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由具有无义突变的DNA生产功能蛋白的方法以及相关疾病的治疗

阅读：960发布：2020-10-11

专利汇可以提供由具有无义突变的DNA生产功能蛋白的方法以及相关疾病的治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及由包含无义突变的核酸序列编码的功能蛋白。本发明还涉及包含无义突变的核酸序列编码的功能蛋白的生产方法，以及该蛋白在 预防 、控制和/或 治疗 与基因无义突变相关的 疾病 中的用途。，下面是由具有无义突变的DNA生产功能蛋白的方法以及相关疾病的治疗专利的具体信息内容。

1.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方 法，该方法包括向有此需要的人个体口服施用有效量的无义密码子抑制剂， 其中该无义密码子抑制剂的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，其被 分为三个剂量，第一和第二剂量分别为总施用量的25％，且第三剂量为总 施用量的50％。
2.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方 法，该方法包括向有此需要的人个体口服施用有效量的无义密码子抑制剂， 其中该无义密码子抑制剂的有效量足以生成0.1μg/ml至500μg/ml该试剂 的血浆浓度至少2小时。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的有效量介 于每天0.1mg/kg和500mg/kg。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的有效量介 于每天0.1mg/kg和500mg/kg，其被分为三个剂量，第一和第二剂量分别 为总施用量的25％，且第三剂量为总施用量的50％。
5.如权利要求2、3或4所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂经口 服施用至人个体。
6.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方 法，该方法包括向有此需要的人个体口服施用有效量的无义密码子抑制剂， 其中该无义密码子抑制剂的有效量对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微 生物不显示出明显的抗菌活性。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂经口服施用 至人个体。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的有效 量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，其被分为三个剂量，第一和第二剂量 分别为总施用量的25％，且第三剂量为总施用量的50％。
9.如权利要求6或7所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的有效 量足以生成0.1μg/ml至500μg/ml该试剂的血浆浓度至少2小时。
10.如权利要求1、2或6所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的 有效量不会引起人个体的听力损失和/或肾衰竭。
11.如权利要求1、2或6所述的方法，其中所述人个体根据对所述无 义密码子抑制剂发生响应的可能性进行筛选。
12.如权利要求6所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的有效量等 于在包含以下步骤的报告基因测定中抑制无义密码子的量：
(a)将所述试剂与具有包含报告基因的核酸序列的细胞相接触，其中该 报告基因包含提前终止密码子；和
(b)检测由该报告基因编码的功能通读蛋白的表达和/或活性。
13.治疗、控制和/或预防与基因无义突变相关的疾病的方法，该方法 包括向有此需要的人个体口服施用有效量的无义密码子抑制剂，其中该试 剂的有效量是足以生成有效量的由该包含无义突变的基因编码的功能通读 蛋白的量。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述功能通读蛋白的有效量是预 防所述疾病或其症状发作、发展和/或恶化所必需的蛋白量。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述功能通读蛋白的有效量是减 少所述疾病或其症状的延续时间和/或严重性所必需的蛋白量。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述功能通读蛋白的有效量是在 所述疾病的动物模型中生成的在该动物模型中具有治疗和/或预防益处的 量。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述功能通读蛋白的有效量等于 包含所述疾病相关基因的细胞所生成的量。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述细胞所生成的功能通读蛋白 的量为包含编码相应野生型蛋白的基因的相同物种和类型的细胞所生成的 量的约1％、约5％、约10％、约15％或约25％。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的有效量 介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，其被分为三个剂量，第一和第二剂量分 别为总施用量的25％，且第三剂量为总施用量的50％。
20.如权利要求13所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂的有效量 可生成0.1μg/ml至500μg/ml该试剂的血浆浓度至少2小时。
21.如权利要求13所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂不会引起 人个体的听力损失和/或肾衰竭。
22.如权利要求13所述的方法，其中所述无义密码子抑制剂对革兰氏 阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不显示出明显的抗菌活性。
23.如权利要求13所述的方法，其中所述人个体根据对无义密码子抑 制剂发生响应的可能性进行筛选。
24.如权利要求1、2、6或13所述的方法，其中所述无义密码子抑制 剂为3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐。
25.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的 方法，该方法包括向有此需要的人个体施用有效量的下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：
X、Y和Z独立地选自N、S、O和C，其中X、Y或Z中至少一个为 杂原子；
R1为氢、C1-C6烷基、或Na+、或Mg2+；
R2独立地为缺失；氢；-CH＝N-OH基团；氰基基团；C1-C6烷基，其任 选地被羟基基团取代；或羰基基团，其任选地被氢、羟基或C1-C4烷氧基取 代；
R3独立地为缺失、卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基或硝基基团；
R4独立地为缺失，氢，C1-C6烷基，或与W一起时，R4可以是键，且 W与R4和W所连接的杂环形成一个十一至十三元杂三环的环状结构；
W选自：
(a)C2-C6炔基，其任选地被苯基取代；
(b)C1-C8直链或支链烷基，其任选地被一个或多个独立地选自如下的基 团取代：C1-C6烷基；卤素；-C(＝O)-NH-苯基，其中苯基任选地被一个或多 个独立选择的卤素或C1-C4烷基基团取代；五至六元杂环；C6-C8芳基，其 任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、 C1-C4烷氧基或任选地被一个或多个C1-C4烷基取代的氨基的基团取代；芳 氧基，其任选地被一个或多个独立地选自如下的基团取代：羟基、卤素、 C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团或任选地被一个或多 个C1-C4烷基基团取代的氨基基团；
(c)C2至C8烯基；
(d)C3-C8环烷基，任选地被C1-C6烷基取代；
(e)C6-C8芳基，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取代：羟 基；卤素；C1-C4直链或支链烷基，其任选地被一个或多个独立选择的卤素 或羟基基团取代；C1-C4烷氧基，其任选地被一个或多个独立选择的卤素或 苯基基团取代；C3-C8环烷基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷 基基团取代；C6-C8芳基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基基 团取代；芳氧基，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取代：羟 基、卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、或被一 个或多个独立选择的C1-C4烷基基团任选地取代的氨基基团；五至六元杂 环，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取代：C1-C4烷基、氧代、 或任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取代的C6-C8芳基：羟基、卤 素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、或被一个或多 个独立选择的C1-C4烷基基团任选地取代的氨基基团；萘基基团，其任选地 被氨基或氨烷基或烷氧基基团取代；-C(O)-NRxRy基团；-C(O)-Rx基团；异 吲哚-1，3-二酮基团；硝基基团；氰基基团；-SO3H基团；烷硫基基团；烷基 磺酰基团；-NRx-C(O)-Rz基团；-NRxRy基团；-NRx-SO2-Rz基团；-NRx-C(O)- NRxRy基团；-NRx-C(O)O-Rz基团；
(f)C10-C14芳基基团，其任选地被一个或多个独立地选自卤素、氨基基 团或氨烷基基团、或烷氧基基团的基团取代；
(g)-C(O)-NRxRy基团；
(h)五或六元杂环，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取 代：氧代基团；卤素；C1-C4烷基基团；C1-C4烷氧基基团；C1-C4卤烷基基 团；C1-C4卤烷氧基基团；芳氧基基团；-NRxRy基团；烷硫基基团；-C(O)-Rx 基团；或C6至C8芳基基团，其任选地被一个或多个独立选择的卤素、C1-C4 烷基基团、C1-C4烷氧基基团取代；
(i)具有二至三个环状结构的杂环基团，其任选地被一个或多个独立选 择的卤素、氧代基团、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、或C1-C4烷氧基 基团取代；
(j)或W与R4，包括当R4是一个键时，与R4和W所连接的杂环一起 形成一个十一至十三元杂-三环的环状结构；
其中Rx为氢、C1-C6烷基基团，或Rx和Ry以及它们所连接的原子一起 形成四至七元碳环或杂环；
Ry为氢、C1-C6烷基基团；任选地被一个或多个独立地选择的C1-C4烷 基基团取代的芳基基团，或Rx和Ry与它们所连接的原子一起形成四至七元 碳环或杂环；和
Rz为C1-C6烷基，其任选地被芳基或卤素取代；或芳基，其任选地被卤 素、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代。
26.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的 方法，该方法包括向有此需要的人个体施用有效量的下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：
W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4烷基基团， 其中W、X、Y和Z中至少一个为N；
n为0、1、2或3；
R1为氰基基团；氨基甲酰，其任选地被一个或两个C1-C4烷基基团取代； 或羰基基团，其任选地被羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基基团取代；
R为羟基基团；卤素；C1-C4烷基，其任选地被一个或多个独立选择的 卤素或羟基基团取代；C1-C4烷氧基，其任选地被一个或多个独立选择的卤 素或苯基基团取代；C4-C8环烷基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4 烷基基团取代；-Rb基团；-O-Rb基团；五至六元杂环，其任选地被一个或 多个独立选择的C1-C4烷基、氧代、或-Rb基团取代；具有两个环状结构的 九至十元杂环；羰基基团，其任选地被羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基 基团取代；氨基甲酰基，其任选地被一个或两个C1-C4烷基基团取代；硝基 基团；氰基基团；任选地被羟基、C1-C4烷基、或-Rb基团取代的硫代；磺 酰基，其任选地被羟基、C1-C4烷基、或-Rb基团取代；氨基，其任选地被 一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基基团取代，其中所述氨基 磺酰基任选地被羟基、C1-C4烷基、或-Rb基团取代，且其中所述氨基羰基 基团任选地被C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、苯甲酰氧基或被-Rb基团任选地取 代的氨基基团取代；或者两个R基团与它们所连接的苯环一起形成苯并[1，3] 二氧杂或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁唑基基团，其中-Rb为C6-C8芳基，任选地 被一个或多个如下基团取代：羟基、卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基 基团、C1-C4烷氧基基团、或任选地被一个或多个C1-C4烷基基团取代的氨 基基团。
27.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的 方法，该方法包括向有此需要的人个体施用有效量的下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：
A1为C、CH或N；
V和X独立地选自N或C；
W选自N、C或CH；
其中V、W或X中至少一个为N，且其中当W为N时，V或X中至 少一个也是N；
Y和Z独立地选自N、C、C-Rc、C＝O、C＝S，其中Rc为H、CH3或 NH2；前提是，当Y或Z之一为C＝O或C＝S时，另一个可选自NH、S或 O；
R1为羧基、氰基或羰基基团，任选地被C1-C4烷氧基基团取代；
R2缺失或为硝基；
Ar1为C1至C4烷基，任选地被R基团取代；C6至C10芳基，其任选地 被一个、两个或三个独立选择的R基团取代；五至十元杂环，其任选地被 一个、两个、三个独立选择的R基团取代；或与Ar2和Ar1和Ar2所连接的 杂环一起形成选自Ar1-2的环状结构；或与Ar3和Ar1和Ar3所连接的杂环一 起形成选自Ar1-3的环状结构；
Ar2缺失或与Ar1和Ar1和Ar2所连接的杂环一起形成选自Ar1-2的环状 结构；
Ar3缺失或与Ar1和Ar1和Ar3所连接的杂环一起形成选自Ar1-3的环状 结构；
Ar4缺失，或为C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、或C1-C4硫烷基，其中的任 何一个与A1一起形成四至七元碳环或杂环；
R为氢；-Ra基团；或两个R基团，其中R还可包括氧基团，与它们所 连接的苯基或杂环一起形成选自RR的环状结构；
其中：
Ar1-2和Ar1-3选自十一至十四元杂-三环环状结构，其任选地被一个或多 个卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、任选地被卤素或C1-C4烷氧基 基团取代的C1-C4烷氧基基团、C1-C4卤烷氧基基团、或任选地被羰基基团(被 C1-C4烷基基团取代)取代的氨基基团取代；
RR为九至十元双环环状结构，其任选地被一个或多个卤素、C1-C4烷 基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、氧代基团或C1-C4卤烷氧基 基团取代；
Ra选自：羟基基团；卤素；C1-C4烷基，其任选地被一个或多个独立选 择的卤素或羟基基团取代；C1-C4烷氧基，其任选地被一个或多个独立选择 的卤素或苯基基团取代；C4-C8环烷基，其任选地被一个或多个独立选择的 C1-C4烷基基团取代；-Rb基团；-O-Rb基团；四至六元杂环，其任选地被一 个或多个独立选择的C1-C4烷基基团、氧代或-Rb基团取代；具有两个环状 结构的九至十元杂环；羰基，其任选地被羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基 基团取代；氨基甲酰，其任选地被一个或两个C1-C4烷基基团取代；硝基基 团；氰基基团；任选地被羟基、C1-C4烷基基团或-Rb基团取代的硫代；磺 酰基，其任选地被羟基、C1-C4烷基基团或-Rb基团取代；或氨基，其任选 地被一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基基团取代，其中的所 述氨基磺酰基基团任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基团取代，且其中的所 述氨基羰基被C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、苯甲酰氧基或任选地被-Rb基团取 代的氨基基团取代；和
其中-Rb为C6-C8芳基，其任选地被一个或多个如下基团取代：羟基、 卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、或任选地被 一个或多个C1-C4烷基基团取代的氨基基团。
28.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的 方法，该方法包括向有此需要的人个体施用有效量的下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：
Y和Z独立地选自N或C；
W为N或CH；
n为0、1、2或3；
R1为氢，被羧基基团任选地取代的C6至C8芳基，或当Z为N时R1 缺失；
R2为氢；C6至C8芳基，其任选地被一个、两个或三个独立选择的Ra 基团取代；四至七元杂环，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C6烷基基 团取代，或三至七元杂环；或当Y为N时R2缺失；
R独立地选自卤素；羧基基团；C1-C6烷基基团，其任选地被四至七元 杂环、C6-C8芳氧基基团或氨基基团取代，其中该四至七元杂环、C6-C8芳 氧基基团或氨基基团任选地被一个或两个独立选择的C1-C6烷基或C6-C8芳 基基团取代，其中该C6-C8芳基基团任选地和独立地被一个或多个C1-C6烷 基基团取代；C1-C6烷氧基；C6-C8芳氧基；C6-C8芳基，其任选地被一个或 多个独立选择的卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、氧代、C1-C4烷氧基或C1-C4 卤烷氧基基团取代；氨基基团，其任选地被一个或两个独立选择的C6-C8 芳基或C1-C6烷基基团(其任选地被羟基、C6-C8芳基或具有两个环状结构的 九至十元环取代)取代；羰基基团，其被五至六元杂环基团取代；四至七元 杂环基团，其任选地被一个或多个C1-C4烷基或氧代基团取代；具有两个环 状结构的九至十元杂环；或双R基团，其中R还可包括氧代基团，与它们 所连接的杂-双环一起形成具有三个环状结构的十二至十三元杂环；和
其中Ra为卤素；C1-C6烷基；C1-C6烷氧基，其任选地被一个或多个独 立选择的卤素基团取代；C6-C8芳基；四至七元杂环，其任选地被一个或多 个独立选择的氧代基团取代；羰基，其任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取 代；氨基甲酰基；氨基，其任选地被独立选择的C1-C6烷基基团取代，其中 该C1-C6烷基基团任选地被一个或多个独立选择的卤素或羟基基团取代；或 两个Ra基团，其中Ra还可包括氧代基团，与它们所连接的C6至C8芳基基 团一起形成具有两个环状结构的九至十元杂环，其中该具有两个环状结构 的九至十元杂环任选地被一个或多个独立选择的卤素取代。
29.生成有效量的由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的 方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：
X为卤素；
R为C1-C8烷基基团；C1-C4卤烷基基团；-OR1基团；或氨基基团，其 任选地被一个或两个独立选择的R2基团取代；
R1为C1-C8烷基基团，其任选地被一个或多个独立选择的Ra基团取代； -Rb基团；吡咯烷基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基或氧代 基团取代；哌啶基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基基团，苯 甲基基团，或羧基基团(其任选地被一个或多个C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基 团取代)取代；四氢呋喃基团；四氢吡喃基团；四氢萘基基团；或茚满基基 团；
R2为氢，C1-C6烷基基团；C1-C4卤烷基基团；C1-C4烷氧基基团；-Rb 基团；嘧啶基基团；吡啶基基团；任选地被-Rb基团取代的磺酰基基团；或 两个R2与它们结合的氨基一起形成任选地被苯基取代的吗啉基基团、吡咯 烷基基团、异吲哚基基团、或哌嗪基基团；
其中Ra为卤素；C1-C4烷氧基基团；氨基甲酰基，其任选地被一个或两 个独立选择的C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基团取代；膦酰基基团，其任选地 被一个或两个独立选择的C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基团取代；吗啉基基团； 吡啶基基团；或-Rb基团；和
其中Rb为C6-C8芳基，其任选地被一个或多个独立地选自如下的基团 取代：羟基；卤素；C1-C4烷基基团；C1-C4卤烷基基团；C1-C4烷氧基基团； 或氨基基团，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基基团取代。
30.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物口 服施用至人个体。
31.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的 有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg。
32.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的 有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，其被分为三个剂量，第一和第二 剂量分别为总施用量的25％，且第三剂量为总施用量的50％。
33.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的 有效量足以生成0.1μg/ml至500μg/ml该试剂的血浆浓度至少2小时。
34.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的 有效量不会引起人个体的听力损失和/或肾衰竭。
35.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述人个体根 据对该化合物发生响应的可能性进行筛选。
36.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物的 有效量等于在包含以下步骤的报告基因测定中抑制无义密码子的量：
(a)将所述试剂与具有包含报告基因的核酸序列的细胞相接触，其中该 报告基因包含提前终止密码子；和
(b)检测由该报告基因编码的功能通读蛋白的表达和/或活性。
37.如权利要求25、26、27、28或29所述的方法，其中所述化合物对 革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不显示出明显的抗菌活性。
38.预防、治疗和/或控制与无义突变相关的疾病的方法，该方法包括 在有此需要的人个体中通过如权利要求25、26、27、28或29所述的方法 生成有效量的功能通读蛋白。

说明书全文

1.技术领域

本发明涉及由包含无义突变的核酸序列编码的功能蛋白。本发明还涉 及包含无义突变的核酸序列编码的功能蛋白的生产方法，以及该蛋白在预 防、控制和/或治疗与基因无义突变相关的疾病中的用途。

2.背景技术

基因在细胞中的表达依赖于相继的转录和翻译过程。这些过程一起从 蛋白相应基因的核苷酸序列生成该蛋白。

转录涉及通过RNA聚合酶从DNA合成RNA。转录起始于基因的启动 子区域，并继续直至诱发终止，例如在新生RNA中形成茎环结构或结合rho 基因产物。

然后在核糖体上在tRNA、tRNA合成酶和各种其它蛋白和RNA类型的 辅助下通过翻译过程从mRNA生成蛋白。翻译包含起始、延伸和终止三个 阶段。翻译可通过形成起始复合物而启动，该起始复合物由蛋白因子、 mRNA、tRNA、辅助因子和识别在mRNA上指导翻译机制开始翻译该 mRNA的信号的核糖体亚基组成。

一旦形成了所述起始复合物，多肽链通过核糖体以及tRNA和tRNA合 成酶的肽基转移酶活性反复添加氨基酸而得以生长。在核糖体的A位点中 存在的三个终止密码子(UAA、UAG、UGA)中的一个向多肽链释放因子(RF) 发出结合和识别该终止信号的信号。从而，位于核糖体P位点的tRNA的 3′核苷酸和新生多肽链之间的酯键被水解。该完成的多肽链被释放，而所述 核糖体亚基循环进入另一轮翻译。

其中碱基数量有变化的DNA序列突变被分类为插入或删除突变(移码 突变)，其可导致基因组的严重破坏。将一种碱基转变为另一种碱基的DNA 突变被称为错义突变，其被细分为转换型(一种嘌呤转变为另一种嘌呤，或 一种嘧啶转变为另一种嘧啶)和颠换型(嘌呤转变为嘧啶，或嘧啶转变为嘌 呤)。

插入、删除、转换和颠换突变均可导致无义突变或链终止突变，其中 碱基突变如移码突变或框内突变将氨基酸密码子转为称为三个终止密码子 中的一个。因为提前的翻译终止，这些提前终止密码子可以在细胞中生成 异常蛋白。基因的无义突变可导致一系列疾病，例如癌症、溶酶体沉积性 疾病、肌肉萎缩症、囊性纤维化和血友病等。

在具有无义突变的细菌和真核菌株中，由于tRNA分子之一发生突变而 使该突变的tRNA能识别无义密码子，由于翻译过程中涉及蛋白的突变，由 于核糖体中(核糖体RNA或核糖体蛋白)突变，或通过加入可改变翻译过程 的化合物，可导致无义突变的抑制。其结果是氨基酸在无义突变的位点处 被整合进所述多肽链，且翻译在所述无义密码子处并不提前终止。该插入 的氨基酸并不必需地与野生型蛋白中的原始氨基酸一致；然而，许多氨基 酸替换并不对蛋白结构或功能产生明显的影响。因此，通过无义突变抑制 生成的蛋白可能具有与野生型蛋白类似的活性。这一情况提供了通过抑制 无义突变，避免翻译的提前终止来治疗与无义突变相关的疾病的机会。

在本领域仍然存在通过施用化合物并在体内生成其数量足以治疗、控 制和/或预防与人个体中基因的无义突变相关的疾病的非野生型蛋白以在人 个体中治疗、控制和/或预防与基因的无义突变相关的疾病的方法的需求， 该化合物介导无义密码子的错读以在人体中抑制提前翻译终止。

3.发明概述

本发明部分地是基于发现了无义密码子抑制剂，其可被全身性地施用 至个体(包括人)以抑制从包含无义突变的基因转录的RNA中的无义密码 子，从而允许通读该无义密码子并在该无义密码子的位置插入氨基酸。在 某些实施方式中，该插入的氨基酸不同于在野生型蛋白的相应位置处存在 的氨基酸以生成功能通读蛋白。通过抑制从包含无义突变的基因转录的 RNA中的无义密码子生成的功能通读蛋白可用于治疗、预防和/或控制与该 基因无义突变有关的疾病。

通过用无义密码子抑制剂抑制从包含无义突变的基因转录的RNA中的 无义密码子在个体(包括人)中生成功能通读蛋白比用于预防、治疗和/或控 制与基因无义突变相关的疾病的其它疗法中具有许多益处。例如，与基因 治疗不同，使用无义密码子抑制剂生成功能通读蛋白不涉及向个体中导入 外源遗传物质。因此，可以消除在染色体DNA中的错误位置插入外源遗传 性物质的风险，消除被导入个体的外源遗传物质编码的蛋白过量表达的风 险，和消除将用于向个体中导入外源遗传性材料的载体(例如病毒)传递至其 它个体的风险。

本发明提供了在有此需要的个体(优选人)中生成有效量的由包含无义 突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方法，该方法包括向个体施用有效 量的无义密码子抑制剂。具体地，本发明提供了用于预防、控制和/或治疗 与基因无义突变相关的疾病的方法，该方法包括向有此需要的个体(优选人) 施用有效量的无义密码子抑制剂，其中有效量的该试剂足以生产有效量的 由所述包含无义突变的基因编码的功能通读蛋白。可被本发明所述的方法 治疗、控制和/或预防的与基因无义突变相关的疾病的非限制性范例包括： 淀粉样变性、LINCL、血友病、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、巨大症、 侏儒症、甲状腺功能减退症、甲状腺功能亢进症、囊性纤维化、老化、肥 胖、帕金森病、尼曼-匹克病、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、肌 肉萎缩症(如杜兴肌营养不良)、脊髓性肌萎缩和马凡综合症。

一方面，本发明提供了可被口服施用至个体(优选人)以预防、治疗和/ 或控制与基因无义突变相关的疾病的无义密码子抑制剂。该口服施用的无 义密码子抑制剂在生成有效量的功能通读蛋白的剂量下不具有或具有极少 的(如有)的不良副作用。在一个特定的实施方式中，该无义密码子抑制剂在 生成有效量的功能通读蛋白的剂量下向个体(优选人)口服施用时不导致肾 衰竭和/或听力损失。因此，该无义密码子抑制剂可被长期全身性地(例如， 口服)施用而无毒性，例如肾衰竭和听力损失。

口服施用无义密码子抑制剂可使个体摄取他/她的处方剂量的无义密码 子抑制剂，而无需医疗人员来施用该试剂。由于减少了通过医疗人员施用 该试剂的成本，因而就减少了与预防、治疗和/或控制与基因无义突变相关 疾病有关的医疗成本。口服施用无义密码子抑制剂还改善了个体的生活质 量，因为该个体无需受限于和/或不方便地约见医疗人员来接受他的/她的无 义密码子抑制剂剂量。此外，口服施用无义密码子抑制剂允许向所有疾病 影响的器官位点传递全身性治疗。

另一方面，本发明提供了对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物 不显示出明显的抗菌活性的无义密码子抑制剂。与具有抗菌活性的无义密 码子抑制剂不同，使用对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不显示 出明显的抗菌活性的无义密码子抑制剂不会导致对具有抗生素活性的药物 形成细菌耐受性。此外，使用对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物 不显示出明显的抗菌活性的无义密码子抑制剂不太可能像许多长期施用抗 生素那样诱发与正常微生物菌丛的病理性过度生长相关的并发症。

因此，本发明提供了由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白， 该蛋白通过包括施用在个体中耐受良好且对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏 阳性微生物不具有明显抗菌活性的无义密码子抑制剂等方法生成。

4.附图说明

图1.来自荧光素酶报告构建体的mRNA的示意图。

图2A-2E.来自mRNA构建体中荧光素酶-CD40报告基因的mRNA。

图3.小鼠β-微管蛋白mRNA的示意图。

5.发明详述

本发明部分地是基于发现无义密码子抑制剂，其可被全身性地施用至 个体(包括人)以抑制从包含无义突变的基因转录的RNA中的无义突变，从 而允许通读该无义突变并在该无义密码子的位置处插入氨基酸。在某些实 施方式中，该插入的氨基酸不同于在野生型蛋白的相应位置处存在的氨基 酸残基以生成功能非野生型蛋白。通过抑制从包含无义突变的基因转录的 RNA中的无义密码子生成的功能通读蛋白可用于治疗、预防和/或控制与该 基因无义突变有关的疾病。

本发明提供了在有此需要的个体(优选人)中生成有效量的由包含无义 突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方法，该方法包括向个体施用有效 量的无义密码子抑制剂。依据本发明，该功能通读蛋白具有全长野生型蛋 白的一个或多个功能。在特定的实施方式中，由本发明的方法生成的功能 通读蛋白为功能非野生型蛋白。在另一实施方式中，该功能非野生型蛋白 为全长蛋白。在其它实施方式中，该功能非野生型蛋白不是全长蛋白。该 功能通读蛋白的生成可通过体外测定和/或在动物模型中进行评价。例如， 可采用报告测定来检测功能通读蛋白是否被生成。可替代地，可采用动物 模型(例如mdx鼠)检测功能通读蛋白是否被生成。

在某些实施方式中，如本发明所述施用至个体的无义密码子抑制剂的 有效量等于在包含如下步骤的报告基因测定中抑制无义密码子的量：(a)将 所述试剂与具有包含报告基因的核酸序列的细胞相接触，其中该报告基因 包含提前终止密码子；和(b)检测由该报告基因编码的功能通读蛋白的表达 和/或活性。在其它实施方式中，无义密码子抑制剂的有效量等于在包含如 下步骤的报告基因测定中抑制无义密码子的量：(a)将所述试剂与细胞裂解 产物和带有报告基因的核酸序列相接触，其中该报告基因包含提前终止密 码子；和(b)检测由该报告基因编码的功能通读蛋白的表达和/或活性。有关 该类测定的详细描述参见5.4节。

在一方面，本发明提供了在有此需要的个体(优选人)中生成有效量的由 包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方法，该方法包括向该个 体口服施用有效量的无义密码子抑制剂。在某些实施方式中，该口服施用 的无义密码子抑制剂的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg。在一些实 施方式中，该口服施用的无义密码子抑制剂的有效量介于每天0.1mg/kg和 500mg/kg，并作为单个剂量、两个剂量、三个剂量、四个剂量或更多个剂 量施用。在具体的实施方式中，该口服施用的无义密码子抑制剂的有效量 介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，其被分为三个剂量，第一和第二剂量分 别为总施用量的25％，第三剂量为总施用量的50％。在其它实施方式中， 该向人口服施用的无义密码子抑制剂的有效量小于每天35mg/kg。在具体 的实施方式中，该向人口服施用的无义密码子抑制剂的有效量介于每天0.1 mg/kg和30mg/kg。

在另一方面，本发明提供了在有此需要的个体(优选人)中生成有效量的 由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方法，该方法包括向个 体施用有效量的无义密码子抑制剂，其中该试剂的有效量足以生成0.5 μg/ml至500μg/ml的该试剂的血浆浓度2小时、2.5小时、3小时或更多时 间。在某些实施方式中，该试剂的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg。 在具体的实施方式中，该试剂的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg， 被分为三个剂量，第一和第二剂量分别为总施用量的25％，第三剂量为总 施用量的50％。在某些实施方式中，该无义密码子抑制剂被口服施用至该 个体。

在另一方面，本发明提供了在有此需要的个体(优选人)中生成有效量的 由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方法，该方法包括向该 个体施用有效量的无义密码子抑制剂，其中该无义密码子抑制剂的有效量 对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不显示出明显的抗菌活性。在 一些实施方式中，该无义密码子抑制剂被口服施用。在某些实施方式中， 该无义密码子抑制剂的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg。在具体的 实施方式中，该无义密码子抑制剂的有效量介于每天0.1mg/kg和500 mg/kg，被分为三个剂量，第一和第二剂量分别为总施用量的25％，第三剂 量为总施用量的50％。在某些其它实施方式中，该试剂的有效量足以生成 0.1μg/ml至500μg/ml的该试剂的血浆浓度2小时、2.5小时、3小时或更 多时间。

通过向个体施用无义密码子抑制剂生成由包含无义突变的核酸序列编 码的功能通读蛋白可用于治疗、控制和/或预防与基因无义突变相关的疾病。 可通过生成由包含无义突变的基因编码的功能通读蛋白治疗、控制和/或预 防的疾病的非限制性范例包括：淀粉样变性、LINCL、血友病、阿尔茨海 默病、动脉粥样硬化、巨大症、侏儒症、甲状腺功能减退症、甲状腺功能 亢进症、囊性纤维化、老化、肥胖、帕金森病、尼曼-匹克病、家族性高胆 固醇血症、视网膜色素变性、肌肉萎缩症(如杜兴肌营养不良)、脊髓性肌萎 缩和马凡综合症。

在某些实施方式中，通过生成由包含无义突变的基因编码的功能通读 蛋白治疗、控制和/或预防的所述疾病不是肠胃疾病。在其它实施方式中， 通过生成由包含无义突变的基因编码的功能通读蛋白治疗、控制和/或预防 的该疾病不是皮肤性疾病。在一些实施方式中，通过生成由包含无义突变 的基因编码的功能通读蛋白治疗、控制和/或预防的该疾病不是如下一种或 多种或所有疾病：基底细胞痣综合症(例如，PTCH基因)、偶发性基底细胞 癌(例如，PTCH基因)、黑色素瘤(例如，CDKN2a基因)、交界型大疱性表 皮松解症(例如，LAMB3、LAMC2、LAMA3基因)、泛发性萎缩性良性大 疱性表皮松解症(例如，COL17A1基因)、营养不良性表皮松解(例如， COL7A1基因)、良性天疱疮疾病(如ATP2C1基因)、Darier氏症(例如， ATP2A2基因)、板层状鱼鳞病(例如，TGM1基因)、X-连锁鱼鳞病(例如， STS基因)、着色性干皮病(例如，XPA、XPC、XPG基因)、布卢姆综合征(例 如，BLM基因)、纹状掌跖角化病(例如，DSP、DSG1基因)、Cockayne综 合症(例如，ERCC6基因)、眼皮肤白化病(例如，TYR、TYRP1基因)、 Hermansky-Pudlack综合症(例如，HPS1、HPS4基因)、共济失调毛细血管 扩张症(例如，ATM基因)、Griscelli综合症(例如，RAB27A、MYO5A基因)、 和外胚层发育不良/皮肤脆性(例如，PKP1基因)。在一些实施方式中，该种 通过生成由包含无义突变的基因编码的功能通读蛋白治疗、控制和/或预防 的疾病不是如下一种或多种或所有疾病：偶发性食道癌(p53基因)和偶发性 结肠癌(APC、p53基因)、Barrett食道(p53基因)、遗传性癌综合症如腺瘤性 结肠息肉病(APC基因)、遗传性非息肉性结肠癌(MLH1、MSH2基因)、 Peutz-Jeghers综合症(STK 11基因)、以及Cowden综合症(PTEN基因)。

本发明提供了用于预防、控制和/或治疗与基因无义突变相关的疾病的 方法，该方法包括向有此需要的个体(优选人)施用有效量的无义密码子抑制 剂，其中该试剂的有效量足以生成有效量的由该包含无义突变的基因编码 的功能通读蛋白。在某些的实施方式中，该功能通读蛋白的有效量为预防 疾病或其症状发作、发展和/或进展所必需的蛋白的量。在其它实施方式中， 该功能通读蛋白的有效量为减少疾病或其症状的延续时间和/或严重性所必 需的蛋白的量。在某些实施方式中，该功能通读蛋白的有效量等于在目标 疾病的动物模型中所生成的量。在其它实施方式中，该功能通读蛋白的有 效量为在所述疾病的动物模型中生成的具有治疗和/或预防效益的蛋白的 量。

在某些实施方式中，所述功能通读蛋白的有效量等于在包含如下步骤 的报告基因测定中生成的量：(a)将无义密码子抑制剂与具有包含报告基因 的核酸序列的细胞相接触，其中该报告基因包含提前终止密码子；和(b)检 测由该报告基因编码的功能通读蛋白的生成量。在其它实施方式中，该功 能通读蛋白的有效量等于在包含如下步骤的报告基因测定中生成的量：(a) 将无义密码子抑制剂与细胞裂解产物和包含该报告基因的核酸序列相接 触，其中该报告基因包含提前终止密码子；和(b)检测由该报告基因编码的 功能通读蛋白的生成量。功能通读蛋白的量可采用，例如，免疫测定检测 功能通读蛋白的表达水平，或通过检测功能通读蛋白的活性得到检测。

在某些实施方式中，所述功能通读蛋白的有效量为具有与所述疾病相 关基因(即，包含与该疾病相关的无义突变的基因)的细胞所生成的量。在一 些实施方式中，由该细胞生成的量为由包含编码相应野生型蛋白的正常基 因(即，不包含该无义突变的基因)的相同物种和类型的细胞所生成量的约 0.1％、约1％、约2％、约5％、约7％、或约10％(在其它实施方式中，约 15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、 约75％或约90％，且在其它实施方式中，0.1-25％、0.1-50％、10-50％、 10-90％、0.1-98％、5-98％或10-98％)。该功能通读蛋白的量以及野生型蛋 白的量可通过本领域技术人员已知的任意方法进行测定，只要测量该两种 蛋白的方法一致。在某些实施方式中，该功能通读蛋白的量和野生型蛋白 的量通过免疫测定(例如，ELISA)进行测量。在具体的实施方式中，该细胞 经工程改造后含有所述基因。在替代性的实施方式中，该细胞天然地包含 该基因。

在某些实施方式中，所述功能通读蛋白的有效量为来自与包含无义突 变的基因相关的疾病的患者的细胞生成的量。在一些实施方式中，由该患 者细胞生成的量为来自不患有该疾病的相同物种和类型的个体的细胞(该细 胞包含编码相应野生型蛋白的基因)所生成量的约1％、约2％、约5％、约 7％或约10％(在其它实施方式中，约15％、约20％、约25％、约30％、 约35％、约40％、约45％、约50％、约75％、约90％，且在其它实施方 式中，0.1-25％、0.1-50％、0.1-90％、10-90％、5-25％、5-90％、10-98％、 0.1-98％或5-98％)。该功能通读蛋白的量以及野生型蛋白的量可通过本领域 技术人员已知的任意方法进行测定，只要测量该两种蛋白的方法一致。在 某些实施方式中，该功能通读蛋白的量和野生型蛋白的量通过免疫测定(例 如，ELISA)进行测量。在具体的实施方式中，该患者细胞来自于正接受或 将要接受无义密码子抑制剂的患者。

本发明提供了预防、控制和/或治疗与基因无义突变相关的疾病的方法， 该方法包括向有此需要的个体(优选人)口服施用有效量的无义密码子抑制 剂，其中该无义密码子抑制剂的有效量足以生成有效量的由该包含无义突 变的基因编码的功能通读蛋白。在某些实施方式中，该试剂的有效量介于 每天0.1mg/kg和500mg/kg。在具体的实施方式中，该无义密码子抑制剂 的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，分为三个剂量，第一和第二剂 量分别为总施用量的25％，第三剂量为总施用量的50％。在其它实施方式 中，该试剂的有效量为可生成0.1μg/ml、2μg/ml或更多(在一些实施方式中， 5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、 40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、125μg/ml、150μg/ml、 175μg/ml、200μg/ml、225μg/ml、250μg/ml、275μg/ml、300μg/ml、325μg/ml、 375μg/ml、400μg/ml、425μg/ml、450μg/ml、475μg/ml或500μg/ml)的该 试剂的血浆浓度至少2小时、至少2.5小时、至少3小时或更多时间。在某 些实施方式中，该无义密码子抑制剂对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性 微生物不显示出明显的抗菌活性。

本发明提供了用于预防、控制和/或治疗与基因无义突变相关的疾病的 方法，该方法包括向有此需要的个体(优选人)施用有效量的无义密码子抑制 剂，其中该试剂的有效量足以生成0.1μg/ml至500μg/ml的该试剂的血浆 浓度2小时、2.5小时、3小时或更长时间。在某些实施方式中，该试剂的 有效量介于每天0.1mg/kg至500mg/kg。在具体的实施方式中，该试剂的 有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg，分为三个剂量，第一和第二剂量 分别为总施用量的25％，第三剂量为总施用量的50％。在某些其它实施方 式中，该试剂对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不具有明显的抗 菌活性。

本发明提供了用于治疗、控制和/或预防与基因无义突变相关的疾病的 方法，该方法包括向有此需要的个体(优选人)施用有效量的对革兰氏阴性微 生物和/或革兰氏阳性微生物不显示出明显的抗菌活性的无义密码子抑制 剂。在某些实施方式中，该试剂的有效量介于每天0.1mg/kg至500mg/kg。 在具体的实施方式中，该试剂的有效量介于每天0.1mg/kg和500mg/kg， 分为三个剂量，第一和第二剂量分别为总施用量的25％，第三剂量为总施 用量的50％。

由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的生成可用于：(i)不 能表达足量的相应野生型蛋白的个体，和/或(ii)不能从特定功能通读蛋白的 表达受益的个体。在一方面，本发明提供了在有此需要的个体(优选人)中生 成由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白的方法，该方法包括向 该个体施用有效量的无义密码子抑制剂，其中该个体已构建成包含所述核 酸序列。在具体的实施方式中，该功能通读蛋白对应于在个体中具有有益 效果的野生型蛋白。在某些实施方式中，施用该试剂的该个体生成不足量 的对应该功能通读蛋白的野生型蛋白。在具体的实施方式中，施用该试剂 的该个体患有与对应该功能通读蛋白的野生型蛋白生成不足相关的疾病。 在本发明的某些实施方式中，待接受无义密码子抑制剂的该个体在接受该 试剂前经过筛选。在具体的实施方式中，该个体经筛选以确定该试剂是否 能生成功能通读蛋白。在另一实施方式中，该个体经筛选以确定该有效量 的该试剂是否施用至该个体。下文5.6节提供了筛选个体的方法。

本发明包括使用无义密码子抑制剂以从包含突变的核酸序列生成功能 通读蛋白，其中该突变导致从该核酸序列转录的RNA中的终止密码子不同 于编码相应野生型蛋白的RNA中发现的终止密码子。具体地，本发明提供 了与包含突变(其导致从该核酸序列转录的RNA中的终止密码子不同于编 码相应野生型蛋白的RNA中发现的终止密码子)的基因相关的疾病的预防、 控制和/或治疗的方法，该方法包括向有此需要的个体(优选人)施用有效量 的无义密码子抑制剂。在某些实施方式中，该无义密码子抑制剂的有效量 是足以生成有效量的由该基因编码的功能通读蛋白的量。在一些实施方式 中，该无义密码子抑制剂的有效量介于每天0.1mg/kg至500mg/kg。在一 些其它实施方式中，该无义密码子抑制剂的有效量为导致介于0.1μg/ml至 500μg/ml的血浆浓度的试剂量。

在某些实施方式中，本发明所采用所述无义密码子抑制剂不是氨基糖 苷。氨基糖苷的非限制性范例包括庆大霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡 那霉素、妥布霉素、奈替米星、新霉素、新霉素B、负霉素(negamycen)、 巴龙霉素(paromycen)、西索米星、G-418及其衍生物和类似物。在具体的 实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂不是以下一种、两种、 三种或多种：庆大霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、 奈替米星、新霉素、新霉素B、负霉素(negamycen)、巴龙霉素(paromycen)、 西索米星、G-418和/或其衍生物和类似物。在其它实施方式中，本发明所 采用的该无义密码子抑制剂不是保留了促进提前终止密码子通读活性的氯 霉素及其衍生物或类似物。在其它实施方式中，本发明所采用的该无义密 码子抑制剂不是恶唑烷酮。恶唑烷酮的非限制性范例为利奈唑酮、依哌唑 胺及其类似物或衍生物。在某些实施方式中，本发明所采用的该无义密码 子抑制剂在基于细胞的测定、动物模型测定或是此处描述的或本领域已知 的针对无义密码子抑制的其它测定中比同等剂量的氨基糖苷、恶唑烷酮和/ 或氯霉素生成更多的(在一些实施方式中，5％、10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更 多，在其它实施方式中，5-95％、10％-95％、25％-95％或10％-65％以上)功 能通读蛋白。

在某些实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂不是具式I、 式II、式III或式IV的化合物。在具体的实施方式中，本发明所采用的该 无义密码子抑制剂不是表1、表2、表3或表4的化合物。在其它实施方式 中，该无义密码子抑制剂不是具式V、式VI、式VII、式VIII或式IX的化 合物。在具体的实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂不是表5、 表6、表7、表8或表9的化合物。

在某些实施方式中，本发明所采用的所述无义密码子抑制剂对革兰氏 阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不显示出明显的抗菌活性。在具体的实 施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂为5.2节中描述的化合物。 在某些实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂是具式I、式II、 式III或式IV的化合物。在具体的实施方式中，本发明所采用的该无义密 码子抑制剂是表1、表2、表3或表4的化合物。在其它实施方式中，本发 明所采用的该无义密码子抑制剂是具式V、式VI、式VII、式VIII或式XI 的化合物。在具体的实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂是 表5、表6、表7、表8或表9的化合物。

在某些实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂与28S rRNA 相互作用。在具体的实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂结 合28S rRNA的特定区域。在其它实施方式中，本发明所采用的该无义密码 子抑制剂不与18S rRNA相互作用。

本发明提供了由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白，该蛋 白由本发明所述的方法生成。在某些实施方式中，该功能通读蛋白发现位 于细胞中相应野生型蛋白的相同位置。在一些实施方式中，该功能通读蛋 白为功能非野生型蛋白。在具体实施方式中，该功能非野生型蛋白与相应 野生型蛋白的区别仅在于在非野生型蛋白中由该提前终止密码子编码的位 置处插入的氨基酸残基。在其它实施方式中，该功能非野生型蛋白与相应 野生型蛋白的区别在于：(i)在非野生型蛋白中由提前终止密码子编码的位 置处插入的氨基酸残基；和(ii)在非野生型蛋白中提前终止密码子编码的氨 基酸残基以外的氨基酸残基。在其它实施方式中，该非野生型蛋白为全长 蛋白(即，与相应的野生型蛋白具有相同的长度)。由本发明的方法生成的功 能通读蛋白的氨基酸序列可通过对包含目标核酸序列(即，包含该目标无义 突变的核酸序列)的细胞生成的蛋白进行测序来测定。在某些实施方式中， 该细胞天然地包含该核酸序列。在具体的实施方式中，该细胞为来自于正 接受或将要接受无义密码子抑制剂的患者的细胞。在其它实施方式中，该 细胞被工程改造以包含该核酸序列。

因此，本发明所公开了示例性的、结构多样的无义密码子抑制剂；制 备该试剂的参考方法；测定该试剂的无义密码子抑制剂活性的方法；施用 无义密码子抑制剂的施用途径和剂型，包括优选的给药方案和药物代谢动 力学模式；与无义突变相关的疾病，包括对无义突变和此处所引的疾病之 间的关系的公开；适于所公开的治疗、控制和预防方法的患者群体，包括 患者筛选的方法；以及用于确定无义密码子抑制剂的效力的治疗终点。

5.1 定义

此处所用的术语“提前翻译终止”指将对应氨基酸的密码子改变为终止 密码子的突变所产生的结果。

此处所用的术语“无义介导的mRNA降解”指介导包含提前翻译终止密 码子的mRNA降解的任意机制。

此处所用的术语“提前终止密码子”和“无义密码子”指在氨基酸相对应 的密码子应该出现时出现终止密码子。

此处所用的术语“无义突变”指将编码氨基酸的密码子改变为终止密码 子的突变。

此处所用的术语“无义密码子抑制”指对提前翻译和/或无义介导的 mRNA降解的抑制或阻抑。在一个实施方式中，对提前翻译和/或无义介导 的mRNA降解的抑制或阻抑存在于体内。在另一实施方式中，对提前翻译 和/或无义介导的mRNA降解的抑制或阻抑存在于体外。

此处所用的短语“对提前翻译终止和/或无义介导的mRNA降解的调节” 指通过改变无义密码子抑制的水平调节基因表达。例如，如果需要提高由 具有提前终止密码子的基因编码的功能通读蛋白的生成，即允许通读该疾 病基因的提前终止密码子从而可以翻译该RNA，则提前翻译终止和/或无义 介导的mRNA降解的调节需要上调无义密码子抑制。相反地，如果需要促 进具有提前终止密码子的mRNA的降解，则提前翻译终止和/或无义介导的 mRNA降解的调节需要下调无义密码子抑制。

此处所用的术语“个体”和“患者”可相互替换地指动物(例如，牛、马、 羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)，优选哺乳 动物例如非灵长动物和灵长动物(例如，猴和人)，最优选人。在某些实施方 式中，该患者为胚胎、胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一个实施方 式中，通过预筛选确定该患者具有无义突变。在另一实施方式中，通过预 筛选确定该患者具有哪一个无义突变(即，UAA、UGA或UAG)。在另一实 施方式中，该患者被细菌细胞(例如，铜绿假单孢菌)感染。在另一实施方式 中，该患者的细胞被病毒感染。

此处所用的短语“对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不显示 出明显的抗菌活性”指无义密码子抑制剂在添加至革兰氏阴性微生物的培 养基和/或革兰氏阳性微生物的培养基时具有250μg/ml或更大(在特定实施 方式中，300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml或500μg/ml，以及 在其它实施方式中，约250μg/ml至约1000μg/ml、或250μg/ml至约500 μg/ml)的最小抑制浓度。在具体实施方式中，该短语指在添加至大肠杆菌 BAS849的培养基(可渗透)、铜绿假单孢菌27853的培养基、金黄葡萄球菌 29213的培养基、上皮葡萄球菌12228(CNSA)的培养基、屎肠球菌49624 的培养基和/或粪肠球菌29212的培养基中时MIC为250μg/ml或更多(在特 定实施方式中，300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml或500μg/ml， 以及在其它实施方式中，约250μg/ml至约1000μg/ml、或250μg/ml至约 500μg/ml)的无义密码子抑制剂。

除非另行指明，此处所用的术语“牛奶”包括标准化的、完全的、减脂的 (2％)、低脂的(1％)、脱脂的、无脂的以及无乳糖的牛奶。术语“牛奶”还包 括来自人或驯养动物(例如，牛、水牛、山羊、绵羊或骆驼)的牛奶和豆奶以 及任意基于牛奶或含奶产品。

除非另行指明，此处所用的术语“取代的”指被一个至四个或更多个取代 基取代的基团，该取代基如卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、 环烷氧基、杂环氧基、氧代、烷酰基、烷基羰基、环烷基、芳基、芳氧基、 芳烷基、烷酰氧基、氰基、叠氮基、氨基、烷氨基、芳氨基、芳烷氨基、 环烷氨基、杂环氨基、单和双取代的氨基，其中在氨基基团上的两个取代 基选自烷基、芳基、芳烷基、烷酰氨基、芳酰氨基、芳烷酰氨基、取代的 烷酰氨基、取代的芳烷氨基、取代的芳烷酰氨基、硫代、烷硫基、芳硫基、 芳烷硫基、环烷硫基、杂环硫基、烷硫羰基、芳硫羰基、芳烷硫羰基、烷 基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、亚磺酰氨基(例如，SO2NH2)、取 代的亚磺酰氨基、硝基、羧基、氨基甲酰(例如，CONH2)，取代的氨基甲酰 (例如，CONH烷基、CONH芳基、CONH芳烷基或是氮上具有两个选自烷 基、芳基或芳烷基的取代基的情况)、烷氧基羰基、芳基、取代的芳基、胍 基和杂环，例如吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、 吡啶基、嘧啶基等。其中，如上文所述，该取代基本身可被进一步取代， 该种进一步的取代基选自卤素、烷基、烷氧基、芳基和芳烷基。在某些实 施方式中，术语取代的不是指氰基。

除非另行指明，此处所用的术语“烷基”指具有1至20个碳原子、优选 1-10个碳原子、最优选1-4个碳原子的饱和直链或支链非环状烃。代表性 的饱和直链烷基包括-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、 -正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而饱和支链烷基包括-异丙基、-仲 丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、 3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基 己基、2，3-二甲基丁基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，3-二甲基己基、 2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，2-二甲基己基、3，3- 二甲基戊基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、 2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基 戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基 -4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、 2，2-二乙基戊基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基、3，3-二乙基己基等。烷 基基团可被取代或未被取代。不饱和烷基基团包括烯基基团和炔基基团， 其将在下文讨论。

除非另行指明，此处所用的术语“烯基基团”指具有2至20个碳原子、 优选2-10个碳原子、最优选2-6个碳原子，并包括至少一个碳碳双键的直 链或支链非环状烃。代表性的直链和支链(C2-C10)烯基包括-乙烯基、-丙烯 基、-1-丁烯基、2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1- 丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基、-1-己烯基、-2-己烯基、 -3-己烯基、-1-庚烯基、-2-庚烯基、-3-庚烯基、-1-辛烯基、-2-辛烯基、-3- 辛烯基、-1-壬烯基、-2-壬烯基、-3-壬烯基、-1-癸烯基、-2-癸烯基、-3-癸 烯基等。烯基基团的双键未结合或结合至另一不饱和基团。烯基基团可被 取代或未被取代。

除非另行指明，此处所用的术语“炔基基团”指具有2至20个碳原子、 优选2-10个碳原子、最优选2-6个碳原子，并包括至少一个碳碳三键的直 链或支链非环状烃。代表性的直链和支链(C2-C10)炔基包括包括-乙炔基、- 丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基、 -4-戊炔基、-1-己炔基、-2-己炔基、-5-己炔基、-1-庚炔基、-2-庚炔基、-6- 庚炔基、-1-辛炔基、-2-辛炔基、-7-辛炔基、-1-壬炔、-2-壬炔、-8-壬炔、-1- 癸炔、-2-癸炔、-9-癸炔等。烯基基团的三键未结合或结合至另一不饱和基 团。炔基基团可被取代或未被取代。

除非另行指明，此处所用的术语“卤素”指氟、氯、溴或碘原子。

除非另行指明，此处所用的术语“卤烷基”指被一个或多个卤素原子取代 的烷基基团。

除非另行指明，此处所用的术语“卤烷氧基”指被一个或多个卤素原子取 代的烷氧基基团。

除非另行指明，此处所述的术语“烷基磺酰基”指-烷基-SO3H或-SO3-烷 基(其中烷基如上文定义)，包括-SO2-CH3、-SO2-CH2CH3、-SO2-(CH2)2CH3、 -SO2-(CH2)3CH3、-SO2-(CH2)4CH3、-SO2-(CH2)5CH3等。

除非另行指明，此处所述的术语“羧基”指-COOH。

除非另行指明，此处所述的术语“烷氧基”指-O-(烷基)(其中烷基如上文 定义)，包括-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3、-O(CH2)3CH3、-O(CH2)4CH3、 -O(CH2)5CH3等。

除非另行指明，此处所述的术语“烷氧基羰基”指-C(＝O)O-(烷基)(其中 烷基如上文定义)，包括-C(＝O)O-CH3、-C(＝O)O-CH2CH3、 -C(＝O)O-(CH2)2CH3、-C(＝O)O-(CH2)3CH3、-C(＝O)O-(CH2)4CH3、 -C(＝O)O-(CH2)5CH3等。在优选的实施方式中，该酯可生物水解(即，该酯 可在体外或体内水解为羧酸)。

除非另行指明，此处所述的术语“烷氧基烷基”指-(亚烷基)-O-(烷基)(其 中各“烷基”独立为上文定义的烷基基团)，包括-CH2OCH3、-CH2OCH2CH3、 -(CH2)2OCH2CH3、-(CH2)2O(CH2)2CH3等。

除非另行指明，此处所用的术语“芳基”指含有5至14个环原子的碳环 型芳香环。该碳环芳基基团中的环原子均为碳原子。芳基环结构包括具有 一个或多个环结构的化合物(例如单、双或三环化合物以及苯稠合的碳环部 分，如5，6，7，8-四氢萘基等)。优选地，该芳基基团为单环状环或双环状环。 代表性的芳基基团包括苯基、甲苯基、蒽基、茀基、茚基、奥基、菲基和 萘基。碳环芳基基团可被取代或未被取代。

除非另行指明，此处所述的术语“杂芳基”指含5至14个环原子的碳环 芳香环，且该环原子包含至少一个、优选1至3个独立地选自氮、氧或硫 的杂原子。杂芳基环结构包括具有一个或多个环结构的化合物，例如，单-、 双-、或三环化合物以及稠合杂环部分。代表性的杂芳基为三唑基、四唑基、 噁二唑基、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并硫苯基、苯并异 噁唑基、苯并异噻唑基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并唑基、 咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、 哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、苯并喹 唑啉基、吖啶基、嘧啶基和噁唑基。基团可被取代或未被取代。

除非另行指明，此处所用的术语“芳氧基”指-O-芳基基团，其中芳基如 上文定义。芳氧基团可被取代或未被取代。

除非另行指明，此处所用的术语“芳烷基”指-(烷基)-(芳基)(其中烷基和 芳基如上文定义)，包括但不限于：-(CH2)苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、 -CH(苯基)2、-CH(苯基)3、-(CH2)苯甲基、-(CH2)蒽基、-(CH2)茀基、-(CH2) 茚基、-(CH2)奥基、-(CH2)萘基等。

除非另行指明，此处所用的术语“杂芳烷基”指-(烷基)-(杂芳基)(其中烷 基和杂芳基如上文定义)，包括但不限于：-(CH2)吡啶基、-(CH2)2吡啶基、 -(CH2)3吡啶基、-CH(吡啶基)2、-CH(吡啶基)3、-(CH2)三唑基、-(CH2)四唑 基、-(CH2)噁二唑基、-(CH2)呋喃基、-(CH2)苯并呋喃基、-(CH2)硫苯基、-(CH2) 苯并硫苯基等。

除非另行指明，此处所用的术语“芳烷氧基”指-O-(烷基)-(芳基)(其中烷 基和芳基如上文定义)，包括但不限于：-O-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、 -O-CH(苯基)2、-O-CH(苯基)3、-O-(CH2)苯甲基、-O-(CH2)蒽基、-O-(CH2) 茀基、-O-(CH2)茚基、-O-(CH2)奥基、-O-(CH2)萘基等。

除非另行指明，此处所用的术语“环烷基”指包含碳和氢原子且不具有碳 碳多键的单环状或多环状饱和的环。环烷基基团可被取代或未被取代。环 烷基基团的范例包括但不限于：(C3-C7)环烷基基团、包括环丙基、环丁基、 环戊基、环己基和环庚基以及饱和的环状和双环萜烯。环烷基基团可被取 代或未被取代。优选地，该环烷基基团为单环状环或双环状环。

除非另行指明，此处所用的术语“杂环基”指包含碳和氢原子，任选地具 有1至4个多重键的单环状或多环状环，且环原子至少包含1个、优选1 至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。杂环基环结构包括具有一个或多 个环结构的化合物，例如单-、双-、或三环化合物。优选地，该杂环基基团 为单环状环或双环状环。代表性的杂环包括但不限于：吗啉基、吡咯烷酮 基、吡咯烷基、哌啶基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧基(oxiranyl)、叔 环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢苯硫 基、四氢硫吡喃基等。杂环基环可被取代或未被取代。

除非另行指明，此处所用的术语“环烷氧基”指-O-(环烷基)，其中环烷 基如上文定义。

除非另行指明，此处所用的术语“环烷基烷氧基”指O-(烷基)-(环烷 基)(其中环烷基和烷基如上文定义)，包括但不限于：-O-环丙基、-O-环丁基、 -O-环戊基、-O-环己基、-O-环庚基等。

除非另行指明，此处所用的术语“氨烷氧基”指-O-(烷基)-NH2(其中烷基 如上文定义)，包括但不限于：-O-CH2-NH2、-O-(CH2)2-NH2、-O-(CH2)3-NH2、 -O-(CH2)4-NH2、-O-(CH2)5-NH2等。

除非另行指明，此处所用的术语“烷氨基”指-NH(烷基)或-N(烷基)(烷 基)(其中烷基如上文定义)，包括但不限于：NHCH3、-NHCH2CH3、 -NH(CH2)2CH3、-NH(CH2)3CH3、-NH(CH2)4CH3、-NH(CH2)5CH3、-N(CH3)2、 -N(CH2CH3)2、-N((CH2)2CH3)2、-N(CH3)(CH2CH3)等。

除非另行说明，此处所用的术语“芳氨基”指-NH(芳基)(其中芳基如上文 定义)，包括但不限于：-NH(苯基)、-NH(苯甲基)、-NH(蒽基)、-NH(茀基)、 -NH(茚基)、-NH(奥基)、-NH(吡啶基)、-NH(萘基)等。

除非另行说明，此处所用的术语“芳烷氨基”指-NH-(烷基)-(芳基)(其中 烷基和芳基如上文定义)，包括-NH-CH2-(苯基)、-NH-CH2-(苯甲基)、 -NH-CH2-(蒽基)、-NH-CH2-(茀基)、-NH-CH2-(茚基)、-NH-CH2-(奥基)、 -NH-CH2-(吡啶基)、-NH-CH2-(萘基)、-NH-(CH2)2-(苯基)等。

除非另行指明，此处所用的术语“环烷氨基”指-NH-(环烷基)(其中环烷 基如上文定义)，包括-NH-环丙基、-NH-环丁基、-NH-环戊基、-NH-环己基、 -NH-环庚基等。

除非另行指明，此处所述的术语“氨烷基”指-(烷基)-NH2(其中烷基如上 文定义)，包括-CH2-NH2、-(CH2)2-NH2、-(CH2)3-NH2、-(CH2)4-NH2、 -(CH2)S-NH2等。

除非另行指明，此处所用的术语“烷氨烷基”指-(烷基)-NH(烷基)或-(烷 基)-N(烷基)(烷基)(其中各“烷基”独立为上文定义的烷基基团)，包括 -CH2-NH-CH3、-CH2-NHCH2CH3、-CH2-NH(CH2)2CH3、-CH2-NH(CH2)3CH3、 -CH2-NH(CH2)4CH3、-CH2-NH(CH2)5CH3、-(CH2)2-NH-CH3、-CH2-N(CH3)2、 -CH2-N(CH2CH3)2、-CH2-N((CH2)2CH3)2、-CH2-N(CH3)(CH2CH3)、 -(CH2)2-N(CH3)2等。

此处所用的术语“具有无义密码子抑制活性的化合物”和“无义密码子抑 制剂”指在体外或体内可引起无义密码子通读的化合物，或其药学上可接受 的盐、前药、溶剂化物、水合物、多晶型或对映体。

此处所用的“治疗方案”指一个或多个治疗的时机和剂量方案。

此处所用的“预防性方案”指一个或多个治疗的时机和用药方案。

此处所用的“方案”包括用药安排和用药方案。

此处所用的“联合”指使用一种以上疗法。术语“联合”的使用不限制各疗 法被施用至患病个体的顺序。第一疗法可在第二疗法被施用至已患或易患 疾病的个体之前(例如，1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小 时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小 时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同时或之后(例 如，1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、 6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、 4周、5周、6周、8周或12周后)进行施用。该疗法可以一定的顺序在一定 的时间间隔内施用至个体，从而使本发明的试剂可以与其它疗法共同作用， 以提供较以其它方式施用更好的效果。可与其它密码子抑制剂联合施用的 疗法的非限制性范例包括镇痛药、麻醉剂、镇痉剂、支持性疗法以及其它 列举于美国药典和/或医生桌上参考手册(Physician′s Desk Reference)的疗 法。

此处所用的术语“控制”在向个体施用疗法的上下文中指个体从疗法中 获得的不导致该疾病的治愈的有益效果。在某些实施方式中，向个体施用 了一种或多种疗法以“控制”疾病，从而防止该疾病或其症状的进展或恶化。

此处所用的术语“疗法”指任何可用于预防、控制和/或治疗疾病或其症 状的方案、方法和/或试剂。在某些实施方式中，该术语“疗法”指可用于预 防、控制和/或治疗疾病或其症状的生物疗法、手术和/或支持性疗法。在具 体实施方式中，无义密码子抑制剂为一种疗法。

此处所用的术语“预防”在向个体施用疗法的上下文中指通过施用疗法 预防个体中疾病或其症状的发作、形成、复发、扩散和/或恶化。

此处所用的术语“治疗”在向个体施用疗法的上下文中指消除或缓解疾 病或与该疾病相关的症状。在某些实施方式中，该术语指通过向患有该疾 病的个体施用一种或多种疗法而使疾病的扩散或恶化的最小化。在其它实 施方式中，该术语指降低疾病或与该疾病相关的症状的严重性和/或延续时 间。

此处所用的术语“全长”在功能通读蛋白的上下文中指与相应野生型蛋 白相同数量的氨基酸残基组成的功能通读蛋白。

此处所用的术语“非野生型蛋白”指氨基酸序列与相应野生型蛋白不同 的蛋白。在某些实施方式中，该非野生型蛋白与相应野生型蛋白的区别仅 在于在非野生型蛋白中提前终止密码子编码位置处插入的氨基酸残基。在 其它实施方式中，该非野生型蛋白与相应野生型蛋白的区别在于：(i)在非 野生型蛋白中提前终止密码子编码位置处插入的氨基酸残基；和(ii)在非野 生型蛋白中提前终止密码子编码的氨基酸残基以外的氨基酸残基。

此处所用的术语“野生型”在涉及蛋白时指天然发现的蛋白(通常(但非 绝对)为主要蛋白)且被称为标准或参考蛋白。

此处所用的短语“功能通读蛋白”指由基因转录的RNA(例如，mRNA) 中的无义密码子的通读所生成的功能蛋白。在具体的实施方式中，短语“功 能通读蛋白”指由包含无义突变的基因转录的RNA中的无义密码子的通读 所生成的功能蛋白。在某些实施方式中，该功能通读蛋白与不具有无义突 变的基因编码的相应野生型蛋白由相同的氨基酸序列组成。在其它实施方 式中，该功能通读蛋白为功能非野生型蛋白。

此处所用的术语“皮肤疾病”指皮肤的疾病，特别指皮肤的表皮或真皮成 分的疾病，更特别地指皮肤的表皮成分的疾病。“表皮”包括角质层、透明层、 颗粒层、棘层和生发层(基底层、基底细胞层)。在具体的实施方式中，本发 明治疗、预防和/或控制的疾病不是皮肤疾病。

此处所用的术语“肠胃疾病”指胃肠(GI)道，包括口腔、咽、食道、胃和 十二指肠(例如小肠、大肠(例如结肠))的疾病。在具体的实施方式中，本发 明治疗、预防和/或控制的疾病不是肠胃疾病。

此处所用的术语“疾病”和“失调”可以互换使用。

此处所用的短语“与基因无义突变相关的疾病”和“与基因无义突变相关 的失调”可互换使用，指由基因无义突变直接或间接导致的疾病，其中该无 义突变阻止在感染细胞中生成野生型蛋白。与无义突变相关的疾病包括单 个基因中包含一个、两个、三个或更多无义突变的疾病，以及两个、三个 或更多(多个)基因中包含一个、两个、三个或更多无义突变的疾病。

此处所用的术语“功能”在功能通读蛋白的上下文中指具有足够的相应 野生型蛋白的功能，以在由于编码该蛋白的核酸序列(例如，基因)的突变(例 如，无义突变)而导致不生成或不足量生成野生型蛋白的细胞或个体中产生 有益效果的蛋白。

此处所用的术语“药学上可接受的盐”指由药学上可接受的无毒的酸或 碱(包括无机酸和碱以及有机酸和碱)制备的盐。本发明化合物适用的药学上 可接受的碱加成盐包括但不限于：由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制备的 金属盐，或由赖氨酸、N，N′-二苄乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、 乙二胺、甲葡胺(N-甲葡糖胺)和普鲁卡因制备的有机盐。适用的无毒酸包括 但不限于：无机和有机酸，例如醋酸、褐藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、 苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸、甲酸、富马酸、糠酸、半乳糖醛 酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、 乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲基磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、 苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、硫酸、酒石酸 和对甲苯磺酸。具体的无毒酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和甲磺酸。 具体盐的范例包括盐酸盐和甲磺酸盐。盐的其它范例已为本领域公知。例 如，参见，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing， Easton PA(1990)。

除非另行指明，此处所用的术语“前药”指在生物学条件下(体外或体内) 能水解、氧化或以其它方式反应而提供活性化合物(特别是本发明的化合物) 的化合物的衍生物。前药的范例包括但不限于：包含如可生物水解酰胺基、 可生物水解酯、可生物水解氨基甲酸酯、可生物水解碳酸酯、可生物水解 酰脲、以及可生物水解磷酸酯类似物的可生物水解部分的本发明化合物的 衍生物和代谢产物。优选地，具有羧基功能基团的化合物的前药为该羧酸 的低级烷基酯。该羧酸酯可通过将该分子上的任意羧酸部分酯化得以方便 地形成。前药通常可采用公知方法进行制备，例如在Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第6版(Donald J.Abraham编，2001，Wiley) 以及Design and Application of Prodrugs(H.Bundgaard编，1985，Harwood Academic Publishers Gmfh)中描述的方法。

除非另行指明，此处所用的术语“可生物水解酰胺”、“可生物水解酯”、 “可生物水解氨基甲酸酯”、“可生物水解碳酸酯”、“可生物水解酰脲”、以及 “可生物水解磷酸酯”分别指1)不干扰该化合物的生物活性但在体内可赋予 该化合物摄取、作用期限或作用发生等有利特性；或者2)无生物活性但在 体内可转化为生物活性化合物的化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 酰脲、以及磷酸酯。可生物水解酯的范例包括但不限于：低级烷基酯、烷 氧基酰氧基酯、烷基酰胺烷基酯、以及胆碱酯。可生物降解的酰胺的范例 包括但不限于：低级烷基酰胺、α-氨基酸酰胺、烷氧酰基酰胺以及烷氨烷羰 基酰胺。可生物水解氨基甲酸酯包括但不限于：低级烷胺、取代乙撑二胺、 氨基酸、羟烷胺、杂环和杂芳环胺以及聚醚胺。

除非另行指明，此处所用的术语“光学纯的”或“立体异构纯的”指基本没 有该化合物的另一立体异构体的化合物的立体异构体。例如，具有一个手 性中心的立体异构纯的化合物就基本上不含有该化合物的相对对映体。具 有两个手性中心的立体异构纯的化合物就基本不含有该化合物的其它非对 映异构体。典型的立体异构纯化合物包含大于约80％重量的该化合物的一 种立体异构体和少于约20％重量的该化合物的其它立体异构体，更优选大 于约90％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约10％重量的该化合物 的其它立体异构体，更优选大于约95％重量的该化合物的一种立体异构体 和少于约5％重量的该化合物的其它立体异构体，最优选大于约97％重量 的该化合物的一种立体异构体和少于约3％重量的该化合物的其它立体异 构体。

除非另行指明，此处所用的术语“立体异构纯的”指具有一个手性中心的 化合物的立体异构纯的组合物。

此处所用的术语“单位剂型”包括片剂；咀嚼片；囊片；胶囊，如软弹性 凝胶胶囊；药囊剂；扁囊剂；锭剂；糖锭；分散剂；粉末；溶液；凝胶； 适于向患者进行口服或黏膜施用的液体剂型，包括悬浮剂(例如，水或非水 液体悬浮剂)、乳剂(例如，水包油型乳剂、或油包水型乳剂)、溶液和酏剂； 以及可以重新配制为可通过口服或肠胃外施用至患者的液体剂型的无菌固 体(例如，结晶或非晶质固体)。该单位剂型不一定必须作为单个剂量施用。

此处所用的术语“库”在涉及化合物时指多个化合物。库可以是组合库， 例如采用组合化学技术合成的化合物的集合，或是各自占据独特的三维空 间的低分子量(小于1000道尔顿)的独特化合物的集合。

此处所用的术语“报告基因”指通过其确定提前翻译终止和/或无义介导 的mRNA降解的调节的基因。在具体的实施方式中，报告基因的表达可简 单地测定，并具有在获取细胞或翻译提取物的生物体中通常不能发现的活 性。

此处所用的“无义介导的mRNA降解”指介导包含提前翻译终止密码子 的mRNA降解的任意机制。

此处所用的术语“预先确定的参考范围”指特定测定的读数的参考范围。 在具体的实施方式中，该术语指特定细胞或特定的无细胞萃取物中报告基 因的表达和/或报告基因产物的活性的参考范围。在一些实施方式中，各个 实验室针对各个特定的测定、各个细胞类型和各个无细胞萃取物建立了其 自己的参考范围。在优选的实施方式中，在进行分析的各批化合物中包括 至少一个阳性对照和至少一个阴性对照。

应当指出如果在所示结构和对该结构所给的名称之间存在差异，则应 当侧重所示的结构。此外，如果一种结构或结构部分的立体化学未通过如 粗线或虚线等线条指出，则该结构或结构部分应解释为包含了其所有的立 体异构体。

5.2 具有无义突变抑制活性的示例化合物

在一个实施方式中，所述无义密码子抑制剂为具式I的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、外消旋体或立 体异构体，其中：

Z为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳 基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳烷 基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取 代的杂环烷基、取代或未取代的芳基羰基；

X为CH2、O、S或NH；

R1为氢，取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代 的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环、取代或未取代 的芳烷基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代 或未取代的杂环烷基；

R2为取代或未取代的烷基、羧基、酰胺基、酰基、烷基羰基、卤素、 可生物水解的基团、OP(O)3 2-、O[P(O)3]2 3-、O[P(O)3]3 4-、N3、CH2-NR6R7或 CH2-OR6；

R3、R3′、R4和R4′在各情况下独立为OR7、OR8、氢、卤素、取代或未 取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取 代的环烷基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳烷基、取代或未取 代的杂芳烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的杂环烷基、 取代或未取代的芳基羰基、取代或未取代的烷基羰基、可生物水解的基团， 或R3和R4一起形成键，或R3和R4与它们结合的原子一起形成取代或未取 代的杂环，或R3和R3′和/或R4和R4′与它们结合的碳一起形成C(＝O)；且

R6、R7和R8在各情况下独立为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取 代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取 代的杂环、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未 取代的环烷基烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基羰基、 取代或未取代的烷基羰基、可生物水解的基团，或R3和R4与它们结合的原 子一起形成取代或未取代的杂环。

优选的式I的化合物列举于下表1。

表1

具式I的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备式I的化合物的起始材料和中 间体可从商业途径获得，或可用商业途径购得的材料通过已知的合成方法 和试剂制备得到。

制备具式I的化合物的具体方法在2004年4月8日公开的US 2004-0067900中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，所述无义密码子抑制剂为式II的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、多晶型、前药或立体异构 体，其中：

X为C(＝O)、C(＝S)、S、S(＝O)或S(O)2；

Y为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂 芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环；

R为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取 代的杂环、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代 的芳烷基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代 或未取代的杂环烷基；

n为介于0-4的整数；

R1和R2各自独立为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、 取代或未取代的炔基、-(CH2)m-W、羧烷基、烷基羰基、烷氧基烷基、烷氧 基羰基、芳烷基、磺酰基、酰胺，或R1和R2与它们连接的原子一起形成任 选地被取代的5-7元杂环、任选地被取代的5-7元杂芳基环，或R1和R2一 起形成：

—CH2-CH2-，—(CH2)3-，—CH＝CH—；

W各情况下独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、羧基、醛、NH2、 NR14R14′、硝基、环烷基、杂芳基、杂芳烷基；

其中(i)各情况下R14和R14′独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代 或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或 未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或CF3； 或(ii)R14和R14′与它们连接的氮原子一起形成含有5至8个环原子(其中1至 3个为杂原子)的任选地被取代的杂环状环；

m为介于1-4的整数；

R3-R6各自独立地选自氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代 的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的 杂环、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳 烷基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未 取代的杂环烷基、烷氨基、氨烷基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、环烷氧 基、杂环烷氧基、酰胺、卤烷基(例如CF3)、卤烷氧基(例如OCF3或OCHF2)、 OH、CN、COOH、COOR15、SO2R15、NO2、NH2，或者NR14R14′和R15选 自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、 取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、 取代或未取代的杂芳基或CF3。

优选的式II的化合物列于下表2。

表2

式II的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备式II的化合物的起始材料和中 间体可从商业途径购得，或可由商业途径购得的材料采用已知的合成方法 和试剂制备得到。

制备具式II的化合物的具体方法在2004年1月29日公开的WO 2004/009558 A2中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂为具式III的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、前药、多晶型、立体异构 体，立体异构体包括对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物， 其中：

X为氧、硫、CO、SO或S(O)2；

Y为氧或硫，

Z为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环 烷基；

n为介于0至4的整数；

R1为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代 的炔基；取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代 的芳基、取代或未取代的杂芳基、SO2R7、CF3、CN、COOH、COR7或COOR7；

R0为氢、或与R1及它们结合的原子一起形成任选地被取代的5-7元杂 环、或杂芳基环；

R2、R3、R4和R5独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的 烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂 环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、 杂芳氧基、卤素、CF3、OCF3、OCHF2、CN、COOH、COOR7、SO2R7、 NO2、NH2或N(R7)2；

R6为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取 代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或任何可 生物水解的基团；以及

各情况下R7独立为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、 取代或未取代的炔基；取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、 取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧 基、卤素或CF3；

前提是，当X为O，Y为O，n为0且R1为氢时，Z不是4-氯苯基、 4-甲基苯基、3-氯苯基或2，4-二氯苯基；且前提是，当X为O，Y为O，n 为0，R1为氢，且Z为未取代的苯基时，R2-R5中至少一个不是氢；且前提 是，当R3为COOH，R2、R4和R5不全为卤素。

优选的式III的化合物列于下表3。

表3

式III的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备具式III的化合物的起始材料 和中间体可从商业途径购得，或可由商业途径购得的材料采用已知的合成 方法和试剂制备得到。

制备式III的化合物的具体方法在2004年1月29日公开的WO 2004/009533 A1中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂为式IV的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、前药、多晶型、立体异构 体，立体异构体包括对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物， 其中：

Z为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环 烷基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂环、 取代或未取代的芳烷基；

R1为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取 代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、 -(CH2CH2O)nR6或任何可生物水解的基团；

R2、R3、R4、R5和R6独立为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代 的烯基、取代或未取代的炔基；取代或未取代的环烷基、取代或未取代的 杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、烷氧基、芳氧 基、杂芳氧基、卤素、CF3、OCF3、OCHF2、CN、COOH、COOR7、SO2R7、 NO2、NH2或N(R7)2；

各情况下R7独立为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、 取代或未取代的炔基；取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、 取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基；烷氧基；芳氧基；杂芳氧 基、卤素或CF3；且

n为介于1至7的整数；

优选的式IV的化合物列于下表4。

表4

式IV的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备具式IV的化合物的起始材料 和中间体可从市场购得，或可由商业途径购得的材料采用已知的合成方法 和试剂制备得到。

制备式IV的化合物的具体方法在2004年10月14日公开的US 2004-0204461 A1中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂为式V的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、前药、多晶型、立体异构 体，立体异构体包括对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物， 其中：

X、Y和Z独立地选自N、S、O和C，其中X、Y或Z中至少一个为 杂原子；

R1为氢、C1-C6烷基、或Na+、或Mg2+；

R2独立地为缺失；氢；-CH＝N-OH基团；氰基基团；C1-C6烷基，其任 选地被羟基基团取代；羰基基团，其任选地被氢、羟基或C1-C4烷氧基取代；

R3独立地为缺失、卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基或硝基基团；

R4独立地为缺失、氢、C1-C6烷基，或与W一起时，R4可以是键，且 W与R4和W所连接的杂环形成一个十一至十三元杂三环的环状结构；

W选自：

(a)C2-C6炔基，其任选地被苯基取代；

(b)C1-C8直链或支链烷基，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基 团取代：C1-C6烷基；卤素；-C(＝O)-NH-苯基，其中苯基任选地被一个或多 个独立选择的卤素或C1-C4烷基的基团取代；五至六元杂环；C6-C8芳基， 其任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、 C1-C4烷氧基或任选地被一个或多个C1-C4烷基取代的氨基的基团取代；芳 氧基，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取代：羟基、卤素、 C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团或任选地被一个或多 个C1-C4烷基基团取代的氨基基团；

(c)C2至C8烯基；

(d)C3-C8环烷基，任选地被C1-C6烷基取代；

(e)C6-C8芳基，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取代：羟 基；卤素；C1-C4直链或支链烷基，其任选地被一个或多个独立选择的卤素 或羟基的基团取代；C1-C4烷氧基，其任选地被一个或多个独立选择的卤素 或苯基的基团取代；C3-C8环烷基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4 烷基的基团取代；C6-C8芳基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷 基的基团取代；芳氧基，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取 代：羟基、卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、 或被一个或多个C1-C4烷基基团任选地取代的氨基基团；五至六元杂环，其 任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取代：C1-C4烷基、氧代、或任 选地被独立地选自如下的基团取代的C6-C8芳基：羟基、卤素、C1-C4烷基 基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、或被一个或多个独立选择的 C1-C4烷基基团任选地取代的氨基基团；萘基基团，其任选地被氨基或氨烷 基或烷氧基基团取代；-C(O)-NRxRy基团；-C(O)-Rx基团；异吲哚-1，3-二酮 基团；硝基基团；氰基基团；-SO3H基团；烷硫基基团；烷基磺酰基团； -NRx-C(O)-Rz基团；-NRxRy基团；-NRx-SO2-Rz基团；-NRx-C(O)-NRxRy基 团；-NRx-C(O)O-Rz基团；

(f)C10-C14芳基基团，其任选地被一个或多个独立选择卤素、氨基基团 或氨烷基基团、或烷氧基基团取代；

(g)-C(O)-NRxRy基团；

(h)五或六元杂环，其任选地被一个或多个独立选择的如下的基团取 代：氧代基团；卤素；C1-C4烷基基团；C1-C4烷氧基基团；C1-C4卤烷基基 团；C1-C4卤烷氧基基团；芳氧基基团；-NRxRy基团；烷硫基基团；-C(O)-Rx 基团；或C6至C8芳基基团，其任选地被一个或多个独立选择的卤素、C1-C4 烷基基团、C1-C4烷氧基基团取代；

(i)具有二至三个环状结构的杂环基团，其任选地被一个或多个独立选 择的卤素、氧代基团、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、或C1-C4烷氧基 基团取代；

(j)或W与R4(包括当R4是一个键时)，和R4和W所连接的杂环一起 形成一个十一至十三元杂-三环的环状结构；

其中Rx为氢、C1-C6烷基基团，或Rx和Ry以及它们所连接的原子一起 形成四至七元碳环或杂环；

Ry为氢、C1-C6烷基基团；任选地被一个或多个独立地选择的C1-C4烷 基基团取代的芳基基团，或Rx和Ry与它们所连接的原子一起形成四至七元 碳环或杂环；和

Rz为C1-C6烷基，其任选地被芳基或卤素取代；或芳基，其任选地被卤 素、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代。

优选的式V的化合物列于下表5。

表5

式V的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备具式V的化合物的起始材料和 中间体可从市场购得，或可由商业途径购得的材料采用已知的合成方法和 试剂制备得到。

制备式V的化合物的具体方法在2005年10月13日提交的国际申请 PCT/US05/036673中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂为式VI的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、前药、多晶型、立体异构 体，立体异构体包括对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物， 其中：

W、X、Y和Z独立地选自N或C-Ra，其中Ra为氢或C1-C4烷基基团， 其中W、X、Y和Z中至少一个为N；

n为0、1、2或3；

R1为氰基基团；氨基甲酰，其任选地被一个或两个C1-C4烷基基团取代； 或羰基基团，其被羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基基团取代；

R为羟基基团；卤素；C1-C4烷基，其任选地被一个或多个独立选择的 卤素或羟基基团取代；C1-C4烷氧基，其任选地被一个或多个独立选择的卤 素或苯基基团取代；C4-C8环烷基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4 烷基基团取代；-Rb基团；-O-Rb基团；五至六元杂环，其任选地被一个或 多个独立选择的C1-C4烷基、氧代、或-Rb基团取代；具有两个环状结构的 九至十元杂环；羰基基团，其被羟基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基基团取 代；氨基甲酰基，其任选地被一个或两个C1-C4烷基基团取代；硝基基团； 氰基基团；任选地被羟基、C1-C4烷基、或-Rb基团取代的硫代；磺酰基， 其任选地被羟基、C1-C4烷基、或-Rb基团取代；氨基，其任选地被一个或 两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基基团取代，其中的所述氨基磺酰 基任选地被羟基、C1-C4烷基、或-Rb基团取代，且其中的所述氨基羰基基 团任选地被C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、苯甲酰氧基或被-Rb基团任选地取代 的氨基基团取代；或者两个R基团与它们所连接的苯环一起形成苯并[1，3] 二氧杂或2，3-二氢-苯并[1，4]二噁唑基(dioxinyl)基团，其中-Rb为C6-C8芳基， 任选地被一个或多个如下基团取代：羟基、卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4 卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、或任选第一个或多个C1-C4烷基基团取代 的氨基基团。

优选的式VI的化合物列于下表6：

表6

式VI的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备具式VI的化合物的起始材料 和中间体可从市场购得，或可由商业途径购得的材料采用己知的合成方法 和试剂制备得到。

制备式VI的化合物的具体方法在2005年10月13日提交的国际申请 PCT/US05/036764中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂为式VII的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、前药、多晶型、立体异构 体，立体异构体包括对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物， 其中：

A1为C、CH或N；

V和X独立地选自N或C；

W选自N、C或CH；

其中V、W或X中至少一个为N，且其中当W为N时，V或X中至 少一个也是N；

Y和Z独立地选自N、C、C-Rc、C＝O、C＝S，其中Rc为H、CH3或 NH2；前提是，当Y或Z之一为C＝O或C＝S时，另一个可选自NH、S或 O；

R1为羧基、氰基或羰基基团，任选地被C1-C4烷氧基基团取代；

R2缺失或为硝基；

Ar1为C1至C4烷基，任选地被R基团取代；C6至C10芳基，其任选地 被一个、两个或三个独立选择的R基团取代；五至十元杂环，其任选地被 一个、两个、三个独立选择的R基团取代；或与Ar2和Ar1和Ar2所连接的 杂环一起形成选自Ar1-2的环状结构；或与Ar3和Ar1和Ar3所连接的杂环一 起形成选自Ar1-3的环状结构；

Ar2缺失或与Ar1和Ar1和Ar2所连接的杂环一起形成选自Ar1-2的环状 结构；

Ar3缺失或与Ar1和Ar1和Ar3所连接的杂环一起形成选自Ar1-3的环状 结构；

Ar4缺失，或为C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、或C1-C4硫烷基，其中的任 何一个与A1一起形成四至七元碳环或杂环；

R为氢；-Ra基团；或两个R基团，其中R还可包括氧基团，与它们所 连接的苯基或杂环一起形成选自RR的环状结构；

其中：

Ar1-2和Ar1-3选自十一至十四元杂-三环环状结构，其任选地被一个或多 个卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、任选地被卤素或C1-C4烷氧基 基团取代的C1-C4烷氧基基团、C1-C4卤烷氧基基团、或任选地被羰基基团(被 C1-C4烷基基团取代)取代的氨基基团取代；

RR为九至十元双环环状结构，其任选地被一个或多个卤素、C1-C4烷 基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、氧代基团或C1-C4卤烷氧基 基团取代；

Ra选自：羟基基团；卤素；C1-C4烷基，其任选地被一个或多个独立选 择的卤素或羟基基团取代；C1-C4烷氧基，其任选地被一个或多个独立选择 的卤素或苯基基团取代；C4-C8环烷基，其任选地被一个或多个独立选择的 C1-C4烷基基团取代；-Rb基团；-O-Rb基团；四至六元杂环，其任选地被一 个或多个独立选择的C1-C4烷基基团、氧代或-Rb基团取代；具有两个环状 结构的九至十元杂环；羰基，其任选地被羟基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基 基团取代；氨基甲酰，其任选地被一个或两个C1-C4烷基基团取代；硝基基 团；氰基基团；任选地被羟基、C1-C4烷基基团或-Rb基团取代的硫代；磺 酰基，其任选地被羟基、C1-C4烷基基团或-Rb基团取代；或氨基，其任选 地被一个或两个独立选择的C1-C4烷基、磺酰基或羰基基团取代，其中的所 述氨基磺酰基基团任选地被羟基、C1-C4烷基或-Rb基团取代，且其中的所 述氨基羰基被C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、苯甲酰氧基或任选地被-Rb基团取 代的氨基基团取代；和

其中-Rb为C6-C8芳基，其任选地被一个或多个如下基团取代：羟基、 卤素、C1-C4烷基基团、C1-C4卤烷基基团、C1-C4烷氧基基团、或任选地被 一个或多个C1-C4烷基基团取代的氨基基团。

优选的式VII的化合物列于下表7：

表7

式VII的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备具式VII的化合物的起始材料 和中间体可从市场购得，或可由商业途径购得的材料采用已知的合成方法 和试剂制备得到。

制备式VII的化合物的具体方法在2005年10月13日提交的国际申请 PCT/US05/036761中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂为式VIII的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、前药、多晶型、立体异构 体，立体异构体包括对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物， 其中：

Y和Z独立地选自N或C；

W为N或CH；

n为0、1、2或3；

R1为氢，被羧基基团任选地取代的C6至C8芳基，或当Z为N时R1 缺失；

R2为氢；C6至C8芳基，其任选地被一个、两个或三个独立选择的Ra 基团取代；四至七元杂环，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C6烷基基 团取代，或三至七元杂环；或当Y为N时R2缺失；

R独立地选自卤素；羧基基团；C1-C6烷基基团，其任选地被四至七元 杂环、C6-C8芳氧基基团或氨基基团取代，其中该四至七元杂环、C6-C8芳 氧基基团或氨基基团任选地被一个或两个独立选择的C1-C6烷基或C6-C8芳 基基团取代，其中该C6-C8芳基基团任选地和独立地被一个或多个C1-C6烷 基烷基基团取代；C1-C6烷氧基；C6-C8芳氧基；C6-C8芳基，其任选地被一 个或多个独立选择的卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤烷基、氧代、C1-C4烷氧基 或C1-C4卤烷氧基基团取代；氨基基团，其任选地被一个或两个独立选择的 C6-C8芳基或C1-C6烷基基团(其任选地被羟基、C6-C8芳基或具有两个环状 结构的九至十元环取代)取代；羰基基团，其被五至六元杂环基团取代；四 至七元杂环基团，其任选地被一个或多个C1-C4烷基或氧代基团取代；具有 两个环状结构的九至十元杂环；或双R基团，其中R还可包括氧代基团， 与它们所连接的杂-双环一起形成具有三个环状结构的十二至十三元杂环； 和

其中Ra为卤素；C1-C6烷基；C1-C6烷氧基，其任选地被一个或多个独 立选择的卤素基团取代；C6-C8芳基；四至七元杂环，其任选地被一个或多 个独立选择的氧代基团取代；羰基，其任选地被羟基或C1-C6烷氧基基团取 代；氨基甲酰基；氨基，其任选地被独立选择的C1-C6烷基基团取代，其中 该C1-C6烷基基团任选地被一个或多个独立选择的卤素或羟基基团取代；或 两个Ra基团，其中Ra还可包括氧代基团，与它们所连接的C6至C8芳基基 团一起形成具有两个环状结构的九至十元杂环，其中该具有两个环状结构 的九至十元杂环任选地被一个或多个独立选择的卤素取代。

优选的式VIII的化合物列于下表8。

表8

式VIII的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参 见，例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备具式VIII的化合物的起始材料 和中间体可从市场购得，或可由商业途径购得的材料采用己知的合成方法 和试剂制备得到。

制备式VIII的化合物的具体方法在2005年10月13日提交的国际申请 PCT/US05/036762中有公开，其全文在此引用作为参考。

在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂为式IX的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、包合物、前药、多晶型、立体异构 体，立体异构体包括对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物， 其中：

X为卤素；

R为C1-C8烷基基团；C1-C4卤烷基基团；-OR1基团；或氨基基团，其 任选地被一个或两个独立选择的R2基团取代；

R1为C1-C8烷基基团，其任选地被一个或多个独立选择的Ra基团取代； -Rb基团；吡咯烷基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基或氧代 基团取代；哌啶基，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基基团、苯 甲基基团或羧基基团(其任选地被一个或多个C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基团 取代)取代；四氢呋喃基团；四氢吡喃基团；四氢萘基基团；或茚满基基团；

R2为氢、C1-C6烷基基团；C1-C4卤烷基基团；C1-C4烷氧基基团；-Rb 基团；嘧啶基基团；吡啶基基团；任选地被-Rb基团取代的磺酰基基团；或 两个R2与它们结合的氨基一起形成任选地被苯基取代的吗啉基基团、吡咯 烷基基团、异吲哚基基团、或哌嗪基基团；

其中Ra为卤素；C1-C4烷氧基基团；氨基甲酰基，其任选地被一个或两 个独立选择的C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基团取代；膦酰基基团，其任选地 被一个或两个独立选择的C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基团取代；吗啉基基团； 吡啶基基团；或-Rb基团；和

其中Rb为C6-C8芳基，其任选地被一个或多个独立地选自如下的基团 取代：羟基；卤素；C1-C4烷基基团；C1-C4卤烷基基团；C1-C4烷氧基基团； 或氨基基团，其任选地被一个或多个独立选择的C1-C4烷基基团取代。

优选的式IX的化合物列于下表9。

表9

式IX的化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方法可参见， 例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和 Structure，第4版，1992。因此，可用于制备具式X的化合物的起始材料和 中间体可从市场购得，或可由商业途径购得的材料采用已知的合成方法和 试剂制备得到。

制备式IX的化合物的具体方法在2005年10月13日提交的国际申请 PCT/US05/037052中有公开，其全文在此引用作为参考。

此处所述的化合物的无义密码子抑制活性可通过5.4节所述的报告测 定法进行检测。在具体的实施方式中，此处所述的化合物的无义密码子抑 制活性可采用基于细胞的荧光素酶报告测定法进行检测，该测定中包含了 被稳定转染至293T人胚胎肾细胞的含有UGA提前终止密码子的荧光素酶 报告构建体。已知一种允许提前终止密码子通读的小分子3-[3-(4-异丙基- 苯基)-2，5-二氧代-咪唑烷-1-基]-苯甲酸可被用作内标。活性的测量基于在细 胞中生成给定蛋白所需的化合物的最小浓度(潜能)和该细胞生成蛋白的最 大数量(效力)之间的定量关系。

相信在基于细胞的荧光素酶测定中具有较低显著性蛋白合成潜能或效 力或两者的化合物仍可用于在本发明的体内方法中。

5.3 示例化合物的合成和制备

此处所述的示例化合物可通过标准的、公知的合成方法获得，该类方 法可参见，例如，March，J.Advanced Organic Chemistry；Reactions Mechanisms和Structure，第4版，1992。因此，可用于制备该示例化合物 的起始材料和中间体可从商业途径购得，或可由商业途径购得的材料采用 已知的合成方法和试剂制备得到。

可获得此处所述的示例化合物的具体方法至少在2004年4月8日公开 的US 2004/0067900、2004年1月29日公开的WO 2004/009558 A2，2004 年1月29日公开的WO 2004/009533 A1、2004年10月14日公开的US 2004-0204461 A1、2005年10月13日提交的国际申请PCT/US2005/036673、 2005年10月13日提交的国际申请PCT/US2005/037052、2005年10月13 日提交的国际申请PCT/US2005/036764、2005年10月13日提交的国际申 请PCT/US2005/036762、2005年10月13日提交的国际申请 PCT/US2005/036761中有描述，其全文在此引用作为参考。

5.4 鉴定无义密码子抑制剂的方法

抑制提前翻译终止和/或无义介导的mRNA降解的化合物可通过本领 域技术人员已知的技术进行鉴定。例如，参见，2005年10月20日公开的 题为“Methods for Identifying Small Molecules that Modulate Premature Translation Termination and Nonsense Mediated mRNA Decay(调节提前翻译 终止和无义介导的mRNA降解的小分子的鉴定方法)”的美国公开 2005/0233327；题为“Methods of Assaying for Compounds that Inhibit Premature Translation Termination and Nonsense Mediated RNA Decay(抑制 提前翻译终止和无义介导的RNA降解的化合物的测定方法)”的美国专利 6,458,538；2003年1月9日公开的题为“Methods of Assaying for Compounds that Inhibit Premature Translation Termination and Nonsense Mediated RNA Decay(抑制提前翻译终止和无义介导的RNA降解的化合物的测定方法)”的 美国公开2003/0008317；以及题为“Methods of Assaying for Compounds that Inhibit Premature Translation Termination and Nonsense Mediated RNA Decay(抑制提前翻译终止和无义介导的RNA降解的化合物的测定方法)”的 国际申请公开WO 2004/010106，其全文分别在此引用作为参考。具体地， 可采用基于细胞的和无细胞的测定法来鉴定抑制提前翻译终止和/或无义介 导的mRNA降解的化合物。

在一个实施方式中，本发明提供了抑制提前翻译终止和/或无义介导的 mRNA降解的化合物的鉴定方法，所述方法包括：(a)将化合物或者化合物 库的成员与带有包含报告基因的核酸序列的细胞相接触，其中该报告基因 包含提前终止密码子；和(b)检测所述报告基因的表达，其中相对于预先测 定的参考范围或所述报告基因在不存在所述化合物或存在合适对照(例如， 阴性对照)时的表达和/或活性，如果在存在化合物时所述报告基因的表达和 /或活性有所提高，则鉴定得到抑制提前翻译终止和/或无义介导的mRNA 降解的化合物。在另一实施方式中，本发明提供了抑制提前翻译终止和/或 无义介导的mRNA降解的化合物的鉴定方法，所述方法包括：(a)将化合物 或者化合物库的成员与包含报告基因的无细胞萃取物和核酸序列相接触， 其中该报告基因包含提前终止密码子；和(b)检测所述报告基因的表达，其 中相对于预先测定的参考范围或所述报告基因在不存在所述化合物或存在 合适对照(例如，阴性对照)时的表达和/或活性，如果在存在化合物时所述 报告基因的表达和/或活性有所提高，则鉴定得到抑制提前翻译终止和/或无 义介导的mRNA降解的化合物。根据该实施方式，该细胞萃取物可从在约 0℃至约10℃下孵育过的细胞中分离得到，并且/或者是S10至S30无细胞 萃取物。

根据本发明，此处所述的基于报告基因的测定中化合物与细胞或无细 胞萃取物和核酸序列的接触步骤优选在包含缓冲液和盐的组合(例如KCl、 NaCl和/或MgCl2)的水溶液中进行。在水溶液中使用的各种盐的最佳浓度取 决于例如由该核酸序列编码的蛋白、多肽或肽(例如，调节蛋白)以及所用的 化合物，并可通过常规实验进行检测。在具体的实施方式中，该水溶液接 近或模仿生理条件。在另一具体的实施方式中，该水溶液进一步包含去污 剂或表面活性剂。

本发明的测定可采用不同的孵育时间。在基于细胞的系统中，该细胞 和化合物或化合物库的成员在检测报告基因的表达和/或活性前共同孵育至 少0.2小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小 时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、至少1天、至少2天或 至少3天。在无细胞系统中，该无细胞萃取物和该核酸序列(例如，报告基 因)可在添加化合物或化合物库成员前共同孵育。在某些实施方式中，该无 细胞萃取物与核酸序列(例如，报告基因)在化合物或化合物库成员添加前至 少孵育0.2小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5 小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时或至少1天。在其它实 施方式中，该无细胞萃取物或该核酸序列(例如，报告基因)在添加该核酸序 列(例如，报告基因)或该无细胞萃取物前分别与化合物或化合物库成员共同 孵育。在某些实施方式中，化合物或化合物库的成员与核酸序列(例如，报 告基因)或无细胞萃取物在添加剩余成分(即，分别为无细胞萃取物或核酸序 列(例如，报告基因))前至少孵育0.2小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2 小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小 时或至少1天。一旦反应容器包含该成分(即，化合物或化合物库的成员， 该无细胞萃取物和该核酸序列(例如，报告基因))，该反应可进一步孵育至 少0.2小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小 时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时或至少1天。

在基于报告基因的测定中可连续检测反应的进展。可替代地，可在反 应的不同时间的时间点监测基于报告基因的测定中的反应进展。

此处所述的基于报告基因的测定可在经遗传工程改造后表达该报告基 因的细胞中进行。可替代地，此处所述的基于报告基因的测定可在天然表 达在基因编码区包含无义突变的报告基因的细胞中进行。本领域技术人员 公知的任意物种的任意细胞或细胞系均可用于本发明所述的方法。此外， 无细胞萃取物可来自本领域技术人员公知的任意物种的任意细胞或细胞 系。细胞和细胞类型的范例包括但不限于：人细胞、培养的小鼠细胞、培 养的大鼠细胞或中国仓鼠卵巢(＂CHO＂)细胞。

在此处所述的基于报告基因的测定中采用的该报告基因构建体包含报 告基因的编码区以及导致提前翻译终止和/或无义介导的mRNA降解的提 前终止密码子。优选地，该提前终止密码子为该报告基因的野生型终止密 码子的N末端，且其位置使得对提前终止密码子的抑制方便检测。在具体 的实施方式中，在此处所述的基于报告基因的测定中采用的该报告基因构 建体包含报告基因编码区，该编码区包含来自报告基因开发阅读框架中离 起始密码子至少15个核苷酸、优选25至50个核苷酸、50至75个核苷酸、 75至100个核苷酸、100至300个核苷酸、100至500个核苷酸、100至750 个核苷酸或100至1000个核苷酸的提前终止密码子。在另一实施方式中， 在此处所述的基于报告基因的测定中采用的报告基因构建体包含报告基因 编码区，该编码区包含来自报告基因开发阅读框架中离野生型终止密码子 至少15个核苷酸、优选25至50个核苷酸、50至75个核苷酸、75至100 个核苷酸、100至150个核苷酸、150至300个核苷酸、300至500个核苷 酸、500至750个核苷酸或500至1000个核苷酸的提前终止密码子。在另 一实施方式中，在此处所述的基于报告基因的测定中采用的报告基因构建 体包含报告基因编码区，该编码区包含UAG和/或UGA提前终止密码子。 在另一实施方式中，在此处所述的基于报告基因的测定中采用的报告基因 构建体包含报告基因编码区，该编码区包含在UGAA、UGAC、UGAG、 UGAU、UAGA、UAGC、UAGG、UAGU、UAAA、UAAC、UAAG或UAAU 中的提前终止密码子。

本领域技术人员公知的任意报告基因均可用于此处所述的报告基因构 建体。报告基因的获得以及该元件的核苷酸序列的测定均可通过本领域技 术人员公知的方法进行。报告基因的核苷酸序列可从，例如，文献或 GenBank等数据库获得。可替代地，编码报告基因的多聚核苷酸可由适当 来源的核酸生成。当对报告基因的核苷酸序列进行测定后，可采用本领域 公知的操作核苷酸序列的方法(如重组DNA技术、定点突变、PCR等(例如， 参见Sambrook等人，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY以及Ausubel等人编， 1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY所述的 技术，其全文在此引用作为参考))对报告基因的核苷酸序列进行操作，以生 成具有不同氨基酸序列(例如形成氨基酸替换、删除、和/或插入)的报告基 因。

在具体的实施方式中，报告基因是具有提前终止密码子的任意天然存 在的基因。可用于本发明的具有提前终止密码子的基因包括但不限于此处 所述的基因。在替代性的实施方式中，报告基因为在自然界中未知的包含 提前终止密码子的任意基因。报告基因的范例包括但不限于：编码萤火虫 荧光素酶的基因、编码海肾荧光素酶的基因、编码叩头虫荧光素酶的基因、 编码绿色荧光蛋白的基因、编码黄色荧光蛋白的基因、编码红色荧光蛋白 的基因、编码青色荧光蛋白的基因、编码蓝色荧光蛋白的基因、编码β-半 乳糖苷酶的基因、编码β-葡萄糖醛酸苷酶的基因、编码β-内酰胺酶的基因、 编码氯霉素乙酰转移酶的基因、以及编码碱性磷酸酶的基因。

此处所述的测定中采用的化合物可以是化合物库的成员。在一个实施 方式中，该化合物选自包含类肽；随机的生物低聚物；diversomers，如乙内 酰脲、苯并二氮和二肽类等；插烯(vinylogous)多肽；非肽类肽类似物；低 聚氨基甲酸酯；肽基磷酸酯；肽核酸库；抗体库；糖库；以及小有机分子 库的化合物组合库。在具体的实施方式中，该小有机分子库为苯并二氮类、 异戊烯类、噻唑啉酮类、间噻嗪酮类、吡咯烷类、吗啉化合物或二氮杂二 酮类的库。

在某些实施方式中，该化合物在池中筛选。鉴定得到阳性池后，对该 池的单个化合物进行单独测试。在某些实施方式中，该池的大小为至少2 个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100 个、至少150个、至少200个、至少250个或至少500个化合物。

本领域已知的用于检测蛋白表达的任意方法均可用于检测根据本发明 生成的功能通读蛋白的表达。该种方法的非限制性范例包括免疫测定例如 Western印迹，免疫沉淀接连十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)，免疫细胞化学，放射性免疫测定，ELISA(酶联免疫吸附分析)， “夹心”免疫测定，免疫沉淀测定，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫 扩散测定，凝集测定，补体-固定测定，免疫放射分析，荧光免疫测定，蛋 白A免疫测定以及使用特异性针对目标基因编码的多肽的抗体的表位标 记。在具体的实施方式中，在免疫测定中采用的抗体对免疫测定中所用的 多肽的C末端部分具有特异性。这些均为常规测定并在本领域公知(例如， 参见Ausubel等人编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷， John Wiley & Sons，Inc.，New York，其全文在此引用作为参考)。下文简述了 示范性的免疫测定(但并非进行限制)。

免疫沉淀方案通常包括在添加了蛋白磷酸酯酶和/或蛋白酶抑制剂(例 如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40 或Triton X-100、1％脱氧胆酸盐、0.1％SDS、0.15M NaCl、pH7.2的0.01M 磷酸钠、1％特血尔(Trasylol))中裂解一定量的细胞，向细胞裂解产物添加识 别该抗原的抗体，在40℃下培养一定时间(例如，1-4小时)，向细胞裂解产 物添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在40℃下培养一小时或更多时间， 以裂解缓冲液洗涤珠子并将珠子重新悬浮于SDS/样本缓冲液中。抗体免疫 沉淀特定抗原的能力可通过，例如，western印迹分析进行评价。本领域的 技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高抗体与抗原的结合，并降低 背景干扰(例如，以琼脂糖珠预先去除细胞裂解产物)。有关免疫沉淀方案的 进一步讨论可参见，例如Ausubel等人编，2003，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第10章。

Western印迹分析通常包括制备蛋白样本，将蛋白样本在聚丙烯酰胺凝 胶(例如，根据抗原的分子量选择8％-20％SDS-PAGE)中进行电泳，将蛋白 样本从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜如硝化纤维、PVDF或尼龙上，在封闭液(例 如，含有3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭膜，以洗涤缓冲液(例如， PBS-Tween 20)清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的一抗(识别该抗原的抗体)封 闭膜，在洗涤缓冲液中清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的结合至酶底物(例如， 辣根过氧化酶、碱性磷酸酶)或放射性底物(例如，32p或125I)的二抗(可识别 该一抗，例如抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中清洗膜，并检测抗原的存 在。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高检测到的信号 并降低背景噪音。有关western印迹方案的进一步讨论可参见，例如Ausubel 等人编，2003，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第10章。

ELISA包括制备抗原，以抗原涂布96孔微量滴定板的孔，向孔中添加 与可测化合物如酶底物(例如，辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)结合的一抗(其 识别该抗原)并孵育一段时间，检测抗原的存在。在ELISA中该目标抗体并 非必须连接至可测化合物；事实上可向孔中添加一种结合了可测化合物的 二抗(可识别一抗)。此外，除了用抗原涂布微孔外，也可以使用抗体涂布微 孔。在这一情况下，在添加目标抗原后可能要向涂布的微孔中添加结合了 可测化合物的二抗。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提 高检测到的信号以及其它本领域已知的ELISA变量。有关ELISA的进一步 讨论可参见，例如Ausubel等人编，2003，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

检测由包含无义突变的报告基因编码的功能通读蛋白活性的方法将随 所用的报告基因而变化。各种报告基因的测定已为本领域技术人员公知。 例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶(＂β-gal＂)、β-葡萄糖醛酸苷酶(＂GUS＂)、β-内 酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(＂CAT＂)以及碱性磷酸酶(＂AP＂)为可在底物存在 下进行分析并可适用于高通量筛选的酶。例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶 (＂β-gal＂)和碱性磷酸酶(＂AP＂)的反应产物可通过光成像(例如，荧光素酶)、 分光光度吸收(例如，＂β-gal＂)或荧光(例如，AP)的变化进行测定。光输出、 吸收和/或荧光的变化的测定可在高通量筛选中简单地采用。例如，β-gal活 性可通过酶标仪进行检测。绿色荧光蛋白(＂GFP＂)活性可通过荧光的变化进 行检测。例如，对于在488nm下发荧光的突变GFP，可采用标准的荧光激 活细胞分类(＂FACS＂)设备根据GFP活性分离细胞。

以下描述了基于细胞的报告基因测定的具体实例：制备报告构建体， 该报告构建体能够基于荧光素酶介导的化学发光对翻译通读的水平进行定 量评价。以在氨基酸位置190处包含提前终止密码子的北美萤火虫荧光素 酶基因稳定转染生长于培养基(例如，含胎牛血清(FBS)的培养基)中的细胞 (例如，HEK293细胞)。代替通常存在于所述位点的苏氨酸密码子(腺苷-胞 啶-腺苷(ACA))，通过定点突变导入3个可能的无义密码子(UAA、UAG或 UGA)中的一个以及在无义密码子后的环境(contextually)重要的下游+1位置 处的4个可能的核苷酸(C、U、A、G)中的一个。图1提供了整合进入这些 构建体的多类荧光素酶mRNA的示意图。将不同浓度的目标化合物、阳性 对照(例如，庆大霉素)或阴性对照(例如，仅溶剂(例如，PBS、DMSO或水)) 添加到该细胞，大约四小时后检测生成的发光量。发光可采用ViewLux CCD 成像仪(Perkin-Elmer，Turku，芬兰)进行检测。发光数据被归一化为由溶剂 单独产生的数据，相对背景的抑制倍数计算为化合物发光单位/溶剂发光单位。

在对照细胞(仅用溶剂处理)中，荧光素酶基因的翻译被荧光素酶mRNA 中存在的提前终止密码子中断，并生成不能有效催化化学发光反应的截短 的、非功能的荧光素酶蛋白。然而，当能够诱导提前终止密码子的核糖体 通读的化合物存在时，可生成全长荧光素酶蛋白，并能够对相对于对照的 相应发光进行量化。

以下描述了无细胞报告基因测定的具体实例：采用MegaScript体外T7- 启动子转录试剂盒(Ambion，Austin，TX)制备在位置190处具有提前终止密 码子(具有+1A)的荧光素酶mRNA。将该mRNA与从细胞(例如，HeLa细胞) 制备的包含核糖体和其它翻译必需细胞因子的细胞质萃取物进行孵育。将 不同浓度的目标化合物、阳性对照(例如，具有无义抑制活性的化合物)或阴 性对照(例如，单独的溶剂(例如，PBS、DMSO或水))添加入该体外反应， 大约4小时后检测生成的发光量。发光可采用ViewLux CCD成像仪 (Perkin-Elmer，Turku，芬兰)进行检测。发光数据被归一化为由溶剂单独产 生的数据，相对背景的抑制倍数计算为化合物发光单位/溶剂发光单位°

在对照萃取物(仅用溶剂处理)中，荧光素酶mRNA的翻译被荧光素酶 mRNA中存在的提前终止密码子中断，并生成不能有效催化化学发光反应 的截短的、非功能的荧光素酶蛋白。然而，当能够诱导提前终止密码子的 核糖体通读的化合物存在时，可生成全长荧光素酶蛋白，并能够对相对于 对照的相应发光进行量化。如果化合物能够在不含核的细胞质萃取物中诱 导全长荧光素酶蛋白的生成，则表明该化合物的无义通读活性发生在翻译 水平而非转录水平。

化合物的无义抑制活性可在个体或动物模型的细胞，例如来自mdx小 鼠的细胞中进行评价，该细胞包含含有与人类疾病相关的无义突变的基因。 该mdx小鼠在肌营养不良蛋白基因的外显子23中具有无义突变，其可在肌 营养不良mRNA中生成提前UAA(+1A)终止密码子(Sicinski等人，Science 244：1578-1580(1989))，并导致几乎完全不生成全长蛋白。

以下描述了用来自动物模型的细胞进行的报告基因测定的具体实例， 该细胞含有与人类疾病相关的无义突变的基因：原代成肌细胞通过已建立 的方法取自1天大新生mdx小鼠(Neville等人(编)，Methods in Cell Biology， 第52卷，第85-116页，San Diego，Academic Press(1998)；以及Barton-Davis 等人，J.Clin.Invest.104(4)：375-381(1999))。吸附至塑料碟后，在添加了目 标化合物或阳性对照(即，具有无义密码子抑制活性的化合物)的含血清培养 基中使细胞分化成为肌管。每隔一天补充培养基和化合物，并在12日通过 免疫荧光检测肌营养不良蛋白和肌球蛋白。各自的阴性和阳性对照包含未 处理的mdx和野生型C57/B16小鼠原代肌培养物。染色的程度采用a-、+1、 +2、+3和+4半定量等级进行评价。具有无义抑制活性的目标化合物将导致 生成全长肌营养不良蛋白。

包含了具有与人类疾病相关的无义突变的基因的动物模型系统可用于 确认在报告测定中鉴定的化合物的无义密码子抑制剂活性。例如，化合物 的无义密码子抑制剂活性可在mdx或CFTR小鼠模型中进行评价。针对人 类疾病的其它动物模型系统的范例参见，例如，国际公布WO 2004/001010， 其全文在此引用作为参考。

在具体的实例中：mdx小鼠在2至12或更多星期的期间内被施用目标 化合物、阳性对照(即，具有无义密码子抑制活性的化合物)或阴性对照(例 如，单独的运载体)。所有的小鼠以等张液体要素饮食(Nestlé， 血清CK活性通过市售的NADH-连接的动力学测定进行评价(Diagnostic Chemicals Limited，Oxford，CT))进行喂养。用于血清肌酸酐激酶(CK)检测的 血液以不同的时间间隔采集。在治疗的末期，将小鼠处死。采集血液以评 价血清CK水平。去除胫前(TA)肌和趾长伸(EDL)肌以进行后续分析。将TA 快速冷冻以进行肌营养不良蛋白整合进入横纹肌的免疫荧光分析。将EDL 用于功能(包括离心收缩损伤的强度和易感性)测试。

肌营养不良蛋白的一抗为市售的针对对应人肌营养不良蛋白的羧基末 端附近序列的合成肽的兔多克隆抗体(Abcam 15277)。该抗体与小鼠肌营养 不良蛋白交叉反应。该表位位于mdx小鼠的肌营养不良蛋白基因的外显子 23编码的提前终止位点的更下游(更朝向肌营养不良蛋白的羧基末端)。以 连接在入射荧光显微镜的数码摄像机捕捉图像，并以图像分析软件进行处 理。

采用专门设计的装置在EDL肌肉(包括可制备双侧制备物的动物中的 各EDL肌肉)上进行分离的全肌肉力学研究(Barton-Davis等人，PNAS USA 95(26)：15603-15607(1998))。对EDL的比力(每单位横截面积上的力)进行 分析。对针对一系列5个离心收缩(其牵张为10％的最佳长度)诱导的机械 损伤所提供的保护进行评价；损伤测定为第一和最后离心收缩之间的力的 百分比损失。

血清CK活性采用市售的NADH连接的动力学测定(Diagnostic Chemicals Ltd.，Oxford，CT)进行评价。

相对于未处理mdx小鼠的肌肉，以具有无义密码子抑制活性的化合物 处理的mdx小鼠会显示出肌营养不良蛋白的可见着色。相对于未处理mdx 小鼠或运载体对照处理的mdx小鼠的平均EDL力，以具有无义密码子抑制 活性的化合物处理的mdx小鼠还提高了平均EDL比力。以具有无义密码子 抑制活性的化合物处理的mdx小鼠还会保护以免受离心收缩损伤。此外， 以具有无义密码子抑制活性的化合物处理的mdx小鼠相对于未处理mdx小 鼠或运载体对照处理的mdx小鼠会降低血清CK。

在另一具体的实例中：为了评价目标化合物对无义密码子抑制的作用， 以该化合物、阴性对照或阳性对照处理cftr-/-FABP-hCFTR-G542X小鼠一 周或更长时间。阴性对照组包含未处理的cftr-/-FABP-hCFTR-G542X小鼠。 阳性对照组包含接受了已知具有无义密码子抑制活性的化合物的cftr-/- FABP-hCFTR-G542X小鼠。在十二指肠切片上进行CFTR特异性免疫荧光 染色以证实CFTR的生成。也可评价目标化合物对CFTR-介导的经上皮氯 电导的功能影响。具有无义密码子抑制活性的化合物将导致定位于十二指 肠分粘膜腺体的上皮顶端区的CFTR免疫荧光染色的阳性结果。此外，在 添加毛喉素而导致环腺苷酸(cAMP)升高后，具有无义突变抑制活性的化合 物还会导致经上皮氯电导的强烈上升。

一旦抑制提前翻译终止和/或无义介导的mRNA降解的化合物被鉴定， 则该化合物的结构可采用公知的技术或者通过参考预定的规范进行测定。 例如，该化合物的结构可通过质谱、NMR、振动光谱或X射线晶体学进行 测定。

为了评价化合物对此处所述的报告测定的部分作用是否是通过报告基 因mRNA水平的变化来介导的，采用实时反转录PCR测定法(Bustin，J.Mol. Endocrinol.25(2)：169-193(2000))。以高浓度的目标化合物处理生长于培养 基(例如，含FBS的培养基)中的细胞(例如，HEK293细胞)48小时。该实验 还包括阴性对照细胞(以单独的溶剂处理)和阳性对照细胞(以已显示能使含 有无义突变的mRNA稳定的化合物处理)。从细胞裂解产物萃取总RNA。 采用针对报告基因mRNA和18S核糖体RNA(rRNA)的引物进行定量实时 PCR。以18S rRNA的测量作为起始原料数量的归一化因子，计算处理细胞 相对对照细胞的报告基因mRNA的水平。

化学足迹法可用于对目标化合物和rRNA相互作用的位点进行定位。 在这些实验中，将由细胞(例如，HeLa细胞)制备的核糖体与运载体对照或 目标化合物共同孵育，然后与用能改变rRNA结构的2种化学修饰剂(硫酸 二甲酯或凯托沙(kethoxal))进行处理。化学修饰反应后，分离rRNA，并采 用末端标记的，被杂交至人28S、18S和5.8S rRNA的不同区域的寡核苷酸 进行引物延伸分析。在6％聚丙烯酰胺凝胶上分辨引物延伸的产物。rRNA 对硫酸二甲酯或凯托沙的化学修饰的可及性可显示为凝胶上条带强度的出 现、消失或变化；任意该类事件可认为是该化合物对rRNA上特定区域的 潜在作用的指示。该凝胶上条带的出现与对化学修饰剂的新导入的可及性 一致(例如，作为引起rRNA中构象变化的化合物相互作用的结果)。相反地， 条带的消失与对化学修饰剂的新导入的不可及性相一致(例如，由于化合物 结合或rRNA中碱基配对的改变而对位点产生保护)。

根据其诱导提前终止密码子的特异性核糖体通读的能力和不诱导普通 终止密码子的非特异性核糖体通读的能力，在体外评价目标化合物的特异 性。例如，将荧光素酶报告体连接至其它蛋白(例如，CD40蛋白)。CD40 是由B-淋巴细胞和其它免疫细胞表达的细胞表面受体；它的mRNA提供合 适的3′-UTR序列且该蛋白具有通过Western印迹检测潜在蛋白延伸的适当 大小。

在该测定中，以编码荧光素酶-CD40融合蛋白的基因稳定转染生长于 培养基(例如，含胎牛血清(FBS)的培养基)的细胞(例如，HEK293细胞)。代 替通常存在于荧光霉素的位置190处的苏氨酸密码子(ACA)，通过定点突变 导入UGA无义密码子。此外，将CD40蛋白的3′-UTR导入到荧光素酶UAA 终止密码子的下游。对于各个构建体，在荧光素酶基因的5′端包含了6个 组氨酸(6X-His)，以方便该目标蛋白从细胞裂解产物中纯化。此外，还包含 XpressTM表位标记，以允许在Western印迹分析时分离该目标蛋白。

图2显示了由这些构建体转录的mRNA的特征以及在各种条件和假定 下的预期结果。在未处理的细胞中，应当仅观察到截短的荧光素酶蛋白(图 2A)。在用具有无义抑制活性、诱导普通终止密码子特异性通读的化合物处 理的细胞中，应当同时生成截短和全长荧光素酶蛋白(图2B)。然而，如果 化合物具有诱导普通终止密码子的非特异性核糖体通读的能力，则可预期 在位置190处插入的提前终止密码子和荧光素酶ORF末端的普通终止密码 子会发生通读。这将导致荧光素酶蛋白产生CD303′-UTR编码的84个氨基 酸的延伸，且通过Western印迹会检测到9kD的分子量增加(从66kD至 75kD)。如果这种情况发生，则该构建体的分子量就会增加，且会生成所有 的3种蛋白(截短的、荧光素酶以及荧光素酶-CD40)(图2C)。进一步制备构 建体作为标记。阴性对照构建体仅编码该全长荧光素酶mRNA(图2D)。该 阴性对照构建体仅编码该全长荧光素酶mRNA(图2D)。阳性对照构建体编 码所述延长的荧光素酶-CD40mRNA，并通过在荧光素酶ORF的末端构建 有义(非终止)突变(CAA)产生(图2E)。

用目标化合物处理细胞一段时间(例如，72小时)，然后制备细胞裂解 产物。将细胞裂解产物与设计来捕获所述6X-His标记蛋白的磁性镍-带电琼 脂糖珠相混合。在蛋白捕获步骤之后，在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离该蛋 白，并采用抗Xpress抗体进行Western印迹分析。

可以使用2维凝胶电泳进行有关非特异性终止密码子通读理论问题的 更通用但灵敏性和特异性较低的方法(O′Farrell，J.Biol.Chem. 250(10)：4007-421(1975))。可诱导普通终止密码子的核糖体通读的化合物可 能会产生异常延长的蛋白，并由于分子量的增加和/或电荷的改变可能会导 致电泳迁移模式随之改变。在该种测定的一个实例中，以目标化合物或运 载体处理双份细胞(例如，HDEK 293细胞)样本一段时间(例如，48小时)， 该细胞在荧光素酶报告体的190氨基酸位置处具有UGA(+1A)终止密码子。 在标准的基于细胞的报告测定中检测等分的细胞以确定化合物诱导的荧光 素酶核糖体通读的证据。进行2维电泳并用Phoretix软件进行计算分析。

通过评价化合物在体内对单个富集mRNA翻译的作用，可在动物疾病 模型中对非特异性终止密码子通读的潜力进行更具体的实验。例如，每天 以目标化合物、阳性对照或运载体处理max小鼠一段时间(例如，28天)， 然后从动物个体中采集肌肉组织。同样对来自未处理的野生型C57/B10小 鼠的肌肉进行分析。另外，已知β-微管蛋白(小鼠肌肉中的富含蛋白)的 mRNA在ORF的末端具有UAA(+1A)终止密码子，且在其3′-UTR下游具 有第二框内UAA(+1A)终止密码子。在这2个终止密码子之间是126个核 苷酸的间隔序列，其理论上可编码小鼠β-微管蛋白的42个氨基酸延伸。图 3提供了β-微管蛋白mRNA的示意图。如果目标化合物能够诱导终止密码 子的非特异性核糖体通读，可以预期该β-微管蛋白的大小将增加≥42个氨基 酸(～5kD)，且该变化可通过Western印迹检测到。

根据其诱导提前终止密码子的特异性核糖体通读的能力和不诱导普通 终止密码子的非特异性核糖体通读的能力，可在施用了所述无义密码子抑 制剂的个体(具体地是人)的生物样本中评价该无义密码子抑制剂的特异性。 例如，可在给药前和给药后的不同时间点(例如，2、4、6、8、12、24、48 和72小时)从无义密码子抑制剂处理的个体(例如，人)获取血液样本。从该 个体获取的血液样本或来自血液样本的样本(例如，PBMC和血浆)可在分析 前汇集。例如，来自相同时间点的相同性别的个体的血液样本或血液样本 的样本可在分析前汇集。可替代地，来自各个个体的血液样本或该血液样 本的样本可单独地分析。

分离外周血单核细胞(PBMC)和血浆，并任选地在使用前进行冷冻和贮 存。将PBMC和血浆加载至聚丙烯酰胺凝胶，该聚丙烯酰胺凝胶经优化以 获得延长的通读蛋白产物之间的最大分离，进行电泳，并转移至硝化纤维 膜(或其它适当的膜，例如尼龙膜)进行免疫印迹。蛋白，例如C-反应蛋白 (CRP)、B2微球蛋白和胱抑素C可用于评价普通终止密码子的非特异性通 读。野生型和相应的延长的蛋白可用作对照。可采用该被评价蛋白的特异 性一抗和包含辣根过氧化酶结合物的该一抗的特异性二抗进行免疫印迹。

施用该无义密码子抑制剂的个体可包括已知具有包含无义突变的基因 的个体，在这种情况下，由该基因编码的功能通读蛋白的生成可用作无义 密码子的特异性通读的阳性对照。施用该无义密码子抑制剂的个体还可包 括未知是否具有包含无义突变的基因的个体。在这种情况下，来自用无义 密码子抑制剂处理的个体的血浆可被添加至以包含提前终止密码子的报告 基因(例如，在氨基酸残基190处包含UGA提前终止密码子的萤火虫荧光 素酶报告基因)稳定转染的细胞(例如，HEK 293细胞)的培养基，或与细胞 萃取物和含有提前终止密码子的报告基因共同孵育。测定处理的细胞或处 理的细胞萃取物中的提前终止密码子的通读，作为阳性对照。

根据本发明鉴定的化合物的毒性和/或效力可在细胞培养物或试验动物 中通过标准的药物程序进行测定，例如测定LD50(50％群体的致死剂量)和 ED50(50％群体的治疗有效剂量)。用于评价本发明鉴定的化合物的细胞毒性 的细胞和细胞系包括但不限于：外周血单核细胞(PBMC)、Caco-2细胞和 Huh7细胞。毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，可以LD50/ED50 来表示。优选具有高治疗指数的本发明的化合物。尽管也可使用显示具有 毒副作用的本发明的化合物，但在设计传递系统的时候应当注意将该试剂 靶向作用组织的位点以最小化对未感染细胞的潜在损伤，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物试验获得的数据可用于制定本发明的化合物在 人体中使用的剂量范围。该试剂的剂量优选处于包含ED50且毒性很小或没 有毒性的循环浓度的范围内。该剂量可根据采用的剂型和给药途径在该范 围内变化。对于本发明的方法中所使用的任何试剂，其治疗有效剂量可通 过细胞培养分析进行初始估计。剂量可以在动物模型中制定，以得到包含 细胞培养中测得的IC50(即达到症状最大抑制一半时该化合物的浓度)的循 环血浆浓度范围。这些信息可用于更准确地制定有用的人体剂量。血浆中 的水平可通过，例如，高效液相色谱进行测定。

毒性测定的具体实例包括如下：

将运载体或各剂量的所述化合物每日施用至雄性和雌性 Sprague-Dawley大鼠一段时间(例如，28天)。多个大鼠/性别/组在一段时间 后(例如，28天)终止，一些其它大鼠/性别/组则在给药期后进行一额外的恢 复期(例如，4周的恢复期)，剩余的大鼠/性别/组用于在给药后的数小时和 数天中(例如，在第1和28天给药后0.5、1.5、4、8、12和24小时)进行毒 理动力学评价。

将运载体或各剂量的所述化合物施用至雄性和雌性beagle犬一段时间 (例如，28天)。多个犬/性别/组在给药期后终止。其它犬/性别/组继续进行 一恢复期(例如，4周的恢复期)并进行毒理动力学评价，在给药后的数小时 和数天(例如，在第1和28天给药后1、2、4、8、12、16和24小时)中采 集样本。

通过HPLC进行剂量分析以确认动物接受了所述预期剂量。每天进行 两次笼侧观察，每周记录具体的临床观察和体重。对治疗期的食物消耗进 行记录。在治疗前和治疗期最后一天进行检眼镜检查和心电图(仅针对犬)。 在基线处(仅针对犬)和在治疗期的最后一天(所有动物)以及在恢复动物的恢 复期评价血液学、凝血、临床化学和尿分析参数。在治疗或恢复期的最后 的步骤包括进行总体的尸体解剖检查，取出器官并称重，对保藏的组织进 行福尔马林固定以供显微镜分析。采用对各个动物种类有效的HPLC和串 联质谱法进行血浆的化合物浓度分析。采用非房室方法评价药代动力学参 数。采用单因素方差分析(ANOVA)分析体重、食物消耗、临床病理学和器 官重量，并以Dunnett检验对各剂量与对照进行两两比较。

在优选的实施方式中，本发明所采用的所述无义密码子抑制剂诱导提 前终止密码子的特异性核糖体通读，但不诱导普通终止密码子的非特异性 通读。可通过本领域已知或是此处所述的任意测定来评价目标化合物对提 前终止密码子的特异性核糖体通读。

本发明所用的无义密码子抑制剂可与28S rRNA、18S rRNA和/或5.8S rRNA相互作用。在某些实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂 结合28S rRNA。在其它实施方式中，本发明所采用的该无义密码子抑制剂 不结合18S rRNA。在一些实施方式中，该无义密码子抑制剂通过与另一蛋 白的相互作用间接结合至rRNA。在某些其它实施方式中，本发明所采用的 该无义密码子抑制剂对革兰氏阴性微生物和/或革兰氏阳性微生物不显示出 明显的抗菌活性。在优选的实施方式中，根据本发明所用的该无义密码子 抑制剂在全身(例如，口服)施用至个体(优选人)时具有极少(如有)的不良或 不需要的副作用。在具体的实施方式中，该无义密码子抑制剂在口服施用 至个体(优选人)时不引起肾衰竭和/或听力问题(例如，听力损失)。

5.5 功能通读蛋白

本发明提供了由包含无义突变的核酸序列编码的功能通读蛋白，该蛋 白由此处所述的方法生成。在某些实施方式中，该功能通读蛋白为功能非 野生型蛋白。在具体的实施方式中，该功能通读蛋白为全长非野生型蛋白。 在其它的实施方式中，该功能通读蛋白与相应的野生型蛋白由相同的氨基 酸序列组成。

本发明提供了由包含突变(例如，删除、插入和/或替换)的核酸序列编 码的功能通读蛋白，该突变导致由该核酸序列转录的RNA中的终止密码子 不同于编码相应野生型蛋白的RNA中的终止密码子。在某些实施方式中， 该功能通读蛋白为功能非野生型蛋白。在具体的实施方式中，该功能通读 蛋白为全长非野生型蛋白。

在具体的实施方式中，本发明提供了由包含突变(例如，删除、插入和/ 或替换)的核酸序列编码的功能通读蛋白的生产方法，该突变导致由该核酸 序列转录的RNA中的终止密码子不同于普通终止密码子(即，编码相应野 生型蛋白的RNA中的终止密码子)，该方法包括将包含该核酸序列的细胞 与无义抑制剂相接触。可替代地，该方法包括将具有该核酸的无细胞萃取 物与无义密码子抑制剂相接触。在另一实施方式中，本发明提供了由包含 突变(例如，删除、插入和/或替换)的基因编码的功能通读蛋白的生产方法， 该突变导致由该基因转录的RNA中的终止密码子不同于普通终止密码子 (即，编码相应野生型蛋白的RNA中发现的终止密码子)，该方法包括向有 此需要的个体(优选人)施用有效量的无义密码子抑制剂。根据这些实施方 式，该无义密码子抑制剂通读该不同的终止密码子至另一终止密码子以生 成功能通读蛋白。

在具体实施方式中，本发明提供了由包含基因编码区无义突变的基因 编码的功能通读蛋白的生产方法，该方法包括将含有该基因的细胞与无义 密码子抑制剂相接触。在另一实施方式中，本发明提供了由包含基因编码 区无义突变的基因编码的功能通读蛋白的生产方法，该方法包括向有此需 要的个体(优选人)施用有效量的无义密码子抑制剂。在某些实施方式中，该 个体患有或可能患有或易患与该基因的无义突变相关的疾病。

在某些实施方式中，根据本发明的方法生成的该功能通读蛋白在细胞 中发现于相应野生型蛋白被发现的相同位置。例如，在某些实施方式中， 该功能通读蛋白和相应的野生型蛋白均发现于细胞表面。在其它实施方式 中，该功能蛋白发现的位置不同于发现相应野生型蛋白的位置。在具体的 实施方式中，根据本发明的方法生成的该功能通读蛋白发现于细胞核，而 相应的野生型蛋白发现于细胞质或细胞表面。在另一实施方式中，根据本 发明的方法生成的该功能通读蛋白发现于细胞质或细胞表面，而相应的野 生型蛋白发现于细胞核。功能通读蛋白在细胞中/上的位置可通过本领域技 术人员已知的技术进行检测/确定。在具体的实施方式中，功能通读蛋白在 细胞中/上的位置可通过免疫荧光进行检测/确定。在某些实施方式中，如下 免疫荧光法被用于检测/确定功能通读蛋白在细胞中/上的位置：

1.在Coplin缸中用PBS使细胞复水(例如，约5分钟)。

2.用免疫前小鼠血清封闭细胞一段时间(例如，20分钟)。

3.应用一抗一段时间。

4.在PBS中洗涤玻片2-5次，然后与二抗孵育一段时间。

5.通过染色(例如，DAPI染色)鉴定核。

6.在数字共焦荧光显微镜上对细胞成像，并以例如IPLab光谱软件捕 获图像。

7.将染色分类/评分为(0)缺失、(1)核周、(2)外周和(3)表面。

8.捕获图像，例如在配备了步进马达、滤光轮装置(Ludi Electronics Products，Hawthorne，NY)和83,000滤光装置(Chroma Technology，Brattleboro， VT)以及SenSys-cooled电荷耦合高分辨率相机(Photometries，Tucson，Az)的 Olympyus IX170倒置式表面荧光显微镜捕获图像。

9.对图像进行部分去卷积，例如通过IPLab软件(Scanalytics，Fairfax， VA)对图像进行部分去卷积。

在具体的实施方式中，由本发明的方法生成的该功能通读蛋白为功能 CFTR通读蛋白。在某些实施方式中，通过本领域已知的方法(例如，免疫 荧光)检测/确定该功能CFTR通读蛋白位于鼻细胞的核周、外周和/或表面。 在优选的实施方式中，通过免疫荧光检测/确定该功能CFTR通读蛋白位于 鼻细胞的表面。在具体的实施例中，通过如下免疫荧光法检测/确定位于核 周、外周和/或表面的该功能CFTR通读蛋白的数量：

1.在Coplin缸中用PBS使鼻细胞复水(例如，约5分钟)。

2.用免疫前小鼠血清封闭细胞一段时间(例如，20分钟)。

3.用一抗，例如1:100的稀释的一抗(例如，针对全长CFTR羧基末端 4氨基酸的小鼠单克隆抗-CFTR24-1)应用一段时间(例如，两小时)。

4.在PBS中洗涤玻片三次，然后与二抗(例如，山羊抗小鼠IgG， AlexaFluor 596，Molecular Probes，Portland，Oregon)孵育一段时间(例如，一 小时)。

5.通过DAPI染色鉴定核。

6.在数字共焦荧光显微镜上对细胞成像，并用例如IPLab光谱软件捕 获图像。

7.将CFTR染色分类/评分为(0)缺失、(1)核周、(2)外周和(3)表面。在 具体的实施方式中，对来自各玻片随机区域的至少50个上皮细胞进行评价 和评分。

8.捕获图像，例如在配备了步进马达、滤光轮装置(Ludi Electronics Products，Hawthorne，NY)和83,000滤光装置(Chroma Technology，Brattleboro， VT)以及SenSys-cooled电荷耦合高分辨率相机(Photometries，Tucson，Az)的 Olympyus IX170倒置式表面荧光显微镜捕获图像。

9.对图像进行部分去卷积，例如通过IPLab软件(Scanalytics，Fairfax， VA)对图像进行部分去卷积。

在某些实施方式中，根据本发明的方法生成的该功能通读蛋白与相应 野生型蛋白的区别仅在该功能通读蛋白中由所述提前终止密码子编码的位 置处插入的氨基酸残基。在其它实施方式中，根据本发明的方法生成的该 功能通读蛋白与相应野生型蛋白的区别在于：(i)在该功能通读蛋白中由提 前终止密码子编码的位置处插入的氨基酸残基；以及(ii)在该功能通读蛋白 中由提前终止密码子编码的氨基酸残基以外的氨基酸残基。

由本发明的方法生成的功能通读蛋白的氨基酸序列可通过对包含目标 核酸序列(即，包含该目标无义突变的核酸序列)的细胞生成的蛋白进行测序 来测定。在某些实施方式中，该细胞天然包含该核酸序列。在具体的实施 方式中，该细胞为来自于正接受或将要接受无义密码子抑制剂的患者的细 胞。在其它实施方式中，该细胞经工程改造后包含该核酸序列。

在某些实施方式中，根据本发明的方法生成的该功能通读蛋白在翻译 该蛋白的RNA中的无义密码子的对应位置处包含酪氨酸、半胱氨酸或色氨 酸。在具体的实施方式中，根据本发明的方法生成的该功能通读蛋白在翻 译该蛋白的RNA中的UAA或UAG无义密码子的对应位置包含酪氨酸。 在其它实施方式中，根据本发明的方法生成的该功能通读蛋白在翻译该蛋 白的RNA中的UAG无义密码子的对应位置包含半胱氨酸或色氨酸。

下表10提供了与基因无义突变相关的疾病的列表。该表提供了与该疾 病相关的基因名称，该基因中至少编码区的核酸的GenBank编号，由该基 因编码的蛋白的GenBank编号，与该疾病相关的基因中发现的代表性无义 突变，以及有关与该基因无义突变相关的疾病的参考文献。在某些实施方 式中，根据本发明的方法生成的该功能通读蛋白在表10中所述的氨基酸残 基(具有与疾病相关的基因无义突变)的位置之外的位置包含相应野生型蛋 白的氨基酸序列。根据该实施方式，在所述位置的氨基酸残基并非在相应 野生型蛋白中发现的1种氨基酸残基，而是其它19种氨基酸残基中的任意 一种。因此，例如，对于3-M综合症，该功能通读蛋白在位置1445处可包 含除了精氨酸外的任意其它氨基酸残基。

5.6 患者群体

5.6.1 优选的个体和遗传状况

本发明的方法和组合物可用于预防、治疗和/或控制患有或可能患有或 易患(例如，由于环境和/或遗传因素)与基因无义突变相关的疾病(例如，本 发明所述的疾病)的患者(例如，胚胎、胎儿、婴儿(新生儿至1岁的人)、儿 童(1岁至18岁的人)、成年人(18岁或更大的人)和老年人(65岁及以上的 人))。在一个实施方式中，该患者为儿童或青少年(5至13岁的人)。在另一 实施方式中，该患者为男性。在某些实施方式中，该患者为男性儿童或青 少年(5至13岁的人)。在具体的实施方式中，该患者为患有肌肉萎缩症(如 杜兴肌营养不良)的男性儿童或青少年(5至13岁的人)。在另一实施方式中， 该患者为女性。在具体的实施方式中，该患者为女性儿童或青少年(5至13 岁的人)。

在具体的实施方式中，本发明的方法和组合物可用于预防、治疗和/或 控制患有或可能患有或易患与基因无义突变相关的疾病(例如，本发明所述 的疾病)的胚胎或胎儿。根据该实施方式中，无义密码子抑制剂被施用至怀 孕女性，并通过胎盘到达该胚胎或胎儿。

上文表10提供了与基因无义突变相关的疾病以及基因无义突变的代表 性范例的列表。在某些实施方式中，该施用了无义密码子抑制剂的患者为 具有表10所列疾病的患者，其具有与该疾病相关的一种或多种代表性基因 无义突变。

在某些实施方式中，根据本发明施用了无义密码子抑制剂的所述患者 在最近数天、1周、2周、1个月、3个月、6个月或1年内未接受另一疗法。 在具体的实施方式中，根据本发明施用了无义密码子抑制剂的该患者从未 接受另一疗法。在其它实施方式中，根据本发明施用了无义密码子抑制剂 的该患者曾在最近分钟、数小时或数天内接受了另一疗法。

本发明包括联合施用无义密码子抑制剂与另一类型的疗法(例如支持疗 法和/或镇痉剂)。对于囊性纤维化，支持疗法的范例包括胰腺酶替代品(例 如，脂肪酶)、粘液溶解剂(例如，α链道酶)、支气管扩张剂、类固醇和抗生 素。对于杜兴肌营养不良，支持疗法的范例包括皮质类固醇和抗生素。在 具体的实施方式中，该患者未以氨基糖苷、恶唑烷酮和/或氯霉素作为抗生 素与无义密码子抑制剂联合施用。根据该实施方式，该无义密码子抑制剂 不是氨基糖苷、恶唑烷酮和/或氯霉素。

在某些实施方式中，根据本发明施用了无义密码子抑制剂的患者对于 氨基糖苷、恶唑烷酮和/或氯霉素的无义密码子抑制活性来说具有难治性。 根据该实施方式，可以确定对该种试剂具有难治性的患者，例如通过将来 自患者的细胞与氨基糖苷、恶唑烷酮或氯霉素相接触，并检查与该疾病相 关的包含无义突变的基因的活性和/或表达来确定。

本发明的方法和组合物还可用于预防、治疗和/或控制患有或可能患有 或易患(例如，由于环境和/或遗传因素)与基因突变相关的疾病的患者(例如， 胚胎、胎儿、婴儿(新生儿至1岁的人)、儿童(1岁至18岁的人)、成年人(18 岁或更大的人)和老年人(65岁及以上的人))，该基因突变导致由该基因转录 的RNA的终止密码子不同于编码相应野生型蛋白的RNA中发现的终止密 码子。该种疾病的非限制性范例包括脊髓性肌萎缩和囊性纤维化(例如，囊 性纤维化由CFTR基因中的突变3849+10kb C→T引起，由于内含子19被 识别为外显子，因而该突变产生84个碱基对的插入，且在翻译时，该84 个碱基对插入生成带有UAA无义突变的28个氨基酸的肽(Highsmith等人， New England Journal of Medicine 331(1)：974(1994))。

此外，本发明的方法和组合物可用于预防、治疗和/或控制患有或可能 患有或易患(例如，由于环境和/或遗传因素)所述疾病的患者(例如，胚胎、 胎儿、婴儿(新生儿至1岁的人)、儿童(1岁至18岁的人)、成年人(18岁或 更大的人)和老年人(65岁及以上的人))，在该疾病中患者不表达足量的蛋白 和/或可受益于特定蛋白的表达。这些患者曾通过基因疗法(有关基因疗法参 见5.11节)施用了在编码区包含无义突变(在某些实施方式中，该无义突变 在编码区的5′区(例如，氨基末端前50、75、100、125、150、175、200、 225、250、300或350个氨基酸))的核酸序列，且施用无义密码子抑制剂抑 制了由该核酸序列转录的RNA的无义密码子，从而可生成由该核酸序列编 码的功能通读蛋白。该无义密码子抑制剂的施用使得人们可以调节所生成 的功能通读蛋白的数量。换言之，当无义密码子抑制剂缺失时，通过例如 ELISA等免疫测定检测可确定仅生成了少量或没有生成可检测的功能通读 蛋白。生成的该种功能通读蛋白对应于患者中未足量表达和/或对该患者有 益的野生型蛋白。可从该种疗法受益的患者群体的非限制性范例包括患有 如下疾病的患者：

软骨发育不全                         马凡综合症

色盲                                 Moebius综合症

酸性麦芽糖酶缺乏症                   黏多糖(贮积)病(MPS)

肾上腺脑白质营养不良                 甲髌综合症

Aicardi综合症                        肾性尿崩症

α-1抗胰蛋白酶缺乏                    神经纤维瘤病

雄激素不敏感综合症                   尼曼-匹克病

Apert综合症                          成骨不全

心律失常性右心室发育不良             卟啉症

共济失调毛细血管扩张                 Prader-Willi综合症

Barth综合症                          早衰

蓝橡皮疱痣综合症                     Proteus综合症

海绵状脑白质营养不良症               视网膜母细胞瘤

癌症                                 Rett综合症

猫叫综合症                           Rubinstein-Taybi综合症

囊性纤维化                           沙费利波综合症

Dercum’s病                          Shwachman综合症

外胚层发育不良                       镰状细胞(贫血)病

范可尼贫血                           史密斯-马吉利氏综合症

进行性肌肉骨化症                     Stickler综合症

X染色体脆弱症                        黑蒙性白痴

半乳糖血症                           血小板缺乏合并桡骨缺失(TAR)综合症

Gaucher病                            Treacher Collins综合症

血色沉着病                           三体

血友病                               结节性脑硬化

亨廷顿舞蹈病                         特纳综合症

Hurler综合症                         尿素循环障碍

低磷酸酯酶症                         von Hippel-Lindau病

克兰费尔特综合症                     瓦登伯革氏综合症

克腊比氏病                           威廉综合症

Langer-Giedion综合症                 威尔森氏病

脑白质营养不良

长QT综合症

可被本发明包括的方法预防、治疗和/或控制的癌症的具体范例包括但 不限于：头、颈、眼、嘴、喉咙、食道、胸部、骨骼、肺、结肠、直肠、 胃、前列腺、乳腺、卵巢、肾、肝、胰和脑的癌症。其它癌症包括但不限 于以下：白血病，例如但不限于急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性 髓细胞白血病如成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞、红白血病 和骨髓增生异常综合症，慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞) 白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋 巴瘤，例如但不限于霍奇金氏病、非霍奇金氏病；多发性骨髓瘤，例如但 不限于阴燃多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞性 白血病、孤立性浆和髓外浆细胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；意义未明 的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨癌和结缔 组织肉瘤，例如但不限于骨组织肉瘤、多发性骨髓瘤骨病、骨肉瘤、软骨 肉瘤、尤文氏肉瘤、帕杰特氏骨病、恶性骨巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索 瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管性肉瘤(血管肉瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉 瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜 肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于胶质瘤、星形胶质细胞瘤、脑干胶质瘤、室 管膜瘤、少突胶质瘤、非神经胶质肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞 瘤、脑膜瘤、成松果体细胞瘤、成松果体母细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳 腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、乳腺癌髓、粘液性 乳腺癌、乳腺癌管、乳头乳腺癌、帕杰特氏病(包括少年帕杰特氏病)和炎性 乳腺癌；肾上腺肿瘤，例如但不仅限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状 腺癌，例如但不仅限于乳头或甲状腺滤泡癌、甲状腺髓样癌和未分化甲状 腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛瘤、胃泌素瘤、胰高糖素瘤、血管活性 肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤以及良性癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不 限于Cushing病、泌乳素分泌肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不 限于黑色素瘤眼虹膜，如黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤和睫状机构黑色素瘤 及视网膜母细胞瘤；阴道癌，例如鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外阴癌， 如鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和帕杰特氏病；子宫 颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不局限于子宫内 膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖 细胞肿瘤和间质细胞瘤；食道癌，例如但不仅限于鳞状上皮癌、腺癌、腺 样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌 和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不仅限于腺癌、蕈伞型(息肉)、溃疡、 表浅扩散型、弥散型、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和肉瘤；结肠癌； 直肠癌；胃癌，如腺癌、鳞状细胞癌、类癌、淋巴瘤、胃基质瘤和神经内 分泌肿瘤；肝癌，例如但不仅限于肝细胞癌和肝母细胞瘤，胆囊癌如腺癌； 胆管癌，例如但不仅限于乳头状、结核状和弥漫性；肺癌，例如非小细胞 肺癌、鳞状细胞癌(上皮癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，例如 但不限于胚组织瘤，精原细胞瘤，退化发育，经典型(典型性)，精母细胞瘤， 非精原细胞瘤，胚胎癌，畸胎瘤癌，绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤)；前列腺癌，例 如但不限于腺癌、平滑肌肉瘤以及横纹肌肉瘤；penal癌；口腔癌，例如但 不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、黏液表皮样 癌和腺腺样囊性癌；咽癌，如但不限于鳞状细胞癌以及疣；皮肤癌，例如 包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表性传播黑色素瘤、 结节性黑色素瘤、黑色素瘤雀斑、肢端黑色素瘤；肾癌，例如但不限于肾 细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)； Wilms肿瘤；膀胱癌，例如但不局限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、 癌肉瘤。此外，癌症包括黏液肉瘤、骨源性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮 肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗 腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(该类疾病的综述可参见Fishman 等人，1985，Medicine，第2版，J.B.Lippincott Co.；Philadelphia和Murphy 等人，1997，Informed Decisions：The Complete Book of Cancer Diagnosis， Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，Inc.，United States of America)。可以预期本发明的方法和组合物还可以用来预防、治疗 和/或控制因为凋亡失常而引起的癌症。该类癌症包括但不限于：滤泡性淋 巴瘤，具有p53突变的肿瘤，乳腺的激素依赖性肿瘤，前列腺癌和卵巢癌， 及癌前病变，如家族性腺瘤性息肉和骨髓增生异常综合症。

5.6.2 患者筛选和细胞系

在一个实施方式中，通过预筛选确定该患者或该患者的亲属具有与遗 传疾病相关的基因无义突变(即UAA、UGA或UAG)。

在某些实施方式中，本发明提供了筛选患者以鉴别可能对使用无义密 码子抑制剂的疗法有响应的患者的方法。

5.6.2.1 短期治疗挑战

本发明提供了根据所述患者响应无义密码子抑制剂的可能性筛选患有 与基因无义突变相关疾病的患者的方法，该方法包括向该患者施用无义密 码子抑制剂，然后检测与该需要预防、控制和/或治疗的疾病相关的一种或 多种药效学标记。如果该药效学标记的检测显示该患者可能对该无义密码 子抑制剂有响应，则可继续施用该试剂。

在具体实施方式中，该筛选方法包括向该患者短期施用无义密码子抑 制剂，然后检测与该需要预防、控制和/或治疗的疾病相关的药效学标记， 接着可选地长期施用该无义密码子抑制剂。在某些实施方式中，该无义密 码子抑制剂的短期施用持续约5天、约10天、约14天、约21天或约28 天。在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂的长期施用持续约30天、约 45天、约80天、约120天、约240天、约1年或直至医生认为治疗应该停 止。在具体实施方式中，在该无义密码子抑制剂TEPD的短期施用和长期 施用，与肺功能评价之间有一段约1天、约3天、约5天、约7天、约10 天、约14天、约21天或约28天的无治疗期。在具体的实施方式中，该无 义密码子抑制剂口服施用。

任何本领域技术人员知道的与本发明所述疾病相关的药效学标记均可 用于本发明的方法(例如，参见，Politano等人，Acta Myologica XXIJ：15-21 (2003)，其全文在此引用作为参考)。

与囊性纤维化相关的示范性药效学标记包括但不限于：鼻部跨上皮电 位差(例如，参见，Standaert等人，Pediatric Pulmonology 57：385-392(2004) 和Du等人，J.Mol.Med.50：595-604(2002)，其全文分别在此引用作为参考， 以及下文的实施例13)、从鼻部采集的细胞的CFTR蛋白染色和检测(例如， 参见，Wilschanski，等人，N.Engl.J.Med.349：1433-1441(2003)，其全文在此 引用作为参考，以及实施例14)、汗液氯离子浓度的变化(例如，参见实施 例16)以及肺功能的变化(例如，参见实施例15)。

与杜兴肌营养不良相关的示范性药效学标记包括但不限于：血清肌酸 酐激酶水平(例如，参见下文实施例20中检测血清肌酸酐激酶水平的方法) 以及通过染色进行的肌营养不良检测(例如，参见，Politano，等人，Acta Myologica XXII：15-21(2003)，其全文在此引用作为参考，以及实施例17)。

与淀粉样变性相关的示范性药效学标记包括但不限于：淀粉样β蛋白 的清除，体重增加，肾小球滤过率，室间隔厚度，淀粉样蛋白的跨组织分 配和心脏淀粉样蛋白负荷，血清中与免疫球蛋白有关的自由轻链(FLC)的κ/ λ比例，以及心脏肌钙蛋白T和I(cTnT、cTnI)的缺失。

与血友病相关的示范性药效学标记包括但不限于：血液凝固活性，组 织因子诱导的纤维蛋白形成和tPA介导的纤维蛋白溶解中血块溶解时间的 缩短。

与阿尔海默病相关的示范性药效学标记包括但不限于：改变的淀粉样 前体蛋白(APP)亚型的血小板比例；总体的、认知的(通过心理测验，例如改 良的简易智能状态测验(MMSE)或改良的Hachinski缺血指数来检测)、功能 和行为的检测，包括日常活动和行为，尤其是激动，减少的脑容积缺损(例 如，使用MRI测得)。还可参见Caban-Holt等人，Geriatrics.2005.06； Suppl：3-8。

与帕金森病相关的示范性药效学标记包括但不限于：帕金森病评定量 表(UPDRS)的评分、MMSE、Hamilton-17抑郁、NPI、每日“开”的总时间 (TTON)、运动测试、运动障碍评定、患者日记以及(18)F-多巴的摄取。

与动脉粥样硬化症和家族性高胆固醇血症相关的示范性药效学标记包 括但不限于：降低的胆固醇水平，如降低的MDA-LDL水平和/或增加的高 密度脂蛋白胆固醇；血清脂肪酸状况，血清脂蛋白和血管发炎的标记，降 低的血浆同型半胱氨酸浓度，动脉粥样硬化脉管中的斑块形成(通过MRI 或血管内超声(IVUS))，通过如电子束计算机断层扫描测得的冠状动脉钙化 (CAC)，以及通过如颈动脉内膜中层厚度(IMT)对颈总动脉(CCA)、颈内动 脉(ICA)以及颈动脉的咽球片段检测测得到的减少的动脉阻塞。

与侏儒症和巨大症相关的示范性药效学标记包括但不限于：高度以及 生长激素和催乳激素的水平。

与甲状腺功能减退症和甲状腺功能亢进症相关的示范性药效学标记包 括但不限于：TT3、TT4和TSH血清水平以及对甲状腺形态及大小的评价、 骨骼年龄、生长发育和发育商数(DQ)。

与视网膜色素变性病相关的示范性药效学标记包括但不限于：二十二 碳六烯酸(DHA)水平，通过Humphrey视野分析仪根据视野敏感性、30-Hz 视网膜电图幅度以及视觉灵敏度测得的眼功能。

与晚发婴儿型神经元蜡样脂褐质沉着病相关的示范性药效学标记包括 但不限于：基于LINCL临床评分表的神经学评价和对脑的磁共振成像/磁共 振波谱评价。

与脊髓性肌萎缩相关的示范性药效学标记包括但不限于：肌肉力量， 运动功能和检查指数(IFM)的总和，呼吸肌麻痹指数(IMR)以及并仰卧位用 力肺活量/理论指数(ICV/CT)，通过手持肌力计得到的最大自愿等长收缩以 及计算的手臂大分值(加合肘屈曲、手抓力和三点捏力分数)，和腿大分值(加 和膝弯曲、膝伸展、扩展和足伸展分数)，总运动功能测试量，肺功能检查， 定量肌力测试，和生活质量。

与共济失调毛细血管扩张症相关的示范性药效学标记包括但不限于： 降低的α-胎儿蛋白，改善的免疫功能以及改善的神经功能。

与巴特综合症相关的示范性药效学标记包括但不限于：提高的血钾水 平，提高的生长和提高的心理功能。

5.6.2.2 培养的组织细胞的体外暴露

本发明提供了针对患者响应无义密码子抑制剂的可能性筛选患有与基 因无义突变相关疾病的患者的方法，该方法包括将来自该患者的细胞样本 与该无义密码子抑制剂接触，并检测该无义密码子抑制剂诱导与该疾病相 关的基因的无义突变的通读时功能通读蛋白的表达和/或活性。细胞样本的 非限制性范例包括有核血细胞(例如，外周血淋巴细胞)、皮肤细胞(例如， 真皮纤维原细胞)、神经元细胞、神经胶质细胞以及肌肉细胞。在某些实施 方式中，该细胞样本为受到基因无义突变的存在影响的细胞的样本。所测 得的活性将取决于由普通基因编码的野生型蛋白的功能。例如，参见上文 5.5节描述的检测。

在某些实施方式中，本发明提供了针对患者响应无义密码子抑制剂的 可能性筛选患有与基因无义突变相关疾病的患者的方法，该方法包括将来 自该患者的细胞样本(例如，皮肤细胞样本，例如，真皮纤维原细胞)在允许 该细胞转化为目标组织(例如，肌肉细胞)的条件下与该无义密码子抑制剂相 接触，并检测所述响应。来自可能响应该无义密码子抑制剂的患者的细胞 样本将会产生功能通读蛋白，因为从该基因转录的RNA中的无义密码子受 到抑制。在具体的实施方式中，所用的该细胞为从患者分离的成纤维细胞。 该类细胞可通过用包含MyoD基因的载体转染该细胞而分化成为肌肉细胞。

本发明还提供了针对患者响应无义密码子抑制剂的可能性筛选患有与 基因无义突变相关疾病的患者的方法，该方法包括对与该疾病相关的基因 测序，将包含了具有相同无义突变的基因的细胞样本与所述无义密码子抑 制剂相接触，并检测当该无义密码子抑制剂诱导了与该疾病相关的基因转 录的RNA中的无义密码子的通读时生成的功能通读蛋白的表达和/或活性。 在某些实施方式中，所用的该细胞样本为细胞样本库的一部分，每个细胞 样本包含与疾病相关的基因的无义突变。例如，囊性纤维化细胞样本库包 含细胞样本，例如，在CTFR基因中具有表10所列举的无义突变的细胞样 本。细胞样本可被贮存在-70℃下直至使用，使用时该细胞样本被解冻并在 允许该细胞生长的条件下培养。

5.6.2.3 荧光素酶测定中的人造基因构建体

本发明还提供了针对患者响应无义密码子抑制剂的可能性筛选患有与 基因无义突变相关疾病的患者的方法，该方法包括对与该疾病相关的基因 测序，将所述无义密码子抑制剂与已改造成包含报告基因例如荧光素酶(包 含与所述疾病相关的基因的具有所述无义突变的区域)的细胞相接触，并检 测当该无义密码子抑制剂诱导了从该基因转录的RNA中的无义密码子的通 读时生成的功能通读蛋白的表达和/或活性。在某些实施方式中，该报告基 因包含目标基因的具有该无义突变的区域的6个核苷酸(在某些实施方式 中，9、12、15、21、24、27、30或33个核苷酸)，其中包括该无义突变。 该报告基因已改造成包含目标基因的具有该无义突变的区域，从而保留该 报告基因的开放阅读框，且在无义密码子抑制剂诱导了从该基因转录的 RNA中的无义密码子的通读时该报告基因编码的蛋白将会形成功能通读蛋 白。上文5.5节提供了报告基因的范例。任意细胞均可通过工程改造为包含 所述报告基因。非限制性的范例包括成纤维细胞、淋巴细胞、神经胶质细 胞、神经细胞、肌肉细胞和巨噬细胞。可通过标准的分子和细胞生物学方 法(包括定点突变)制备该报告基因，并对细胞进行工程改造(包括磷酸钙沉 淀、电穿孔和脂质体)以包含该报告基因。

5.6.3 疾病

通过抑制提前翻译终止和/或无义介导的mRNA降解来预防、治疗和/ 或控制的疾病包括但不限于：遗传疾病、癌症、自身免疫疾病、血液疾病、 胶原病、糖尿病、神经退行性疾病、增生性疾病、心血管疾病、肺病、炎 性疾病和中枢神经系统疾病。

在本发明的方法范围内的具体遗传疾病包括但不限于：淀粉样变性、 血友病、阿尔海默病、泰伊-萨克斯二氏病、动脉粥样硬化、巨大症、侏儒 症、甲状腺功能减退症、甲状腺功能亢进症、衰老、肥胖、帕金森病、尼 曼-匹克病、囊肿性纤维化、肌肉萎缩症、心脏病、肾结石、共济失调毛细 血管扩张症、家族性高胆固醇血症、视网膜色素变性、溶酶体贮积病、结 节性硬化症、杜兴型肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症和马凡综合症。实体 肿瘤和其它癌症均包括在本发明方法的范围内。

在另一实施方式中，该遗传疾病为自身免疫疾病。在优选的实施方式 中，该自身免疫疾病为风湿关节炎或移植物抗宿主病。

在另一实施方式中，该遗传疾病为血液疾病。在优选的实施方式中， 该血液疾病为血友病、Von Willebrand病、共济失调毛细血管扩张症、b-地 中海贫血或肾结石。

在另一实施方式中，该遗传疾病为胶原病。在另一实施方式中，该胶 原病为成骨不全或肝硬化。

在另一实施方式中，该遗传疾病为糖尿病。

在另一实施方式中，该遗传疾病为炎性疾病。在优选的实施方式中， 该炎性疾病为关节炎。

在另一实施方式中，该遗传疾病为中枢神经系统疾病。在一个实施方 式中，该中枢神经系统疾病为神经退行性疾病。在优选的实施方式中，该 中枢神经系统疾病为多发性硬化症、肌肉萎缩症、杜兴型肌营养不良症、 脊髓性肌萎缩症、阿尔海默病、泰伊-萨克斯二氏病、晚发婴儿型神经元蜡 样脂褐质沉着病(LINCL)或帕金森病。

在另一实施方式中，该遗传疾病为癌症。在优选的实施方式中，该癌 症为头颈、眼、皮肤、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、结肠、乙状结肠、 直肠、胃、前列腺、乳腺、卵巢、肾、肝、胰、脑、肠、心脏或肾上腺的 癌症。

在另一优选的实施方式中，该癌症与肿瘤抑制基因有关(例如，参见 Garinis等人2002，Hum Gen 111：115-117；Meyers等人.1998，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，95：15587-15591；Kung等人2000，Nature Medicine 6(12)： 1335-1340)。该肿瘤抑制基因包括但不限于：APC、ATM、BRACl、BRAC2、 MSH1、pTEN、Rb和p53。

在特别优选的实施方式中，该肿瘤抑制基因为p53基因。已经鉴别出 了p53基因中的无义突变，其与癌症相关联。在p53基因中已鉴定出多个 无义突变(例如，参见Masuda等人，2000，Tokai J Exp Clin Med.25(2)：69-77； Oh等人，2000，Mol Cells 10(3)：275-80；Li等人，2000，Lab Invest.80(4)：493-9； Yang等人，1999，Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 21(2)：114-8；Finkelstein等人， 1998，Mol Diagn.3(1)：37-41；Kajiyama等人，1998，Dis Esophagus. 11(4)：279-83；Kawamura等人，1999，Leuk Res.23(2)：115-26；Radig等人， 1998，Hum Pathol.29(11)：1310-6；Schuyer等人，1998，Int J Cancer 76(3)：299-303；Wang-Gohrke等人，1998，Oncol Rep.5(1)：65-8；Fulop等人， 1998，J Reprod Med.43(2)：119-27；Ninomiya等人，1997，J Dermatol Sci. 14(3)：173-8；Hsieh等人，1996，Cancer Lett.100(1-2)：107-13；Rail等人，1996， Pancreas.12(1)：10-7；Fukutomi等人，1995，Nippon Rinsho.53(11)：2764-8； Frebourg等人，1995，Am J Hum Genet.56(3)：608-15；Dove等人，1995， Cancer Surv.25：335-55；Adamson等人，1995，Br J Haematol.89(1)：61-6； Grayson等人，1994，Am J Pediatr Hematol Oncol.16(4)：341-7；Lepelley等人， 1994，Leukemia.8(8)：1342-9；Mclntyre等人，1994，J Clin Oncol.12(5)：925-30； Horio等人，1994，Oncogene.9(4)：1231-5；Nakamura等人，1992，Jpn J Cancer Res.83(12)：1293-8；Davidoff等人，1992，Oncogene.7(1)：127-33；以及 Ishioka等人，1991，Biochem Biophys Res Commun.177(3)：901-6；其披露的内 容在此全文引用作为参考)。与编码提前翻译密码子，包括但不限于上文所 引的参考文献中描述的无义突变的p53基因相关的任何疾病都可用本发明 的方法来治疗、控制和/或预防。

其它可用本发明的方法治疗、控制和/或预防的疾病包括实体肿瘤、肉 瘤、癌、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、 血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、 尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、 前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状 癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆道癌、 绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilms肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺 癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形胶质细胞瘤、髓母细胞 瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神 经瘤、胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、血 液源性肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞B-细胞白血病、急性 淋巴细胞的T-细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、 急性单核细胞白血病、急性红白血病、急性成巨核细胞白血病、急性粒细 胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化型白血病、慢性粒细胞白 血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病或多发性骨髓瘤。例如，参见 Harrison′s Principles of Internal Medicine，Eugene Braunwald等人编，第 491-762页(第15版，2001)。

在一些实施方式中，可以用本发明的方法预防、治疗和/或控制的疾病 包括上文表10列举的疾病。在某些实施方式中，可以预防、治疗和/或控制 的疾病不是肠胃疾病和/或皮肤疾病。在一些实施方式中，可以预防、治疗 和/或控制的疾病不是如下疾病的一种或多种：基底细胞痣综合症(例如， PTCH基因)、偶发性基底细胞癌(例如，PTCH基因)、黑色素瘤(例如， CDKN2a基因)、交界型大疱性表皮松解症(例如，LAMB3、LAMC2、LAMA3 基因)、泛发性萎缩性良性大疱性表皮松解症(例如，COL17Al基因)、营养 不良性表皮松解(例如，COL7A1基因)、良性天疱疮疾病(如ATP2C1基因)、 Darier氏症(例如，ATP2A2基因)、板层状鱼鳞病(例如，TGM1基因)、X- 连锁鱼鳞病(例如，STS基因)、着色性干皮病(例如，XPA、XPC、XPG基 因)、Bloom综合征(例如，BLM基因)、纹状掌跖角化病(例如，DSP、DSG1 基因)、Cockayne综合症(例如，ERCC6基因)、眼皮肤白化病(例如，TYR、 TYRP1基因)、Hermansky-Pudlack综合征(例如，HPS1、HPS4基因)、共济 失调毛细血管扩张症(例如，ATM基因)、Griscelli综合症(例如，RAB27A、 MYO5A基因)、以及外胚层发育不良/皮肤脆性(例如，PKP1基因)。在一些 实施方式中，该疾病不是如下一种或多种疾病：偶发性食道癌(p53基因)和 偶发性结肠癌(APC、p53基因)、Barrett’s食道癌(p53基因)、遗传性癌综合 症、如腺瘤性结肠息肉病(APC基因)、遗传性非息肉性结肠癌(MLH1、MSH2 基因)、Peutz-Jeghers综合征(STK11基因)、以及Cowden综合症(PTEN基 因)。

5.7 制剂

本发明的方法中可采用包含有效量的无义密码子抑制剂的药物组合物 和单一单位剂型。个体剂型可适用于通过口服、粘膜(包括舌下、口腔、直 肠、鼻部、或阴道)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、弹丸注射、动脉内或静脉 内)施用。优选的药物组合物和单一单位剂型适用于口服施用。在一个实施 方式中，该药物组合物或单一单位剂型包含有效量的一种或多种无义密码 子抑制剂，和用于制备该无义密码子抑制剂的合成路径中的一种或多种杂 质。

在一个实施方式中，该药物组合物为固体口服剂型。在一个实施方式 中，该药物组合物为液体口服剂型。在某些实施方式中，本发明的方法包 括剂量、单位剂型或药物组合物的施用，其中该无义密码子抑制剂是口服 生物相容的。口服施用的优势包括便于施用，对给药方案产生更好的患者 适应性，临床效力，更少的并发症，住院期更短和节省总成本。

在另一实施方式中，本发明的方法包括施用包含约35mg至约1400 mg、约125mg至约1000mg、约250mg至约1000mg、或约500mg至约 1000mg无义密码子抑制剂的单位剂型。在一个实施方式中，该单位剂型包 含无义密码子抑制剂，和适于在瓶中悬浮于药学上可接受的溶剂(例如，水、 牛奶、碳酸饮料、果汁、苹果酱、婴儿食品或婴儿配方)中的一种或多种载 体或赋形剂。

在另一实施方式中，本发明的方法包括施用包含35mg、50mg、70mg、 100mg、125mg、140mg、175mg、200mg、250mg、280mg、350mg、 500mg、560mg、700mg、750mg、1000mg或1400mg的无义密码子抑制 剂的单位剂型。优选的单位剂型包括约125mg、约250mg或约1000mg 的无义突变抑制剂。在一个实施方式中，该单位剂型包含无义密码子抑制 剂，和适于在瓶中悬浮于药学上可接受的溶剂(例如，水、牛奶、碳酸饮料、 果汁、苹果酱、婴儿食品或婴儿配方)中的一种或多种载体或赋形剂。优选 的单位剂型为粉末和小袋。

尽管推荐本发明所述的单位剂型贮存于约2℃至约8℃，但该单位剂型 可在重新配制前在室温下贮存48小时。在一个实施方式中，可通过直接向 含有3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、 溶剂化物或水合物的瓶中添加约10mL的水来对250mg的3-[5-(2-氟-苯 基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物 的单位剂型进行重新配制，从而形成浓度约为25mg/mL的悬浮液。对于 1,000mg的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受 的盐、溶剂化物或水合物的单位剂型，直接向含有3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4] 噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物的瓶中添加 约20mL的水，从而形成浓度约为50mg/mL的悬浮液。在加入水后立即盖 上瓶子，并用手轻柔震荡至少30秒以实现均匀悬浮。尽管该重新配制的悬 浮液在摄入前可在最初的塑料瓶中保存达24小时，但推荐在重新配制后立 即施用该药物。如果在重新配制和给药之间有超过大约15分钟的延误，则 推荐用手轻柔摇动该瓶至少30秒。推荐从瓶中直接施用该悬浮液。进一步 推荐用水洗涤该瓶一次，并将该洗涤液摄入以确保没有粉末遗留在该瓶中。

用于向患者口服施用的单一单位剂型包括但不限于：药囊剂；扁囊剂； 片剂；咀嚼片；囊片；胶囊，如软弹性凝胶胶囊；锭剂；糖锭；分散剂； 粉末；溶液；液体剂型，包括悬浮液(例如，水或非水液体悬浮液)；乳剂(例 如，水包油乳剂或油包水乳剂)；以及酏剂。在一个实施方式中，本发明的 方法包括施用含有过饱和的其它活性试剂的胶体溶液或溶液。可用于本发 明方法的特定剂型的彼此的区分方法对本领域的技术人员而言是显而易见 的。例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing， Easton PA(1990)。

本发明的方法进一步包括施用包含无义密码子抑制剂的无水药物组合 物和剂型。无水药物组合物和剂型可采用无水或低含水量的成分并在低水 分或低湿度条件下制备。

典型的口服剂型可通过充分混合具有无义密码子抑制活性的化合物和 根据常规药物配合技术的至少一种载体或赋形剂制备得到。赋形剂可根据 需要施用的制剂形式可采取各种形式。例如，适于在口服液体或气雾剂剂 型中使用的赋形剂包括但不限于：水、乙二醇、油、醇、调味剂(例如，香 草精)、防腐剂以及着色剂。适于在固体口服剂型中使用的赋形剂(例如，粉 末、片剂、咀嚼片、药囊剂、胶囊和囊片)的范例包括但不限于：淀粉、糖、 微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、结合剂和崩解剂。

特别优选的单位剂型为包含有效量的无义密码子抑制剂的粉剂，其适 于在药学上可接受的溶剂(例如水、牛奶、碳酸饮料、果汁、苹果酱、婴儿 食品或婴儿配方)中重新配制并随后口服施用。在具体实施方式中，该粉剂 可任选地包含与该无义密码子抑制剂联合的一种或多种载体或赋形剂。在 另一实施方式中，该粉剂可在施用或重新配制前贮存于密封容器中。在另 一实施方式中，该粉末被胶囊化(例如，包含在凝胶胶囊中)。

用于口服施用的液体制剂的形式可以是例如溶液、糖浆或悬浮液，或 是在使用前可用水或其它合适运载体配制的干产品(例如，粉末或颗粒)。该 种液体制剂可通过常规方法用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山 梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯 树胶)；非水运载体(例如，杏仁油、油酯、酒精或分馏的植物油)；以及防 腐剂(甲基或丙基-对羟基安息香酸盐或山梨酸)进行制备。该制剂还可酌情 包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。

可用于固体口服剂型中的赋形剂的范例包括但不限于：结合剂、填充 剂、崩解剂和润滑剂。适用于药物组合物和剂型的结合剂包括但不限于： 玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它淀粉、凝胶、阿拉伯树胶等天然和合成树胶、 藻酸钠、海藻酸、其它藻酸盐、粉状黄芪胶、瓜儿胶、纤维素及其衍生物(例 如，乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙 烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如，2208、 2906、2910)，粗晶纤维素及其混合物。

优选的赋形剂包括 Ultra(精制右旋糖)甘露醇、表面活性剂(聚 乙二醇3350和 micro F127(poloxamer 407粉))、崩解剂(交聚维酮)、 硅石粉、、聚丙烯酸和其它赋形剂(羟基乙基纤维素、香草香精、 硬脂酸镁(非牛)、以及硅胶)。

适用于本发明所公开的药物组合物和固体剂型的填充剂的范例包括但 不限于：乳糖、滑石、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉末状纤 维素、葡聚糖、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉及其 混合物。本发明药物组合物的结合剂或填充剂通常占该药物组合物或剂型 的约50％至约99％重量。

适用的微晶纤维素包括但不限于：商品名为AVICEL-PH-101、 AVICEL-PH-103 AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105(可从FMC Corporation， American Viscose Division，Avicel Sales，Marcus Hook，PA购得)的材料及其 混合物。一种特定的结合剂为商品名为AVICEL RC-581的微晶纤维素和羧 甲基纤维素钠的混合物。适用的无水或低水分赋形剂或添加剂包括 AVICEL-PH-103TM和淀粉1500LM。

5.8 剂量和给药方案

不希望受限于理论，本发明的方法部分地包括可最大化地抑制提前翻 译终止和/或无义介导的mRNA降解的无义密码子抑制剂的特定剂量和给 药方案。

本发明的方法包括治疗、预防和控制可通过抑制提前翻译终止和/或无 义介导的mRNA降解来治疗、预防和/或控制的疾病或其症状，同时减少或 避免不良或不需要的作用(例如，毒性或副作用)。此处所述的剂量和给药方 案的优选施用途径为口服(即，摄入溶液、含有超过活性剂饱和浓度的其它 活性试剂的胶体溶液或溶液)。在一个实施方式中，此处所述的剂量或给药 方案的施用途径为局部(例如，经皮肤)施用。

此处所述的剂量和给药方案由于能够达到或维持具有无义密码子抑制 活性的所述化合物的预期血浆浓度而被认为是有用的。不希望受限于理论， 认为在例如24小时或更长的时间内达到并维持无义突变抑制剂相对恒定的 血浆浓度会对患者产生有益的治疗效果。此处所述的剂量和给药方案可用 于到达并维持具有无义密码子抑制活性的化合物的该种治疗性血浆浓度。

在一个实施方式中，本发明的方法包括施用无义密码子抑制剂，其中 该化合物在12小时或24小时的期间内向有此需要的患者施用一、二或三 次，其中各次施用优选间隔约4-14小时。在具体实施方式中，该无义密码 子抑制剂在早晨、下午和晚上各施用一次。在另一实施方式中，该无义密 码子抑制剂在早晨和晚上各施用一次。在另一实施方式中，该无义密码子 抑制剂在早晨施用一次、下午施用一次或晚上施用一次。各次剂量之间的 优选间隔包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14小时。

在一个实施方式中，该无义密码子抑制剂的剂量在24小时的期间内逐 步升高。在具体实施方式中，所施用的所述二剂量高于(例如，两倍于)所述 第一剂量。在另一实施方式中，所施用的该第一和第二剂量保持恒定，而 施用的第三剂量升高(例如，两倍)。不希望受限于理论，认为该无义密码子 抑制剂的施用存在昼夜变化，其中在晚上施用的剂量所得到的血浆浓度高 于在早晨或下午施用剂量所得到的浓度。不希望进一步受限于理论，认为 相对于之前的施用剂量倍增晚上施用的剂量会最佳地维持目标血浆浓度， 同时会降低对该无义密码子抑制剂的总体暴露。

在某些实施方式中，参照以下公式1X、1X、2X在24小时期间内施用 三个剂量，其中X为具体的起始剂量(例如，4mg/kg、7mg/kg或10mg/kg)。 在另一实施方式中，该无义密码子抑制剂在患者进食(即之前或之后)约10， 15、30、45或60分钟内被施用。在一个实施方式中，有效量的无义密码子 抑制剂被散布或混合于食物中。在一个实施方式中，在该无义密码子抑制 剂施用前、施用时或施用后摄取的食物为高脂肪和/或高卡路里和/或高蛋白 食物。

在一个实施方式中，如果在一个治疗周期中形成的不良事件被认为是 剂量限制的，则在该治疗周期的剩余时间内或者直至该不良事件消退，所 施用的该第二或第三剂量(例如，晚上的剂量)被减少约5％、10％、15％、 20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、75％或完全不施用。

特别优选的给药方案为：以大约6-、6-和12-小时的间隔(例如，早餐后 的～7:00AM，午餐后的～1:00PM以及晚餐后的～7:00PM)在就餐后30分钟 内向患者施用无义密码子抑制剂。

在另一实施方式中，本发明的方法包括以介于0.1mg/kg和500mg/kg、 1mg/kg和250mg/kg、1mg/kg和150mg/kg、1mg/kg和100mg/kg、1mg/kg 和50mg/kg、1mg/kg和25mg/kg、1mg/kg和20mg/kg、1mg/kg和10mg/kg、 或2mg/kg和10mg/kg之间的剂量单次或分次(例如，在24小时内三次)向 有此需要的患者施用无义密码子抑制剂。在某些实施方式中，以约2-6 mg/kg、约5-9mg/kg、约6-10mg/kg、约8-12mg/kg、约12-16mg/kg或约 18-22mg/kg的剂量施用无义密码子抑制剂。在某些实施方式中，以约3 mg/kg、约4mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约 14mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg、约200mg/kg 或约300mg/kg的剂量施用无义密码子抑制剂。在另一实施方式中，前述实 施方式中所述的无义密码子抑制剂的任意剂量在24小时的期间内施用一 次、两次或三次。

在另一实施方式中，本发明的方法包括持续疗法，其中在特定的时间 期限(例如，5、7、10、14、20、24、28、60或120天或更长时间)内每天 向有此需要的患者施用无义密码子抑制剂。在一个实施方式中，无义密码 子抑制剂每24小时连续施用一次、两次或三次。在另一实施方式中，无义 密码子抑制剂每天、每周、每月或每年连续施用。在具体的实施方式中， 无义密码子抑制剂每24小时以约4mg/kg、约4mg/kg和约8mg/kg的剂量 连续施用一次、两次或三次，持续数天、数周、数月或数年。在具体的实 施方式中，无义密码子抑制剂每24小时以约7mg/kg、约7mg/kg和约14 mg/kg的剂量连续施用三次，持续数天、数周、数月或数年。在具体的实施 方式中，无义密码子抑制剂每24小时以约10mg/kg、约10mg/kg和约20 mg/kg的剂量连续施用三次，持续数天、数周、数月或数年。在另一实施方 式中，无义密码子抑制剂每24小时以约8mg/kg的剂量连续施用两次，持 续数天、数周、数月或数年。

在另一具体的实施方式中，无义密码子抑制剂在第一周期中每24小时 以约4mg/kg、约4mg/kg和约8mg/kg的剂量连续施用三次，持续数天、 数周、数月或数年，然后在第二周期中每24小时以约8mg/kg的剂量施用 两次，持续数天、数周、数月或数年。在另一具体的实施方式中，无义密 码子抑制剂在第一周期中每24小时以约8mg/kg的剂量施用两次，持续数 天、数周、数月或数年，然后在第二周期中每24小时以约4mg/kg、约4mg/kg 和约8mg/kg的剂量连续施用三次，持续数天、数周、数月或数年。在这些 实施方式中，该第一和第二周期可以分开或伴随一段不施用无义密码子抑 制剂的休息期。该休息期可持续数天、数月或数年。

在施用无义密码子抑制剂的各个24小时期间内，优选以大约6-、6和 12-小时的间隔(例如，早餐后的～7:00AM、午餐后的～1:00PM以及晚餐后 的～7:00PM)施用三次。

一个疗程的治疗期间可持续一周、两周、三周、四周、五周、六周、 七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、十三周、十四周、四个月、 五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、 两年、三年、四年、五年或更长。在具体的实施方式中，一个疗程的治疗 期间可以是该个体的终生。该治疗期间可被持续一天、一周、两周、三周、 四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、十三周、 十四周、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、 十一个月、一年、两年、三年、四年、五年或更长的休息期所中断。这可 由本领域的技术人员(例如，医师)确定。

可以理解向有此需要的患者施用的无义密码子抑制剂的量是根据/或可 以根据所涉及患者的实际体重或所涉及患者群体(例如，白人男性、白人女 性、非裔美国男性、非裔美国女性、亚裔男性或亚裔女性，包括胚胎、胎 儿、婴儿、儿童、成年人和老年人)的平均体重进行计算。

5.9 血浆浓度

在一个实施方式中，本发明的方法包括在患者体内维持无义密码子抑 制剂的血浆浓度0.1μg/ml至500μg/ml、0.1μg/ml至400μg/ml、0.1μg/ml 至300μg/ml、0.1μg/ml至200μg/ml、0.1μg/ml至100μg/ml或2μg/ml至 10μg/ml约1至72小时、2至48小时或2至24小时，包括向有此需要的 患者施用有效量的无义密码子抑制剂。在另一实施方式中，本发明的方法 包括维持无义密码子抑制剂的血浆浓度大于约0.1μg/ml、约1μg/ml、约2 μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约15μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、 约30μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125 μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约225μg/ml、约250μg/ml、 约275μg/ml、约300μg/ml、约325μg/ml、约350μg/ml、约375μg/ml或 约400μg/ml至少约2、4、6、8、12、24、36或48小时，包括向有此需要 的患者施用有效量的无义密码子抑制剂。在某些实施方式中，该施用为口 服。

在另一实施方式中，本发明的方法包括在患者体内维持无义密码子抑 制剂的血浆浓度约0.1μg/ml至约400μg/ml至少约2、4、6、8、12或24 小时，包括向有此需要的患者以相同或递增的剂量(例如，此处所述的1X、 1X、2X)施用有效量的无义密码子抑制剂多达每天三次。在某些实施方式中， 该施用为口服。

在某些实施方式中，通过向有此需要的患者每天三次施用该无义密码 子抑制剂，将患者的无义密码子抑制剂血浆水平维持在约0.1μg/ml至约400 μg/ml以上至少2、4、6、8、12或24小时。在具体实施方式中，该施用为 口服。

在一个实施方式中，本发明的方法包括施用无义密码子抑制剂，从而 在施用后约1至约3小时或约2至约4小时出现Tmax血浆浓度。

在一个实施方式中，本发明的方法包括施用无义密码子抑制剂，从而 使该血浆浓度的平均半衰期t1/2为约2至约6小时或约3至约6小时。

在某些实施方式中，本发明的方法包括施用无义密码子抑制剂，该施 用的量可在体内有效生成相当于正常个体中生成的相应野生型蛋白量的 1％或更多、2％或更多、3％或更多、4％或更多、5％或更多、7％或更多、 10％或更多、12％或更多、15％或更多、17％或更多、20％或更多、22％或 更多、25％或更多、27％或更多、30％或更多、32％或更多、35％或更多、 40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或 更多、70％或更多、75％或更多或是80％或更多的该种功能通读蛋白。在一 些实施方式中，本发明的方法包括施用无义密码子抑制剂，该施用的量有 效生成足够的功能通读蛋白，从而获得正常个体中的野生型蛋白的大约 1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％、大约10％、大约15％、大约 20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、 大约55％、大约60％或更多的活性。

在具体的实施方式中，本发明的方法包括施用无义密码子抑制剂，该 施用的量可在体内有效生成相当于正常个体中生成的CFTR蛋白量的至少 约1％或更多、2％或更多、3％或更多、4％或更多、5％或更多、7％或更多、 10％或更多、12％或更多、15％或更多、17％或更多、20％或更多、22％或 更多、25％或更多、27％或更多、30％或更多、32％或更多、35％或更多、 40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或 更多、70％或更多、75％或更多或是80％的该种功能通读CFTR蛋白。

在另一实施方式中，本发明的方法包括施用无义密码子抑制剂，该施 用的量可在体内有效生成相当于正常个体中生成的肌营养不良蛋白蛋白量 的1％或更多、2％或更多、3％或更多、4％或更多、5％或更多、7％或更多、 10％或更多、12％或更多、15％或更多、17％或更多、20％或更多、22％或 更多、25％或更多、27％或更多、30％或更多、32％或更多、35％或更多、 40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或 更多、70％或更多、75％或更多或是80％的功能通读肌营养不良蛋白。

5.10 治疗终点

任何本领域技术人员知道的本发明所公开的疾病的治疗终点或结果均 可用于本发明的方法(例如，参见Politano，等人，2003，Acta Myologica XXII：15-21，其全文在此引用作为参考)。代表性的治疗终点包括但不限于： 如本发明所述的，包括实施例中列举的治疗终点。

杜兴型肌营养不良症的代表性终点包括但不限于：在其它情况下不生 成肌营养不良蛋白的肌肉内肌营养不良蛋白的生成(例如，骨骼肌细胞的肌 膜中肌营养不良蛋白的重新表达)；与相对侧的未处理的肌肉相比，处理的 肌肉的肌肉MRI参与方式和肌容积；以及肌肉力量和表现，包括个体肘部 和膝屈肌和伸肌和手抓力QMT评分以及通过医学研究委员会(MRC)肌肉力 量评分法测定的徒手肌力测试分值。

定量的肌肉力量可以测定，例如通过儿科定量测量系统(PQMS)测定。 主要的力量标记包括由配对屈肌/伸肌组构成的上和下肢的定量肌力法 (QMT)分值。

囊性纤维化的代表性终点包括但不限于：通过鼻跨上皮电位差(TEPD) 评价的CFTR活性；副作用，CFTR蛋白和mRNA的存在，以及肺功能。

淀粉样变性的代表性终点包括但不限于：淀粉样β蛋白的清除；体重 增加，肾小球滤过率，室间隔厚度，淀粉样蛋白的跨组织分配和心脏淀粉 样蛋白负荷，血清中与免疫球蛋白有关的自由轻链(FLCs)的κ/λ比例，以及 心脏肌钙蛋白T和I(cTnT、cTnI)的缺失。

血友病的代表性终点包括但不限于：血液凝固活性，组织因子诱导的 纤维蛋白形成和tPA介导的纤维蛋白溶解中血块溶解时间的缩短。

阿尔海默病的代表性终点包括但不限于：改变的淀粉样前体蛋白(APP) 亚型的血小板比例；总体的、认知的(通过心理测验，例如改良的简易智能 状态测验(MMSE)或改良的Hachinski缺血指数测得)、功能和行为的检测， 包括日常活动和行为，尤其是激动，减少的脑容积缺损(例如，使用MRI 测得)。还可参见Caban-Holt等人，Geriatrics.2005.06；Suppl：3-8。

帕金森病的代表性终点包括但不限于：帕金森病评定量表(UPDRS)的评 分、MMSE、Hamilton-17抑郁、NPI、每日“开”的总时间(TTON)、运动测 试、运动障碍评定、患者日记以及(18)F-多巴的摄取。

动脉粥样硬化症和家族性高胆固醇血症的代表性终点包括但不限于： 降低的胆固醇水平，如降低的MDA-LDL水平和/或增加的高密度脂蛋白胆 固醇；血清脂肪酸状况，血清脂蛋白和血管发炎的标记，降低的血浆同型 半胱氨酸浓度，动脉粥样硬化脉管中的斑块形成(通过MRI或血管内超声 (IVUS))，通过如电子束计算机断层扫描测得的冠状动脉钙化(CAC)，以及 通过如颈动脉内膜中层厚度(IMT)对颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)以及颈 动脉的咽球片段检测测得的减少的动脉阻塞。

侏儒症和巨大症的代表性终点包括但不限于：高度以及生长激素和催 乳激素的水平。

甲状腺功能减退症和甲状腺功能亢进症的代表性终点包括但不限于： TT3、TT4和TSH血清水平以及对甲状腺形态及大小的评价，骨骼年龄， 生长发育和发展商数(DQ)。

视网膜色素变性病的代表性终点包括但不限于：二十二碳六烯酸(DHA) 水平，通过Humphrey视野分析仪对视野敏感性、30-Hz视网膜电图幅度以 及视觉灵敏度测得的眼功能。

晚发婴儿型神经元蜡样脂褐质沉着病的代表性终点包括但不限于：基 于LINCL临床评分表神经学评价和对脑的磁共振成像/磁共振波谱评价。

脊髓性肌萎缩的代表性终点包括但不限于：肌肉力量，运动功能和检 查指数(IFM)的总和，呼吸肌麻痹指数(IMR)以及并仰卧位用力肺活量/理论 指数(ICV/CT)，通过手持肌力计得到的最大自愿等长收缩以及计算的手臂 大分值(总结肘屈曲、手抓力以及三点捏力分数)，和腿大分值(总结膝弯曲、 膝伸展、扩展和足伸展分数)，总运动功能测试量，肺功能检查，定量肌力 测试，和生活质量。

共济失调毛细血管扩张症的代表性终点包括但不限于：降低的α-胎儿 蛋白，改善的免疫功能以及改善的神经功能。

巴特综合症的代表性终点包括，但不限于：提高的血钾水平，提高的 生长和提高的心理功能。

5.11 基因疗法

基因疗法指通过向个体施用表达的或可表达的核酸序列进行的治疗。 本领域中现有的任何基因治疗方法均可用于本发明。以下描述了示范性方 法。

对于基因疗法的一般综述可参见，Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993， Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，Science 260：926-932 (1993)；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May， 1993，TIBTECH 11(5)：155-215。重组DNA技术领域中公知的方法描述于 Ausubel等人(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons， NY(1993)；以及Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual， Stockton Press，NY(1990)。

一方面，核酸序列是在适当宿主中表达该核酸序列的表达载体的一部 分。具体地，这种核酸序列包括可操作地与蛋白编码区连接的启动子(包括 外源启动子)，所述启动子为可诱导型或组成型，且任选地具有组织特异性。 在另一特定的实施方案中，所使用的核酸序列中所述蛋白编码序列和任意 其它目标序列与促进该基因组在目标位点上发生同源重组的区域侧翼连 接，从而提供了该蛋白编码核酸序列的染色体内表达(Roller和Smithies， 1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature 342：435-438)。

所述核酸序列向个体的传递可以是直接的，此时该个体直接暴露至该 核酸序列或携带该核酸序列的载体；也可以是间接的，此时首先在体外以 该核酸转化细胞，然后将细胞移植入该个体。这两种方法分别被称为体内 或体外基因疗法。

在具体的实施方式中，所述核酸序列被直接施用至体内，在其中该核 酸序列表达或生成编码产物。这可通过本领域已知的许多方法中的任一方 法实现，例如，通过将其构建为合适核酸表达载体的一部分，并例如通过 如下方法而将其施用至细胞内来实现：例如使用缺陷型或减毒型逆转录病 毒或其它病毒载体感染(参见美国专利4,980,286)，或直接注射裸露DNA， 或通过微粒轰击(例如，基因枪法；Biolistic，Dupont)，或通过具有包含该核 酸序列的原位支架的基质(例如，参见欧洲专利EP 0 741 785 B1和美国专利 5,962,427)，或以脂质或细胞表面受体或转染剂包覆，在脂质体、微粒或微 胶囊中包封，或通过将其与已知进入细胞核的的肽相结合进行施用，将其 与会遭受受体介导的内吞作用的配体相结合进行施用(例如，参见Wu和 Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可用于靶向特异性表达该受体的 细胞类型)等。在另一实施方式中，可形成核酸-配体复合物，其中该配体包 含融合的病毒肽来破坏内涵体，从而使核酸避免溶酶体降解。在另一实施 方式中，该核酸序列可通过靶向特异性受体在体内定向，从而进行细胞特 异性摄取和表达(例如，参见PCT公开WO 92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316、WO 93/14188、WO 93/20221)。可替代地，该核酸序列可被导入 胞内，并通过同源重组被整合至该宿主细胞DNA中以进行表达(Koller和 Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；以及Zijlstra等人， 1989，Nature 342：435-438)。

在具体的实施方式中，使用包含编码预防或治疗性试剂的核酸序列的 病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等人，1993，Meth. Enzymol.217：581-599)。这些逆转录载体包含正确包装病毒基因组并整合进 入宿主细胞DNA所必需的组件。将在基因疗法中使用的所述核酸序列克隆 进一种或多种促进该基因传递进入个体的载体中。有关逆转录病毒载体更 具体的信息可参见Boesen等人，1994，Biotherapy 6：291-302，其描述了使用 逆转录病毒载体传递mdr1基因进入造血干细胞，从而使该干细胞对化疗更 具耐受力。其它阐述逆转录病毒在基因疗法中的用途的参考文献有：Clowes 等人，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Klein等人，1994，Blood 83：1467-1473； Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4：129-141；以及Grossman 和Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114。

腺病毒是可用于基因疗法的另一病毒载体。腺病毒是用于向呼吸道上 皮细胞传递基因的特别受人关注的载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮细胞， 并在此引起轻微的疾病。基于腺病毒的传递系统的其它靶标为肝、中枢神 经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。Kozarsky 和Wilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503中提 供了基于腺病毒基因疗法的综述。Bout等人，1994，Human Gene Therapy 5：3-10显示了腺病毒载体在向恒河猴的呼吸道上皮细胞传递基因中的用途。 腺病毒在基因疗法中的用途的其它实例可参见Rosenfeld等人，1991， Science 252：431-434；Rosenfeld等人，1992，Cell 68：143-155；Mastrangeli等 人，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公布WO94/12649；以及Wang等人， 1995，Gene Therapy 2：775-783。在优选的实施方式中，采用腺病毒载体。

腺相关病毒(AAV)也曾被提议用于基因疗法(Walsh等人，1993，Proc. Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300以及美国专利5,436,146)。

基因疗法的另一方法包括通过诸如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导 的转染或病毒感染等方法将基因转移进入组织培养中的细胞。该种转移方 法通常包括将可选择标记转移进入该细胞。然后对该细胞进行选择，以分 离那些摄取并表达该转移基因的细胞。这些细胞随后被传递进入个体。

在该实施方式中，该核酸首先被导入细胞，随后体内施用所得的重组 细胞。该种导入可通过本领域任何已知的方法进行，包括但不限于转染、 电穿孔、显微注射、以带有该核酸序列的病毒或噬菌体感染、细胞融合、 染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领 域中已知有多种技术可用于将外源基因导入细胞(例如，参见Loeffler和 Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618；Cohen等人，1993，Meth.Enzymol. 217：618-644；Clin.Pharma.Ther.29：69-92(1985))，这些技术均可用于本发 明，只要受体细胞必要的发育和生理功能未被破坏。该技术应能将核酸稳 定转移至该细胞，从而使该核酸可被细胞表达，并优选可被其细胞子代继 承和表达。

所得的重组细胞可通过本领域已知的各种方法传递至个体。重组血细 胞(例如，造血干或祖细胞)优选通过静脉内施用。预期使用的细胞的数量取 决于目标效果、患者状态等，并可由本领域技术人员确定。

用于基因治疗目的导入核酸的细胞包括任意理想的、现有的细胞类型， 且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、 肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细 胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干 或祖细胞，尤其是造血干或祖细胞，例如由骨髓、脐带血、外周血、胎肝 等获得的造血干或祖细胞等。

在优选的实施方式中，用于基因疗法的所述细胞与该个体自体同源。

在重组细胞被用于基因疗法的实施方式中，将编码蛋白的核酸序列导 入细胞，从而使它们可以被该细胞或其子代表达，随后将该重组细胞体内 施用以获得预防或治疗效果。在具体的实施方式中，使用干或祖细胞。任 何能被分离并在体外维持的干和/或祖细胞均可用于本发明的该种实施方式 (例如，参见PCT公布WO 94/08598；Stemple和Anderson，1992，Cell 71：973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A：229以及Pittelkow和Scott， 1986，Mayo Clinic Proc.61：771)。

在具体的实施方式中，用于基因疗法而被导入的核酸包含可操作地与 编码区域连接的组成型或组织特异型启动子。

6.实施例

以下实施例采用了可用于鉴定具有无义突变抑制活性的化合物的方 法。

6.1 实施例1：促进无义突变抑制和/或调节翻译终止的化合物的鉴定和表 征

调节提前翻译终止和/或无义介导的mRNA降解的化合物可通过许多 技术进行鉴定。例如，国际专利申请WO 01/44516 A2(在此全文引用作为参 考)中描述了能调节任意具有提前翻译终止密码子的基因的转录后表达的化 合物的筛选方法。在一个实例中，具有提前终止密码子的mRNA在体外翻 译并用于筛选测试化合物的库。在另一实例中，该具有提前终止密码子的 mRNA为具有提前终止密码子的报告基因。

人们开发了两种用于高通量筛选的两种测定法，以鉴定促进无义突变 抑制的小分子。各测定法中均采用了荧光素酶，因为这是一种功能报告基 因测定法(仅当蛋白为功能蛋白时发光)并且极度灵敏(光强度与nM范围内 的荧光素酶浓度成比例)。第一种测定法为基于细胞的荧光素酶报告测定法， 第二种为由兔网状细胞裂解产物和含无义荧光素酶报告mRNA组成的生物 化学测定法。在基于细胞的测定法中，含UGA提前终止密码子的荧光素酶 报告构建体被转染进入293T人胚胎肾细胞。在生物化学测定法中，含UGA 提前终止密码子的mRNA被用作体外翻译反应(其采用添加了tRNA、血红 素、肌酸酐激酶、氨基酸、KOAc、Mg(OAc)2和磷酸肌酸的兔网状细胞裂 解产物)的报告体。mRNA的翻译在来自病毒的前导序列中启动。合成mRNA 可采用T7启动子和MegaScript体外转录试剂盒(Ambion)在体外制备。在生 物化学和基于细胞的测定法中，已知允许提前终止密码子通读的小分子 3-[3-(4-异丙基-苯基)-2，5-二氧代-咪唑烷-1-基]-苯甲酸可被用作内标。

6.2 实施例2：可提高无义突变抑制并生成功能蛋白的化合物的表征

为测定体内活性，以测试化合物处理具有含有所述无义UGA的荧光素 酶基因的稳定细胞系。在添加了1％青霉素-链霉素(P/S)和10％胎牛血清 (FBS)的标准细胞培养基中将细胞生长至70％汇合，并在处理前一天1:1分 离。在次日，将细胞胰蛋白酶化并向96孔组织培养皿的每个微孔中添加 40,000个细胞。制备各个化合物的系列稀释物以生成跨越2log(30μM至 0.3μM)的六点剂量响应曲线。各微孔中的DMSO溶剂的终浓度恒定为1％。 以1％DMSO处理的细胞作为背景标准，以庆大霉素处理的细胞作为阳性 对照。

6.3 实施例3：无义抑制剂改变化学修饰剂对28S RRNA中特定核苷酸的 可及性。

前述研究已经证明了可降低翻译精确性的庆大霉素和氨基糖苷家族的 其它成员结合至16S rRNA的A位点。通过化学足迹、UV交联和NMR已 显示庆大霉素结合在rRNA的A位点(包含核苷酸1400-1410和1490-1500， 大肠杆菌编号)的核苷酸1406、1407、1494和1496上(Moazed & Noller，1987， Nature 327(6121)：389-394；Woodcock等人，1991，EMBO J. 10(10)：3099-3103；以及Schroeder等人，2000，EMBO J.19：1-9)。

从HeLa细胞制备的核糖体与测试化合物(浓度100μM)一起孵育，然后 以化学修饰剂(硫酸二甲酯[DMS]或凯托沙[KE])处理。化学修饰后，以苯酚 -氯仿萃取rRNA，乙醇沉淀，通过杂交至三个rRNA不同区域的末端标记 寡核苷酸进行引物延伸反应分析，在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行分辨。用于 引物延伸的探针涵盖了整个18S(7个寡核苷酸引物)、28S(24个寡核苷酸引 物)和5S(一个引物)rRNA。这些实验中的对照包括DMSO(由DMSO诱导的 rRNA可及性变化的对照)、巴龙霉素(18S rRNA结合的标记)以及茴香霉素 (28S rRNA结合的标记)。

6.4 实施例4：基于细胞的疾病模型中的提前终止密码子的通读

为了说明无义抑制化合物对特定的遗传性疾病中改变的mRNA的影 响，以测试化合物(20μM)处理在氨基酸1282处(W1282X)具有无义密码子 的支气管上皮细胞系，并用SPQ测定法监测CFTR功能作为cAMP-激活的 氯离子通道(Yang等人，1993，Hum Mol Genet.2(8)：1253-1261和Howard 等人，1996，Nat Med.2(4)：467-469)。这些实验证实了这些细胞的cAMP处理 导致SPQ荧光的上升，这与CFTR-介导的卤化物流出相一致。当细胞未以 测试化合物处理时，或当该细胞未以cAMP刺激时，未观察到荧光的上升。 这些结果表明该种含无义的等位基因在以测试化合物处理后表达的全长 CFTR具有和cAMP-刺激的阴离子通道具有相同作用，从而证实了囊性纤 维化细胞系在以测试化合物处理时提高了氯离子通道活性。

6.5 实施例5：含无义的MDX小鼠的原代细胞在以无义抑制剂处理后表达 全长肌营养不良蛋白

据显示mdx小鼠中导致427kDa肌营养不良多肽提前终止的突变是在 外显子23的位置3185处的C转变成了T(Sicinski等人，1989，Science 244(4912)：1578-1580)。参照已有的描述从1天大mdx小鼠制备小鼠原代骨 骼肌培养物(Barton-Davis等人，1999，J Clin Invest.104(4)：375-381)。在测试 化合物(20μM)存在下将细胞培养10天。每四天更换培养基，并参照已有描 述通过免疫染色检测成肌细胞培养物中肌营养不良蛋白的存在 (Barton-Davis等人，1999，J Clin Invest.104(4)：375-381)。使用未经稀释的针 对肌营养不良蛋白C末端(F19A12)的一级单克隆抗体，并将结合了若丹明 的抗小鼠IgG作为二抗。F19A12抗体将检测通过无义密码子抑制生成的全 长蛋白。在宾夕法尼亚大学通过Leica DMR显微镜、数码相机和相关的成 像软件观察染色。

6.6 实施例6：MDX小鼠中提前终止密码早的通读

根据已有的描述(Barton-Davis等人，1999，J Clin Invest. 104(4)：375-381)，将测试化合物通过植入麻醉小鼠皮下的AlZet渗透泵输入。 施用两种测试化合物剂量。以庆大霉素作为阳性对照，并以仅装有溶剂的 泵作为阴性对照。向泵中加入适当的化合物，使得计算的组织所暴露的剂 量为10μM和20μM。庆大霉素的浓度经计算达到约200μM的组织暴露。 在初期实验中，将小鼠处理14天，随后以克他命麻醉动物并放血。然后切 下实验动物的胫前(TA)肌，冷冻，并用于对结合进入横纹肌肌的营养不良 蛋白进行免疫荧光分析。TA肌肉中肌营养不良蛋白的存在可参照已有描述 通过免疫染色进行检测(Barton-Davis等人，1999，J Clin Invest. 104(4)：375-381)。

6.7 实施例7：3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸的制备

向3-氰基苯甲酸(44.14g，300mmol)的DMF溶液(0.6L)添加K2CO3 (62.19g，450mmol)，并在室温下搅拌30分钟。在20分钟内向该悬浮液添 加碘代甲烷(28mL，450mmol)，将反应混合物在室温下继续搅拌4小时。将 反应混合物注入1.2L冰水，搅拌30分钟，并滤出沉淀物。将白色滤饼溶 解于甲醇(70mL)，并在冷水中重新沉淀。以79％的产率获得白色粉末状的 目标产物(38g，LC/UV纯度为99％)。1H-NMR(CDCl3)δ 8.85(2H)，8.28 (1H)，8.02(1H)，4.17(3H)。

向3-氰基苯甲酸甲酯(50g，310mmol)的乙醇溶液(500mL)在室温下添 加50％羟胺(41mL，620mmol)水溶液。将反应混合物在100℃下搅拌1小 时，并减压去除溶剂。将油状残留物溶解于20/80乙醇/甲苯(50mL×2)，然 后再次浓缩。获得98％纯度(LC/UV)的白色粉末状的目标酯(61g，定量产 率)。1H-NMR(CDCl3)δ 9.76(1H)，8.24(1H)，7.82(2H)，7.51(1H)，5.92(2H)， 3.82(3H)。

此时向3-(N-羟基亚胺甲酰基)-苯甲酸甲酯(60g，310mmol)的无水THF 溶液(200mL)中5℃下添加二异丙基乙胺(75mL，434mmol)，然后在20分 钟内向该混合物添加2-氟苯甲酰氯(48.1mL，403mmol)。将该反应混合物 在室温下搅拌1小时。滤出沉淀物并减压浓缩滤出液。将残留物溶解于乙 酸乙酯(400mL)，然后用水洗涤(200mL×2)。减压去除溶剂，在60％乙酸 乙酯的己烷溶液中将目标产物结晶，得到白色固体状的目标产物(81g，83％ 产率)。1H-NMR(CDCl3)δ 8.18(1H)，8.03(3H)，7.48(2H)，7.18(2H)，5.61 (2H)53.82(3H)。

使用Dean-Stark装置将溶于甲苯(500mL)的44g的3-(N-2-氟苯甲酰亚 胺甲酰基)-苯甲酸甲酯在130℃下回流4小时。将反应混合物在5℃下搅拌 18小时。滤出白色沉淀物并浓缩滤出液，再次在甲苯中结晶。获得99％纯 度(LC/UV)的白色粉固体状的目标噁二唑(38g，92％产率)。1H-NMR(CDCl3) δ 8.91(1H)，8.38(1H)，8.15(2H)，7.62(2H)，7.35(2H)，3.95(3H)。

向3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸甲酯(3.3g，11mmol)的 THF溶液(40mL)添加1.5M NaOH水溶液(10mL，14mmol)。将反应混合物 在100℃下回流2小时。去除有机溶剂，并用水(50mL)稀释该水溶液。然 后以HCl水溶液酸化。滤出白色沉淀物，以冰水洗涤该白色滤饼，然后用 冻干机干燥。获得98％纯度(LC/UV)的白色粉末状的目标酸(3.0g，96％产 率)。熔点242℃；IR 3000(芳香的C-H)，1710(C＝O)；1H-NMR(D6-DMSO) δ 8.31(1H)，8.18(2H)38.08(1H)，7.88(2H)，7.51(2H)；13C-NMR(D6-DMSO) δ 172.71，167.38，166.48，161.25，135.80，132.24，131.79，131.79，131.08， 130.91，129.81，127.76，125.48，117.38，111.70；19F-NMR(D6-DMSO)δ 109.7。

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸的药学上可接受的盐可通 过本领域技术人员已知的方法进行制备。钠盐可按如下制备。向3-[5-(2-氟 -苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸甲酯(33g，111mmol)的THF溶液(400 mL)添加1.5M NaOH水溶液(100mL，144mmol)。将反应混合物在100℃下 回流2小时。减压去除有机溶剂，并在5℃下搅拌该水溶液2小时。滤出白 色沉淀物，浓缩滤出液，并再次在水中沉淀。以冰水洗涤该白色滤饼，然 后用冻干机干燥。获得98.6％纯度(LC/UV)的白色粉末状的目标盐(33g， 96％产率)。

6.8 实施例8：口服治疗无义突变介导的囊性纤维化

本实施例提供了可用于治疗无义突变介导的囊性纤维化的给药方案。

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶 剂化物或水合物作为香草风味的粉末提供以用于悬浮。该药物在现行良好 生产规范(cGMP)条件下生产。该制剂可包括结合剂和悬浮剂、表面活性剂、 以及各种在生产过程中提供辅助的少量赋形剂。该混合物可被包装于40mL 塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，用铝箔封口和白色塑料的、对儿童安全 的盖子进行密封。每个瓶中可包含或125、250或1000mg(总制剂总重量的 25.0％)的药物物质。可替代地，该混合物可制备成如实施例12所述的药囊 剂剂型。赋形剂(及其相对总剂型重量的比例)包括悬浮剂( Ultra[精 制右旋糖]-25.7％)、可提供味道掩饰的结合剂(甘露醇-25.0％)、表面活性剂 (聚乙二醇3350-12.8％和 micro F 127(poloxamer 407粉)-3.7％)、崩解 剂(交聚维酮-5.0％)，以及每种存在的量少于2％的其它赋形剂(羟基乙基纤 维素、香草香精、硬脂酸镁[非牛]、以及硅胶)。瓶标签上注明药物物质的 种类、批次、药物物质的量、以及储藏条件(例如，室温或5℃至8℃冷藏)。

所述药物物质的剂量基于每公斤患者体重的药物毫克数。药物物质的 剂量可大约与现有瓶子的大小保持一致。该给药方案确保总的实际给药剂 量不比理想剂量<50mg或>250mg(即始终在5mg/kg的浮动(assigned)剂量 水平之内)。例如，体重40kg的患者以4mg/kg的剂量进行治疗时的计算剂 量为160mg。该患者应该接受一个250mg瓶(总计250mg)或6.25mg/kg 的剂量。这一相同患者在晚上以8mg/kg的剂量治疗时，则计算剂量应该为 320mg，其应该接受两个250mg瓶(总计500mg)或12.5mg/kg的剂量。这 一相同患者在晚上以10mg/kg的剂量治疗时，则计算剂量为400mg，其应 该接受两个250mg瓶(总计500mg)或12.5mg/kg的剂量。这一相同患者在 晚上以20mg/kg的剂量治疗时，则计算剂量为800mg，其应该接受一个1000 mg瓶(总计1000mg)或25mg/kg的剂量。

该药物产品的重新配制和给药均在室温下进行。在重新配制前无需对 药物产品进行特定的加温。该药物产品可以用任何药学上可接受的溶剂(例 如，水、牛奶、碳酸饮料、果汁、苹果酱、婴儿食品或婴儿配方)进行重新 配制。对于每个250mg瓶，加入～10mL的水或其它药学上可接受的溶剂 以在总悬浮液中形成约25mg/mL的浓度。对于每个1000mg瓶，加入～20 mL的水或其它药学上可接受的溶剂以在总悬浮液中形成约50mg/mL的浓 度。同样可以制备约150mg/mL的悬浮液。当水或其它药学上可接受的溶 剂被加入到干的研究试剂中后，立即盖上瓶子并用手剧烈振荡约60秒，以 形成均匀的悬浮液。尽管该悬浮液可在摄入前于最初的塑料瓶中保存达24 小时，但推荐在重新配制后的短时间内摄入该药物。如果在重新配制和给 药之间有超过15分钟的间隔，则应用手剧烈振荡该瓶约60秒。

可持续施用治疗，只要患有或可能患有囊性纤维化的患者需要。表11 列举了3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、 溶剂化物或水合物的示例性每日给药方案，其中每天以6-、6-和12-小时(例 如，-7:00AM、-1:00PM和-7:00PM)的间隔随食物施用三次。在具体的实 施方式中，该患者参照表11连续14天施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑 -3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，随后14天无治 疗，接着给药另外14天，随后又一个14天无治疗。在另一具体实施方式 中，该患者参照表11连续14天以4mg/kg、4mg/kg和8mg/kg的三个每 日剂量施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受 的盐、溶剂化物或水合物，随后14天无治疗，随后以10mg/kg、10mg/kg 和20mg/kg的三个每日剂量给药另外14天，随后又一个14天无治疗。在 某些实施方式中，每天采用表11所列举的单一每日给药方案。在另一实施 方式中，可在不同的天内采用表11列举的不同给药方案。

表11.给药方案

             1                   2                 3

方案         TID随食物给药       TID随食物给药     TID随食物给药

安排         连续每日施用        连续每日施用      连续每日施用

时间                                               剂量

～7:00AM     4mg/kg              7mg/kg            10mg/kg

～1:00PM     4mg/kg              7mg/kg            10mg/kg

～7:00PM     8mg/kg              14mg/kg           20mg/kg

缩写：TID＝每日三次

患者优选在就餐后30分钟内摄入药物；理想情况下该药物应当以约6-、 6-和12-小时的间隔(例如，早餐后的～7:00AM、午餐后的～1:00PM以及晚 餐后的～7:00PM)摄入。患者通过如下方式摄入该药物：将所需量的水或其 它药学上可接受的溶剂注入每个瓶中，将每个瓶子加盖并振荡约60秒，然 后摄入每次服药所需量和大小的瓶子中的内含物。重新配制药物的整个剂 量应当一次摄入。摄入后，用水或其它药学上可接受的溶剂将给药瓶加至 半满，加盖并振荡，然后由患者摄入该瓶中的这种水或其它药学上可接受 的溶剂。该洗涤步骤进行一次。在某些实施方式中，该药物作为药囊剂提 供。在这些实施方式中，称量或测定该药物的适当量，并在施用前与适当 的药学上可接受的溶剂合并。

6.9 实施例9：口服治疗无义突变介导的杜兴型肌营养不良症

本实施例提供了可用于治疗无义突变介导的杜兴型肌营养不良症的给 药方案。

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶 剂化物或水合物作为香草风味的粉末提供以用于悬浮。该药物在现行良好 生产规范(cGMP)条件下生产。该制剂可包括结合剂和悬浮剂、表面活性剂、 以及各种在生产过程中提供辅助的少量赋形剂。该混合物可被包装于40mL 塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，用铝箔封口和白色塑料的、对儿童安全 的盖子进行密封。每个瓶中可包含或125、250或1000mg(总制剂总重量的 25.0％)的药物物质。可替代地，该混合物可制备成如实施例12所述的药囊 剂剂型。赋形剂(及其相对总剂型重量的比例)包括悬浮剂( Ultra[精 制右旋糖]-25.7％)、可提供味道掩饰的结合剂(甘露醇-25.0％)、表面活性剂 (聚乙二醇3350-12.8％和 micro F 127(poloxamer 407粉)-3.7％)、崩解 剂(交聚维酮-5.0％)，以及每种存在的量少于2％的其它赋形剂(羟基乙基纤 维素、香草香精、硬脂酸镁[非牛]、以及硅胶)。瓶标签上注明药物物质的 种类、批次、药物物质的量、以及储藏条件(例如，室温或5℃至8℃冷藏)。

该药物的剂量基于每公斤患者体重的药物毫克数。应当计算将向患者 施用的药物总毫克数相对应的总体积。例如，如果一位30kg的患者需要4 mg/kg，则待传递的剂量为30×4＝120mg。该患者应该使用250mg剂量瓶 进行给药。由于在该种250mg剂量瓶中每mL的悬浮液包含250/10＝25mg 该种药物，因此该患者在每个4mg/kg剂量下应取用120/25＝～5mL该悬浮 液。同一患者在晚上以8mg/kg剂量治疗时，其计算剂量为240mg，并应 该接受一个250mg瓶(10mL悬浮液)。这些体积的各个剂量的悬浮液应该 通过塑料口服给药注射器而从药物瓶中取出。在转移<10mL(针对250mg 瓶)或<20mL(针对1000mg瓶)的部分体积时，应当以适当类型和大小的给 药注射器(例如，Baxa，Exacta-Med校正的无乳胶的塑料口服给药注射器) 从实验药物瓶中取出预定量并使用同一注射器给药。在重新配制后的同一 24小时内，可从悬浮液的相同瓶中取出>1剂量；然而，重新配制的药物不 应为了使用同一物质向同一患者多次给药的目的而储存超过24小时。如果 在1天内需要摄入的药物总量超过10mL(针对250mg瓶)或20mL(针对 1000mg瓶)重新配制的药物，则应在每次给药时使用新一瓶药物。

针对TID给药方案，可施用如下药物剂量：

TID给药方案：125mg药囊剂中每次服药所 摄入的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸的量

  体重范围 (kg)     早餐剂量 (4mg/kg) 午餐剂量 (4mg/kg) 晚餐剂量 (8mg/kg) 25-35 1 1 2 36-44 1 1 3 45-53 2 2 3 54-66 2 2 4 67-78 2 2 5 79-89 3 3 5 90 3 3 6 中间剂量 [范围]   4mg/kg     [3-6mg/kg] 4mg/kg     [3-6mg/kg] 8mg/kg      [7-10mg/kg]

针对BID给药方案，可施用如下药物剂量：

BID给药方案：125mg药囊剂中每次服药所 摄入的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸的量

  体重范围 (kg)     早餐剂量 (8mg/kg) 晚餐剂量 (8mg/kg) 25-35 2 2 36-44 3 3 45-53 3 3 54-66 4 4 67-78 5 5 79-89 5 5 90 6 6 中间剂量 [范围]   8mg/kg      [7-10mg/kg] 8mg/kg      [7-10mg/kg]

该药物产品的重新配制和给药均在室温下进行。在重新配制前无需对 药物产品进行特定的加温。该药物产品可以用任何药学上可接受的溶剂(例 如，水、牛奶、碳酸饮料、果汁、苹果酱、婴儿食品或婴儿配方)进行重新 配制。对于每个250mg瓶，加入～10mL的水或其它药学上可接受的溶剂 以在总悬浮液中形成约25mg/mL的浓度。对于每个1000mg瓶，加入～20 mL的水或其它药学上可接受的溶剂以在总悬浮液中形成约50mg/mL的浓 度。当水或其它药学上可接受的溶剂被加入到干的研究试剂中后，立即盖 上瓶子并用手剧烈振荡约60秒，以形成均匀的悬浮液。尽管该悬浮液可在 摄入前于最初的塑料瓶中保存达24小时，但推荐在重新配制后的短时间内 摄入该药物。如果在重新配制和给药之间有超过15分钟的间隔，则应再次 用手剧烈振荡该瓶约60秒。

可持续施用治疗，只要患有或可能患有有杜兴型肌营养不良症的患者 需要。表12列举了3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上 可接受的盐、溶剂化物或水合物的示例性每日给药方案，其中每天以12- 小时(例如，-7:00AM和-7:00PM)的间隔随食物施用两次，或以6-、6-和12- 小时(例如，-7:00AM、-1:00PM和-7:00PM)的间隔随食物施用三次。在具 体实施方式中，该患者连续14或28天以表12所述的给药方案中的一种施 用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶剂 化物或水合物。在某些实施方式中，每天采用表12所述的单一每日给药方 案。在其它实施方式中，可在不同的天内采用表12所述的不同给药方案。

表12.给药方案

            1                  2                    3                  4

方案        BID随食物施用      TID随食物施用        TID随食物施用      TID随食物施用

安排        连续每日施用       连续每日施用         连续每日施用       连续每日施用

时间                                      剂量

～7:00AM    8mg/kg             4mg/kg               7mg/kg             10mg/kg

～1:00PM    0mg/kg             4mg/kg               7mg/kg             10mg/kg

～7:00PM    8mg/kg             8mg/kg               14mg/kg            20mg/kg

缩写：TID＝每日三次

患者优选在就餐后30分钟内摄入药物；理想情况下该药物应当以约6-、 6-和12-小时的间隔(例如，早餐后的～7:00AM、午餐后的～1:00PM以及晚 餐后的～7:00PM)摄入。患者通过如下方式摄入该药物：将所需量的水或其 它药学上可接受的溶剂注入每个瓶中，将每个瓶子加盖并振荡约60秒，使 用口服给药注射器从该瓶中取出适当量并直接从该给药注射器中摄入内含 物。对应于所述剂量的重新配制药物的整个计算体积应当一次摄入。在药 物摄入后，应以与剂量体积等体积的水或其它药学上可接受的溶剂注入该 给药注射器，并由患者摄入。该洗涤步骤应进行一次。在某些实施方式中， 该药物作为药囊剂提供。在这些实施方式中，称量或测量该药物适当量， 并在施用前与适当的药学上可接受的溶剂合并。

治疗的效力可通过测定足部肌肉趾短伸肌(EDB)活检组织中的肌营养 不良蛋白水平相对于基线测量值的变化来确定。

6.10 实施例10：制备3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药 学上可接受的盐、溶剂化物或水合物的无味剂型

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶 剂化物或水合物可提供为粉末以用于悬浮。该药物在现行良好生产规范 (cGMP)条件下生产。该药物可与结合剂和悬浮剂、表面活性剂、以及各种 在生产过程中提供辅助的少量赋形剂充分混合。该混合物被包装于40mL 塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，该瓶以铝箔封口和白色塑料的、对儿童 安全的盖子进行密封。每个瓶子包含约35mg、约70mg、约125mg、约 140mg、约175mg、约250mg、约280mg、约350mg、约560mg、约700 mg、约1000mg或约1400mg的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲 酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。赋形剂(及其相对总剂型重 量的比例)任选地包括悬浮剂( Ultra[精制右旋糖]-25.7％)、可提供味 道掩饰的结合剂(甘露醇-25.0％)、表面活性剂(聚乙二醇3350-12.8％和  micro F 127(poloxamer 407粉)-3.7％)、崩解剂(交聚维酮-5.0％)，以 及每种存在的量少于2％的其它赋形剂(硅石粉、羟基乙基纤维素、硬脂酸 镁[非牛]、以及硅胶)。瓶标签上注明药物物质的种类、批次、药物物质的 量、以及储藏条件(例如，室温或5℃至8℃冷藏)。在施用前，该药物产品 可在适当体积的药学上可接受的溶剂(例如，水、牛奶、碳酸饮料、果汁、 苹果酱、婴儿食品或婴儿配方)中重新配制。

6.11 实施例11：制备3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药 学上可接受的盐、溶剂化物或水合物的调味剂型

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶 剂化物或水合物可提供为香草风味(例如，通过添加香草萃取物)的粉末以用 于悬浮。该药物在现行良好生产规范(cGMP)条件下生产。该药物可与结合 剂和悬浮剂、表面活性剂、以及各种在生产过程中提供辅助的少量赋形剂 充分混合。该混合物被包装于40mL塑料(高密度聚乙烯[HDPE])瓶中，该 瓶以铝箔封口和白色塑料的、对儿童安全的盖子进行密封。每个瓶子包含 约35mg、约70mg、约125mg、约140mg、约175mg、约250mg、约 280mg、约350mg、约560mg、约700mg、约1000mg或约1400mg的 3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可接受的盐、溶剂化 物或水合物。赋形剂(及其相对总剂型重量的比例)任选地包括悬浮剂  Ultra[精制右旋糖]-25.7％)、可提供味道掩饰的结合剂(甘露醇 -25.0％)、表面活性剂(聚乙二醇3350-12.8％和 micro F 127(poloxamer 407粉)-3.7％)、崩解剂(交聚维酮-5.0％)，以及每种存在的量少于2％的其它 赋形剂(硅石粉、羟基乙基纤维素、香草香精、硬脂酸镁[非牛]、以及硅胶)。 瓶标签上注明药物物质的种类、批次、药物物质的量、以及储藏条件(例如， 室温或5℃至8℃冷藏)。在施用前，该药物产品可在适当体积的药学上可接 受的溶剂(例如，水、牛奶、碳酸饮料、果汁、苹果酱、婴儿食品或婴儿配 方)中重新配制。

6.12 实施例12：3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其药学上可 接受的盐、溶剂化物或水合物的药囊剂剂型

使用囊状物或扁囊包装所述混合物，该囊状物或扁囊具有可包括纸层、 铝箔层和沙林(surlyn)层的多重复合层。每个扁囊可包含约125mg、约250 mg、约500mg或约1000mg的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸 或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。赋形剂(及其相对总剂型重量 的比例)任选地包括表13和表14所列其中之一。

表13.配方

成分                                                  重量％

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其     25.0

药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物

 Ultra                                          24.75

聚乙二醇                                              12.8

 Micro                                           3.7

甘露醇                                                25.0

羟乙基纤维素                                          1.5

香草香精                                              0.75

交聚维酮                                              5.0

硅石粉                                                0.5

硬脂酸镁                                              0.5

滑石                                                  0.5

表14.配方

成分                                                  重量％

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸或其     25.0

药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物

 Ultra                                          25.65

聚乙二醇                                              12.8

 Micro                                           3.7

甘露醇                                                25.0

羟乙基纤维素                                          1.5

香草香精                                              0.75

交聚维酮                                              5.0

硅石粉                                                0.1

硬脂酸镁                                              0.5

然后在该药囊剂上添加标签以注明药物物质的种类、批次、药物物质 的数量、以及储藏条件(例如，5℃至8℃冷藏)。在施用前，可在适当体积 的药学上可接受的溶剂(例如，水、牛奶、碳酸饮料、果汁、苹果酱、婴儿 食品或婴儿配方)中重新配制适当量的药物产品。

6.13 实施例13：跨上皮电位差(TEPD)测定

跨上皮电位差(TEPD)(也称为鼻部电位差)测定通过评价跨上皮生物电 属性可提供分泌上皮细胞中直接的钠和氯运输的灵敏评价(Knowles等人， 1981，N.Engl.J.Med.305(25)：1489-95；Knowles等人，1995，Hum.GeneTher 5：445)。TEPD使用标准化的技术在每个鼻孔中进行(Standaert等人，2004， Ped Pulm.57：385-92)。在该方法中，采用小塑料导管来评价鼻孔中鼻粘膜细 胞的跨外细胞膜电位差。TEPD值以毫伏或mV表示。电负性等于或负于-5.0 mV的氯电导通常认为在正常范围内。TEPD评价在下鼻甲的内层鼻上皮细 胞上进行，因为这些细胞比下气道内层的呼吸道上皮细胞更容易接近，且 已经表明具有相同的离子运输特征(Knowles等人，1981，Am.Rev.Respir.Dis. 124(4)：484～90)。TEPD评价还可在直肠上皮细胞和下呼吸道上皮细胞上进 行。由于CFTR蛋白在运输氯离子通过细胞膜中具有作用且由于缺失该种 蛋白，因此囊性纤维化患者具有异常的TEPD氯电导。作为终点，TEPD的 优势在于它可以检测到氯运输变化，这是在气道细胞中的CFTR存在、功 能活性和顶端位置的数量整合。此外，CFTR活性的直接测量不可能受到 CF支持性治疗或姑息治疗的影响(可能无需全身施用氨基糖苷抗菌素)。重 要的是，有证据表明TEPD值与肺功能障碍和放射学异常的程度相关(Ho 等人，1997，Eur.Respir.J.10(9)：2018-22；Fajac等人，1998，Eur.Respir.J. 12(6)：1295-300；Sermet-Gaudelus等人，2005，Am.J.Respit.Crit.CareMed. 171(9)：1026-1031)。具体地，经证实异丙肾上腺素诱导的CFTR氯活性的 TEPD评价在测定FEV1和放射性评分上比基因型具有更好的预测价值(Ho 等人，1997，Eur Respir J.10(9)：2018-22)。在基线条件下，TEPD评价的氯离 子通道的活性在患有CF的患者中极不可能自发地正常化；在TEPD评价氯 离子通道活性方面观察的任何改善预期可特别地表示CFTR纠正疗法的药 理学活性。因此，它已经成为纠正CFTR障碍的1-2期药理和基因替代研究 的主要终点(Peckham等人，1995，AJ.Clin Sci(London).89(3)：277-84； Wilschanski等人，2003，N.Engl.J.Med.349(15)：1433-41)。

6.14 实施例14：CFTR免疫荧光

可通过标准化技术从患者的各个鼻孔采集和处理鼻粘膜刮除物，以通 过免疫荧光或CFTR mRNA定量来进行评价CFTR蛋白(Clancy等人，2001， Am.J.Respir.Crit.Care Med.163(7)：1683-92；Amaral等人，2004，J.Cyst. Fibros.3 Suppl 2：17-23)。普通上皮细胞(例如，来自于鼻粘膜刮除物)的免疫 荧光染色表面大多数CFTR蛋白存在于顶端表面。在无义突变介导的CF动 物模型中或在患有无义突变介导的CF的患者中，没有观察到CFTR染色(例 如，在对提前终止突变纯合的患者中)或主要在核周区域观察到CFTR染色 (例如，在具有阻止正常CFTR胞内运输的ΔF508突变的患者中)。在动物模 型中和患者中，功能野生型或非野生型CFTR蛋白的成功生成与通过免疫 荧光检测到的顶端表皮CFTR蛋白的再现相关(Clancy等人，2001，Am.J. Respir.Crit.Care Med.163(7)：1683-92；Wilschanski等人，2003，N.Engl.J. Med.349(75)：1433-41)。

6.15 实施例15：肺功能试验

肺功能试验(包括FEVl、FVC和MEF25-75)以标准肺活量测定法进行 检测。肺功能(包括MEF25-75、FVC、以及特别地FEV1)评价已被认为是 CF患者的确定性临床终点(Food and Drug Administration，第62版， Anti-Infective Drugs Advisory Committee.Discussion of NDA for tobramycin solution for inhalationfor the management of cystic fibrosis patients. November，1997；Tiddens，2002，Pediatr.Pulmonol 34(3)：228-31)。已经表明 FEV1和其它肺功能试验检测与疾病严重性相关，其根据医疗服务利用情况 和IV抗生素的使用情况预测疾病发病率，并显示与CF有关的死亡风险 (Food and Drug Administration，第62版，Anti-Infective Drugs Advisory Committee.Discussion of NDA for tobramycin solution for ihhalation() for the management of cystic fibrosis patients.November，1997)。肺功能试验易 于实施(即使对于仅7岁大的患者)，并采用广泛使用的标准设备和技术。可 使用既定的与患者年龄、身高和性别有关的规范性方程进行解读。认为 FEV1的改善定量显示了CF中有意义的临床益处，并用作α链道酶和吸入 得妥布霉素的注册审批的基础(Food and Drug Administration，第62版， Anti-Infective Drugs Advisory Committee.Discussion of NDA for tobramycin solution for inhalation()for the management of cystic fibrosis patients. November，1997)。

6.16 实施例16：用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸口服治疗无 义突变介导的囊性纤维化的2期研究

患者必须满足以下所有条件，方可有资格被招募进入本研究：

1.基于确定性异常出汗试验的文件证明诊断患有CF(通过毛果芸香碱 电离子导入法得到汗水氯化物>60mEq/升(LeGrys，Sweat testing：Sample collection and quantitative analysis：Approved guidelines—第2版，National Committee for Clinical Laboratory Standards 2000；第20卷：14))；

2.通过TEPD测得异常氯化物分泌(比使用无氯阿米洛利和异丙基肾上 腺素测得的氯化物分泌-5mV TEPD评价更正)；

3.在cftr基因的一个等位基因中存在无义突变；

4.有文件表明已经进行过cftr基因测序；

5.年龄≥18岁；

6.体重≥40kg；

7.FEV1≥根据年龄、性别和身高的预测值的40％(Knudson标 准)(Knudson，1983，Am.Rev.Respi.r Dis.127：725-734)；

8.室内空气下血氧饱和度(通过脉搏血氧测定法测定)≥92％；

9.在研究药物施用和随访期中，男性和女性患者愿意(如未手术绝育) 禁止性交或者采用避孕屏障或医学避孕方法；

10.怀孕测试为阴性(对于有生育可能的女性)；

11.愿意并有能力遵守定期访问、药品施用计划、研究程序(包括TEPD 测量、临床实验室试验以及PK取样)、以及研究限制；

12.能够提供书面知情同意书；以及

13.亲自签署并注明日期的知情同意的证明文件，表明患者已被告知该 试验的所有相关方面。

出现下列任一条件时不得将患者招募进入本研究：

1.根据研究者的观点，以前的或现发生的医学疾病(例如，伴发病、精 神疾病、酒精中毒、药物滥用)、病史、体检发现、ECG发现或实验室异常 可能对患者安全有不利影响、使治疗期或随访期不可能完成或可能影响研 究结果的评价；

2.在研究治疗开始前两周内发生急性疾病，包括急性上或下呼吸道感 染；

3.在研究治疗开始前2月内有肺病主并发症的病史(包括近期大量咯血 或气胸)；

4.胸部X光筛选异常，其表明具有临床意义的非CF的活跃性肺病， 或者新的重大异常(如肺不张或胸腔积液)，其可能是临床意义的从属于CF 的活性肺病的指征；

5.乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体检测或人类免疫缺陷病毒(HIV) 检验阳性；

6.血色素<10g/dL；

7.血清白蛋白<2.5g/dL；

8.肝功能异常(血清总胆红素>正常的上限，或血清ALT、AST或GGT >大于正常上限的2.0倍)；

9.肾功能异常(血清肌氨酸酐>正常上限的1.5倍)；

10.怀孕或哺乳；

11.固体器官或血液移植史；

12.在试验治疗开始前14天内接触另一研究药物；

13.正参与任何其它的治疗性临床试验；

14.正使用噻唑烷二酮过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)激动剂， 例如，罗格列酮(或同等药物)或吡格列酮(或同等药物)；

15.在试验治疗开始前14天内改变了鼻内药物治疗(包括使用皮质类固 醇、色甘酸、异丙托溴铵、苯肾上腺素或羟甲唑啉)；

16.在试验治疗开始前14天内改变了全身性或吸入性皮质类固醇治 疗；

17.在试验治疗开始前14天内或试验治疗期间使用或需要吸入性庆大 霉素或阿米卡星；或者

18.在试验治疗开始前14天内需要全身性氨基糖甙类抗生素。

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸以本发明所述的剂型提供。 参照下文的56日计划向15名患者(12名来自于在以色列进行的2期试验， 3名来自在美国进行的2期试验；七名患者为男性，8名为女性；患者的平 均年龄为22岁；且所有的患者具有囊肿性纤维化的多种迹象和症状，包括 一定程度的肺功能障碍)口服施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲 酸：以4mg/kg、4mg/kg和8mg/kg每天三次(TID)施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4] 噁二唑-3-基]-苯甲酸14天，然后14天无治疗(周期1，共28天)，然后以 10mg/kg、10mg/kg和20mg/kg每天三次(TID)施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4] 噁二唑-3-基]-苯甲酸14天，然后14天无治疗(周期2，共28天)。

临床终点可通过以上所述的方法进行评价。在治疗前以及周期1和周 期2的14日和28日进行TEPD检测。在治疗前以及周期1和周期2的14 日和28日从各名患者的各鼻孔采集鼻粘膜刮除物。在以色列所进行的研究 中于治疗前、周期2的第1日、周期1的13或14日以及周期2的13日或 14日进行肺部检测，包括测定FEV1、FVC和MEF25-75；在美国进行的研究 中于治疗前以及周期2的13或14日检测相同的参数。

TEPD氯电导的平均变化。这是各个研究参与者在治疗期开始至结束的 TEPD氯电导变化的平均值。例如，假设三名参与者的TEPD氯电导的变化 分别为-7.0mV、-2.0mV和-9.0mV，则这三个参与者的TEPD氯电导的平 均变化为-6.0mV。

具有氯电导响应的患者百分比。这是在使用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二 唑-3-基]-苯甲酸治疗的末期显示了TEPD氯电导响应的患者的百分比。针对 本试验的目的，氯电导响应被定义为至少-5mV的TEPD氯电导提高。例如， 对于基线TEPD氯电导值为+1.0mV，治疗末期TEPD氯电导值为-6.0mV 的患者，其TEPD氯电导提高了-7.0mV，这表示具有氯电导响应。

TEPD氯电导值提高至正常范围的患者百分比。如上文指出，电负性等 于或负于-5.0mV的氯电导通常认为在正常范围内。这样，基线TEPD氯电 导值为+1.0mV的患者可被认为具有异常值，因为该值比-5.0mV更具电正 性。如果在治疗末期，该患者的TEPD氯电导值提高为-6.0mV，表示该值 被提高至正常范围，因为该提升后的值比-5.0mV更具电负性。

根据患者性别、年龄和身高，研究入口的平均FEV1为正常值的66％， 而研究入口的平均FVC为正常值的80％。本分析中15名患者中的14人具 有铜绿假单胞菌的气道定殖(囊性纤维化患者的常见细菌感染，能导致严重 肺炎)。15名患者中的14人还患有胰腺功能不全并需要慢性胰酶替代疗法。 患者具有较低的体重，研究入口的平均体重为58.3kg。

表15显示了15名患者的TEPD结果。各个测定的结果分别显示为鼻 孔最佳值和两个鼻孔平均值。过去TEPD测验的结果通常显示为鼻孔最佳 值。然而，由囊性纤维化治疗剂开发网络最近制定的指南推荐同时显示两 种TEPD结果。可明显看到具有不同类型的CFTR基因无义突变的患者中 TEPD氯电导提高。

表15

                                       较低剂量水平               较高剂量水平

TEPD结果

                                    结果          p-值         结果          p-值

TEPD氯电导的平均变化：

鼻孔最佳值                          -9.0mV        <0.001       -6.4mV        0.010

两个鼻孔平均值                      -6.7mV        <0.001       -4.4mV        0.023

TEPD氯电导提高≥-5mV的患者数：

鼻孔最佳值                          9/15(60％)    <0.001       8/15(53％)    <0.001

两个鼻孔平均值                      6/15(40％)    0.005        7/15(47％)    <0.001

TEPD氯电导提高至正常的患者数：

鼻孔最佳值                          8/15(53％)    0.008        8/15(53％)    0.008

两个鼻孔平均值                      6/15(40％)    0.032        7/15(47％)    0.016

较低和较高3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸剂量水平的治 疗效果并不是统计学上显著的，这表明没有必要作进一步的剂量提升，且 即使较低剂量的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸也能有效提高 TEPD氯电导。还观察到有关第二终点的统计上显著的结果和正向趋势。具 体地，尽管本试验未检测到第二终点方面的统计上的显著变化，但观察到 了从研究入口至高剂量治疗周期末期患者的平均FEV1、FVC和体重的统计 学上的显著提高。表16显示了该结果。对于肺功能的变化，一名患者不包 括在内，因为该患者在高剂量治疗周期的末期并未检测肺功能。

表16

                                                  较高剂量治

终点                                   研究入口            变化

                                                 疗末期             p-值

肺功能(表示为相对性别、年龄和

身高的正常值的百分比)：

平均FEV1...........................    65.8％    69.1％    3.3％    0.015

平均FVC............................    80.2％    85.1％    4.9％    0.037

体重                                   58.3kg    59.0kg    0.7kg    0.012

表17描述了来自这15名患者的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]- 苯甲酸中期PK参数。不同性别的PK参数没有明显差异。

表17

此外，尽管未通过生活质量问卷来正式检测患者症状的变化，但试验 研究者被要求询问患者囊性纤维化症状的变化。在中期分析包括的15名患 者中，6名报告了健康的总体改善，6名报告了咳嗽的减少，10名报告了粘 液厚度的减少和更容易清除粘液。

随后进行以3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸口服治疗无义 突变介导的囊性纤维化的第二个2期研究方案。

该治疗以两个28天的周期施用。每个周期包括连续14日每日以3-[5-(2- 氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸进行治疗，然后计划为14日无研究药 物给药期。如果需要，周期2的治疗可在周期1的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4] 噁二唑-3-基]-苯甲酸最后剂量后早至10天或晚至28天开始。

群组1中的患者将在周期1内每日三次分别以4mg/kg、4mg/kg和8 mg/kg的剂量以6-、6-和12-小时(±～30分钟)的间隔施用3-[5-(2-氟-苯 基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想情况下每个剂量应在就餐后～30分钟 (例如，早餐后的～7:00AM、午餐后的～1:00PM、晚餐后的～7:00PM)内施 用。在第二个周期内进行计划的给药方案改变，从而使该群组中的每个患 者在周期2内以8mg/kg的剂量每日两次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑 -3-基]-苯甲酸。理想情况下每个剂量应在就餐后～30分钟(例如，早餐后的 ～7:00AM和晚餐后的～7:00PM)内施用。

群组2中的患者在周期1内以8mg/kg的剂量并以12小时(±～30分 钟)的间隔每日两次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想 情况下每个剂量应在就餐后～30分钟(例如，早餐后的～7:00AM和晚餐后的 ～7:00PM)内施用。在第二个周期内进行计划的给药方案改变，从而使该群 组中的每个患者将在周期2内以4mg/kg、4mg/kg和8mg/kg的剂量每日 三次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想情况下每个剂量 应在就餐后～30分钟(例如，早餐后的～7:00AM、午餐后的～1:00PM、晚餐 后的～7:00PM)内施用。

6.17 实施例17：用免疫荧光和WESTERN印迹检测肌营养不良蛋白、肌聚 糖和肌营养不良蛋白聚糖的表达

在治疗前于局部麻醉和清醒镇静(在某些情况下可能需要全身麻醉)的 情况下进行一只脚的EDB肌肉和上覆皮肤的活组织检查，并在治疗的最后 一天进行另一只脚的活组织检查。该活组织检查方法采用标准技术进行 (Stedman，2000，Human Gene Therapy 11：777-90)。在该方法中(如有可能) 去除整个腹肌。在治疗前采集活检组织时，将肌肉标本分为至少3个片段， 并将治疗最后一天采集的活检标本至少分为2个片段。将活检标本置于用 Ringer盐溶液润湿的telfa纱布海绵上。在立体解剖显微镜下以低倍数观察 活检标本，以确定纤维取向。在可能时以锋利的手术刀以横截方式(与纤维 取向垂直)横切肌肉，并放置2分钟以使痉挛停止。然后在液氮冷却的异戊 烷中冷冻该样本，转移至液氮容器，并在液/气界面1英寸以上保留2分钟， 从而在浸入液氮之前缓慢冷却并蒸发异戊烷，并包入预先冷却(于液氮中冷 却并储存在干冰上)的标记了研究编号、位点编号、患者编号、日期、患者 姓名首字母以及脚的位置(右侧脚或左侧脚)的金属薄片中。

所有的样本容器均清晰标明个体身份和采集日期。标记应当以能够防 止脱落的方式固定在样本容器上。进行该操作后立即运送样本以供分析/培 养/主要检查(central review)。为检测肌营养不良蛋白，可采用3种市售的识 别该蛋白C末端、N末端和杆状区的抗体。为检查肌聚糖和肌营养不良蛋 白聚糖复合物，如有可能采用市售的针对α-、β-、γ-和δ-肌聚糖以及β-肌营 养不良蛋白聚糖的抗体。该分析中采用了表面荧光显微术。在对正常肌肉 标本进行荧光强度的校正后，以CCD相机捕获图像。将图像数字储存和留 存以供进一步考察，并在研究完成时进行最终的评价。还对组织进行处理 以使用相同抗体通过Western印迹检测组织中的肌营养不良蛋白、肌聚糖和 β-肌营养不良蛋白聚糖。捕捉显微镜图像并留存以供进一步考察和在研究完 成时进行最终的评价。保留剩余肌肉组织样本以进行DMD中涉及的mRNA 和蛋白的验证试验。免疫染色和Western印迹可用于蛋白检测。

肌肉活检通常作为研究过程中诊断和疗效测定的一部分在DMD个体 上进行。选择EDB是因为它是日常活动的非必需肌肉，因此该肌肉的取样 不会对该个体产生不利的功能后果。由于很少使用，EDB肌肉不太可能显 示大量的肌肉纤维更换，因此是检测肌营养不良蛋白的合适组织。由于EDB 肌肉易于辨别，可在局部麻醉状态下解剖，并提供了足够进行所需分析的 组织数量，因而EDB肌肉的取样还提供了其它的实际优势。免疫荧光和 Western印迹是在肌肉活检标本上确认全长肌营养不良蛋白的存在或缺失 的常规测试。肌营养不良蛋白的缺失被看作是DMD的确诊。肌营养不良蛋 白的修复并定位到肌肉膜被认为是临床前和临床药效活性的直接测量 (Barton-Davis，1999，J.Clin.Invest.104(4)：375-81；Politano，2003，Acta Myol. 22(1)：15-21)。

6.18 实施例18：上肢和下肢肌力法

上下肢肌力法可通过手持式肌力计根据标准方法进行(Beenakker，2001， Neuromuscul.Disord.11(5)：441-6；Hyde，2001，Neuromuscul.Disord.11(2)： 165-70)。(根据个体的基线功能状态)推荐评价的肌肉组包括髋外展肌、膝伸 肌、肘屈肌和伸肌、以及手抓力。可进行双侧评价，且可从每个肌肉组的 每一侧记录三个测量值。这些参数可在治疗前、治疗的第二至最后一天、 以及治疗后的随访期内进行监测。在治疗前和治疗期间，该肌力法可在肌 肉活检之前进行。

通过手持肌力计进行的肌力法评价是针对可走动和不可走动的个体的 肌肉力量的一种灵敏的可重复的检测法(Beenakker，2001，Neuromuscul. Disord.11(5)：441-6；Hyde，2001，Neuromuscul.Disord.11(2)：165-70)。患有 肌营养不良症的个体的评分信度高(Stuberg，1988，Phys.Ther.1988 68(6)： 911-82；Hyde，2001，Neuromuscul.Disord.11(2)：165-70)。与徒手肌力测定相 比，肌力法更为灵敏，且对肌肉功能检测的复杂性更低(McDonald，1995，Am. J.Phys.Med.Rehabil.(5 Suppl)：S70-92)。该测试可由评价者(例如，医生或物 理治疗师)简单地实施。

6 19 实施例19：计时功能试验

计时功能试验包括从仰卧姿势站起所需的时间，行走10米所需的时间， 以及爬上4级标准大小的阶梯所需的时间(Mendell，1989，N.Engl.J.Med. 320(24)：1592-7；Griggs，1991，Arch.Neurol.48(4)：383-8)。这些参数可在治 疗前、治疗的第二至最后一天、以及治疗后的随访期内进行监测。在治疗 前和治疗期间，该计时功能试验可在肌肉活检之前进行。

这些试验(仰卧姿势站起所需的时间、行走10米所需的时间、以及爬上 4级标准大小的阶梯所需的时间)提供了对可走动个体的功能能力的附加检 测。这些试验重现性好、较为常用、易于实施，并能记录对类固醇治疗性 介入的响应(Mendell，1989，N.Engl.J.Med.320(24)：1592-7；Griggs，1991， Arch.Neurol.48(4)；383-8)。

6.20 实施例20：血清CK水平

血清CK活性采用市售的NADH连接的动力学测定(Diagnostic Chemicals Ltd.，Oxford，CT)进行评价。血清CK水平可在治疗前，治疗期第 1天(第一剂量前)、第7天、第14天、第21天和第27天，以及治疗后的 第42天和第56天进行检测。血清CK在杜兴型肌营养不良症中上升，因此 它是该疾病的简易可测诊断标记，并可作为该药物药理活性的潜在生物标 记(Mendell等人，1989，New Eng.J.Med.320(24)：1592-1597)。

血清CK提供了对全身肌肉完整性的检测。在患有DMD的个体中该酶 在血清中的浓度会上升50至100倍，且对其水平的检测可用于进行该疾病 的早期诊断(Worton，The muscular dystrophies，在Scriver CR.，Beaudet A.L.， Sly W.S.，Valle D编，The metabolic and molecular basis of inherited disease. 第8版，第4卷，New York：McGraw-Hill，2001：5493-523中)。通过血清CK 水平的检测可以监测该疾病的进展，并作为肌肉损伤的标记。尽管运动诱 导的变化可带来可变性(Politano，2003，Acta.Myol.22(1)：15-21)，但该标记仍 具有一定优势，因为它用广泛使用的可靠的测定法可容易地、反复地和频 繁地评价。已有临床研究显示血清CK的下降与类固醇治疗中肌肉力量的提 升相一致(Reitter，1995，Brain Dev.17 Suppl：39-43)。

6.21 实施例21：真皮纤维原细胞及肌肉细胞培养

在来自患者的肌肉组织和皮肤进行研究，以确定来自患者的原代肌肉 培养中的肌营养不良蛋白生成是否与体内的肌营养不良蛋白生成相对应。 这些实验评价来自患者的真皮纤维原细胞在以Myo-D-生成表达构建体转 染后体外分化成为肌肉细胞时(Wang，2001，Development 128：4623-33)是否 响应治疗而显示生成肌营养不良蛋白。皮肤细胞应答与临床活性的相关性 可为选择进行治疗的患者，或是为治疗DMD的新试剂筛选提供易获性预测 试验。细胞可按如下方式培养。活检物质在运输过程中储存于人扩增培养 基(或PBS)中，如有需要置于冰上以储存更长时间。如果该组织不在24小 时内制备，则该物质可冷冻于含10％ DMSO的人扩增培养基并在液氮(或干 冰)中储存。在准备组织以建立成肌细胞培养时，以PBS洗涤活检材料。向 培养皿添加足以使该组织润湿的PBS。用刀片将活检材料彻底切碎至几乎 均匀悬浮的状态。添加每克组织约2ml的胶原酶/分散酶/CaCl2溶液，并继 续破碎数分钟(例如，5×5×5mm的肌肉活检标本使用1ml的酶溶液)。将该 悬浮液转移至无菌管中，并在37℃下水浴中孵育，直至该混合物成为稀浆 状(例如，约20至30分钟)。在孵育过程中通过多次上下移液使该悬浮液进 一步匀浆化。如有需要，使用注射器上下移液进行附加的重悬浮循环。向 该悬浮液添加8mL的人扩增培养基并混合。将混合物在1200rpm下离心 10分钟。将细胞团重悬浮于3ml人扩增培养基。将细胞接种到胶原涂覆的 6孔平板的一个微孔上，或者，根据材料的数量，接种到T25胶原涂覆的瓶 中。在37℃和5％CO2下培养细胞48小时。去除未吸附细胞，并转移至另 一胶原涂覆的微孔中(作为备份)。向第一个微孔添加新鲜的扩增培养基(3 ml)。将第一微孔的细胞培养至汇合，并直至获得两个汇合的T75瓶。为进 行储存，将细胞从一个T75瓶中移入4个具有1ml冷冻培养基的低温保存 管中冷冻。培养物中的肌原性细胞成分可通过肌间线蛋白染色进行检测。 在肌间线蛋白阳性细胞的百分比太低的情况下，需要预接种该培养物。

6.22 实施例22：3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸口服治疗杜兴 型肌营养不良症的2期研究

个体必须满足以下所有条件，方可有资格被招募进入本研究：

1.基于5期所表示的临床表型，及血清CK提高和肌肉活检标本中肌 营养不良蛋白缺失(以肌营养不良蛋白的C末端部分的抗体进行的肌纤维膜 染色呈阴性)，诊断患有杜兴型肌营养不良症(DMD)；

2.肌营养不良蛋白基因中存在无义突变；

3.有文件记载表明进行过肌营养不良蛋白基因测序，或在未进行过该 测序时，已将血液样本发送用于验证性肌营养不良蛋白基因测序；

4.经物理检查或射线成像证明在双足上均有EDB肌肉；

5.能够走动；

6.男性；

7.年龄≥5岁；

8.已知性活跃的个体愿意在研究药物施用和随访期中禁止性交或者采 用避孕屏障或医疗避孕方法；

9.愿意并有能力遵守定期访问、药品施用计划、实验室试验、研究限 制、以及研究程序(包括肌肉活检、肌力法、以及PK取样)；

10.当年龄≥18岁时，能够提供书面知情同意书，或当年龄≥7岁时，能 够提供书面知情同意(经父母亲/监护人同意)。如果该个体年龄<7岁，可获 取父母/法定监护人的同意；以及

11.亲自签署并注明日期的知情同意的证明文件(年龄≥7岁的儿童同样 要求同意)，该证明文件表明该个体/父母/法定监护人已被告知该试验的所有 相关方面。

出现下列任一条件时不得将个体招募进入本研究：

1.根据研究者的观点，以前的或现发生的医学疾病(例如，伴发病、精 神疾病、酒精中毒、药物滥用)、病史、体检发现、ECG发现或实验室异常 可能对患者安全有不利影响、使治疗期或随访期不可能完成或可能影响研 究结果的评价；

2.具有充血性心力衰竭的临床症状和表现(美国心脏病学院/美国心脏 病协会C阶段或D阶段)(Hunt，2001，J.Am.Coll.Cardiol.35：2101-13)；

3.乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体检测、或人类免疫缺陷病毒(HIV) 检验阳性；

4.血色素<10g/dL；

5.血清白蛋白<2.5g/dL；

6.GST或总胆红素异常(>正常的实验室上限)；

7.肾功能异常(血清肌氨酸酐>正常的实验室上限的1.5倍)；

8.固体器官或血液移植史；

9.正在使用免疫抑制疗法(非皮质类固醇类)；

10.在试验治疗开始前28天内接触另一研究药物；

11.正参与任何其它的治疗性临床试验；

12.正使用噻唑烷二酮过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)激动剂， 例如，罗格列酮(或同等药物)或吡格列酮(或同等药物)；

13.在研究治疗开始前3个月内改变了全身性皮质类固醇疗法(例如， 治疗的启动；治疗的中止；剂量、进度或类固醇类型的改变)；或者

14.在试验治疗开始前3月内用全身性氨基糖甙类抗生素治疗。

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸以本发明所述的剂型提供。 对每个治疗组施用治疗28天。对患者的初始群组每日三次以给定的剂量水 平(例如，4、4和8mg/kg)的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸治 疗28天。如果该初始患者对药物耐受，则第二组患者每日三次接受更高剂 量水平(例如，10、10和20mg/kg)的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]- 苯甲酸。这样，每位患者接受了总计84剂量的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二 唑-3-基]-苯甲酸。在28天治疗的末期，每位患者将继续进行附加的28天无 治疗。

在每个剂量水平下，推荐以6、6和12小时(±～30分钟)间隔每天三 次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。理想情况下每个剂量应 在就餐后～30分钟(例如，早餐后的～7:00AM、午餐后的～1:00PM、晚餐后 的～7:00PM)内施用。尽管可以理解在门诊安排中可能出现不同的给药方案， 但推荐该处方方案(包括给药间隔和给药和就餐的关系)紧随PK样本采集的 日子。临床终点可通过如上方法进行评价。

向六位患者以早餐时4mg/kg、午餐时4mg/kg和晚餐时8mg/kg的方 案每日三次施用3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸，其每日总剂量 为16mg/kg。所有的患者均可走动，但具有DMD的特征表现和症状，包括 一定程度的肌肉功能障碍和提高的CK浓度。未报道严重的药物相关不良事 件。初步结果提示所有潜在的药物相关不良事件的严重性均较温和。这种 不良事件包括腹泻1例；腹部疼痛1例；以及胀气2例。目前尚未在患者 的身体检查、生命体征测量、或心电图中发现有安全问题。在血清肝酶、 胆红素、肌酐或脲氮方面未观察到临床意义的提高。治疗顺应性良好，患 者接受了>95％的预期的28天低剂量水平的全部药物治疗。未有患者由于 不良事件而停止治疗。

表18描述了来自这6名患者的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯 甲酸中期PK参数。在DMD2期研究中的取样期之间的27天治疗间隔中既 没有药物积累的证据，也没有由代谢诱导的药物水平下降的证据。

表18

参照如下方案进行额外的2期研究以评价3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二 唑-3-基]-苯甲酸在患有无义突变介导的DMD的患者中的安全性、顺应性、 PK、对全长肌营养不良蛋白表达的影响以及临床活性。

分别在早餐、午餐和晚餐后以4、4、8mg/kg(低剂量)，10、10、20mg/kg(中 剂量)，和20、20、40mg/kg(高剂量)的剂量水平口服施用28天的3-[5-(2- 氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸。26位男孩(年龄：5-13岁；终止密码 子：15UGA、6UAG、5UAA；基线血清CK：8，645-49,500IU；类固醇使 用：19/26)完成了低(n＝6)或中(n＝20)剂量水平的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二 唑-3-基]-苯甲酸。所有的不良事件和实验室异常均为轻至中度，且其频率或 严重性没有剂量相关性变化。两种剂量水平下的顺应性均>98％。第1和第 28天的PK显示随时间变化血浆暴露稳定；然而，在3-[5-(2-氟-苯基)-[1.2，4] 噁二唑-3-基]-苯甲酸治疗的健康成年志愿者和囊性纤维化患者中的暴露较 低。治疗前肌肉活检组织的肌管培养显示，在24/24(100％)可评价的患者中， 肌营养不良蛋白表达用体外3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸治 疗表现出剂量依赖性提高。相对于基线，在低和中剂量下的男孩中分别发 生4/6(67％)(90％CI 27-94％)和10/20(50％)(90％CI 30-70％)的体内肌营养 不良蛋白表达的治疗后提升。在3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸 施用过程中血清CK水平明显下降。在28天的治疗中，肌肉力量和计时功 能的变化较小，不太明显。

3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯甲酸在患有无义突变介导的 DMD的男孩中安全地诱导了全长肌营养不良蛋白的体外和体内表达，并降 低了血清CK水平。尽管低和中剂量水平的3-[5-(2-氟-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3- 基]-苯甲酸具有活性，但它们未形成与最大临床前活性相关的血浆暴露。对 高剂量水平下的另12位男孩的评价正在进行。

7.等同

本领域的技术人员应该认识到或能利用常规实验确定本发明所述的发 明的具体实施方式的众多等同方式。这些等同方式应该包含在所附权利要 求的范围内。本说明书中所涉及的所有出版物、专利和专利申请均引用作 为参考，其引用程度如同每一个单独的出版物、专利和专利申请特定地单 独引为参考一样。

本申请主张于2006年3月30日提交的美国临时申请序列号60/787,333 以及于2006年6月12日提交的美国临时申请序列号60/813,085的权益， 其披露的内容在此全文引用作为参考。

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