEQ ID NO：3-364和388-391的序列。
20、权利要求14的组合物，其中单克隆抗体结合至在TM 2和3之 间的LIV-1细胞外结构域中的LIV-1表位。
21、权利要求19的组合物，其中单克隆抗体结合至SEQ ID NO：388 的一个或多个表位。
22、权利要求14的组合物，其中单克隆抗体结合至LIV-1N端细胞 外结构域中的LIV-1表位。
23、权利要求22的组合物，其中单克隆抗体结合至SEQ ID NO：387 的一个或多个表位。
24、权利要求1的组合物，其中LIV-1调节剂是具有选自SEQ ID NO：367-382的序列的寡核苷酸。
25、产生权利要求14的抗体的经分离的细胞。
26、产生权利要求14的抗体的杂交瘤细胞。
27、产生权利要求14的抗体的非人类转基因动物。
28、分离的带有表位的多肽，其包含SEQ ID NO：2的一个或多个表 位，所述表位选自SEQ ID NO：6-364和387-391。
29、权利要求28的分离的带有表位的多肽，其进一步的限制条件是： 多肽不包含SEQ ID NO：2的全部氨基酸序列。
30、编码权利要求28的分离的带有表位的多肽的多核苷酸。
31、权利要求28的带有表位的多肽，其中每一个所述表位由选自 SEQ ID NO：6-364和387-391的表位的约6至约20个连续氨基酸组成。
32、权利要求28的带有表位的多肽，其包含SEQ ID NO：2的至少两 个表位，并且其中每一个所述表位由选自SEQ ID NO：6-364和387-391的 表位的约6至20个连续氨基酸组成。
33、权利要求28的带有表位的多肽，其中至少一个所述表位由SEQ ID NO：2的至少21个连续氨基酸组成。
34、分离的LIV-1抗体，其是通过用权利要求28的带有表位的多肽 免疫受试者获得的。
35、在有需要的患者中治疗癌症或癌症症状的方法，所述方法包括给 患者施与治疗有效量的权利要求1的LIV-1调节剂。
36、权利要求35的方法，其中在测量细胞生长的体外测试法中， LIV-1调节剂抑制表达LIV-1的癌细胞的生长至少25％。
37、权利要求35的方法，其中在测量细胞凋亡的体外测试法中， LIV-1调节剂在小于约1mM的浓度能有效地在至少25％所接触的细胞中 诱导细胞凋亡。
38、权利要求35的方法，其中与对照相比较，LIV-1调节剂使细胞 质锌水平减少至少25％。
39、权利要求35的方法，其中所述的LIV-1调节剂抑制细胞周期蛋 白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR和 EGFR磷酸化中的一种或多种。
40、权利要求35的方法，其中与对照相比较，LIV-1调节剂抑制LIV-1 表达至少25％。
41、权利要求35的方法，其中LIV-1调节剂是siRNA、shRNA或反 义寡核苷酸。
42、权利要求41的方法，其中LIV-1调节剂是具有选自SEQ ID NO：367-382的序列的寡核苷酸。
43、权利要求35的方法，其中LIV-1调节剂是单克隆抗体。
44、权利要求43的方法，其中单克隆抗体结合一个或多个表位，所 述的表位具有选自SEQ ID NO：3-364和388-391的序列。
45、权利要求43的方法，其中单克隆抗体结合至在跨膜结构域(TM)2 和3之间的LIV-1细胞外结构域中的LIV-1表位。
46、权利要求43的方法，其中单克隆抗体结合至SEQ ID NO：388的 一个或多个表位。
47、权利要求43的方法，其中单克隆抗体结合至LIV-1N端细胞外 结构域中的LIV-1表位。
48、权利要求43的方法，其中单克隆抗体结合至SEQ ID NO：387的 一个或多个表位。
49、权利要求35的方法，其中癌症是乳腺癌、皮肤癌、食管癌、肝 癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多 发性骨髓瘤或黑素瘤。
50、权利要求35的方法，其中癌症位于非激素调节的组织。
51、权利要求49的方法，其中乳腺癌是雌激素受体阳性乳腺癌、雌 激素受体阴性乳腺癌和转移性乳腺癌。
52、权利要求49的方法，其中乳腺癌选自管腺癌、小叶腺癌和转移 性腺癌。
53、权利要求35的方法，其中癌症是鳞状细胞癌。
54、权利要求35的方法，其还包括给患者施与常规的癌症治疗。
55、权利要求35的方法，其还包括用化学治疗、放射治疗或外科手 术中的一种或多种治疗患者。
56、权利要求35的方法，其中癌症症状选自：胸部肿块、乳头变化、 胸部囊肿、胸部疼痛、死亡、重量减轻、虚弱、极度疲劳、进食困难、食 欲不振、久咳、恶化的气喘、咳出血、尿血、便血、恶心、呕吐、肝转移、 肺转移、骨转移、腹痛下堕、气胀、腹膜腔中有液体、阴道流血、便秘、 腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎、疼痛、吐血、重汗、发烧、高血压、贫血、 腹泻、黄疸、眩晕、寒战、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝 转移、骨转移、肾转移、和胰腺转移、吞咽困难等。
57、在患者中调节LIV-1相关生物学活性的方法，所述方法包括给患 者施与调节LIV-1相关生物学活性有效量的权利要求1的LIV-1调节剂。
58、权利要求57的方法，其中LIV-1调节剂是选择性结合至LIV-1 的单克隆抗体。
59、权利要求57的方法，其中患者患有或易诱发乳腺癌、皮肤癌、 食管癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、 卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤中的一种或多种。
60、权利要求35的方法，其中LIV-1调节剂是抗体，并且通过体内 治疗性抗体基因转移施与受试者。
61、鉴定对LIV-1治疗敏感的患者的方法，包括：
(a)检测患者样本中LIV-1差异表达的存在或不存在，其中在所述 样本中存在LIV-1差异表达表明患者是LIV-1治疗的候选者；且在所述样 本中不存在LIV-1差异表达表明患者不是LIV-1治疗的候选者；
(b)如果患者是LIV-1治疗的候选者，则给患者施与治疗有效量的 权利要求1的组合物；和
(c)如果患者不是LIV-1治疗的候选者，则给患者施与常规的癌症 治疗。
62、权利要求61的方法，其中与对照相比较，在患者中LIV-1的表 达升高了至少50％。
63、权利要求61的方法，其中通过测量LIV-1RNA检测LIV-1差异 表达。
64、权利要求61的方法，其中通过测量LIV-1表达产物检测LIV-1 差异表达。
65、权利要求61的方法，其还包括给患者施与常规的癌症治疗。
66、抑制表达LIV-1的癌细胞生长的方法，所述方法包括将抑制癌细 胞生长有效量的权利要求1的LIV-1调节剂与细胞接触。
67、权利要求66的方法，其中与对照相比较，LIV-1调节剂使细胞 质锌水平降低至少25％。
68、权利要求66的方法，其中与对照相比较，LIV-1调节剂使细胞 周期蛋白D1水平降低至少25％。
69、在表达LIV-1的细胞群中抑制癌细胞表型的方法，所述方法包括 给所述细胞群施与抑制癌细胞表型有效量的权利要求1的LIV-1调节剂。
70、权利要求69的方法，其中癌细胞选自：乳腺癌、皮肤癌、食管 癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢 癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤。
71、在样本中检测一种或多种表达LIV-1的癌细胞的方法，所述方法 包括将样本与包含连接至显像剂的权利要求1的LIV-1调节剂的组合物接 触并检测显像剂在样本中的定位。
72、权利要求71的方法，其中组合物包含缀合至显像剂的LIV-1抗 体。
73、权利要求72的方法，其中显像剂是18F、43K、52Fe、57Co、67Cu、 67Ga、77Br、87MSr、86Y、90Y、99MTc、111In、123I、125I、127Cs、129Cs、131I、 132I、197Hg、203Pb或206Bi。
74、抑制两个或多个细胞相互作用的方法，其中至少一个所述细胞表 达LIV-1，所述方法包括给包含所述细胞的样本施与有效量的权利要求1 的LIV-1调节剂。
75、权利要求74的方法，其中相互作用是在体内的。
76、权利要求74的方法，其中LIV-1调节剂是与对照相比较使细胞 质锌水平降低至少25％的单克隆抗体。
77、权利要求74的方法，其中LIV-1调节剂是与对照相比较使细胞 周期蛋白D1水平降低至少25％的单克隆抗体。
78、在CHO或骨髓瘤细胞中表达抗LIV-1抗体的方法，其中抗LIV-1 抗体抑制一种或多种LIV-1相关生物学活性，所述方法包括在所述CHO 或骨髓瘤细胞中表达编码抗LIV-1抗体的核酸。
79、鉴定癌抑制剂的方法，所述癌的特征在于与对照相比LIV-1的过 量表达，所述方法包括将表达LIV-1的细胞与候选化合物和LIV-1配体接 触，并确定LIV-1相关锌转运活性是否受到抑制，其中LIV-1相关锌转运 活性的抑制是癌抑制剂的指标。
80、鉴定癌抑制剂的方法，所述癌的特征在于与对照相比LIV-1的过 量表达，所述方法包括将表达LIV-1的细胞与候选化合物和LIV-1配体接 触，并确定LIV-1下游标志物是否受到抑制，其中下游标志物的抑制是癌 抑制剂的指标。
81、权利要求80的方法，其中下游标志物是细胞周期蛋白D1或细胞 质锌水平。
82、确定患者对LIV-1调节剂敏感性的方法，所述方法包括在所述患 者的癌样本中检测LIV-1差异表达的证据，其中LIV-1差异表达的证据是 患者对所述LIV-1调节剂敏感性的指标。
83、权利要求82的方法，其中所述的LIV-1差异表达的证据是LIV-1 在所述患者癌样本中的上调。
84、从包含LIV-1蛋白的样本中纯化LIV-1蛋白的方法，包括：
a)提供亲和基质，所述亲和基质包含结合至固体支持物的权利要求 1的抗体；
b)将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-LIV-1蛋白复合体；
c)从样本剩余物中分离亲和基质-LIV-1蛋白复合体；以及
d)从亲和基质释放LIV-1蛋白。
85、将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表达LIV-1的细胞的方 法，所述方法包括：
a)提供缀合至权利要求1的抗体或其片段的细胞毒剂或诊断剂；以 及
b)将细胞暴露于抗体-剂或片段-剂缀合物。
86、确定癌症患者预后的方法，包括确定所述患者的样本中LIV-1-δ 对LIV-1的比值，其中应用LIV-1-δ对LIV-1的比值来确定癌症患者的预 后。
87、确定癌症患者预后的方法，包括在所述患者的样本中确定结合至 细胞质膜的LIV-1的存在或不存在，其中所述患者的样本中不存在结合至 细胞质膜的LIV-1指示患者良好的预后。
88、权利要求86或87的方法，其中LIV-1由具有SEQ ID NO：1的 序列的核酸编码。
89、权利要求86或87的方法，其中LIV-1具有SEQ ID NO：2的序 列。
90、权利要求86的方法，其中LIV-1-δ具有SEQ ID NO：365的序列。
91、权利要求86的方法，其中至少2∶1的LIV-1-δ：LIV-1比值是具 有良好预后的患者的指标。
92、包含锌转运蛋白调节剂和一种或多种可药用载体的组合物，其中 锌转运蛋白调节剂选自：分离的双链RNA(dsRNA)；包含选自序列SEQ ID NO：383-385的至少10个连续核苷酸的分离的寡核苷酸；结合锌转运蛋白 结构域中的表位的抗体，所述锌转运蛋白结构域选自：N-端细胞外结构域、 在跨膜结构域(TM)2和3之间的细胞外结构域、在TM 4和5之间的细胞 外结构域、在TM 6和7之间的细胞外结构域、以及C-端细胞外结构域。
93、权利要求92的组合物，其中锌转运蛋白是SLC39A10、SLC39A11 或SLC39A13。
94、权利要求92的组合物，其中所述锌转运蛋白调节剂调节整联蛋 白介导的活性、抑制锌转运或降低细胞质锌水平。
95、权利要求92的组合物，其中寡核苷酸是siRNA或反义寡核苷酸。
96、权利要求92的组合物，其中锌转运蛋白调节剂是以至少1×108 Ka的亲和力结合至锌转运蛋白的单克隆抗体。
97、权利要求97的组合物，其中单克隆抗体结合至锌转运蛋白N端 细胞外结构域中的一个或多个表位。
98、权利要求97的组合物，其中单克隆抗体结合至在跨膜结构域 (TM)2和3之间的锌转运蛋白细胞外结构域中的一个或多个表位。
99、权利要求97的组合物，其中单克隆抗体抑制癌细胞生长、癌细 胞存活、肿瘤形成和癌细胞增殖中的一种或多种。
100、在有需要的患者中治疗癌症或癌症症状的方法，所述方法包 括给患者施与治疗有效量的权利要求92的锌转运蛋白调节剂。
101、权利要求100的方法，其中锌转运蛋白调节剂具有选自以下 的一种或多种活性：增加癌细胞凋亡、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞存活、 抑制肿瘤形成、抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞转移、抑制细胞迁移、抑制 血管生成、抑制LIV-1信号传导、抑制LIV-1介导的细胞-细胞粘附、抑制 LIV-1介导的细胞-细胞膜相互作用、抑制LIV-1介导的细胞-细胞外基质 相互作用、抑制LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解、和抑制LIV-1表达。
102、权利要求100的方法，其中在测定细胞生长的体外测试法中， 锌转运蛋白调节剂抑制表达锌转运蛋白的癌细胞的癌细胞生长至少30％。
103、权利要求100的方法，其中在测定细胞凋亡的体外测试法中， 锌转运蛋白调节剂在小于约1mM的浓度能有效地在至少20％的接触的细 胞中诱导细胞凋亡。
104、权利要求100的方法，其中锌转运蛋白调节剂抑制锌转运。
105、权利要求100的方法，其中锌转运蛋白调节剂调节细胞质锌 水平。
106、权利要求100的方法，其中所述的锌转运蛋白调节剂调节整 联蛋白介导的活性。
107、权利要求101的方法，其中与对照相比较，锌转运蛋白调节 剂至少25％抑制锌转运蛋白表达。
108、权利要求100的方法，其中锌转运蛋白调节剂是单克隆抗体。
109、权利要求108的方法，其中抗体具有对除锌转运蛋白之外的 多肽的小于约1×105Ka的结合亲和力。
110、权利要求109的方法，其中单克隆抗体诱导细胞凋亡。
111、权利要求109的方法，其中单克隆抗体抑制肿瘤形成。
112、在患者中调节锌转运蛋白相关生物学活性的方法，所述方法 包括给患者施与调节锌转运蛋白相关生物学活性有效量的权利要求92的 锌转运蛋白调节剂。
113、权利要求112的方法，其中锌转运蛋白调节剂是选择性结合 至锌转运蛋白的单克隆抗体。
114、权利要求100或112的方法，其中患者患有或易诱发乳腺癌、 皮肤癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、 膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤中的一种或多种。
115、抑制表达锌转运蛋白的癌细胞生长的方法，所述方法包括将 细胞与抑制癌细胞生长有效量的权利要求92的锌转运蛋白调节剂接触。
116、权利要求115的方法，其中锌转运蛋白调节剂是选择性地结 合锌转运蛋白并与对照相比较调节细胞质锌水平至少30％的单克隆抗体。
117、在样本中检测一种或多种表达锌转运蛋白的癌细胞的方法， 所述方法包括将样本与包含连接至显像剂的权利要求92的锌转运蛋白调 节剂的组合物接触并检测显像剂在样本中的定位。
118、权利要求117的方法，其中组合物包含缀合至显像剂的锌转 运蛋白抗体。
119、权利要求118的方法，其中显像剂是18F、43K、52Fe、57Co、 67Cu、67Ga、77Br、87MSr、86Y、90Y、99MTc、111In、123I、125I、127Cs、129Cs、 131I、132I、197Hg、203Pb或206Bi。
120、抑制两个或多个细胞相互作用的方法，其中至少一个所述细 胞表达锌转运蛋白，所述方法包括给包含所述细胞的样本施与有效量的权 利要求92的锌转运蛋白调节剂。
121、权利要求120的方法，其中相互作用是在体内的。
122、鉴定癌抑制剂的方法，所述癌的特征在于与对照相比锌转运 蛋白的过量表达，所述方法包括将表达锌转运蛋白的细胞与候选化合物和 锌转运蛋白配体接触，并确定锌转运活性是否受到抑制，其中锌转运活性 的抑制是癌抑制剂的指标。
123、鉴定癌抑制剂的方法，所述癌的特征在于与对照相比锌转运 蛋白的过量表达，所述方法包括将表达锌转运蛋白的细胞与候选化合物和 锌转运蛋白配体接触，并确定锌转运蛋白下游标志物是否受到抑制，其中 下游标志物的抑制是癌抑制剂的指标。
124、确定患者对锌转运蛋白调节剂敏感性的方法，所述方法包括 在所述患者的癌样本中检测锌转运蛋白差异表达的证据，其中锌转运蛋白 差异表达的证据是患者对所述锌转运蛋白调节剂敏感性的指标。
125、权利要求124的方法，其中所述的锌转运蛋白差异表达的证 据是锌转运蛋白在所述患者癌样本中的上调。
126、从包含一种或多种锌转运蛋白的样本中纯化锌转运蛋白的方 法，所述方法包括：
a)提供亲和基质，所述亲和基质包含结合至固体支持物的权利要求 92的抗体；
b)将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-锌转运蛋白复合体；
c)从样本剩余物中分离亲和基质-锌转运蛋白复合体；以及
d)从亲和基质释放锌转运蛋白。
127、将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表达锌转运蛋白的细 胞的方法，所述方法包括：
a)提供缀合至权利要求92的抗体或其片段的细胞毒剂或诊断剂；以 及
b)将细胞暴露于抗体-剂或片段-剂缀合物。
发明领域
本发明总体上涉及肿瘤学领域。更具体地，本发明涉及治疗癌症的方 法，治疗癌症的组合物以及用于诊断和/或检测癌症的方法和组合物。
发明背景
癌症是美国第二的主要死亡原因。虽然“癌症”常被用于描述许多不 同类型的癌症，即乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌，每一种类 型的肿瘤在表型水平和遗传水平都是不同的。当一个或多个基因的表达由 于突变而变得失调且细胞生长不再受到控制时，就会发生癌症的失调生长 特征。
通常将基因分为两类：癌基因和肿瘤抑制基因。癌基因是其正常功能 是只在特定条件下促进细胞生长的基因。当癌基因获得了突变并然后丧失 这一控制时，它会在所有条件下都促进生长。然而，已经发现，对于癌症 要真正成功来说，癌症还必须需要在肿瘤抑制基因中的突变。肿瘤抑制基 因的正常功能是阻止细胞生长。肿瘤抑制基因的例子包括p53、p16、p21 和APC，所有这些在正常作用时均阻止细胞免于不受控制地分裂和生长。 当肿瘤抑制基因突变或丧失时，细胞生长的刹车也丧失了，使得细胞现在 可以不受限制的生长。
锌是细胞生长所需要的，并且也是超过300种酶的辅因子。锌参与蛋 白、核酸、碳水化合物和脂代谢。锌在基因转录、生长、发育和分化的控 制中也起着重要作用(Vallee和Falchuk(1993)Physiol.Rev.73，79-118)。在 哺乳动物中，锌缺乏是有害的，会引起发育障碍和严重的代谢疾病 (Truong-Tran等，(2001)Biometals 14，315-330)。过量的锌也会对细胞有 毒(Koh等，(1996)Science 272，1013-1016)。锌不能被动地扩散穿过细胞 膜。因此，需要特定的锌转运蛋白来将锌转运入细胞。因为锌对细胞生长 非常重要，因此锌转运蛋白在维持细胞凋亡和细胞生长之间的细胞平衡中 起着重要的作用。细胞平衡的失常能够导致癌症(Taylor等，Biochem.J. (2003)375，51-59)。
真核生物具有许多不同的锌转运蛋白。迄今为止，研究得最多的锌转 运蛋白属于ZIP或CDF(阳离子扩散家族)转运蛋白家族。ZIP转运蛋白定 位于质膜上并作为锌流入转运蛋白，或定位于细胞内膜上并允许它们从这 些结构中动员储存。ZIP家族由至少86个成员组成并且可分为4个独立的 亚家族：ZIP亚家族I(有1个已知的人类成员)、ZIP亚家族II(有3个已 知的人类成员)、gufa亚家族(有2个已知的人类成员)、以及LIV-1亚家族 (有9个已知的人类成员)(Gaither和Eide(2001)，Biometals 14，251-270)。
LIV-1也被称为Zip6，是锌转运蛋白，其作为这样的基因得到鉴定， 即它的表达受到某些乳腺癌细胞的雌激素治疗的刺激(Manning等，(1988)， Mol.Cell.Endocrinol.59，205-212)。已显示出LIV-1属于ZIP(Zrt-、Irt- 样蛋白)锌转运蛋白的被命名为LZT(ZIP锌转运蛋白LIV-1亚家族)的亚家 族(Taylor和Nicholson(2003)Biochim.Biophys.Acta Biomembr.1611， 16-30)。这些转运蛋白含有与在代谢中具有已知功能的存在于基质金属蛋 白酶的基序类似的潜在金属蛋白酶基序(Itoh和Nagase，(2002)，Essays Biochem.38，21-36)。LIV-1mRNA的表达显示出与乳腺癌至局部淋巴结的 扩散相关。LIV-1结构显示出它是富含组氨酸的并且至少具有结合和/或转 运Zn2+离子的可能性(Taylor，(2000)，ZUBMB Life 49：249-253)。
脊椎动物的原肠胚形成是身体建立中的关键步骤。上皮-间充质细胞转 变(EMT)发生在原肠胚形成过程中。EMT是胚胎发育、器官和组织再生以 及肿瘤转移的中心事件之一。转录的信号转导物和激活子(STATs)介导了 在各种生物过程中应答细胞因子和生长因子的包括细胞增殖、分化和存活 的生物学作用。STATs在原肠胚形成、器官发生、伤口愈合和癌演进过程 中的EMT中也是重要的。已显示STAT3在斑马鱼原肠胚形成过程中被激 活并且其活性对于原肠胚形成活动非常重要。然而，在EMT中STAT作 用的分子机制还没有被完全阐述明白。LIV1是STAT3在EMT中的下游 靶标，并且其在锌指蛋白Snail(EMT的主调节剂)的核定位中也很重要。
然而，迄今为止LIV-1在癌症中的作用还没有被完全阐述明白。需要 鉴定调控LIV-1的组合物和方法。本发明涉及这些以及其它重要需求。
发明概述
在一些方面，本发明提供了包含LIV-1调节剂和一种或多种可药用载 体的组合物。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是分离的双链 RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是包含SEQ ID NO：1序 列的至少10个连续核苷酸的分离的寡核苷酸。在一些实施方案中，LIV-1 调节剂是结合LIV-1结构域中的表位的抗体，所述LIV-1结构域选自： LIV-1的N-端细胞外结构域、在跨膜结构域(TM)2和3之间的LIV-1细胞 外结构域、在TM 4和5之间的LIV-1细胞外结构域、在TM 6和7之间 的LIV-1细胞外结构域、以及LIV-1的C-端细胞外结构域。在一些实施方 案中，LIV-1调节剂是dsRNA、siRNA、shRNA或反义寡核苷酸。
在一些方面，本发明提供了在有需要的患者中治疗癌症或癌症症状的 方法，包括给患者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。
在一些方面，本发明提供了在患者中调节LIV-1相关生物学活性的方 法，包括给患者施与调节LIV-1相关生物学活性有效量的LIV-1调节剂。
在一些方面，本发明提供了鉴定对LIV-1治疗敏感的患者的方法，包 括检测在患者样本中存在或不存在LIV-1的差异表达，如果患者是LIV-1 治疗的候选者则给患者施与治疗有效量的LIV-1调节剂；如果患者不是 LIV-1治疗的候选者则给患者施与常规的癌症治疗。
在一些方面，本发明提供了抑制表达LIV-1的癌细胞生长的方法， 包括将抑制细胞生长有效量的LIV-1调节剂与细胞接触。
在一些方面，本发明提供了在表达LIV-1的细胞群中抑制癌细胞表 型的方法，包括给细胞群施与抑制癌细胞表型有效量的LIV-1调节剂。
在一些方面，本发明提供了在样本中检测一种或多种表达LIV-1的 癌细胞的方法，包括将样本与包含和显像剂连接的LIV-1调节剂的组合物 接触并检测显像剂在样本中的定位。
在一些方面，本发明提供了抑制两个或多个细胞(其中至少一个细胞 表达LIV-1)相互作用的方法，包括给包含细胞的样本施与有效量的LIV-1 调节剂。
在一些方面，本发明提供了在CHO或骨髓瘤细胞中表达抗LIV-1抗 体的方法。在一些实施方案中，抗LIV-1抗体抑制一种或多种LIV-1相关 生物学活性。在一些实施方案中，该方法包括在CHO或骨髓瘤细胞中表 达编码抗LIV-1抗体的核酸。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，包括将表达LIV-1 的细胞与候选化合物和LIV-1配体接触，并检测LIV-1相关锌转运活性是 否被抑制。在一些实施方案中，LIV-1相关锌转运活性的抑制是癌抑制剂 的指标。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，包括将表达LIV-1 的细胞与候选化合物和LIV-1配体接触，并检测LIV-1下游标志物是否被 抑制。在一些实施方案中，下游标志物的抑制是癌抑制剂的指标。
在一些方面，本发明提供了确定患者对LIV-1调节剂敏感性的方法， 包括在所述患者的癌样本中检测LIV-1差异表达的证据。在一些实施方案 中，LIV-1差异表达的证据是患者对LIV-1调节剂敏感性的指标。
在一些方面，本发明提供了从包含LIV-1蛋白的样本中纯化LIV-1 蛋白的方法，包括提供包含结合至固体支持物的LIV-1抗体的亲和基质， 将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-LIV-1蛋白复合体；从样本剩余物 中分离亲和基质-LIV-1蛋白复合体；以及从亲和基质释放LIV-1蛋白。
在一些方面，本发明提供了将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表 达LIV-1的细胞的方法，该方法包括提供与LIV-1抗体或其片段缀合的细 胞毒剂或诊断剂，并且将细胞暴露于抗体-剂或片段-剂缀合物。
在一些方面，本发明提供了确定癌症患者预后的方法，包括确定患者 样本中LIV-1-δ对LIV-1的比值。在一些实施方案中，应用LIV-1-δ对LIV-1 的比值来确定癌症患者的预后。
在一些方面，本发明提供了确定癌症患者预后的方法，包括在患者样 本中检测结合至细胞质膜的LIV-1的存在或不存在。在一些实施方案中， 患者样本中结合至细胞质膜的LIV-1的不存在是患者良好预后的指标。
在一些方面，本发明提供了包含锌转运蛋白调节剂和一种或多种可药 用载体的组合物。在一些实施方案中，锌转运蛋白是分离的双链 RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，锌转运蛋白是包含选自SEQ ID NO： 383-385的序列的至少10个连续核苷酸的分离的寡核苷酸。在一些实施方 案中，锌转运蛋白是结合锌转运蛋白结构域中的表位的抗体，所述锌转运 蛋白结构域选自：N-端细胞外结构域、在跨膜结构域(TM)2和3之间的细 胞外结构域、在TM 4和5之间的细胞外结构域、在TM 6和7之间的细 胞外结构域、以及C-端细胞外结构域。在一些实施方案中，锌转运蛋白是 SLC39A10、SLC39A11或SLC39A13。
在一些方面，本发明提供了在有需要的患者中治疗癌症或癌症症状的 方法，包括给患者施与治疗有效量的锌转运蛋白调节剂。
在一些方面，本发明提供了在患者中调节锌转运蛋白相关生物学活性 的方法，包括给患者施与调节锌转运蛋白相关生物学活性有效量的锌转运 蛋白调节剂。
在一些方面，本发明提供了抑制表达锌转运蛋白的癌细胞生长的方 法，包括将抑制细胞生长有效量的锌转运蛋白调节剂与细胞接触。
在一些方面，本发明提供了在样本中检测一种或多种表达锌转运蛋白 的癌细胞的方法，包括将样本与包含和显像剂连接的锌转运蛋白调节剂的 组合物接触并检测显像剂在样本中的定位。
在一些方面，本发明提供了抑制两个或多个细胞(其中至少一个细胞表 达锌转运蛋白)相互作用的方法，包括给包含细胞的样本施与有效量的锌转 运蛋白调节剂。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，癌症的特征在于与 对照相比锌转运蛋白的过量表达。在一些实施方案中，该方法包括将表达 锌转运蛋白的细胞与候选化合物和锌转运蛋白配体接触，并检测锌转运活 性是否被抑制。在一些实施方案中，锌转运活性的抑制是癌抑制剂的指标。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，癌症的特征在于与 对照相比锌转运蛋白的过量表达。在一些实施方案中，该方法包括将表达 锌转运蛋白的细胞与候选化合物和锌转运蛋白配体接触，并检测锌转运蛋 白的下游标志物是否被抑制。在一些实施方案中，下游标志物的抑制是癌 抑制剂的指标。
在一些方面，本发明提供了确定患者对锌转运蛋白调节剂敏感性的方 法，包括在患者的癌样本中检测锌转运蛋白差异表达的证据。在一些实施 方案中，锌转运蛋白差异表达的证据是患者对锌转运蛋白调节剂敏感性的 指标。
在一些方面，本发明提供了从包含一种或多种锌转运蛋白的样本中纯 化锌转运蛋白的方法，包括提供包含结合至固体支持物的锌转运蛋白抗体 的亲和基质，将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-锌转运蛋白复合体； 从样本剩余物中分离亲和基质-锌转运蛋白复合体；以及从亲和基质释放锌 转运蛋白。
在一些方面，本发明提供了将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表 达锌转运蛋白的细胞的方法，该方法包括提供缀合至锌转运蛋白抗体或其 片段的细胞毒剂或诊断剂，并且将细胞暴露于抗体-剂或片段-剂缀合物。
本发明的这些和其它方面将在以下的发明详述中阐述。
附图简述：
图1描述几个癌样本中LIV-1蛋白的表达。左图描述ER阳性、ER 阴性和转移性乳腺癌。在右图中的癌组织中可看到质膜染色。右下图描述 在非透化细胞上的共焦覆盖图。
图2描述通过LIV-1特异的siRNAs敲低(knockdown)LIV-1蛋白。
图3描述在癌细胞中通过LIV-1特异的siRNAs抑制癌细胞生长、增 殖和存活。
图4描述在癌细胞中通过LIV-1特异的siRNAs敲低LIV-1诱导的胱 天蛋白酶活化。
图5描述了在正常细胞中LIV-1特异的siRNAs对增殖、胱天蛋白酶 活性和LIV-1mRNA水平的影响。
图6描述了在癌细胞中通过LIV-1特异的siRNAs降低癌细胞中细胞 周期蛋白D1水平。
图7描述了通过LIV-1特异的抗体降低细胞质锌水平。
图8描述了正常和癌细胞中的LIV-1表达。
图9描述了在MCF7细胞中LIV-1敲低的影响，包括对细胞增殖、软 琼脂生长、蛋白质表达和存活的影响。
图10描述了通过LIV-1特异的siRNAs降低细胞质锌水平。
图11描述了在用LIV-1特异性抗体处理后细胞周期蛋白D1水平的降 低。
图12描述了应用LIV-1分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133 plus 2芯片)图示。沿水平轴上布置正常和癌性组织类型。癌性组织 用“c”标记，例如，“c_乳腺_管”表示乳腺癌组织样本，且正常组织类 似地用“n”表示。如果知道的话，还对组织类型进一步标记有关组织的类 型和亚型。例如，“c_乳腺_管”是来自位于乳腺管中的乳腺癌的癌性组织。 如果在外科切除期间不清楚或不知道亚型，则标签记为“ns”表示“非确 切的”。在垂直轴上的每一个点表示来自单个患者的组织样本，以及每一 点在垂直轴上的高度(基于log2)代表探针组(probeset)的相对表达水平。实 心圆代表表达水平在线性检测范围内的样本。空心圆代表在其中基因在探 针组的检测极限以下的样本中基因表达的上限。空的方块代表在其中探针 组被饱和的样本中基因表达的下限。(简而言之，在进行分析之前，通过在 大量、不同的样本组中分析组成探针组的探针的表现校正探针组。这一校 正确定每一探针的相对敏感性、以及强度范围，在所述强度范围内探针组 的反应在探针之间是线性的。在这一范围以下的强度被称为“未检测到” 而在所述范围以上的强度被称为“饱和”。由于样本之间杂交和标记效率 的不同，每一芯片均在应用校正后被规一化。这使得按照基因表达水平的 范围上限和下限在样本与样本之间有些不同。)
图13描述了用SLC39A10分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133plus 2芯片)图示。附图说明信息如以上图12所提供。
图14描述了用SLC39A11分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133plus 2芯片)图示。附图说明信息如以上图12所提供。
图15描述了用SLC39A13分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133plus 2芯片)图示。附图说明信息如以上图12所提供。
发明详述：
本发明提供了用于癌症治疗、诊断和成像，具体而言用于LIV-1相关 癌症的治疗、诊断和成像的方法和组合物。
本发明的发明人尤其发现LIV-1在数种癌症，包括乳腺癌中过量表达， 并且在正常组织中具有受限的表达。抑制LIV-1则抑制了癌细胞的增殖， 但不抑制LIV-1-阳性的“正常”细胞。此外，已发现LIV-1的抑制调节细 胞质锌水平以及下游标志物的水平，所述下游标志物例如包括细胞周期蛋 白D1和MT1-MMP。在本申请中提供了本发明的这些和其它方面。
定义
在这一文件中使用了许多定义。多数词语具有对本领域技术人员来说 是这些词语本身的意思。在下面或在这一文件中其它地方特别定义的词语 具有在本发明的上下文中作为整体所提供的以及如本领域技术人员通常理 解的意思。
除非特别标明，本发明的实施将应用本领域内常见的化学、生物化学、 分子生物学、免疫学和药学方法。在文献中充分地解释了此类技术。例如， 参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania： Mack Publishing Company，1990)；Methods In Enzymology(S.Colowick 和N.Kaplan，编辑，Academic Press，Inc.)；以及Handbook of Experimental Immunology，I-IV卷(D.M.Weir和CC.Blackwell，编辑， 1986，Blackwell Scientific Publications)以及Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，1989)。
本文所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数关系， 除非文中另外清楚地标明。因此，例如论及“一种抗体”时包括两种或以 上此类抗体的混合物。
本文所使用的术语“约”是指值的+/-20％、+/-10％、或+/-5％。
本文所使用的术语“锌转运蛋白”或“锌运载蛋白”是指显示出锌转 运蛋白结构特征的生物分子。在一些实施方案中，锌转运蛋白包括LIV-1、 SLC39A13、SLC39A11和SLC39A10。
本文所使用的术语“LIV-1”也被称为Zip6，是指属于被称为LZT的 ZIP锌转运蛋白的亚家族的锌转运蛋白。在GeneCard中，LIV-1也被称 为SLC39A6(溶质载体蛋白家族39(锌转运蛋白)，成员6)。LIV-1的核苷 酸序列如SEQ ID NO：1所示，且LIV-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。 尽管为了简洁的目的，本发明主要根据LIV-1作为例证，但应该理解涉及 LIV-1的定义和实施方案也可用于本文公开的其它锌转运蛋白。
本文所使用的术语“LIV-1-δ”是指与LIV-1相比至少缺乏氨基端部 分的LIV-1变体。LIV-1-δ的多肽序列如SEQ ID NO：365所示。
本文所使用的术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用，是指任何长度 的氨基酸聚合体形式，其可以包括编码的或非编码的氨基酸、化学或生物 化学修饰或衍生的氨基酸、以及具有经修饰的肽骨架的多肽。该术语包括 融合蛋白，包括但不限于与异源氨基酸序列融合的融合蛋白、与同源或异 源的具有或没有N端甲硫氨酸残基的前导序列融合；免疫学标记的蛋白等。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”可互换使用，是指 对于其来说诊断、治疗或疗法是所期望的任何受试者，尤其是人类。其它 受试者可以包括牛、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马等。在一些优 选的实施方案中，受试者是人类。
本文所使用的术语“癌症”是指原发或转移癌。术语“癌细胞”是指 被转化的细胞。这些细胞可以从患有癌症的患者中分离，或者是在体外经 转化变为癌性的细胞。癌细胞可以从许多种类的样本中取得，所述样本包 括任何组织或细胞培养系。在一些实施方案中，癌细胞是过度增生细胞、 肿瘤细胞或赘生物。在一些实施方案中，癌细胞从乳腺癌、皮肤癌、食管 癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢 癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤中分离。在一些实施方案中，癌细胞从公众可 获得的已建立的细胞系中取得。在一些实施方案中，癌细胞从业已存在的 患者样本或从包含癌细胞的文库中分离。在一些实施方案中，分离癌细胞 并然后将其移植至不同的宿主中，例如异种移植。在一些实施方案中，在 SCED小鼠模型中移植并应用癌细胞。在一些实施方案中，癌是乳腺癌。
本文所使用的术语“经转化的”是其后代能稳定遗传的在细胞特性上 的任何转变。在一些实施方案中，“经转化的”是指正常细胞至癌性细胞 的转变，例如，能够引起肿瘤的改变。在一些实施方案中，经转化的细胞 是永生化的。转化可以通过许多因素引起，包括在缺乏受体磷酸化的情况 下的受体过量表达、病毒感染、在癌基因和/或肿瘤抑制基因上的突变、和 /或任何改变细胞生长和/或永生化特性的其它技术。
“癌性表型”通常是指作为癌性细胞特性的任意的多种生物学现象， 其中的现象在不同类型的癌症中可以不同。癌性表型通常通过在例如细胞 生长或增殖(例如，不受控制的生长或增殖)、细胞周期调控、细胞迁移、 细胞-细胞相互作用或转移等中的反常来鉴定。
本文所使用的术语“转移”是指已传播至远离癌的起源，例如远离原 发癌的位置处的癌症。转移的位置包括但不限于骨、淋巴结、肺、肝和脑。
本文所使用的术语“血管发生”是指患者中血管的发生。
本文所使用的术语“临床端点(clinical endpoint)”是指癌症的可测 量事件指标。临床端点包括但不限于第一次转移的时间、随后转移的时间、 转移瘤的大小和/或数目、肿瘤的大小和/或数目、肿瘤的位置、肿瘤的侵袭、 生活质量、疼痛等。本领域技术人员具有确定和测量临床端点的能力。测 量临床端点的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
本文所使用的术语“样本”是指来自患者的生物学材料。通过本发明 测定的样本不限于任何特殊的类型。作为非限制性实例，样本包括单个细 胞、多个细胞、组织、肿瘤、生物学液体、生物分子、或任何前述的上清 液或提取物。样本的例子包括为活组织检查取出的组织、在切除术期间取 出的组织、血液、尿、淋巴组织、淋巴液、脑脊髓液、粘液和粪便样本。 所使用的样本会依据分析方式、检测方法和待检测肿瘤、组织、细胞或提 取物的性质而不同。制备样本的方法在本领域是熟知的，并且可以很容易 的修改以获得适合于所应用的方法的样本。
本文所使用的术语“生物分子”包括但不限于多肽、核酸和糖类。
本文所用的术语“调节”是指在细胞内部、外部或表面的基因、蛋白 或任何分子的质或量上的改变。改变可以是分子表达或水平上的升高或降 低。术语“调节”也包括改变生物学功能/活性的质或量，所述生物学功能 /活性包括但不限于细胞增殖、生长、粘附、细胞存活、凋亡、细胞内信号 传导、细胞-细胞间信号传导等。
本文所使用的术语“调节剂”是指调节一种或多种与癌症相关的生理 学或生物化学事件的组分。在一些实施方案中，调节剂抑制一种或多种与 癌症相关的生物学活性。在一些实施方案中，调节剂是小分子、抗体、模 拟物、诱饵(decoy)或寡核苷酸。在一些实施方案中，调节剂通过阻断配 体结合或通过竞争配体结合位点起作用。在一些实施方案中，调节剂独立 于配体结合之外起作用。在一些实施方案中，调节剂不竞争配体结合位点。 在一些实施方案中，调节剂阻断参与癌症的基因产物的表达。在一些实施 方案中，调节剂阻断两个或更多个参与癌症的生物分子的物理相互作用。 在一些实施方案中，本发明的调节剂抑制一种或多种LIV-1生物学活性， 所述LIV-1生物学活性选自：癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细 胞存活、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1介 导的细胞-细胞粘附、细胞-细胞相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互 作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质相互作用、整联蛋白介导的活性、 LIV-1表面表达、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解、EGFR磷酸化和Snail 核定位。在一些实施方案中，LIV-1调节剂抑制LIV-1表达。
“基因产物”是指由基因表达或产生的生物聚合物产物。基因产物例 如可以是未剪接的RNA、mRNA、剪接变体mRNA、多肽、翻译后修饰 的多肽、剪接变体多肽等。这一术语还包括应用RNA基因产物作为模板 产生的生物聚合物产物(即，RNA的cDNA)。基因产物可以酶学地、重组 地、化学地或在对于其来说该基因是天然存在的细胞中制得。在一些实施 方案中，如果基因产物是蛋白质的，其表现出生物学活性。在一些实施方 案中，如果基因产物是核酸，其可以翻译为表现出生物学活性的蛋白质基 因产物。
本文所使用的“LIV-1活性的调节”是指LIV-1活性的升高或降低， 其例如可以是物质与LIV-1多核苷酸或多肽的相互作用、LIV-1转录和/ 或翻译的抑制(例如，通过反义或siRNA与LIV-1基因或LIV-1转录子相 互作用、通过促进LIV-1表达的转录因子的调控)等的结果。例如，生物活 性的调节是指生物学活性的升高或生物学活性的降低。本发明对导致 LIV-1活性降低的LIV-1活性调节特别感兴趣。可以通过以下方法评估 LIV-1活性，所述方法包括但不限于：测试锌转运活性、评估LIV-1多肽 水平、或通过评估LIV-1转录水平。LIV-1活性的比较也可以通过测量 LIV-1下游标志物的水平、测量对LIV-1信号传导的抑制、测量对LIV-1 介导的细胞粘附的抑制、测量对LIV-1介导的癌细胞凋亡的活化、测量癌 细胞生长抑制、测量肿瘤形成的抑制、测量细胞周期蛋白产生的抑制、测 量对产生纤连蛋白的抑制和测量对锌转运的抑制来完成。
本文所使用的术语“抑制”是指活性或量的减少、降低、失活或下调。 例如，在本发明的上下文中，Liv-1调节剂可以抑制癌细胞生长、肿瘤形成、 癌细胞增殖、癌细胞存活、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信 号传导、LIV-1介导的细胞-细胞粘附、细胞-细胞相互作用、LIV-1介导的 细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质相互作用、整联蛋白 介导的活性、LIV-1表面表达、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解、Snail 核定位、以及LIV-1表达中的一种或多种。LIV-1调节剂也可以抑制细胞 周期蛋白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR、 EGFR磷酸化、在SNAIL途径中的一个或多个基因。LIV-1调节剂也可以 抑制锌转运并且在一些实施方案中能降低细胞质锌水平。与对照相比，抑 制可以是至少25％、至少50％、至少是60％、至少70％、至少75％、至 少是80％、至少90％、至少95％、至少是97％、至少98％、至少是99％、 或100％。
本文所使用的术语“在癌细胞中差异表达”和“在癌细胞中差异表达 的多核苷酸”在本文中可以互相使用，是指代表或对应于基因的多核苷酸， 当与非癌性的相同细胞类型的细胞相比较时，所述基因在癌性细胞中差异 表达，例如，发现mRNA在至少约25％、至少约50％至约75％、至少约 90％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50 倍或更多不同(例如，更高或更低)的水平上。例如如果使用原位杂交或其 它在组织上的细胞类型之间允许一定程度的区别的分析方法，可以在组织 中进行比较。比较也可以或备选地在从它们的组织来源中分离的细胞之间 进行，或在一个原位细胞和第二个从它的组织来源中分离的细胞之间进行。 在一些实施方案中，与正常细胞相比较，基因在癌细胞中上调。
如果癌症的至少一个症状得到减轻、终止、变慢或防止，则“抑制” 了LIV-1相关癌症。在本文中，如果癌症的复发或转移得到减轻、变慢、 延缓或防止，则也“抑制”了LIV-1相关癌症。
本文所使用的词组“抑制LIV-1介导的细胞粘附”是指在LIV-1抑制 剂存在的情况下，细胞-细胞之间粘附的抑制或消失，其中至少一个细胞差 异表达LIV-1。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时LIV-1介 导的细胞粘附，通过LIV-1抑制剂能够使LIV-1介导的细胞粘附降低至少 25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直至100％。 LIV-1介导的细胞粘附的比较可以通过测量完成，例如，通过标记感兴趣 的细胞、将它们与黏附至基质的未标记细胞群孵育、以及洗涤以从非黏附 细胞群中分离黏附细胞。在这一方法中，通过测量保留在基质上的标记的 量确定细胞粘附。分析系统的实例包括但不限于用荧光探针标记并在荧光 板读数器上或通过流式细胞术测量荧光，所述荧光探针诸如钙荧光素AM， CFMDA(二乙酸5-氯甲基荧光素)、5(6)-CFDA-SE[二乙酸5-(和-6)-羧基荧 光素，琥珀酰亚胺酯]。
在本文中所使用的词组“增加癌细胞凋亡”是指在存在LIV-1抑制剂 的情况下增加差异表达LIV-1的癌细胞的凋亡。在这一上下文中，相对于 不存在LIV-1抑制剂时的癌细胞凋亡，通过LIV-1抑制剂可以使癌细胞凋 亡增加至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、 直至100％。癌细胞凋亡的比较例如可以通过测量DNA片段化、胱天蛋白 酶活性、线粒体膜电位的丧失、活性氧类(ROS)增加的产生、细胞内酸化、 染色质凝聚、细胞表面的磷脂酰丝氨酸水平以及增加的细胞膜通透性来完 成。
DNA片段化例如可以用TUNEL测试法(末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP缺口末端标记)来测量。该测试法的商业版本可广泛地获得，例如， APO-BrdUTM TUNEL测试试剂盒(Invitrogen)、APO-DIRECTTM试剂盒 (BD Biosciences Pharmingen)和ApoAlertTM DNA片段化测试试剂盒 (Clontech，Takara Bio Company)。
胱天蛋白酶活性可以通过对特定胱天蛋白酶特异的荧光、生色和发光 底物来监测。至少对于胱天蛋白酶1、2、3、6、7、8和9可获得商业化测 试试剂盒。(例如，参见Invitrogen、Chemicon、CalBiochem、BioSource International、Biovision)。
线粒体膜电位的丧失可以用在健康活性的线粒体中差异聚集的荧光染 料来测量。一个非限制性实例是Invitrogen的MitoTracker Red系统。
活性氧类(ROS)的产生可以用荧光染料来测量，所述染料例如包括 H2DCFDA(Invitrogen)。
细胞内酸化可以用荧光或生色染料来测量。
染色质凝聚可以用荧光染料来测量，所述荧光染料例如包括Hoechst 33342。
磷脂酰丝氨酸(PS)可以在细胞表面测量。例如，膜联蛋白V具有对PS 的高亲和性。许多商业可获得的测试法适合于监测经标记的膜联蛋白V与 细胞表面的结合。
细胞膜通透性可以用染料来测量，所述染料诸如可以进入凋亡细胞但 不能进入坏死细胞的荧光染料YO-PRO-1(Invitrogen)。
本文所使用的词组“抑制癌细胞生长”是指在存在LIV-1抑制剂的情 况下癌细胞生长的抑制或消失，其中细胞差异表达LIV-1。在这一上下文 中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的癌细胞生长，通过LIV-1抑制剂可以 使癌细胞生长降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、 至少95％、直至100％。癌细胞生长的比较例如可以应用MTT测试法(例 如，MTT细胞增殖测试试剂盒(Invitrogen))、BrdU掺入(例如， Absolute-S SBIP测试法(Invitrogen))、测量细胞内ATP水平(例如应用 ATPLiteTM-M，1,000测试试剂盒(PerkinElmer)或ATP细胞活力测试试剂 盒(Bio Vision))、DiOc 18测试法(膜可渗透染料(Invitrogen))、葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶活性测试法(例如，Vibrant细胞毒测试法(Invitrogen))或测量细胞 LDH活性来完成。
本文所使用的词组“抑制肿瘤形成”是指在存在LIV-1抑制剂的情 况下肿瘤形成的抑制或消失，其中肿瘤包含差异表达LIV-1的细胞。在这 一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的肿瘤形成，通过LIV-1抑制 剂可以使肿瘤形成减少至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至 少90％、至少95％、直至100％。肿瘤形成的比较例如可以应用基于细胞 的测试法(例如在软琼脂上的集落形成)、通常依赖于将感兴趣的细胞注射 至动物(例如，无胸腺小鼠或大鼠、受辐射的小鼠或大鼠；接种至免疫特惠 位点(immunologically privileged sites)，诸如脑、颊囊或眼；同系动物 接种)并在规定的时间段后监测肿块大小的体内肿瘤形成模型来完成。
本文所使用的词组“抑制细胞周期蛋白D1”是指LIV-1介导的细胞周 期蛋白产生的抑制或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂 时的LIV-1介导的细胞周期蛋白产生，通过抑制剂可以使LIV-1介导的细 胞周期蛋白产生降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少 90％、至少95％、直至100％。细胞周期蛋白产生的比较可以通过以下方 法来完成：例如通过RT-PCR或RNA印迹法测量细胞周期蛋白mRNA水 平；通过免疫印迹、免疫沉淀或ELISA测量细胞周期蛋白多肽水平；或应 用功能测试法，包括例如应用靶向CDK、p21WAFl、p27KEP-1的抗体的 免疫共沉淀测试法以测量与细胞周期蛋白调节剂(诸如细胞周期蛋白依赖 性激酶(CDK’s))复合的细胞周期蛋白水平；以及测量通过CDK’s的细胞周 期蛋白的磷酸化，可以通过放射性标记和免疫沉淀分析或基于FRET的方 法，例如CDK2/细胞周期蛋白A测试试剂盒(Molecular Devices)来测试。
本文所使用的词组“抑制EGFR磷酸化”是指LIV-1介导的EGFR 磷酸化的抑制或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的 LIV-1介导的EGFR磷酸化，通过抑制剂可以使LIV-1介导的EGFR磷酸 化降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、 直至100％。EGFR磷酸化的比较可以通过本领域技术人员已知的磷酸化 测试法来确定。
本文所使用的词组“抑制肿瘤细胞存活”是指对表达LIV-1的癌细 胞存活的抑制。在一些实施方案中，该术语是指实现表达LIV-1的癌细胞 的凋亡。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的癌细胞存活和 /或在正常细胞中，通过抑制剂可以使表达LIV-1的癌细胞存活降低至少 25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直至100％。
本文所使用的词组“抑制整联蛋白介导的活性”是指对与整联蛋白相 关的活性的抑制或消失。整联蛋白介导的活性包括但不限于细胞粘附、趋 化性、增殖、存活和小管形成。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑 制剂时LIV-1介导的整联蛋白活性，通过抑制剂可以使LIV-1介导的整联 蛋白活性降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、 至少95％、直至100％。
本文所使用的词组“抑制纤连蛋白”是指对LIV-1介导的产生纤连蛋 白的抑制或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时LIV-1 介导的纤连蛋白产生，通过抑制剂可以使LIV-1介导的纤连蛋白产生降低 至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直 至100％。纤连蛋白产生的比较可以通过以下方法完成：例如通过RT-PCR 或RNA印迹法测量纤连蛋白mRNA水平；通过免疫印迹、免疫沉淀或 ELISA(例如，纤连蛋白ELISA试剂盒(AMERICAN DIAGNOSTICA))； 应用功能测试法以测量与纤连蛋白包被的底物的细胞粘附。例如，参见 InnoCyteTM ECM细胞粘附测试法，纤连蛋白(Calbiochem)和 QCMTM-FN[定量细胞迁移测试法-纤连蛋白(CHEMICON)]。
本文所使用的词组“抑制锌转运”是指对LIV-1介导的锌转运的抑制 或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时LIV-1介导的锌 转运，通过抑制剂可以使LIV-1介导的锌转运降低至少25％、至少50％、 至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直至100％。在一些实施 方案中，LIV-1抑制剂降低胞质锌水平。锌转运的比较和锌水平的确定可 以应用本领域技术人员已知的方法来完成，例如包括：测量到细胞或囊泡 内的65Zn摄入(参见，Kambe等，(2002)J.Biol.Chem.，277：19049-19055)； 或测量细胞通透的荧光锌指示剂Newport绿二乙酸盐(Molecular Probes) 的摄入。体液和细胞条件介质中的锌库例如可以按照Zalewski等阐述的讨 论来测量(BioTechniques，2006，第40卷，第4期：第509-520页)。
本文所使用的词组“抑制LIV-1信号传导”是指降低LIV-1对包括 LIV-1的细胞信号级联下游成员的影响。包括LIV-1的细胞信号级联尤其 包括SNAIL途径。在一些实施方案中，对LIV-1信号传导的抑制上调 SNAIL途径中的一个或多个上皮标记物。在一些实施方案中，对LIV-1信 号传导的抑制下调SNAIL途径中的一个或多个间充质标记物。在一些实施 方案中，上皮标记物和/或间充质标记物参与运动性和细胞存活。在一些实 施方案中，对LIV-1信号传导的调节调节了Stat3相关信号级联。在一些 实施方案中，Stat3相关信号级联的元件与SNAIL相关信号级联的元件不 同。对LIV-1信号传导的抑制可以通过测量细胞信号传导途径下游成员的 多肽或多核苷酸水平来确定。本领域技术人员具备测量LIV-1多肽和/或多 核苷酸水平能力。本领域技术人员也能够测量LIV-1下游标志物的水平。
本文所使用的词组“抑制细胞-细胞相互作用”是指减少或消除两个或 多个表达LIV-1的细胞之间的相互作用。在一些实施方案中，细胞之间的 相互作用导致细胞信号。细胞-细胞相互作用可以通过本领域技术人员已知 的多种方法检测，所述方法包括但不限于观察共培养的、例如用不同荧光 膜染料(包括PKH26和PKH67(Sigma))标记的预标记细胞之间的膜交换。
本文所使用的“LIV-1下游标志物”是指与其在正常或健康组织中的 表达水平相比较，在癌组织或癌细胞中表现出改变的表达水平的基因或活 性，或是在存在LIV-1调节剂的情况下改变的特性(例如，胞质锌水平)。 在一些实施方案中，当LIV-1受到本发明的LIV-1调节剂扰动时，下游标 志物表现出改变的表达水平。LIV-1下游标志物包括但不限于：细胞周期 蛋白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR、 SNAIL途径中的一个或多个基因、E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、Muc-1、 水闸蛋白(claudin)、封闭蛋白(occludin)、桥粒斑蛋白、胱天蛋白酶、 p21、p53、BID(bcl-相互作用死亡激动剂)、DFF40(DNA片段化因子)以及 细胞角蛋白。如上面所讨论的那样，在一些实施方案中，LIV-1下游标志 物是Stat3途径的基因。
本文所使用的术语“上调”是指活性或量的增加、激活或刺激。例如， 在本发明的上下文中，Liv-1调节剂可以增加E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋 白、Muc-1、水闸蛋白、封闭蛋白、桥粒斑蛋白、胱天蛋白酶、p21、p53、 BID(bcl-相互作用死亡激动剂)、DFF40(DNA片段化因子)以及细胞角蛋白 之中的一种或多种。与对照相比，上调可以是至少25％、至少50％、至少 75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少400％、 或至少500％。
本文所使用的术语“N-端”是指蛋白质的最前的10个氨基酸。
本文所使用的术语“C-端”是指蛋白质的最后的10个氨基酸。
本文所使用的术语“结构域”是指有对生物分子已知或猜想的功能有 贡献的生物分子的结构部分。结构域可以与其区域或部分共延伸 (co-extensive)，以及除了特定区域的全部或部分外也可以还包含与特定 区域不同的生物分子的部分。
本文所使用的术语“细胞外结构域”是指分子在细胞外部或外边的部 分。在本发明的上下文中，N-端细胞外结构域是指存在于紧接在第一个跨 膜结构域之前的分子N-端的细胞外结构域。在两个跨膜(TM)结构域之间， 例如在TM 2和3之间的细胞外结构域的上下文中，细胞外结构域是指在 LIV-1第二和第三跨膜结构域之间的在细胞膜外的LIV-1的部分。
本文所使用的术语“配体结合结构域”是指至少保留了一种相应LIV-1 天然序列定性结合活性的受体的任何部分或区域。
术语“区域”是指生物分子一级结构的物理连续部分。在蛋白质的情 况下，区域是通过蛋白质氨基酸序列的连续部分来定义的，在一些实施方 案中，“区域”与生物分子的功能相关。
本文所使用的术语“片段”是指生物分子一级结构的物理连续部分。 在蛋白质的情况下，部分是通过蛋白质氨基酸序列的连续部分来定义的， 并且指至少3-5个氨基酸、至少8-10个氨基酸、至少11-15个氨基酸、至 少17-24个氨基酸、至少25-30个氨基酸、至少30-45个氨基酸。在寡核苷 酸的情况下，部分是通过寡核苷酸的核酸序列的连续部分来定义的，并且 指至少9-15个核苷酸、至少18-30个核苷酸、至少33-45个核苷酸、至少 48-72个核苷酸、至少75-90个核苷酸、至少90-130个核苷酸。在一些实 施方案中，生物分子的部分具有生物学活性。在本发明的上下文中，LIV-1 多肽片段不包含如SEQ ID NO：2所示的全长LIV-1多肽序列。
本文所使用的词组“LIV-1相关细胞/肿瘤/样本”等是指其特征是相对 于非癌性和/或非转移细胞、样本、肿瘤或其它病变而言，LIV-1差异表达 的细胞、样本、肿瘤或其它病变。在一些实施方案中，LIV-1相关细胞、 样本、肿瘤或其它病变的特征是相对于非转移细胞、样本、肿瘤或其它病 变而言LIV-1表达的升高证据。
本文所使用的术语“抗体”是指对靶标蛋白或其片段特异的单克隆和 多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双功能/双特异性抗体、人源化抗体、 人类抗体、以及互补决定区移植抗体。术语“抗体”还包括体内治疗的抗 体基因转移。本发明也提供了包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和Fv的抗 体片段。
本文所使用的术语“表位”是指多肽的抗原决定簇。在一些实施方案 中，表位可以包含3个或更多氨基酸，所述氨基酸位于对表位唯一的空间 构象中的。在一些实施方案中，表位是线性的或构象的表位。表位通常由 至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、以及至少12个此类氨基酸 组成，或更通常由至少8-10个此类氨基酸组成。确定氨基酸空间构象的方 法在本领域是已知的，例如包括X射线晶体学和2维核磁共振。
本文所使用的术语“寡核苷酸”是指一系列连接的核苷酸残基。寡核 苷酸包括但不限于反义和siRNA寡核苷酸。寡核苷酸包含DNA序列的部 分，并且具有至少约10个核苷酸以及多达约500个核苷酸。在一些实施方 案中，寡核苷酸包含约10至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、以 及约20至约25个核苷酸。寡核苷酸可以化学合成并且能够被用作探针。 在一些实施方案中，寡核苷酸是单链的。在一些实施方案中，寡核苷酸至 少包含是双链的一部分。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸 (ASO)。在一些实施方案中，寡核苷酸是RNAi寡核苷酸、siRNAs或 shRNAs。
本文所使用的术语“反义寡核苷酸”具有与LIV-1多核苷酸序列互补 的核苷酸序列的未经修饰或经修饰的核酸，所述LIV-1多核苷酸序列包括 与LIV-1转录或翻译相关的多核苷酸序列(例如，LIV-1多核苷酸的启动 子)，其中反义多核苷酸能够杂交至LIV-1多核苷酸序列。特别感兴趣的是 能够在体外或体内抑制编码LIV-1多肽的多核苷酸转录和/或翻译的反义 多核苷酸。
本文所使用的术语“siRNA寡核苷酸”、“RNAi寡核苷酸”、“短 干扰RNA”、或“siRNA”可互换使用，是指通过转录后基因沉默、也被 称为RNA干扰(RNAi)而起作用的寡核苷酸。该术语是指能够RNA干扰 “RNAi”的双链核酸分子(参见Kreutze等，WO 00/44895；Zernicka-Goetz 等WO 01/36646；Fire，WO 99/32619；Mello和Fire，WO 01/29058)。 SiRNA分子通常是RNA分子但进一步包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。 SiRNA基因靶向实验通过将siRNA瞬时转染至细胞(通过如脂质体介导转 染、电穿孔或微注射等此类经典方法实现)进行。SiRNA分子是21至23 个核苷酸的RNA，具有特征性的类似于长双链RNA(dsRNAs)的RNase III 加工产物的2至3个核苷酸3’突出端，其通常启始RNAi。
有效利用siRNA途径来介导基因沉默部分地取决于siRNA细胞内递 送的有效方法。siRNA分子在细胞内倾向于是短命的，不容易递送至难以 转染的细胞类型，并且通过化学合成生产相对昂贵(Jacks等，(2005) Biotechniques 39：215-224；Bernards等，(2006)Nature Methods 3： 701-706)。
有效细胞内递送siRNA的一种方法是应用短发夹RNA，或“shRNAs”。 shRNAs是单链RNA分子，其包括由非互补区域连接的两条互补序列。在 体内，互补序列退火以产生在一个末端具有非配对环的双链螺旋。得到的 棒棒糖状形状的结构称为茎环并且可以被RNAi机制识别并在细胞内加工 为具有类似siRNA特性的短双螺旋RNA。
shRNA可以通过从已插入到合适载体的DNA模板转录而在细胞内合 成。有用的shRNA一般是50-70个核苷酸长、具有通过5-10个核苷酸环 分隔的两条19-29个核苷酸的互补序列。shRNA构建体一般通过以下三种 方法之一产生：互补寡核苷酸退火；基于启动子的聚合酶链式反应(PCR)； 或引物延伸。许多载体系统应用RNA Pol III启动子，Pol III介导的转录 是有利的，因为其在定义明确的起始位点开始、产生不含poly(A)的转录 本，并且Pol III启动子在所有细胞类型中都是有效的(Brummelkamp等， (2002)Science 296：550-553；Mclntyre，G.和Fanning，G.(2006)BMC Biotechnology 6：1-8)。
编码shRNA的载体系统提供了基因沉默试剂的可再生细胞内来源， 这可以在将载体稳定整合至宿主基因组后介导持续的基因沉默。此外，能 很容易地将shRNA盒插入逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体以方便将 shRNA递送至宽范围的细胞类型中，所述细胞类型包括非分裂的原代培养 物。可调节的shRNA载体形式对遗传筛选是特别有用的。
本文所使用的术语“诱饵”(decoy)是指至少包含能够结合锌或锌载 体的一部分LIV-1多肽的多肽。在一些实施方案中，诱饵能够结合与锌复 合的锌载体。在一些实施方案中，诱饵结合未与锌复合的锌载体。
本文所使用的术语“治疗有效量”是指产生药用效果的药物量，所述 药用效果是指当将治疗有效量的药物施与个体后，观察到的个体中一种或 多种临床端点、癌细胞生长和/或存活、或癌细胞转移的减少或逆转。治疗 有效量一般通过与当用不包含活性成分的组合物施与类似处境个体时观察 到的效果相比较的效果来确定。对于受试者精确的治疗有效量将取决于受 试者的大小和健康、疾病的性质和程度、以及选择施与的治疗或治疗组合。 然而，对于给定情况的有效量可通过常规实验确定并且在临床医生的判断 范围内。
本文所使用的术语“联合”或“联用”是指本发明的LIV-1调节剂和 其它治疗方案一起施与。
本文所使用的术语“敏感的”是指对于其来说LIV-1治疗是可接受的 治疗方法的患者，即很可能有阳性反应的患者。对LIV-1治疗敏感的癌症 患者相对于对LIV-1治疗不敏感的那些患者表达高水平的LIV-1。对LIV-1 治疗来说不是好候选者的癌症患者包括具有这样肿瘤样本的癌症患者，所 述肿瘤样本在它们的肿瘤细胞中或肿瘤细胞上缺乏或具有较低水平的 LIV-1。
本文所使用的术语“检测”是指确立、发现或确认活性(例如，基因表 达)或生物分子(例如，多肽)的证据。
本文所使用的词组“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变 体是指特征在于在核苷酸水平或氨基酸水平至少特定百分数同源的序列， 并且与“序列同一性”可互相使用。同源核苷酸序列包括编码蛋白同种型 的那些序列。此类同种型可以例如作为RNA选择性剪接的结果在相同机 体的不同组织中表达。或者，同种型可以由不同的基因编码。同源核苷酸 序列包括编码除人类之外其它物种的蛋白的核酸序列，所述物种包括但不 限于哺乳动物。同源核苷酸序列还包括但不限于本文中阐明的核苷酸序列 的天然存在的等位变体和突变体。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸替 换以及其多肽具有相同结合和/或活性的那些氨基酸序列。
同源或同一性百分比例如可以通过Gap程序(Wisconsin序列分析软件 包，用于UNIX的第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，Madispn WI)、应用缺省设置来确定，所述程序应用了Smith和 Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。在一些实施方案 中，探针和靶标之间的同源性在约50％至约60％之间。在一些实施方案中， 核酸具有与SEQ ID NO：1或其部分约60％、约70％、约80％、约85％、 约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约98％、约99％以及约 100％同源的核苷酸。本发明还提供了SEQ ID NO：1的完全互补序列的部 分，或它的同源物。
同源性也可以是在多肽水平上的。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO：2或其部分约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、 约94％、约95％、约97％、约98％、约99％以及约100％的同源。
本文所使用的术语“探针”是指可变长度的核酸序列。在一些实施方 案中，探针包含至少约10个以及多至约6,000个核苷酸。在一些实施方案 中，探针包含至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少25、至 少50或至少75个连续的核苷酸。探针用于检测同一的、类似的或互补的 核酸序列。较长的探针通常从天然或重组来源得到、对靶序列高度特异、 以及比寡聚物慢得多地与靶标杂交。探针可以是单链或双链，并经过设计 从而在PCR、基于膜的杂交、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)或类 似ELISA的技术中具有特异性。
本文所使用的术语“混合”是指将一种或多种化合物、细胞、分子等 在同一区域中结合在一起的过程。这例如可以在试管、培养皿或其它允许 一种或多种化合物、细胞或分子混合的容器中进行。
本文所使用的术语“分离的”是指处于与多核苷酸、多肽或抗体天然 存在的环境不同的环境当中的多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞。分离细 胞的方法对本领域技术人员是已知的。分离的多核苷酸、多肽、抗体通常 是基本上纯的。
本文所使用的术语“基本上纯的”是指从其天然环境中分离并至少 60％、至少75％、至少90％没有其它与之天然联系的成分搀杂的化合物(例 如，多核苷酸或多肽或抗体)。
本文所使用的术语“结合”意思是两个或多个生物分子或化合物之间 的物理或化学相互作用。结合包括离子键、非离子键、氢键、范德华力(Van der Waals)、疏水相互作用等。结合可以是直接的或间接的，间接是通过 或由于另一个生物分子或化合物的作用。直接结合是指不通过或由于另一 个分子或化合物的作用而是在没有其它实体的化学媒介物下发生的相互作 用。
本文所使用的术语“接触”是指直接或间接地将一个分子带到一起与 第二个分子物理上接近。分子可以在任意数量的缓冲液、盐、溶液等之中。 “接触”例如包括将多核苷酸置于含有核酸分子的烧杯、微量滴定板、细 胞培养瓶或微阵列等中。接触例如还包括将抗体置于含有多肽的烧杯、微 量滴定板、细胞培养瓶或微阵列等中。接触可以发生在体内(in vivo)、 间接体内(ex vivo)或体外(in vitro)。
本文所使用的词组“严格的杂交条件”或“严格条件”是指这样的条 件，在所述条件下，探针、引物或寡核苷酸能够与它的靶标序列杂交，但 是与最小数量的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的 环境下会不同。更长的序列会在更高的温度与它们适当的互补链特异杂交。 通常，在规定的离子强度和pH下对于特定序列的严格条件选择比热熔解 点(Tm)低约5℃。Tm是这样的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度 下)，在该温度中在平衡状态下50％与靶标序列互补的探针与靶标序列杂 交。由于靶标序列通常过量存在，在Tm，在平衡状态下50％的探针与它 们的互补序列杂交。一般地，严格条件是这些条件：其中盐浓度小于约1.0 M钠离子、一般地约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)；pH7.0至8.3；以及 对于短探针、引物或寡核苷酸(例如10至50个核苷酸)而言温度至少约 30℃、及对于更长的探针、引物或寡核苷酸而言温度至少约60℃。严格条 件也可以通过添加去稳定剂，诸如甲酰胺而实现。
本文所使用的术语“中等严格条件”是指这样的条件，在这种条件下 探针、引物或寡核苷酸能够与它的靶标序列杂交，但是与有限数量的其它 序列杂交。中等条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下会不同。中等 条件是本领域技术人员已知的并尤其描述于Manitatis等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory；第二版 (1989年12月))。
本文所描述的核酸组合物例如可被用于产生多肽、作为用于检测生物 样本(例如人类细胞提取物)中mRNA或从此类样本中产生的cDNA的探 针、产生寡核苷酸的另外的拷贝、产生核酶或寡核苷酸(单链或双链)、以 及作为单链DNA探针或作为形成三链的寡核苷酸。本文描述的探针例如 可以用于确定样本中本文所提供的寡核苷酸的存在或不存在。多肽可以用 于产生对与癌症相关的多肽特异的抗体，其抗体又可用于如本文中更详细 讨论的诊断方法、预后方法等。多肽也可以用于作为治疗干预的靶标，如 本文更详细讨论的那样。本发明的抗体例如也可以用于纯化、检测和靶向 本发明的多肽，包括体外和体内诊断和治疗方法。例如，抗体在用于定性 和定量测量生物样本中本发明多肽水平的免疫分析中是有用的。例如参见 Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版1988)。这些和其它用途将在以下更详细地描述。
本文所使用的术语“显像剂”是指能用本领域技术人员已知的方法检 测的连接至本发明的抗体、小分子或探针上的组合物。本文所使用的术语 “基因表达的证据”是指基因表达了的任何可检测的指标。
术语“可药用载体”是指用于施用治疗剂，诸如抗体或多肽、基因和 其它治疗剂的载体。该术语是指其本身不会诱导产生对接受组合物的个体 有害的抗体且可以施与而没有过度毒性的任何药学载体。合适的载体可以 是大的、代谢缓慢的大分子，诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合 氨基酸、氨基酸共聚物、脂聚集体、失活的病毒颗粒。此类载体是本领域 普通技术人员公知的。治疗组合物中可药用载体包括液体，诸如水、盐水、 甘油或乙醇。辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可以存在 于此类载体中。
可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的特定例子包括但不限于 LIV-1相关癌症。本文所使用的术语“LIV-1相关癌症”是指特征是其细 胞相对于非癌性细胞差异表达LIV-1的癌症。本发明也可以应用于其中 LIV-1在癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、 血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1介导的细胞-细胞粘附、细胞-细胞相互 作用、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质 相互作用、整联蛋白介导的活性、LIV-1表面表达、LIV-1介导的细胞-细 胞外基质降解、Snail核定位以及LIV-1表达中起着作用的任何的肿瘤细胞 类型。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、皮肤癌、食管癌、肝癌、胰腺 癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓 瘤和黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是ER阳性乳腺癌。在一些实施方 案中，癌症是ER阴性乳腺癌。在一些实施方案中，此类癌症展现出与对 照相比至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约 150％、至少约200％或至少约300％的LTV-I差异表达。
本发明提供了用于治疗、抑制和管理与LIV-1过量表达相关的疾病和 病症以及治疗、抑制和管理此类疾病和病症的症状的方法和组合物。本发 明的一些实施方案涉及包含治疗、抑制和管理癌症的组合物的方法和组合 物，所述癌症包括但不限于癌转移、癌细胞增殖、癌细胞生长和癌细胞侵 袭。
本发明还提供了包括与本发明LIV-1调节剂联合的其它活性组分的方 法。在一些实施方案中，该方法还包括给患者施与一种或多种常规癌治疗。 在一些实施方案中，本发明的方法还包括用化学治疗、放射治疗或外科手 术中的一种或多种治疗患者。
本法还提供了用于治疗、抑制和管理癌症或其它超增殖的细胞病症或 疾病的方法和组合物，所述癌症或其它超增殖的细胞病症或疾病已变得部 分或完全地耐受当前的或标准癌症治疗，诸如外科手术、化学治疗、放射 治疗、激素治疗和生物学治疗。
本发明也提供了应用本发明的LIV-1调节剂、特别是LIV-1抗体以诊 断癌症和/或预测癌症进程的诊断和/或成像方法。在一些实施方案中，本发 明的方法提供成像和定位肿瘤和/或转移灶的方法以及诊断和预后的方法。 在一些实施方案中，本发明的方法提供了评价LIV-1相关治疗适当性的方 法。
LIV-1调节剂
本发明提供了LIV-1调节剂，尤其用于癌症治疗、诊断、检测或成像。 LIV-1调节剂也可用于制备治疗癌症的药物。
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是寡核苷酸、小分子、模拟物、诱 饵或抗体。在一些实施方案中，与对照相比，LIV-1调节剂使LIV-1生物 活性被抑制了25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、 98％、99％或100％。在一些实施方案中，与对照相比，LIV-1调节剂使 LIV-1表达被抑制了至少25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、 95％、97％、98％、99％或100％。
抗体
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合 抗体、人类抗体、人源化抗体、单链抗体、或Fab片段。抗体例如可以用 酶、同位素或荧光团标记。在一些实施方案中，抗体具有对除LIV-1之外 的多肽小于约1×105Ka的结合亲和力。在一些实施方案中，LIV-1调节 剂是以至少1×108Ka的亲和力结合至LIV-1的单克隆抗体。
本发明也提供了抗体，所述抗体竞争性地抑制抗体与本发明的表位的 结合，如通过例如应用免疫分析的用于确定竞争性抑制的任何本领域已知 方法确定的那样。在一些实施方案中，抗体对至表位的结合而言，竞争性 抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、 至少60％或至少50％。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可以通过各种方 法得到，所述方法例如包括：(1)将非人类互补决定区(CDRs)移植至人类构 架和恒定区(本领域称为“人源化”的方法)，或者备选地(2)移植整个非人 类可变区，但是通过表面残基替换用人类样表面“遮掩”它们(本领域称为 “镶饰(veneering)”的方法)。在本发明中，人源化抗体将包括“人源化” 和“镶饰”抗体。类似地，人类抗体可以通过将人类免疫球蛋白基因座引 入其中内源免疫球蛋白基因已部分或全部失活的转基因动物例如小鼠中而 得以制备。攻击后，观察到了人类抗体的产生，其在包括基因重排、组装 和抗体库等的所有方面都非常类似于在人类中所观察到的。这一方法例如 描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、 5,661,016，以及以下科学出版物中：Marks等，Bio/Technology 10，779-783 (1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature，368， 812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)； Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar， Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；Jones等，Nature 321：522-525 (1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，81：6851-6855(1984)； Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyer等，Science， 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan， Molec.Immunol.31(3)：169-217(1994)；以及Kettleborough，CA.等，Protein Eng.4(7)：773-83(1991)，其中的每一个都在此引入作为参考。
本发明的抗体可以通过不同的机制工作。在一些实施方案中，抗体触 发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，细胞溶解作用攻击抗体靶向的细胞。在一 些实施方案中，抗体具有多重治疗功能，例如包括抗原结合、诱导凋亡以 及补体依赖的细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以作为本发明多肽的激动剂或拮 抗剂。例如，在一些实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体部分或完 全地破坏受体/配体与本发明多肽的相互作用。在一些实施方案中，本发明 的抗体结合本文公开的表位，或其部分。在一些实施方案中，提供了抗体， 与不存在抗体的情况下相比，所述抗体调节配体活性或受体活性至少 95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少 60％或至少50％。
在一些实施方案中，LIV-1抗体抑制Snail途径和/或抑制细胞周期蛋 白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR和 EGFR磷酸化中的一个或多个。在一些实施方案中，LIV-1抗体抑制整联 蛋白介导的活性。在一些实施方案中，LIV-1抗体抑制Snail核定位。
在一些实施方案中，LIV-1抗体上调E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、 Muc-1、水闸蛋白、封闭蛋白、桥粒斑蛋白、胱天蛋白酶、p21、p53、BID(bcl- 相互作用死亡激动剂)、DFF40(DNA片段化因子)以及细胞角蛋白中的一 个或多个。在一些实施方案中，LIV-1抗体下调Snail途径中的一个或多个 间充质标记物。
在一些实施方案中，本发明提供了中和抗体。在一些实施方案中，中 和抗体作为受体拮抗剂，即抑制配体介导的受体活化的生物活性的全部或 其子集。在一些实施方案中，可以将抗体描述为生物学活性的激动剂、拮 抗剂或反向激动剂，所述生物学活性包含本文所公开发明多肽的特定生物 学活性。
本发明的抗体可以单独使用或与其它组合物联合使用。抗体可以进一 步在N-或C-端重组融合至异源多肽或化学缀合(包括共价或非共价缀合) 至多肽或其它组合物上。例如，本发明的抗体可以重组融合或缀合至在检 测分析中用于作为标签的分子或诸如异源多肽、药物、放射性核素或毒素 的效应分子上。例如，参见PCT公开WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624；美国专利号5,314,995；以及EP 396,387。
除了嵌合抗体和人源化抗体之外，完全的人类抗体也可以从具有人类 免疫球蛋白基因的转基因小鼠(例如，参见美国专利号6,075,181、6,091,001 和6,114,598，其全部在此引入作为参考)、或从人类免疫球蛋白基因的噬 菌体展示文库中(例如，参见McCafferty等，Nature，348：552-554(1990). Clackson等，Nature，352：624-628(1991)，以及Marks等，J.Mol.Biol.， 222：581-597(19911))得到。
可以应用Kohler等(1975，Nature 256：495-496)的方法或其修改方法制 备单克隆抗体。一般地，用含有抗原的溶液免疫小鼠。免疫可以通过在盐 水、优选在佐剂诸如弗氏完全佐剂中混合或乳化含有抗原的溶液，以及肠 胃外注射混合物或乳剂而完成。可用本领域已知的任何免疫方法获得本发 明的单克隆抗体。在动物免疫之后，分离脾脏(以及任选地，数个大淋巴结) 并将其解离为单个细胞。可以通过将细胞悬浮液应用至包被有感兴趣抗原 的板或孔中来筛选脾脏细胞。表达对抗原特异的膜结合免疫球蛋白的B细 胞结合至板上并不会被漂洗走。然后诱导所得到的B细胞或所有离解的脾 脏细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并在选择培养基中培养。通过系 列或有限稀释平板接种所得到的细胞，并且分析特异性结合感兴趣抗原(并 且不结合非相关抗原)的抗体的产生。然后在体外(例如在组织培养瓶或中 空纤维反应器中)或体内(如小鼠中的腹水)培养所选择的分泌单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤。
作为对应用杂交瘤用于表达的备选，可以在细胞系，诸如CHO或骨 髓瘤细胞系中产生抗体，如在美国专利号5,545,403、5,545,405和5,998,144 公开的那样，其中上述每一个专利均在此引入作为参考。简而言之，分别 用能够表达轻链和重链的载体转染细胞系。通过转染在分开的载体上的两 个蛋白，可以产生嵌合抗体。Immunol.147：8；Banchereau等(1991)Clin. Immunol.Spectrum 3：8；以及Banchereau等(1991)Science 251：70，其全 部在此引入作为参考。
也可以通过应用本领域已知的技术，包括噬菌体展示文库 [Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol. Biol.，222：581(1991)]来制备人类抗体。也可以利用Cole等和Boerner等的 方法制备人类单克隆抗体[Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)以及Boerner等，J.Immunol.， 147(1)：8695(1991)]。人源化抗体可以通过各种方法得到，所述方法例如包 括(1)将非人类互补决定区(CDRs)移植至人类构架和恒定区(本领域称为 “人源化”的方法)，或者备选地(2)移植整个非人类可变结构域，但是通过 表面残基替换用人类样表面“遮掩”它们(本领域称为“镶饰”的方法)。 在本发明中，人源化抗体将包括“人源化”和“镶饰”抗体。类似地，人 类抗体可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入其中内源免疫球蛋白基因已 部分或全部失活的转基因动物如小鼠中而制备。攻击后，观察到了人类抗 体的产生，其在包括基因重排、组装和抗体谱的所有方面都非常类似于在 人类中所观察到的。这一方法例如描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、 5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016，以及以下科学出版物中：Marks 等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859 (1994)；Morrison，Nature，368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826 (1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；Jones 等，Nature 321：522-525(1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.， 81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)； Verhoeyer等，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun. 28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169-217(1994)；以及 Kettleborough，CA.等，Protein Eng.4(7)：773-83(1991)，其中的每一个都在 此引入作为参考。
词组“互补决定区”是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv 区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。例如参见，Chothia等，J.Mol. Biol.196：901-917(1987)；Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services NEH Publication No.91-3242(1991)。词组“恒定区”是指赋予效 应子功能的抗体分子的部分。在本发明中，用人类恒定区替换了小鼠恒定 区。对象人源化抗体的恒定区衍生自人类免疫球蛋白。重链恒定区可以选 自任意的以下5种同种型：α、δ、ε、γ、μ。人源化抗体的一种方法包括将 非人类重链和轻链序列与人类重链和轻链序列进行比对，基于该比对选择 并用人类构架替换非人类构架，分子建模以预测人源化序列的构象并与亲 本抗体的构象相比较。这一方法之后，反复回复突变妨碍CDRs结构的CDR 区残基，直到人源化序列模型的预测构象密切接近亲本非人类抗体的非人 类CDRs的构象。可以进一步衍生此类人源化抗体以促进摄入和例如通过 Ashwell受体的清除。例如参见美国专利号5,530,101和5,585,089，其在此 引入作为参考。
人源化抗体也可以用经基因工程改造含有人类免疫球蛋白基因座的转 基因动物来生产。例如，WO 98/24893公开了具有人类Ig基因座的转基因 动物，其中该动物由于内源重链和轻链基因座的失活而不产生有功能的内 源免疫球蛋白。WO 91/10741也公开了能够对免疫原产生免疫反应的转基 因非灵长类哺乳动物宿主，其中抗体具有灵长类的恒定和/或可变区，且其 中编码内源免疫球蛋白的基因座被替换或失活了。WO 96/30498公开了用 Cre/Lox系统修饰哺乳动物中免疫球蛋白基因座的应用，诸如替换恒定或 可变区的全部或部分以形成经修饰的抗体分子。WO 94/02602公开了具有 失活的内源Ig基因座和有功能的人类Ig基因座的非人类哺乳动物宿主。 美国专利号5,939,598公开了制备转基因小鼠的方法，其中小鼠缺乏内源重 链并且表达包含一个或多个异种恒定区的异源免疫球蛋白基因座。本发明 的抗体也可以应用如在美国专利5,766,886中所讨论的人类基因工程技术 得以制备，其在此引入作为参考。
应用以上描述的转基因动物，可以产生对所选择的抗原分子的免疫反 应，以及可以从动物中分离产生抗体的细胞并且用于产生分泌人类单克隆 抗体的杂交瘤。免疫方案、佐剂等是本领域已知的，并且例如用于如WO 96/33735描述的转基因小鼠的免疫。可对单克隆抗体进行抑制或中和相应 蛋白生物学活性或生理学作用的能力测试。
本发明的抗体可以通过如Fang等((2005)，Nat.Biotechnol.23，584-590) 所讨论的体内治疗性抗体基因转移而施与给受试者。例如可以产生重组载 体以递送多顺反子表达盒，所述表达盒包含介导位于MAb重链和轻链编 码序列之间多肽的不依赖酶的共翻译自切割的肽。表达产生化学计量量的 两个MAb链。介导不依赖酶的共翻译自切割的肽的优选示例是衍生自口 蹄疫的2A肽。
抗体片段适合用于本发明的方法，只要它们保留了全长抗体的期望亲 和力。因此，抗LIV-1抗体片段将保留结合至LIV-1的能力。此类片段的 特征在于与相应的全长抗LIV-1抗体类似的特性，即片段特异性地结合在 人类细胞表面上表达的人类LIV-1抗原。
在一些实施方案中，抗体结合LIV-1细胞外结构域上的一个或多个表 位。在一些实施方案中，抗体调节一个或多个LIV-1相关的生物学活性。 在一些实施方案中，抗体抑制癌细胞生长、肿瘤形成和癌细胞增殖中的一 个或多个。
在一些实施方案中，抗体是结合至选自以下的结构域中的一个或多个 LIV-1表位的单克隆抗体：LIV-1的N端细胞外结构域、跨膜结构域(TM)2 和3之间的LIV-1细胞外结构域、TM 4和5之间的LIV-1细胞外结构域、 TM 6和7之间的LIV-1细胞外结构域以及LIV-1的C端细胞外结构域。
在一些实施方案中，单克隆抗体结合至TM 2和3之间的LIV-1细胞 外结构域中的LIV-1表位。在一些实施方案中，单克隆抗体结合至SEQ ID NO：388的一个或多个表位。
在一些实施方案中，抗体单克隆抗体结合至LIV-1N端细胞外结构域 中的LIV-1表位。在一些实施方案中，单克隆抗体结合至SEQ ID NO：387 的一个或多个表位。
根据本发明的合适的抗体能够识别线性或构象型的表位，或其组合。 在一些实施方案中，本发明的抗体结合至选自SEQ ID NO：3-6的LIV-1抗 原区域的表位。在一些实施方案中，抗体对具有选自SEQ ID NO：3-360的 序列的表位是特异的。在一些实施方案中，抗体对具有选自SEQ ID NO：361-364或387-391的序列的表位是特异的。应当理解，这些肽可以不 需要精确的绘制表位，而是也可以含有非免疫原性的LIV-1序列。
预测其它本发明抗体可以与其结合的潜在表位的方法对于本领域技术 人员来说是公知的，包括但不限于Kyte-Doolittle分析(Kyte，J.和Dolittle， R.F.，J.Mol.Biol.(1982)157：105-132)、Hopp和Woods分析(Hopp，T.P. 和Woods，K.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78：3824-3828；Hopp，TJ. 和Woods，K.R.，Mol.Immunol.(1983)20：483-489；Hopp，TJ.，J.Immunol. Methods(1986)88：1-18.)、Jameson-Wolf分析(Jameson，B.A.和Wolf，H.， Comput.Appl.Biosci.(1988)4：181-186.)和Emini分析(Emini，E.A.， Schlief，W.A.，Colonno，RJ.和Wimmer，E.，Virology(1985)140：13-20.)。
如果抗体满足以下条件则被定义为“特异性结合”：1)它们表现出阈 水平的结合活性，和/或2)它们不与已知相关多肽分子显著地交叉反应。抗 体的结合亲和力可以通过本领域普通技术人员很容易地确定，例如，通过 Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)。在一些 实施方案中，本发明的抗体结合至它们的靶标表位或模拟诱饵，对靶标癌 相关多肽比对其它ZIP(Zrt-、Irt-样蛋白)锌转运蛋白的已知成员高至少1.5 倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。
在一些实施方案中，抗体以10-4M或更少、10-7M或更少、10-9M或更 少的高亲和力，或以亚纳摩级亲和力(0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、 0.2、0.1nM或甚至更低)结合。在一些实施方案中，抗体对LIV-1的结合 亲和力至少是1×106Ka。在一些实施方案中，抗体对LIV-1的结合亲和 力是至少5×106Ka、至少1×107Ka、至少2×107Ka、至少1×108Ka， 或更高。本发明的抗体也可以根据它们对本发明多肽的结合亲和力来描述 或说明。在一些实施方案中，结合亲和力包括Kd小于5×10-2M、10-2M、 5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、 10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10 M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、 5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M或更低的那些。
在一些实施方案中，例如，如果应用标准蛋白质印迹分析(Ausubel等) 本发明的抗体结合LIV-1多肽而不是已知相关多肽，则本发明的抗体不结 合至已知的相关多肽分子。已知相关多肽的例子包括但不限于ZIP(Zrt-， Irt-样蛋白)锌转运蛋白家族的其它成员等，包括但不限于SEQ ID NO：365、 SEQ ID NO：366和SEQ ID NO：386。
在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1或锌转运蛋白多肽的 直向同源物(orthologs)、同源物、旁系同源物(paralogs)或变体、或其组合 和亚组合。在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1或锌转运蛋白 多肽的直向同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1或锌 转运蛋白多肽的同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1 或锌转运蛋白多肽的旁系同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合 至LIV-1或锌转运蛋白多肽的变体。在一些实施方案中，本发明的抗体不 结合至LIV-1或锌转运蛋白多肽的直向同源物、同源物、旁系同源物或变 体、或其组合和亚组合。
在一些实施方案中，可以针对已知相关多肽筛选抗体以分离特异结合 至LIV-1多肽的抗体群。例如，在合适的缓冲条件下使对人类LIV-1多肽 特异的抗体流过包含附着在不可溶基质的ZIP(Zrt-，Irt-样蛋白)锌转运蛋 白(除LIV-1之外)的柱。此类筛选允许分离不与密切相关多肽交叉反应的 多克隆和单克隆抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane (编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988、Current Protocols in Immunology，Cooligan等(编辑)，National Institutes of Health，John Wiley 和Sons，Inc.，1995)。特定抗体的筛选和分离在本领域是公知的(参见， Fundamental Immunology，Paul(编辑)，Raven Press，1993、Getzoff等， Adv.in Immunol.43：1-98，1988、Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Goding，J.W.(编辑)，Academic Press Ltd.，1996、Benjamin等， Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984)。此类分析的代表性例子包括：并行 免疫电泳、放射免疫分析(RIA)、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附分析 (ELISA)、点印迹或蛋白质印迹分析、抑制或竞争分析以及三明治分析法。
在一些实施方案中，本发明的抗体不特异性的结合至SEQ ID NO： 365、SEQ ID NO：366或SEQ ID NO：386。在一些实施方案中，本发明的 抗体不特异性地结合至由SEQ ID NO：386的125-138位残基、SEQ ID NO：386的252-265位残基或SEQ ID NO：386的418-431位残基组成的表 位。在一些实施方案中，抗体不与ZnT1或Zip1交叉反应。
本发明也提供是SMIPs或对靶标蛋白特异的结合结构域免疫球蛋白 融合蛋白的抗体。这些构建物是包含融合至免疫球蛋白实施抗体效应子功 能所必需结构域的抗原结合结构域的单链多肽。例如参见WO03/041600、 美国专利公开20030133939和美国专利公开20030118592。
在一些实施方案中，本发明的抗体是中和抗体。在一些实施方案中， 抗体是靶向抗体，在一些实施方案中，抗体在结合靶标后被内在化。在一 些实施方案中，抗体在结合靶标后不被内在化而是保留在表面。
可以针对结合至所讨论的肿瘤细胞抗原后迅速内在化的能力或针对在 结合后留在细胞表面的能力筛选本发明的抗体。在一些实施方案中，例如 在一些类型的免疫缀合物构建物中，如果需要内在化以释放毒素部分的话， 抗体被内在化的能力是所期望的。或者，如果将抗体用于提高ADCC或 CDC，更期望抗体保留在细胞表面。可以应用筛选方法区分这些类型的表 现。例如，可以利用拥有肿瘤细胞抗原的细胞，其中将细胞与人类IgGl(对 照抗体)或本发明抗体之一以大约1μg/mL的浓度在冰上(具有0.1％叠氮化 钠以阻止内在化)或在37℃(没有叠氮化钠)孵育3小时。然后用冷的染色缓 冲液(PBS+1％BSA+0.1％叠氮化钠)洗涤细胞，并用山羊抗人IgG-FITC 在冰上染色30分钟。通过FACS Calibur记录几何平均荧光强度(MFI)。 如果在与本发明抗体冰上于存在叠氮化钠的情况下孵育的细胞和在37℃ 不存在叠氮化钠的情况下观察的细胞之间没有观察到MFI的差别，则认为 该抗体是保持结合在细胞表面而不被内在化的抗体。然而如果发现当细胞 在37℃不存在叠氮化钠的情况下孵育时，在表面的可染色的抗体减少了， 则认为该抗体是能够内在化的抗体。
抗体缀合物
在一些实施方案中，本发明的抗体是缀合的。在一些实施方案中，缀 合的抗体可以用于癌症治疗、癌症诊断或癌性细胞成像。
对用于诊断应用，一般用可检测部分标记抗体。可利用很多标签，这 些标签通常可以分为以下类型：
(a)放射性核素，诸如以下所讨论的那些。例如，可以用放射性同位 素应用例如描述于Current Protocols in Immunology，卷1和2，Coligen等 编辑.Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)的技术标记抗体， 并可以用闪铄计数法测量放射性。
(b)荧光标签，诸如可以利用稀土元素螯合物(铕螯合物)，或荧光素 及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红素、德克萨斯红。 可以应用例如以上Current Protocols in Immunology中公开的技术将荧光 标签缀合至抗体。可以用荧光计定量荧光。
(c)可以利用各种酶-底物标签，以及美国专利号4,275,149提供了这 些中一些的综述。酶通常催化可应用各种技术测量的显色底物的化学改变。 例如，酶可以催化可用分光光度计测量的底物的颜色变化。或者，酶可以 改变底物的荧光或化学发光。上面讨论了定量荧光改变的技术。化学发光 底物通过化学反应变得电子活跃的，并可能然后发射可测量(例如应用化学 发光仪)的光或给与能量给荧光受体。酶标签的示例包括萤光素酶(例如， 萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶，美国专利号4,737,456)、萤光素、2，3-二 氢二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、脲酶、 过氧化物酶诸如辣根过氧物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖 淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、以及葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化 物酶、微过氧化物酶等。将酶缀合至抗体的技术描述于O’Sullivan等， Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，Methods in Enzym.(编辑J.Langone&H.Van Vunakis)，Academic press，New York，73：147-166(1981)。
抗体也可以用于体内诊断分析。在一些实施方案中，用放射性核素标 记抗体，从而可以应用免疫闪烁成像定位肿瘤。为了方便，本发明的抗体 可以在试剂盒中提供，即预定量试剂和进行诊断分析说明书的经包装的组 合。当抗体用酶标记时，试剂盒可以包括酶所需的底物和辅助因子(例如， 提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，还可以包括其它添加剂， 诸如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相 对量可能变化很大，以提供基本上最优化分析敏感性的试剂在溶液中的浓 度。具体地，试剂可以作为通常是冻干的干粉提供，所述试剂包括赋形剂， 其在溶解后将提供具有合适浓度的试剂溶液。
在一些实施方案中，将抗体缀合至一个或多个美登素分子(例如每一个 抗体分子约1至约10个美登素分子)。例如，可将美登素转换为May-SS-Me， 后者可还原为May-SH3并与经修饰的抗体反应(Chari等Cancer Research 52：127-131(1992))以产生美登木素生物碱-抗体免疫缀合物。在一些实施方 案中，缀合物可以是高效的美登素衍生物DM1(N2’-脱乙酰-N2’-(3-巯基-l- 氧代丙基)-美登素)(例如，参见2002年12月12日公开的WO02/098883)， 其具有约10-11M的IC50(综述，参见Payne(2003)Cancer Cell 3：207-212)， 或DM4(N2’-脱乙酰-N2’(4-甲基--4-巯基-l-氧代戊基)-美登素)(例如参见 2004年12月2日公开的WO2004/103272)。
在一些实施方案中，抗体缀合物包含缀合至一个或多个加利车霉素分 子的抗肿瘤细胞抗原抗体。抗生素的加利车霉素家族能够在亚皮摩尔的浓 度下产生双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素结构类似物包括但不限 于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode等Cancer Research 58：2925-2928(1998))。 也参见美国专利号5,714,586、5,712,374、5,264,586和5,773,001，其每一 个都明确地在此引入作为参考。
在一些实施方案中，抗体缀合至前体药物，所述前体药物能够通过在 许多癌中过度生产的酶释放它的活性形式。例如，可以与阿霉素的前体药 物形式制得抗体缀合物，其中通过纤维蛋白溶酶从缀合物中释放活性成分。 已知在许多癌性组织中都过度产生纤维蛋白溶酶(参见Decy等，(2004) FASEB Journal 18(3)：565-567)。
在一些实施方案中，将抗体缀合至酶活性毒素或其片段，在一些实施 方案中，毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒 素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、假单胞菌内毒素、 蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋 白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和 PAP-S)、核糖核酸酶(Rnase)、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、美洲商陆抗病毒 蛋白、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、促细胞分裂剂、局限曲菌素、酚霉素、新 霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。例如参见1993年10月28 日公开的WO 93/21232。在一些实施方案中，毒素具有很低的内在免疫原 性以及减少癌性细胞变得耐受毒素的可能性的作用机理(例如，细胞毒性机 理对细胞抑制机理)。
在一些实施方案中，在本发明的抗体和免疫调节剂之间制得缀合物。 例如，在一些实施方案中，可以应用免疫刺激性寡核苷酸。这些分子是可 以引起抗原特异性抗体反应的有效免疫原(参见Datta等，(2003)Ann N.Y. Acad.Sci 1002：105-111)。其它的免疫调节化合物可以包括干细胞生长因 子，诸如“S1因子”；淋巴毒素，诸如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子， 诸如白介素；集落刺激因子(CSF)，诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒 细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)；干扰素(IFN)，诸如干扰素α、β、γ； 促红细胞生成素以及促血小板生成素。
在一些实施方案中，提供了放射缀合的抗体。在一些实施方案中，此 类抗体可以应用32P、33P、47Sc、59Fe、64Cu、67Cu、75Se、77As、89Sr、90Y、 99Mo、105Rh、109Pd、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、161Th、166Ho、 169Er、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211Pb、212Pb、213Bi、 58Co、67Ga、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、161Ho、189mOs、192Ir、152Dy、 211At、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、225Ac、221Fr、217At、213Bi、255Fm 或其组合或亚组合而制得。在一些实施方案中，将硼、钆或铀原子缀合至 抗体。在一些实施方案中，硼原子是10B、钆原子是157Gd以及铀原子是235U。
在一些实施方案中，放射性核素缀合物具有能量在20至10,000keV 之间的放射性核素。放射性核素可以是具有小于1000keV能量的Auger 发射体、具有20至5000keV之间能量的P发射体、或具有2000至10,000 keV之间能量的α或“a”发射体。
在一些实施方案中，提供了诊断的放射性缀合物，其包含是发射γ-、β- 或发射正电子的同位素的放射性核素。在一些实施方案中，放射性核素具 有20至10,000keV之间的能量。在一些实施方案中，放射性核素选自：18F、 51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、68Ga、72As、75Br、76Br、82mRb、 83Sr、89Zr、94mTc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、 114mIn、123I、125I、13Li和197Hg。
在一些实施方案中，本发明的抗体缀合至是光活化剂或造影剂的诊断 剂。光活化化合物可以包含诸如发色团或染料的化合物。造影剂例如可以 是顺磁离子，其中离子包含选自以下的金属：铬(III)、锰(II)、铁(III)、 铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、 铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。造影剂也可以是用于X射线技术或计 算机断层扫描中的射线不透性化合物，诸如碘、铱、钡、镓和铊化合物。 射线不透性化合物可以选自：钡、3，5-双[乙酰氨基]-2，4，6-三碘苯甲酸盐、 乙碘油(ethiodized oil)、柠檬酸镓、碘卡酸、碘酸胺酸、碘达酸、胆影酸、 碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、 碘丝酸、碘磺拉胺甲基葡胺、iosemetic酸、碘酞硫、碘替酸、碘拉酸、碘 托西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、甲基葡胺、甲泛葡胺、甲泛影 钠、丙磺酮以及氯化亚铊。在一些实施方案中，诊断性免疫缀合物可以含 有缀合至本发明抗体的超声增强剂，诸如充满气体的脂质体。诊断性免疫 缀合物可以用于各种方法中，包括但不限于肿瘤或癌症诊断和检测的手术 中、内窥镜检查或血管内方法。
在一些实施方案中，应用各种双功能蛋白偶联剂制备缀合物，所述偶 联剂诸如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸盐(SPDP)、琥珀酰亚胺 -4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的 双功能衍生物(诸如己二酰亚氨二甲酯HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基 辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(对叠氮基苯甲酰)己 二胺)、二-重氮衍生物(诸如二-(对重氮基苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸盐(诸 如甲苯2，6-二异氰酸盐)以及双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。 例如，可以如Vitetta等Science 238：1098(1987)描述的方法制备蓖麻毒素 免疫毒素。碳-14-标记的l-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示范性螯合剂。参见 WO94/11026。接头可以是能促进细胞毒素药物在细胞中释放的“可切割接 头”。例如，可以应用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、二甲基接头或 含有二硫化物的接头(Chari等Cancer Research 52：127-131(1992))。此外 试剂也可以通过碳水化合物部分连接至本发明的抗体。
在一些实施方案中，包含本发明的抗体和细胞毒剂的融合蛋白例如可 以通过重组技术或肽合成制备。在一些实施方案中，将此类包含与细胞毒 剂缀合的抗肿瘤抗原抗体的免疫缀合物施与患者。在一些实施方案中，免 疫缀合物和/或其结合的肿瘤细胞抗原蛋白被细胞内在化，导致增加了免疫 缀合物在杀伤其结合的癌细胞中的治疗效力。在一些实施方案中，细胞毒 剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱、 加利车霉素、核糖核酸酶和DNA核酸内切酶。
在一些实施方案中，抗体缀合至“受体”(例如链亲和素)用于在肿瘤 预靶向中的应用，其中将抗体-受体缀合物施与患者，随后用清洁剂从循环 中移除未结合的缀合物并然后施与缀合至细胞毒剂(例如放射性核苷酸)的 “配体”(例如抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，抗体缀合至在靶细胞溶酶体内释放的细胞毒素分 子。例如，可以通过缬氨酸-瓜氨酸连接来缀合药物一甲基奥瑞他汀 (auristatin)E(MMAE)，在抗体缀合物内在化后，所述缬氨酸-瓜氨酸连 接会被水解蛋白的溶酶体酶-组织蛋白酶B切割(例如参见2003年4月3 日公开的WO03/026577)。在一些实施方案中，可应用酸不稳定的接头将 MMAE连接至抗体，所述酸不稳定的接头含有作为可切割部分的腙官能度 (例如参见2002年11月11日公开的WO02/088172)。
抗体依赖的酶介导的前体药物治疗(ADEPT)
在一些实施方案中，通过缀合抗体至前体药物活化酶可以将本发明的 抗体用于ADEPT，所述前体药物活化酶将前体药物(例如，肽基化学治疗 剂，参见WO81/01145)转换为活性抗癌药物。例如参见WO 88/07378和美 国专利号No.4,975,278。
在一些实施方案中，用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括任何能 够以将前体药物转换为它的更有效的细胞毒性形式的方式作用于前体药物 的酶。
在ADEPT中有用的酶包括但不限于：用于将含有磷酸酯的前体药物 转换为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸酯的前体药物转换为游离 药物的芳香基硫酸酯酶；用于将非毒性5-氟胞嘧啶转换为抗癌药物5-氟尿 嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含有肽的前体药物转换为游离药物的蛋白酶， 诸如灵杆菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶 和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；用于转换含有D-氨基酸替代物的 前体药物的D-丙氨酰羧基肽酶；用于将糖基化前体药物转换为游离药物的 糖切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将与β-内酰胺衍生的药 物转换为游离药物的β-内酰胺酶；用于将在它们的胺氮上分别用苯氧基乙 酰或苯乙酰基团衍生的药物转换为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素 V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。在一些实施方案中，可以用具有酶活性的抗 体(在本领域也称为“抗体酶(abzymes)”)将本发明的前体药物转换为游 离的活性药物(例如参见，Massey，Nature328：457-458(1987))。可以如本文 描述的那样制备抗体-抗体酶缀合物用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。
在一些实施方案中，可以通过本领域公知的技术将ADEPT酶共价结 合至抗体，诸如应用上面讨论的异双功能交联剂。在一些实施方案中，可 以应用本领域公知的重组DNA技术构建包含连接至本发明的酶的至少功 能活性部分的本发明抗体的至少抗原结合区域的融合蛋白(例如参见 Neuberger等，Nature，312：604-608(1984))。
在一些实施方案中，对以细胞抑制方式而不是以细胞毒性方式作用的 抗体的鉴定可以通过测量与未经处理的对照培养物相比，经处理的靶细胞 培养物的生存力来完成。可以用本领域已知的方法检测生存力，诸如 CellTiter-细胞生存力测试法或CellTiter-发光细胞生存力测 试法(Promega，目录编号分别是G8080和G5750)。在一些实施方案中， 如果处理引起与对照培养相比在细胞数目上的降低，而没有任何如通过以 上描述的方法测量的细胞死亡的证据，则认为该抗体是潜在的细胞抑制剂。
在一些实施方案中，可以应用本领域已知的测试法进行体外筛选测试 以鉴定促进ADCC的抗体。一个示范性测试法是体外ADCC测试法。为 制备铬51标记的靶细胞，使肿瘤细胞系在组织培养板中生长并用灭菌的在 PBS中的10mM EDTA收集。用细胞培养基洗涤分离的细胞两次。用200 μCi铬51(New England Nuclear/DuPont)在37℃标记细胞(5×106)一个小 时，偶尔进行混合。用细胞培养基洗涤经标记的细胞三次，然后将细胞悬 浮至1×105个细胞/mL的浓度。在通过与抗体在PBMC测试法中以100 ng/mL和1.25ng/mL或在NK测试法中以20ng/mL和1ng/mL孵育的测 试之前，细胞没有经调理作用或经调理作用。通过从正常健康供体收集肝 素支持的血液并用等容积的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释制备外周血单核细胞。 然后将血液铺在LYMPHOCYTE SEPARATION(LSM： Organon Teknika)上并按照生产商的教导离心。从LSM-血浆分界面收集 单核细胞并用PBS洗涤3次。将效应细胞悬浮在细胞培养基中至终浓度1 ×107个细胞/mL。在通过LSM纯化后，应用NK细胞分离试剂盒和磁柱 (Miltenyi Biotech)，按照生产商的教导，通过负选择从PBMCs分离自然杀 伤(NK)细胞。收集分离的NK细胞，洗涤并悬浮于细胞培养基中达到2× 106个细胞/mL的浓度。通过流式细胞分析确定NK细胞的身份。通过用细 胞培养基沿微滴定板的行两倍系列稀释效应(PBMC或NK)细胞(100μL 终体积)而制备不同的效应子：靶标比。效应细胞的浓度范围对于PBMC 是1.0×107/mL至2.0×104/mL，且对于NK是2.0×106/mL至3.9× 103/mL。在效应细胞的滴定之后，将100μL 1×105个细胞/mL的铬51标 记的靶细胞(受调理或未受调理)加至板的每一个孔。这样得到对于PBMC 的100∶1的初始效应子：靶标比以及对于NK细胞的20∶1的初始效应子： 靶标比。所有的分析均以双份进行，并且每一块板都含有对于自发裂解(没 有效应细胞)和总裂解(靶细胞加上100μL 1％十二烷基硫酸钠、1N氢氧化 钠)的对照。将板在37℃孵育18小时，之后应用上清收集系统(Skatron Instrument，Inc.)收集细胞培养上清液并在Minaxi自动-γ5000系列γ计数 器(Packard)中计数1分钟。然后应用公式：％细胞毒性＝(样本cpm- 自发裂解)/(总裂解-自发裂解)×100以细胞毒性百分数表达结果。
为鉴定促进CDC的抗体，熟练的技术人员可以进行本领域已知的测 试。一个示范性的测试法是体外CDC测试法。在体外，CDC活性可以通 过将表达肿瘤抗原的细胞与人类(或其它来源)含有补体的血清在不存在或 存在不同浓度测试抗体的情况下孵育而得以测量。然后通过应用 ALAMAR(Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202 163-171(1997))定量活细胞来测量细胞毒性。以不含抗体和含有抗体，但使 用热灭活血清和/或应用不表达所讨论的肿瘤细胞抗原的细胞来进行对照 测试。或者，可以用肿瘤抗原或衍生自肿瘤抗原的肽包被红细胞，以及然 后可以通过观察红细胞裂解来测试CDC(例如参见Karjalainen和 Mantyjarvi，Acta Pathol Microbiol Scand[C].1981年10月；89(5)：315-9)。
为选择诱导细胞死亡的抗体，可以相对于对照评估如通过PI、台盼蓝 或7AAD摄入指示的膜完整性的丧失。一个示范性测试法是应用表达肿瘤 抗原的细胞的PI摄入测试法。按照这一测试法，在补充有10％热失活FBS (Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(D-MEM)： Ham′s F-12(50∶50)中培养表达肿瘤细胞抗原的细胞。(因此，该测试法在 不存在补体和免疫效应细胞的情况下进行)。以每培养皿3×106的密度在 100×20mm培养皿中接种肿瘤细胞并允许贴附过夜。然后移除培养基， 并替换以单独的新鲜培养基或含有10μg/mL合适单克隆抗体的培养基。将 细胞孵育3天时间。在每个处理之后，用PBS洗涤单细胞层并通过胰蛋白 酶消化分离。然后将细胞在4℃以1200转/分钟离心5分钟，将沉淀重悬 浮于3ml冰冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5 mM CaCl2)中，并分装至用于移除细胞团块的盖有35mm滤过器的12×75 管(每管1ml，每一处理组3管)中。管然后接受PI(10μg/mL)。可以应用 FACSCANTM流式细胞计和FACSCONVERTTM.CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样本。那些诱导统计学显著水平的细胞死亡(如通过PI摄入 所确定的那样)的抗体可以选择作为诱导细胞死亡的抗体。
也可以应用18F-膜联蛋白作为PET成像剂在体内针对细胞凋亡活性 筛选抗体。在这一方法中，用18F放射性标记膜联蛋白V并且在测试动物 服用所研究的抗体后将其给予测试动物。在细胞凋亡过程中发生的最早事 件之一是磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧外翻至可被膜联蛋白接近的细胞外 表面。然后将动物进行PET成像(参见Yagle等，J Nucl Med.2005年4 月；46(4)：658-66)。也可以将动物处死并分离单个的器官或肿瘤并按照标准 方案针对细胞凋亡标记进行分析。
尽管在一些技术方案中，癌症的特征是基因表达产物的过量表达，本 申请还提供了用于治疗这样的癌症的方法，所述癌症不认为是过量表达肿 瘤抗原的癌症。为确定癌中肿瘤抗原的表达，可以利用各种诊断/预后测试 法。在一些实施方案中，可以通过IHC分析基因表达产物的过量表达。可 以将石蜡包埋的来自肿瘤活组织检查的组织切片进行IHC测试，并如下给 予肿瘤抗原蛋白染色强度标准：
得分0：没有观察到染色或在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色；
得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/几乎不能察觉的膜 染色。这些细胞仅仅在它们膜的一部分被染色。
得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到弱至中等的完全的膜染色。
得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强的完全的膜染色。
可将具有0或1+的肿瘤抗原过量表达评估得分的那些肿瘤描述为不 过量表达肿瘤抗原，而将具有2+或3+得分的那些肿瘤描述为过量表达肿 瘤抗原。
备选地，或另外地，可在福尔马林固定、石蜡包埋的的肿瘤组织上进 行诸如INFORMTM(由Ventana，Ariz销售)或PATHVISIONTM(Vysis， I11.)的FISH测试法，以确定肿瘤中肿瘤抗原过量表达的程度(如果有的 话)。
此外，可通过共价缀合至聚合物来化学修饰抗体以例如增加它们的循 环半寿期。每一个抗体分子可连接至一个或多个(即1、2、3、4、5或更多) 聚合物分子。优选地将聚合物分子通过连接分子连接至抗体。一般而言， 聚合物可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚 烯烃、聚亚烯烃或聚氧基亚烷基聚合物或支链或无支链的多糖，例如同- 或异多糖。在一些实施方案中，聚合物是聚氧乙烯多元醇或聚乙二醇 (PEG)。PEG在室温下可溶于水并且具有通式：R(O-CH2-CH2)n O-R，其 中R可以是氢或保护基团，诸如烷基或烷醇基团。在一些实施方案中，保 护基团具有1至8个碳。在一些实施方案中，保护基团是甲基。符号n是 1至1,000之间或2至500之间的正整数。在一些实施方案中，PEG具有 1000至40,000之间、2000至20,000之间、或3,000至12,000之间的平均 分子量。在一些实施方案中，PEG具有至少一个羟基基团。在一些实施方 案中，羟基是末端羟基基团。在一些实施方案中，正是这一羟基基团被活 化以与抑制剂上的游离氨基基团反应。然而，应当理解，反应基团的种类 和量可以是不同的以得到本发明共价缀合的PEG/抗体。聚合物以及将它们 连接至多肽的方法显示于美国专利号4,766,106、4,179,337、4,495,285和 4,609,546，其每一个均在此全文引入作为参考。
寡核苷酸
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是寡核苷酸。在一些实施方案中， LIV-1调节剂是包含选自SEQ ID NO：367-382的序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸是反义或RNAi寡核苷酸，包括siRNAs 和shRNAs。在一些实施方案中，寡核苷酸与LIV-1基因或基因产物的区 域、结构域、部分或片段互补。在一些实施方案中，寡核苷酸包含约5至 约100个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约12至约35、以及约18至25 个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与LIV-1基因或基因产物的区域、 部分、结构域或片段至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％ 同源。在一些实施方案中，寡核苷酸与LIV-1基因或基因产物的至少15、 20、25、30、35、40、50或100个连续核苷酸存在相当高的序列同源性。 在一些实施方案中，寡核苷酸与全长的LIV-1基因或基因产物存在相当高 的序列同源性。在一些实施方案中，寡核苷酸在中等或严格杂交条件下结 合至具有SEQ ID NO：1核苷酸序列的核酸分子。
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是双链RNA(dsRNA)分子并通过 RNAi(RNA干扰)工作。在一些实施方案中，dsRNA的一条链与LIV-1基 因的区域、部分、结构域或片段至少50％、至少60％、至少70％、至少 80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％ 或100％同源。在一些实施方案中，与LIV-1基因的至少15、20、25、30、 35、40、50、100、200、300、400、500或1000个连续核苷酸存在相当高 的序列同源性。在一些实施方案中，与全长的LIV-1基因存在相当高的序 列同源性。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸用于聚合酶链式反应(PCR)。 这一序列可基于基因组序列或cDNA序列(或由此设计)并用于扩增、确定 或检测在特定细胞或组织中同一的、类似的或互补的DNA或RNA的存在。
小分子
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是小分子。本文所使用的术语“小 分子”是指具有小于约10千道尔顿分子量的有机或无机非聚合物化合物。 小分子的示例包括肽、寡核苷酸、有机化合物、无机化合物等。在一些实 施方案中，小分子具有小于约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约 2或约1千道尔顿的分子量。
模拟物
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是模拟物。本文所使用的术语“模 拟物”是指模拟肽活性的化合物。模拟物是非肽但可以包含通过非肽键连 接的氨基酸。1997年6月10日发布的美国专利号5,637,677及其母申请(其 全部在此引物作为参考)包含产生模拟物的详细教导。简而言之，用不是肽 的分子复制与LIV-1三维结构特异性相互作用的肽的三维结构。在一些实 施方案中，LIV-1模拟物是LIV-1的模拟物或LIV-1配体的模拟物。
诱饵
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是包含至少一部分LIV-1多肽的诱 饵。在一些实施方案中，诱饵与天然LIV-1多肽竞争锌或锌载体-锌复合体。 在一些实施方案中，标记诱饵以利于定量、定性和/或可视化。在其它的实 施方案中，诱饵还包含利于诱饵或诱饵-锌或诱饵-锌载体复合体分离或分 开的部分。在一些实施方案中，诱饵通过捕获锌和/或锌载体(与锌复合或 未复合)并阻止其与传导信号的LIV-1多肽相互作用发挥功能。在一些实施 方案中，诱饵至少包含融合至抗体或抗体片段的LIV-1多肽的部分。
治疗/预防癌症的方法
本发明提供了在受试者中治疗和/或预防癌症或癌症症状的方法，其包 括给受试者施与治疗有效量的一种或多种本发明的LIV-1调节剂。在一些 实施方案中，癌症是与LIV-1过量表达相关的癌症。在一些实施方案中， 癌症是乳腺癌、皮肤癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子 宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤或黑素瘤。在一些实施方 案中，癌位于非激素调节的组织。在一些实施方案中，乳腺癌是ER-阳性 乳腺癌、ER-阴性乳腺癌、或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌 是管腺癌、小叶腺癌或转移性腺癌。在一些实施方案中，受试者已被诊断 为患有癌症或是对癌症易感的。
癌症的症状是本领域技术人员公知的并且包括但不限于胸部肿块、乳 头变化、胸部囊肿、胸部疼痛、死亡、重量减轻、虚弱、极度疲劳、进食 困难、食欲不振、久咳、恶化的气喘、咳出血、尿血、便血、恶心、呕吐、 肝转移、肺转移、骨转移、腹痛下堕、气胀、腹膜腔中有液体、阴道流血、 便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发烧、疼痛)、疼痛、吐血、 重汗、发烧、高血压、贫血、腹泻、黄疸、眩晕、寒战、肌肉痉挛、结肠 转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移、以及胰腺转移、吞 咽困难等。
所述调节化合物的治疗有效量可以按照药剂师公知的程序凭经验确 定，并且将尤其取决于患者的年龄、疾病的严重度以及取决于所期望的最 终药物制剂。本发明调节剂的施与例如可以以下列方式进行：通过吸入或 栓剂或施与至粘膜组织(诸如通过灌洗至阴道、直肠、尿道、口腔或舌下组 织)、经口地、局部地、鼻内地、腹膜内地、非肠胃地、静脉内地、淋巴管 内地、瘤内地、肌内地、间质地、动脉内地、皮下地、经眼地(intraoccularly)、 滑膜内地、经上皮的和经皮地施用。在一些实施方案中，抑制剂通过灌洗、 口头或动脉内施与。其它合适的引入方法也可以包括可再填装 (rechargeable)或可生物降解的装置以及缓慢或持续释放的聚合物装置。 如上面所讨论的那样，本发明的治疗组合物可以作为与其它已知抗癌剂或 其它已知抗骨病治疗方案的联合治疗的一部分施与。
本发明还提供了在患者中调节LIV-1相关生物学活性的方法。该方法 包括给患者施与调节一种或多种LIV-1生物活性有效量的LIV-1调节剂。 在上文或下文中给出了用于测量LIV-1生物活性的合适的测试法。
本发明也提供了在有需要的患者中抑制癌细胞生长的方法，包括给患 者施与治疗有效量的一种或多种LIV-1调节剂。用于测量LIV-1相关细胞 生长的合适的测试法是本领域普通技术人员已知的并且在上文和下文中给 出。
本发明还提供了在有需要的患者中抑制癌症的方法。方法包括确定患 者是否是本文所述的LIV-1治疗的候选者，以及如果患者是LIV-1治疗的 候选者则施与治疗有效量的一种或多种LIV-1调节剂给患者。如果患者不 是LIV-1治疗的候选者，则用常规癌症疗法来治疗患者。
本发明还提供了在诊断或怀疑患有癌症的患者中抑制癌症的方法。方 法包括施与治疗有效量的一种或多种LIV-1调节剂给患者。
本发明也提供了在患者中抑制两个或多个细胞相互作用的方法，包括 施与治疗有效量的LIV-1调节剂给所述患者。用于测量LIV-1相关细胞相 互作用的合适的测试法是本领域技术人员已知的并在上文和下文中给出。
本发明也提供了在患者中调节一种或多种癌症症状的方法，包括给所 述患者施与治疗有效量的本文所描述的LIV-1组合物。
本发明还提供了在有需要的患者中抑制细胞生长的方法，包括给患者 施与治疗有效量的LIV-1调节剂。在上文和下文中给出了适合用于测量 LIV-1相关的贴壁不依赖细胞生长的测试法。
本发明也提供了在有需要的患者中抑制癌细胞迁移的方法，包括给患 者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。用于测量LIV-1相关的细胞迁移的合 适的测试法是本领域技术人员已知的。
本发明还提供了在有需要的患者中抑制癌细胞粘附的方法，包括给患 者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。用于测量LIV-1相关的细胞粘附的测 试法是本领域技术人员已知的。
本发明也提供了用于预防性治疗患者的方法，所述患者是对形成癌、 癌转移易感的患者或已患有转移病变并因此对再发或复发易感的患者。该 方法在例如具有癌症家族史或转移肿瘤家族史，或显示出癌转移的遗传倾 向性的高危个体中是特别有用的。在一些实施方案中，肿瘤是LIV-1相关 肿瘤。此外，该方法能用于预防患者LIV-1相关肿瘤的复发，所述患者患 有已通过外科切除术移除或用常规的癌症治疗方法治疗的LIV-1相关肿 瘤。
本发明也提供了抑制癌进程和/或引起癌消退的方法，所述方法包括给 患者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。
在一些实施方案中，用本发明的LIV-1调节剂与化学疗法和/或放射疗 法联合治疗需要抗癌治疗的患者。例如，在施与LIV-1调节剂后，也可以 用治疗有效量的抗癌放射治疗患者。在一些实施方案中，提供了与LIV-1 调节剂联合的化学疗法治疗。在一些实施方案中，LIV-1调节剂与化学疗 法和放射疗法联合施与。
治疗方法包括施与单剂量或多剂量的一种或多种LIV-1调节剂给患 者。在一些实施方案中，以无菌、无热原且包含与可药用载体或稀释剂联 合的LIV-1调节剂的可注射药物组合物施与LIV-1调节剂。
在一些实施方案中，本发明的治疗方案与常规的癌症治疗方案一起使 用，所述常规的癌症治疗方案包括但不限于外科手术、放射治疗、激素消 融和/或化学治疗。本发明LIV-1调节剂的施与可发生在常规的癌症治疗之 前、同时或之后。在一些实施方案中，给患者施与两种或多种不同的LIV-1 调节剂。
在一些实施方案中，施与患者的LIV-1调节剂的量能有效地抑制癌细 胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1 信号传导、抑制LIV-1介导的细胞-细胞粘附、LIV-1介导的细胞-细胞膜 相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质相互作用、整联蛋白介导的活性、 LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解以及LIV-1表达中的一种或多种。在一 些实施方案中，施与患者的LIV-1调节剂的量能有效地通过细胞凋亡增加 癌细胞死亡。
联合治疗
在一些实施方案中，发明提供了包含两种或多种LIV-1调节剂的组合 物以提供更改良的抗癌效力。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是单克隆 抗体。可将包含两种或多种LIV-1抗体的组合物施与患有或倾向于患有癌 症的人或哺乳动物。也可将一种或多种抗体与另外一种治疗剂，诸如细胞 毒剂或癌化疗剂施与。两种或多种治疗剂的同时施与不需要在相同的时间 或通过相同的途径施与所述药剂，只要在药剂发挥它们治疗作用期间的时 间段有重叠即可。考虑在不同天或周施与的同时或顺次施与。
在一些实施方案中，本发明提供的方法考虑了施与不同抗体的联合或 “混合物(cocktails)”。此类抗体混合物具有某些优点，因为它们含有 利用不同效应物机理的抗体或使细胞毒性抗体与依赖免疫效应物功能的抗 体直接联合。此类联合的抗体可能表现出协同的治疗效果。
细胞毒剂是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞毁灭的物质。该术语 意图包括放射性同位素(例如，131I、125I、90Y和186Re)、化学治疗剂和毒素， 所述毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或合成毒素、 或其片段。非细胞毒剂是指不会抑制或阻止细胞功能和/或不引起细胞毁灭 的物质。非细胞毒剂可以包括能被活化为细胞毒剂的试剂。非细胞毒剂可 以包括珠子、脂质体、基质或颗粒(例如参见，美国专利公开2003/0028071 和2003/0032995，其在此引入作为参考)。此类试剂可以与本发明的抗体缀 合、偶联、连接或联合。
在一些实施方案中，将常规癌症药物与本发明的组合物一起施与。常 规癌症药物包括：
a)癌症化疗剂；
b)其它的药剂；
c)前体药物。
癌症化疗剂包括但不限于烷化剂，诸如卡波铂和顺氯氨铂；氮芥烷化 剂；亚硝基脲烷化剂，诸如亚硝脲氮芥(BCNU)；代谢拮抗剂，诸如氨甲蝶 呤；亚叶酸；嘌呤类似物代谢拮抗剂，巯基嘌呤；嘧啶类似物代谢拮抗剂， 诸如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨激素抗肿瘤药，诸如戈 舍瑞林、利普安和他莫昔芬；天然抗肿瘤药，诸如阿地白介素、白介素-2、 紫杉萜、依托泊苷(VP-16)、干扰素α、紫杉醇和维甲酸(ATRA)； 抗生素天然抗肿瘤药，诸如博莱霉素、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、道 诺霉素和包括丝裂霉素C的丝裂霉素；以及长春花生物碱天然抗肿瘤药， 诸如长春花碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺；羟基脲；醋葡内酯、阿霉素、 异环磷酰胺、依诺他滨、环硫雄醇、阿柔比星、环胞苷、嘧啶亚硝脲、盐 酸甲基下肼、卡巴醌、卡波铂、卡莫氟、色霉素A3、抗癌多糖、抗癌血小 板因子、环磷酰胺裂裥菌素、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、 氮烯唑胺、硫肌苷、硫替派、替加氟、多拉司他汀、多拉司他汀类似物诸 如奥瑞他汀(auristatin)、CPT-11(依立替康)、米托蒽醌、长春瑞滨、替 尼泊苷、胺-蝶呤、洋红霉素、esperamicins(例如参见，美国专利号 4,675,187)、新制癌菌素、OK-432、博莱霉素、氟铁龙、溴苷、白消安、 二磷酸己烯雌酚四钠、培洛霉素、贝他定干扰素-β、美雄 烷、二溴甘露醇、米尔法兰、层粘连蛋白肽、蘑菇多糖、云芝提取物、替 加氟/尿嘧啶、雌氮芥(雌激素/氮芥)。
可以用作癌症患者治疗的其它的药剂包括EPO、G-CSF、更昔洛伟； 抗体、利普安；哌嘧啶；齐多夫定(AZT)；白介素1至18，包括突变体和 类似物；干扰素或细胞因子，诸如干扰素α、β和γ；激素，诸如黄体生成 素释放激素(LHRH)和类似物，以及促性腺激素释放激素(GnRH)；生长因 子，诸如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长 因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细 胞生长因子类似因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子 (IGF)；肿瘤坏死因子-α和β(TNF-α和β)；侵袭抑制因子-2(IIF-2)；骨形 态发生蛋白1-7(BMP 1-7)；促生长素抑制素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超 氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗血管生成因子；抗原物质；以及前体 药物。
前体药物是指药学活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比， 其对肿瘤细胞的细胞毒性更小或没有细胞毒性，并且其能被酶激活或转换 为活性或更具活性的母体形式。例如，参见Wiknan，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical Society Transactions，14，第375-382页， 615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed Drug Delivery，Borchardt 等，(编辑)，第247-267页，Humana Press(1985)。前体药物包括但不限于含 磷酸酯的前体药物、含硫代磷酸酯的前体药物、含硫酸酯的前体药物、含 肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含b-内酰胺 的前体药物、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代的苯乙 酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它能够转换为更有效的细胞毒游离药物 的5-氟尿苷前体药物。可衍生为本文应用的前体药物形式的细胞毒药物的 示例包括但不限于上面描述的那些化学治疗剂。
临床方面
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物尤其对乳腺癌、皮肤癌、 食管癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、 卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤有用。在一些实施方案中，癌症是管腺癌、 小叶腺癌或转移性腺癌。
药物组合物
本发明也提供了包含一种或多种本文描述的LIV-1调节剂和可药用载 体的药物组合物。在一些实施方案中，将药物组合物制备为可注射的液体 溶液或悬浮液；也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮于液体载体中的 固体形式。脂质体也包括在可药用载体的定义之内。药物组合物中也可存 在药学可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫 酸盐等；以及有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。 对药学可接受赋形剂的完全的讨论可在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(1995)Alfonso Gennaro，Lippincott，Williams和 Wilkins中得到。
检测LIV-1的方法
本发明也提供了检测LIV-1的方法。在一些实施方案中，LIV-1存在 于患者或患者样本中。在一些实施方案中，方法包括将包含一种或多种 LIV-1调节剂的组合物施与患者并检测显像剂在患者中的定位。在一些实 施方案中，患者样本包含癌细胞。在一些实施方案中，将LIV-1调节剂连 接至显像剂或进行可检测地标记。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是缀 合至显像剂的LIV-1抗体，并将其施与患者以检测一种或多种肿瘤或确定 患者对LIV-1治疗的敏感性。经标记的抗体结合至细胞上高密度的受体并 且因此聚集在肿瘤细胞上。应用标准成像技术可以检测肿瘤的位置。
本发明也提供了成像/检测表达或过量表达LIV-1的细胞或肿瘤的方 法，包括将包含LIV-1调节剂的组合物与样本接触，并检测样本中LIV-I 调节剂的存在。在一些实施方案中，样本是患者样本。在一些实施方案中， 患者样本包含癌细胞。在一些实施方案中，将LIV-1调节剂连接至显像剂 或进行可检测地标记。
本发明也提供了定量化患者、细胞或样本中存在的LIV-1量的方法。 该方法包括将一种或多种抗体、探针、或小分子施与患者或样本，并检测 样本中存在的LIV-1量。在一些实施方案中，将抗体、探针、或小分子连 接至显像剂或进行可检测地标记。此类信息表明，例如，肿瘤是否与LIV-1 相关以及因此是否需要应用或避免特定治疗。在一些实施方案中，应用本 领域公知的标准技术，获得被认为包含肿瘤细胞的样本并与经标记的抗体、 探针、寡核苷酸和小分子接触。在移除任何未结合的经标记的抗体、探针、 寡核苷酸和小分子后，确定结合至细胞的经标记的抗体、肽、寡核苷酸或 模拟物的量、或确定因为未结合而被移除的抗体、肽、寡核苷酸或模拟物 的量。该信息直接涉及LIV-1的存在量。
成像可以应用本领域技术人员公知的方法完成。成像例如可以通过放 射性闪烁显像、核磁共振成像(MRI)或计算机断层扫描(CT扫描)等完成。 最常用的用于显像剂的放射性标记包括放射性碘和铟。通过CT扫描成像 可以利用重金属诸如铁螯合物。MRI扫描可以利用钆或锰的螯合物。此外， 正电子放射层扫描术(PET)可能应用氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射器。 成像也可以应用锌敏感染料以监测体内Liv-1活性来完成。此类方法是本 领域技术人员已知的。A.Takeda等，Cancer Research 61，5065-5069，，2001 年7月1日；和C.Frederickson，Sci STKE.2003年5月13日；2003(182) 讨论了此类方法的实例，其每一个均在此全文引入作为参考。
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是LIV-1抗体。在一些实施方案中， 将调节剂连接至显像剂或进行可检测地标记。在一些实施方案中，显像剂 是18F、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、77Br、87MSr、86Y、90Y、99MTc、 111In、123I、125I、127Cs、129Cs、131I、132I、197Hg、203Pb或206Bi。
检测的方法是本领域普通技术人员公知的。例如，检测多核苷酸的方 法包括但不限于PCR、RNA印迹法、DNA印迹法、RNA保护和DNA杂 交(包括原位杂交)。检测多肽的方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、 酶活性测试法、狭线印迹法、肽质量指纹法、电泳、免疫化学和免疫组织 化学。检测方法的其它示例包括但不限于放射免疫测试法(RIA)、化学发光 免疫测试法、荧光免疫测试法、时间分辨荧光免疫测试法(TR-FIA)、双 色荧光显微镜法、或免疫色谱法(ICA)，全部都是本领域技术人员公知的。 在一些本发明优选的实施方案中，应用PCR方法检测多核苷酸的表达以及 应用ELISA技术检测多肽产物。
将细胞毒剂或诊断剂递送至细胞的方法
本发明也提供了将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表达LIV-1的 细胞中的方法。在一些实施方案中，方法包括将缀合至细胞毒剂或诊断剂 的本发明的LIV-1调节剂与细胞接触。
确定癌症患者预后的方法
本发明也提供了确定患有LIV-1相关癌症的患者预后的方法。该方法 包括确定患者样本中LIV-1-δ对LIV-1的比值。尽管不希望被理论所束缚， 发明人已发现相对于LIV-1的更高水平的LIV-1-δ与侵袭性更小的癌症和/ 或更容易治疗的癌症相关。因此，在一些实施方案中，相对于LIV-1的高 水平LIV-1-δ是具有延长生存和/或用本发明的LIV-1调节剂和/或常规癌 症药物成功治疗的良好预后的患者的指标。在一些实施方案中，良好的预 后通过至少2∶1、至少3∶1、至少4∶1或至少5∶1的LIV-1-δ∶LIV-1比值来 指示。在一些实施方案中，通过测量mRNA或蛋白水平确定LIV-1-δ∶LIV-1 的比值。
在一些实施方案中，确定患有LIV-1相关癌症患者的预后的方法包 括检测患者样本中结合至细胞质膜的LIV-1。在一些实施方案中，在患者 样本中结合至细胞质膜的LIV-1的检出不是延长生存和/用本发明的LIV-1 调节剂和/或常规癌症药物成功治疗的良好预后的指标。
在一些实施方案中，LIV-1由具有SEQ ID NO：1序列的核酸编码。在 一些实施方案中，LIV-1具有SEQ ID NO：2的序列。在一些实施方案中， LIV-1-δ具有SEQ ID NO：365的序列。
确定对LIV-1治疗敏感性的方法
本发明也提供了确定患者对LIV-1治疗敏感性的方法。该方法包括检 测患者或患者样本中LIV-1差异表达证据的存在或不存在。在患者或样本 中LIV-1差异表达证据的存在是对LIV-1治疗敏感的患者的指标。在一些 实施方案中，在患者或患者样本中LIV-1差异表达证据的不存在表明患者 不是LIV-1治疗的候选者。
在一些实施方案中，治疗方法包括首先鉴定对LIV-1治疗敏感的患者， 包括给有需要的患者施与包含连接至显影剂的LIV-1调节剂的组合物，并 检测患者中基因或基因产物证据的存在或不存在。在一些实施方案中，治 疗方法还包括如果患者是LIV-1治疗的候选者则施与一种或多种LIV-1调 节剂给患者，以及如果患者不是LIV-1治疗的候选者则用常规癌症疗法治 疗患者。
在一些治疗方法中，当患者被确认为患有癌症或对癌症易感，则给患 者单独施与或与其它抗癌药物联合施与一种或多种LIV-1调节剂。
评估癌症进展的方法
本发明还提供了在患者中评估癌症进展的方法，包括将第一时间点的 生物样本中LIV-1表达产物的水平与第二时间点的相同表达产物水平相比 较。第二时间点相对于第一时间点的表达产物水平的改变是癌症进展的指 标。
筛选方法
本发明也提供了筛选抗癌剂的方法。该方法包括将表达LIV-1的细胞 与候选化合物接触，并确定LIV-1相关生物活性是否受到调节。在一些实 施方案中，癌细胞生长、整联蛋白介导的活性、肿瘤形成、癌细胞增殖、 癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1介导的细胞- 细胞粘附、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外 基质相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解以及LIV-1表达中一种 或多种的抑制是抗癌剂的指标。
本发明还提供了鉴定癌抑制剂的方法。该方法包括将表达LIV-1的细 胞与候选化合物和LIV-1配体接触，并确定LIV-1相关生物活性是否受到 调节。在一些实施方案中，癌细胞生长、整联蛋白介导的活性、肿瘤形成、 癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1 介导的细胞-细胞粘附、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的 细胞-细胞外基质相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解以及LIV-1 表达中一种或多种的抑制是癌抑制剂的指标。在一些实施方案中，施与患 者的LIV-1调节剂的量对增加癌细胞凋亡有效。
在一些实施方案中，本发明提供了筛选抗癌剂、尤其是抗转移癌药剂 的方法，例如通过针对调节下游标志物的活性或水平的能力筛选假定的调 节剂。在一些实施方案中，将降低细胞周期蛋白D1水平、减少MT1-MMP 水平或减少细胞质锌水平的候选试剂确定为抗癌剂。
纯化LIV-1的方法
在一些实施方案中，本发明提供了从包含LIV-1的样本中纯化LIV-1 蛋白的方法。该方法包括提供包含结合至固体支持物上的本发明LIV-1抗 体的亲和基质，将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-LIV-1蛋白复合体， 从样本的剩余物中分离亲和基质-LIV-1蛋白复合体，并从亲和基质上释放 LIV-1蛋白。
试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供了用于成像和/或检测与LIV-1过量表 达相关的基因或基因产物的试剂盒。本发明的试剂盒包含可检测的抗体、 小分子、寡核苷酸、诱饵、模拟物或探针以及完成本发明方法的说明书。 任选地，试剂盒也可以含有以下的一个或多个以下组分：对照(阳性和/或 阴性)、对照的容器、阳性和/或阴性结果代表实例的照片或描绘。
本文描述的每一个专利、专利申请、登录号和出版物均在此全文引入 作为参考。
除了本文描述之外的本发明的各种修改鉴于前面的描述对于本领域技 术人员是显而易见的。意图使此类修改也落入附录实施方案的范围内。本 发明将在以下实施例中进一步说明，所述实施例的目的是举例说明而不是 试图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：免疫沉淀法
制备含有50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1％TritonX-100 和每10ml总体积1个蛋白酶抑制剂片剂(Roche Diagnostic Corp.， Indianapolis，IN)的免疫沉淀(IP)缓冲液。合并用IP缓冲液以1∶100稀释 的机构内部(in-house)产生的抗LIV-1兔多克隆抗体(Ab)，并添加至有 螺旋盖的管中的细胞裂解产物中，允许其在摇动平台上在4℃混合1-2小 时。为进行免疫沉淀，将40μl抗兔IgG缀合珠或120μl链亲和素珠添加 至每一管并继续在摇动平台上在4℃孵育过夜。随后，将管以7000xg在 4℃离心2分钟，并移除上清液。用冷的洗涤缓冲液洗涤珠子沉淀4次， 然后往每一管加入30μl含有还原剂的2X SDS Tris/甘氨酸样本缓冲液。然 后将样本缓冲液中的珠子在95℃煮两次，每次5分钟，以从珠子中释放 免疫沉淀物。然后将煮过的珠子溶液在室温下以14,000xg离心5分钟， 将上清液移出并转移至新管中。立即通过在SDS-PAGE凝胶上电泳分析免 疫沉淀物或将其储存在-20℃。应用标准方法进行蛋白质印迹分析。将经电 泳的免疫沉淀物从聚丙烯酰胺凝胶中转移至膜上，并然后于室温在温和摇 动中应用第二LIV-1抗体(1∶1000)探测膜1小时。用含有0.05％吐温20 的PBS(PBST)洗涤数次后，加入缀合至辣根过氧物酶(HRP)的合适的物种 特异性二抗，并于室温在摇动平台上孵育30分钟。数次洗涤后，然后用 ECL检测系统(Amersham Biosciences UK)显现膜上的反应条带。
实施例2：FACS分析
将非透化的细胞用于分析。制备含有(冷)PBS、1％牛血清白蛋白 (BSA)、2％胎牛血清(FBS)和0.1％叠氮化钠的FACS缓冲液。通过用离解 缓冲液(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)使贴壁细胞不贴壁而收集细胞。为 中和离解缓冲液，加入等体积的生长培养基。然后将细胞分装至5ml聚苯 乙烯圆底管中。对每一个染色，将一百万个细胞在4℃以1000转/分钟 离心5分钟，并然后往细胞沉淀中加入第一抗体(100μL FACS缓冲液中达 6μg)，通过涡旋混合并在冰上孵育30分钟至1小时。然后通过在4℃以 1000转/分钟离心5分钟沉淀后，用3ml FACS缓冲液洗涤细胞两次。在 第二次洗涤和离心后，往细胞沉淀中加入第二抗体(50μL FACS缓冲液中 1μg)，通过涡旋混合并在冰上在黑暗中孵育30分钟。通过在4℃以1000 转/分钟离心5分钟沉淀细胞后，用3ml FACS缓冲液洗涤细胞两次。在 第二次洗涤和离心后，将细胞以500μg悬浮于50μL含有碘化丙锭(PI)的 FACS缓冲液中。(将PI制备为1μg/μL的储存液并以1∶100使用)。在一 小时内实施FACS/流式细胞术分析。
实施例3：LIV-1寡核苷酸抑制软琼脂生长
用对LIV-1的寡核苷酸(SEQ ID NO：369和370)处理MDA231、 MCF-7、ZR75-1和T47D1细胞。将细胞平板接种于0.35％软琼脂中并在 培养7天后用Alamar Blue定量生长。
通过在软琼脂中的集落形成测量LIV-1基因表达对T47D1细胞的贴 壁不依赖性细胞生长的影响。通过首先用聚HEMA包被非组织培养处理 的平板以阻止细胞贴附至平板来进行软琼脂分析。用胰蛋白酶收集非转染 的细胞并用培养基洗涤两次。用血细胞计数器计数细胞并在培养基中重悬 细胞至每ml 104个细胞。将50μl等分试样置于聚HEMA包被的96孔板中， 并转染。对于每一个转染混合物，将载体分子(优选脂-拟肽缀合物(lipitoid) 或拟胆固醇(cholesteroid))制备为在水中的0.5nM工作浓度，超声处理 以产生均匀的溶液并通过0.45μm PVDF膜过滤。然后将反义或对照寡核 苷酸在无菌Millipore水中制备成100μM的工作浓度。将寡核苷酸在微离 心管中的OptiMEMTM(Gibco/BRL)中进一步稀释至2μM，或每ml OptiMEMTM约20μg寡核苷酸。在另一个微离心管中，将脂-拟肽缀合物 或拟胆固醇稀释至与稀释寡核苷酸所用的相同体积的OptiMEMTM中，一 般地以每μg反义寡核苷酸约1.5-2nmol脂-拟肽缀合物的量进行。将经稀 释的反义寡核苷酸立即添加至经稀释的脂-拟肽缀合物，并通过上下移液混 合。将寡核苷酸添加至细胞至约300nM的终浓度。在37℃转染约30分 钟后，通过上下移液将3％GTG琼脂糖加至细胞中，达到0.35％琼脂糖的 终浓度。在细胞层琼脂凝固后，将100μl培养基滴在每一个孔的上面。在 约7天中形成集落。为了读出生长，往每一孔中加入20μl Alamar Blue并 将平板振动约15分钟。在孵育6-24小时后，进行荧光读数(530nm激发 /590nm发射)。
应用LIV-1调节剂对癌细胞系集落形成的抑制表明LIV-1在转移表型 的产生和/或维持中是重要的。
实施例4：基因表达的调节
应用寡核苷酸分析了由癌性细胞中多核苷酸所示的差异表达基因的表 达，以确定LIV-1在肿瘤发生，例如在促进转移表型中的作用和功能。
产生LIV-1寡核苷酸并测试它们抑制LIV-1表达的能力。一旦合成并 定量后，则在一组细胞系中针对转录敲低的效率筛选寡核苷酸。通过应用 GeneAmp定量分析mRNA水平来确定敲除效率。
通过转染至T47D1、T47D-T1、MCF7、ZR-75-1、MDA231、184B5 或HMEC细胞中测试每一个寡核苷酸抑制基因表达的能力。
对于每一个转染混合物，将载体分子(诸如脂类，脂类衍生物、脂类样 分子、胆固醇、胆固醇衍生物或胆固醇样分子)在水中制备为0.5mM的工 作浓度，超声处理以产生均匀溶液并通过0.45μm PVDF膜过滤。然后将 反义和siRNA寡核苷酸在无菌Millipore水中制备成约100μM的工作浓 度。将寡核苷酸在微离心管中在OptiMEMTM(Gibco/BRL)中进一步稀释至 2μM，或每ml OptiMEMTM约20μg寡核苷酸。在另一个微离心管中，将 载体分子稀释至与稀释寡核苷酸所用的相同体积的OptiMEMTM中，一般 以每μg反义寡核苷酸约1.5-2nmol载体进行。将经稀释的反义寡核苷酸 立即添加至经稀释的载体中，并通过上下移液混合。将siRNAs添加至细 胞至约67nM的终浓度。
应用ABI GeneAmp 7000TM实时PCR仪在细胞系中定量经转染细胞 中与感兴趣的靶标基因相对应的靶标mRNA的水平。将靶标mRNA值对 内对照进行标准化。对于每一20μl反应，将提取的RNA(通常总共0.2-1μg) 置于灭菌的0.5或1.5ml微离心管中，添加水达到12.5μl的总体积。往每 一管添加7.5μl缓冲液/酶混合物，所述缓冲液/酶混合物通过(以所列顺序) 混合2.5μl H2O、2.0μl 10×反应缓冲液、10μl寡聚dT(20pmol)、1.0μl dNTP混合物(每一种10mM)、0.5μl RN(20u)(Ambion，Inc.， Hialeah，FL)和0.5μl MMLV逆转录酶(50u)(Ambion，Inc.)而制备。通过上 下移液混合内容物，将反应混合物在42℃孵育1小时。在扩增之前离心 每一管的内容物。
应用ABI sybr master mix加上0.175pmol每一种寡核苷酸制备扩增 混合物。Green(Molecular Probes，Eugene，OR)是当其结合至双链 DNA时发荧光的染料。由于在扩增过程中会产生双链PCR产物，来自 Green的荧光增加。往每20μl扩增混合物的等分试样中加入2μl 模板RT，并按照标准方案进行扩增。以相应基因的表达相对于没有转染 的细胞、只转染了载体的细胞(假转染)或用反向对照寡核苷酸转染的细胞 降低的百分比来表达结果。
尽管LIV-1寡核苷酸在所有测试细胞系中均抑制Liv-1表达，LIV-1 寡核苷酸只在致瘤系中具有功能后果。在非致癌系中没有观察到LIV-1寡 核苷酸的功能后果，表明癌细胞和“正常”细胞对Liv1活性具有不同的依 赖性。
实施例5：表达对增殖的影响
在数个细胞系中应用siRNA方法评估了基因表达对细胞增殖抑制的影 响，所述细胞系包括T47D1、T47D-T1、MCF7、ZR-75-1、184B5、MDA231 和HMEC细胞。
将细胞以数天后会达到约80-95％融合的密度接种在96-孔皿上。将寡 核苷酸(反义或siRNA)在OptiMEMTM中稀释至2μM。然后将寡核苷酸 -OptiMEMTM加入到递送载体，对所述载体进行选择使得对于在测试中待 使用的特定细胞类型是最优化的。然后将寡核苷酸/递送载体混合物进一步 稀释至在细胞上的有血清的培养液中。反义寡核苷酸的终浓度是约300nM 以及siRNA寡核苷酸的终浓度是67-100nM。
如上面描述的那样制备寡核苷酸。将细胞在37℃转染约4小时至过 夜，然后用新鲜培养基更换转染混合物。如上面描述的那样进行转染。
LIV-1寡核苷酸抑制癌细胞增殖但不抑制HMEC(原代乳腺上皮细胞) 或184B5(非致瘤性乳腺上皮细胞系)细胞的增殖，表明LIV-1在癌细胞癌 性表型的产生和/或维持中起着重要作用。
实施例6：生存测试
为评估靶信息的缺失对细胞死亡的影响，转染T47D-T1、MCF7、 Zr-75-1和MDA-MB231细胞用于细胞毒性测试。通过测量由于膜损伤释 放至培养基中的LDH酶量来监测细胞毒性。应用来自Roche Molecular Biochemicals的细胞毒性检测试剂盒来检测LDH活性。数据以释放至培养 基中的LDH对在相同时间点和处理中在孔中存在的总LDH的比值 (rLDH/tLDH)提供。测试包括了应用针对BCL2(已知的抗凋亡基因)的反义 和反向对照寡核苷酸的阳性对照；与用对照寡核苷酸的处理相比(由于转染 的背景细胞毒性)，BCL2信号的丧失导致了细胞死亡的增加。
实施例7：胱天蛋白酶/M30方法
对来自用siRNA处理的细胞的裂解产物应用蛋白质印迹分析评估胱天 蛋白酶原(procaspase)和M30。在处理后的不同时间点，裂解细胞(贴壁 或分离的细胞，将后者离心下来)并应用针对胱天蛋白酶原和M30的抗体 进行蛋白质印迹分析。胱天蛋白酶原的消失与胱天蛋白酶活化相对应。M30 表位的出现是细胞角蛋白18的胱天蛋白酶切割的反映。所使用的抗体是 Axxora/Alexis M30(CytoDeath：CAT#ALX-804-590)和胱天蛋白酶原Ab (R&D Systems，货号：MAB707)。
实施例8：细胞周期蛋白D1方法
用siRNA转染细胞以敲低Liv1或用Liv-1特异的抗体处理细胞。对于 转染的细胞，在转染48小时后收集细胞裂解产物。对于Ab处理，在处理 6小时后收集细胞裂解产物。应用抗细胞周期蛋白D1 Ab：周期蛋白D1 Abeam Cat#-ab24249对裂解产物进行蛋白质印迹分析。所使用的siRNAs 是SEQ ID NO：369和370。测试的LIV-1抗体是针对N端和TM2-3ECD 的机构内部产生的抗体。针对TM2-3ECD的抗体似乎显示出最大的效力。
实施例9：锌水平
在实施例G之前24、48或72小时用siRNA处理细胞或在实施例10 之前30分钟用抗体处理细胞。所使用的siRNAs是SEQ ID NO：369和370。 测试的LIV-1抗体是针对N端和TM2-3ECD的机构内部产生的抗体。针 对TM2-3ECD的抗体似乎显示出最大的效力。
实施例10：锌转运测试法
应用通透细胞的锌选择性荧光指示剂Newport Green测试锌转运。在 通过细胞内酯酶切割后，Newport Green结合至游离的锌离子并作为细胞 内游离锌含量的荧光指示剂。
如下制备在Krebs-Ringer-HEPES Buffer(KRH)缓冲液(120mM NaCl、25mM HEPES、pH 7.5、4.8mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2)中的10μM Newport Green PDX染料(渗透酯形式， Cat#N24191，Invitrogen-Molecular ProbesTM)和0.02％Pluronic F-127(在 DMSO中20％Pluronic F-127；Cat#P3000，Invitrogen-Molecular ProbesTM)的工作溶液。将Newport Green以50μg等分试样于干燥下储存 于-20℃、避光并在使用之前融化。通过将50μg Newport Green在16.8μl 无水二甲亚砜(DMSO)(Cat#276855-100mL，Sigma-Aldrich)中重构制得 Newport Green染料的2.5mM储存溶液。通过将等体积(16.8μL)的分散剂 Pluronic F-127添加至2.5mM储存溶液并然后将全部体积的染料稀释至 8.366mL KRH缓冲液中制备Newport Green染料的10μM工作溶液。
将贴壁细胞用没有Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次， 并用没有酶的、基于Hanks的离解缓冲液(Invitrogen，Cat#13150-016)收 集。将PBS和解离缓冲液在使用前平衡至37℃。然后通过添加等体积的 生长培养基中和细胞悬浮液的pH。通过在1000转/分钟离心5分钟收集 细胞，将得到的细胞沉淀以1×106个细胞/mL的浓度重悬于PBS。为了 进行分析，将1.5×106个细胞分装至5ml聚苯乙烯圆底FACS管(Becton Dickinson，Cat#352054)中。通过离心再次沉淀细胞并移除PBS。
将细胞通过涡旋重悬浮于0.5mL 10μM Newport Green染料溶液中； 盖上FACS管并在30℃水浴中孵育45分钟。将1mL没有染料的KRH缓 冲液加入到细胞悬浮液中，并通过在1000转/分钟离心5分钟沉淀细胞。 吸出上清液，在1mL没有染料的KRH缓冲液中再次洗涤细胞，将细胞沉 淀重悬浮于0.5mL没有染料的KRH缓冲液中并在30℃水浴中孵育30分 钟。将1mL没有染料的KRH缓冲液加入到细胞悬浮液中，并通过在1000 转/分钟离心5分钟沉淀细胞。吸出上清液，在1mL没有染料的KRH缓 冲液中再次洗涤细胞，将细胞沉淀通过涡旋重悬浮于2.0mL没有染料的 KRH缓冲液中。
通过FACS(FACSCalibur)(BD Biosciences)监测细胞内荧光。实时收 集细胞，并根据时间绘制Newport Green染料荧光(FITC设置)图(收集设 置在10分钟收集200万个细胞)。在建立了1.5至2分钟收集范围内的荧光 基线后，将100mM氯化锌(Cat#Z0152-100G，Sigma-Aldrich，溶解于29 mM HCl)添加至细胞达到1-100μM的终浓度。立即将细胞管送回FACS 机器，通过荧光的瞬时增加显示锌摄入。将FACS数据输出至Flowjo软件 (Tree Star Inc，Ashland，Oregon)并应用动力学平台(Kinetics Platform)分 析。用移动平均平滑选择来展示数据的中位数，以及在布图编辑器(Layout Editor)中产生图示覆盖图。
实施例11：LIV-1表位
可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种鉴定用于抗体识别和制 备的LIV-1线性表位。一些示例方法包括探测衍生自抗原氨基酸序列的肽 的抗体结合能力。可以通过应用BIACORE或ELISA方法评估结合。其 它技术包括将在平面固体支持物(“芯片”)上的肽文库暴露给抗体，并通 过在固相筛选中所应用的多种方法中的任何一种检测结合。此外，可以应 用噬菌体展示来筛选肽文库，经过数轮生物筛选后选择表位。
以下表1提供了已鉴定为适合于被抗LIV1抗体识别的线性表位的 LIV-1(SEQ ID NO：2)区域。
实施例12：免疫组织化学
应用商业可获得的石蜡包埋的人类组织微阵列通过免疫组织化学方法 评估LIV-1的表达。(Zymed Laboratories Inc，San Francisco CA；Cybrdi， Gaithersburg，MD；Clinomics Biosciences Inc，Cambridge UK)。应用原初 293T细胞和经LIV-1转染的293T细胞作为验证表达的对照。
在Ventana Discovery上应用标准细胞条件完成组织切片去石蜡化和 抗原恢复，随后在第一抗体中孵育60分钟。以10ug/ml应用兔抗人LIV-1 抗体(Chiron，Emeryville，CA)和兔IgG取血前对照(Chiron，Emeryville， CA)。将Ventana普遍第二试剂(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，Az) 和随后的Ventana DAB Map试剂盒(Ventana Medical Systems Inc.)用于 检测。使用Ventana苏木精和上蓝试剂(Ventana Medical Systems，Inc)用 于复染，并在分级醇中使切片脱水，在二甲苯中清洁并应用合成的固封介 质盖上盖玻片。
实施例13：癌对正常组织；Spotfire分析
也将微阵列数据用于确定多种癌性肿瘤类型和多种来自正常样本的组 织中LIV-1、SLC39A10、SLC39A11和SLC39A13的表达。应用DecisionSite 软件(Spotfire，Somerville，MA)和机构内部开发的Pipeline Pilot(SciTegic， San Diego，CA，机构内部的开发人Josef Ringgenberg)方案产生显示于图 12-15的图解描述。结果显示每一种目的肿瘤细胞抗原在许多癌类型中表达 升高，而在很多正常组织类型中有较低水平的表达。
实施例14：序列
LIV-1核苷酸序列；SEQ ID NO：1：
CTCGTGCCGAATTCGGCACGAGACCGCGTGTTCGCGCCTGGTAGAGATTTCTCGAAGACACCAGTGGGCCCGTGT
GGAACCAAACCTGCGCGCGTGGCCGGGCCGTGGGACAACGAGGCCGCGGAGACGAAGGCGCAATGGCGAGGAAGT
TATCTGTAATCTTGATCCTGACCTTTGCCCTCTCTGTCACAAATCCCCTTCATGAACTAAAAGCAGCTGCTTTCC
CCCAGACCACTGAGAAAATTAGTCCGAATTGGGAATCTGGCATTAATGTTGACTTGGCAATTTCCACACGGCAAT
ATCATCTACAACAGCTTTTCTACCGCTATGGAGAAAATAATTCTTTGTCAGTTGAAGGGTTCAGAAAATTACTTC
AAAATATAGGCATAGATAAGATTAAAAGAATCCATATACACCATGACCACGACCATCACTCAGACCACGAGCATC
ACTCAGACCATGAGCGTCACTCAGACCATGAGCATCACTCAGACCACGAGCATCACTCTGACCATGATCATCACT
CTCACCATAATCATGCTGCTTCTGGTAAAAATAAGCGAAAAGCTCTTTGCCCAGACCATGACTCAGATAGTTCAG
GTAAAGATCCTAGAAACAGCCAGGGGAAAGGAGCTCACCGACCAGAACATGCCAGTGGTAGAAGGAATGTCAAGG
ACAGTGTTAGTGCTAGTGAAGTGACCTCAACTGTGTACAACACTGTCTCTGAAGGAACTCACTTTCTAGAGACAA
TAGAGACTCCAAGACCTGGAAAACTCTTCCCCAAAGATGTAAGCAGCTCCACTCCACCCAGTGTCACATCAAAGA
GCCGGGTGAGCCGGCTGGCTGGTAGGAAAACAAATGAATCTGTGAGTGAGCCCCGAAAAGGCTTTATGTATTCCA
GAAACACAAATGAAAATCCTCAGGAGTGTTTCAATGCATCAAAGCTACTGACATCTCATGGCATGGGCATCCAGG
TTCCGCTGAATGCAACAGAGTTCAACTATCTCTGTCCAGCCATCATCAACCAAATTGATGCTAGATCTTGTCTGA
TTCATACAAGTGAAAAGAAGGCTGAAATCCCTCCAAAGACCTATTCATTACAAATAGCCTGGGTTGGTGGTTTTA
TAGCCATTTCCATCATCAGTTTCCTGTCTCTGCTGGGGGTTATCTTAGTGCCTCTCATGAATCGGGTGTTTTTCA
AATTTCTCCTGAGTTTCCTTGTGGCACTGGCCGTTGGGACTTTGAGTGGTGATGCTTTTTTACACCTTCTTCCAC
ATTCTCATGCAAGTCACCACCATAGTCATAGCCATGAAGAACCAGCAATGGAAATGAAAAGAGGACCACTTTTCA
GTCATCTGTCTTCTCAAAACATAGAAGAAAGTGCCTATTTTGATTCCACGTGGAAGGGTCTAACAGCTCTAGGAG
GCCTGTATTTCATGTTTCTTGTTGAACATGTCCTCACATTGATCAAACAATTTAAAGATAAGAAGAAAAAGAATC
AGAAGAAACCTGAAAATGATGATGATGTGGAGATTAAGAAGCAGTTGTCCAAGTATGAATCTCAACTTTCAACAA
ATGAGGAGAAAGTAGATACAGATGATCGAACTGAAGGCTATTTACGAGCAGACTCACAAGAGCCCTCCCACTTTG
ATTCTCAGCAGCCTGCAGTCTTGGAAGAAGAAGAGGTCATGATAGCTCATGCTCATCCACAGGAAGTCTACAATG
AATATGTACCCAGAGGGTGCAAGAATAAATGCCATTCACATTTCCACGATACACTCGGCCAGTCAGACGATCTCA
TTCACCACCATCATGACTACCATCATATTCTCCATCATCACCACCACCAAAACCACCATCCTCACAGTCACAGCC
AGCGCTACTCTCGGGAGGAGCTGAAAGATGCCGGCGTCGCCACTTTGGCCTGGATGGTGATAATGGGTGATGGCC
TGCACAATTTCAGCGATGGCCTAGCAATTGGTGCTGCTTTTACTGAAGGCTTATCAAGTGGTTTAAGTACTTCTG
TTGCTGTGTTCTGTCATGAGTTGCCTCATGAATTAGGTGACTTTGCTGTTCTACTAAAGGCTGGCATGACCGTTA
AGCAGGCTGTCCTTTATAATGCATTGTCAGCCATGCTGGCGTATCTTGGAATGGCAACAGGAATTTTCATTGGTC
ATTATGCTGAAAATGTTTCTATGTGGATATTTGCACTTACTGCTGGCTTATTCATGTATGTTGCTCTGGTTGATA
TGGTACCTGAAATGCTGCACAATGATGCTAGTGACCATGGATGTAGCCGCTGGGGGTATTTCTTTTTACAGAATG
CTGGGATGCTTTTGGGTTTTGGAATTATGTTACTTATTTCCATATTTGAACATAAAATCGTGTTTCGTATAAATT
TCTAGTTAAGGTTTAAATGCTAGAGTAGCTTAAAAAGTTGTCATAGTTTCAGTAGGTCATAGGGAGATGAGTTTG
TATGCTGTACTATGCAGCGTTTAAAGTTAGTGGGTTTTGTGATTTTTGTATTGAATATTGCTGTCTGTTACAAAG
TCAGTTAAAGGTACGTTTTAATATTTAAGTTATTCTATCTTGGAGATAAAATCTGTATGTGCAATTCACCGGTAT
TACCAGTTTATTATGTAAACAAGAGATTTGGCATGACATGTTCTGTATGTTTCAGGGAAAAATGTCTTTAATGCT
TTTTCAAGAACTAACACAGTTATTCCTATACTGGATTTTAGGTCTCTGAAGAACTGCTGGTG
LIV-1氨基酸序列；SEQ ID NO：2：
MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAISTRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGF
RKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHDHHSHHNHAASGKNKRKALCPDHD
SDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTSTVYNTVSEGTHFLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPS
VTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGFMYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDA
RSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFL
HLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDK
KKKNQKKPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQ
EVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVI
MGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAVLYNALSAMLAYLGMATG
IFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVPEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIV
FRINF
在本发明的一些实施方案中，LIV-1调节剂包含或涉及LIV-1多肽的 抗原性区域。LIV-1的抗原性区域包括但不限于以下的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5：
HHDHDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHNHAASGKNKRKALCPDHDSDS(SEQ ID NO：3)
KGAHRPEHASGRRNVKDSVSASE(SEQ ID NO：4)
HLLPHSHASHHHSHSHEEPA(SEQ ID NO：5)
在本发明的一些实施方案中，LIV-1调节剂包含和/或特异性地结合至 SEq ID NO：2的一个或多个序列。在一些实施方案中，LIV-1调节剂特异 性地结合至一个或多个具有选自以下SEq ID NO：361-SEQ ID NO：364或 SEQ ID NO：387-SEQ ID NO：391序列的LIV-1表位：
HSHSHEEPAMEMKRGPLFSH；SEQ ID NO：361
CFNASKLLSHGM；SEQ ID NO：362
GMGIQVPLNATEFNYL；SEQ ID NO：363
SVSASEVTSTVYNTVSEGT；SEQ ID NO：364
LHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAISTRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHD
HDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHNHAASGKNKRKALCPDHDSDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRR
NVKDSVSASEVTSTVYNTVSEGTHFLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPSVTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGF
MYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWV
GGFI；SEQ ID NO：387；N端
HLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDST；SEQ ID NO：388；TM 2/3
TEGLSS；SEQ ID NO：389；TM 4/5
HYAENVSM；SEQ ID NO：390；TM 6/7
VFRINF；SEQ ID NO：391；C端
在一些实施方案中，本发明的LIV-1调节剂具有下面的序列：
CHIR296-4SI；AAAGGCTGGCATGACCGTTAA(SEQ ID NO：367)
CHIR296-3SI；GACAGTGTTAGTGCTAGTGAA(SEQ ID NO：368)
CHIR296-2SI；CTAGTTAAGGTTTAAATGCTA(SEQ ID NO：369)
CHIR296-1SI；AAGGCTTATCAAGTGGTTTAA(SEQ ID NO：370)
CHIR296-7RC；GCAACCCTGAAACTCACCACTACGA(SEQ ID NO：371)
CHIR296-5RC；TACCGTACCCGTAGGTCCAAGGCG(SEQ ID NO：372)
CHIR296-2RC；TGTGGTACTGGTGCTGGTAGTGAGT(SEQ ID NO：373)
CHIR296-9；TGGTGAATGAGATCGTCTGACTGGC(SEQ ID NO：374)
CHIR296-8；AGGGCTCTTGTGAGTCTGCTCGTAA(SEQ ID NO：375)
CHIR296-7；AGCATCACCACTCAAAGTCCCAACG(SEQ ID NO：376)
CHIR296-6；GCCAGTGCCACAAGGAAACTCAGG(SEQ ID NO：377)
CHIR296-5；GCGGAACCTGGATGCCCATGCCAT(SEQ ID NO：378)
CHIR296-4；ACTGGCATGTTCTGGTCGGTGAGC(SEQ ID NO：379)
CHIR296-3；ATGCTCATGGTCTGAGTGACGCTCA(SEQ ID NO：380)
CHIR296-2；TGAGTGATGGTCGTGGTCATGGTGT(SEQ ID NO：381)
CHIR296-1；GAGAGGGCAAAGGTCAGGATCAAGA(SEQ ID NO：382).
SLC39A10；SEQ ID NO.383；NP_065075.1
MKVHMHTKFCLICLLTFIFHHCNHCHEEHDHGPEALHRQHRGMTELEPSKFSKQAAENEKKYY
IEKLFERYGENGRLSFFGLEKLLTNLGLGERKVVEINHEDLGHDHVSHLDILAVQEGKHFHSH
NHQHSHNHLNSENQTVTSVSTKRNHKCDPEKETVEVSVKSDDKHMHDHNHRLRHHHRLHHHLD
HNNTHHFHNDSITPSERGEPSNEPSTETNKTQEQSDVKLPKGKRKKKGRKSNENSEVITPGFP
PNHDQGEQYEHNRVHKPDRVHNPGHSHVHLPERNGHDPGRGHQDLDPDNEGELRHTRKREAPH
VKNNAIISLRKDLNEDDHHHECLNVTQLLKYYGHGANSPISTDLFTYLCPALLYQIDSRLCIE
HFDKLLVEDINKDKNLVPEDEANIGASAWICGIISITVISLLSLLGVILVPIINQGCFKFLLT
FLVALAVGTMSGDALLHLLPHSQGGHDHSHQHAHGHGHSHGHESNKFLEEYDAVLKGLVALGG
IYLLFIIEHCIRMFKHYKQQRGKQKWFMKQNTEESTIGRKLSDHKLNNTPDSDWLQLKPLAGT
DDSVVSEDRLNETELTDLEGQQESPPKNYLCIEEEKIIDHSHSDGLHTIHEHDLHAAAHNHHG
ENKTVLRKHNHQWHHKHSHHSHGPCHSGSDLKETGIANIAWMVIMGDGIHNFSDGLAIGAAFS
AGLTGGISTSIAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAIVYNLLSAMMAYIGMLIGTAVGQYA
NNITLWIFAVTAGMFLYVALVDMLPEMLHGDGDNEEHGFCPVGQFILQNLGLLFGFAIMLVIA
LYEDKIVFDIQF
SLC39A11；SEQ ID NO：384；NP_631916
MLQGHSSVFQALLGTFFTWGMTAAGAALVFVFSSGQRRILDGSLGFAAGVMLAASYWSLLAPAVEMATSSGGFGA
FAFFPVAVGFTLGAAFVYLADLLMPHLGAAEDPQTALALNFGSTLMKKKSDPEGPALLFPESELSIRIDKSENGE
AYQRKKAAATGLPEGPAVPVPSRGNLAQPGGSSWRRIALLILAITIHNVPEGLAVGVGFGAIEKTASATFESARN
LAIGIGIQNFPEGLAVSLPLRGAGFSTWRAFWYGQLSGMVEPLAGVFGAFAVVLAEPILPYALAFAAGAMVYVVM
DDIIPEAQISGNGKLASWASILGFVVMMSLDVGLG
SLC39A13；SEQ ID NO：385；NP_689477.2
MPGCPCPGCGMAGPRLLFLTALALELLGRAGGSQPALRSRGTATACRLDNKESESWGALLSGE
RLDTWICSLLGSLMVGLSGVFPLLVIPLEMGTMLRSEAGAWRLKQLLSFALGGLLGNVFLHLL
PEAWAYTCSASPGGEGQSLQQQQQLGLWVIAGILTFLALEKMFLDSKEEGTSQAPNKDPTAAA
AALNGGHCLAQPAAEPGLGAVVRSIKVSGYLNLLANTIDNFTHGLAVAASFLVSKKIGLLTTM
AILLHEIPHEVGDFAILLRAGFDRWSAAKLQLSTALGGLLGAGFAICTQSPKGVEETAAWVLP
FTSGGFLYIALVNVLPDLLEEEDPWRSLQQLLLLCAGIVVMVLFSLFVD
SEQ ID NO：386
GFIAISIISFLSLLGVLVPLMNRVFFKFLLSLVALAVGTLSGDAFLLLPHSHASHHHSHSHEP
AMEMKRGPLFSHLSQNIEESAYFDSTWKLTALGGLYFMFLVEHLTLIKQFKDKKKKNQKPEND
DDVEIKKQLSYESQLSTNEEKVDTDRTEGYLRADSQEPSHDSQQPAVLEEEEVMIHAHPQEVY
NEYVPRGKNKCHSHFHDTLGQSDLIHHHHDYHHILHHHHQNHHPHSHSQRYSEELKDAGVATL
AWMVMGDGLHNFSDGLAIGAFTEGLSSGLSTSVAFCHELPHELGDFAVLKAGMTVKQAVLYNA
LAMLAYLGMATGIFIGYAENVSMWIFALTAGFMYVALVDMVPEMLHDASDHGCSRWGYFFLMA
GMLLGFGIMLLIPLNIKSCSYKFLVKV
LIV-1-δ；SEQ ID NO：365
MGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFL
SLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRG
PLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDKKKKMQKKPENDDDV
EIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQEV
YNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDA
GVATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMT
VKQAVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVSF
SEQ ID NO：366
MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAISTRQYHLQQLFYR
YGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDH
DHHSHHNHAASGKNKRKALCPDHDSDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTS
TVYNTVSEGTHFLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPSVTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGFM
YSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIP
PKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHLL
PHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVL
TLIKQFKDKKKKNQKKPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHF
DSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQEVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHH
HHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSV
AVFCHELPHELGDFAVLLKADMTVKQAVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALT
AGLFMYVALVDMVPEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIVFRINF
尽管已参照其特定的实施方案对本发明进行了描述，但本领域技术人 员应当理解可以进行各种改变以及可以以等同方式进行替代，而不背离本 发明真实精神和范围的情况。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材 料、物质组合物、处理、处理步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有 的此类修改都在本发明的范围内。
序列表
<110>诺瓦提斯疫苗和诊断公司
<120>治疗、诊断或检测癌症的方法
<130>20366-039WO1
<150>US 60/791,871
<151>2006-04-13
<160>391
<170>用于Windows的FastSEQ版本4.0
<210>1
<211>2762
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ctcgtgccga attcggcacg agaccgcgtg ttcgcgcctg gtagagattt ctcgaagaca 60
ccagtgggcc cgtgtggaac caaacctgcg cgcgtggccg ggccgtggga caacgaggcc 120
gcggagacga aggcgcaatg gcgaggaagt tatctgtaat cttgatcctg acctttgccc 180
tctctgtcac aaatcccctt catgaactaa aagcagctgc tttcccccag accactgaga 240
aaattagtcc gaattgggaa tctggcatta atgttgactt ggcaatttcc acacggcaat 300
atcatctaca acagcttttc taccgctatg gagaaaataa ttctttgtca gttgaagggt 360
tcagaaaatt acttcaaaat ataggcatag ataagattaa aagaatccat atacaccatg 420
accacgacca tcactcagac cacgagcatc actcagacca tgagcgtcac tcagaccatg 480
agcatcactc agaccacgag catcactctg accatgatca tcactctcac cataatcatg 540
ctgcttctgg taaaaataag cgaaaagctc tttgcccaga ccatgactca gatagttcag 600
gtaaagatcc tagaaacagc caggggaaag gagctcaccg accagaacat gccagtggta 660
gaaggaatgt caaggacagt gttagtgcta gtgaagtgac ctcaactgtg tacaacactg 720
tctctgaagg aactcacttt ctagagacaa tagagactcc aagacctgga aaactcttcc 780
ccaaagatgt aagcagctcc actccaccca gtgtcacatc aaagagccgg gtgagccggc 840
tggctggtag gaaaacaaat gaatctgtga gtgagccccg aaaaggcttt atgtattcca 900
gaaacacaaa tgaaaatcct caggagtgtt tcaatgcatc aaagctactg acatctcatg 960
gcatgggcat ccaggttccg ctgaatgcaa cagagttcaa ctatctctgt ccagccatca 1020
tcaaccaaat tgatgctaga tcttgtctga ttcatacaag tgaaaagaag gctgaaatcc 1080
ctccaaagac ctattcatta caaatagcct gggttggtgg ttttatagcc atttccatca 1140
tcagtttcct gtctctgctg ggggttatct tagtgcctct catgaatcgg gtgtttttca 1200
aatttctcct gagtttcctt gtggcactgg ccgttgggac tttgagtggt gatgcttttt 1260
tacaccttct tccacattct catgcaagtc accaccatag tcatagccat gaagaaccag 1320
caatggaaat gaaaagagga ccacttttca gtcatctgtc ttctcaaaac atagaagaaa 1380
gtgcctattt tgattccacg tggaagggtc taacagctct aggaggcctg tatttcatgt 1440
ttcttgttga acatgtcctc acattgatca aacaatttaa agataagaag aaaaagaatc 1500
agaagaaacc tgaaaatgat gatgatgtgg agattaagaa gcagttgtcc aagtatgaat 1560
ctcaactttc aacaaatgag gagaaagtag atacagatga tcgaactgaa ggctatttac 1620
gagcagactc acaagagccc tcccactttg attctcagca gcctgcagtc ttggaagaag 1680
aagaggtcat gatagctcat gctcatccac aggaagtcta caatgaatat gtacccagag 1740
ggtgcaagaa taaatgccat tcacatttcc acgatacact cggccagtca gacgatctca 1800
ttcaccacca tcatgactac catcatattc tccatcatca ccaccaccaa aaccaccatc 1860
ctcacagtca cagccagcgc tactctcggg aggagctgaa agatgccggc gtcgccactt 1920
tggcctggat ggtgataatg ggtgatggcc tgcacaattt cagcgatggc ctagcaattg 1980
gtgctgcttt tactgaaggc ttatcaagtg gtttaagtac ttctgttgct gtgttctgtc 2040
atgagttgcc tcatgaatta ggtgactttg ctgttctact aaaggctggc atgaccgtta 2100
agcaggctgt cctttataat gcattgtcag ccatgctggc gtatcttgga atggcaacag 2160
gaattttcat tggtcattat gctgaaaatg tttctatgtg gatatttgca cttactgctg 2220
gcttattcat gtatgttgct ctggttgata tggtacctga aatgctgcac aatgatgcta 2280
gtgaccatgg atgtagccgc tgggggtatt tctttttaca gaatgctggg atgcttttgg 2340
gttttggaat tatgttactt atttccatat ttgaacataa aatcgtgttt cgtataaatt 2400
tctagttaag gtttaaatgc tagagtagct taaaaagttg tcatagtttc agtaggtcat 2460
agggagatga gtttgtatgc tgtactatgc agcgtttaaa gttagtgggt tttgtgattt 2520
ttgtattgaa tattgctgtc tgttacaaag tcagttaaag gtacgtttta atatttaagt 2580
tattctatct tggagataaa atctgtatgt gcaattcacc ggtattacca gtttattatg 2640
taaacaagag atttggcatg acatgttctg tatgtttcag ggaaaaatgt ctttaatgct 2700
ttttcaagaa ctaacacagt tattcctata ctggatttta ggtctctgaa gaactgctgg 2760
tg 2762
<210>2
<211>755
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Ala Arg Lys Leu Ser Val Ile Leu Ile Leu Thr Phe Ala Leu Ser
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr
20 25 30
Thr Glu Lys Ile Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu
35 40 45
Ala Ile Ser Thr Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Asn Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln
65 70 75 80
Asn Ile Gly Ile Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His
85 90 95
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
100 105 110
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asp His
115 120 125
His Ser His His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
130 135 140
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser Gly Lys Asp Pro Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
165 170 175
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr
180 185 190
Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu Glu Thr Ile Glu Thr Pro
195 200 205
Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val Ser Ser Ser Thr Pro Pro
210 215 220
Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg Leu Ala Gly Arg Lys Thr
225 230 235 240
Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly Phe Met Tyr Ser Arg Asn
245 250 255
Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Thr
260 265 270
Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn
275 280 285
Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu
290 295 300
Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser
325 330 335
Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val
340 345 350
Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr
355 360 365
Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
370 375 380
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg
385 390 395 400
Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala
405 410 415
Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr
420 425 430
Phe Met Phe Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys
435 440 445
Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val
450 455 460
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn
465 470 475 480
Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala
485 490 495
Asp Ser Gln Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu
500 505 510
Glu Glu Glu Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr
515 520 525
Asn Glu Tyr Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe
530 535 540
His Asp Thr Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp
545 550 555 560
Tyr His His Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His
565 570 575
Ser His Ser Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val
580 585 590
Ala Thr Leu Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe
595 600 605
Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser
610 615 620
Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu
625 630 635 640
Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln
645 650 655
Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met
660 665 670
Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp
675 680 685
Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp
690 695 700
Met Val Pro Glu Met Leu His Asn Asp Ala Ser Asp His Gly Cys Ser
705 710 715 720
Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Gln Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe
725 730 735
Gly Ile Met Leu Leu Ile Ser Ile Phe Glu His Lys Ile Val Phe Arg
740 745 750
Ile Asn Phe
755
<210>3
<211>55
<212>PRT
<213>智人
<400>3
His His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10 15
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
20 25 30
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
35 40 45
Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
50 55
<210>4
<211>23
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
20
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>5
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10 15
Glu Glu Pro Ala
20
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>6
His His Asp His Asp His His Ser
1 5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>7
His Asp His Asp His His Ser Asp
1 5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Asp His Asp His His Ser Asp His
1 5
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>9
His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>11
His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>12
His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>13
Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>15
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>15
His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>17
His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5
<210>18
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>18
His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5
<210>20
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5
<210>21
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>21
His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5
<210>22
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>24
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>24
His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>25
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>26
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>27
His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>28
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>29
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>29
His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>30
His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>33
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>33
His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5
<210>34
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5
<210>35
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>35
His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>36
His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5
<210>37
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5
<210>39
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>39
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5
<210>40
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5
<210>41
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>41
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5
<210>42
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5
<210>43
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5
<210>44
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>44
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5
<210>45
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>45
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>46
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>47
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5
<210>48
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>48
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5
<210>49
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>49
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5
<210>50
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>51
Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>54
His His Asp His Asp His His Ser Asp
1 5
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>55
His Asp His Asp His His Ser Asp His
1 5
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>56
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>57
His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>58
Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>59
His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>60
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>62
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>63
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>63
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5
<210>64
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>64
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5
<210>65
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>65
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5
<210>66
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>66
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>67
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>68
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5
<210>69
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>69
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>70
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>71
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>72
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>74
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>75
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>75
His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>76
Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>77
His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>78
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>79
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>80
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5
<210>81
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>81
His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>82
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>83
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>84
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>85
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>86
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5
<210>87
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>87
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>88
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5
<210>89
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>89
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>90
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>91
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>92
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>93
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>94
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>95
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>96
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>97
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5
<210>98
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>98
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5
<210>99
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>99
Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>100
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>101
His His Asp His Asp His His Ser Asp His
1 5 10
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>102
His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>103
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>104
His Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>105
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>106
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>106
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>107
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>107
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>108
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>108
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>109
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>109
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5 10
<210>110
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>110
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5 10
<210>111
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>111
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5 10
<210>112
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>112
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5 10
<210>113
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>113
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5 10
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>114
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>115
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>115
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>116
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>116
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>117
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>117
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>118
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>118
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>119
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>119
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>120
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>120
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>121
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>121
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>122
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>122
His Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>123
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>123
Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>124
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>124
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>125
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>125
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>126
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>126
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5 10
<210>127
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>127
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5 10
<210>128
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>128
His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5 10
<210>129
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>129
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5 10
<210>130
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>130
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5 10
<210>131
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>131
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5 10
<210>132
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>132
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5 10
<210>133
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>133
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5 10
<210>134
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>134
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5 10
<210>135
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>135
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5 10
<210>136
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>136
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5 10
<210>137
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>137
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5 10
<210>138
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>138
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5 10
<210>139
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>139
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5 10
<210>140
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>140
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5 10
<210>141
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>141
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5 10
<210>142
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>142
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5 10
<210>143
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>143
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5 10
<210>144
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>144
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5 10
<210>145
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>145
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5 10
<210>146
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>146
Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5 10
<210>147
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>147
His His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>148
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>148
His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>149
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>149
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>150
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>150
His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>151
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>151
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>152
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>152
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>153
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>153
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>154
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>154
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5 10
<210>155
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>155
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5 10
<210>156
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>156
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5 10
<210>157
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>157
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5 10
<210>158
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>158
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5 10
<210>159
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>159
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>160
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>160
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>161
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>161
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>162
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>162
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>163
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>163
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>164
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>164
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>165
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>165
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>166
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>166
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>167
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>167
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>168
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>168
His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>169
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>169
Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>170
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>170
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>171
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>171
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5 10
<210>172
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>172
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5 10
<210>173
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>173
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5 10
<210>174
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>174
His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5 10
<210>175
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>175
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5 10
<210>176
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>176
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5 10
<210>177
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>177
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5 10
<210>178
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>178
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5 10
<210>179
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>179
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5 10
<210>180
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>180
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5 10
<210>181
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>181
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5 10
<210>182
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>182
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5 10
<210>183
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>183
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5 10
<210>184
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>184
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5 10
<210>185
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>185
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5 10
<210>186
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>186
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5 10
<210>187
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>187
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5 10
<210>188
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>188
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5 10
<210>189
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>189
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5 10
<210>190
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>190
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5 10
<210>191
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>191
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5 10
<210>192
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>192
His His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>193
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>193
His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>194
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>194
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>195
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>195
His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>196
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>196
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>197
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>197
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>198
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>198
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5 10
<210>199
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>199
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5 10
<210>200
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>200
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5 10
<210>201
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>201
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5 10
<210>202
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>202
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5 10
<210>203
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>203
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>204
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>204
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>205
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>205
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>206
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>206
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>207
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>207
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>208
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>208
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>209
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>209
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>210
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>210
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>211
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>211
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>212
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>212
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>213
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>213
His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>214
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>214
Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>215
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>215
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5 10
<210>216
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>216
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5 10
<210>217
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>217
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5 10
<210>218
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>218
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5 10
<210>219
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>219
His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5 10
<210>220
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>220
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5 10
<210>221
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>221
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5 10
<210>222
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>222
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5 10
<210>223
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>223
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5 10
<210>224
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>224
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5 10
<210>225
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>225
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5 10
<210>226
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>226
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5 10
<210>227
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>227
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5 10
<210>228
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>228
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5 10
<210>229
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>229
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5 10
<210>230
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>230
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5 10
<210>231
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>231
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5 10
<210>232
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>232
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5 10
<210>233
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>233
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5 10
<210>234
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>234
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5 10
<210>235
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>235
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5 10
<210>236
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>236
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His
1 5
<210>237
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>237
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala
1 5
<210>238
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>238
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser
1 5
<210>239
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>239
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5
<210>240
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>240
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5
<210>241
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>241
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5
<210>242
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>242
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5
<210>243
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>243
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5
<210>244
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>244
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5
<210>245
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>245
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5
<210>246
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>246
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5
<210>247
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>247
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5
<210>248
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>248
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5
<210>249
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>249
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5
<210>250
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>250
Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5
<210>251
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>251
Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5
<210>252
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>252
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala
1 5
<210>253
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>253
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser
1 5
<210>254
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>254
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5
<210>255
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>255
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5
<210>256
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>256
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5
<210>257
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>257
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5
<210>258
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>258
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5
<210>259
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>259
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5
<210>260
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>260
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5
<210>261
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>261
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5
<210>262
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>262
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5
<210>263
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>263
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5
<210>264
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>264
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5
<210>265
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>265
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5
<210>266
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>266
Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5
<210>267
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>267
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser
1 5 10
<210>268
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>268
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5 10
<210>269
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>269
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5 10
<210>270
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>270
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5 10
<210>271
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>271
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5 10
<210>272
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>272
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5 10
<210>273
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>273
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10
<210>274
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>274
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5 10
<210>275
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>275
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5 10
<210>276
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>276
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5 10
<210>277
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>277
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5 10
<210>278
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>278
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5 10
<210>279
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>279
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5 10
<210>280
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>280
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5 10
<210>281
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>281
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5 10
<210>282
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>282
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5 10
<210>283
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>283
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5 10
<210>284
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>284
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5 10
<210>285
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>285
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5 10
<210>286
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>286
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10
<210>287
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>287
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5 10
<210>288
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>288
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5 10
<210>289
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>289
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5 10
<210>290
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>290
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5 10
<210>291
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>291
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5 10
<210>292
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>292
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5 10
<210>293
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>293
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5 10
<210>294
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>294
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5 10
<210>295
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>295
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5 10
<210>296
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>296
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5 10
<210>297
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>297
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5 10
<210>298
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>298
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10
<210>299
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>299
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5 10
<210>300
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>300
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5 10
<210>301
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>301
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5 10
<210>302
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>302
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5 10
<210>303
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>303
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5 10
<210>304
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>304
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5 10
<210>305
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>305
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5 10
<210>306
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>306
His Leu Leu Pro His Ser His Ala
1 5
<210>307
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>307
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
1 5
<210>308
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>308
Leu Pro His Ser His Ala Ser His
1 5
<210>309
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>309
Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5
<210>310
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>310
His Ser His Ala Ser His His His
1 5
<210>311
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>311
Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5
<210>312
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>312
His Ala Ser His His His Ser His
1 5
<210>313
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>313
Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5
<210>314
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>314
Ser His His His Ser His Ser His
1 5
<210>315
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>315
His His His Ser His Ser His Glu
1 5
<210>316
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>316
His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5
<210>317
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>317
His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5
<210>318
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>318
Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5
<210>319
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>319
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
1 5
<210>320
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>320
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His
1 5
<210>321
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>321
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5
<210>322
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>322
Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5
<210>323
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>323
His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5
<210>324
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>324
Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5
<210>325
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>325
His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5
<210>326
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>326
Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5
<210>327
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>327
Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5
<210>328
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>328
His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5
<210>329
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>329
His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5
<210>330
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>330
His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5
<210>331
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>331
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His
1 5 10
<210>332
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>332
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5 10
<210>333
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>333
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5 10
<210>334
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>334
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5 10
<210>335
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>335
His Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5 10
<210>336
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>336
Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5 10
<210>337
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>337
His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10
<210>338
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>338
Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5 10
<210>339
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>339
Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5 10
<210>340
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>340
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5 10
<210>341
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>341
His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5 10
<210>342
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>342
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5 10
<210>343
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>343
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5 10
<210>344
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>344
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5 10
<210>345
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>345
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5 10
<210>346
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>346
His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5 10
<210>347
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>347
Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10
<210>348
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>348
His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5 10
<210>349
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>349
Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5 10
<210>350
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>350
Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5 10
<210>351
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>351
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5 10
<210>352
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>352
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5 10
<210>353
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>353
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5 10
<210>354
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>354
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5 10
<210>355
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>355
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5 10
<210>356
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>356
His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10
<210>357
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>357
Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5 10
<210>358
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>358
His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5 10
<210>359
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>359
Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5 10
<210>360
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>360
Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5 10
<210>361
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>361
His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro
1 5 10 15
Leu Phe Ser His
20
<210>362
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>362
Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Ser His Gly Met
1 5 10
<210>363
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>363
Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn Tyr Leu
1 5 10 15
<210>364
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>364
Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr Asn Thr Val Ser
1 5 10 15
Glu Gly Thr
<210>365
<211>433
<212>PRT
<213>智人
<400>365
Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn Tyr Leu Cys
1 5 10 15
Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu Ile His Thr
20 25 30
Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser Leu Gln Ile
35 40 45
Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser Phe Leu Ser
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val Phe Phe Lys
65 70 75 80
Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr Leu Ser Gly
85 90 95
Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
100 105 110
Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu
115 120 125
Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp
130 135 140
Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr Phe Met Phe
145 150 155 160
Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys Asp Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val Glu Ile Lys
180 185 190
Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn Glu Glu Lys
195 200 205
Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala Asp Ser Gln
210 215 220
Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu Glu Glu Glu
225 230 235 240
Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr Asn Glu Tyr
245 250 255
Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe His Asp Thr
260 265 270
Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp Tyr His His
275 280 285
Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His Ser His Ser
290 295 300
Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val Ala Thr Leu
305 310 315 320
Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe Ser Asp Gly
325 330 335
Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser Gly Leu Ser
340 345 350
Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp
355 360 365
Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln Ala Val Leu
370 375 380
Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met Ala Thr Gly
385 390 395 400
Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp Ile Phe Ala
405 410 415
Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp Met Val Ser
420 425 430
Phe
<210>366
<211>755
<212>PRT
<213>智人
<400>366
Met Ala Arg Lys Leu Ser Val Ile Leu Ile Leu Thr Phe Ala Leu Ser
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr
20 25 30
Thr Glu Lys Ile Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu
35 40 45
Ala Ile Ser Thr Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Asn Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln
65 70 75 80
Asn Ile Gly Ile Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His
85 90 95
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
100 105 110
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asp His
115 120 125
His Ser His His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
130 135 140
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser Gly Lys Asp Pro Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
165 170 175
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr
180 185 190
Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu Glu Thr Ile Glu Thr Pro
195 200 205
Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val Ser Ser Ser Thr Pro Pro
210 215 220
Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg Leu Ala Gly Arg Lys Thr
225 230 235 240
Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly Phe Met Tyr Ser Arg Asn
245 250 255
Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Thr
260 265 270
Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn
275 280 285
Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu
290 295 300
Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser
325 330 335
Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val
340 345 350
Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr
355 360 365
Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
370 375 380
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg
385 390 395 400
Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala
405 410 415
Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr
420 425 430
Phe Met Phe Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys
435 440 445
Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val
450 455 460
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn
465 470 475 480
Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala
485 490 495
Asp Ser Gln Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu
500 505 510
Glu Glu Glu Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr
515 520 525
Asn Glu Tyr Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe
530 535 540
His Asp Thr Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp
545 550 555 560
Tyr His His Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His
565 570 575
Ser His Ser Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val
580 585 590
Ala Thr Leu Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe
595 600 605
Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser
610 615 620
Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu
625 630 635 640
Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Asp Met Thr Val Lys Gln
645 650 655
Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met
660 665 670
Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp
675 680 685
Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp
690 695 700
Met Val Pro Glu Met Leu His Asn Asp Ala Ser Asp His Gly Cys Ser
705 710 715 720
Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Gln Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe
725 730 735
Gly Ile Met Leu Leu Ile Ser Ile Phe Glu His Lys Ile Val Phe Arg
740 745 750
Ile Asn Phe
755
<210>367
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>367
aaaggctggc atgaccgtta a 21
<210>368
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>368
gacagtgtta gtgctagtga a 21
<210>369
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>369
ctagttaagg tttaaatgct a 21
<210>370
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>370
aaggcttatc aagtggttta a 21
<210>371
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>371
gcaaccctga aactcaccac tacga 25
<210>372
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>372
taccgtaccc gtaggtccaa ggcg 24
<210>373
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>373
tgtggtactg gtgctggtag tgagt 25
<210>374
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>374
tggtgaatga gatcgtctga ctggc 25
<210>375
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>375
agggctcttg tgagtctgct cgtaa 25
<210>376
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>376
agcatcacca ctcaaagtcc caacg 25
<210>377
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>377
gccagtgcca caaggaaact cagg 24
<210>378
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>378
gcggaacctg gatgcccatg ccat 24
<210>379
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>379
actggcatgt tctggtcggt gagc 24
<210>380
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>380
atgctcatgg tctgagtgac gctca 25
<210>381
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>381
tgagtgatgg tcgtggtcat ggtgt 25
<210>382
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>382
gagagggcaa aggtcaggat caaga 25
<210>383
<211>831
<212>PRT
<213>智人
<400>383
Met Lys Val His Met His Thr Lys Phe Cys Leu Ile Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Phe Ile Phe His His Cys Asn His Cys His Glu Glu His Asp His Gly
20 25 30
Pro Glu Ala Leu His Arg Gln His Arg Gly Met Thr Glu Leu Glu Pro
35 40 45
Ser Lys Phe Ser Lys Gln Ala Ala Glu Asn Glu Lys Lys Tyr Tyr Ile
50 55 60
Glu Lys Leu Phe Glu Arg Tyr Gly Glu Asn Gly Arg Leu Ser Phe Phe
65 70 75 80
Gly Leu Glu Lys Leu Leu Thr Asn Leu Gly Leu Gly Glu Arg Lys Val
85 90 95
Val Glu Ile Asn His Glu Asp Leu Gly His Asp His Val Ser His Leu
100 105 110
Asp Ile Leu Ala Val Gln Glu Gly Lys His Phe His Ser His Asn His
115 120 125
Gln His Ser His Asn His Leu Asn Ser Glu Asn Gln Thr Val Thr Ser
130 135 140
Val Ser Thr Lys Arg Asn His Lys Cys Asp Pro Glu Lys Glu Thr Val
145 150 155 160
Glu Val Ser Val Lys Ser Asp Asp Lys His Met His Asp His Asn His
165 170 175
Arg Leu Arg His His His Arg Leu His His His Leu Asp His Asn Asn
180 185 190
Thr His His Phe His Asn Asp Ser Ile Thr Pro Ser Glu Arg Gly Glu
195 200 205
Pro Ser Asn Glu Pro Ser Thr Glu Thr Asn Lys Thr Gln Glu Gln Ser
210 215 220
Asp Val Lys Leu Pro Lys Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Arg Lys Ser
225 230 235 240
Asn Glu Asn Ser Glu Val Ile Thr Pro Gly Phe Pro Pro Asn His Asp
245 250 255
Gln Gly Glu Gln Tyr Glu His Asn Arg Val His Lys Pro Asp Arg Val
260 265 270
His Asn Pro Gly His Ser His Val His Leu Pro Glu Arg Asn Gly His
275 280 285
Asp Pro Gly Arg Gly His Gln Asp Leu Asp Pro Asp Asn Glu Gly Glu
290 295 300
Leu Arg His Thr Arg Lys Arg Glu Ala Pro His Val Lys Asn Asn Ala
305 310 315 320
Ile Ile Ser Leu Arg Lys Asp Leu Asn Glu Asp Asp His His His Glu
325 330 335
Cys Leu Asn Val Thr Gln Leu Leu Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Asn
340 345 350
Ser Pro Ile Ser Thr Asp Leu Phe Thr Tyr Leu Cys Pro Ala Leu Leu
355 360 365
Tyr Gln Ile Asp Ser Arg Leu Cys Ile Glu His Phe Asp Lys Leu Leu
370 375 380
Val Glu Asp Ile Asn Lys Asp Lys Asn Leu Val Pro Glu Asp Glu Ala
385 390 395 400
Asn Ile Gly Ala Ser Ala Trp Ile Cys Gly Ile Ile Ser Ile Thr Val
405 410 415
Ile Ser Leu Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Ile Ile Asn
420 425 430
Gln Gly Cys Phe Lys Phe Leu Leu Thr Phe Leu Val Ala Leu Ala Val
435 440 445
Gly Thr Met Ser Gly Asp Ala Leu Leu His Leu Leu Pro His Ser Gln
450 455 460
Gly Gly His Asp His Ser His Gln His Ala His Gly His Gly His Ser
465 470 475 480
His Gly His Glu Ser Asn Lys Phe Leu Glu Glu Tyr Asp Ala Val Leu
485 490 495
Lys Gly Leu Val Ala Leu Gly Gly Ile Tyr Leu Leu Phe Ile Ile Glu
500 505 510
His Cys Ile Arg Met Phe Lys His Tyr Lys Gln Gln Arg Gly Lys Gln
515 520 525
Lys Trp Phe Met Lys Gln Asn Thr Glu Glu Ser Thr Ile Gly Arg Lys
530 535 540
Leu Ser Asp His Lys Leu Asn Asn Thr Pro Asp Ser Asp Trp Leu Gln
545 550 555 560
Leu Lys Pro Leu Ala Gly Thr Asp Asp Ser Val Val Ser Glu Asp Arg
565 570 575
Leu Asn Glu Thr Glu Leu Thr Asp Leu Glu Gly Gln Gln Glu Ser Pro
580 585 590
Pro Lys Asn Tyr Leu Cys Ile Glu Glu Glu Lys Ile Ile Asp His Ser
595 600 605
His Ser Asp Gly Leu His Thr Ile His Glu His Asp Leu His Ala Ala
610 615 620
Ala His Asn His His Gly Glu Asn Lys Thr Val Leu Arg Lys His Asn
625 630 635 640
His Gln Trp His His Lys His Ser His His Ser His Gly Pro Cys His
645 650 655
Ser Gly Ser Asp Leu Lys Glu Thr Gly Ile Ala Asn Ile Ala Trp Met
660 665 670
Val Ile Met Gly Asp Gly Ile His Asn Phe Ser Asp Gly Leu Ala Ile
675 680 685
Gly Ala Ala Phe Ser Ala Gly Leu Thr Gly Gly Ile Ser Thr Ser Ile
690 695 700
Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp Phe Ala Val
705 710 715 720
Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln Ala Ile Val Tyr Asn Leu
725 730 735
Leu Ser Ala Met Met Ala Tyr Ile Gly Met Leu Ile Gly Thr Ala Val
740 745 750
Gly Gln Tyr Ala Asn Asn Ile Thr Leu Trp Ile Phe Ala Val Thr Ala
755 760 765
Gly Met Phe Leu Tyr Val Ala Leu Val Asp Met Leu Pro Glu Met Leu
770 775 780
His Gly Asp Gly Asp Asn Glu Glu His Gly Phe Cys Pro Val Gly Gln
785 790 795 800
Phe Ile Leu Gln Asn Leu Gly Leu Leu Phe Gly Phe Ala Ile Met Leu
805 810 815
Val Ile Ala Leu Tyr Glu Asp Lys Ile Val Phe Asp Ile Gln Phe
820 825 830
<210>384
<211>335
<212>PRT
<213>智人
<400>384
Met Leu Gln Gly His Ser Ser Val Phe Gln Ala Leu Leu Gly Thr Phe
1 5 10 15
Phe Thr Trp Gly Met Thr Ala Ala Gly Ala Ala Leu Val Phe Val Phe
20 25 30
Ser Ser Gly Gln Arg Arg Ile Leu Asp Gly Ser Leu Gly Phe Ala Ala
35 40 45
Gly Val Met Leu Ala Ala Ser Tyr Trp Ser Leu Leu Ala Pro Ala Val
50 55 60
Glu Met Ala Thr Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ala Phe Ala Phe Phe Pro
65 70 75 80
Val Ala Val Gly Phe Thr Leu Gly Ala Ala Phe Val Tyr Leu Ala Asp
85 90 95
Leu Leu Met Pro His Leu Gly Ala Ala Glu Asp Pro Gln Thr Ala Leu
100 105 110
Ala Leu Asn Phe Gly Ser Thr Leu Met Lys Lys Lys Ser Asp Pro Glu
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Leu Phe Pro Glu Ser Glu Leu Ser Ile Arg Ile Asp
130 135 140
Lys Ser Glu Asn Gly Glu Ala Tyr Gln Arg Lys Lys Ala Ala Ala Thr
145 150 155 160
Gly Leu Pro Glu Gly Pro Ala Val Pro Val Pro Ser Arg Gly Asn Leu
165 170 175
Ala Gln Pro Gly Gly Ser Ser Trp Arg Arg Ile Ala Leu Leu Ile Leu
180 185 190
Ala Ile Thr Ile His Asn Val Pro Glu Gly Leu Ala Val Gly Val Gly
195 200 205
Phe Gly Ala Ile Glu Lys Thr Ala Ser Ala Thr Phe Glu Ser Ala Arg
210 215 220
Asn Leu Ala Ile Gly Ile Gly Ile Gln Asn Phe Pro Glu Gly Leu Ala
225 230 235 240
Val Ser Leu Pro Leu Arg Gly Ala Gly Phe Ser Thr Trp Arg Ala Phe
245 250 255
Trp Tyr Gly Gln Leu Ser Gly Met Val Glu Pro Leu Ala Gly Val Phe
260 265 270
Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Ala Glu Pro Ile Leu Pro Tyr Ala Leu
275 280 285
Ala Phe Ala Ala Gly Ala Met Val Tyr Val Val Met Asp Asp Ile Ile
290 295 300
Pro Glu Ala Gln Ile Ser Gly Asn Gly Lys Leu Ala Ser Trp Ala Ser
305 310 315 320
Ile Leu Gly Phe Val Val Met Met Ser Leu Asp Val Gly Leu Gly
325 330 335
<210>385
<211>364
<212>PRT
<213>智人
<400>385
Met Pro Gly Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Met Ala Gly Pro Arg Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Thr Ala Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gly Arg Ala Gly Gly
20 25 30
Ser Gln Pro Ala Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ala Thr Ala Cys Arg Leu
35 40 45
Asp Asn Lys Glu Ser Glu Ser Trp Gly Ala Leu Leu Ser Gly Glu Arg
50 55 60
Leu Asp Thr Trp Ile Cys Ser Leu Leu Gly Ser Leu Met Val Gly Leu
65 70 75 80
Ser Gly Val Phe Pro Leu Leu Val Ile Pro Leu Glu Met Gly Thr Met
85 90 95
Leu Arg Ser Glu Ala Gly Ala Trp Arg Leu Lys Gln Leu Leu Ser Phe
100 105 110
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Gly Asn Val Phe Leu His Leu Leu Pro Glu
115 120 125
Ala Trp Ala Tyr Thr Cys Ser Ala Ser Pro Gly Gly Glu Gly Gln Ser
130 135 140
Leu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gly Leu Trp Val Ile Ala Gly Ile Leu
145 150 155 160
Thr Phe Leu Ala Leu Glu Lys Met Phe Leu Asp Ser Lys Glu Glu Gly
165 170 175
Thr Ser Gln Ala Pro Asn Lys Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Leu
180 185 190
Asn Gly Gly His Cys Leu Ala Gln Pro Ala Ala Glu Pro Gly Leu Gly
195 200 205
Ala Val Val Arg Ser Ile Lys Val Ser Gly Tyr Leu Asn Leu Leu Ala
210 215 220
Asn Thr Ile Asp Asn Phe Thr His Gly Leu Ala Val Ala Ala Ser Phe
225 230 235 240
Leu Val Ser Lys Lys Ile Gly Leu Leu Thr Thr Met Ala Ile Leu Leu
245 250 255
His Glu Ile Pro His Glu Val Gly Asp Phe Ala Ile Leu Leu Arg Ala
260 265 270
Gly Phe Asp Arg Trp Ser Ala Ala Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Leu
275 280 285
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Gly Phe Ala Ile Cys Thr Gln Ser Pro Lys
290 295 300
Gly Val Glu Glu Thr Ala Ala Trp Val Leu Pro Phe Thr Ser Gly Gly
305 310 315 320
Phe Leu Tyr Ile Ala Leu Val Asn Val Leu Pro Asp Leu Leu Glu Glu
325 330 335
Glu Asp Pro Trp Arg Ser Leu Gln Gln Leu Leu Leu Leu Cys Ala Gly
340 345 350
Ile Val Val Met Val Leu Phe Ser Leu Phe Val Asp
355 360
<210>386
<211>405
<212>PRT
<213>智人
<400>386
Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Leu
20 25 30
Val Ala Leu Ala Val Gly Thr Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu Leu Leu
35 40 45
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Pro Ala
50 55 60
Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Gln Asn Ile
65 70 75 80
Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Leu Thr Ala Leu Gly
85 90 95
Gly Leu Tyr Phe Met Phe Leu Val Glu His Leu Thr Leu Ile Lys Gln
100 105 110
Phe Lys Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp
115 120 125
Val Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn
130 135 140
Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala Asp
145 150 155 160
Ser Gln Glu Pro Ser His Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu Glu Glu
165 170 175
Glu Glu Val Met Ile His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr Asn Glu Tyr
180 185 190
Val Pro Arg Gly Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe His Asp Thr Leu
195 200 205
Gly Gln Ser Asp Leu Ile His His His His Asp Tyr His His Ile Leu
210 215 220
His His His His Gln Asn His His Pro His Ser His Ser Gln Arg Tyr
225 230 235 240
Ser Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val Ala Thr Leu Ala Trp Met Val
245 250 255
Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala
260 265 270
Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Phe Cys
275 280 285
His Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Lys Ala Gly
290 295 300
Met Thr Val Lys Gln Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Met Leu Ala
305 310 315 320
Tyr Leu Gly Met Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly Tyr Ala Glu Asn Val
325 330 335
Ser Met Trp Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Phe Met Tyr Val Ala Leu
340 345 350
Val Asp Met Val Pro Glu Met Leu His Asp Ala Ser Asp His Gly Cys
355 360 365
Ser Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe
370 375 380
Gly Ile Met Leu Leu Ile Pro Leu Asn Ile Lys Ser Cys Ser Tyr Lys
385 390 395 400
Phe Leu Val Lys Val
405
<210>387
<211>304
<212>PRT
<213>智人
<400>387
Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr Thr Glu Lys Ile
1 5 10 15
Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu Ala Ile Ser Thr
20 25 30
Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr Gly Glu Asn Asn
35 40 45
Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln Asn Ile Gly Ile
50 55 60
Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His Asp His His Ser
65 70 75 80
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
85 90 95
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser
115 120 125
Gly Lys Asp Pro Arg Asn Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu
130 135 140
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
145 150 155 160
Val Thr Ser Thr Val Tyr Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu
165 170 175
Glu Thr Ile Glu Thr Pro Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val
180 185 190
Ser Ser Ser Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg
195 200 205
Leu Ala Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly
210 215 220
Phe Met Tyr Ser Arg Asn Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn
225 230 235 240
Ala Ser Lys Leu Leu Thr Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu
245 250 255
Asn Ala Thr Glu Phe Asn Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile
260 265 270
Asp Ala Arg Ser Cys Leu Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile
275 280 285
Pro Pro Lys Thr Tyr Ser Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile
290 295 300
<210>388
<211>46
<212>PRT
<213>智人
<400>388
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10 15
Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Leu
20 25 30
Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp Ser Thr
35 40 45
<210>389
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>389
Thr Glu Gly Leu Ser Ser
1 5
<210>390
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>390
His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met
1 5
<210>391
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>391
Val Phe Arg Ile Asn Phe
1 5
通常将基因分为两类：癌基因和肿瘤抑制基因。癌基因是其正常功能 是只在特定条件下促进细胞生长的基因。当癌基因获得了突变并然后丧失 这一控制时，它会在所有条件下都促进生长。然而，已经发现，对于癌症 要真正成功来说，癌症还必须需要在肿瘤抑制基因中的突变。肿瘤抑制基 因的正常功能是阻止细胞生长。肿瘤抑制基因的例子包括p53、p16、p21 和APC，所有这些在正常作用时均阻止细胞免于不受控制地分裂和生长。 当肿瘤抑制基因突变或丧失时，细胞生长的刹车也丧失了，使得细胞现在 可以不受限制的生长。
锌是细胞生长所需要的，并且也是超过300种酶的辅因子。锌参与蛋 白、核酸、碳水化合物和脂代谢。锌在基因转录、生长、发育和分化的控 制中也起着重要作用(Vallee和Falchuk(1993)Physiol.Rev.73，79-118)。在 哺乳动物中，锌缺乏是有害的，会引起发育障碍和严重的代谢疾病 (Truong-Tran等，(2001)Biometals 14，315-330)。过量的锌也会对细胞有 毒(Koh等，(1996)Science 272，1013-1016)。锌不能被动地扩散穿过细胞 膜。因此，需要特定的锌转运蛋白来将锌转运入细胞。因为锌对细胞生长 非常重要，因此锌转运蛋白在维持细胞凋亡和细胞生长之间的细胞平衡中 起着重要的作用。细胞平衡的失常能够导致癌症(Taylor等，Biochem.J. (2003)375，51-59)。
真核生物具有许多不同的锌转运蛋白。迄今为止，研究得最多的锌转 运蛋白属于ZIP或CDF(阳离子扩散家族)转运蛋白家族。ZIP转运蛋白定 位于质膜上并作为锌流入转运蛋白，或定位于细胞内膜上并允许它们从这 些结构中动员储存。ZIP家族由至少86个成员组成并且可分为4个独立的 亚家族：ZIP亚家族I(有1个已知的人类成员)、ZIP亚家族II(有3个已 知的人类成员)、gufa亚家族(有2个已知的人类成员)、以及LIV-1亚家族 (有9个已知的人类成员)(Gaither和Eide(2001)，Biometals 14，251-270)。
LIV-1也被称为Zip6，是锌转运蛋白，其作为这样的基因得到鉴定， 即它的表达受到某些乳腺癌细胞的雌激素治疗的刺激(Manning等，(1988)， Mol.Cell.Endocrinol.59，205-212)。已显示出LIV-1属于ZIP(Zrt-、Irt- 样蛋白)锌转运蛋白的被命名为LZT(ZIP锌转运蛋白LIV-1亚家族)的亚家 族(Taylor和Nicholson(2003)Biochim.Biophys.Acta Biomembr.1611， 16-30)。这些转运蛋白含有与在代谢中具有已知功能的存在于基质金属蛋 白酶的基序类似的潜在金属蛋白酶基序(Itoh和Nagase，(2002)，Essays Biochem.38，21-36)。LIV-1mRNA的表达显示出与乳腺癌至局部淋巴结的 扩散相关。LIV-1结构显示出它是富含组氨酸的并且至少具有结合和/或转 运Zn2+离子的可能性(Taylor，(2000)，ZUBMB Life 49：249-253)。
脊椎动物的原肠胚形成是身体建立中的关键步骤。上皮-间充质细胞转 变(EMT)发生在原肠胚形成过程中。EMT是胚胎发育、器官和组织再生以 及肿瘤转移的中心事件之一。转录的信号转导物和激活子(STATs)介导了 在各种生物过程中应答细胞因子和生长因子的包括细胞增殖、分化和存活 的生物学作用。STATs在原肠胚形成、器官发生、伤口愈合和癌演进过程 中的EMT中也是重要的。已显示STAT3在斑马鱼原肠胚形成过程中被激 活并且其活性对于原肠胚形成活动非常重要。然而，在EMT中STAT作 用的分子机制还没有被完全阐述明白。LIV1是STAT3在EMT中的下游 靶标，并且其在锌指蛋白Snail(EMT的主调节剂)的核定位中也很重要。
然而，迄今为止LIV-1在癌症中的作用还没有被完全阐述明白。需要 鉴定调控LIV-1的组合物和方法。本发明涉及这些以及其它重要需求。
发明概述
在一些方面，本发明提供了包含LIV-1调节剂和一种或多种可药用载 体的组合物。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是分离的双链 RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是包含SEQ ID NO：1序 列的至少10个连续核苷酸的分离的寡核苷酸。在一些实施方案中，LIV-1 调节剂是结合LIV-1结构域中的表位的抗体，所述LIV-1结构域选自： LIV-1的N-端细胞外结构域、在跨膜结构域(TM)2和3之间的LIV-1细胞 外结构域、在TM 4和5之间的LIV-1细胞外结构域、在TM 6和7之间 的LIV-1细胞外结构域、以及LIV-1的C-端细胞外结构域。在一些实施方 案中，LIV-1调节剂是dsRNA、siRNA、shRNA或反义寡核苷酸。
在一些方面，本发明提供了在有需要的患者中治疗癌症或癌症症状的 方法，包括给患者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。
在一些方面，本发明提供了在患者中调节LIV-1相关生物学活性的方 法，包括给患者施与调节LIV-1相关生物学活性有效量的LIV-1调节剂。
在一些方面，本发明提供了鉴定对LIV-1治疗敏感的患者的方法，包 括检测在患者样本中存在或不存在LIV-1的差异表达，如果患者是LIV-1 治疗的候选者则给患者施与治疗有效量的LIV-1调节剂；如果患者不是 LIV-1治疗的候选者则给患者施与常规的癌症治疗。
在一些方面，本发明提供了抑制表达LIV-1的癌细胞生长的方法， 包括将抑制细胞生长有效量的LIV-1调节剂与细胞接触。
在一些方面，本发明提供了在表达LIV-1的细胞群中抑制癌细胞表 型的方法，包括给细胞群施与抑制癌细胞表型有效量的LIV-1调节剂。
在一些方面，本发明提供了在样本中检测一种或多种表达LIV-1的 癌细胞的方法，包括将样本与包含和显像剂连接的LIV-1调节剂的组合物 接触并检测显像剂在样本中的定位。
在一些方面，本发明提供了抑制两个或多个细胞(其中至少一个细胞 表达LIV-1)相互作用的方法，包括给包含细胞的样本施与有效量的LIV-1 调节剂。
在一些方面，本发明提供了在CHO或骨髓瘤细胞中表达抗LIV-1抗 体的方法。在一些实施方案中，抗LIV-1抗体抑制一种或多种LIV-1相关 生物学活性。在一些实施方案中，该方法包括在CHO或骨髓瘤细胞中表 达编码抗LIV-1抗体的核酸。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，包括将表达LIV-1 的细胞与候选化合物和LIV-1配体接触，并检测LIV-1相关锌转运活性是 否被抑制。在一些实施方案中，LIV-1相关锌转运活性的抑制是癌抑制剂 的指标。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，包括将表达LIV-1 的细胞与候选化合物和LIV-1配体接触，并检测LIV-1下游标志物是否被 抑制。在一些实施方案中，下游标志物的抑制是癌抑制剂的指标。
在一些方面，本发明提供了确定患者对LIV-1调节剂敏感性的方法， 包括在所述患者的癌样本中检测LIV-1差异表达的证据。在一些实施方案 中，LIV-1差异表达的证据是患者对LIV-1调节剂敏感性的指标。
在一些方面，本发明提供了从包含LIV-1蛋白的样本中纯化LIV-1 蛋白的方法，包括提供包含结合至固体支持物的LIV-1抗体的亲和基质， 将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-LIV-1蛋白复合体；从样本剩余物 中分离亲和基质-LIV-1蛋白复合体；以及从亲和基质释放LIV-1蛋白。
在一些方面，本发明提供了将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表 达LIV-1的细胞的方法，该方法包括提供与LIV-1抗体或其片段缀合的细 胞毒剂或诊断剂，并且将细胞暴露于抗体-剂或片段-剂缀合物。
在一些方面，本发明提供了确定癌症患者预后的方法，包括确定患者 样本中LIV-1-δ对LIV-1的比值。在一些实施方案中，应用LIV-1-δ对LIV-1 的比值来确定癌症患者的预后。
在一些方面，本发明提供了确定癌症患者预后的方法，包括在患者样 本中检测结合至细胞质膜的LIV-1的存在或不存在。在一些实施方案中， 患者样本中结合至细胞质膜的LIV-1的不存在是患者良好预后的指标。
在一些方面，本发明提供了包含锌转运蛋白调节剂和一种或多种可药 用载体的组合物。在一些实施方案中，锌转运蛋白是分离的双链 RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，锌转运蛋白是包含选自SEQ ID NO： 383-385的序列的至少10个连续核苷酸的分离的寡核苷酸。在一些实施方 案中，锌转运蛋白是结合锌转运蛋白结构域中的表位的抗体，所述锌转运 蛋白结构域选自：N-端细胞外结构域、在跨膜结构域(TM)2和3之间的细 胞外结构域、在TM 4和5之间的细胞外结构域、在TM 6和7之间的细 胞外结构域、以及C-端细胞外结构域。在一些实施方案中，锌转运蛋白是 SLC39A10、SLC39A11或SLC39A13。
在一些方面，本发明提供了在有需要的患者中治疗癌症或癌症症状的 方法，包括给患者施与治疗有效量的锌转运蛋白调节剂。
在一些方面，本发明提供了在患者中调节锌转运蛋白相关生物学活性 的方法，包括给患者施与调节锌转运蛋白相关生物学活性有效量的锌转运 蛋白调节剂。
在一些方面，本发明提供了抑制表达锌转运蛋白的癌细胞生长的方 法，包括将抑制细胞生长有效量的锌转运蛋白调节剂与细胞接触。
在一些方面，本发明提供了在样本中检测一种或多种表达锌转运蛋白 的癌细胞的方法，包括将样本与包含和显像剂连接的锌转运蛋白调节剂的 组合物接触并检测显像剂在样本中的定位。
在一些方面，本发明提供了抑制两个或多个细胞(其中至少一个细胞表 达锌转运蛋白)相互作用的方法，包括给包含细胞的样本施与有效量的锌转 运蛋白调节剂。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，癌症的特征在于与 对照相比锌转运蛋白的过量表达。在一些实施方案中，该方法包括将表达 锌转运蛋白的细胞与候选化合物和锌转运蛋白配体接触，并检测锌转运活 性是否被抑制。在一些实施方案中，锌转运活性的抑制是癌抑制剂的指标。
在一些方面，本发明提供了鉴定癌抑制剂的方法，癌症的特征在于与 对照相比锌转运蛋白的过量表达。在一些实施方案中，该方法包括将表达 锌转运蛋白的细胞与候选化合物和锌转运蛋白配体接触，并检测锌转运蛋 白的下游标志物是否被抑制。在一些实施方案中，下游标志物的抑制是癌 抑制剂的指标。
在一些方面，本发明提供了确定患者对锌转运蛋白调节剂敏感性的方 法，包括在患者的癌样本中检测锌转运蛋白差异表达的证据。在一些实施 方案中，锌转运蛋白差异表达的证据是患者对锌转运蛋白调节剂敏感性的 指标。
在一些方面，本发明提供了从包含一种或多种锌转运蛋白的样本中纯 化锌转运蛋白的方法，包括提供包含结合至固体支持物的锌转运蛋白抗体 的亲和基质，将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-锌转运蛋白复合体； 从样本剩余物中分离亲和基质-锌转运蛋白复合体；以及从亲和基质释放锌 转运蛋白。
在一些方面，本发明提供了将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表 达锌转运蛋白的细胞的方法，该方法包括提供缀合至锌转运蛋白抗体或其 片段的细胞毒剂或诊断剂，并且将细胞暴露于抗体-剂或片段-剂缀合物。
本发明的这些和其它方面将在以下的发明详述中阐述。
附图简述：
图1描述几个癌样本中LIV-1蛋白的表达。左图描述ER阳性、ER 阴性和转移性乳腺癌。在右图中的癌组织中可看到质膜染色。右下图描述 在非透化细胞上的共焦覆盖图。
图2描述通过LIV-1特异的siRNAs敲低(knockdown)LIV-1蛋白。
图3描述在癌细胞中通过LIV-1特异的siRNAs抑制癌细胞生长、增 殖和存活。
图4描述在癌细胞中通过LIV-1特异的siRNAs敲低LIV-1诱导的胱 天蛋白酶活化。
图5描述了在正常细胞中LIV-1特异的siRNAs对增殖、胱天蛋白酶 活性和LIV-1mRNA水平的影响。
图6描述了在癌细胞中通过LIV-1特异的siRNAs降低癌细胞中细胞 周期蛋白D1水平。
图7描述了通过LIV-1特异的抗体降低细胞质锌水平。
图8描述了正常和癌细胞中的LIV-1表达。
图9描述了在MCF7细胞中LIV-1敲低的影响，包括对细胞增殖、软 琼脂生长、蛋白质表达和存活的影响。
图10描述了通过LIV-1特异的siRNAs降低细胞质锌水平。
图11描述了在用LIV-1特异性抗体处理后细胞周期蛋白D1水平的降 低。
图12描述了应用LIV-1分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133 plus 2芯片)图示。沿水平轴上布置正常和癌性组织类型。癌性组织 用“c”标记，例如，“c_乳腺_管”表示乳腺癌组织样本，且正常组织类 似地用“n”表示。如果知道的话，还对组织类型进一步标记有关组织的类 型和亚型。例如，“c_乳腺_管”是来自位于乳腺管中的乳腺癌的癌性组织。 如果在外科切除期间不清楚或不知道亚型，则标签记为“ns”表示“非确 切的”。在垂直轴上的每一个点表示来自单个患者的组织样本，以及每一 点在垂直轴上的高度(基于log2)代表探针组(probeset)的相对表达水平。实 心圆代表表达水平在线性检测范围内的样本。空心圆代表在其中基因在探 针组的检测极限以下的样本中基因表达的上限。空的方块代表在其中探针 组被饱和的样本中基因表达的下限。(简而言之，在进行分析之前，通过在 大量、不同的样本组中分析组成探针组的探针的表现校正探针组。这一校 正确定每一探针的相对敏感性、以及强度范围，在所述强度范围内探针组 的反应在探针之间是线性的。在这一范围以下的强度被称为“未检测到” 而在所述范围以上的强度被称为“饱和”。由于样本之间杂交和标记效率 的不同，每一芯片均在应用校正后被规一化。这使得按照基因表达水平的 范围上限和下限在样本与样本之间有些不同。)
图13描述了用SLC39A10分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133plus 2芯片)图示。附图说明信息如以上图12所提供。
图14描述了用SLC39A11分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133plus 2芯片)图示。附图说明信息如以上图12所提供。
图15描述了用SLC39A13分析的癌性和正常组织的微阵列分析(affy U133plus 2芯片)图示。附图说明信息如以上图12所提供。
发明详述：
本发明提供了用于癌症治疗、诊断和成像，具体而言用于LIV-1相关 癌症的治疗、诊断和成像的方法和组合物。
本发明的发明人尤其发现LIV-1在数种癌症，包括乳腺癌中过量表达， 并且在正常组织中具有受限的表达。抑制LIV-1则抑制了癌细胞的增殖， 但不抑制LIV-1-阳性的“正常”细胞。此外，已发现LIV-1的抑制调节细 胞质锌水平以及下游标志物的水平，所述下游标志物例如包括细胞周期蛋 白D1和MT1-MMP。在本申请中提供了本发明的这些和其它方面。
定义
在这一文件中使用了许多定义。多数词语具有对本领域技术人员来说 是这些词语本身的意思。在下面或在这一文件中其它地方特别定义的词语 具有在本发明的上下文中作为整体所提供的以及如本领域技术人员通常理 解的意思。
除非特别标明，本发明的实施将应用本领域内常见的化学、生物化学、 分子生物学、免疫学和药学方法。在文献中充分地解释了此类技术。例如， 参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania： Mack Publishing Company，1990)；Methods In Enzymology(S.Colowick 和N.Kaplan，编辑，Academic Press，Inc.)；以及Handbook of Experimental Immunology，I-IV卷(D.M.Weir和CC.Blackwell，编辑， 1986，Blackwell Scientific Publications)以及Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，1989)。
本文所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数关系， 除非文中另外清楚地标明。因此，例如论及“一种抗体”时包括两种或以 上此类抗体的混合物。
本文所使用的术语“约”是指值的+/-20％、+/-10％、或+/-5％。
本文所使用的术语“锌转运蛋白”或“锌运载蛋白”是指显示出锌转 运蛋白结构特征的生物分子。在一些实施方案中，锌转运蛋白包括LIV-1、 SLC39A13、SLC39A11和SLC39A10。
本文所使用的术语“LIV-1”也被称为Zip6，是指属于被称为LZT的 ZIP锌转运蛋白的亚家族的锌转运蛋白。在GeneCard中，LIV-1也被称 为SLC39A6(溶质载体蛋白家族39(锌转运蛋白)，成员6)。LIV-1的核苷 酸序列如SEQ ID NO：1所示，且LIV-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。 尽管为了简洁的目的，本发明主要根据LIV-1作为例证，但应该理解涉及 LIV-1的定义和实施方案也可用于本文公开的其它锌转运蛋白。
本文所使用的术语“LIV-1-δ”是指与LIV-1相比至少缺乏氨基端部 分的LIV-1变体。LIV-1-δ的多肽序列如SEQ ID NO：365所示。
本文所使用的术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用，是指任何长度 的氨基酸聚合体形式，其可以包括编码的或非编码的氨基酸、化学或生物 化学修饰或衍生的氨基酸、以及具有经修饰的肽骨架的多肽。该术语包括 融合蛋白，包括但不限于与异源氨基酸序列融合的融合蛋白、与同源或异 源的具有或没有N端甲硫氨酸残基的前导序列融合；免疫学标记的蛋白等。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”可互换使用，是指 对于其来说诊断、治疗或疗法是所期望的任何受试者，尤其是人类。其它 受试者可以包括牛、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马等。在一些优 选的实施方案中，受试者是人类。
本文所使用的术语“癌症”是指原发或转移癌。术语“癌细胞”是指 被转化的细胞。这些细胞可以从患有癌症的患者中分离，或者是在体外经 转化变为癌性的细胞。癌细胞可以从许多种类的样本中取得，所述样本包 括任何组织或细胞培养系。在一些实施方案中，癌细胞是过度增生细胞、 肿瘤细胞或赘生物。在一些实施方案中，癌细胞从乳腺癌、皮肤癌、食管 癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢 癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤中分离。在一些实施方案中，癌细胞从公众可 获得的已建立的细胞系中取得。在一些实施方案中，癌细胞从业已存在的 患者样本或从包含癌细胞的文库中分离。在一些实施方案中，分离癌细胞 并然后将其移植至不同的宿主中，例如异种移植。在一些实施方案中，在 SCED小鼠模型中移植并应用癌细胞。在一些实施方案中，癌是乳腺癌。
本文所使用的术语“经转化的”是其后代能稳定遗传的在细胞特性上 的任何转变。在一些实施方案中，“经转化的”是指正常细胞至癌性细胞 的转变，例如，能够引起肿瘤的改变。在一些实施方案中，经转化的细胞 是永生化的。转化可以通过许多因素引起，包括在缺乏受体磷酸化的情况 下的受体过量表达、病毒感染、在癌基因和/或肿瘤抑制基因上的突变、和 /或任何改变细胞生长和/或永生化特性的其它技术。
“癌性表型”通常是指作为癌性细胞特性的任意的多种生物学现象， 其中的现象在不同类型的癌症中可以不同。癌性表型通常通过在例如细胞 生长或增殖(例如，不受控制的生长或增殖)、细胞周期调控、细胞迁移、 细胞-细胞相互作用或转移等中的反常来鉴定。
本文所使用的术语“转移”是指已传播至远离癌的起源，例如远离原 发癌的位置处的癌症。转移的位置包括但不限于骨、淋巴结、肺、肝和脑。
本文所使用的术语“血管发生”是指患者中血管的发生。
本文所使用的术语“临床端点(clinical endpoint)”是指癌症的可测 量事件指标。临床端点包括但不限于第一次转移的时间、随后转移的时间、 转移瘤的大小和/或数目、肿瘤的大小和/或数目、肿瘤的位置、肿瘤的侵袭、 生活质量、疼痛等。本领域技术人员具有确定和测量临床端点的能力。测 量临床端点的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
本文所使用的术语“样本”是指来自患者的生物学材料。通过本发明 测定的样本不限于任何特殊的类型。作为非限制性实例，样本包括单个细 胞、多个细胞、组织、肿瘤、生物学液体、生物分子、或任何前述的上清 液或提取物。样本的例子包括为活组织检查取出的组织、在切除术期间取 出的组织、血液、尿、淋巴组织、淋巴液、脑脊髓液、粘液和粪便样本。 所使用的样本会依据分析方式、检测方法和待检测肿瘤、组织、细胞或提 取物的性质而不同。制备样本的方法在本领域是熟知的，并且可以很容易 的修改以获得适合于所应用的方法的样本。
本文所使用的术语“生物分子”包括但不限于多肽、核酸和糖类。
本文所用的术语“调节”是指在细胞内部、外部或表面的基因、蛋白 或任何分子的质或量上的改变。改变可以是分子表达或水平上的升高或降 低。术语“调节”也包括改变生物学功能/活性的质或量，所述生物学功能 /活性包括但不限于细胞增殖、生长、粘附、细胞存活、凋亡、细胞内信号 传导、细胞-细胞间信号传导等。
本文所使用的术语“调节剂”是指调节一种或多种与癌症相关的生理 学或生物化学事件的组分。在一些实施方案中，调节剂抑制一种或多种与 癌症相关的生物学活性。在一些实施方案中，调节剂是小分子、抗体、模 拟物、诱饵(decoy)或寡核苷酸。在一些实施方案中，调节剂通过阻断配 体结合或通过竞争配体结合位点起作用。在一些实施方案中，调节剂独立 于配体结合之外起作用。在一些实施方案中，调节剂不竞争配体结合位点。 在一些实施方案中，调节剂阻断参与癌症的基因产物的表达。在一些实施 方案中，调节剂阻断两个或更多个参与癌症的生物分子的物理相互作用。 在一些实施方案中，本发明的调节剂抑制一种或多种LIV-1生物学活性， 所述LIV-1生物学活性选自：癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细 胞存活、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1介 导的细胞-细胞粘附、细胞-细胞相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互 作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质相互作用、整联蛋白介导的活性、 LIV-1表面表达、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解、EGFR磷酸化和Snail 核定位。在一些实施方案中，LIV-1调节剂抑制LIV-1表达。
“基因产物”是指由基因表达或产生的生物聚合物产物。基因产物例 如可以是未剪接的RNA、mRNA、剪接变体mRNA、多肽、翻译后修饰 的多肽、剪接变体多肽等。这一术语还包括应用RNA基因产物作为模板 产生的生物聚合物产物(即，RNA的cDNA)。基因产物可以酶学地、重组 地、化学地或在对于其来说该基因是天然存在的细胞中制得。在一些实施 方案中，如果基因产物是蛋白质的，其表现出生物学活性。在一些实施方 案中，如果基因产物是核酸，其可以翻译为表现出生物学活性的蛋白质基 因产物。
本文所使用的“LIV-1活性的调节”是指LIV-1活性的升高或降低， 其例如可以是物质与LIV-1多核苷酸或多肽的相互作用、LIV-1转录和/ 或翻译的抑制(例如，通过反义或siRNA与LIV-1基因或LIV-1转录子相 互作用、通过促进LIV-1表达的转录因子的调控)等的结果。例如，生物活 性的调节是指生物学活性的升高或生物学活性的降低。本发明对导致 LIV-1活性降低的LIV-1活性调节特别感兴趣。可以通过以下方法评估 LIV-1活性，所述方法包括但不限于：测试锌转运活性、评估LIV-1多肽 水平、或通过评估LIV-1转录水平。LIV-1活性的比较也可以通过测量 LIV-1下游标志物的水平、测量对LIV-1信号传导的抑制、测量对LIV-1 介导的细胞粘附的抑制、测量对LIV-1介导的癌细胞凋亡的活化、测量癌 细胞生长抑制、测量肿瘤形成的抑制、测量细胞周期蛋白产生的抑制、测 量对产生纤连蛋白的抑制和测量对锌转运的抑制来完成。
本文所使用的术语“抑制”是指活性或量的减少、降低、失活或下调。 例如，在本发明的上下文中，Liv-1调节剂可以抑制癌细胞生长、肿瘤形成、 癌细胞增殖、癌细胞存活、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信 号传导、LIV-1介导的细胞-细胞粘附、细胞-细胞相互作用、LIV-1介导的 细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质相互作用、整联蛋白 介导的活性、LIV-1表面表达、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解、Snail 核定位、以及LIV-1表达中的一种或多种。LIV-1调节剂也可以抑制细胞 周期蛋白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR、 EGFR磷酸化、在SNAIL途径中的一个或多个基因。LIV-1调节剂也可以 抑制锌转运并且在一些实施方案中能降低细胞质锌水平。与对照相比，抑 制可以是至少25％、至少50％、至少是60％、至少70％、至少75％、至 少是80％、至少90％、至少95％、至少是97％、至少98％、至少是99％、 或100％。
本文所使用的术语“在癌细胞中差异表达”和“在癌细胞中差异表达 的多核苷酸”在本文中可以互相使用，是指代表或对应于基因的多核苷酸， 当与非癌性的相同细胞类型的细胞相比较时，所述基因在癌性细胞中差异 表达，例如，发现mRNA在至少约25％、至少约50％至约75％、至少约 90％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50 倍或更多不同(例如，更高或更低)的水平上。例如如果使用原位杂交或其 它在组织上的细胞类型之间允许一定程度的区别的分析方法，可以在组织 中进行比较。比较也可以或备选地在从它们的组织来源中分离的细胞之间 进行，或在一个原位细胞和第二个从它的组织来源中分离的细胞之间进行。 在一些实施方案中，与正常细胞相比较，基因在癌细胞中上调。
如果癌症的至少一个症状得到减轻、终止、变慢或防止，则“抑制” 了LIV-1相关癌症。在本文中，如果癌症的复发或转移得到减轻、变慢、 延缓或防止，则也“抑制”了LIV-1相关癌症。
本文所使用的词组“抑制LIV-1介导的细胞粘附”是指在LIV-1抑制 剂存在的情况下，细胞-细胞之间粘附的抑制或消失，其中至少一个细胞差 异表达LIV-1。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时LIV-1介 导的细胞粘附，通过LIV-1抑制剂能够使LIV-1介导的细胞粘附降低至少 25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直至100％。 LIV-1介导的细胞粘附的比较可以通过测量完成，例如，通过标记感兴趣 的细胞、将它们与黏附至基质的未标记细胞群孵育、以及洗涤以从非黏附 细胞群中分离黏附细胞。在这一方法中，通过测量保留在基质上的标记的 量确定细胞粘附。分析系统的实例包括但不限于用荧光探针标记并在荧光 板读数器上或通过流式细胞术测量荧光，所述荧光探针诸如钙荧光素AM， CFMDA(二乙酸5-氯甲基荧光素)、5(6)-CFDA-SE[二乙酸5-(和-6)-羧基荧 光素，琥珀酰亚胺酯]。
在本文中所使用的词组“增加癌细胞凋亡”是指在存在LIV-1抑制剂 的情况下增加差异表达LIV-1的癌细胞的凋亡。在这一上下文中，相对于 不存在LIV-1抑制剂时的癌细胞凋亡，通过LIV-1抑制剂可以使癌细胞凋 亡增加至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、 直至100％。癌细胞凋亡的比较例如可以通过测量DNA片段化、胱天蛋白 酶活性、线粒体膜电位的丧失、活性氧类(ROS)增加的产生、细胞内酸化、 染色质凝聚、细胞表面的磷脂酰丝氨酸水平以及增加的细胞膜通透性来完 成。
DNA片段化例如可以用TUNEL测试法(末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP缺口末端标记)来测量。该测试法的商业版本可广泛地获得，例如， APO-BrdUTM TUNEL测试试剂盒(Invitrogen)、APO-DIRECTTM试剂盒 (BD Biosciences Pharmingen)和ApoAlertTM DNA片段化测试试剂盒 (Clontech，Takara Bio Company)。
胱天蛋白酶活性可以通过对特定胱天蛋白酶特异的荧光、生色和发光 底物来监测。至少对于胱天蛋白酶1、2、3、6、7、8和9可获得商业化测 试试剂盒。(例如，参见Invitrogen、Chemicon、CalBiochem、BioSource International、Biovision)。
线粒体膜电位的丧失可以用在健康活性的线粒体中差异聚集的荧光染 料来测量。一个非限制性实例是Invitrogen的MitoTracker Red系统。
活性氧类(ROS)的产生可以用荧光染料来测量，所述染料例如包括 H2DCFDA(Invitrogen)。
细胞内酸化可以用荧光或生色染料来测量。
染色质凝聚可以用荧光染料来测量，所述荧光染料例如包括Hoechst 33342。
磷脂酰丝氨酸(PS)可以在细胞表面测量。例如，膜联蛋白V具有对PS 的高亲和性。许多商业可获得的测试法适合于监测经标记的膜联蛋白V与 细胞表面的结合。
细胞膜通透性可以用染料来测量，所述染料诸如可以进入凋亡细胞但 不能进入坏死细胞的荧光染料YO-PRO-1(Invitrogen)。
本文所使用的词组“抑制癌细胞生长”是指在存在LIV-1抑制剂的情 况下癌细胞生长的抑制或消失，其中细胞差异表达LIV-1。在这一上下文 中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的癌细胞生长，通过LIV-1抑制剂可以 使癌细胞生长降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、 至少95％、直至100％。癌细胞生长的比较例如可以应用MTT测试法(例 如，MTT细胞增殖测试试剂盒(Invitrogen))、BrdU掺入(例如， Absolute-S SBIP测试法(Invitrogen))、测量细胞内ATP水平(例如应用 ATPLiteTM-M，1,000测试试剂盒(PerkinElmer)或ATP细胞活力测试试剂 盒(Bio Vision))、DiOc 18测试法(膜可渗透染料(Invitrogen))、葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶活性测试法(例如，Vibrant细胞毒测试法(Invitrogen))或测量细胞 LDH活性来完成。
本文所使用的词组“抑制肿瘤形成”是指在存在LIV-1抑制剂的情 况下肿瘤形成的抑制或消失，其中肿瘤包含差异表达LIV-1的细胞。在这 一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的肿瘤形成，通过LIV-1抑制 剂可以使肿瘤形成减少至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至 少90％、至少95％、直至100％。肿瘤形成的比较例如可以应用基于细胞 的测试法(例如在软琼脂上的集落形成)、通常依赖于将感兴趣的细胞注射 至动物(例如，无胸腺小鼠或大鼠、受辐射的小鼠或大鼠；接种至免疫特惠 位点(immunologically privileged sites)，诸如脑、颊囊或眼；同系动物 接种)并在规定的时间段后监测肿块大小的体内肿瘤形成模型来完成。
本文所使用的词组“抑制细胞周期蛋白D1”是指LIV-1介导的细胞周 期蛋白产生的抑制或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂 时的LIV-1介导的细胞周期蛋白产生，通过抑制剂可以使LIV-1介导的细 胞周期蛋白产生降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少 90％、至少95％、直至100％。细胞周期蛋白产生的比较可以通过以下方 法来完成：例如通过RT-PCR或RNA印迹法测量细胞周期蛋白mRNA水 平；通过免疫印迹、免疫沉淀或ELISA测量细胞周期蛋白多肽水平；或应 用功能测试法，包括例如应用靶向CDK、p21WAFl、p27KEP-1的抗体的 免疫共沉淀测试法以测量与细胞周期蛋白调节剂(诸如细胞周期蛋白依赖 性激酶(CDK’s))复合的细胞周期蛋白水平；以及测量通过CDK’s的细胞周 期蛋白的磷酸化，可以通过放射性标记和免疫沉淀分析或基于FRET的方 法，例如CDK2/细胞周期蛋白A测试试剂盒(Molecular Devices)来测试。
本文所使用的词组“抑制EGFR磷酸化”是指LIV-1介导的EGFR 磷酸化的抑制或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的 LIV-1介导的EGFR磷酸化，通过抑制剂可以使LIV-1介导的EGFR磷酸 化降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、 直至100％。EGFR磷酸化的比较可以通过本领域技术人员已知的磷酸化 测试法来确定。
本文所使用的词组“抑制肿瘤细胞存活”是指对表达LIV-1的癌细 胞存活的抑制。在一些实施方案中，该术语是指实现表达LIV-1的癌细胞 的凋亡。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时的癌细胞存活和 /或在正常细胞中，通过抑制剂可以使表达LIV-1的癌细胞存活降低至少 25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直至100％。
本文所使用的词组“抑制整联蛋白介导的活性”是指对与整联蛋白相 关的活性的抑制或消失。整联蛋白介导的活性包括但不限于细胞粘附、趋 化性、增殖、存活和小管形成。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑 制剂时LIV-1介导的整联蛋白活性，通过抑制剂可以使LIV-1介导的整联 蛋白活性降低至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、 至少95％、直至100％。
本文所使用的词组“抑制纤连蛋白”是指对LIV-1介导的产生纤连蛋 白的抑制或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时LIV-1 介导的纤连蛋白产生，通过抑制剂可以使LIV-1介导的纤连蛋白产生降低 至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直 至100％。纤连蛋白产生的比较可以通过以下方法完成：例如通过RT-PCR 或RNA印迹法测量纤连蛋白mRNA水平；通过免疫印迹、免疫沉淀或 ELISA(例如，纤连蛋白ELISA试剂盒(AMERICAN DIAGNOSTICA))； 应用功能测试法以测量与纤连蛋白包被的底物的细胞粘附。例如，参见 InnoCyteTM ECM细胞粘附测试法，纤连蛋白(Calbiochem)和 QCMTM-FN[定量细胞迁移测试法-纤连蛋白(CHEMICON)]。
本文所使用的词组“抑制锌转运”是指对LIV-1介导的锌转运的抑制 或消失。在这一上下文中，相对于不存在LIV-1抑制剂时LIV-1介导的锌 转运，通过抑制剂可以使LIV-1介导的锌转运降低至少25％、至少50％、 至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、直至100％。在一些实施 方案中，LIV-1抑制剂降低胞质锌水平。锌转运的比较和锌水平的确定可 以应用本领域技术人员已知的方法来完成，例如包括：测量到细胞或囊泡 内的65Zn摄入(参见，Kambe等，(2002)J.Biol.Chem.，277：19049-19055)； 或测量细胞通透的荧光锌指示剂Newport绿二乙酸盐(Molecular Probes) 的摄入。体液和细胞条件介质中的锌库例如可以按照Zalewski等阐述的讨 论来测量(BioTechniques，2006，第40卷，第4期：第509-520页)。
本文所使用的词组“抑制LIV-1信号传导”是指降低LIV-1对包括 LIV-1的细胞信号级联下游成员的影响。包括LIV-1的细胞信号级联尤其 包括SNAIL途径。在一些实施方案中，对LIV-1信号传导的抑制上调 SNAIL途径中的一个或多个上皮标记物。在一些实施方案中，对LIV-1信 号传导的抑制下调SNAIL途径中的一个或多个间充质标记物。在一些实施 方案中，上皮标记物和/或间充质标记物参与运动性和细胞存活。在一些实 施方案中，对LIV-1信号传导的调节调节了Stat3相关信号级联。在一些 实施方案中，Stat3相关信号级联的元件与SNAIL相关信号级联的元件不 同。对LIV-1信号传导的抑制可以通过测量细胞信号传导途径下游成员的 多肽或多核苷酸水平来确定。本领域技术人员具备测量LIV-1多肽和/或多 核苷酸水平能力。本领域技术人员也能够测量LIV-1下游标志物的水平。
本文所使用的词组“抑制细胞-细胞相互作用”是指减少或消除两个或 多个表达LIV-1的细胞之间的相互作用。在一些实施方案中，细胞之间的 相互作用导致细胞信号。细胞-细胞相互作用可以通过本领域技术人员已知 的多种方法检测，所述方法包括但不限于观察共培养的、例如用不同荧光 膜染料(包括PKH26和PKH67(Sigma))标记的预标记细胞之间的膜交换。
本文所使用的“LIV-1下游标志物”是指与其在正常或健康组织中的 表达水平相比较，在癌组织或癌细胞中表现出改变的表达水平的基因或活 性，或是在存在LIV-1调节剂的情况下改变的特性(例如，胞质锌水平)。 在一些实施方案中，当LIV-1受到本发明的LIV-1调节剂扰动时，下游标 志物表现出改变的表达水平。LIV-1下游标志物包括但不限于：细胞周期 蛋白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR、 SNAIL途径中的一个或多个基因、E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、Muc-1、 水闸蛋白(claudin)、封闭蛋白(occludin)、桥粒斑蛋白、胱天蛋白酶、 p21、p53、BID(bcl-相互作用死亡激动剂)、DFF40(DNA片段化因子)以及 细胞角蛋白。如上面所讨论的那样，在一些实施方案中，LIV-1下游标志 物是Stat3途径的基因。
本文所使用的术语“上调”是指活性或量的增加、激活或刺激。例如， 在本发明的上下文中，Liv-1调节剂可以增加E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋 白、Muc-1、水闸蛋白、封闭蛋白、桥粒斑蛋白、胱天蛋白酶、p21、p53、 BID(bcl-相互作用死亡激动剂)、DFF40(DNA片段化因子)以及细胞角蛋白 之中的一种或多种。与对照相比，上调可以是至少25％、至少50％、至少 75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少400％、 或至少500％。
本文所使用的术语“N-端”是指蛋白质的最前的10个氨基酸。
本文所使用的术语“C-端”是指蛋白质的最后的10个氨基酸。
本文所使用的术语“结构域”是指有对生物分子已知或猜想的功能有 贡献的生物分子的结构部分。结构域可以与其区域或部分共延伸 (co-extensive)，以及除了特定区域的全部或部分外也可以还包含与特定 区域不同的生物分子的部分。
本文所使用的术语“细胞外结构域”是指分子在细胞外部或外边的部 分。在本发明的上下文中，N-端细胞外结构域是指存在于紧接在第一个跨 膜结构域之前的分子N-端的细胞外结构域。在两个跨膜(TM)结构域之间， 例如在TM 2和3之间的细胞外结构域的上下文中，细胞外结构域是指在 LIV-1第二和第三跨膜结构域之间的在细胞膜外的LIV-1的部分。
本文所使用的术语“配体结合结构域”是指至少保留了一种相应LIV-1 天然序列定性结合活性的受体的任何部分或区域。
术语“区域”是指生物分子一级结构的物理连续部分。在蛋白质的情 况下，区域是通过蛋白质氨基酸序列的连续部分来定义的，在一些实施方 案中，“区域”与生物分子的功能相关。
本文所使用的术语“片段”是指生物分子一级结构的物理连续部分。 在蛋白质的情况下，部分是通过蛋白质氨基酸序列的连续部分来定义的， 并且指至少3-5个氨基酸、至少8-10个氨基酸、至少11-15个氨基酸、至 少17-24个氨基酸、至少25-30个氨基酸、至少30-45个氨基酸。在寡核苷 酸的情况下，部分是通过寡核苷酸的核酸序列的连续部分来定义的，并且 指至少9-15个核苷酸、至少18-30个核苷酸、至少33-45个核苷酸、至少 48-72个核苷酸、至少75-90个核苷酸、至少90-130个核苷酸。在一些实 施方案中，生物分子的部分具有生物学活性。在本发明的上下文中，LIV-1 多肽片段不包含如SEQ ID NO：2所示的全长LIV-1多肽序列。
本文所使用的词组“LIV-1相关细胞/肿瘤/样本”等是指其特征是相对 于非癌性和/或非转移细胞、样本、肿瘤或其它病变而言，LIV-1差异表达 的细胞、样本、肿瘤或其它病变。在一些实施方案中，LIV-1相关细胞、 样本、肿瘤或其它病变的特征是相对于非转移细胞、样本、肿瘤或其它病 变而言LIV-1表达的升高证据。
本文所使用的术语“抗体”是指对靶标蛋白或其片段特异的单克隆和 多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双功能/双特异性抗体、人源化抗体、 人类抗体、以及互补决定区移植抗体。术语“抗体”还包括体内治疗的抗 体基因转移。本发明也提供了包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和Fv的抗 体片段。
本文所使用的术语“表位”是指多肽的抗原决定簇。在一些实施方案 中，表位可以包含3个或更多氨基酸，所述氨基酸位于对表位唯一的空间 构象中的。在一些实施方案中，表位是线性的或构象的表位。表位通常由 至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、以及至少12个此类氨基酸 组成，或更通常由至少8-10个此类氨基酸组成。确定氨基酸空间构象的方 法在本领域是已知的，例如包括X射线晶体学和2维核磁共振。
本文所使用的术语“寡核苷酸”是指一系列连接的核苷酸残基。寡核 苷酸包括但不限于反义和siRNA寡核苷酸。寡核苷酸包含DNA序列的部 分，并且具有至少约10个核苷酸以及多达约500个核苷酸。在一些实施方 案中，寡核苷酸包含约10至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、以 及约20至约25个核苷酸。寡核苷酸可以化学合成并且能够被用作探针。 在一些实施方案中，寡核苷酸是单链的。在一些实施方案中，寡核苷酸至 少包含是双链的一部分。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸 (ASO)。在一些实施方案中，寡核苷酸是RNAi寡核苷酸、siRNAs或 shRNAs。
本文所使用的术语“反义寡核苷酸”具有与LIV-1多核苷酸序列互补 的核苷酸序列的未经修饰或经修饰的核酸，所述LIV-1多核苷酸序列包括 与LIV-1转录或翻译相关的多核苷酸序列(例如，LIV-1多核苷酸的启动 子)，其中反义多核苷酸能够杂交至LIV-1多核苷酸序列。特别感兴趣的是 能够在体外或体内抑制编码LIV-1多肽的多核苷酸转录和/或翻译的反义 多核苷酸。
本文所使用的术语“siRNA寡核苷酸”、“RNAi寡核苷酸”、“短 干扰RNA”、或“siRNA”可互换使用，是指通过转录后基因沉默、也被 称为RNA干扰(RNAi)而起作用的寡核苷酸。该术语是指能够RNA干扰 “RNAi”的双链核酸分子(参见Kreutze等，WO 00/44895；Zernicka-Goetz 等WO 01/36646；Fire，WO 99/32619；Mello和Fire，WO 01/29058)。 SiRNA分子通常是RNA分子但进一步包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。 SiRNA基因靶向实验通过将siRNA瞬时转染至细胞(通过如脂质体介导转 染、电穿孔或微注射等此类经典方法实现)进行。SiRNA分子是21至23 个核苷酸的RNA，具有特征性的类似于长双链RNA(dsRNAs)的RNase III 加工产物的2至3个核苷酸3’突出端，其通常启始RNAi。
有效利用siRNA途径来介导基因沉默部分地取决于siRNA细胞内递 送的有效方法。siRNA分子在细胞内倾向于是短命的，不容易递送至难以 转染的细胞类型，并且通过化学合成生产相对昂贵(Jacks等，(2005) Biotechniques 39：215-224；Bernards等，(2006)Nature Methods 3： 701-706)。
有效细胞内递送siRNA的一种方法是应用短发夹RNA，或“shRNAs”。 shRNAs是单链RNA分子，其包括由非互补区域连接的两条互补序列。在 体内，互补序列退火以产生在一个末端具有非配对环的双链螺旋。得到的 棒棒糖状形状的结构称为茎环并且可以被RNAi机制识别并在细胞内加工 为具有类似siRNA特性的短双螺旋RNA。
shRNA可以通过从已插入到合适载体的DNA模板转录而在细胞内合 成。有用的shRNA一般是50-70个核苷酸长、具有通过5-10个核苷酸环 分隔的两条19-29个核苷酸的互补序列。shRNA构建体一般通过以下三种 方法之一产生：互补寡核苷酸退火；基于启动子的聚合酶链式反应(PCR)； 或引物延伸。许多载体系统应用RNA Pol III启动子，Pol III介导的转录 是有利的，因为其在定义明确的起始位点开始、产生不含poly(A)的转录 本，并且Pol III启动子在所有细胞类型中都是有效的(Brummelkamp等， (2002)Science 296：550-553；Mclntyre，G.和Fanning，G.(2006)BMC Biotechnology 6：1-8)。
编码shRNA的载体系统提供了基因沉默试剂的可再生细胞内来源， 这可以在将载体稳定整合至宿主基因组后介导持续的基因沉默。此外，能 很容易地将shRNA盒插入逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体以方便将 shRNA递送至宽范围的细胞类型中，所述细胞类型包括非分裂的原代培养 物。可调节的shRNA载体形式对遗传筛选是特别有用的。
本文所使用的术语“诱饵”(decoy)是指至少包含能够结合锌或锌载 体的一部分LIV-1多肽的多肽。在一些实施方案中，诱饵能够结合与锌复 合的锌载体。在一些实施方案中，诱饵结合未与锌复合的锌载体。
本文所使用的术语“治疗有效量”是指产生药用效果的药物量，所述 药用效果是指当将治疗有效量的药物施与个体后，观察到的个体中一种或 多种临床端点、癌细胞生长和/或存活、或癌细胞转移的减少或逆转。治疗 有效量一般通过与当用不包含活性成分的组合物施与类似处境个体时观察 到的效果相比较的效果来确定。对于受试者精确的治疗有效量将取决于受 试者的大小和健康、疾病的性质和程度、以及选择施与的治疗或治疗组合。 然而，对于给定情况的有效量可通过常规实验确定并且在临床医生的判断 范围内。
本文所使用的术语“联合”或“联用”是指本发明的LIV-1调节剂和 其它治疗方案一起施与。
本文所使用的术语“敏感的”是指对于其来说LIV-1治疗是可接受的 治疗方法的患者，即很可能有阳性反应的患者。对LIV-1治疗敏感的癌症 患者相对于对LIV-1治疗不敏感的那些患者表达高水平的LIV-1。对LIV-1 治疗来说不是好候选者的癌症患者包括具有这样肿瘤样本的癌症患者，所 述肿瘤样本在它们的肿瘤细胞中或肿瘤细胞上缺乏或具有较低水平的 LIV-1。
本文所使用的术语“检测”是指确立、发现或确认活性(例如，基因表 达)或生物分子(例如，多肽)的证据。
本文所使用的词组“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变 体是指特征在于在核苷酸水平或氨基酸水平至少特定百分数同源的序列， 并且与“序列同一性”可互相使用。同源核苷酸序列包括编码蛋白同种型 的那些序列。此类同种型可以例如作为RNA选择性剪接的结果在相同机 体的不同组织中表达。或者，同种型可以由不同的基因编码。同源核苷酸 序列包括编码除人类之外其它物种的蛋白的核酸序列，所述物种包括但不 限于哺乳动物。同源核苷酸序列还包括但不限于本文中阐明的核苷酸序列 的天然存在的等位变体和突变体。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸替 换以及其多肽具有相同结合和/或活性的那些氨基酸序列。
同源或同一性百分比例如可以通过Gap程序(Wisconsin序列分析软件 包，用于UNIX的第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，Madispn WI)、应用缺省设置来确定，所述程序应用了Smith和 Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。在一些实施方案 中，探针和靶标之间的同源性在约50％至约60％之间。在一些实施方案中， 核酸具有与SEQ ID NO：1或其部分约60％、约70％、约80％、约85％、 约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约98％、约99％以及约 100％同源的核苷酸。本发明还提供了SEQ ID NO：1的完全互补序列的部 分，或它的同源物。
同源性也可以是在多肽水平上的。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO：2或其部分约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、 约94％、约95％、约97％、约98％、约99％以及约100％的同源。
本文所使用的术语“探针”是指可变长度的核酸序列。在一些实施方 案中，探针包含至少约10个以及多至约6,000个核苷酸。在一些实施方案 中，探针包含至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少25、至 少50或至少75个连续的核苷酸。探针用于检测同一的、类似的或互补的 核酸序列。较长的探针通常从天然或重组来源得到、对靶序列高度特异、 以及比寡聚物慢得多地与靶标杂交。探针可以是单链或双链，并经过设计 从而在PCR、基于膜的杂交、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)或类 似ELISA的技术中具有特异性。
本文所使用的术语“混合”是指将一种或多种化合物、细胞、分子等 在同一区域中结合在一起的过程。这例如可以在试管、培养皿或其它允许 一种或多种化合物、细胞或分子混合的容器中进行。
本文所使用的术语“分离的”是指处于与多核苷酸、多肽或抗体天然 存在的环境不同的环境当中的多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞。分离细 胞的方法对本领域技术人员是已知的。分离的多核苷酸、多肽、抗体通常 是基本上纯的。
本文所使用的术语“基本上纯的”是指从其天然环境中分离并至少 60％、至少75％、至少90％没有其它与之天然联系的成分搀杂的化合物(例 如，多核苷酸或多肽或抗体)。
本文所使用的术语“结合”意思是两个或多个生物分子或化合物之间 的物理或化学相互作用。结合包括离子键、非离子键、氢键、范德华力(Van der Waals)、疏水相互作用等。结合可以是直接的或间接的，间接是通过 或由于另一个生物分子或化合物的作用。直接结合是指不通过或由于另一 个分子或化合物的作用而是在没有其它实体的化学媒介物下发生的相互作 用。
本文所使用的术语“接触”是指直接或间接地将一个分子带到一起与 第二个分子物理上接近。分子可以在任意数量的缓冲液、盐、溶液等之中。 “接触”例如包括将多核苷酸置于含有核酸分子的烧杯、微量滴定板、细 胞培养瓶或微阵列等中。接触例如还包括将抗体置于含有多肽的烧杯、微 量滴定板、细胞培养瓶或微阵列等中。接触可以发生在体内(in vivo)、 间接体内(ex vivo)或体外(in vitro)。
本文所使用的词组“严格的杂交条件”或“严格条件”是指这样的条 件，在所述条件下，探针、引物或寡核苷酸能够与它的靶标序列杂交，但 是与最小数量的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的 环境下会不同。更长的序列会在更高的温度与它们适当的互补链特异杂交。 通常，在规定的离子强度和pH下对于特定序列的严格条件选择比热熔解 点(Tm)低约5℃。Tm是这样的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度 下)，在该温度中在平衡状态下50％与靶标序列互补的探针与靶标序列杂 交。由于靶标序列通常过量存在，在Tm，在平衡状态下50％的探针与它 们的互补序列杂交。一般地，严格条件是这些条件：其中盐浓度小于约1.0 M钠离子、一般地约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)；pH7.0至8.3；以及 对于短探针、引物或寡核苷酸(例如10至50个核苷酸)而言温度至少约 30℃、及对于更长的探针、引物或寡核苷酸而言温度至少约60℃。严格条 件也可以通过添加去稳定剂，诸如甲酰胺而实现。
本文所使用的术语“中等严格条件”是指这样的条件，在这种条件下 探针、引物或寡核苷酸能够与它的靶标序列杂交，但是与有限数量的其它 序列杂交。中等条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下会不同。中等 条件是本领域技术人员已知的并尤其描述于Manitatis等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory；第二版 (1989年12月))。
本文所描述的核酸组合物例如可被用于产生多肽、作为用于检测生物 样本(例如人类细胞提取物)中mRNA或从此类样本中产生的cDNA的探 针、产生寡核苷酸的另外的拷贝、产生核酶或寡核苷酸(单链或双链)、以 及作为单链DNA探针或作为形成三链的寡核苷酸。本文描述的探针例如 可以用于确定样本中本文所提供的寡核苷酸的存在或不存在。多肽可以用 于产生对与癌症相关的多肽特异的抗体，其抗体又可用于如本文中更详细 讨论的诊断方法、预后方法等。多肽也可以用于作为治疗干预的靶标，如 本文更详细讨论的那样。本发明的抗体例如也可以用于纯化、检测和靶向 本发明的多肽，包括体外和体内诊断和治疗方法。例如，抗体在用于定性 和定量测量生物样本中本发明多肽水平的免疫分析中是有用的。例如参见 Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版1988)。这些和其它用途将在以下更详细地描述。
本文所使用的术语“显像剂”是指能用本领域技术人员已知的方法检 测的连接至本发明的抗体、小分子或探针上的组合物。本文所使用的术语 “基因表达的证据”是指基因表达了的任何可检测的指标。
术语“可药用载体”是指用于施用治疗剂，诸如抗体或多肽、基因和 其它治疗剂的载体。该术语是指其本身不会诱导产生对接受组合物的个体 有害的抗体且可以施与而没有过度毒性的任何药学载体。合适的载体可以 是大的、代谢缓慢的大分子，诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合 氨基酸、氨基酸共聚物、脂聚集体、失活的病毒颗粒。此类载体是本领域 普通技术人员公知的。治疗组合物中可药用载体包括液体，诸如水、盐水、 甘油或乙醇。辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可以存在 于此类载体中。
可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的特定例子包括但不限于 LIV-1相关癌症。本文所使用的术语“LIV-1相关癌症”是指特征是其细 胞相对于非癌性细胞差异表达LIV-1的癌症。本发明也可以应用于其中 LIV-1在癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、 血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1介导的细胞-细胞粘附、细胞-细胞相互 作用、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质 相互作用、整联蛋白介导的活性、LIV-1表面表达、LIV-1介导的细胞-细 胞外基质降解、Snail核定位以及LIV-1表达中起着作用的任何的肿瘤细胞 类型。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、皮肤癌、食管癌、肝癌、胰腺 癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓 瘤和黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是ER阳性乳腺癌。在一些实施方 案中，癌症是ER阴性乳腺癌。在一些实施方案中，此类癌症展现出与对 照相比至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约 150％、至少约200％或至少约300％的LTV-I差异表达。
本发明提供了用于治疗、抑制和管理与LIV-1过量表达相关的疾病和 病症以及治疗、抑制和管理此类疾病和病症的症状的方法和组合物。本发 明的一些实施方案涉及包含治疗、抑制和管理癌症的组合物的方法和组合 物，所述癌症包括但不限于癌转移、癌细胞增殖、癌细胞生长和癌细胞侵 袭。
本发明还提供了包括与本发明LIV-1调节剂联合的其它活性组分的方 法。在一些实施方案中，该方法还包括给患者施与一种或多种常规癌治疗。 在一些实施方案中，本发明的方法还包括用化学治疗、放射治疗或外科手 术中的一种或多种治疗患者。
本法还提供了用于治疗、抑制和管理癌症或其它超增殖的细胞病症或 疾病的方法和组合物，所述癌症或其它超增殖的细胞病症或疾病已变得部 分或完全地耐受当前的或标准癌症治疗，诸如外科手术、化学治疗、放射 治疗、激素治疗和生物学治疗。
本发明也提供了应用本发明的LIV-1调节剂、特别是LIV-1抗体以诊 断癌症和/或预测癌症进程的诊断和/或成像方法。在一些实施方案中，本发 明的方法提供成像和定位肿瘤和/或转移灶的方法以及诊断和预后的方法。 在一些实施方案中，本发明的方法提供了评价LIV-1相关治疗适当性的方 法。
LIV-1调节剂
本发明提供了LIV-1调节剂，尤其用于癌症治疗、诊断、检测或成像。 LIV-1调节剂也可用于制备治疗癌症的药物。
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是寡核苷酸、小分子、模拟物、诱 饵或抗体。在一些实施方案中，与对照相比，LIV-1调节剂使LIV-1生物 活性被抑制了25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、 98％、99％或100％。在一些实施方案中，与对照相比，LIV-1调节剂使 LIV-1表达被抑制了至少25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、 95％、97％、98％、99％或100％。
抗体
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合 抗体、人类抗体、人源化抗体、单链抗体、或Fab片段。抗体例如可以用 酶、同位素或荧光团标记。在一些实施方案中，抗体具有对除LIV-1之外 的多肽小于约1×105Ka的结合亲和力。在一些实施方案中，LIV-1调节 剂是以至少1×108Ka的亲和力结合至LIV-1的单克隆抗体。
本发明也提供了抗体，所述抗体竞争性地抑制抗体与本发明的表位的 结合，如通过例如应用免疫分析的用于确定竞争性抑制的任何本领域已知 方法确定的那样。在一些实施方案中，抗体对至表位的结合而言，竞争性 抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、 至少60％或至少50％。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可以通过各种方 法得到，所述方法例如包括：(1)将非人类互补决定区(CDRs)移植至人类构 架和恒定区(本领域称为“人源化”的方法)，或者备选地(2)移植整个非人 类可变区，但是通过表面残基替换用人类样表面“遮掩”它们(本领域称为 “镶饰(veneering)”的方法)。在本发明中，人源化抗体将包括“人源化” 和“镶饰”抗体。类似地，人类抗体可以通过将人类免疫球蛋白基因座引 入其中内源免疫球蛋白基因已部分或全部失活的转基因动物例如小鼠中而 得以制备。攻击后，观察到了人类抗体的产生，其在包括基因重排、组装 和抗体库等的所有方面都非常类似于在人类中所观察到的。这一方法例如 描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、 5,661,016，以及以下科学出版物中：Marks等，Bio/Technology 10，779-783 (1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature，368， 812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)； Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar， Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；Jones等，Nature 321：522-525 (1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，81：6851-6855(1984)； Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyer等，Science， 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan， Molec.Immunol.31(3)：169-217(1994)；以及Kettleborough，CA.等，Protein Eng.4(7)：773-83(1991)，其中的每一个都在此引入作为参考。
本发明的抗体可以通过不同的机制工作。在一些实施方案中，抗体触 发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，细胞溶解作用攻击抗体靶向的细胞。在一 些实施方案中，抗体具有多重治疗功能，例如包括抗原结合、诱导凋亡以 及补体依赖的细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以作为本发明多肽的激动剂或拮 抗剂。例如，在一些实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体部分或完 全地破坏受体/配体与本发明多肽的相互作用。在一些实施方案中，本发明 的抗体结合本文公开的表位，或其部分。在一些实施方案中，提供了抗体， 与不存在抗体的情况下相比，所述抗体调节配体活性或受体活性至少 95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少 60％或至少50％。
在一些实施方案中，LIV-1抗体抑制Snail途径和/或抑制细胞周期蛋 白D1、纤连蛋白、RhoB、MT1-MMP、FGF、CDK4、VEGF、EGFR和 EGFR磷酸化中的一个或多个。在一些实施方案中，LIV-1抗体抑制整联 蛋白介导的活性。在一些实施方案中，LIV-1抗体抑制Snail核定位。
在一些实施方案中，LIV-1抗体上调E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、 Muc-1、水闸蛋白、封闭蛋白、桥粒斑蛋白、胱天蛋白酶、p21、p53、BID(bcl- 相互作用死亡激动剂)、DFF40(DNA片段化因子)以及细胞角蛋白中的一 个或多个。在一些实施方案中，LIV-1抗体下调Snail途径中的一个或多个 间充质标记物。
在一些实施方案中，本发明提供了中和抗体。在一些实施方案中，中 和抗体作为受体拮抗剂，即抑制配体介导的受体活化的生物活性的全部或 其子集。在一些实施方案中，可以将抗体描述为生物学活性的激动剂、拮 抗剂或反向激动剂，所述生物学活性包含本文所公开发明多肽的特定生物 学活性。
本发明的抗体可以单独使用或与其它组合物联合使用。抗体可以进一 步在N-或C-端重组融合至异源多肽或化学缀合(包括共价或非共价缀合) 至多肽或其它组合物上。例如，本发明的抗体可以重组融合或缀合至在检 测分析中用于作为标签的分子或诸如异源多肽、药物、放射性核素或毒素 的效应分子上。例如，参见PCT公开WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624；美国专利号5,314,995；以及EP 396,387。
除了嵌合抗体和人源化抗体之外，完全的人类抗体也可以从具有人类 免疫球蛋白基因的转基因小鼠(例如，参见美国专利号6,075,181、6,091,001 和6,114,598，其全部在此引入作为参考)、或从人类免疫球蛋白基因的噬 菌体展示文库中(例如，参见McCafferty等，Nature，348：552-554(1990). Clackson等，Nature，352：624-628(1991)，以及Marks等，J.Mol.Biol.， 222：581-597(19911))得到。
可以应用Kohler等(1975，Nature 256：495-496)的方法或其修改方法制 备单克隆抗体。一般地，用含有抗原的溶液免疫小鼠。免疫可以通过在盐 水、优选在佐剂诸如弗氏完全佐剂中混合或乳化含有抗原的溶液，以及肠 胃外注射混合物或乳剂而完成。可用本领域已知的任何免疫方法获得本发 明的单克隆抗体。在动物免疫之后，分离脾脏(以及任选地，数个大淋巴结) 并将其解离为单个细胞。可以通过将细胞悬浮液应用至包被有感兴趣抗原 的板或孔中来筛选脾脏细胞。表达对抗原特异的膜结合免疫球蛋白的B细 胞结合至板上并不会被漂洗走。然后诱导所得到的B细胞或所有离解的脾 脏细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并在选择培养基中培养。通过系 列或有限稀释平板接种所得到的细胞，并且分析特异性结合感兴趣抗原(并 且不结合非相关抗原)的抗体的产生。然后在体外(例如在组织培养瓶或中 空纤维反应器中)或体内(如小鼠中的腹水)培养所选择的分泌单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤。
作为对应用杂交瘤用于表达的备选，可以在细胞系，诸如CHO或骨 髓瘤细胞系中产生抗体，如在美国专利号5,545,403、5,545,405和5,998,144 公开的那样，其中上述每一个专利均在此引入作为参考。简而言之，分别 用能够表达轻链和重链的载体转染细胞系。通过转染在分开的载体上的两 个蛋白，可以产生嵌合抗体。Immunol.147：8；Banchereau等(1991)Clin. Immunol.Spectrum 3：8；以及Banchereau等(1991)Science 251：70，其全 部在此引入作为参考。
也可以通过应用本领域已知的技术，包括噬菌体展示文库 [Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol. Biol.，222：581(1991)]来制备人类抗体。也可以利用Cole等和Boerner等的 方法制备人类单克隆抗体[Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)以及Boerner等，J.Immunol.， 147(1)：8695(1991)]。人源化抗体可以通过各种方法得到，所述方法例如包 括(1)将非人类互补决定区(CDRs)移植至人类构架和恒定区(本领域称为 “人源化”的方法)，或者备选地(2)移植整个非人类可变结构域，但是通过 表面残基替换用人类样表面“遮掩”它们(本领域称为“镶饰”的方法)。 在本发明中，人源化抗体将包括“人源化”和“镶饰”抗体。类似地，人 类抗体可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入其中内源免疫球蛋白基因已 部分或全部失活的转基因动物如小鼠中而制备。攻击后，观察到了人类抗 体的产生，其在包括基因重排、组装和抗体谱的所有方面都非常类似于在 人类中所观察到的。这一方法例如描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、 5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016，以及以下科学出版物中：Marks 等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859 (1994)；Morrison，Nature，368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826 (1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；Jones 等，Nature 321：522-525(1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.， 81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)； Verhoeyer等，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun. 28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169-217(1994)；以及 Kettleborough，CA.等，Protein Eng.4(7)：773-83(1991)，其中的每一个都在 此引入作为参考。
词组“互补决定区”是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv 区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。例如参见，Chothia等，J.Mol. Biol.196：901-917(1987)；Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services NEH Publication No.91-3242(1991)。词组“恒定区”是指赋予效 应子功能的抗体分子的部分。在本发明中，用人类恒定区替换了小鼠恒定 区。对象人源化抗体的恒定区衍生自人类免疫球蛋白。重链恒定区可以选 自任意的以下5种同种型：α、δ、ε、γ、μ。人源化抗体的一种方法包括将 非人类重链和轻链序列与人类重链和轻链序列进行比对，基于该比对选择 并用人类构架替换非人类构架，分子建模以预测人源化序列的构象并与亲 本抗体的构象相比较。这一方法之后，反复回复突变妨碍CDRs结构的CDR 区残基，直到人源化序列模型的预测构象密切接近亲本非人类抗体的非人 类CDRs的构象。可以进一步衍生此类人源化抗体以促进摄入和例如通过 Ashwell受体的清除。例如参见美国专利号5,530,101和5,585,089，其在此 引入作为参考。
人源化抗体也可以用经基因工程改造含有人类免疫球蛋白基因座的转 基因动物来生产。例如，WO 98/24893公开了具有人类Ig基因座的转基因 动物，其中该动物由于内源重链和轻链基因座的失活而不产生有功能的内 源免疫球蛋白。WO 91/10741也公开了能够对免疫原产生免疫反应的转基 因非灵长类哺乳动物宿主，其中抗体具有灵长类的恒定和/或可变区，且其 中编码内源免疫球蛋白的基因座被替换或失活了。WO 96/30498公开了用 Cre/Lox系统修饰哺乳动物中免疫球蛋白基因座的应用，诸如替换恒定或 可变区的全部或部分以形成经修饰的抗体分子。WO 94/02602公开了具有 失活的内源Ig基因座和有功能的人类Ig基因座的非人类哺乳动物宿主。 美国专利号5,939,598公开了制备转基因小鼠的方法，其中小鼠缺乏内源重 链并且表达包含一个或多个异种恒定区的异源免疫球蛋白基因座。本发明 的抗体也可以应用如在美国专利5,766,886中所讨论的人类基因工程技术 得以制备，其在此引入作为参考。
应用以上描述的转基因动物，可以产生对所选择的抗原分子的免疫反 应，以及可以从动物中分离产生抗体的细胞并且用于产生分泌人类单克隆 抗体的杂交瘤。免疫方案、佐剂等是本领域已知的，并且例如用于如WO 96/33735描述的转基因小鼠的免疫。可对单克隆抗体进行抑制或中和相应 蛋白生物学活性或生理学作用的能力测试。
本发明的抗体可以通过如Fang等((2005)，Nat.Biotechnol.23，584-590) 所讨论的体内治疗性抗体基因转移而施与给受试者。例如可以产生重组载 体以递送多顺反子表达盒，所述表达盒包含介导位于MAb重链和轻链编 码序列之间多肽的不依赖酶的共翻译自切割的肽。表达产生化学计量量的 两个MAb链。介导不依赖酶的共翻译自切割的肽的优选示例是衍生自口 蹄疫的2A肽。
抗体片段适合用于本发明的方法，只要它们保留了全长抗体的期望亲 和力。因此，抗LIV-1抗体片段将保留结合至LIV-1的能力。此类片段的 特征在于与相应的全长抗LIV-1抗体类似的特性，即片段特异性地结合在 人类细胞表面上表达的人类LIV-1抗原。
在一些实施方案中，抗体结合LIV-1细胞外结构域上的一个或多个表 位。在一些实施方案中，抗体调节一个或多个LIV-1相关的生物学活性。 在一些实施方案中，抗体抑制癌细胞生长、肿瘤形成和癌细胞增殖中的一 个或多个。
在一些实施方案中，抗体是结合至选自以下的结构域中的一个或多个 LIV-1表位的单克隆抗体：LIV-1的N端细胞外结构域、跨膜结构域(TM)2 和3之间的LIV-1细胞外结构域、TM 4和5之间的LIV-1细胞外结构域、 TM 6和7之间的LIV-1细胞外结构域以及LIV-1的C端细胞外结构域。
在一些实施方案中，单克隆抗体结合至TM 2和3之间的LIV-1细胞 外结构域中的LIV-1表位。在一些实施方案中，单克隆抗体结合至SEQ ID NO：388的一个或多个表位。
在一些实施方案中，抗体单克隆抗体结合至LIV-1N端细胞外结构域 中的LIV-1表位。在一些实施方案中，单克隆抗体结合至SEQ ID NO：387 的一个或多个表位。
根据本发明的合适的抗体能够识别线性或构象型的表位，或其组合。 在一些实施方案中，本发明的抗体结合至选自SEQ ID NO：3-6的LIV-1抗 原区域的表位。在一些实施方案中，抗体对具有选自SEQ ID NO：3-360的 序列的表位是特异的。在一些实施方案中，抗体对具有选自SEQ ID NO：361-364或387-391的序列的表位是特异的。应当理解，这些肽可以不 需要精确的绘制表位，而是也可以含有非免疫原性的LIV-1序列。
预测其它本发明抗体可以与其结合的潜在表位的方法对于本领域技术 人员来说是公知的，包括但不限于Kyte-Doolittle分析(Kyte，J.和Dolittle， R.F.，J.Mol.Biol.(1982)157：105-132)、Hopp和Woods分析(Hopp，T.P. 和Woods，K.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78：3824-3828；Hopp，TJ. 和Woods，K.R.，Mol.Immunol.(1983)20：483-489；Hopp，TJ.，J.Immunol. Methods(1986)88：1-18.)、Jameson-Wolf分析(Jameson，B.A.和Wolf，H.， Comput.Appl.Biosci.(1988)4：181-186.)和Emini分析(Emini，E.A.， Schlief，W.A.，Colonno，RJ.和Wimmer，E.，Virology(1985)140：13-20.)。
如果抗体满足以下条件则被定义为“特异性结合”：1)它们表现出阈 水平的结合活性，和/或2)它们不与已知相关多肽分子显著地交叉反应。抗 体的结合亲和力可以通过本领域普通技术人员很容易地确定，例如，通过 Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)。在一些 实施方案中，本发明的抗体结合至它们的靶标表位或模拟诱饵，对靶标癌 相关多肽比对其它ZIP(Zrt-、Irt-样蛋白)锌转运蛋白的已知成员高至少1.5 倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。
在一些实施方案中，抗体以10-4M或更少、10-7M或更少、10-9M或更 少的高亲和力，或以亚纳摩级亲和力(0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、 0.2、0.1nM或甚至更低)结合。在一些实施方案中，抗体对LIV-1的结合 亲和力至少是1×106Ka。在一些实施方案中，抗体对LIV-1的结合亲和 力是至少5×106Ka、至少1×107Ka、至少2×107Ka、至少1×108Ka， 或更高。本发明的抗体也可以根据它们对本发明多肽的结合亲和力来描述 或说明。在一些实施方案中，结合亲和力包括Kd小于5×10-2M、10-2M、 5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、 10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10 M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、 5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M或更低的那些。
在一些实施方案中，例如，如果应用标准蛋白质印迹分析(Ausubel等) 本发明的抗体结合LIV-1多肽而不是已知相关多肽，则本发明的抗体不结 合至已知的相关多肽分子。已知相关多肽的例子包括但不限于ZIP(Zrt-， Irt-样蛋白)锌转运蛋白家族的其它成员等，包括但不限于SEQ ID NO：365、 SEQ ID NO：366和SEQ ID NO：386。
在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1或锌转运蛋白多肽的 直向同源物(orthologs)、同源物、旁系同源物(paralogs)或变体、或其组合 和亚组合。在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1或锌转运蛋白 多肽的直向同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1或锌 转运蛋白多肽的同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合至LIV-1 或锌转运蛋白多肽的旁系同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合 至LIV-1或锌转运蛋白多肽的变体。在一些实施方案中，本发明的抗体不 结合至LIV-1或锌转运蛋白多肽的直向同源物、同源物、旁系同源物或变 体、或其组合和亚组合。
在一些实施方案中，可以针对已知相关多肽筛选抗体以分离特异结合 至LIV-1多肽的抗体群。例如，在合适的缓冲条件下使对人类LIV-1多肽 特异的抗体流过包含附着在不可溶基质的ZIP(Zrt-，Irt-样蛋白)锌转运蛋 白(除LIV-1之外)的柱。此类筛选允许分离不与密切相关多肽交叉反应的 多克隆和单克隆抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane (编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988、Current Protocols in Immunology，Cooligan等(编辑)，National Institutes of Health，John Wiley 和Sons，Inc.，1995)。特定抗体的筛选和分离在本领域是公知的(参见， Fundamental Immunology，Paul(编辑)，Raven Press，1993、Getzoff等， Adv.in Immunol.43：1-98，1988、Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Goding，J.W.(编辑)，Academic Press Ltd.，1996、Benjamin等， Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984)。此类分析的代表性例子包括：并行 免疫电泳、放射免疫分析(RIA)、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附分析 (ELISA)、点印迹或蛋白质印迹分析、抑制或竞争分析以及三明治分析法。
在一些实施方案中，本发明的抗体不特异性的结合至SEQ ID NO： 365、SEQ ID NO：366或SEQ ID NO：386。在一些实施方案中，本发明的 抗体不特异性地结合至由SEQ ID NO：386的125-138位残基、SEQ ID NO：386的252-265位残基或SEQ ID NO：386的418-431位残基组成的表 位。在一些实施方案中，抗体不与ZnT1或Zip1交叉反应。
本发明也提供是SMIPs或对靶标蛋白特异的结合结构域免疫球蛋白 融合蛋白的抗体。这些构建物是包含融合至免疫球蛋白实施抗体效应子功 能所必需结构域的抗原结合结构域的单链多肽。例如参见WO03/041600、 美国专利公开20030133939和美国专利公开20030118592。
在一些实施方案中，本发明的抗体是中和抗体。在一些实施方案中， 抗体是靶向抗体，在一些实施方案中，抗体在结合靶标后被内在化。在一 些实施方案中，抗体在结合靶标后不被内在化而是保留在表面。
可以针对结合至所讨论的肿瘤细胞抗原后迅速内在化的能力或针对在 结合后留在细胞表面的能力筛选本发明的抗体。在一些实施方案中，例如 在一些类型的免疫缀合物构建物中，如果需要内在化以释放毒素部分的话， 抗体被内在化的能力是所期望的。或者，如果将抗体用于提高ADCC或 CDC，更期望抗体保留在细胞表面。可以应用筛选方法区分这些类型的表 现。例如，可以利用拥有肿瘤细胞抗原的细胞，其中将细胞与人类IgGl(对 照抗体)或本发明抗体之一以大约1μg/mL的浓度在冰上(具有0.1％叠氮化 钠以阻止内在化)或在37℃(没有叠氮化钠)孵育3小时。然后用冷的染色缓 冲液(PBS+1％BSA+0.1％叠氮化钠)洗涤细胞，并用山羊抗人IgG-FITC 在冰上染色30分钟。通过FACS Calibur记录几何平均荧光强度(MFI)。 如果在与本发明抗体冰上于存在叠氮化钠的情况下孵育的细胞和在37℃ 不存在叠氮化钠的情况下观察的细胞之间没有观察到MFI的差别，则认为 该抗体是保持结合在细胞表面而不被内在化的抗体。然而如果发现当细胞 在37℃不存在叠氮化钠的情况下孵育时，在表面的可染色的抗体减少了， 则认为该抗体是能够内在化的抗体。
抗体缀合物
在一些实施方案中，本发明的抗体是缀合的。在一些实施方案中，缀 合的抗体可以用于癌症治疗、癌症诊断或癌性细胞成像。
对用于诊断应用，一般用可检测部分标记抗体。可利用很多标签，这 些标签通常可以分为以下类型：
(a)放射性核素，诸如以下所讨论的那些。例如，可以用放射性同位 素应用例如描述于Current Protocols in Immunology，卷1和2，Coligen等 编辑.Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)的技术标记抗体， 并可以用闪铄计数法测量放射性。
(b)荧光标签，诸如可以利用稀土元素螯合物(铕螯合物)，或荧光素 及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红素、德克萨斯红。 可以应用例如以上Current Protocols in Immunology中公开的技术将荧光 标签缀合至抗体。可以用荧光计定量荧光。
(c)可以利用各种酶-底物标签，以及美国专利号4,275,149提供了这 些中一些的综述。酶通常催化可应用各种技术测量的显色底物的化学改变。 例如，酶可以催化可用分光光度计测量的底物的颜色变化。或者，酶可以 改变底物的荧光或化学发光。上面讨论了定量荧光改变的技术。化学发光 底物通过化学反应变得电子活跃的，并可能然后发射可测量(例如应用化学 发光仪)的光或给与能量给荧光受体。酶标签的示例包括萤光素酶(例如， 萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶，美国专利号4,737,456)、萤光素、2，3-二 氢二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、脲酶、 过氧化物酶诸如辣根过氧物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖 淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、以及葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化 物酶、微过氧化物酶等。将酶缀合至抗体的技术描述于O’Sullivan等， Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，Methods in Enzym.(编辑J.Langone&H.Van Vunakis)，Academic press，New York，73：147-166(1981)。
抗体也可以用于体内诊断分析。在一些实施方案中，用放射性核素标 记抗体，从而可以应用免疫闪烁成像定位肿瘤。为了方便，本发明的抗体 可以在试剂盒中提供，即预定量试剂和进行诊断分析说明书的经包装的组 合。当抗体用酶标记时，试剂盒可以包括酶所需的底物和辅助因子(例如， 提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，还可以包括其它添加剂， 诸如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相 对量可能变化很大，以提供基本上最优化分析敏感性的试剂在溶液中的浓 度。具体地，试剂可以作为通常是冻干的干粉提供，所述试剂包括赋形剂， 其在溶解后将提供具有合适浓度的试剂溶液。
在一些实施方案中，将抗体缀合至一个或多个美登素分子(例如每一个 抗体分子约1至约10个美登素分子)。例如，可将美登素转换为May-SS-Me， 后者可还原为May-SH3并与经修饰的抗体反应(Chari等Cancer Research 52：127-131(1992))以产生美登木素生物碱-抗体免疫缀合物。在一些实施方 案中，缀合物可以是高效的美登素衍生物DM1(N2’-脱乙酰-N2’-(3-巯基-l- 氧代丙基)-美登素)(例如，参见2002年12月12日公开的WO02/098883)， 其具有约10-11M的IC50(综述，参见Payne(2003)Cancer Cell 3：207-212)， 或DM4(N2’-脱乙酰-N2’(4-甲基--4-巯基-l-氧代戊基)-美登素)(例如参见 2004年12月2日公开的WO2004/103272)。
在一些实施方案中，抗体缀合物包含缀合至一个或多个加利车霉素分 子的抗肿瘤细胞抗原抗体。抗生素的加利车霉素家族能够在亚皮摩尔的浓 度下产生双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素结构类似物包括但不限 于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode等Cancer Research 58：2925-2928(1998))。 也参见美国专利号5,714,586、5,712,374、5,264,586和5,773,001，其每一 个都明确地在此引入作为参考。
在一些实施方案中，抗体缀合至前体药物，所述前体药物能够通过在 许多癌中过度生产的酶释放它的活性形式。例如，可以与阿霉素的前体药 物形式制得抗体缀合物，其中通过纤维蛋白溶酶从缀合物中释放活性成分。 已知在许多癌性组织中都过度产生纤维蛋白溶酶(参见Decy等，(2004) FASEB Journal 18(3)：565-567)。
在一些实施方案中，将抗体缀合至酶活性毒素或其片段，在一些实施 方案中，毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒 素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、假单胞菌内毒素、 蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋 白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和 PAP-S)、核糖核酸酶(Rnase)、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、美洲商陆抗病毒 蛋白、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、促细胞分裂剂、局限曲菌素、酚霉素、新 霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。例如参见1993年10月28 日公开的WO 93/21232。在一些实施方案中，毒素具有很低的内在免疫原 性以及减少癌性细胞变得耐受毒素的可能性的作用机理(例如，细胞毒性机 理对细胞抑制机理)。
在一些实施方案中，在本发明的抗体和免疫调节剂之间制得缀合物。 例如，在一些实施方案中，可以应用免疫刺激性寡核苷酸。这些分子是可 以引起抗原特异性抗体反应的有效免疫原(参见Datta等，(2003)Ann N.Y. Acad.Sci 1002：105-111)。其它的免疫调节化合物可以包括干细胞生长因 子，诸如“S1因子”；淋巴毒素，诸如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子， 诸如白介素；集落刺激因子(CSF)，诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒 细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)；干扰素(IFN)，诸如干扰素α、β、γ； 促红细胞生成素以及促血小板生成素。
在一些实施方案中，提供了放射缀合的抗体。在一些实施方案中，此 类抗体可以应用32P、33P、47Sc、59Fe、64Cu、67Cu、75Se、77As、89Sr、90Y、 99Mo、105Rh、109Pd、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、161Th、166Ho、 169Er、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211Pb、212Pb、213Bi、 58Co、67Ga、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、161Ho、189mOs、192Ir、152Dy、 211At、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、225Ac、221Fr、217At、213Bi、255Fm 或其组合或亚组合而制得。在一些实施方案中，将硼、钆或铀原子缀合至 抗体。在一些实施方案中，硼原子是10B、钆原子是157Gd以及铀原子是235U。
在一些实施方案中，放射性核素缀合物具有能量在20至10,000keV 之间的放射性核素。放射性核素可以是具有小于1000keV能量的Auger 发射体、具有20至5000keV之间能量的P发射体、或具有2000至10,000 keV之间能量的α或“a”发射体。
在一些实施方案中，提供了诊断的放射性缀合物，其包含是发射γ-、β- 或发射正电子的同位素的放射性核素。在一些实施方案中，放射性核素具 有20至10,000keV之间的能量。在一些实施方案中，放射性核素选自：18F、 51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、68Ga、72As、75Br、76Br、82mRb、 83Sr、89Zr、94mTc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、 114mIn、123I、125I、13Li和197Hg。
在一些实施方案中，本发明的抗体缀合至是光活化剂或造影剂的诊断 剂。光活化化合物可以包含诸如发色团或染料的化合物。造影剂例如可以 是顺磁离子，其中离子包含选自以下的金属：铬(III)、锰(II)、铁(III)、 铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、 铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。造影剂也可以是用于X射线技术或计 算机断层扫描中的射线不透性化合物，诸如碘、铱、钡、镓和铊化合物。 射线不透性化合物可以选自：钡、3，5-双[乙酰氨基]-2，4，6-三碘苯甲酸盐、 乙碘油(ethiodized oil)、柠檬酸镓、碘卡酸、碘酸胺酸、碘达酸、胆影酸、 碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、 碘丝酸、碘磺拉胺甲基葡胺、iosemetic酸、碘酞硫、碘替酸、碘拉酸、碘 托西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、甲基葡胺、甲泛葡胺、甲泛影 钠、丙磺酮以及氯化亚铊。在一些实施方案中，诊断性免疫缀合物可以含 有缀合至本发明抗体的超声增强剂，诸如充满气体的脂质体。诊断性免疫 缀合物可以用于各种方法中，包括但不限于肿瘤或癌症诊断和检测的手术 中、内窥镜检查或血管内方法。
在一些实施方案中，应用各种双功能蛋白偶联剂制备缀合物，所述偶 联剂诸如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸盐(SPDP)、琥珀酰亚胺 -4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的 双功能衍生物(诸如己二酰亚氨二甲酯HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基 辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(对叠氮基苯甲酰)己 二胺)、二-重氮衍生物(诸如二-(对重氮基苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸盐(诸 如甲苯2，6-二异氰酸盐)以及双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。 例如，可以如Vitetta等Science 238：1098(1987)描述的方法制备蓖麻毒素 免疫毒素。碳-14-标记的l-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示范性螯合剂。参见 WO94/11026。接头可以是能促进细胞毒素药物在细胞中释放的“可切割接 头”。例如，可以应用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、二甲基接头或 含有二硫化物的接头(Chari等Cancer Research 52：127-131(1992))。此外 试剂也可以通过碳水化合物部分连接至本发明的抗体。
在一些实施方案中，包含本发明的抗体和细胞毒剂的融合蛋白例如可 以通过重组技术或肽合成制备。在一些实施方案中，将此类包含与细胞毒 剂缀合的抗肿瘤抗原抗体的免疫缀合物施与患者。在一些实施方案中，免 疫缀合物和/或其结合的肿瘤细胞抗原蛋白被细胞内在化，导致增加了免疫 缀合物在杀伤其结合的癌细胞中的治疗效力。在一些实施方案中，细胞毒 剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱、 加利车霉素、核糖核酸酶和DNA核酸内切酶。
在一些实施方案中，抗体缀合至“受体”(例如链亲和素)用于在肿瘤 预靶向中的应用，其中将抗体-受体缀合物施与患者，随后用清洁剂从循环 中移除未结合的缀合物并然后施与缀合至细胞毒剂(例如放射性核苷酸)的 “配体”(例如抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，抗体缀合至在靶细胞溶酶体内释放的细胞毒素分 子。例如，可以通过缬氨酸-瓜氨酸连接来缀合药物一甲基奥瑞他汀 (auristatin)E(MMAE)，在抗体缀合物内在化后，所述缬氨酸-瓜氨酸连 接会被水解蛋白的溶酶体酶-组织蛋白酶B切割(例如参见2003年4月3 日公开的WO03/026577)。在一些实施方案中，可应用酸不稳定的接头将 MMAE连接至抗体，所述酸不稳定的接头含有作为可切割部分的腙官能度 (例如参见2002年11月11日公开的WO02/088172)。
抗体依赖的酶介导的前体药物治疗(ADEPT)
在一些实施方案中，通过缀合抗体至前体药物活化酶可以将本发明的 抗体用于ADEPT，所述前体药物活化酶将前体药物(例如，肽基化学治疗 剂，参见WO81/01145)转换为活性抗癌药物。例如参见WO 88/07378和美 国专利号No.4,975,278。
在一些实施方案中，用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括任何能 够以将前体药物转换为它的更有效的细胞毒性形式的方式作用于前体药物 的酶。
在ADEPT中有用的酶包括但不限于：用于将含有磷酸酯的前体药物 转换为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸酯的前体药物转换为游离 药物的芳香基硫酸酯酶；用于将非毒性5-氟胞嘧啶转换为抗癌药物5-氟尿 嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含有肽的前体药物转换为游离药物的蛋白酶， 诸如灵杆菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶 和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；用于转换含有D-氨基酸替代物的 前体药物的D-丙氨酰羧基肽酶；用于将糖基化前体药物转换为游离药物的 糖切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将与β-内酰胺衍生的药 物转换为游离药物的β-内酰胺酶；用于将在它们的胺氮上分别用苯氧基乙 酰或苯乙酰基团衍生的药物转换为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素 V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。在一些实施方案中，可以用具有酶活性的抗 体(在本领域也称为“抗体酶(abzymes)”)将本发明的前体药物转换为游 离的活性药物(例如参见，Massey，Nature328：457-458(1987))。可以如本文 描述的那样制备抗体-抗体酶缀合物用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。
在一些实施方案中，可以通过本领域公知的技术将ADEPT酶共价结 合至抗体，诸如应用上面讨论的异双功能交联剂。在一些实施方案中，可 以应用本领域公知的重组DNA技术构建包含连接至本发明的酶的至少功 能活性部分的本发明抗体的至少抗原结合区域的融合蛋白(例如参见 Neuberger等，Nature，312：604-608(1984))。
在一些实施方案中，对以细胞抑制方式而不是以细胞毒性方式作用的 抗体的鉴定可以通过测量与未经处理的对照培养物相比，经处理的靶细胞 培养物的生存力来完成。可以用本领域已知的方法检测生存力，诸如 CellTiter-细胞生存力测试法或CellTiter-发光细胞生存力测 试法(Promega，目录编号分别是G8080和G5750)。在一些实施方案中， 如果处理引起与对照培养相比在细胞数目上的降低，而没有任何如通过以 上描述的方法测量的细胞死亡的证据，则认为该抗体是潜在的细胞抑制剂。
在一些实施方案中，可以应用本领域已知的测试法进行体外筛选测试 以鉴定促进ADCC的抗体。一个示范性测试法是体外ADCC测试法。为 制备铬51标记的靶细胞，使肿瘤细胞系在组织培养板中生长并用灭菌的在 PBS中的10mM EDTA收集。用细胞培养基洗涤分离的细胞两次。用200 μCi铬51(New England Nuclear/DuPont)在37℃标记细胞(5×106)一个小 时，偶尔进行混合。用细胞培养基洗涤经标记的细胞三次，然后将细胞悬 浮至1×105个细胞/mL的浓度。在通过与抗体在PBMC测试法中以100 ng/mL和1.25ng/mL或在NK测试法中以20ng/mL和1ng/mL孵育的测 试之前，细胞没有经调理作用或经调理作用。通过从正常健康供体收集肝 素支持的血液并用等容积的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释制备外周血单核细胞。 然后将血液铺在LYMPHOCYTE SEPARATION(LSM： Organon Teknika)上并按照生产商的教导离心。从LSM-血浆分界面收集 单核细胞并用PBS洗涤3次。将效应细胞悬浮在细胞培养基中至终浓度1 ×107个细胞/mL。在通过LSM纯化后，应用NK细胞分离试剂盒和磁柱 (Miltenyi Biotech)，按照生产商的教导，通过负选择从PBMCs分离自然杀 伤(NK)细胞。收集分离的NK细胞，洗涤并悬浮于细胞培养基中达到2× 106个细胞/mL的浓度。通过流式细胞分析确定NK细胞的身份。通过用细 胞培养基沿微滴定板的行两倍系列稀释效应(PBMC或NK)细胞(100μL 终体积)而制备不同的效应子：靶标比。效应细胞的浓度范围对于PBMC 是1.0×107/mL至2.0×104/mL，且对于NK是2.0×106/mL至3.9× 103/mL。在效应细胞的滴定之后，将100μL 1×105个细胞/mL的铬51标 记的靶细胞(受调理或未受调理)加至板的每一个孔。这样得到对于PBMC 的100∶1的初始效应子：靶标比以及对于NK细胞的20∶1的初始效应子： 靶标比。所有的分析均以双份进行，并且每一块板都含有对于自发裂解(没 有效应细胞)和总裂解(靶细胞加上100μL 1％十二烷基硫酸钠、1N氢氧化 钠)的对照。将板在37℃孵育18小时，之后应用上清收集系统(Skatron Instrument，Inc.)收集细胞培养上清液并在Minaxi自动-γ5000系列γ计数 器(Packard)中计数1分钟。然后应用公式：％细胞毒性＝(样本cpm- 自发裂解)/(总裂解-自发裂解)×100以细胞毒性百分数表达结果。
为鉴定促进CDC的抗体，熟练的技术人员可以进行本领域已知的测 试。一个示范性的测试法是体外CDC测试法。在体外，CDC活性可以通 过将表达肿瘤抗原的细胞与人类(或其它来源)含有补体的血清在不存在或 存在不同浓度测试抗体的情况下孵育而得以测量。然后通过应用 ALAMAR(Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202 163-171(1997))定量活细胞来测量细胞毒性。以不含抗体和含有抗体，但使 用热灭活血清和/或应用不表达所讨论的肿瘤细胞抗原的细胞来进行对照 测试。或者，可以用肿瘤抗原或衍生自肿瘤抗原的肽包被红细胞，以及然 后可以通过观察红细胞裂解来测试CDC(例如参见Karjalainen和 Mantyjarvi，Acta Pathol Microbiol Scand[C].1981年10月；89(5)：315-9)。
为选择诱导细胞死亡的抗体，可以相对于对照评估如通过PI、台盼蓝 或7AAD摄入指示的膜完整性的丧失。一个示范性测试法是应用表达肿瘤 抗原的细胞的PI摄入测试法。按照这一测试法，在补充有10％热失活FBS (Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(D-MEM)： Ham′s F-12(50∶50)中培养表达肿瘤细胞抗原的细胞。(因此，该测试法在 不存在补体和免疫效应细胞的情况下进行)。以每培养皿3×106的密度在 100×20mm培养皿中接种肿瘤细胞并允许贴附过夜。然后移除培养基， 并替换以单独的新鲜培养基或含有10μg/mL合适单克隆抗体的培养基。将 细胞孵育3天时间。在每个处理之后，用PBS洗涤单细胞层并通过胰蛋白 酶消化分离。然后将细胞在4℃以1200转/分钟离心5分钟，将沉淀重悬 浮于3ml冰冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5 mM CaCl2)中，并分装至用于移除细胞团块的盖有35mm滤过器的12×75 管(每管1ml，每一处理组3管)中。管然后接受PI(10μg/mL)。可以应用 FACSCANTM流式细胞计和FACSCONVERTTM.CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样本。那些诱导统计学显著水平的细胞死亡(如通过PI摄入 所确定的那样)的抗体可以选择作为诱导细胞死亡的抗体。
也可以应用18F-膜联蛋白作为PET成像剂在体内针对细胞凋亡活性 筛选抗体。在这一方法中，用18F放射性标记膜联蛋白V并且在测试动物 服用所研究的抗体后将其给予测试动物。在细胞凋亡过程中发生的最早事 件之一是磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧外翻至可被膜联蛋白接近的细胞外 表面。然后将动物进行PET成像(参见Yagle等，J Nucl Med.2005年4 月；46(4)：658-66)。也可以将动物处死并分离单个的器官或肿瘤并按照标准 方案针对细胞凋亡标记进行分析。
尽管在一些技术方案中，癌症的特征是基因表达产物的过量表达，本 申请还提供了用于治疗这样的癌症的方法，所述癌症不认为是过量表达肿 瘤抗原的癌症。为确定癌中肿瘤抗原的表达，可以利用各种诊断/预后测试 法。在一些实施方案中，可以通过IHC分析基因表达产物的过量表达。可 以将石蜡包埋的来自肿瘤活组织检查的组织切片进行IHC测试，并如下给 予肿瘤抗原蛋白染色强度标准：
得分0：没有观察到染色或在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色；
得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/几乎不能察觉的膜 染色。这些细胞仅仅在它们膜的一部分被染色。
得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到弱至中等的完全的膜染色。
得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强的完全的膜染色。
可将具有0或1+的肿瘤抗原过量表达评估得分的那些肿瘤描述为不 过量表达肿瘤抗原，而将具有2+或3+得分的那些肿瘤描述为过量表达肿 瘤抗原。
备选地，或另外地，可在福尔马林固定、石蜡包埋的的肿瘤组织上进 行诸如INFORMTM(由Ventana，Ariz销售)或PATHVISIONTM(Vysis， I11.)的FISH测试法，以确定肿瘤中肿瘤抗原过量表达的程度(如果有的 话)。
此外，可通过共价缀合至聚合物来化学修饰抗体以例如增加它们的循 环半寿期。每一个抗体分子可连接至一个或多个(即1、2、3、4、5或更多) 聚合物分子。优选地将聚合物分子通过连接分子连接至抗体。一般而言， 聚合物可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚 烯烃、聚亚烯烃或聚氧基亚烷基聚合物或支链或无支链的多糖，例如同- 或异多糖。在一些实施方案中，聚合物是聚氧乙烯多元醇或聚乙二醇 (PEG)。PEG在室温下可溶于水并且具有通式：R(O-CH2-CH2)n O-R，其 中R可以是氢或保护基团，诸如烷基或烷醇基团。在一些实施方案中，保 护基团具有1至8个碳。在一些实施方案中，保护基团是甲基。符号n是 1至1,000之间或2至500之间的正整数。在一些实施方案中，PEG具有 1000至40,000之间、2000至20,000之间、或3,000至12,000之间的平均 分子量。在一些实施方案中，PEG具有至少一个羟基基团。在一些实施方 案中，羟基是末端羟基基团。在一些实施方案中，正是这一羟基基团被活 化以与抑制剂上的游离氨基基团反应。然而，应当理解，反应基团的种类 和量可以是不同的以得到本发明共价缀合的PEG/抗体。聚合物以及将它们 连接至多肽的方法显示于美国专利号4,766,106、4,179,337、4,495,285和 4,609,546，其每一个均在此全文引入作为参考。
寡核苷酸
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是寡核苷酸。在一些实施方案中， LIV-1调节剂是包含选自SEQ ID NO：367-382的序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸是反义或RNAi寡核苷酸，包括siRNAs 和shRNAs。在一些实施方案中，寡核苷酸与LIV-1基因或基因产物的区 域、结构域、部分或片段互补。在一些实施方案中，寡核苷酸包含约5至 约100个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约12至约35、以及约18至25 个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与LIV-1基因或基因产物的区域、 部分、结构域或片段至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％ 同源。在一些实施方案中，寡核苷酸与LIV-1基因或基因产物的至少15、 20、25、30、35、40、50或100个连续核苷酸存在相当高的序列同源性。 在一些实施方案中，寡核苷酸与全长的LIV-1基因或基因产物存在相当高 的序列同源性。在一些实施方案中，寡核苷酸在中等或严格杂交条件下结 合至具有SEQ ID NO：1核苷酸序列的核酸分子。
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是双链RNA(dsRNA)分子并通过 RNAi(RNA干扰)工作。在一些实施方案中，dsRNA的一条链与LIV-1基 因的区域、部分、结构域或片段至少50％、至少60％、至少70％、至少 80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％ 或100％同源。在一些实施方案中，与LIV-1基因的至少15、20、25、30、 35、40、50、100、200、300、400、500或1000个连续核苷酸存在相当高 的序列同源性。在一些实施方案中，与全长的LIV-1基因存在相当高的序 列同源性。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸用于聚合酶链式反应(PCR)。 这一序列可基于基因组序列或cDNA序列(或由此设计)并用于扩增、确定 或检测在特定细胞或组织中同一的、类似的或互补的DNA或RNA的存在。
小分子
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是小分子。本文所使用的术语“小 分子”是指具有小于约10千道尔顿分子量的有机或无机非聚合物化合物。 小分子的示例包括肽、寡核苷酸、有机化合物、无机化合物等。在一些实 施方案中，小分子具有小于约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约 2或约1千道尔顿的分子量。
模拟物
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是模拟物。本文所使用的术语“模 拟物”是指模拟肽活性的化合物。模拟物是非肽但可以包含通过非肽键连 接的氨基酸。1997年6月10日发布的美国专利号5,637,677及其母申请(其 全部在此引物作为参考)包含产生模拟物的详细教导。简而言之，用不是肽 的分子复制与LIV-1三维结构特异性相互作用的肽的三维结构。在一些实 施方案中，LIV-1模拟物是LIV-1的模拟物或LIV-1配体的模拟物。
诱饵
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是包含至少一部分LIV-1多肽的诱 饵。在一些实施方案中，诱饵与天然LIV-1多肽竞争锌或锌载体-锌复合体。 在一些实施方案中，标记诱饵以利于定量、定性和/或可视化。在其它的实 施方案中，诱饵还包含利于诱饵或诱饵-锌或诱饵-锌载体复合体分离或分 开的部分。在一些实施方案中，诱饵通过捕获锌和/或锌载体(与锌复合或 未复合)并阻止其与传导信号的LIV-1多肽相互作用发挥功能。在一些实施 方案中，诱饵至少包含融合至抗体或抗体片段的LIV-1多肽的部分。
治疗/预防癌症的方法
本发明提供了在受试者中治疗和/或预防癌症或癌症症状的方法，其包 括给受试者施与治疗有效量的一种或多种本发明的LIV-1调节剂。在一些 实施方案中，癌症是与LIV-1过量表达相关的癌症。在一些实施方案中， 癌症是乳腺癌、皮肤癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子 宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤或黑素瘤。在一些实施方 案中，癌位于非激素调节的组织。在一些实施方案中，乳腺癌是ER-阳性 乳腺癌、ER-阴性乳腺癌、或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌 是管腺癌、小叶腺癌或转移性腺癌。在一些实施方案中，受试者已被诊断 为患有癌症或是对癌症易感的。
癌症的症状是本领域技术人员公知的并且包括但不限于胸部肿块、乳 头变化、胸部囊肿、胸部疼痛、死亡、重量减轻、虚弱、极度疲劳、进食 困难、食欲不振、久咳、恶化的气喘、咳出血、尿血、便血、恶心、呕吐、 肝转移、肺转移、骨转移、腹痛下堕、气胀、腹膜腔中有液体、阴道流血、 便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发烧、疼痛)、疼痛、吐血、 重汗、发烧、高血压、贫血、腹泻、黄疸、眩晕、寒战、肌肉痉挛、结肠 转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移、以及胰腺转移、吞 咽困难等。
所述调节化合物的治疗有效量可以按照药剂师公知的程序凭经验确 定，并且将尤其取决于患者的年龄、疾病的严重度以及取决于所期望的最 终药物制剂。本发明调节剂的施与例如可以以下列方式进行：通过吸入或 栓剂或施与至粘膜组织(诸如通过灌洗至阴道、直肠、尿道、口腔或舌下组 织)、经口地、局部地、鼻内地、腹膜内地、非肠胃地、静脉内地、淋巴管 内地、瘤内地、肌内地、间质地、动脉内地、皮下地、经眼地(intraoccularly)、 滑膜内地、经上皮的和经皮地施用。在一些实施方案中，抑制剂通过灌洗、 口头或动脉内施与。其它合适的引入方法也可以包括可再填装 (rechargeable)或可生物降解的装置以及缓慢或持续释放的聚合物装置。 如上面所讨论的那样，本发明的治疗组合物可以作为与其它已知抗癌剂或 其它已知抗骨病治疗方案的联合治疗的一部分施与。
本发明还提供了在患者中调节LIV-1相关生物学活性的方法。该方法 包括给患者施与调节一种或多种LIV-1生物活性有效量的LIV-1调节剂。 在上文或下文中给出了用于测量LIV-1生物活性的合适的测试法。
本发明也提供了在有需要的患者中抑制癌细胞生长的方法，包括给患 者施与治疗有效量的一种或多种LIV-1调节剂。用于测量LIV-1相关细胞 生长的合适的测试法是本领域普通技术人员已知的并且在上文和下文中给 出。
本发明还提供了在有需要的患者中抑制癌症的方法。方法包括确定患 者是否是本文所述的LIV-1治疗的候选者，以及如果患者是LIV-1治疗的 候选者则施与治疗有效量的一种或多种LIV-1调节剂给患者。如果患者不 是LIV-1治疗的候选者，则用常规癌症疗法来治疗患者。
本发明还提供了在诊断或怀疑患有癌症的患者中抑制癌症的方法。方 法包括施与治疗有效量的一种或多种LIV-1调节剂给患者。
本发明也提供了在患者中抑制两个或多个细胞相互作用的方法，包括 施与治疗有效量的LIV-1调节剂给所述患者。用于测量LIV-1相关细胞相 互作用的合适的测试法是本领域技术人员已知的并在上文和下文中给出。
本发明也提供了在患者中调节一种或多种癌症症状的方法，包括给所 述患者施与治疗有效量的本文所描述的LIV-1组合物。
本发明还提供了在有需要的患者中抑制细胞生长的方法，包括给患者 施与治疗有效量的LIV-1调节剂。在上文和下文中给出了适合用于测量 LIV-1相关的贴壁不依赖细胞生长的测试法。
本发明也提供了在有需要的患者中抑制癌细胞迁移的方法，包括给患 者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。用于测量LIV-1相关的细胞迁移的合 适的测试法是本领域技术人员已知的。
本发明还提供了在有需要的患者中抑制癌细胞粘附的方法，包括给患 者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。用于测量LIV-1相关的细胞粘附的测 试法是本领域技术人员已知的。
本发明也提供了用于预防性治疗患者的方法，所述患者是对形成癌、 癌转移易感的患者或已患有转移病变并因此对再发或复发易感的患者。该 方法在例如具有癌症家族史或转移肿瘤家族史，或显示出癌转移的遗传倾 向性的高危个体中是特别有用的。在一些实施方案中，肿瘤是LIV-1相关 肿瘤。此外，该方法能用于预防患者LIV-1相关肿瘤的复发，所述患者患 有已通过外科切除术移除或用常规的癌症治疗方法治疗的LIV-1相关肿 瘤。
本发明也提供了抑制癌进程和/或引起癌消退的方法，所述方法包括给 患者施与治疗有效量的LIV-1调节剂。
在一些实施方案中，用本发明的LIV-1调节剂与化学疗法和/或放射疗 法联合治疗需要抗癌治疗的患者。例如，在施与LIV-1调节剂后，也可以 用治疗有效量的抗癌放射治疗患者。在一些实施方案中，提供了与LIV-1 调节剂联合的化学疗法治疗。在一些实施方案中，LIV-1调节剂与化学疗 法和放射疗法联合施与。
治疗方法包括施与单剂量或多剂量的一种或多种LIV-1调节剂给患 者。在一些实施方案中，以无菌、无热原且包含与可药用载体或稀释剂联 合的LIV-1调节剂的可注射药物组合物施与LIV-1调节剂。
在一些实施方案中，本发明的治疗方案与常规的癌症治疗方案一起使 用，所述常规的癌症治疗方案包括但不限于外科手术、放射治疗、激素消 融和/或化学治疗。本发明LIV-1调节剂的施与可发生在常规的癌症治疗之 前、同时或之后。在一些实施方案中，给患者施与两种或多种不同的LIV-1 调节剂。
在一些实施方案中，施与患者的LIV-1调节剂的量能有效地抑制癌细 胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1 信号传导、抑制LIV-1介导的细胞-细胞粘附、LIV-1介导的细胞-细胞膜 相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质相互作用、整联蛋白介导的活性、 LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解以及LIV-1表达中的一种或多种。在一 些实施方案中，施与患者的LIV-1调节剂的量能有效地通过细胞凋亡增加 癌细胞死亡。
联合治疗
在一些实施方案中，发明提供了包含两种或多种LIV-1调节剂的组合 物以提供更改良的抗癌效力。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是单克隆 抗体。可将包含两种或多种LIV-1抗体的组合物施与患有或倾向于患有癌 症的人或哺乳动物。也可将一种或多种抗体与另外一种治疗剂，诸如细胞 毒剂或癌化疗剂施与。两种或多种治疗剂的同时施与不需要在相同的时间 或通过相同的途径施与所述药剂，只要在药剂发挥它们治疗作用期间的时 间段有重叠即可。考虑在不同天或周施与的同时或顺次施与。
在一些实施方案中，本发明提供的方法考虑了施与不同抗体的联合或 “混合物(cocktails)”。此类抗体混合物具有某些优点，因为它们含有 利用不同效应物机理的抗体或使细胞毒性抗体与依赖免疫效应物功能的抗 体直接联合。此类联合的抗体可能表现出协同的治疗效果。
细胞毒剂是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞毁灭的物质。该术语 意图包括放射性同位素(例如，131I、125I、90Y和186Re)、化学治疗剂和毒素， 所述毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或合成毒素、 或其片段。非细胞毒剂是指不会抑制或阻止细胞功能和/或不引起细胞毁灭 的物质。非细胞毒剂可以包括能被活化为细胞毒剂的试剂。非细胞毒剂可 以包括珠子、脂质体、基质或颗粒(例如参见，美国专利公开2003/0028071 和2003/0032995，其在此引入作为参考)。此类试剂可以与本发明的抗体缀 合、偶联、连接或联合。
在一些实施方案中，将常规癌症药物与本发明的组合物一起施与。常 规癌症药物包括：
a)癌症化疗剂；
b)其它的药剂；
c)前体药物。
癌症化疗剂包括但不限于烷化剂，诸如卡波铂和顺氯氨铂；氮芥烷化 剂；亚硝基脲烷化剂，诸如亚硝脲氮芥(BCNU)；代谢拮抗剂，诸如氨甲蝶 呤；亚叶酸；嘌呤类似物代谢拮抗剂，巯基嘌呤；嘧啶类似物代谢拮抗剂， 诸如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨激素抗肿瘤药，诸如戈 舍瑞林、利普安和他莫昔芬；天然抗肿瘤药，诸如阿地白介素、白介素-2、 紫杉萜、依托泊苷(VP-16)、干扰素α、紫杉醇和维甲酸(ATRA)； 抗生素天然抗肿瘤药，诸如博莱霉素、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、道 诺霉素和包括丝裂霉素C的丝裂霉素；以及长春花生物碱天然抗肿瘤药， 诸如长春花碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺；羟基脲；醋葡内酯、阿霉素、 异环磷酰胺、依诺他滨、环硫雄醇、阿柔比星、环胞苷、嘧啶亚硝脲、盐 酸甲基下肼、卡巴醌、卡波铂、卡莫氟、色霉素A3、抗癌多糖、抗癌血小 板因子、环磷酰胺裂裥菌素、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、 氮烯唑胺、硫肌苷、硫替派、替加氟、多拉司他汀、多拉司他汀类似物诸 如奥瑞他汀(auristatin)、CPT-11(依立替康)、米托蒽醌、长春瑞滨、替 尼泊苷、胺-蝶呤、洋红霉素、esperamicins(例如参见，美国专利号 4,675,187)、新制癌菌素、OK-432、博莱霉素、氟铁龙、溴苷、白消安、 二磷酸己烯雌酚四钠、培洛霉素、贝他定干扰素-β、美雄 烷、二溴甘露醇、米尔法兰、层粘连蛋白肽、蘑菇多糖、云芝提取物、替 加氟/尿嘧啶、雌氮芥(雌激素/氮芥)。
可以用作癌症患者治疗的其它的药剂包括EPO、G-CSF、更昔洛伟； 抗体、利普安；哌嘧啶；齐多夫定(AZT)；白介素1至18，包括突变体和 类似物；干扰素或细胞因子，诸如干扰素α、β和γ；激素，诸如黄体生成 素释放激素(LHRH)和类似物，以及促性腺激素释放激素(GnRH)；生长因 子，诸如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长 因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细 胞生长因子类似因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子 (IGF)；肿瘤坏死因子-α和β(TNF-α和β)；侵袭抑制因子-2(IIF-2)；骨形 态发生蛋白1-7(BMP 1-7)；促生长素抑制素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超 氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗血管生成因子；抗原物质；以及前体 药物。
前体药物是指药学活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比， 其对肿瘤细胞的细胞毒性更小或没有细胞毒性，并且其能被酶激活或转换 为活性或更具活性的母体形式。例如，参见Wiknan，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical Society Transactions，14，第375-382页， 615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed Drug Delivery，Borchardt 等，(编辑)，第247-267页，Humana Press(1985)。前体药物包括但不限于含 磷酸酯的前体药物、含硫代磷酸酯的前体药物、含硫酸酯的前体药物、含 肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含b-内酰胺 的前体药物、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代的苯乙 酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它能够转换为更有效的细胞毒游离药物 的5-氟尿苷前体药物。可衍生为本文应用的前体药物形式的细胞毒药物的 示例包括但不限于上面描述的那些化学治疗剂。
临床方面
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物尤其对乳腺癌、皮肤癌、 食管癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、肺癌、膀胱癌、 卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤有用。在一些实施方案中，癌症是管腺癌、 小叶腺癌或转移性腺癌。
药物组合物
本发明也提供了包含一种或多种本文描述的LIV-1调节剂和可药用载 体的药物组合物。在一些实施方案中，将药物组合物制备为可注射的液体 溶液或悬浮液；也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮于液体载体中的 固体形式。脂质体也包括在可药用载体的定义之内。药物组合物中也可存 在药学可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫 酸盐等；以及有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。 对药学可接受赋形剂的完全的讨论可在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(1995)Alfonso Gennaro，Lippincott，Williams和 Wilkins中得到。
检测LIV-1的方法
本发明也提供了检测LIV-1的方法。在一些实施方案中，LIV-1存在 于患者或患者样本中。在一些实施方案中，方法包括将包含一种或多种 LIV-1调节剂的组合物施与患者并检测显像剂在患者中的定位。在一些实 施方案中，患者样本包含癌细胞。在一些实施方案中，将LIV-1调节剂连 接至显像剂或进行可检测地标记。在一些实施方案中，LIV-1调节剂是缀 合至显像剂的LIV-1抗体，并将其施与患者以检测一种或多种肿瘤或确定 患者对LIV-1治疗的敏感性。经标记的抗体结合至细胞上高密度的受体并 且因此聚集在肿瘤细胞上。应用标准成像技术可以检测肿瘤的位置。
本发明也提供了成像/检测表达或过量表达LIV-1的细胞或肿瘤的方 法，包括将包含LIV-1调节剂的组合物与样本接触，并检测样本中LIV-I 调节剂的存在。在一些实施方案中，样本是患者样本。在一些实施方案中， 患者样本包含癌细胞。在一些实施方案中，将LIV-1调节剂连接至显像剂 或进行可检测地标记。
本发明也提供了定量化患者、细胞或样本中存在的LIV-1量的方法。 该方法包括将一种或多种抗体、探针、或小分子施与患者或样本，并检测 样本中存在的LIV-1量。在一些实施方案中，将抗体、探针、或小分子连 接至显像剂或进行可检测地标记。此类信息表明，例如，肿瘤是否与LIV-1 相关以及因此是否需要应用或避免特定治疗。在一些实施方案中，应用本 领域公知的标准技术，获得被认为包含肿瘤细胞的样本并与经标记的抗体、 探针、寡核苷酸和小分子接触。在移除任何未结合的经标记的抗体、探针、 寡核苷酸和小分子后，确定结合至细胞的经标记的抗体、肽、寡核苷酸或 模拟物的量、或确定因为未结合而被移除的抗体、肽、寡核苷酸或模拟物 的量。该信息直接涉及LIV-1的存在量。
成像可以应用本领域技术人员公知的方法完成。成像例如可以通过放 射性闪烁显像、核磁共振成像(MRI)或计算机断层扫描(CT扫描)等完成。 最常用的用于显像剂的放射性标记包括放射性碘和铟。通过CT扫描成像 可以利用重金属诸如铁螯合物。MRI扫描可以利用钆或锰的螯合物。此外， 正电子放射层扫描术(PET)可能应用氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射器。 成像也可以应用锌敏感染料以监测体内Liv-1活性来完成。此类方法是本 领域技术人员已知的。A.Takeda等，Cancer Research 61，5065-5069，，2001 年7月1日；和C.Frederickson，Sci STKE.2003年5月13日；2003(182) 讨论了此类方法的实例，其每一个均在此全文引入作为参考。
在一些实施方案中，LIV-1调节剂是LIV-1抗体。在一些实施方案中， 将调节剂连接至显像剂或进行可检测地标记。在一些实施方案中，显像剂 是18F、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、77Br、87MSr、86Y、90Y、99MTc、 111In、123I、125I、127Cs、129Cs、131I、132I、197Hg、203Pb或206Bi。
检测的方法是本领域普通技术人员公知的。例如，检测多核苷酸的方 法包括但不限于PCR、RNA印迹法、DNA印迹法、RNA保护和DNA杂 交(包括原位杂交)。检测多肽的方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、 酶活性测试法、狭线印迹法、肽质量指纹法、电泳、免疫化学和免疫组织 化学。检测方法的其它示例包括但不限于放射免疫测试法(RIA)、化学发光 免疫测试法、荧光免疫测试法、时间分辨荧光免疫测试法(TR-FIA)、双 色荧光显微镜法、或免疫色谱法(ICA)，全部都是本领域技术人员公知的。 在一些本发明优选的实施方案中，应用PCR方法检测多核苷酸的表达以及 应用ELISA技术检测多肽产物。
将细胞毒剂或诊断剂递送至细胞的方法
本发明也提供了将细胞毒剂或诊断剂递送至一个或多个表达LIV-1的 细胞中的方法。在一些实施方案中，方法包括将缀合至细胞毒剂或诊断剂 的本发明的LIV-1调节剂与细胞接触。
确定癌症患者预后的方法
本发明也提供了确定患有LIV-1相关癌症的患者预后的方法。该方法 包括确定患者样本中LIV-1-δ对LIV-1的比值。尽管不希望被理论所束缚， 发明人已发现相对于LIV-1的更高水平的LIV-1-δ与侵袭性更小的癌症和/ 或更容易治疗的癌症相关。因此，在一些实施方案中，相对于LIV-1的高 水平LIV-1-δ是具有延长生存和/或用本发明的LIV-1调节剂和/或常规癌 症药物成功治疗的良好预后的患者的指标。在一些实施方案中，良好的预 后通过至少2∶1、至少3∶1、至少4∶1或至少5∶1的LIV-1-δ∶LIV-1比值来 指示。在一些实施方案中，通过测量mRNA或蛋白水平确定LIV-1-δ∶LIV-1 的比值。
在一些实施方案中，确定患有LIV-1相关癌症患者的预后的方法包 括检测患者样本中结合至细胞质膜的LIV-1。在一些实施方案中，在患者 样本中结合至细胞质膜的LIV-1的检出不是延长生存和/用本发明的LIV-1 调节剂和/或常规癌症药物成功治疗的良好预后的指标。
在一些实施方案中，LIV-1由具有SEQ ID NO：1序列的核酸编码。在 一些实施方案中，LIV-1具有SEQ ID NO：2的序列。在一些实施方案中， LIV-1-δ具有SEQ ID NO：365的序列。
确定对LIV-1治疗敏感性的方法
本发明也提供了确定患者对LIV-1治疗敏感性的方法。该方法包括检 测患者或患者样本中LIV-1差异表达证据的存在或不存在。在患者或样本 中LIV-1差异表达证据的存在是对LIV-1治疗敏感的患者的指标。在一些 实施方案中，在患者或患者样本中LIV-1差异表达证据的不存在表明患者 不是LIV-1治疗的候选者。
在一些实施方案中，治疗方法包括首先鉴定对LIV-1治疗敏感的患者， 包括给有需要的患者施与包含连接至显影剂的LIV-1调节剂的组合物，并 检测患者中基因或基因产物证据的存在或不存在。在一些实施方案中，治 疗方法还包括如果患者是LIV-1治疗的候选者则施与一种或多种LIV-1调 节剂给患者，以及如果患者不是LIV-1治疗的候选者则用常规癌症疗法治 疗患者。
在一些治疗方法中，当患者被确认为患有癌症或对癌症易感，则给患 者单独施与或与其它抗癌药物联合施与一种或多种LIV-1调节剂。
评估癌症进展的方法
本发明还提供了在患者中评估癌症进展的方法，包括将第一时间点的 生物样本中LIV-1表达产物的水平与第二时间点的相同表达产物水平相比 较。第二时间点相对于第一时间点的表达产物水平的改变是癌症进展的指 标。
筛选方法
本发明也提供了筛选抗癌剂的方法。该方法包括将表达LIV-1的细胞 与候选化合物接触，并确定LIV-1相关生物活性是否受到调节。在一些实 施方案中，癌细胞生长、整联蛋白介导的活性、肿瘤形成、癌细胞增殖、 癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1介导的细胞- 细胞粘附、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外 基质相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解以及LIV-1表达中一种 或多种的抑制是抗癌剂的指标。
本发明还提供了鉴定癌抑制剂的方法。该方法包括将表达LIV-1的细 胞与候选化合物和LIV-1配体接触，并确定LIV-1相关生物活性是否受到 调节。在一些实施方案中，癌细胞生长、整联蛋白介导的活性、肿瘤形成、 癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管生成、LIV-1信号传导、LIV-1 介导的细胞-细胞粘附、LIV-1介导的细胞-细胞膜相互作用、LIV-1介导的 细胞-细胞外基质相互作用、LIV-1介导的细胞-细胞外基质降解以及LIV-1 表达中一种或多种的抑制是癌抑制剂的指标。在一些实施方案中，施与患 者的LIV-1调节剂的量对增加癌细胞凋亡有效。
在一些实施方案中，本发明提供了筛选抗癌剂、尤其是抗转移癌药剂 的方法，例如通过针对调节下游标志物的活性或水平的能力筛选假定的调 节剂。在一些实施方案中，将降低细胞周期蛋白D1水平、减少MT1-MMP 水平或减少细胞质锌水平的候选试剂确定为抗癌剂。
纯化LIV-1的方法
在一些实施方案中，本发明提供了从包含LIV-1的样本中纯化LIV-1 蛋白的方法。该方法包括提供包含结合至固体支持物上的本发明LIV-1抗 体的亲和基质，将样本与亲和基质接触以形成亲和基质-LIV-1蛋白复合体， 从样本的剩余物中分离亲和基质-LIV-1蛋白复合体，并从亲和基质上释放 LIV-1蛋白。
试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供了用于成像和/或检测与LIV-1过量表 达相关的基因或基因产物的试剂盒。本发明的试剂盒包含可检测的抗体、 小分子、寡核苷酸、诱饵、模拟物或探针以及完成本发明方法的说明书。 任选地，试剂盒也可以含有以下的一个或多个以下组分：对照(阳性和/或 阴性)、对照的容器、阳性和/或阴性结果代表实例的照片或描绘。
本文描述的每一个专利、专利申请、登录号和出版物均在此全文引入 作为参考。
除了本文描述之外的本发明的各种修改鉴于前面的描述对于本领域技 术人员是显而易见的。意图使此类修改也落入附录实施方案的范围内。本 发明将在以下实施例中进一步说明，所述实施例的目的是举例说明而不是 试图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：免疫沉淀法
制备含有50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1％TritonX-100 和每10ml总体积1个蛋白酶抑制剂片剂(Roche Diagnostic Corp.， Indianapolis，IN)的免疫沉淀(IP)缓冲液。合并用IP缓冲液以1∶100稀释 的机构内部(in-house)产生的抗LIV-1兔多克隆抗体(Ab)，并添加至有 螺旋盖的管中的细胞裂解产物中，允许其在摇动平台上在4℃混合1-2小 时。为进行免疫沉淀，将40μl抗兔IgG缀合珠或120μl链亲和素珠添加 至每一管并继续在摇动平台上在4℃孵育过夜。随后，将管以7000xg在 4℃离心2分钟，并移除上清液。用冷的洗涤缓冲液洗涤珠子沉淀4次， 然后往每一管加入30μl含有还原剂的2X SDS Tris/甘氨酸样本缓冲液。然 后将样本缓冲液中的珠子在95℃煮两次，每次5分钟，以从珠子中释放 免疫沉淀物。然后将煮过的珠子溶液在室温下以14,000xg离心5分钟， 将上清液移出并转移至新管中。立即通过在SDS-PAGE凝胶上电泳分析免 疫沉淀物或将其储存在-20℃。应用标准方法进行蛋白质印迹分析。将经电 泳的免疫沉淀物从聚丙烯酰胺凝胶中转移至膜上，并然后于室温在温和摇 动中应用第二LIV-1抗体(1∶1000)探测膜1小时。用含有0.05％吐温20 的PBS(PBST)洗涤数次后，加入缀合至辣根过氧物酶(HRP)的合适的物种 特异性二抗，并于室温在摇动平台上孵育30分钟。数次洗涤后，然后用 ECL检测系统(Amersham Biosciences UK)显现膜上的反应条带。
实施例2：FACS分析
将非透化的细胞用于分析。制备含有(冷)PBS、1％牛血清白蛋白 (BSA)、2％胎牛血清(FBS)和0.1％叠氮化钠的FACS缓冲液。通过用离解 缓冲液(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)使贴壁细胞不贴壁而收集细胞。为 中和离解缓冲液，加入等体积的生长培养基。然后将细胞分装至5ml聚苯 乙烯圆底管中。对每一个染色，将一百万个细胞在4℃以1000转/分钟 离心5分钟，并然后往细胞沉淀中加入第一抗体(100μL FACS缓冲液中达 6μg)，通过涡旋混合并在冰上孵育30分钟至1小时。然后通过在4℃以 1000转/分钟离心5分钟沉淀后，用3ml FACS缓冲液洗涤细胞两次。在 第二次洗涤和离心后，往细胞沉淀中加入第二抗体(50μL FACS缓冲液中 1μg)，通过涡旋混合并在冰上在黑暗中孵育30分钟。通过在4℃以1000 转/分钟离心5分钟沉淀细胞后，用3ml FACS缓冲液洗涤细胞两次。在 第二次洗涤和离心后，将细胞以500μg悬浮于50μL含有碘化丙锭(PI)的 FACS缓冲液中。(将PI制备为1μg/μL的储存液并以1∶100使用)。在一 小时内实施FACS/流式细胞术分析。
实施例3：LIV-1寡核苷酸抑制软琼脂生长
用对LIV-1的寡核苷酸(SEQ ID NO：369和370)处理MDA231、 MCF-7、ZR75-1和T47D1细胞。将细胞平板接种于0.35％软琼脂中并在 培养7天后用Alamar Blue定量生长。
通过在软琼脂中的集落形成测量LIV-1基因表达对T47D1细胞的贴 壁不依赖性细胞生长的影响。通过首先用聚HEMA包被非组织培养处理 的平板以阻止细胞贴附至平板来进行软琼脂分析。用胰蛋白酶收集非转染 的细胞并用培养基洗涤两次。用血细胞计数器计数细胞并在培养基中重悬 细胞至每ml 104个细胞。将50μl等分试样置于聚HEMA包被的96孔板中， 并转染。对于每一个转染混合物，将载体分子(优选脂-拟肽缀合物(lipitoid) 或拟胆固醇(cholesteroid))制备为在水中的0.5nM工作浓度，超声处理 以产生均匀的溶液并通过0.45μm PVDF膜过滤。然后将反义或对照寡核 苷酸在无菌Millipore水中制备成100μM的工作浓度。将寡核苷酸在微离 心管中的OptiMEMTM(Gibco/BRL)中进一步稀释至2μM，或每ml OptiMEMTM约20μg寡核苷酸。在另一个微离心管中，将脂-拟肽缀合物 或拟胆固醇稀释至与稀释寡核苷酸所用的相同体积的OptiMEMTM中，一 般地以每μg反义寡核苷酸约1.5-2nmol脂-拟肽缀合物的量进行。将经稀 释的反义寡核苷酸立即添加至经稀释的脂-拟肽缀合物，并通过上下移液混 合。将寡核苷酸添加至细胞至约300nM的终浓度。在37℃转染约30分 钟后，通过上下移液将3％GTG琼脂糖加至细胞中，达到0.35％琼脂糖的 终浓度。在细胞层琼脂凝固后，将100μl培养基滴在每一个孔的上面。在 约7天中形成集落。为了读出生长，往每一孔中加入20μl Alamar Blue并 将平板振动约15分钟。在孵育6-24小时后，进行荧光读数(530nm激发 /590nm发射)。
应用LIV-1调节剂对癌细胞系集落形成的抑制表明LIV-1在转移表型 的产生和/或维持中是重要的。
实施例4：基因表达的调节
应用寡核苷酸分析了由癌性细胞中多核苷酸所示的差异表达基因的表 达，以确定LIV-1在肿瘤发生，例如在促进转移表型中的作用和功能。
产生LIV-1寡核苷酸并测试它们抑制LIV-1表达的能力。一旦合成并 定量后，则在一组细胞系中针对转录敲低的效率筛选寡核苷酸。通过应用 GeneAmp定量分析mRNA水平来确定敲除效率。
通过转染至T47D1、T47D-T1、MCF7、ZR-75-1、MDA231、184B5 或HMEC细胞中测试每一个寡核苷酸抑制基因表达的能力。
对于每一个转染混合物，将载体分子(诸如脂类，脂类衍生物、脂类样 分子、胆固醇、胆固醇衍生物或胆固醇样分子)在水中制备为0.5mM的工 作浓度，超声处理以产生均匀溶液并通过0.45μm PVDF膜过滤。然后将 反义和siRNA寡核苷酸在无菌Millipore水中制备成约100μM的工作浓 度。将寡核苷酸在微离心管中在OptiMEMTM(Gibco/BRL)中进一步稀释至 2μM，或每ml OptiMEMTM约20μg寡核苷酸。在另一个微离心管中，将 载体分子稀释至与稀释寡核苷酸所用的相同体积的OptiMEMTM中，一般 以每μg反义寡核苷酸约1.5-2nmol载体进行。将经稀释的反义寡核苷酸 立即添加至经稀释的载体中，并通过上下移液混合。将siRNAs添加至细 胞至约67nM的终浓度。
应用ABI GeneAmp 7000TM实时PCR仪在细胞系中定量经转染细胞 中与感兴趣的靶标基因相对应的靶标mRNA的水平。将靶标mRNA值对 内对照进行标准化。对于每一20μl反应，将提取的RNA(通常总共0.2-1μg) 置于灭菌的0.5或1.5ml微离心管中，添加水达到12.5μl的总体积。往每 一管添加7.5μl缓冲液/酶混合物，所述缓冲液/酶混合物通过(以所列顺序) 混合2.5μl H2O、2.0μl 10×反应缓冲液、10μl寡聚dT(20pmol)、1.0μl dNTP混合物(每一种10mM)、0.5μl RN(20u)(Ambion，Inc.， Hialeah，FL)和0.5μl MMLV逆转录酶(50u)(Ambion，Inc.)而制备。通过上 下移液混合内容物，将反应混合物在42℃孵育1小时。在扩增之前离心 每一管的内容物。
应用ABI sybr master mix加上0.175pmol每一种寡核苷酸制备扩增 混合物。Green(Molecular Probes，Eugene，OR)是当其结合至双链 DNA时发荧光的染料。由于在扩增过程中会产生双链PCR产物，来自 Green的荧光增加。往每20μl扩增混合物的等分试样中加入2μl 模板RT，并按照标准方案进行扩增。以相应基因的表达相对于没有转染 的细胞、只转染了载体的细胞(假转染)或用反向对照寡核苷酸转染的细胞 降低的百分比来表达结果。
尽管LIV-1寡核苷酸在所有测试细胞系中均抑制Liv-1表达，LIV-1 寡核苷酸只在致瘤系中具有功能后果。在非致癌系中没有观察到LIV-1寡 核苷酸的功能后果，表明癌细胞和“正常”细胞对Liv1活性具有不同的依 赖性。
实施例5：表达对增殖的影响
在数个细胞系中应用siRNA方法评估了基因表达对细胞增殖抑制的影 响，所述细胞系包括T47D1、T47D-T1、MCF7、ZR-75-1、184B5、MDA231 和HMEC细胞。
将细胞以数天后会达到约80-95％融合的密度接种在96-孔皿上。将寡 核苷酸(反义或siRNA)在OptiMEMTM中稀释至2μM。然后将寡核苷酸 -OptiMEMTM加入到递送载体，对所述载体进行选择使得对于在测试中待 使用的特定细胞类型是最优化的。然后将寡核苷酸/递送载体混合物进一步 稀释至在细胞上的有血清的培养液中。反义寡核苷酸的终浓度是约300nM 以及siRNA寡核苷酸的终浓度是67-100nM。
如上面描述的那样制备寡核苷酸。将细胞在37℃转染约4小时至过 夜，然后用新鲜培养基更换转染混合物。如上面描述的那样进行转染。
LIV-1寡核苷酸抑制癌细胞增殖但不抑制HMEC(原代乳腺上皮细胞) 或184B5(非致瘤性乳腺上皮细胞系)细胞的增殖，表明LIV-1在癌细胞癌 性表型的产生和/或维持中起着重要作用。
实施例6：生存测试
为评估靶信息的缺失对细胞死亡的影响，转染T47D-T1、MCF7、 Zr-75-1和MDA-MB231细胞用于细胞毒性测试。通过测量由于膜损伤释 放至培养基中的LDH酶量来监测细胞毒性。应用来自Roche Molecular Biochemicals的细胞毒性检测试剂盒来检测LDH活性。数据以释放至培养 基中的LDH对在相同时间点和处理中在孔中存在的总LDH的比值 (rLDH/tLDH)提供。测试包括了应用针对BCL2(已知的抗凋亡基因)的反义 和反向对照寡核苷酸的阳性对照；与用对照寡核苷酸的处理相比(由于转染 的背景细胞毒性)，BCL2信号的丧失导致了细胞死亡的增加。
实施例7：胱天蛋白酶/M30方法
对来自用siRNA处理的细胞的裂解产物应用蛋白质印迹分析评估胱天 蛋白酶原(procaspase)和M30。在处理后的不同时间点，裂解细胞(贴壁 或分离的细胞，将后者离心下来)并应用针对胱天蛋白酶原和M30的抗体 进行蛋白质印迹分析。胱天蛋白酶原的消失与胱天蛋白酶活化相对应。M30 表位的出现是细胞角蛋白18的胱天蛋白酶切割的反映。所使用的抗体是 Axxora/Alexis M30(CytoDeath：CAT#ALX-804-590)和胱天蛋白酶原Ab (R&D Systems，货号：MAB707)。
实施例8：细胞周期蛋白D1方法
用siRNA转染细胞以敲低Liv1或用Liv-1特异的抗体处理细胞。对于 转染的细胞，在转染48小时后收集细胞裂解产物。对于Ab处理，在处理 6小时后收集细胞裂解产物。应用抗细胞周期蛋白D1 Ab：周期蛋白D1 Abeam Cat#-ab24249对裂解产物进行蛋白质印迹分析。所使用的siRNAs 是SEQ ID NO：369和370。测试的LIV-1抗体是针对N端和TM2-3ECD 的机构内部产生的抗体。针对TM2-3ECD的抗体似乎显示出最大的效力。
实施例9：锌水平
在实施例G之前24、48或72小时用siRNA处理细胞或在实施例10 之前30分钟用抗体处理细胞。所使用的siRNAs是SEQ ID NO：369和370。 测试的LIV-1抗体是针对N端和TM2-3ECD的机构内部产生的抗体。针 对TM2-3ECD的抗体似乎显示出最大的效力。
实施例10：锌转运测试法
应用通透细胞的锌选择性荧光指示剂Newport Green测试锌转运。在 通过细胞内酯酶切割后，Newport Green结合至游离的锌离子并作为细胞 内游离锌含量的荧光指示剂。
如下制备在Krebs-Ringer-HEPES Buffer(KRH)缓冲液(120mM NaCl、25mM HEPES、pH 7.5、4.8mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2)中的10μM Newport Green PDX染料(渗透酯形式， Cat#N24191，Invitrogen-Molecular ProbesTM)和0.02％Pluronic F-127(在 DMSO中20％Pluronic F-127；Cat#P3000，Invitrogen-Molecular ProbesTM)的工作溶液。将Newport Green以50μg等分试样于干燥下储存 于-20℃、避光并在使用之前融化。通过将50μg Newport Green在16.8μl 无水二甲亚砜(DMSO)(Cat#276855-100mL，Sigma-Aldrich)中重构制得 Newport Green染料的2.5mM储存溶液。通过将等体积(16.8μL)的分散剂 Pluronic F-127添加至2.5mM储存溶液并然后将全部体积的染料稀释至 8.366mL KRH缓冲液中制备Newport Green染料的10μM工作溶液。
将贴壁细胞用没有Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次， 并用没有酶的、基于Hanks的离解缓冲液(Invitrogen，Cat#13150-016)收 集。将PBS和解离缓冲液在使用前平衡至37℃。然后通过添加等体积的 生长培养基中和细胞悬浮液的pH。通过在1000转/分钟离心5分钟收集 细胞，将得到的细胞沉淀以1×106个细胞/mL的浓度重悬于PBS。为了 进行分析，将1.5×106个细胞分装至5ml聚苯乙烯圆底FACS管(Becton Dickinson，Cat#352054)中。通过离心再次沉淀细胞并移除PBS。
将细胞通过涡旋重悬浮于0.5mL 10μM Newport Green染料溶液中； 盖上FACS管并在30℃水浴中孵育45分钟。将1mL没有染料的KRH缓 冲液加入到细胞悬浮液中，并通过在1000转/分钟离心5分钟沉淀细胞。 吸出上清液，在1mL没有染料的KRH缓冲液中再次洗涤细胞，将细胞沉 淀重悬浮于0.5mL没有染料的KRH缓冲液中并在30℃水浴中孵育30分 钟。将1mL没有染料的KRH缓冲液加入到细胞悬浮液中，并通过在1000 转/分钟离心5分钟沉淀细胞。吸出上清液，在1mL没有染料的KRH缓 冲液中再次洗涤细胞，将细胞沉淀通过涡旋重悬浮于2.0mL没有染料的 KRH缓冲液中。
通过FACS(FACSCalibur)(BD Biosciences)监测细胞内荧光。实时收 集细胞，并根据时间绘制Newport Green染料荧光(FITC设置)图(收集设 置在10分钟收集200万个细胞)。在建立了1.5至2分钟收集范围内的荧光 基线后，将100mM氯化锌(Cat#Z0152-100G，Sigma-Aldrich，溶解于29 mM HCl)添加至细胞达到1-100μM的终浓度。立即将细胞管送回FACS 机器，通过荧光的瞬时增加显示锌摄入。将FACS数据输出至Flowjo软件 (Tree Star Inc，Ashland，Oregon)并应用动力学平台(Kinetics Platform)分 析。用移动平均平滑选择来展示数据的中位数，以及在布图编辑器(Layout Editor)中产生图示覆盖图。
实施例11：LIV-1表位
可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种鉴定用于抗体识别和制 备的LIV-1线性表位。一些示例方法包括探测衍生自抗原氨基酸序列的肽 的抗体结合能力。可以通过应用BIACORE或ELISA方法评估结合。其 它技术包括将在平面固体支持物(“芯片”)上的肽文库暴露给抗体，并通 过在固相筛选中所应用的多种方法中的任何一种检测结合。此外，可以应 用噬菌体展示来筛选肽文库，经过数轮生物筛选后选择表位。
以下表1提供了已鉴定为适合于被抗LIV1抗体识别的线性表位的 LIV-1(SEQ ID NO：2)区域。
实施例12：免疫组织化学
应用商业可获得的石蜡包埋的人类组织微阵列通过免疫组织化学方法 评估LIV-1的表达。(Zymed Laboratories Inc，San Francisco CA；Cybrdi， Gaithersburg，MD；Clinomics Biosciences Inc，Cambridge UK)。应用原初 293T细胞和经LIV-1转染的293T细胞作为验证表达的对照。
在Ventana Discovery上应用标准细胞条件完成组织切片去石蜡化和 抗原恢复，随后在第一抗体中孵育60分钟。以10ug/ml应用兔抗人LIV-1 抗体(Chiron，Emeryville，CA)和兔IgG取血前对照(Chiron，Emeryville， CA)。将Ventana普遍第二试剂(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，Az) 和随后的Ventana DAB Map试剂盒(Ventana Medical Systems Inc.)用于 检测。使用Ventana苏木精和上蓝试剂(Ventana Medical Systems，Inc)用 于复染，并在分级醇中使切片脱水，在二甲苯中清洁并应用合成的固封介 质盖上盖玻片。
实施例13：癌对正常组织；Spotfire分析
也将微阵列数据用于确定多种癌性肿瘤类型和多种来自正常样本的组 织中LIV-1、SLC39A10、SLC39A11和SLC39A13的表达。应用DecisionSite 软件(Spotfire，Somerville，MA)和机构内部开发的Pipeline Pilot(SciTegic， San Diego，CA，机构内部的开发人Josef Ringgenberg)方案产生显示于图 12-15的图解描述。结果显示每一种目的肿瘤细胞抗原在许多癌类型中表达 升高，而在很多正常组织类型中有较低水平的表达。
实施例14：序列
LIV-1核苷酸序列；SEQ ID NO：1：
CTCGTGCCGAATTCGGCACGAGACCGCGTGTTCGCGCCTGGTAGAGATTTCTCGAAGACACCAGTGGGCCCGTGT
GGAACCAAACCTGCGCGCGTGGCCGGGCCGTGGGACAACGAGGCCGCGGAGACGAAGGCGCAATGGCGAGGAAGT
TATCTGTAATCTTGATCCTGACCTTTGCCCTCTCTGTCACAAATCCCCTTCATGAACTAAAAGCAGCTGCTTTCC
CCCAGACCACTGAGAAAATTAGTCCGAATTGGGAATCTGGCATTAATGTTGACTTGGCAATTTCCACACGGCAAT
ATCATCTACAACAGCTTTTCTACCGCTATGGAGAAAATAATTCTTTGTCAGTTGAAGGGTTCAGAAAATTACTTC
AAAATATAGGCATAGATAAGATTAAAAGAATCCATATACACCATGACCACGACCATCACTCAGACCACGAGCATC
ACTCAGACCATGAGCGTCACTCAGACCATGAGCATCACTCAGACCACGAGCATCACTCTGACCATGATCATCACT
CTCACCATAATCATGCTGCTTCTGGTAAAAATAAGCGAAAAGCTCTTTGCCCAGACCATGACTCAGATAGTTCAG
GTAAAGATCCTAGAAACAGCCAGGGGAAAGGAGCTCACCGACCAGAACATGCCAGTGGTAGAAGGAATGTCAAGG
ACAGTGTTAGTGCTAGTGAAGTGACCTCAACTGTGTACAACACTGTCTCTGAAGGAACTCACTTTCTAGAGACAA
TAGAGACTCCAAGACCTGGAAAACTCTTCCCCAAAGATGTAAGCAGCTCCACTCCACCCAGTGTCACATCAAAGA
GCCGGGTGAGCCGGCTGGCTGGTAGGAAAACAAATGAATCTGTGAGTGAGCCCCGAAAAGGCTTTATGTATTCCA
GAAACACAAATGAAAATCCTCAGGAGTGTTTCAATGCATCAAAGCTACTGACATCTCATGGCATGGGCATCCAGG
TTCCGCTGAATGCAACAGAGTTCAACTATCTCTGTCCAGCCATCATCAACCAAATTGATGCTAGATCTTGTCTGA
TTCATACAAGTGAAAAGAAGGCTGAAATCCCTCCAAAGACCTATTCATTACAAATAGCCTGGGTTGGTGGTTTTA
TAGCCATTTCCATCATCAGTTTCCTGTCTCTGCTGGGGGTTATCTTAGTGCCTCTCATGAATCGGGTGTTTTTCA
AATTTCTCCTGAGTTTCCTTGTGGCACTGGCCGTTGGGACTTTGAGTGGTGATGCTTTTTTACACCTTCTTCCAC
ATTCTCATGCAAGTCACCACCATAGTCATAGCCATGAAGAACCAGCAATGGAAATGAAAAGAGGACCACTTTTCA
GTCATCTGTCTTCTCAAAACATAGAAGAAAGTGCCTATTTTGATTCCACGTGGAAGGGTCTAACAGCTCTAGGAG
GCCTGTATTTCATGTTTCTTGTTGAACATGTCCTCACATTGATCAAACAATTTAAAGATAAGAAGAAAAAGAATC
AGAAGAAACCTGAAAATGATGATGATGTGGAGATTAAGAAGCAGTTGTCCAAGTATGAATCTCAACTTTCAACAA
ATGAGGAGAAAGTAGATACAGATGATCGAACTGAAGGCTATTTACGAGCAGACTCACAAGAGCCCTCCCACTTTG
ATTCTCAGCAGCCTGCAGTCTTGGAAGAAGAAGAGGTCATGATAGCTCATGCTCATCCACAGGAAGTCTACAATG
AATATGTACCCAGAGGGTGCAAGAATAAATGCCATTCACATTTCCACGATACACTCGGCCAGTCAGACGATCTCA
TTCACCACCATCATGACTACCATCATATTCTCCATCATCACCACCACCAAAACCACCATCCTCACAGTCACAGCC
AGCGCTACTCTCGGGAGGAGCTGAAAGATGCCGGCGTCGCCACTTTGGCCTGGATGGTGATAATGGGTGATGGCC
TGCACAATTTCAGCGATGGCCTAGCAATTGGTGCTGCTTTTACTGAAGGCTTATCAAGTGGTTTAAGTACTTCTG
TTGCTGTGTTCTGTCATGAGTTGCCTCATGAATTAGGTGACTTTGCTGTTCTACTAAAGGCTGGCATGACCGTTA
AGCAGGCTGTCCTTTATAATGCATTGTCAGCCATGCTGGCGTATCTTGGAATGGCAACAGGAATTTTCATTGGTC
ATTATGCTGAAAATGTTTCTATGTGGATATTTGCACTTACTGCTGGCTTATTCATGTATGTTGCTCTGGTTGATA
TGGTACCTGAAATGCTGCACAATGATGCTAGTGACCATGGATGTAGCCGCTGGGGGTATTTCTTTTTACAGAATG
CTGGGATGCTTTTGGGTTTTGGAATTATGTTACTTATTTCCATATTTGAACATAAAATCGTGTTTCGTATAAATT
TCTAGTTAAGGTTTAAATGCTAGAGTAGCTTAAAAAGTTGTCATAGTTTCAGTAGGTCATAGGGAGATGAGTTTG
TATGCTGTACTATGCAGCGTTTAAAGTTAGTGGGTTTTGTGATTTTTGTATTGAATATTGCTGTCTGTTACAAAG
TCAGTTAAAGGTACGTTTTAATATTTAAGTTATTCTATCTTGGAGATAAAATCTGTATGTGCAATTCACCGGTAT
TACCAGTTTATTATGTAAACAAGAGATTTGGCATGACATGTTCTGTATGTTTCAGGGAAAAATGTCTTTAATGCT
TTTTCAAGAACTAACACAGTTATTCCTATACTGGATTTTAGGTCTCTGAAGAACTGCTGGTG
LIV-1氨基酸序列；SEQ ID NO：2：
MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAISTRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGF
RKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHDHHSHHNHAASGKNKRKALCPDHD
SDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTSTVYNTVSEGTHFLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPS
VTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGFMYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDA
RSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFL
HLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDK
KKKNQKKPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQ
EVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVI
MGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAVLYNALSAMLAYLGMATG
IFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVPEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIV
FRINF
在本发明的一些实施方案中，LIV-1调节剂包含或涉及LIV-1多肽的 抗原性区域。LIV-1的抗原性区域包括但不限于以下的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5：
HHDHDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHNHAASGKNKRKALCPDHDSDS(SEQ ID NO：3)
KGAHRPEHASGRRNVKDSVSASE(SEQ ID NO：4)
HLLPHSHASHHHSHSHEEPA(SEQ ID NO：5)
在本发明的一些实施方案中，LIV-1调节剂包含和/或特异性地结合至 SEq ID NO：2的一个或多个序列。在一些实施方案中，LIV-1调节剂特异 性地结合至一个或多个具有选自以下SEq ID NO：361-SEQ ID NO：364或 SEQ ID NO：387-SEQ ID NO：391序列的LIV-1表位：
HSHSHEEPAMEMKRGPLFSH；SEQ ID NO：361
CFNASKLLSHGM；SEQ ID NO：362
GMGIQVPLNATEFNYL；SEQ ID NO：363
SVSASEVTSTVYNTVSEGT；SEQ ID NO：364
LHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAISTRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHD
HDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHNHAASGKNKRKALCPDHDSDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRR
NVKDSVSASEVTSTVYNTVSEGTHFLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPSVTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGF
MYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWV
GGFI；SEQ ID NO：387；N端
HLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDST；SEQ ID NO：388；TM 2/3
TEGLSS；SEQ ID NO：389；TM 4/5
HYAENVSM；SEQ ID NO：390；TM 6/7
VFRINF；SEQ ID NO：391；C端
在一些实施方案中，本发明的LIV-1调节剂具有下面的序列：
CHIR296-4SI；AAAGGCTGGCATGACCGTTAA(SEQ ID NO：367)
CHIR296-3SI；GACAGTGTTAGTGCTAGTGAA(SEQ ID NO：368)
CHIR296-2SI；CTAGTTAAGGTTTAAATGCTA(SEQ ID NO：369)
CHIR296-1SI；AAGGCTTATCAAGTGGTTTAA(SEQ ID NO：370)
CHIR296-7RC；GCAACCCTGAAACTCACCACTACGA(SEQ ID NO：371)
CHIR296-5RC；TACCGTACCCGTAGGTCCAAGGCG(SEQ ID NO：372)
CHIR296-2RC；TGTGGTACTGGTGCTGGTAGTGAGT(SEQ ID NO：373)
CHIR296-9；TGGTGAATGAGATCGTCTGACTGGC(SEQ ID NO：374)
CHIR296-8；AGGGCTCTTGTGAGTCTGCTCGTAA(SEQ ID NO：375)
CHIR296-7；AGCATCACCACTCAAAGTCCCAACG(SEQ ID NO：376)
CHIR296-6；GCCAGTGCCACAAGGAAACTCAGG(SEQ ID NO：377)
CHIR296-5；GCGGAACCTGGATGCCCATGCCAT(SEQ ID NO：378)
CHIR296-4；ACTGGCATGTTCTGGTCGGTGAGC(SEQ ID NO：379)
CHIR296-3；ATGCTCATGGTCTGAGTGACGCTCA(SEQ ID NO：380)
CHIR296-2；TGAGTGATGGTCGTGGTCATGGTGT(SEQ ID NO：381)
CHIR296-1；GAGAGGGCAAAGGTCAGGATCAAGA(SEQ ID NO：382).
SLC39A10；SEQ ID NO.383；NP_065075.1
MKVHMHTKFCLICLLTFIFHHCNHCHEEHDHGPEALHRQHRGMTELEPSKFSKQAAENEKKYY
IEKLFERYGENGRLSFFGLEKLLTNLGLGERKVVEINHEDLGHDHVSHLDILAVQEGKHFHSH
NHQHSHNHLNSENQTVTSVSTKRNHKCDPEKETVEVSVKSDDKHMHDHNHRLRHHHRLHHHLD
HNNTHHFHNDSITPSERGEPSNEPSTETNKTQEQSDVKLPKGKRKKKGRKSNENSEVITPGFP
PNHDQGEQYEHNRVHKPDRVHNPGHSHVHLPERNGHDPGRGHQDLDPDNEGELRHTRKREAPH
VKNNAIISLRKDLNEDDHHHECLNVTQLLKYYGHGANSPISTDLFTYLCPALLYQIDSRLCIE
HFDKLLVEDINKDKNLVPEDEANIGASAWICGIISITVISLLSLLGVILVPIINQGCFKFLLT
FLVALAVGTMSGDALLHLLPHSQGGHDHSHQHAHGHGHSHGHESNKFLEEYDAVLKGLVALGG
IYLLFIIEHCIRMFKHYKQQRGKQKWFMKQNTEESTIGRKLSDHKLNNTPDSDWLQLKPLAGT
DDSVVSEDRLNETELTDLEGQQESPPKNYLCIEEEKIIDHSHSDGLHTIHEHDLHAAAHNHHG
ENKTVLRKHNHQWHHKHSHHSHGPCHSGSDLKETGIANIAWMVIMGDGIHNFSDGLAIGAAFS
AGLTGGISTSIAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAIVYNLLSAMMAYIGMLIGTAVGQYA
NNITLWIFAVTAGMFLYVALVDMLPEMLHGDGDNEEHGFCPVGQFILQNLGLLFGFAIMLVIA
LYEDKIVFDIQF
SLC39A11；SEQ ID NO：384；NP_631916
MLQGHSSVFQALLGTFFTWGMTAAGAALVFVFSSGQRRILDGSLGFAAGVMLAASYWSLLAPAVEMATSSGGFGA
FAFFPVAVGFTLGAAFVYLADLLMPHLGAAEDPQTALALNFGSTLMKKKSDPEGPALLFPESELSIRIDKSENGE
AYQRKKAAATGLPEGPAVPVPSRGNLAQPGGSSWRRIALLILAITIHNVPEGLAVGVGFGAIEKTASATFESARN
LAIGIGIQNFPEGLAVSLPLRGAGFSTWRAFWYGQLSGMVEPLAGVFGAFAVVLAEPILPYALAFAAGAMVYVVM
DDIIPEAQISGNGKLASWASILGFVVMMSLDVGLG
SLC39A13；SEQ ID NO：385；NP_689477.2
MPGCPCPGCGMAGPRLLFLTALALELLGRAGGSQPALRSRGTATACRLDNKESESWGALLSGE
RLDTWICSLLGSLMVGLSGVFPLLVIPLEMGTMLRSEAGAWRLKQLLSFALGGLLGNVFLHLL
PEAWAYTCSASPGGEGQSLQQQQQLGLWVIAGILTFLALEKMFLDSKEEGTSQAPNKDPTAAA
AALNGGHCLAQPAAEPGLGAVVRSIKVSGYLNLLANTIDNFTHGLAVAASFLVSKKIGLLTTM
AILLHEIPHEVGDFAILLRAGFDRWSAAKLQLSTALGGLLGAGFAICTQSPKGVEETAAWVLP
FTSGGFLYIALVNVLPDLLEEEDPWRSLQQLLLLCAGIVVMVLFSLFVD
SEQ ID NO：386
GFIAISIISFLSLLGVLVPLMNRVFFKFLLSLVALAVGTLSGDAFLLLPHSHASHHHSHSHEP
AMEMKRGPLFSHLSQNIEESAYFDSTWKLTALGGLYFMFLVEHLTLIKQFKDKKKKNQKPEND
DDVEIKKQLSYESQLSTNEEKVDTDRTEGYLRADSQEPSHDSQQPAVLEEEEVMIHAHPQEVY
NEYVPRGKNKCHSHFHDTLGQSDLIHHHHDYHHILHHHHQNHHPHSHSQRYSEELKDAGVATL
AWMVMGDGLHNFSDGLAIGAFTEGLSSGLSTSVAFCHELPHELGDFAVLKAGMTVKQAVLYNA
LAMLAYLGMATGIFIGYAENVSMWIFALTAGFMYVALVDMVPEMLHDASDHGCSRWGYFFLMA
GMLLGFGIMLLIPLNIKSCSYKFLVKV
LIV-1-δ；SEQ ID NO：365
MGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFL
SLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRG
PLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDKKKKMQKKPENDDDV
EIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQEV
YNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDA
GVATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMT
VKQAVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVSF
SEQ ID NO：366
MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAISTRQYHLQQLFYR
YGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDH
DHHSHHNHAASGKNKRKALCPDHDSDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTS
TVYNTVSEGTHFLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPSVTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGFM
YSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIP
PKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHLL
PHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVL
TLIKQFKDKKKKNQKKPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHF
DSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQEVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHH
HHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSV
AVFCHELPHELGDFAVLLKADMTVKQAVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALT
AGLFMYVALVDMVPEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIVFRINF
尽管已参照其特定的实施方案对本发明进行了描述，但本领域技术人 员应当理解可以进行各种改变以及可以以等同方式进行替代，而不背离本 发明真实精神和范围的情况。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材 料、物质组合物、处理、处理步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有 的此类修改都在本发明的范围内。
序列表
<110>诺瓦提斯疫苗和诊断公司
<120>治疗、诊断或检测癌症的方法
<130>20366-039WO1
<150>US 60/791,871
<151>2006-04-13
<160>391
<170>用于Windows的FastSEQ版本4.0
<210>1
<211>2762
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ctcgtgccga attcggcacg agaccgcgtg ttcgcgcctg gtagagattt ctcgaagaca 60
ccagtgggcc cgtgtggaac caaacctgcg cgcgtggccg ggccgtggga caacgaggcc 120
gcggagacga aggcgcaatg gcgaggaagt tatctgtaat cttgatcctg acctttgccc 180
tctctgtcac aaatcccctt catgaactaa aagcagctgc tttcccccag accactgaga 240
aaattagtcc gaattgggaa tctggcatta atgttgactt ggcaatttcc acacggcaat 300
atcatctaca acagcttttc taccgctatg gagaaaataa ttctttgtca gttgaagggt 360
tcagaaaatt acttcaaaat ataggcatag ataagattaa aagaatccat atacaccatg 420
accacgacca tcactcagac cacgagcatc actcagacca tgagcgtcac tcagaccatg 480
agcatcactc agaccacgag catcactctg accatgatca tcactctcac cataatcatg 540
ctgcttctgg taaaaataag cgaaaagctc tttgcccaga ccatgactca gatagttcag 600
gtaaagatcc tagaaacagc caggggaaag gagctcaccg accagaacat gccagtggta 660
gaaggaatgt caaggacagt gttagtgcta gtgaagtgac ctcaactgtg tacaacactg 720
tctctgaagg aactcacttt ctagagacaa tagagactcc aagacctgga aaactcttcc 780
ccaaagatgt aagcagctcc actccaccca gtgtcacatc aaagagccgg gtgagccggc 840
tggctggtag gaaaacaaat gaatctgtga gtgagccccg aaaaggcttt atgtattcca 900
gaaacacaaa tgaaaatcct caggagtgtt tcaatgcatc aaagctactg acatctcatg 960
gcatgggcat ccaggttccg ctgaatgcaa cagagttcaa ctatctctgt ccagccatca 1020
tcaaccaaat tgatgctaga tcttgtctga ttcatacaag tgaaaagaag gctgaaatcc 1080
ctccaaagac ctattcatta caaatagcct gggttggtgg ttttatagcc atttccatca 1140
tcagtttcct gtctctgctg ggggttatct tagtgcctct catgaatcgg gtgtttttca 1200
aatttctcct gagtttcctt gtggcactgg ccgttgggac tttgagtggt gatgcttttt 1260
tacaccttct tccacattct catgcaagtc accaccatag tcatagccat gaagaaccag 1320
caatggaaat gaaaagagga ccacttttca gtcatctgtc ttctcaaaac atagaagaaa 1380
gtgcctattt tgattccacg tggaagggtc taacagctct aggaggcctg tatttcatgt 1440
ttcttgttga acatgtcctc acattgatca aacaatttaa agataagaag aaaaagaatc 1500
agaagaaacc tgaaaatgat gatgatgtgg agattaagaa gcagttgtcc aagtatgaat 1560
ctcaactttc aacaaatgag gagaaagtag atacagatga tcgaactgaa ggctatttac 1620
gagcagactc acaagagccc tcccactttg attctcagca gcctgcagtc ttggaagaag 1680
aagaggtcat gatagctcat gctcatccac aggaagtcta caatgaatat gtacccagag 1740
ggtgcaagaa taaatgccat tcacatttcc acgatacact cggccagtca gacgatctca 1800
ttcaccacca tcatgactac catcatattc tccatcatca ccaccaccaa aaccaccatc 1860
ctcacagtca cagccagcgc tactctcggg aggagctgaa agatgccggc gtcgccactt 1920
tggcctggat ggtgataatg ggtgatggcc tgcacaattt cagcgatggc ctagcaattg 1980
gtgctgcttt tactgaaggc ttatcaagtg gtttaagtac ttctgttgct gtgttctgtc 2040
atgagttgcc tcatgaatta ggtgactttg ctgttctact aaaggctggc atgaccgtta 2100
agcaggctgt cctttataat gcattgtcag ccatgctggc gtatcttgga atggcaacag 2160
gaattttcat tggtcattat gctgaaaatg tttctatgtg gatatttgca cttactgctg 2220
gcttattcat gtatgttgct ctggttgata tggtacctga aatgctgcac aatgatgcta 2280
gtgaccatgg atgtagccgc tgggggtatt tctttttaca gaatgctggg atgcttttgg 2340
gttttggaat tatgttactt atttccatat ttgaacataa aatcgtgttt cgtataaatt 2400
tctagttaag gtttaaatgc tagagtagct taaaaagttg tcatagtttc agtaggtcat 2460
agggagatga gtttgtatgc tgtactatgc agcgtttaaa gttagtgggt tttgtgattt 2520
ttgtattgaa tattgctgtc tgttacaaag tcagttaaag gtacgtttta atatttaagt 2580
tattctatct tggagataaa atctgtatgt gcaattcacc ggtattacca gtttattatg 2640
taaacaagag atttggcatg acatgttctg tatgtttcag ggaaaaatgt ctttaatgct 2700
ttttcaagaa ctaacacagt tattcctata ctggatttta ggtctctgaa gaactgctgg 2760
tg 2762
<210>2
<211>755
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Ala Arg Lys Leu Ser Val Ile Leu Ile Leu Thr Phe Ala Leu Ser
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr
20 25 30
Thr Glu Lys Ile Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu
35 40 45
Ala Ile Ser Thr Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Asn Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln
65 70 75 80
Asn Ile Gly Ile Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His
85 90 95
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
100 105 110
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asp His
115 120 125
His Ser His His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
130 135 140
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser Gly Lys Asp Pro Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
165 170 175
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr
180 185 190
Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu Glu Thr Ile Glu Thr Pro
195 200 205
Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val Ser Ser Ser Thr Pro Pro
210 215 220
Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg Leu Ala Gly Arg Lys Thr
225 230 235 240
Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly Phe Met Tyr Ser Arg Asn
245 250 255
Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Thr
260 265 270
Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn
275 280 285
Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu
290 295 300
Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser
325 330 335
Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val
340 345 350
Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr
355 360 365
Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
370 375 380
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg
385 390 395 400
Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala
405 410 415
Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr
420 425 430
Phe Met Phe Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys
435 440 445
Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val
450 455 460
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn
465 470 475 480
Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala
485 490 495
Asp Ser Gln Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu
500 505 510
Glu Glu Glu Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr
515 520 525
Asn Glu Tyr Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe
530 535 540
His Asp Thr Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp
545 550 555 560
Tyr His His Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His
565 570 575
Ser His Ser Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val
580 585 590
Ala Thr Leu Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe
595 600 605
Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser
610 615 620
Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu
625 630 635 640
Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln
645 650 655
Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met
660 665 670
Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp
675 680 685
Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp
690 695 700
Met Val Pro Glu Met Leu His Asn Asp Ala Ser Asp His Gly Cys Ser
705 710 715 720
Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Gln Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe
725 730 735
Gly Ile Met Leu Leu Ile Ser Ile Phe Glu His Lys Ile Val Phe Arg
740 745 750
Ile Asn Phe
755
<210>3
<211>55
<212>PRT
<213>智人
<400>3
His His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10 15
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
20 25 30
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
35 40 45
Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
50 55
<210>4
<211>23
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
20
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>5
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10 15
Glu Glu Pro Ala
20
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>6
His His Asp His Asp His His Ser
1 5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>7
His Asp His Asp His His Ser Asp
1 5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Asp His Asp His His Ser Asp His
1 5
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>9
His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>11
His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>12
His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>13
Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>15
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>15
His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>17
His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5
<210>18
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>18
His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5
<210>20
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5
<210>21
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>21
His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5
<210>22
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>24
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>24
His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>25
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>26
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>27
His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>28
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>29
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>29
His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>30
His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>33
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>33
His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5
<210>34
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5
<210>35
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>35
His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>36
His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5
<210>37
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5
<210>39
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>39
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5
<210>40
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5
<210>41
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>41
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5
<210>42
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5
<210>43
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5
<210>44
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>44
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5
<210>45
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>45
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>46
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>47
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5
<210>48
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>48
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5
<210>49
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>49
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5
<210>50
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>51
Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>54
His His Asp His Asp His His Ser Asp
1 5
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>55
His Asp His Asp His His Ser Asp His
1 5
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>56
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>57
His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>58
Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>59
His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>60
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>62
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>63
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>63
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5
<210>64
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>64
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5
<210>65
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>65
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5
<210>66
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>66
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>67
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>68
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5
<210>69
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>69
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>70
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>71
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>72
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>74
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5
<210>75
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>75
His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>76
Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>77
His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>78
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>79
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>80
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5
<210>81
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>81
His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>82
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>83
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>84
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>85
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>86
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5
<210>87
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>87
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>88
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5
<210>89
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>89
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>90
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>91
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>92
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>93
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>94
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>95
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>96
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>97
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5
<210>98
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>98
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5
<210>99
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>99
Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>100
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>101
His His Asp His Asp His His Ser Asp His
1 5 10
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>102
His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>103
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>104
His Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>105
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>106
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>106
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>107
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>107
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>108
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>108
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>109
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>109
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5 10
<210>110
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>110
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5 10
<210>111
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>111
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5 10
<210>112
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>112
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5 10
<210>113
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>113
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5 10
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>114
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>115
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>115
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>116
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>116
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>117
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>117
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>118
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>118
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>119
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>119
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>120
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>120
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>121
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>121
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>122
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>122
His Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>123
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>123
Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>124
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>124
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>125
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>125
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>126
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>126
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5 10
<210>127
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>127
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5 10
<210>128
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>128
His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5 10
<210>129
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>129
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5 10
<210>130
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>130
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5 10
<210>131
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>131
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5 10
<210>132
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>132
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5 10
<210>133
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>133
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5 10
<210>134
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>134
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5 10
<210>135
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>135
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5 10
<210>136
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>136
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5 10
<210>137
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>137
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5 10
<210>138
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>138
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5 10
<210>139
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>139
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5 10
<210>140
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>140
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5 10
<210>141
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>141
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5 10
<210>142
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>142
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5 10
<210>143
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>143
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5 10
<210>144
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>144
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5 10
<210>145
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>145
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5 10
<210>146
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>146
Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5 10
<210>147
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>147
His His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>148
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>148
His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>149
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>149
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>150
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>150
His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>151
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>151
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>152
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>152
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>153
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>153
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>154
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>154
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5 10
<210>155
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>155
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5 10
<210>156
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>156
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5 10
<210>157
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>157
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5 10
<210>158
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>158
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5 10
<210>159
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>159
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>160
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>160
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>161
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>161
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>162
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>162
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>163
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>163
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>164
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>164
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>165
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>165
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>166
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>166
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>167
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>167
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>168
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>168
His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>169
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>169
Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>170
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>170
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>171
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>171
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5 10
<210>172
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>172
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5 10
<210>173
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>173
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5 10
<210>174
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>174
His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5 10
<210>175
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>175
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5 10
<210>176
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>176
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5 10
<210>177
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>177
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5 10
<210>178
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>178
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5 10
<210>179
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>179
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5 10
<210>180
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>180
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5 10
<210>181
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>181
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5 10
<210>182
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>182
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5 10
<210>183
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>183
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5 10
<210>184
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>184
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5 10
<210>185
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>185
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5 10
<210>186
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>186
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5 10
<210>187
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>187
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5 10
<210>188
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>188
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5 10
<210>189
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>189
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5 10
<210>190
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>190
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5 10
<210>191
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>191
Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5 10
<210>192
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>192
His His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>193
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>193
His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>194
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>194
Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>195
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>195
His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>196
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>196
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>197
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>197
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>198
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>198
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg
1 5 10
<210>199
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>199
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His
1 5 10
<210>200
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>200
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
1 5 10
<210>201
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>201
His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp
1 5 10
<210>202
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>202
Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His
1 5 10
<210>203
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>203
His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>204
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>204
His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>205
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>205
Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>206
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>206
Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>207
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>207
His Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>208
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>208
Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>209
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>209
Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu
1 5 10
<210>210
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>210
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His
1 5 10
<210>211
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>211
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His
1 5 10
<210>212
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>212
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser
1 5 10
<210>213
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>213
His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp
1 5 10
<210>214
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>214
Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His
1 5 10
<210>215
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>215
His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn
1 5 10
<210>216
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>216
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His
1 5 10
<210>217
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>217
Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala
1 5 10
<210>218
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>218
Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala
1 5 10
<210>219
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>219
His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser
1 5 10
<210>220
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>220
Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
1 5 10
<210>221
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>221
His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys
1 5 10
<210>222
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>222
His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn
1 5 10
<210>223
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>223
Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys
1 5 10
<210>224
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>224
Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg
1 5 10
<210>225
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>225
His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys
1 5 10
<210>226
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>226
Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
1 5 10
<210>227
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>227
His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu
1 5 10
<210>228
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>228
Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys
1 5 10
<210>229
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>229
Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro
1 5 10
<210>230
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>230
Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp
1 5 10
<210>231
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>231
Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His
1 5 10
<210>232
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>232
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp
1 5 10
<210>233
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>233
Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser
1 5 10
<210>234
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>234
Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp
1 5 10
<210>235
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>235
Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser
1 5 10
<210>236
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>236
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His
1 5
<210>237
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>237
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala
1 5
<210>238
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>238
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser
1 5
<210>239
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>239
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5
<210>240
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>240
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5
<210>241
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>241
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5
<210>242
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>242
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5
<210>243
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>243
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5
<210>244
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>244
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5
<210>245
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>245
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5
<210>246
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>246
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5
<210>247
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>247
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5
<210>248
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>248
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5
<210>249
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>249
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5
<210>250
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>250
Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5
<210>251
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>251
Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5
<210>252
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>252
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala
1 5
<210>253
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>253
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser
1 5
<210>254
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>254
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5
<210>255
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>255
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5
<210>256
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>256
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5
<210>257
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>257
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5
<210>258
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>258
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5
<210>259
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>259
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5
<210>260
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>260
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5
<210>261
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>261
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5
<210>262
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>262
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5
<210>263
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>263
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5
<210>264
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>264
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5
<210>265
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>265
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5
<210>266
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>266
Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5
<210>267
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>267
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser
1 5 10
<210>268
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>268
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5 10
<210>269
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>269
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5 10
<210>270
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>270
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5 10
<210>271
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>271
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5 10
<210>272
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>272
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5 10
<210>273
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>273
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10
<210>274
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>274
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5 10
<210>275
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>275
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5 10
<210>276
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>276
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5 10
<210>277
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>277
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5 10
<210>278
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>278
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5 10
<210>279
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>279
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5 10
<210>280
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>280
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5 10
<210>281
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>281
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly
1 5 10
<210>282
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>282
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5 10
<210>283
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>283
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5 10
<210>284
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>284
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5 10
<210>285
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>285
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5 10
<210>286
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>286
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10
<210>287
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>287
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5 10
<210>288
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>288
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5 10
<210>289
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>289
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5 10
<210>290
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>290
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5 10
<210>291
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>291
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5 10
<210>292
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>292
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5 10
<210>293
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>293
Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5 10
<210>294
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>294
Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg
1 5 10
<210>295
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>295
Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
1 5 10
<210>296
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>296
Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn
1 5 10
<210>297
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>297
His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val
1 5 10
<210>298
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>298
Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys
1 5 10
<210>299
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>299
Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp
1 5 10
<210>300
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>300
Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser
1 5 10
<210>301
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>301
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val
1 5 10
<210>302
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>302
Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser
1 5 10
<210>303
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>303
Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala
1 5 10
<210>304
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>304
Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser
1 5 10
<210>305
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>305
Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
1 5 10
<210>306
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>306
His Leu Leu Pro His Ser His Ala
1 5
<210>307
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>307
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
1 5
<210>308
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>308
Leu Pro His Ser His Ala Ser His
1 5
<210>309
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>309
Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5
<210>310
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>310
His Ser His Ala Ser His His His
1 5
<210>311
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>311
Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5
<210>312
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>312
His Ala Ser His His His Ser His
1 5
<210>313
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>313
Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5
<210>314
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>314
Ser His His His Ser His Ser His
1 5
<210>315
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>315
His His His Ser His Ser His Glu
1 5
<210>316
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>316
His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5
<210>317
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>317
His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5
<210>318
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>318
Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5
<210>319
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>319
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
1 5
<210>320
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>320
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His
1 5
<210>321
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>321
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5
<210>322
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>322
Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5
<210>323
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>323
His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5
<210>324
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>324
Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5
<210>325
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>325
His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5
<210>326
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>326
Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5
<210>327
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>327
Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5
<210>328
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>328
His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5
<210>329
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>329
His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5
<210>330
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>330
His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5
<210>331
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>331
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His
1 5 10
<210>332
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>332
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5 10
<210>333
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>333
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5 10
<210>334
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>334
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5 10
<210>335
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>335
His Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5 10
<210>336
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>336
Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5 10
<210>337
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>337
His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10
<210>338
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>338
Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5 10
<210>339
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>339
Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5 10
<210>340
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>340
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5 10
<210>341
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>341
His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5 10
<210>342
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>342
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His
1 5 10
<210>343
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>343
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5 10
<210>344
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>344
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5 10
<210>345
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>345
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5 10
<210>346
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>346
His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5 10
<210>347
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>347
Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10
<210>348
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>348
His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5 10
<210>349
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>349
Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5 10
<210>350
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>350
Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5 10
<210>351
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>351
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5 10
<210>352
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>352
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
1 5 10
<210>353
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>353
Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser
1 5 10
<210>354
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>354
Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His
1 5 10
<210>355
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>355
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser
1 5 10
<210>356
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>356
His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10
<210>357
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>357
Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu
1 5 10
<210>358
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>358
His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu
1 5 10
<210>359
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>359
Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro
1 5 10
<210>360
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>360
Ser His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala
1 5 10
<210>361
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>361
His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro
1 5 10 15
Leu Phe Ser His
20
<210>362
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>362
Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Ser His Gly Met
1 5 10
<210>363
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>363
Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn Tyr Leu
1 5 10 15
<210>364
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>364
Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr Asn Thr Val Ser
1 5 10 15
Glu Gly Thr
<210>365
<211>433
<212>PRT
<213>智人
<400>365
Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn Tyr Leu Cys
1 5 10 15
Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu Ile His Thr
20 25 30
Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser Leu Gln Ile
35 40 45
Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser Phe Leu Ser
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val Phe Phe Lys
65 70 75 80
Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr Leu Ser Gly
85 90 95
Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His
100 105 110
Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu
115 120 125
Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp
130 135 140
Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr Phe Met Phe
145 150 155 160
Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys Asp Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val Glu Ile Lys
180 185 190
Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn Glu Glu Lys
195 200 205
Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala Asp Ser Gln
210 215 220
Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu Glu Glu Glu
225 230 235 240
Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr Asn Glu Tyr
245 250 255
Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe His Asp Thr
260 265 270
Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp Tyr His His
275 280 285
Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His Ser His Ser
290 295 300
Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val Ala Thr Leu
305 310 315 320
Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe Ser Asp Gly
325 330 335
Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser Gly Leu Ser
340 345 350
Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp
355 360 365
Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln Ala Val Leu
370 375 380
Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met Ala Thr Gly
385 390 395 400
Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp Ile Phe Ala
405 410 415
Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp Met Val Ser
420 425 430
Phe
<210>366
<211>755
<212>PRT
<213>智人
<400>366
Met Ala Arg Lys Leu Ser Val Ile Leu Ile Leu Thr Phe Ala Leu Ser
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr
20 25 30
Thr Glu Lys Ile Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu
35 40 45
Ala Ile Ser Thr Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Asn Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln
65 70 75 80
Asn Ile Gly Ile Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His
85 90 95
Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser
100 105 110
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asp His
115 120 125
His Ser His His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala
130 135 140
Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser Gly Lys Asp Pro Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg
165 170 175
Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr
180 185 190
Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu Glu Thr Ile Glu Thr Pro
195 200 205
Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val Ser Ser Ser Thr Pro Pro
210 215 220
Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg Leu Ala Gly Arg Lys Thr
225 230 235 240
Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly Phe Met Tyr Ser Arg Asn
245 250 255
Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Thr
260 265 270
Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn
275 280 285
Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu
290 295 300
Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser
325 330 335
Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val
340 345 350
Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr
355 360 365
Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser
370 375 380
His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg
385 390 395 400
Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala
405 410 415
Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr
420 425 430
Phe Met Phe Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys
435 440 445
Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val
450 455 460
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn
465 470 475 480
Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala
485 490 495
Asp Ser Gln Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu
500 505 510
Glu Glu Glu Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr
515 520 525
Asn Glu Tyr Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe
530 535 540
His Asp Thr Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp
545 550 555 560
Tyr His His Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His
565 570 575
Ser His Ser Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val
580 585 590
Ala Thr Leu Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe
595 600 605
Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser
610 615 620
Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu
625 630 635 640
Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Asp Met Thr Val Lys Gln
645 650 655
Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met
660 665 670
Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp
675 680 685
Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp
690 695 700
Met Val Pro Glu Met Leu His Asn Asp Ala Ser Asp His Gly Cys Ser
705 710 715 720
Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Gln Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe
725 730 735
Gly Ile Met Leu Leu Ile Ser Ile Phe Glu His Lys Ile Val Phe Arg
740 745 750
Ile Asn Phe
755
<210>367
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>367
aaaggctggc atgaccgtta a 21
<210>368
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>368
gacagtgtta gtgctagtga a 21
<210>369
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>369
ctagttaagg tttaaatgct a 21
<210>370
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>370
aaggcttatc aagtggttta a 21
<210>371
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>371
gcaaccctga aactcaccac tacga 25
<210>372
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>372
taccgtaccc gtaggtccaa ggcg 24
<210>373
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>373
tgtggtactg gtgctggtag tgagt 25
<210>374
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>374
tggtgaatga gatcgtctga ctggc 25
<210>375
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>375
agggctcttg tgagtctgct cgtaa 25
<210>376
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>376
agcatcacca ctcaaagtcc caacg 25
<210>377
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>377
gccagtgcca caaggaaact cagg 24
<210>378
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>378
gcggaacctg gatgcccatg ccat 24
<210>379
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>379
actggcatgt tctggtcggt gagc 24
<210>380
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>380
atgctcatgg tctgagtgac gctca 25
<210>381
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>381
tgagtgatgg tcgtggtcat ggtgt 25
<210>382
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的寡核苷酸
<400>382
gagagggcaa aggtcaggat caaga 25
<210>383
<211>831
<212>PRT
<213>智人
<400>383
Met Lys Val His Met His Thr Lys Phe Cys Leu Ile Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Phe Ile Phe His His Cys Asn His Cys His Glu Glu His Asp His Gly
20 25 30
Pro Glu Ala Leu His Arg Gln His Arg Gly Met Thr Glu Leu Glu Pro
35 40 45
Ser Lys Phe Ser Lys Gln Ala Ala Glu Asn Glu Lys Lys Tyr Tyr Ile
50 55 60
Glu Lys Leu Phe Glu Arg Tyr Gly Glu Asn Gly Arg Leu Ser Phe Phe
65 70 75 80
Gly Leu Glu Lys Leu Leu Thr Asn Leu Gly Leu Gly Glu Arg Lys Val
85 90 95
Val Glu Ile Asn His Glu Asp Leu Gly His Asp His Val Ser His Leu
100 105 110
Asp Ile Leu Ala Val Gln Glu Gly Lys His Phe His Ser His Asn His
115 120 125
Gln His Ser His Asn His Leu Asn Ser Glu Asn Gln Thr Val Thr Ser
130 135 140
Val Ser Thr Lys Arg Asn His Lys Cys Asp Pro Glu Lys Glu Thr Val
145 150 155 160
Glu Val Ser Val Lys Ser Asp Asp Lys His Met His Asp His Asn His
165 170 175
Arg Leu Arg His His His Arg Leu His His His Leu Asp His Asn Asn
180 185 190
Thr His His Phe His Asn Asp Ser Ile Thr Pro Ser Glu Arg Gly Glu
195 200 205
Pro Ser Asn Glu Pro Ser Thr Glu Thr Asn Lys Thr Gln Glu Gln Ser
210 215 220
Asp Val Lys Leu Pro Lys Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Arg Lys Ser
225 230 235 240
Asn Glu Asn Ser Glu Val Ile Thr Pro Gly Phe Pro Pro Asn His Asp
245 250 255
Gln Gly Glu Gln Tyr Glu His Asn Arg Val His Lys Pro Asp Arg Val
260 265 270
His Asn Pro Gly His Ser His Val His Leu Pro Glu Arg Asn Gly His
275 280 285
Asp Pro Gly Arg Gly His Gln Asp Leu Asp Pro Asp Asn Glu Gly Glu
290 295 300
Leu Arg His Thr Arg Lys Arg Glu Ala Pro His Val Lys Asn Asn Ala
305 310 315 320
Ile Ile Ser Leu Arg Lys Asp Leu Asn Glu Asp Asp His His His Glu
325 330 335
Cys Leu Asn Val Thr Gln Leu Leu Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Asn
340 345 350
Ser Pro Ile Ser Thr Asp Leu Phe Thr Tyr Leu Cys Pro Ala Leu Leu
355 360 365
Tyr Gln Ile Asp Ser Arg Leu Cys Ile Glu His Phe Asp Lys Leu Leu
370 375 380
Val Glu Asp Ile Asn Lys Asp Lys Asn Leu Val Pro Glu Asp Glu Ala
385 390 395 400
Asn Ile Gly Ala Ser Ala Trp Ile Cys Gly Ile Ile Ser Ile Thr Val
405 410 415
Ile Ser Leu Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Ile Ile Asn
420 425 430
Gln Gly Cys Phe Lys Phe Leu Leu Thr Phe Leu Val Ala Leu Ala Val
435 440 445
Gly Thr Met Ser Gly Asp Ala Leu Leu His Leu Leu Pro His Ser Gln
450 455 460
Gly Gly His Asp His Ser His Gln His Ala His Gly His Gly His Ser
465 470 475 480
His Gly His Glu Ser Asn Lys Phe Leu Glu Glu Tyr Asp Ala Val Leu
485 490 495
Lys Gly Leu Val Ala Leu Gly Gly Ile Tyr Leu Leu Phe Ile Ile Glu
500 505 510
His Cys Ile Arg Met Phe Lys His Tyr Lys Gln Gln Arg Gly Lys Gln
515 520 525
Lys Trp Phe Met Lys Gln Asn Thr Glu Glu Ser Thr Ile Gly Arg Lys
530 535 540
Leu Ser Asp His Lys Leu Asn Asn Thr Pro Asp Ser Asp Trp Leu Gln
545 550 555 560
Leu Lys Pro Leu Ala Gly Thr Asp Asp Ser Val Val Ser Glu Asp Arg
565 570 575
Leu Asn Glu Thr Glu Leu Thr Asp Leu Glu Gly Gln Gln Glu Ser Pro
580 585 590
Pro Lys Asn Tyr Leu Cys Ile Glu Glu Glu Lys Ile Ile Asp His Ser
595 600 605
His Ser Asp Gly Leu His Thr Ile His Glu His Asp Leu His Ala Ala
610 615 620
Ala His Asn His His Gly Glu Asn Lys Thr Val Leu Arg Lys His Asn
625 630 635 640
His Gln Trp His His Lys His Ser His His Ser His Gly Pro Cys His
645 650 655
Ser Gly Ser Asp Leu Lys Glu Thr Gly Ile Ala Asn Ile Ala Trp Met
660 665 670
Val Ile Met Gly Asp Gly Ile His Asn Phe Ser Asp Gly Leu Ala Ile
675 680 685
Gly Ala Ala Phe Ser Ala Gly Leu Thr Gly Gly Ile Ser Thr Ser Ile
690 695 700
Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp Phe Ala Val
705 710 715 720
Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln Ala Ile Val Tyr Asn Leu
725 730 735
Leu Ser Ala Met Met Ala Tyr Ile Gly Met Leu Ile Gly Thr Ala Val
740 745 750
Gly Gln Tyr Ala Asn Asn Ile Thr Leu Trp Ile Phe Ala Val Thr Ala
755 760 765
Gly Met Phe Leu Tyr Val Ala Leu Val Asp Met Leu Pro Glu Met Leu
770 775 780
His Gly Asp Gly Asp Asn Glu Glu His Gly Phe Cys Pro Val Gly Gln
785 790 795 800
Phe Ile Leu Gln Asn Leu Gly Leu Leu Phe Gly Phe Ala Ile Met Leu
805 810 815
Val Ile Ala Leu Tyr Glu Asp Lys Ile Val Phe Asp Ile Gln Phe
820 825 830
<210>384
<211>335
<212>PRT
<213>智人
<400>384
Met Leu Gln Gly His Ser Ser Val Phe Gln Ala Leu Leu Gly Thr Phe
1 5 10 15
Phe Thr Trp Gly Met Thr Ala Ala Gly Ala Ala Leu Val Phe Val Phe
20 25 30
Ser Ser Gly Gln Arg Arg Ile Leu Asp Gly Ser Leu Gly Phe Ala Ala
35 40 45
Gly Val Met Leu Ala Ala Ser Tyr Trp Ser Leu Leu Ala Pro Ala Val
50 55 60
Glu Met Ala Thr Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ala Phe Ala Phe Phe Pro
65 70 75 80
Val Ala Val Gly Phe Thr Leu Gly Ala Ala Phe Val Tyr Leu Ala Asp
85 90 95
Leu Leu Met Pro His Leu Gly Ala Ala Glu Asp Pro Gln Thr Ala Leu
100 105 110
Ala Leu Asn Phe Gly Ser Thr Leu Met Lys Lys Lys Ser Asp Pro Glu
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Leu Phe Pro Glu Ser Glu Leu Ser Ile Arg Ile Asp
130 135 140
Lys Ser Glu Asn Gly Glu Ala Tyr Gln Arg Lys Lys Ala Ala Ala Thr
145 150 155 160
Gly Leu Pro Glu Gly Pro Ala Val Pro Val Pro Ser Arg Gly Asn Leu
165 170 175
Ala Gln Pro Gly Gly Ser Ser Trp Arg Arg Ile Ala Leu Leu Ile Leu
180 185 190
Ala Ile Thr Ile His Asn Val Pro Glu Gly Leu Ala Val Gly Val Gly
195 200 205
Phe Gly Ala Ile Glu Lys Thr Ala Ser Ala Thr Phe Glu Ser Ala Arg
210 215 220
Asn Leu Ala Ile Gly Ile Gly Ile Gln Asn Phe Pro Glu Gly Leu Ala
225 230 235 240
Val Ser Leu Pro Leu Arg Gly Ala Gly Phe Ser Thr Trp Arg Ala Phe
245 250 255
Trp Tyr Gly Gln Leu Ser Gly Met Val Glu Pro Leu Ala Gly Val Phe
260 265 270
Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Ala Glu Pro Ile Leu Pro Tyr Ala Leu
275 280 285
Ala Phe Ala Ala Gly Ala Met Val Tyr Val Val Met Asp Asp Ile Ile
290 295 300
Pro Glu Ala Gln Ile Ser Gly Asn Gly Lys Leu Ala Ser Trp Ala Ser
305 310 315 320
Ile Leu Gly Phe Val Val Met Met Ser Leu Asp Val Gly Leu Gly
325 330 335
<210>385
<211>364
<212>PRT
<213>智人
<400>385
Met Pro Gly Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Met Ala Gly Pro Arg Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Thr Ala Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gly Arg Ala Gly Gly
20 25 30
Ser Gln Pro Ala Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ala Thr Ala Cys Arg Leu
35 40 45
Asp Asn Lys Glu Ser Glu Ser Trp Gly Ala Leu Leu Ser Gly Glu Arg
50 55 60
Leu Asp Thr Trp Ile Cys Ser Leu Leu Gly Ser Leu Met Val Gly Leu
65 70 75 80
Ser Gly Val Phe Pro Leu Leu Val Ile Pro Leu Glu Met Gly Thr Met
85 90 95
Leu Arg Ser Glu Ala Gly Ala Trp Arg Leu Lys Gln Leu Leu Ser Phe
100 105 110
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Gly Asn Val Phe Leu His Leu Leu Pro Glu
115 120 125
Ala Trp Ala Tyr Thr Cys Ser Ala Ser Pro Gly Gly Glu Gly Gln Ser
130 135 140
Leu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gly Leu Trp Val Ile Ala Gly Ile Leu
145 150 155 160
Thr Phe Leu Ala Leu Glu Lys Met Phe Leu Asp Ser Lys Glu Glu Gly
165 170 175
Thr Ser Gln Ala Pro Asn Lys Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Leu
180 185 190
Asn Gly Gly His Cys Leu Ala Gln Pro Ala Ala Glu Pro Gly Leu Gly
195 200 205
Ala Val Val Arg Ser Ile Lys Val Ser Gly Tyr Leu Asn Leu Leu Ala
210 215 220
Asn Thr Ile Asp Asn Phe Thr His Gly Leu Ala Val Ala Ala Ser Phe
225 230 235 240
Leu Val Ser Lys Lys Ile Gly Leu Leu Thr Thr Met Ala Ile Leu Leu
245 250 255
His Glu Ile Pro His Glu Val Gly Asp Phe Ala Ile Leu Leu Arg Ala
260 265 270
Gly Phe Asp Arg Trp Ser Ala Ala Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Leu
275 280 285
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Gly Phe Ala Ile Cys Thr Gln Ser Pro Lys
290 295 300
Gly Val Glu Glu Thr Ala Ala Trp Val Leu Pro Phe Thr Ser Gly Gly
305 310 315 320
Phe Leu Tyr Ile Ala Leu Val Asn Val Leu Pro Asp Leu Leu Glu Glu
325 330 335
Glu Asp Pro Trp Arg Ser Leu Gln Gln Leu Leu Leu Leu Cys Ala Gly
340 345 350
Ile Val Val Met Val Leu Phe Ser Leu Phe Val Asp
355 360
<210>386
<211>405
<212>PRT
<213>智人
<400>386
Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Leu
20 25 30
Val Ala Leu Ala Val Gly Thr Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu Leu Leu
35 40 45
Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Pro Ala
50 55 60
Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Gln Asn Ile
65 70 75 80
Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Leu Thr Ala Leu Gly
85 90 95
Gly Leu Tyr Phe Met Phe Leu Val Glu His Leu Thr Leu Ile Lys Gln
100 105 110
Phe Lys Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp
115 120 125
Val Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn
130 135 140
Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala Asp
145 150 155 160
Ser Gln Glu Pro Ser His Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu Glu Glu
165 170 175
Glu Glu Val Met Ile His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr Asn Glu Tyr
180 185 190
Val Pro Arg Gly Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe His Asp Thr Leu
195 200 205
Gly Gln Ser Asp Leu Ile His His His His Asp Tyr His His Ile Leu
210 215 220
His His His His Gln Asn His His Pro His Ser His Ser Gln Arg Tyr
225 230 235 240
Ser Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val Ala Thr Leu Ala Trp Met Val
245 250 255
Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala
260 265 270
Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Phe Cys
275 280 285
His Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Lys Ala Gly
290 295 300
Met Thr Val Lys Gln Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Met Leu Ala
305 310 315 320
Tyr Leu Gly Met Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly Tyr Ala Glu Asn Val
325 330 335
Ser Met Trp Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Phe Met Tyr Val Ala Leu
340 345 350
Val Asp Met Val Pro Glu Met Leu His Asp Ala Ser Asp His Gly Cys
355 360 365
Ser Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe
370 375 380
Gly Ile Met Leu Leu Ile Pro Leu Asn Ile Lys Ser Cys Ser Tyr Lys
385 390 395 400
Phe Leu Val Lys Val
405
<210>387
<211>304
<212>PRT
<213>智人
<400>387
Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr Thr Glu Lys Ile
1 5 10 15
Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu Ala Ile Ser Thr
20 25 30
Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr Gly Glu Asn Asn
35 40 45
Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln Asn Ile Gly Ile
50 55 60
Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His Asp His His Ser
65 70 75 80
Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His
85 90 95
His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser
115 120 125
Gly Lys Asp Pro Arg Asn Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu
130 135 140
His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu
145 150 155 160
Val Thr Ser Thr Val Tyr Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu
165 170 175
Glu Thr Ile Glu Thr Pro Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val
180 185 190
Ser Ser Ser Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg
195 200 205
Leu Ala Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly
210 215 220
Phe Met Tyr Ser Arg Asn Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn
225 230 235 240
Ala Ser Lys Leu Leu Thr Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu
245 250 255
Asn Ala Thr Glu Phe Asn Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile
260 265 270
Asp Ala Arg Ser Cys Leu Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile
275 280 285
Pro Pro Lys Thr Tyr Ser Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile
290 295 300
<210>388
<211>46
<212>PRT
<213>智人
<400>388
His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His
1 5 10 15
Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Leu
20 25 30
Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp Ser Thr
35 40 45
<210>389
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>389
Thr Glu Gly Leu Ser Ser
1 5
<210>390
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>390
His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met
1 5
<210>391
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>391
Val Phe Arg Ile Asn Phe
1 5
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种低剂量非典型抗精神病药物组合物 | 2020-05-17 | 112 |
| 用于治疗精神分裂症阴性症状的反式-4-{2-[4-(2,3-二氯苯基)-哌嗪-1-基]-乙基}-N,N-二甲基氨基甲酰基-环己基胺 | 2020-05-11 | 427 |
| 精神病阴性四步疗法系列药物 | 2020-05-13 | 51 |
| 具有谷氨酸NMDA活性的新型精神病治疗剂 | 2020-05-19 | 811 |
| 鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒 | 2020-05-20 | 923 |
| 芳族羟苯基和芳族硫基苯基衍生物 | 2020-05-14 | 563 |
| 新旋素:抗微生物肽 | 2020-05-16 | 760 |
| 2-取代氧基-5-甲砜基芳基哌嗪酰胺类似物及其制备方法和用途 | 2020-05-17 | 639 |
| 2-取代氧基-5-甲砜基吡啶哌嗪酰胺类似物及其制备方法和用途 | 2020-05-17 | 693 |
| 2-取代氧基-5-甲砜基苯基哌嗪酰胺类似物及其制备方法和用途 | 2020-05-18 | 218 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈