技术领域
[0001] 本
发明属于检测
生物分子反应的装置，特别涉及一种基于激光扫描共聚焦显微系统的时实观测和检测生物分子反应的表面等离子共振装置。
[0002] 背景技术
[0003] 在生命科学研究中，生物分子相互作用是一种基本的生命现象，也是现代生命科学研究的重大问题之一，研究交互作用的传统方法有多种，如放射免疫分析、酶连结免疫分析、标记示踪法等。然而，由于这些过程涉及不同种类和含量的细胞、生物分子，而且各种物质间存在着复杂的相互作用，因而利用这些传统的研究方法很难准确获取相关的传递信息，同时，日益增加的新蛋白和DNA序列数据也迫切需要能够准确、快速鉴定生物作用的方法。因此，近年来许多现代技术，如激光扫描共聚焦
显微镜、暗
视野显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、
电子显微镜(TEM，SEM、AFM等)、表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)等已被用于实时观察生物分子相互作用过程。在这些技术中，表面等离子共振
传感器具有测量准确度较高、响应快、抗
电磁干扰能
力强、实时监控、低样品消耗、操作简易和灵敏度较高等优点，特别是在生物科学领域中，此技术可实时追踪分子间相互作用的动力学信息，并能获得生物分子间相互作用的动力学常数和平衡常数，引起了人们的极大兴趣，并在近十年里得到了迅速的发展。虽然表面等离子共振仪能方便、快捷地测量分子、纳米
单体及
蛋白质间相互作用的动力学信息(动力学常数和平衡常数)，但难以区分非特异性
吸附，无法原位精确观察相互作用过程，对
温度、样品组成等干扰因素敏感，多数实验数据是在不精确的实验设计下获得的，因此该系统仍需优化、改进和提高。其中方法之一是与其它仪器联合使用以提高仪器灵敏度和可靠性，如与电化学仪器联用研究电化学动力学过程等。目前国际上与其它仪器的联合使用并已商品 化的有AUTOLAB电化学表面等离子共振仪(Electrochemistry Surface PlasmonResonance)。而与其它技术结合的表面等离子共振仪器目前仅限于实验室装备的应用，如腔环降(ring-down)表面等离子共振仪，近场光学扫描显微镜表面等离子共振仪，
傅立叶变换表面等离子共振仪、MALDI-TOF质谱表面等离子共振仪，微流控多通道表面等离子共振检测仪等。
[0004] 另一方面，激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)作为一种高级的
荧光显微镜，由于具有穿透性强，其检测深度可达100μm，可对样本进行一定深度光学
断层，获得高标准的连续光学切片，高图像
分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点，因此在生物学、医学、高分子材料、生物化学、胶体化学等众多研究领域，激光共聚焦技术都有着广泛的应用。然而，激光扫描共聚焦系统也有其局限性：如无法准确获得相互作用的动力学信息(动力学常数和平衡常数)、存在荧
光漂白现象、定量灵敏检测困难等。这些局限性限制了该系统的进一步提升及在其它领域如材料科学、纳米体系及超分子聚集体中的应用。
[0005] 激光扫描共聚焦技术与表面等离子共振相结合，利用表面等离子共振的高灵敏性，能获取分子间相互作用的动力学信息，及激光扫描共聚焦技术的高三维图像分辨率和较深的穿透性等特点，实现原位实时，定量灵敏检测。为深入了解不同物种包括小分子、蛋白分子、大分子、纳米单体、细胞之间的相互作用信息及动力学过程提供新一代强有力的研究工具和手段，必将在
纳米技术、大分子结构和功能、生物分子的
信号转导过程等新兴研究方向上发挥重要作用，并对纳米科学、信息科学、生命科学的发展产生一定的影响。 [0006] 发明内容
[0007] 本发明的目的是将激光扫描共聚焦技术与表面等离子共振相结合，利用表面等离子共振的高灵敏性，能获取分子间相互作用的动力学信息，及激光扫描共聚焦技术的高三维图像分辨率和较深的穿透性等特点，实现原位实时，定量灵敏检测。从而提供一种既能原位定性定量检测又能实时观测生物分子反应的表面等离子共振装置。
[0008] 本发明的基于激光扫描共聚焦显微系统的表面等离子共振检测装置，包括转动样品平台、半球形棱镜、恒温流通池、倒置激光扫描共聚焦成像显微镜、注射
泵、电控转
角装置、
数据采集和处理系统。
[0009] 一具有三维手动调节机构的样品平台，在样品平台上有表面等离子共振的核心部件半球形棱镜，半球形棱镜下方有恒温流通池；所述的恒温流通池的进液口通过管路与
注射泵的出液口相连接，恒温流通池的出液口通过管路与注射泵的进液口相连接，以使恒温流通池中的液体循环流通。
[0010] 所述的样品平台置于一倒置激光扫描共聚焦成像显微镜的载物台
位置。 [0011] 一电控转角装置包括步进
电机控制的转动平台，及两个固定在转动平台上的
机械臂。
[0012] 其中，在一机械臂上沿出射光的光路方向顺序设置产生表面等离子共振的
激光器、扩束镜组、起偏器，在另一机械臂上沿反射光的光路方向顺序设置聚焦透镜、
硅光电
二极管；激光器输出的光通过扩束镜组和起偏器聚焦在样品平台上的表面等离子共振的核心部件半球形棱镜；经半球形棱镜反射，由聚集透镜会聚到硅
光电二极管上，再由数据线输出。
[0013] 所述的出射光路上的产生表面等离子共振的激光器、扩束镜组，起偏器，与反射光路上的聚焦透镜，硅光电二极管分别集成在两个机械臂上，机械臂固定在转动平台上，通过步进电机控制转动平台的转动，可以
自动调节聚焦在半球形棱镜上的入射光束和出射光束的角度。
[0014] 所述的硅光电二极管与
锁相
放大器通过数据线连接，
锁相放大器通过数据线与数据采集和处理系统连接，数据采集和处理系统通过数据线与注射泵的
控制器相连接。 [0015] 所述的产生表面等离子共振的激光器是
波长为632.8nm的He-Ne激光器。 [0016] 所述的恒温流通池采用聚四氟乙烯材料做四壁，
石英玻璃做底面，
橡胶密封圈密封，注射泵作为恒温流通池中液体的流通动力源。
[0017] 所述的数据采集和处理系统由带有BNC适配器的数据采集卡和
数据处理装置(如计算机)构成；数据采集卡通过数据线与数据处理装置连接；数据处理装置通过数据线与注射泵的控制器相连接。
[0018] 所述的半球形棱镜的平底面的外表面
镀有金膜或
银膜。
[0019] 所述的硅光电二极管和锁相放大器构成光
电信号转换器。
[0020] 所述的样品平台为具有三维手动调节机构并有半球形棱镜固定装置的不锈
钢支架。
[0021] 所述的表面等离子共振的核心部件半球形棱镜集成于具有三维手动调节机构的样品平台上，并置于倒置激光扫描共聚焦成像显微镜的载物台位置，可以通过样品平台的调节来确定激光扫描共聚焦成像系统的物面。
[0022] 本发明中的BNC适配器接收锁相放大器
输出信号，由数据采集卡采集BNC适配器输出的数据，并传送给数据处理装置；数据处理装置对数据采集卡发送来的数据进行存储、分析和处理。
[0023] 本发明结合倒置激光扫描共聚焦成像显微镜和表面等离子共振检测的优点，可以同时对生物样品间的反应进行定量定性表面等离子信号检测的同时进行荧光成像观察。 [0024] 本发明具有：
[0025] (1)本发明采用硅光电二极管作为反射光的接收元件，当入射
激光束经过一系列光学系统后入射到镀有金膜或银膜的半球形棱镜上，金膜或银膜上用化学方法修饰上一层生物样品(如
抗体分子)，当恒温流通池中的样品(
抗原分子)与金膜或银膜上的样品发生反应，导致金膜或银膜上物质折射率的变化，产生表面等离子共振现象，在样品不动的情况下移动出射光路和反射光路，硅光电二极管会接收到表面等离子信号，当激光器的波长一定时，步进电机控制出射光路和反射光路同步反向移动，不用移动转动样品平台，只采用硅光电二极管就可以将一定角度范围内的表面等离子信号接收，这样不仅减少了移动样品带来的噪声，而且大大提高
信噪比和检测灵敏度；
[0026] (2)采用表面等离子共振的核心部件半球形棱镜放在倒置激光扫描共聚焦成像显微镜载物台位置，使得本发明的装置可以同时对生物样品进行荧
光标记成像监测和表面等离子共振检测，这样可以对生物样品特别是蛋白和细胞的具体反应位置做定性和定量的双重原位检测。如：蛋白和细胞的作用是否发生在细胞膜、细胞壁或细胞的其他位点等。通过实时成像观察和表面等离子共振信号变化的检测对物质相互作用的具体位点及动力学过程进行研究；
[0027] (3)本发明的装置结构简单，易于操作，能应用于化学、生物、医学、材料、环境、安全等多个领域。为纳米科学、材料科学、生物化学及交叉领域的科学问题的深入研究提供新的高效率研究手段；
[0028] (4)本发明的出射光路系统和反射光路系统分别集成于两个机械臂上，采用步进电机同步控制固定有机械臂的转动平台，使得光束的入射角度可以在50°～78°之间自动调整。
附图说明
[0029] 图1本发明
实施例1基于激光扫描共聚焦显微系统的表面等离子共振检测装置的结构示意图。
[0030] 附图标记
[0031] 1.He-Ne激光器 2.扩束镜组 3.起偏器
[0032] 4.半球形棱镜 5.恒温流通池 6.倒置激光共聚焦成像显微镜 [0033] 7.注射泵 8.聚焦透镜 9.硅光电二极管
[0034] 10.锁相放大器 11.数据采集卡 12.计算机
[0035] 具体实施方式
[0036] 下面结合具体实施例来对本发明做进一步的解释和说明。
[0037] 实施例1
[0038] 请参见图1。基于激光扫描共聚焦显微系统的表面等离子共振检测装置，包括样品平台、半球形棱镜、恒温流通池、倒置激光扫描共聚焦成像显微镜、注射泵、电控转角装置、数据采集和处理系统。
[0039] 一具有三维手动调节机构的样品平台，在样品平台上有表面等离子共振的核心部件半球形棱镜，半球形棱镜下方有尺寸为15mm×15mm×5mm的恒温流通池5，体积为3
1125(mm) 的恒温流通池采用聚四氟乙烯材料做四壁，石英玻璃做底面，橡胶密封圈密封；
所述的恒温流通池5的进液口通过管路与注射泵7的出液口相连接，恒温流通池5的出液口通过管路与注射泵7的进液口相连接，注射泵作为恒温流通池中液体的流通动力源，以使恒温流通池中的液体循环流通。
[0040] 在样品平台上有表面等离子共振的核心部件半球形棱镜，所述的半球形棱镜的平底面的外表面镀有50nm厚的金膜。样品平台置于一倒置激光扫描共聚焦成像显微镜6的载物台位置。
[0041] 一电控转角装置包括步进电机控制的，及两个固定在转动平台上的机械臂。 [0042] 其中，在一机械臂上沿出射光的光路方向顺序设置产生表面等离子共振的激光器1、扩束镜组2、起偏器3，在另一机械臂上沿反射光的光路方向顺序设置聚焦透镜8、硅光电二极管9；激光器1输出的光通过扩束镜组2和起偏器入射到样品平台上的表面等离子共振的核心部件半球形棱镜上；经半球形棱镜4折射到半球形棱镜底面的金膜上，被金膜反射，由聚集透镜8聚焦到硅光电二极管9接收后，再由数据线输出。
[0043] 所述的出射光路上的产生表面等离子共振的激光器1、扩束镜组2，起偏器3，与反射光路上的聚焦透镜8，硅光电二极管9分别集成在两个机械臂上，机械臂固定在转动平台上，通过步进电机控制转动平台，可以自动调节聚焦在半球形棱镜上的入射光束和出射光束的角度。
[0044] 所述的硅光电二极管9与锁相放大器10通过数据线连接，锁相放大器10通过数据线与带有BNC适配器的数据采集卡11连接，数据采集卡11通过数据线与计算机12连接；计算机12通过数据线与注射泵7的控制器相连接。
[0045] 本发明装置中采用的是功率为10mW，波长为632.8nm的He-Ne激光器作为
光源，出光孔径为3mm，从激光器1出射的激光束经由扩束镜组
准直后，再由起偏器(New Focus5524)校正偏振方向后变成偏振方向平行于入射面的p偏振光；然后入射到底面镀有50nm金膜的半球形棱镜上，所述的金膜上用化学的方法修饰有生物敏感膜如IgG抗体分子，通过电控转角装置调节光束的入射角度，使入射光在金膜和生物敏感膜界面处产生表面等离子共振现象，半球形棱镜的底面的恒温流通池里流通有anti-IgG，并与生物敏感膜
接触发生反应，通过注射泵(SP200i注射泵容量10μL～140ML，最大流速147mL/min，最小流速0.001μL/小时)控制anti-IgG反应物进出恒温流通池与生物敏感膜反应引起折射率改变，折射率的改变引起表面等离子共振角度发生变化。所述恒温流通池的温度范围为20℃～45℃，
精度±0.5℃，anti-IgG反应物进出恒温流通池的流速范围为0.005～
380ml/min，精度为±1％。所述扩束镜组2由连续变倍扩束镜头和准直镜筒构成，在出射光路方向上顺次放置连续变倍扩束镜头和准直镜筒，其适用波长范围450～680nm、扩束比为
5X～6X、出射光斑和反射光斑直径分别为4mm和24mm，镜筒总长度为134mm；所述的半球形棱镜4采用市场上购买的球面半径为20mm的K9玻璃棱镜、
不锈钢棱镜支架可以放置半球形棱镜于激光扫描共聚焦显微镜样品台位置，不锈钢棱镜支架固定于一市场上可以买到的三维手动调节平台上，实现倒置激光扫描共聚焦成像显微镜成像物面的寻找。所述的倒置激光扫描共聚焦成像显微镜(OLYMPUS FV1000)分辨率为2um。
[0046] 经金膜表面反射的光经聚焦透镜8聚焦后，由硅光电二极管(BPX-65)9接收并转换成电信号；硅光电二极管输出的电信号通过数据线输入到锁相放大器10(Stanford Research Systems SR830 DSP)并进一步被滤波放大，
光信号转换成电信号后由数据采集和处理系统读取。
[0047] 本发明装置采用固定波长角度变化的表面等离子共振检测方式，具体是将两个分别集成有反射光路和出射光路元件的机械臂(
铝合金加工而成)，固定于可垂直放置使用的步进电机控制的转动平台，由此组成电控转角装置来实现表面等离子共振角度的调节。 [0048] 所述的机算计12配置有数据采集卡11(PCI-6220)、BNC适配器(BNC-2110)和LabVIEW编写的采集程序，锁相放大器10输出的电信号首先经由BNC适配器进行分通道处理，锁相放大器输出的信号被分成振幅信息和位相信息两个部分，然后将锁相放大器的振幅信息和位相信息分别送入数据采集卡采集，最后把采集到的数据传送给用LabView编写的数据处理程序进行存储、分析和处理，同时倒置激光扫描共聚焦成像显微镜对反应过程进行成像，结果输入到计算机12与表面等离子共振信号数据实时对比。
[0049] 本实施例的装置中还采用了机械臂将出射光路和反射光路分别集成在两个机械臂上，两个机械臂侧面通过螺钉固定在同一个可以垂直
水平面的转动样品平台上，可同时以同一点为轴转动，从而可以按照实验的需要在50°～78°之间调节光束的入射角度。 [0050] 采用该套实验装置能够检测到折射率变化2×10-5，样品检测灵敏度达到10-11g/ml，并达到图像分辨率为2μm。
[0051] 实施例2
[0052] 硅光电二极管9采用型号为9863/100B的
光电倍增管，其它与实施例1相同，本实施例的装置的灵敏度和检测精度能提高2个数量极。
[0053] 实施例3
[0054] 将半球形棱镜的平底面的外表面镀有的金膜换成银膜，表面采用化学修饰有爱滋病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的抗体，恒温流通池中流有爱滋病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的抗原，其它与实施例1相同，可以对爱滋病毒1型做出诊断检测。
[0055] 实施例4
[0056] 将金膜表面修饰有可以识别汞离子的荧光探针，恒温流通池中流有被汞离子污染的生物细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的汞离子进行检测。 [0057] 实施例5
[0058] 将金膜表面修饰有可以识别锌离子的荧光探针，恒温流通池中流有被锌离子污染的生物细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的锌离子进行检测。 [0059] 实施例6
[0060] 将金膜表面修饰有可以识别镁离子的荧光探针，恒温流通池中流有被镁离子污染的生物细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的镁离子进行检测。 [0061] 实施例7
[0062] 将金膜表面修饰有可以识别氟离子的荧光探针，恒温流通池中流有被氟离子污染的生物细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的氟离子进行检测。 [0063] 实施例8
[0064] 硅光电二极管9采用感光面积为1.0mm2的方形高速感应硅光二极管(BPX-65)组2
成30×30二维阵列，其它与实施例1相同，本实施例的装置能够实现对面积为9(cm) 微阵列生物样品进行检测。
[0065] 实施例9
[0066] 硅光电二极管9采用1300×1024的CCD面阵(AM1300)其它与实施例1相同，本2
实施例的装置能够实现对面积为9(cm) 微阵列生物样品进行检测。
