本发明涉及新的HMGB1高亲和力结合结构域A盒(Box-A)(HMGB1 A盒)的或HMGB1 A盒的生物学活性片段的聚合体缀合物。进一步，本 发明涉及新的HMGB1高亲和力结合结构域A盒(HMGB1 A盒)的或HMGB1 A盒的生物学活性片段的多肽变体的聚合体缀合物。此外，本发明涉 及所述聚合体缀合物用于诊断，预防，减轻和/或治疗与细胞外HMGB1 相关和/或与RAGE增加的表达相关的病理(pathologies)的用途。

HMGB1蛋白属于高速泳动族(HMG)蛋白家族。HMG蛋白(这样称 谓是由于其在聚丙烯酰胺凝胶中的高速电泳泳动)是真核细胞中与分 离的染色质相关的最广泛的非组蛋白蛋白。这些蛋白在DNA弯曲，成 环，折叠和缠绕(wrapping)中起普遍的“建筑学”(architectural) 作用，因为它们扭曲，弯曲或修饰DNA结构和具有转录因子或组蛋白 的复合物(Andersson等，2002；Agresti等，2003；Degryse等， 2003)。高速泳动族1(HMGB1)蛋白通常是细胞核因子，特别是引起 DNA弯曲和促进数个转录复合物的结合的转录调节分子。

在结构上，HMGB1蛋白是在哺乳动物间具有高度保守序列的大约 25kDa的蛋白，其中214个氨基酸中2个在所有哺乳动物物种中具有 保守性取代。HMGB1广泛存在于所有脊椎动物细胞核中并且特别能够 在成纤维细胞，神经元，肝细胞，神经胶质细胞以及衍生自造血干细 胞的细胞(包括单核细胞/巨噬细胞，嗜中性粒细胞和血小板)中发现。 HMGB1分子具有由以下三个不同结构域组成的三联结构：称为HMG A 盒和B盒(Box-B)的两个DNA结合结构域，和酸性羧基末端，这使 得它两端带有电荷(bipolarly charged)。

这两个HMGB1盒涉及作为非序列特异性建筑学DNA结合元件的蛋 白功能，赋予结合DNA至被识别的扭曲的DNA结构中的能力并稳定核 小体装配，重塑和滑移。A-和B-HMG盒都由高度保守的84个氨基酸 残基组成，带强正电荷并且排列在具有相似的L形折叠的三个α-螺旋 中。“L”的长臂包含N-末端伸展链和螺旋III(Andersson等2002； Agresti等，2003；Thomas，J.O.2001)，而短臂包含螺旋I和II。 结构-功能分析表明HMGB1的促炎细胞因子结构域是B盒，特别是其前 20个氨基酸序列。A盒是由HMGB1引起的炎症细胞因子释放的极弱的 激动剂并且竞争性抑制B盒和完整蛋白的促炎活性。因此，从药理学 观点来看，A盒作为由B盒和HMGB1诱导和/或维持的病理情况的拮 抗剂起作用。

第三个结构域，羧基末端或酸性尾部，由于它包含30个重复的天 冬氨酸和谷氨酸残基而带强负电荷，并且通过约20个残基的碱性区域 与盒连接。小鼠和大鼠HMGB1与人的形式的不同仅在于两个位于该连 续C末端段(stretch)的取代。

除了它的核定位和作为转录因子调节子的功能外，还在细胞外基 质中发现，HMGB1由免疫系统的活性细胞(单核细胞和巨噬细胞)主 动释放或由损伤或坏死细胞被动释放(Andersson等，2002； Scaffidi等，2002；Bonaldi等，2002；Taniguchi等，2003； Friedman等，2003；Palumbo等，2004)。

细胞外释放的HMGB1作为有效的细胞因子和作为非常有效的巨噬 细胞刺激因子起作用。HMGB1直接通过与细胞膜结合起作用，诱导信 号传导和趋化作用，具有趋化因子样功能(Yang等，2001)并且进一步 间接通过上调促炎细胞因子的表达和分泌起作用。这使得细胞外 HMGB1蛋白成为有效的趋化性和免疫调节蛋白，其促进有效的炎症免 疫反应。此外，属于HMG蛋白家族并且能够弯曲DNA的其他蛋白，和 细胞外基质中的HMGB1一起释放。这些蛋白尤其是HMGB2，HMGB3， HMG-1L10，HMG-4L和SP100-HMG。它们都具有HMGB1高度同源性氨基 酸序列。像HMGB1，它们通过与相同受体相互作用，导致相同的相互 作用的下游途径来引起/维持炎症病理。

在健康细胞中，HMGB1通过被动和主动运输迁移至细胞质。然而， 所有的培养细胞和静息单核细胞在细胞核中包含大量HMGB1，表明在 基线情况下输入比输出更有效。细胞可以通过乙酰化HMGB1中丰富的 赖氨酸残基，从而中和它们的碱性电荷并且使它们不能作为核定位信 号起作用来从细胞核运输HMGB1。细胞核HMGB1高乙酰化决定该蛋白 从细胞核到细胞质的再定位(在成纤维细胞中，例如)或它在分泌性 内吞溶酶体中的积累(在活性单核细胞和巨噬细胞中，例如)和随后 朝经由非经典囊泡介导的分泌途径的释放的重定向。然后通过生物活 性溶血卵磷脂(LPC)引起已经活化的单核细胞分泌HMGB1，所述溶血 卵磷脂随后在炎症位点中通过由活化后数小时的单核细胞产生的分泌 性磷脂酶sPLA2的作用由卵磷酯产生。因此，HMGB1分泌似乎由两种 信号诱导(Bonaldi等，2003)并且以三个步骤发生：1)首先，炎症 信号促进HMGB1乙酰化和其从细胞核到细胞质的再定位(步骤1)和 在细胞质分泌性囊泡中的储存(步骤2)；然后，分泌信号(细胞外 ATP或溶血卵磷脂)促进胞吐(第三步)(Andersson等，2002； Scaffidi等2002；Gardella等，2002；Bonaldi等，2003； Friedman等，2003)。

释放的HMGB1已被鉴定为与RAGE受体结合的配体之一。该受体在 大多数细胞类型中表达，并且主要在内皮细胞，血管平滑肌细胞，单 核细胞和巨噬细胞和单核吞噬细胞中以高水平表达。识别涉及HMGB1 的C末端。HMGB1和RAGE的相互作用引起由RAGE上调和受体依赖的 信号传导介导的持续一段时间的细胞活化。特别地，HMGB1和RAGE的 相互作用活化了数个细胞内信号转导途径，包括有丝分裂激活蛋白激 酶(MAPK)，Cdc-42，p21 ras，Rac和核易位因子κB(NF-κB)，通常 与炎症过程相关的转录因子(Schmidt等，2001)。

根据数个实验证据，释放的HMGB1还可以与属于Toll样受体家族 的一个或多个亚类的受体相互作用。进一步地，HMGB1还可以与血栓 调节蛋白的功能性N末端凝集素样结构域(D1)相互作用。由于血栓 调节蛋白的功能性D1结构域截取和结合循环的HMGB1的能力，阻止了 与RAGE受体和Toll样受体的相互作用。

当体内释放时，HMGB1是非常有效的细胞因子和有效的巨噬细胞 刺激因子。事实上，像其他内毒素血症的细胞因子介体，HMGB1体外 活化来自人巨噬细胞的多种促炎细胞因子(TNF，IL-1α，IL-1β， IL-1Ra，IL-6，IL-8，MIP-1α和MIP-1β)的级联。因此，HMGB1在 急性炎症期间作为晚期介体起作用并且在早期介体反应减退后参与全 身性炎症发病机理的重要途径。

而且，促炎环境中观察到的RAGE上调和多种急性和慢性炎症疾病 中已证实的该受体的增加的表达为RAGE作为将来涉及炎症的药物干 扰的有吸引力的靶标提供支持。

观察到的HMGB1的体外促炎作用以及循环的HMGB1水平与体内全 身性炎症的致病序列的开发(development)之间的关联表明该细胞因 子样分子的治疗靶向应具有相应的临床价值，暗示通过“晚期”施用 HMGB1的细胞外活性的(选择性的)拮抗剂/抑制剂的新的治疗方法。

因此，为了阻断该细胞外HMGB1趋化-细胞因子(chemo-cytokine) 蛋白，进行了数次尝试。数个重要方法关注于施用抗HMGB1抗体，抗 HMGB1片段(例如HMGB1盒)的抗体，抗RAGE抗体，可溶性RAGE(sRAGE)， 丙酮酸乙酯(Czura等，2003；Lotze等，2003)和血栓调节蛋白的N 末端凝集素样结构域(D1)。

HMGB1 A盒，HMGB1中两个DNA结合结构域之一，已被鉴定为HMGB1 的特异性拮抗剂：即使当病理诱导后初始治疗被延迟24小时时，高度 纯化的重组A盒保护小鼠免受致死性实验脓毒症，进一步暗示HMGB1 拮抗剂可以在比用于其他已知细胞因子的窗口更宽的临床相关窗口中 成功施用(Yang等，2004)。

HMGB1截短突变体的结构功能分析揭示HMGB1的A盒结构域竞争 性取代HMGB1对巨噬细胞的可饱和的结合，尤其是拮抗HMGB1的活性。 如已经观察到的，与抗HMGB1抗体的保护活性一致，即使当迟至手术 诱导脓毒症后24小时开始治疗时，A盒的施用拯救小鼠免于脓毒症 (Yang H.等，2004)。选自与HMGB1蛋白结合的抗体或抗体片段，HMGB1 基因反义序列和HMGB1受体拮抗剂的HMGB1拮抗剂或抑制剂从US 6,468,533，WO 02/074337和US 2003/0144201中可知。

因此用于抑制和/或拮抗细胞外HMGB1趋化-细胞因子蛋白的有希 望的尝试基于以下实验证据：两个对DNA高亲和力的结合结构域(即 HMGB1 A盒和HMGB1 B盒，其存在于HMGB1分子中)在释放到细胞外 空间的蛋白中具有两个相反的作用。HMGB1 B盒的主要活性是介导归 因于HMGB1蛋白的促炎活性。在另一方面，HMGB1 A盒作为与B盒结 构域的促炎活性竞争的拮抗剂起作用。

专利申请WO 2006/024547公开了HMGB1 A盒或HMGB1 A盒的生 物学活性片段的多肽变体，其通过野生型HMGB1 A盒蛋白的单个氨基 酸的系统性突变获得。因此，WO 2006/024547提供新的作为细胞外 HMGB1的选择性抑制剂和/或拮抗剂的试剂和它们用于预防、减轻和/ 或治疗相关的和通过细胞外HMGB1趋化因子和/或通过由HMGB1趋化因 子蛋白的细胞外释放导致的多种炎症细胞因子的级联诱导的广谱病理 情况的用途。

可以通过因素，例如在生理pH下的可溶性，通过肾小球过滤的快 速排除，细胞清除和新陈代谢以及易于吸收，在体内妨碍合成蛋白药 物的给药功效。例如，如果经口服，蛋白被消化从而妨碍口服给药的 功效。另一方面，低于65-70kDa的蛋白被快速从体内清除从而妨碍全 身给药的功效。在很多情况下，此类不利作用导致降低的病人顺应性 和降低的药物功效，阻碍了此类蛋白试剂的有效的治疗用途。

用于提高蛋白试剂作用的功效和持续时间和用于降低潜在的毒理 学作用的成功的策略为将生物学活性蛋白试剂与不同聚合体共价结 合。在本领域中最经常使用的用于提高活性试剂的药理和毒理学性质 的聚合体之一为聚乙二醇，简称PEG。聚乙二醇(PEG)聚合体是两亲 的，无毒的和免疫惰性的并且能够与药物缀合以操作很多药代动力学 和毒理学性质。

在本领域中，已报道很多治疗有用的蛋白用聚乙二醇(PEG)的共 价修饰。为了延长蛋白的循环半衰期，将PEG共价连接至蛋白(“聚 乙二醇化”)是有用的，因为它增加了蛋白有效大小并降低了其从体 内清除的速度。而且蛋白的PEG修饰增加了蛋白的可溶性，稳定性并 且减少了蛋白的免疫原性。

因此，本发明所解决的问题是提供新的治疗有用的蛋白试剂，其 作为细胞外HMGB1的选择性拮抗剂和/或抑制剂起作用。因此，本发明 的范围为开发一些聚合体(特别是PEG)的独有性质，以开发HMGB1 高亲和力结合结构域A盒(HMGB1 A盒)的新的给药形式，其与非缀合 HMGB1 A盒多肽相比表现相同的甚至更高的药理学活性和改进的药代 动力学和毒理学性能，并且其允许在各种可能的给药途径中获得 HMGB1 A盒或其生物学活性片段的最佳有效性。

因此，本发明关注于人和/或非人野生型HMGB1高亲和力结合结构 域A盒(HMGB1 A盒)或HMGB1 A盒的生物学活性片段的新的聚合体缀 合物。人HMGB1 A盒的氨基酸序列如SEQ ID N0：1所示。优选的非人 HMGB1 A盒为冈比亚按蚊(Anapheles gambia)HMGB1 A盒，其序列 如SEQ ID NO：301所示。

本发明进一步的方面关注于人和/或非人HMGB1高亲和力结合结 构域A盒或HMGB1 A盒的生物学活性片段的多肽变体的聚合体缀合物， 其中所述多肽变体的氨基酸序列通过一个或多个单个氨基酸的突变不 同于野生型HMGB1 A盒的氨基酸序列。

在本发明的上下文中，“HMGB1”包括HMGB1的非乙酰化形式或/ 和乙酰化形式。同样的，“HMGB1同源蛋白”包括HMGB1蛋白的非乙 酰化形式或/和乙酰化形式。优选的HMGB1同源蛋白为HMGB2，HMGB3， HMG-1L10，HMG-4L或/和SP100-HMG。

本发明的新的聚合体缀合物与非缀合HMGB1多肽或多肽变体相比 表现出增强的水溶性，改进的药物可管理性，改进的药代动力学和生 物利用率和/或减少的毒性和/或免疫原性。而且，令人惊讶的发现 HMGB1 A盒多肽或多肽变体和/或片段的缀合不改变蛋白的生物学活 性。

根据本发明的聚合体部分必须是生物相容的，可以是天然或半合 成或合成来源的并且可以具有线性或分支结构。示例性的聚合体包括 不限于聚亚烷基二醇，聚环氧烷烃，聚丙烯酸，聚丙烯酸酯，聚丙烯 酰胺或其N-烷基衍生物，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸酯，聚乙基丙 烯酸(polyethylacrylic acid)，聚丙烯酸乙酯，聚乙烯吡咯烷酮， 聚(乙烯醇)，聚乙醇酸，聚乳酸，乳酸-乙醇酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic)acid)，右旋糖酐，壳聚糖，聚氨基酸。

在本发明的特别优选的实施方案中，聚合体为聚乙二醇(PEG)或 聚乙二醇，其中末端OH基团可以任选地是经修饰的，例如用C1-C5烷 基或C1-C5酰基，优选用C1-，C2-或C3烷基或C1-，C2-或C3酰基修饰。 优选地，经修饰的聚乙二醇为甲氧基-聚乙二醇(mPEG)。

根据本发明所用的聚合体具有100至100,000Da，优选5,000至 50,000Da范围的分子量。在本发明的特别优选的实施方案中，聚合体 为PEG，其优选地具有末端OH和/或甲氧基，具有10,000至40,000Da， 优选20,000至40,000Da范围的分子量。在最优选的实施方案中，在 本发明中使用PEG，其优选地具有末端OH和/或甲氧基，具有20,000 或40,000Da的平均分子量。

为了提供稳定的缀合物，本发明的聚合体缀合物的聚合体部分通 过共价化学键与HMGB1多肽或多肽变体缀合。

HMGB1 A盒部分上的优选缀合位点选自赖氨酸，半胱氨酸，组氨 酸，精氨酸，酪氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸和谷氨酸残基或选 自蛋白部分的N末端氨基。

本发明的聚合体缀合物可以是单-，双-和多-聚乙二醇化的缀合 物。优选地，本发明的聚合体缀合物是单-聚乙二醇化的。

聚合体部分通常通过连接体基团(linker group)与HMGB1 A盒 部分共价连接。特别地，本发明的上下文中，术语连接体基团表示通 过多肽部分和聚合体部分之间的化学反应获得的基团。连接体基团可 以是聚合体缀合领域技术人员已知的任何残基，通过HMGB1 A盒部分 的氨基酸残基上的活性基团和聚合体或通过反应基团活化的聚合体的 反应获得。示例性的连接体基团包括但不限于亚烷基，胺，酰胺，氨 基甲酸酯，羧化物，羰基，酯，醚，硫醚和二硫基。优选地，连接体 基团为胺键，其通过N末端氨基酸残基与用醛反应基团活化的聚合体 部分反应和随后的还原获得。

此外，连接体基团可以任选地包含一个或多个间隔基团。在本发 明的上下文中，间隔基团定义为在两个末端上都具有反应功能性末端 基团(reactive functional end-group)的双官能团(bifunctional group)。间隔基团用一个反应性末端基团与聚合体部分或与聚合体部 分上的反应基团反应。用在另一末端上的官能团，间隔基团与HMGB1 A 盒部分的氨基酸残基上的官能团结合。合适的间隔基团是本领域技术 人员已知的。间隔基团的实例包括，但不限于，异-，双-官能小分子 或聚合体。例如，间隔基团可以由双官能C6-C12烷基或包含1-3个选 自N，S和O的杂原子的异双官能烷基或居间短双官能PEG链表示。

为了获得本发明的聚合体缀合物，可以通过已知的化学合成技术 实现聚合体与HMGB1 A盒部分的共价连接。例如，在本发明的一个示 例性实施方案中，可以通过使N-羟基丁二酰亚胺聚合体(es.NHS-PEG) 和在氨基酸残基，优选赖氨酸残基上的，或在HMGB1 A盒多肽的N 末端氨基酸上的游离胺基反应实现聚合体缀合。可选择地，通过PEG 醛经由还原胺化作用与多肽的N末端反应完成聚合体缀合。进一步地， 还可以通过使PEG-马来酰亚胺与HMGB1 A盒多肽或多肽变体的半胱 氨酸残基反应来获得聚合体缀合物。

本发明的上下文中，术语“HMGB1 A盒部分”指聚合体缀合物化 合物内的多肽部分。因此，该术语指野生型HMGB1 A盒和其生物学活 性片段以及HMGB1 A盒和其生物学活性片段的多肽变体。

本发明的上下文中，当涉及术语“HMGB1 A盒或HMGB1 A盒的氨 基酸序列”时，其指人和非人HMGB1 A盒。在本发明的优选的实施方 案中，HMGB1 A盒部分衍生自野生型的人HMGB1 A盒蛋白和野生型的 冈比亚按蚊HMGB1 A盒蛋白。

本文所用的“HMGB1 A盒的生物学活性片段”意欲于包含已知的 野生型HMGB1 A盒蛋白的部分，对其来说，当使用已知的测试时，仍 然可观察到至少一种相应的成熟蛋白的生物学活性。优选地，如果可 以检测到关于HMGB1 B盒和作为整体的HMGB1蛋白的促炎活性的拮 抗剂活性，则成熟蛋白的片段被认为是生物学活性的。天然HMGB1 A 盒的生物学活性片段为至少20，25，30，35，45，50，55，60，65，70， 75或80个氨基酸的片段。在本发明上下文中使用的优选的天然HMGB1 A盒的生物学活性片段分别包括至少77个或至少54个氨基酸的片段。

本发明的上下文中所用的术语“突变”可理解为靶序列中单个氨 基酸的取代，缺失和/或添加。优选地，本发明中的靶序列的突变为取 代。取代可以用不同的遗传编码氨基酸或通过非遗传编码氨基酸进行。 非遗传编码氨基酸的实例为高半胱氨酸，羟脯氨酸，鸟氨酸，羟赖氨 酸，瓜氨酸，肉碱等。

本发明的最优选的实施方案中，通过使用定向进化方法获得 HMGB1 A盒或其生物学活性片段的多肽变体，该方法的技术详尽地描 述于WO 2004/7022593和一些进一步的专利申请中(PCT/FR00/03503， PCT/FR01/01366，US 10/022,249，US 10/022,390，US 10/375,192， US 60/409,898，US 60/457,135，US 60/410,258和US 60/410,263)， 全部以Nautilus Biotech S.A.(Paris，France)名义，其通过引用 并入本文。

通过用定向进化技术获得的本发明的多肽变体是通过一个或多个 单个氨基酸的突变而不同于野生型HMGB1 A盒的氨基酸序列的突变体 蛋白。在本发明的特别优选的实施方案中，在天然蛋白的序列上仅出 现一个氨基酸取代。然而，本发明的主题包括可以进一步通过多个取 代，例如两个或更多氨基酸取代优化天然蛋白。因此，经修饰的多肽 变体可以通过1-10，优选2、3、4、5和6个不同氨基酸靶位点上的 氨基酸取代不同于野生型蛋白序列。

特别地，用作本发明的聚合体缀合物的HMGB1 A盒部分的特别优 选的HMGB1 A盒或其生物学活性片段的多肽变体为WO 2006/024547 中描述的那些。

因此，在本发明的一个优选的实施方案中，聚合体缀合物的HMGB1 A盒部分衍生自人HMGB1 A盒。特别地，一组多肽变体衍生自导入来 自人HMGB1 A盒(SEQ ID NO：1)(图1a)的全长氨基酸序列(84个氨基 酸)中的单个突变。这些优选的多肽变体在序列SEQ ID No：2-116(图 1b)中定义。

其他优选的多肽变体分别获得自77个氨基酸(SEQ ID NO：117)(图 2a)和54个氨基酸(SEQ ID NO：223)(图3a)的人HMGB1 A盒生物 学活性片段。77个氨基酸的人HMGB1片段的A盒的多肽变体在序列SEQ ID NO：118至222(图2b)中定义。54个氨基酸的人HMGB1片段的A 盒的多肽变体在序列SEQ ID NO：224至300(图3b)中定义。

在本发明进一步优选的实施方案中，聚合体缀合物的HMGB1 A盒 部分衍生自冈比亚按蚊HMGB1 A盒。特别地，一组多肽变体衍生自导 入来自冈比亚按蚊HMGB1 A盒(SEQ ID NO：301)(图4a)的全长氨基 酸序列(84个氨基酸)中的单个突变。这些多肽变体在序列SEQ ID No：302至418(图4b)中定义。其他优选的多肽变体分别产生自77 个氨基酸(SEQ ID NO：419)(图5a)和54个氨基酸(SEQ ID NO：529)(图 6a)的冈比亚按蚊HMGB1 A盒的生物学活性片段。77个氨基酸的HMGB1 片段的A盒的多肽变体在序列SEQ ID No：420至528(图5b)中定义。 54个氨基酸的HMGB1冈比亚按蚊(XP_311154)片段的A盒的多肽变体 在序列SEQ ID No：530至610(图6b)中定义。

为了鉴定用作本发明的聚合体缀合物的HMGB1 A盒部分的最优选 的HMGB1 A盒的多肽变体，已进行研究以确定表现出与野生型HMGB1 A 盒蛋白相比相似的或甚至提高的活性和增加的蛋白酶抗性的多肽变 体。为了该目的，在趋化测定中确定SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒的 A盒多肽变体在抑制HMGB1诱导的NIH/3T3细胞迁移中的活性(与人 HMGB1 A盒野生型自身的拮抗活性相比)(实施例1和图7.1至7.9)。 此外，针对这些表现出与SEQ ID NO：1的天然HMGB1 A盒蛋白相比相 似或甚至更高的拮抗活性的多肽变体，通过将这些多肽变体中的每一 个与胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，内切蛋白酶Asp-N和内切蛋白酶 Glu-C(sigma)的混合物一起温育，确定其对蛋白酶消化的体外抗性。 该蛋白酶抗性测试在实施例2中描述并且与天然HMGB1 A盒相比所述 变体的蛋白酶抗性特征(profile)的结果在图9.1至9.67中表示。

从该结果可以推断，用作本发明的聚合体缀合物的HMGB1 A盒部 分的优选的HMGB1 A盒的多肽变体为表现出相似或更高的拮抗活性和 增加的蛋白酶抗性的那些变体。特别地，优选的多肽变体为SEQ ID NO： 33，35，37-39，42-45，47-49，52，55，57，59，62，64，67，69 和104的多肽。在这些优选的多肽变体中，最优选的变体为在SEQ ID No：45，49，52，55，59，64和67中定义的变体。这些特别优选的 多肽变体表现出与SEQ ID NO：1的野生型人HMGB1 A盒相比显著提高 的蛋白酶抗性特征(参见实施例2的结果)。

应当注意本文公开的不同氨基酸序列中出现的氨基酸是根据它们 已知的单字母符号简写来确定的。应当进一步注意本文通过它们的单 字母简写符号表示的所有氨基酸残基序列以从左到右的方向为氨基末 端到羧基末端的常规方向。

在本发明中，令人惊讶地发现上文描述的聚合体缀合物表现出改 进的药代动力学和毒理学性能，导致与非缀合的HMGB1 A盒多肽部分 相比改进的生物利用度。与非缀合形式相比，HMGB1 A盒多肽和其变 体的聚合体缀合(特别是这些多肽的聚乙二醇化)的特别有利的作用 为，蛋白的流体力学体积增加。由于避免了肾清除，即降低了肾小球 滤过，这导致缀合化合物的药代动力学性质显著的和意想不到的改进。

此外，本发明的聚合体缀合物表现出增加的对蛋白酶和/或肽酶的 蛋白酶解活性的抗性，特别表现出增加的对人蛋白酶和/或肽酶，特别 是人血清蛋白酶和/或人胃肠道蛋白酶或肽酶的蛋白酶解活性的抗性。

特别地，与非缀合HMGB1 A盒相比对蛋白酶解的抗性为至少10％， 20％，30％，40％，50％，70％，80％，90％，95％或更高。在不同时间点(5 分钟和8小时之间)，在25℃下，将20μg的A盒野生型或变体和 占总蛋白1％w/w的蛋白酶的混合物一起温育后，测量蛋白酶抗性。每 次测定的蛋白酶混合物都从内切蛋白酶Glu-C(SIGMA)200μg/ml； 胰蛋白酶(SIGMA)400μg/ml和α-胰凝乳蛋白酶(SIGMA)400μ g/ml的原液新鲜制备。蛋白酶温育后，通过加入10μl抗蛋白酶溶 液(anti-proteases solution)(Roche)来停止反应并且在-20℃下 储存样品，以用于生物学活性测定。

作为由于对蛋白酶活性的增加的抗性而增加的稳定性的结果，本 发明的聚合体缀合物在体液中还表现出与非缀合的HMGB1 A盒相比更 长的半衰期。特别地，在血清中和/或血液中的半衰期增加，由此观察 到与非缀合的HMGB1 A盒相比至少10分钟，20分钟，30分钟，60分 钟或甚至更长时间的增加。

由于蛋白的流体力学体积的增加，还由于对蛋白酶解抗性的增加 和因此更高的稳定性，本发明的聚合体缀合物还表现出改进的治疗和 生物学性质和活性。事实上，它们表现出与非缀合的HMGB1 A盒蛋白 和蛋白变体相比更有利的药代动力学和药效特征。

因此，本发明关注于上述HMGB1 A盒聚合体缀合物作为药物中的 活性剂的用途。

因此，本发明更进一步的方面为本发明的聚合体缀合物用于制备 用于预防和/或治疗与细胞外HMGB1相关的病理或与HMGB1同源蛋白相 关的病理的药物的用途。特别地，与HMGB1相关的病理为由多种炎症 细胞因子级联介导的病理。

由HMGB1趋化因子诱导的和由HMGB1诱导的炎症细胞因子的级联 诱导的广泛谱系的病理情况分为以下类别：炎症疾病，自身免疫性疾 病，全身炎症反应综合征，器官移植后再灌注损伤，心血管疾患，妇 产科疾病，传染性(病毒性和细菌性)疾病，变应性和特应性疾病， 实体和非实体瘤病理，移植排斥疾病，先天性疾病，皮肤病，神经系 统疾病，恶病质，肾病，医源性中毒情况，代谢和特发性疾病。

根据本发明的HMGB1相关病理优选为由炎症细胞因子级联的活化 介导的病理情况。能够利用本发明进行有益治疗的病况的非限制性实 例包括，分为以下类别的由HMGB1趋化因子诱导的和由HMGB1诱导的 炎症细胞因子的级联诱导的广泛谱系的病理情况：再狭窄和其他心血 管疾病，再灌注损伤，炎症疾病(例如炎症肠病)，全身炎症反应综 合征(例如，脓毒症，成人呼吸窘迫综合征等)，自身免疫性疾病(例 如类风湿性关节炎和骨关节炎)，妇产科疾病，传染性疾病，特应性 疾病(例如哮喘，湿疹等)，肿瘤病理(例如实体和非实体瘤)，与 器官或组织移植相关的疾病(例如器官移植后再灌注损伤，器官排斥 和移植物抗宿主疾病)，先天性疾病，皮肤病(例如银屑病或脱发)， 神经系统疾病，眼科疾病，肾、代谢或特发性疾病和中毒情况(例如 医源性毒性和贝切特病(Behset disease))，其中上述疾病是由HMGB1 蛋白释放引起、与HMGB1蛋白释放相关和/或伴随HMGB1蛋白释放。

特别地，属于炎症和自身免疫性疾病的病理包括，类风湿性关节 炎/血清阴性关节炎，骨关节炎，炎症肠病，克罗恩病(Crohn′s disease)，肠梗塞，系统性红斑狼疮，虹膜炎(iridoeyelitis)/ 葡萄膜炎，眼神经炎，特发性肺纤维化，系统性血管炎/韦格纳肉芽肿 (Wegener′s granulomatosis)，结节病，睾丸炎/输精管复通术，系 统性硬化症和硬皮病。全身炎症反应包括，脓毒症综合征(包括革兰 氏阳性脓毒症，革兰氏阴性脓毒症，培养阴性脓毒症，真菌性脓毒症， 中性白细胞减少性发热(neutropenic fever)，尿脓毒症，脓毒性结 膜炎)，脑膜炎球菌血症，创伤性出血，hums，电离辐射暴露，急性 和慢性前列腺炎，急性和慢性胰腺炎，阑尾炎，消化性、胃和十二指 肠溃疡，腹膜炎，溃疡性、假膜性、急性和缺血性结肠炎，憩室炎， 失弛缓症，胆管炎，胆囊炎，小肠炎，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。 再灌注损伤包括，post-pump综合征和缺血-再灌注损伤。心血管疾 病包括心脏顿抑(cardiac stun)综合征，心肌梗塞和缺血，动脉粥 样硬化，血栓性静脉炎，心内膜炎，心包炎，充血性心力衰竭和再狭 窄。妇产科疾病包括，早产，子宫内膜异位症，流产，阴道炎和不育。 传染性疾病包括，HIV感染/HIV神经病，脑膜炎，乙型和丙型肝炎， 单纯疱疹性感染，脓毒性关节炎，腹膜炎，大肠杆菌O157:H7，肺炎 会厌炎，溶血性尿毒综合征/溶栓性血小板减少性紫癜，念珠菌病，丝 虫病，阿米巴病，疟疾，登革出血热，利什曼病，麻风，中毒性休克 综合征，链球菌性肌炎，气性坏疽，结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、鸟胞内分枝杆菌(mycobacterium avium intracellulare)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)肺炎，盆 腔炎症疾病，睾丸炎/附睾炎，军团病杆菌属(legionella)疾病，莱 姆病(Lyme disease)，A型流感，EB病毒、巨细胞病毒、病毒相关 嗜血细胞综合征，病毒性脑炎/无菌性脑膜炎。变应性和特应性疾病包 括，哮喘，过敏症，过敏性休克，免疫复合物病，花粉症，变应性鼻 炎，湿疹，变应性接触性皮炎，变应性结膜炎，过敏性肺炎。恶性肿 瘤(液体和实体瘤病理)包括ALL，AML，CML，CLL，霍奇金病(Hodgkin′s disease)，非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin′s lymphoma)，卡波西 肉瘤(Kaposi′s sarcoma)，结肠直肠癌，鼻咽癌，恶性组织细胞增 生症和恶性肿瘤的副肿瘤综合征/高血钙症。移植疾病包括，器官移植 排斥和移植物抗宿主疾病。先天性疾病包括囊性纤维化，家族性嗜血 细胞性淋巴组织细胞增生症和镰状细胞贫血症。皮肤病包括，银屑病， 银屑病关节炎和脱发。神经系统疾病包括，神经变性疾病(多发性硬 化，偏头痛，头痛，淀粉样蛋白相关病理，朊病毒病/克雅病 (Creutzfeld-Jacob disease)，阿尔茨海默和帕金森病(Alzheimer and Parkinson′s diseases)，多发性硬化，肌萎缩性emilateral 硬化)和周围神经病，偏头痛，头痛。肾病包括，肾病综合征，血液 透析和尿毒症。医源性中毒情况包括，OKT3治疗，抗CD3治疗，细胞 因子治疗，化学疗法，放射疗法和慢性水杨酸中毒。代谢和特发性疾 病包括，成尔逊病，血色素沉着病，α-1抗胰蛋白酶缺乏症，糖尿病 和糖尿病并发症，失重，嗜欲缺乏，恶病质，肥胖，桥本甲状腺炎， 骨质疏松症，下丘脑-垂体-肾上腺轴评价和原发性胆汁性肝硬化。 眼科疾病包括，青光眼，视网膜病变和干眼症。其他疾病的杂集包括： 多器官功能紊乱综合征，肌营养不良症，脓毒性脑膜炎，动脉粥样硬 化，会厌炎，惠普耳病(Whipple′sdisease)，哮喘，过敏症，变异 性鼻炎，器官坏死，发热，败血病，内毒素性休克，高热，嗜酸细胞 肉芽肿，肉芽肿病，结节病，感染性流产，尿道炎，肺气肿，鼻炎， 肺泡炎，细支气管炎，咽炎，上皮屏障功能障碍(epithelial barrier dysfunctions)，pneumoultramicropicsilicovolcanoconiosis，胸 膜炎，鼻窦炎，流感，呼吸道合胞体病毒感染，弥散性菌血症，包虫 囊肿，皮肌炎，烧伤，晒伤，荨麻疹，warst，风团，血管炎，脉管炎， 心肌炎，动脉炎，结节性动脉周围炎，风湿热，乳糜泻，脑炎，脑栓 塞，Guillame-Barre综合征，神经炎，神经痛，医源性并发症/周围 神经损伤，脊髓损伤，麻痹(paralysis)，葡萄膜炎，arthriditis， 关节痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特病(Paget′s disease)，痛风，牙 周病，滑膜炎，重症肌无力，肺出血肾炎综合征(Goodpasture′s syndrome)，贝切特综合征(Behsets′s syndrome)，强直性脊柱炎， Barger′s病，Retier′s综合征，大疱性皮炎(大疱性类天疱疮)，天 疱疮(pemphigous)和寻常性天疱疮和脱发。

进一步优选的实施方案中，本发明的聚合体化合物用作用于预防， 减轻和/或治疗RAGE相关病理的活性剂。RAGE相关病理定义为与RAGE 的增加的表达相关的病理情况。

RAGE(晚期糖基化终产物受体)是细胞表面分子免疫球蛋白超家 族的多配体成员。其由三个免疫球蛋白样区域(一个V型免疫球蛋白 结构域接着两个C型免疫球蛋白结构域)，一个跨膜结构域和一个对 于后RAGE信号传导(post-RAGE signalling)必须的高荷电短胞质尾 部组成。1992年首次鉴定RAGE为AGE(在老化过程中的血管组织中和 在糖尿病中以加快的速度积累的非酶促糖基化和氧化蛋白)的结合靶。 RAGE在广泛的细胞中表达，包括内皮细胞，平滑肌细胞，单核吞噬细 胞和神经元。虽然它在发育期间以高水平存在，尤其是在中枢神经系 统中，但在成熟期间它的水平下降。

如上文报道的，RAGE是第一个经鉴定的细胞外HMGB1受体。结合 在细胞表面的HMGB1诱导RAGE的转录上调。RAGE相关病理的实例为 糖尿病和与糖尿病有关的病症，例如糖尿病血管病，神经病，视网膜 病变和其他病症，包括阿尔茨海默病和脉管壁的免疫/炎症反应。在本 申请上下文中RAGE相关病理的特别优选的实例为I型和/或II型糖尿 病。

在本发明的进一步的方面中，上述HMGB1 A盒聚合体缀合物与进 一步的活性剂组合使用。

进一步的试剂优选能够抑制炎症细胞因子级联的早期介体的试 剂。优选地，此类进一步的试剂为选自TNF，IL-1α，IL-1β，IL-Ra， IL-6，IL-8，IL-10，IL 13，IL-18，IFN-γ MIP-1α，MIF-1β， MIP-2，MIF和PAF的细胞因子的拮抗剂或抑制剂。

与聚合体缀合物组合使用的进一步的试剂还可以是RAGE的抑制 剂，例如抗RAGE的抗体，能够抑制RAGE表达的核酸或核酸类似物， 例如反义分子，核酶或RNA干扰分子，或HMGB1与RAGE的相互作用， 优选HMGB1的非乙酰化或/和乙酰化形式与RAGE或可溶性RAGE (sRAGE)的相互作用的小的合成的分子拮抗剂。抗RAGE抗体优选单 克隆抗体，更优选嵌合或人源化抗体或重组抗体，例如单链抗体或此 类抗体的抗原结合片段。任选地，可溶性RAGE类似物可以作为融合蛋 白存在，例如具有人抗体的Fc结构域。HMGB1与RAGE相互作用的小 的合成的分子拮抗剂优选具有小于1000道尔顿的分子量。该小的合成 的分子拮抗剂优选抑制RAGE与HMGB1的非乙酰化形式或/和与乙酰化 形式以及与HMGB1同源蛋白(特别是HMGB2，HMGB3，HMG-1L10，HMG-4L 或/和SP100-HMG)的非乙酰化形式或/和乙酰化形式的相互作用。

与聚合体缀合物组合使用的进一步的试剂还可以是Toll样受体 (TLR)(例如TLR2，TLR4，TLR7，TLR8或/和TLR9)与HMGB1的相 互作用的抑制剂，该抑制剂优选单克隆抗体或多克隆抗体，能够抑制 TLR表达的核酸或核酸类似物，例如反义分子，核酶或RNA干扰分子， 或优选具有少于1000道尔顿大小的合成分子。抑制剂可以是已知的 Toll样受体的抑制剂，特别是TLR2，TLR4，TLR7，TLR8或/和TLR9 的抑制剂。该抑制剂优选抑制Toll样受体与HMGB1的非乙酰化形式或 /和乙酰化形式以及与HMGB1同源蛋白(特别是HMGB2，HMGB3， HMG-1L10，HMG-4L或/和SP100-HMG)的非乙酰化形式或/和乙酰化 形式的相互作用。

在另一个实施方案中，进一步的试剂为血栓调节蛋白的功能性N 末端凝集素样结构域(D1)。血栓调节蛋白的D1结构域能够截取释放 的HMGB1和释放的HMGB1同源蛋白(特别是HMGB2，HMGB3，HMG-1L10， HMG-4L或/和SP100-HMG)的非乙酰化形式和/或乙酰化形式，从而 阻止它们与RAGE和Toll样受体的相互作用。血栓调节蛋白的D1结构 域可以是天然的或突变的(为了使它抗蛋白酶)。

进一步的试剂还可以是具有弯曲形状结构的合成的双链核酸或核 酸类似物分子，特别是双链弯曲DNA，PNA或DNA/PNA嵌合体或杂合体 或双链十字形DNA，PNA或DNA/PNA嵌合体或杂合体结构，其能够与 HMGB1蛋白结合。优选的核酸和核酸类似物分子在共同拥有和同时待 决的于2005年7月4日提交的国际专利申请No.PCT/EP2005/007198 (要求于2004年7月2日提交的美国临时申请No.60/584,678的优先 权)中公开，其通过引用并入本文。具有弯曲形状结构的合成的双链核 酸或核酸类似物分子优选能够与HMGB1的非乙酰化或/和乙酰化形式 以及HMGB1同源蛋白(特别是HMGB2，HMGB3，HMG-1L10，HMG4L或/ 和SP100-HMG)的非乙酰化或/和乙酰化形式结合。

在进一步的实施方案中，与聚合体缀合物组合使用的进一步的试 剂为K-252a或/和其盐或衍生物或K-252a或/和其衍生物的聚合体缀 合物。K-252a或K-252a和其衍生物的聚合体缀合物的用途在共同拥 有和同时待决的于2005年8月25日提交的国际专利申请 No.PCT/EP2005/008258中公开，其通过引用并入本文。

因此，本发明的进一步的方面为包含有效量的作为用于治疗与 HMGB1有关的病理的活性成分的至少一种HMGB1 A盒多肽或多肽变体 或其生物学活性片段的聚合体缀合物和药学上可接受的载体，稀释剂 和/或佐剂的药物组合物。本发明的药物组合物优选适合于治疗与 HMGB1和/或HMGB1同源蛋白的非乙酰化或/和乙酰化形式相关的病理。 在进一步优选的实施方案中，包含至少一种聚合体缀合物的本发明的 药物组合物还包含如上所述的进一步的试剂。本发明的药物组合物可 以用于诊断或治疗应用。

可以由个体医师视病人情况选择精确的剂型，给药途径和剂量。 可以以单剂量或一定时间间隔的重复剂量进行给药。剂量的量和时间 间隔可以单独调整以提供导致症状改善或患者存活延长的治疗作用。 当然，施用的组合物的实际量将取决于待治疗的受试者，受试者的体 重，疼痛的严重度，给药方式和处方医师的判断。合适的每日剂量在 0.001至10mg/kg之间，特别是0.1至5mg/kg之间。

给药可以通过已知的方法进行，例如通过注射，特别通过静脉内， 肌内，透粘膜，皮下或腹膜内注射和/或通过口服，局部，鼻，吸入， 气雾剂和/或直肠施用等。给药可以是局部的或全身的。

另外，本发明的对象HMGB1部分的A盒的聚合体缀合物可以可逆 地固定和/或吸附在医疗器械或药物释放/传递系统(微球体)的表面 和/或内部。医疗器械和微球体可以通过在医疗器械或微球体的表面或 包被其表面的层上结合，浸渍和/或吸附聚合体缀合物，可逆地装载本 发明的聚合体缀合物。当医疗器械或微球体与生物流体接触时，释放 可逆固定的聚合体缀合物。因此，医疗器械和微球体作为以下述方式 洗脱本发明的分子对象的药物释放工具起作用，所述方式可以控制它 们的释放动力学，确保治疗所必需的受控或持续的释放。用于包被/ 浸渍医疗器械和装载微球体的方法是这些技术领域中的专家所公知 的。

因此，本发明的进一步的方面为HMGB1的A盒的聚合体缀合物的 用途，其中缀合分子可逆地固定在医疗器械或微球体的表面或吸附在 它们内部。此类医疗器械优选为外科工具，植入物，导管或支架，例 如用于血管成形术的支架和特别是含药的药物洗脱支架。

本发明的另一方面涉及用至少一种本发明的聚合体缀合物包被的 医疗器械。此类器械可选自外科器械，植入物，导管或支架。此类器 械可以用于血管成形术。

本发明进一步通过下列附图阐明：

图1a表示由84个氨基酸残基组成的天然人HMGB1 A盒的氨基酸 序列(SEQ ID NO：1)。

图1b表示在各个经选择以产生全长人HMGB1 A盒的多肽变体的靶 位点上的取代氨基酸的类型。进一步地，产生的多肽变体的具体氨基 酸序列在SEQ ID NO：2至116中表示。

图2a表示由77个氨基酸残基组成的人HMGB1 A盒的生物学活性 片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：117)。

图2b表示在各个经选择以产生由77个氨基酸残基组成的人 HMGB1 A盒的生物学活性片段的多肽变体的靶位点上的取代氨基酸的 类型。进一步地，产生的多肽变体的具体氨基酸序列在SEQ ID NO：118 至222中表示。

图3a表示由54个氨基酸残基组成的人HMGB1 A盒的生物学活性 片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：223)。

图3b表示在各个经选择以产生由54个氨基酸残基组成的人 HMGB1 A盒的生物学活性片段的多肽变体的靶位点上的取代氨基酸的 类型。进一步地，产生的多肽变体的具体氨基酸序列在SEQ ID NO：224 至300中表示。

图4a表示由84个氨基酸残基组成的天然冈比亚按蚊HMGB1 A盒 的氨基酸序列(SEQ ID NO：301)。

图4b表示在各个经选择以产生全长冈比亚按蚊HMGB1 A盒的多肽 变体的靶位点上的取代氨基酸的类型。进一步地，产生的多肽变体的 具体氨基酸序列在SEQ ID NO：302至418中表示。

图5a表示由77个氨基酸残基组成的冈比亚按蚊HMGB1 A盒的生 物学活性片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：419)。

图5b表示在各个经选择以产生由77个氨基酸残基组成的冈比亚 按蚊HMGB1 A盒的生物学活性片段的多肽变体的靶位点上的取代氨基 酸的类型。进一步地，产生的多肽变体的具体氨基酸序列在SEQ ID NO： 420至528中表示。

图6a表示由54个氨基酸残基组成的冈比亚按蚊HMGB1 A盒的生 物学活性片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：529)。

图6b表示在各个经选择以产生由54个氨基酸残基组成的冈比亚 按蚊HMGB1 A盒的生物学活性片段的多肽变体的靶位点上的取代氨基 酸的类型。进一步地，产生的多肽变体的具体氨基酸序列在SEQ ID NO： 530至610中表示。

图和表7.1至7.9表示实施例1中描述的在用作本发明的聚合体 缀合物的HMGB1 A盒部分的SEQ ID NO：2至SEQ ID NO.116的HMGB1 A盒多肽变体上进行的趋化测定的结果。在各个图中，测试了一组多 肽变体在抑制HMGB1诱导NIH/3T3细胞迁移中的活性(与SEQ ID NO： 1的人野生型HMGB1 A盒全长片段的活性相比)。各个图中展示了报 告统计分析数据的表和显示趋化测定结果的柱状图。

图7.1和表7.1表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID NO：2至15的多肽变体(在表和图中分别用代码 CT501，CT568，CT569，CT570，CT571，CT502，CT572，CT503，CT573， CT504，CT574，CT575，CT576和CT505表示)抑制HMGB1诱导的 NIH/3T3细胞的趋化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图7.2和表7.2表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID NO：16-23和25-29的多肽变体(在表和图中分别 用代码CT577，CT578，CT506，CT579，CT580，CT581，CT507，CT582， CT584，CT508，CT509，CT510和CT585表示)抑制HMGB1诱导的 NIH/3T3细胞的趋化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图7.3和表7.3表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID No：30-35和37-43的多肽变体(在表和图中分别 用代码CT511，CT512，CT513，CT514，CT586，CT515，CT516，CT517， CT518，CT519，CT520，CT521和CT522表示)抑制HMGB1诱导的 NIH/3T3细胞的趋化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图7.4和表7.4表示通过SEQ ID NO：44-57的人HMGB1 A盒野生 型(在图和表中分别用代码CT523，CT524，CT525，CT526，CT527， CT528，CT588，CT529，CT530，CT589，CT590，CT531，CT591和CT532 表示)抑制HMGB1诱导的NIH/3T3细胞的趋化迁移测定结果的柱状图 和统计数据。

图7.5和表7.5表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID No：58-67和69-71的多肽变体(在表和图中分别 用代码CT592，CT533，CT593，CT534，CT535，CT536，CT537，CT594， CT538，CT539，CT540，CT541和CT542表示)抑制HMGB1诱导的 NIH/3T3细胞的趋化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图7.6和表7.6表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID No：72-85的多肽变体(在表和图中分别用代码CT596， CT597，CT598，CT599，CT600，CT601，CT602，CT603，CT543，CT544， CT545，CT546，CT547和CT604表示)抑制HMGB1诱导的NIH/3T3细 胞的趋化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图7.7和表7.7表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID No：86-99的多肽变体(在表和图中分别用代码CT548， CT549，CT605，CT606，CT607，CT608，CT609，CT610，CT550，CT551， CT611，CT552，CT553和CT554表示)抑制HMGB1诱导的NIH/3T3 细胞的趋化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图7.8和表7.8表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID No：100-113的多肽变体(在表和图中分别用代码 CT555，CT556，CT557，CT558，CT559，CT612，CT560，CT561，CT613， CT562，CT563，CT564，CT565和CT566表示)抑制HMGB1诱导的 NIH/3T3细胞的趋化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图7.9和表7.9表示通过SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型 (CT500)和SEQ ID No：114-116的多肽变体(在表和图中分别用代码 CT567，CT614和CT615表示)抑制HMGB1诱导的NIH/3T3细胞的趋 化迁移测定结果的柱状图和统计数据。

图8表示装载有实施例2中描述的蛋白酶抗性测试的蛋白酶消化 后不同时间点的SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型(CT500)的Tricine SDS-PAGE凝胶的图。用于蛋白酶抗性测试的A盒野生型蛋白为带组氨 酸标签的蛋白。消化5分钟后，CT500表现出两个主要条带，一条对 应样品中的起始蛋白和第二条对应不具有N末端组氨酸标签的84个氨 基酸的蛋白(在图中用箭头指出)。该第二条带的分布表示对蛋白酶 的抗性持续30分钟。在该凝胶和图9.1至图9.67的其他凝胶上存在 的较小条带对应A盒消化片段。

图9.1至图9.67表示装载有实施例2中描述的蛋白酶抗性测试的 蛋白酶消化后不同时间点的本发明的聚合体缀合物的HMGB1 A盒部分 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE凝胶的图。用于蛋白酶抗性测试的A 盒多肽变体为带组氨酸标签的蛋白。在消化5分钟后，多肽变体的 SDS-PAGE凝胶图表现出两个主要条带，一条对应样品中的起始蛋白变 体和第二条对应不具有N末端组氨酸标签的A盒84个氨基酸蛋白变 体。

图9.1表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：2(CT501)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.2表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：7(CT502)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.3表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：9(CT503)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.4表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：11(CT504)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.5表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：15(CT505)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.6表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：18(CT506)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.7表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：22(CT507)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.8表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：26(CT508)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.9表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：27(CT509)的 多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.10表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：28(CT510) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.11表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：30(CT511) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.12表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：31(CT512) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.13表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：32(CT513) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.14表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：33(CT514) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.15表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：35(CT515) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.16表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：37(CT516) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.17表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：38(CT517) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.18表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：39(CT518) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.19表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：40(CT519) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.20表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：41(CT520) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.21表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：42(CT521) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.22表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：43(CT522) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.23表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：44(CT523) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.24表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：45(CT524) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.25表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：46(CT525) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.26表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：47(CT526) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.27表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：48(CT527) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.28表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：49(CT528) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.29表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：51(CT529) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.30表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：52(CT530) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.31表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：55(CT531) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.32表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：57(CT532) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.33表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：59(CT533) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.34表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：61(CT534) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.35表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：62(CT535) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.36表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：63(CT536) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.37表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：64(CT537) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.38表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：66(CT538) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.39表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：67(CT539) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.40表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：69(CT540) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.41表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：70(CT541) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.42表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：71(CT542) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.43表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：80(CT543) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.44表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：81(CT544) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.45表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：82(CT545) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.46表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：83(CT546) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.47表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：84(CT547) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.48表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：86(CT548) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.49表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：87(CT549) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.50表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：94(CT550) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.51表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：95(CT551) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.52表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：97(CT552) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.53表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：98(CT553) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.54表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：99(CT554) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.55表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：100(CT555) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.56表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：101(CT556) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.57表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：102(CT557) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.58表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：103(CT558) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.59表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：104(CT559) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.60表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：106(CT560) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.61表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：107(CT561) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.62表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：109(CT562) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.63表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：110(CT563) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.64表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：111(CT564) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.65表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：112(CT565) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.66表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：113(CT566) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图9.67表示蛋白酶消化后不同时间点的SEQ ID NO：19(CT567) 的多肽变体的Tricine SDS-PAGE。

图10表示其中总结了Tricine SDS-PAGE的结果的表。叉号表示 与HMGB1 A盒野生型或HMGB1 A盒多肽变体的84个氨基酸长的蛋白片 段对应的条带在凝胶上存在。

图11表示A盒野生型(WT)和A盒变体号64(64)1mg/kg的 剂量单次皮下给药后的平均血浆浓度/时间。数据表示：平均值±标 准误(Mean±SEM)。

图12表示A盒野生型(wt)和A盒变体号64(64)以1mg/kg 的剂量以及聚乙二醇化的A盒野生型(PEG-WT)和聚乙二醇化的A盒变 体号64(PEG-64)以5mg/kg的剂量单次皮下给药后的平均血浆浓度/ 时间。数据表示：平均值±标准误。

实施例

1.体外活性测试：NIH/3T3细胞迁移测定

本研究的目的为评估SEQ ID NO：2-116中定义的各个HMGB1 A盒 多肽变体的活性并将它们的活性与SEQ ID NO：1的人野生型HMGB1 A 盒全长片段的活性进行比较以选择与野生型相比具有相似的或更好的 活性的所有变体。

HMGB1 A盒活性在体外评估为对HMGB1诱导的NIH/3T3细胞迁移 的抑制。

1.1材料

●HMGB1 A盒野生型和变体(Nautilus Biotech)

●NIH/3T3细胞(ATCC n.CRL-1658)

●D-MEM培养基(GIBCO；目录号(cat.n.)31966-021)

●胎牛血清(GIBCO；目录号10270-106)

●青霉素-链霉素10,000U/ml(GIBCO；目录号15140-122)

●L-谷氨酰胺200mM(GIBCO；目录号25030-024)

●TrypLE Select(GIBCO；目录号12563-011)

●磷酸盐缓冲液(0.138M NaCl，0.0027M KCl，0.01M磷酸， pH 7.4)

●无PVP滤器(8μm孔径；13mm总直径)(Neuro Probe；目 录号PFA8)

●人纤连蛋白(Roche；目录号1080938)

●Blind Well趋化小室(Chemotaxis Chamber)(Neuro Probe； 目录号BW25)

●GIEMSA Stain Modified(Sigma；目录号GS1L)

1.2滤器制备

在进行实验前约1小时，通过用30μl/滤器的分散于滤器的不 透明面的50μg/ml的纤连蛋白溶液包被滤器而制备聚碳酸酯膜无 PVP滤器(8μm孔径，13mm总直径)。通过在ddH2O中稀释冻干的 纤连蛋白至终浓度为1mg/ml和通过将该溶液在37℃保持约1小时以 完全溶解来制备纤连蛋白的原液。该原液可在-20℃下储存。

然后滤器在通风柜的层流(laminar flux)下静置至干燥(约1 小时)。

1.3细胞制备

在实验前的那天(进行实验前大约22-24小时)以106个细胞/平 板接种NIH/3T3细胞。

当准备使用滤器时，用胰蛋白酶分散细胞，对其计数并在无血清 培养基中以106个细胞/ml进行重悬。

1.4趋化测定

在各个趋化实验中，测试SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒全长片段 的14个不同的多肽变体。

无血清添加物的生长细胞培养基(w/o FBS)用作阴性对照，表示 自发迁移。

1nM HMGB1用作阳性对照。将0.5/1nM HMGB1 A盒野生型或测试 的多肽变体加入1nM HMGB1以抑制HMGB1诱导的NIH/3T3细胞迁移。

在每个实验中阴性对照(w/o FBS)和阳性对照(1nM HMGB1)都 以一式三份进行测试。

在每个实验中HMGB1 A盒野生型(SEQ ID NO：1)抑制HMGB1诱 导的细胞迁移的活性都以一式三份进行测试。

各个HMGB1 A盒多肽变体(SEQ ID NO：2至116)都以一式两份进 行测试。

使用Blind Well趋化小室。各个小室的清洁，干燥的下部孔填 充有50μl不含FBS但添加了适当的趋化剂和抑制剂的DMEM。当孔被 加满时，应该形成微小的正液面；这有助于在使用滤器时防止气泡被 截留。用小镊子将滤器放置在加满的孔上(经纤连蛋白处理的面朝上)， 小心不要截留气泡并且不要用手指接触滤器。滤器固定器用手拧紧。 将细胞悬液(50000个细胞/50μl)用吸液管移入上部孔中并且添加 150μl无血清培养基以充满小室的上部孔。将该充满的小室温育3小 时(37℃，5％CO2)以允许细胞迁移。温育后，从滤器中除去液体。拧 开固定器并且将其浸入冷的蒸馏水中。用镊子取出滤器，置于清洁表 面上(固体石蜡)(迁移细胞面朝上)并且用针固定(所述针置于边 缘区域)。

1.5迁移细胞的GIEMSA染色

用乙醇固定滤器一次然后在流水下清洗三次。以1∶10稀释到 ddH2O中的GIEMSA Stain Modified工作液在临使用前制备。清洗滤 器后，添加染色液并且静置温育20分钟。在流水下清洗染色液。然后 将滤器置于载玻片上，迁移细胞面朝下，并且用湿棉签轻轻擦非迁移 细胞面(用两根棉签或用两头棉签的两端擦两次)，小心不要移动滤 器。清洁后，在滤器上放置盖玻片并且在40X显微镜下在10个随机的 区域/滤器中对细胞计数。

1.6数据表示和统计分析

所进行的NIH/3T3迁移测定的结果在图和表7.1至图和表7.9所 示的表和柱状图中报道。

数据在柱状图中表示为平均值±95％置信区间(Mean±95％CI)。

单因素方差分析(one-way ANOVA)接着Dunnett′s事后检验(post test)(对照柱数据：1nM HMGB1样品+HMGB1 A盒WT样品)为所 进行的统计分析。

当评估结果数据时，认为具有＜0.05的事后检验p值数据的HMGB1 A盒变体显著不同于HMGB1 A盒野生型。如果A盒多肽变体的平均值 比A盒野生型的平均值高，则柱在图7.1至7.9中所示的实验的图中 涂为红色。这些红色的柱表示与野生型相比表现出较低的抑制HMGB1 诱导的细胞迁移的活性的HMGB1 A盒多肽变体。

如果多肽变体结果的平均值比野生型A盒的平均值低，则柱在图 7.1至7.9中所示的实验的图中涂为浅蓝色。这些变体表示与HMGB1 A 盒野生型相比表现出较高的抑制HMGB1诱导的细胞迁移的活性的 HMGB1 A盒变体。

认为具有＞0.05的事后检验p值数据的HMGB1 A盒变体没有显著 不同于HMGB1 A盒野生型。这些变体的柱涂为绿色。这些变体表示表 现出与野生型相同的抑制HMGB1诱导的细胞迁移的活性的HMGB1 A盒 变体。

1.7结果

与SEQ ID NO：1的人HMGB1 A盒野生型相比，评估SEQ ID NO：2 至116的人HMGB1高亲和力结合结构域A盒的多肽变体的抑制HMGB1 诱导的细胞迁移的活性，以确定用作本发明的优选的聚合体缀合物的 HMGB1 A盒部分的优选的多肽变体。

趋化测定结果显示(图7.1至7.9)根据本发明，26个多肽变体 的突变可以导致与野生型人HMGB1 A盒的活性相比较高抑制细胞迁移 的活性。具体地，SEQ ID NO：30-32，35，38，40-41，43，48，51， 57，63-64，69，70，94，95，100，103-104，106-107，109-111和 113的多肽变体表现出较高的抑制细胞迁移的活性。

此外，趋化测定结果显示(图7.1至7.9)与A盒野生型多肽的 活性相比，41个多肽变体在抑制HMGB1诱导的细胞迁移的活性方面没 有表现出变化。具体地，其为SEQ ID NO：2，7，9，11，15，18，22， 26-28，33，37，39，42，44-47，49，52，55，59，61，62，66-67， 71，80-84，86-87，97-99，101-102，112和114的多肽变体。

测试表现出与A盒野生型相比相似或更高的活性的所有这些A盒 多肽变体的体外蛋白酶抗性，以选择最具抗性的变体，其至少与A盒 野生型一样活跃(参见实施例2中的蛋白酶抗性测试)。

2.体外蛋白酶抗性测试

本研究的目的是评估实施例1中所示的HMGB1 A盒变体的体外蛋 白酶抗性并且将其与SEQ ID NO：1的野生型HMGB1 A盒的体外蛋白酶 抗性相比较以鉴定与野生型多肽相比具有改进的蛋白酶抗性的变体。

2.1材料

●HMGB1带组氨酸标签的A盒野生型和经选择的变体(Nautilus biotech)

●胰蛋白酶(Sigma；目录号T8658；批号(lot.n.)045K5113)

●α-胰凝乳蛋白酶(Sigma；目录号C6423；批号 109H74858)，

●内切蛋白酶Asp-N(Sigma；目录号P3303；批号046K1049)

●内切蛋白酶Glu-C(Sigma；目录号P6181；批号075K5100)

●Complete，Mini无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(cocktail) (Roche；目录号11836170 001)

●Trizma base(Sigma；目录号T6066)

●甲叉双丙烯酰胺(Acrylamide/bis)溶液40％溶于水(Sigma； 目录号01709)

●SDS(Sigma；目录号71729)

●丙三醇99％(Sigma；目录号G9012)

●Temed(Sigma；目录号87689)

●APS(Sigma；目录号A 3678)

●多肽SDS-PAGE分子量标准(Bio-Rad；目录号161-0326)

●预混合的10×Tris/tricine/SDS缓冲液(Bio-Rad；目录号 161-0744)

●β-巯基乙醇(Sigma；目录号M7154)

●甲醇(VWR；目录号20864.320)

●乙酸(VWR；目录号20104.323)

●Brilliant Blue R(Sigma；目录号B0149)

●溴酚蓝(Sigma；目录号B0126)

●盐酸(Merck；目录号1.00319.2511)

●用于Tricine凝胶的3X上样缓冲液(组成：150mM Tris-HCl， pH 6.8；12％SDS；36％丙三醇；6％β-巯基乙醇；0.04％溴酚蓝)

2.2蛋白酶混合物的制备

使用包含胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，内切蛋白酶Asp-N和内切 蛋白酶Glu-C的蛋白酶混合物。

表1报道了在本研究中所用的各种蛋白酶的特异性。

表1：蛋白酶特异性

  蛋白酶  特异性   胰蛋白酶  K，R的C末端(如果P在切割位点C末端则不消化；如  果酸性残基在切割位点的任一边，则较慢的消化)   α-胰凝乳蛋白酶  T，P，W，L的C末端(次级水解；M，I，S，T，V，H，G，  A的C末端)   内切蛋白酶Asp-N  D，C的N末端   内切蛋白酶Glu  E，D的C末端(如果P在切割位点的C末端则不消化)

根据制造商的说明溶解各种冻干的蛋白酶以获得原液，其被等分 并储存在-80℃下。

将100μg胰蛋白酶溶于100μl dH2O以获得1μg/μl的原液。 将25μgα-胰凝乳蛋白酶溶于50μl的1mM HCl，2mM CaCl2的溶液 以获得0.5μg/μl的原液。将2μg内切蛋白酶Asp-N溶于50μl dH2O以获得0.04μg/μl的原液。将25μg内切蛋白酶Glu-C溶 于50μl dH2O以获得0.5μg/μl的原液。

进行实验前，将一等份各种蛋白酶原液静置在冰上解冻。

胰蛋白酶和内切蛋白酶Glu-C原液等份在dH2O中稀释以获得0.1 μg/μl的终工作溶液。α-胰凝乳蛋白酶原液等份在1mM HCl，2mM CaCl2溶液中稀释以获得0.1μg/μl的终工作溶液。内切蛋白酶 Asp-N等份不经稀释使用。

临进行实验前，新鲜制备包含1％(以重量/包含在样品中的总A 盒的重量)的各种蛋白酶的蛋白酶混合物并且立即将其加到待消化的 HMGB1 A盒中。

2.3HMGB1 A盒野生型和变体的蛋白酶消化

在各个实验中消化18μg的各种HMGB1 A盒(野生型或变体)。

将待测试的HMGB1 A盒静置在冰上解冻并且取相当于18μg的体 积。然后用dH2O使该溶液的体积变为终体积90μl，以获得相同终体 积的各个待测试的HMGB1 A盒。

添加蛋白酶混合物前，取10μl该溶液(相当于2μg HMGB1 A 盒)。该样品相当于“时间0”未消化样品。

向剩下的样品(16μg HMGB1 A盒)中添加8.8μl(相当于0.16 μg的新鲜制备的混合物的各种蛋白酶；参见2.2)蛋白酶混合物以进 行消化。

在25℃进行蛋白酶消化并且在定义的时间点取样相当于2μg HMGB1 A盒(最初存在于混合物中)的体积。加入4μl complete Mini 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物溶液(1片溶于10ml dH2O中)终止消化。 取样时间点为：0，5分钟，15分钟，30分钟，1小时，1.5小时，2 小时和4小时。

蛋白酶抑制后不久，向样品中添加适当量的3×上样缓冲液并且在 95℃温育大约3分钟。

2.4经消化的HMGB1 A盒野生型和变体的Tricine SDS-PAGE 蛋白酶消化和样品制备后，将各个HMGB1 A盒的时间点样品上样 到Tricine SDS PAGE凝胶(参见文献：和von Jagow， ″Tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa″，Anal.Biochem.166，368-379，1987)。

将5μl多肽SDS-PAGE分子量标准(Bio-Rad)上样到各个凝胶上 作为参照(reference)。

凝胶上的各个孔上样有10μl样品(相当于消化前1μg HMGB1 A 盒的体积)。

在30V下进行电泳直到溴酚蓝进入凝胶的分离部分，然后在120V 下进行(Mini Protean 3 System；Bio-Rad)直到电泳结束。

通过浸泡在考马斯亮蓝R染色溶液(0.1％w/v在50％甲醇，10％乙 酸中)中对凝胶染色1小时，而后在脱色溶液(30％甲醇，10％乙酸) 中对凝胶脱色过液。

用Gel Doc 2000(Bio-Rad)成像系统获得凝胶图。

2.5结果

在上述测定条件下，HGMB1野生型蛋白抵抗完全的蛋白酶消化大 约30分钟。在图8中，直至蛋白酶消化30分钟还能看到对应SEQ ID NO：1蛋白的人HMGB1 A盒野生型的84个氨基酸全长片段的条带。

测试的21个A盒多肽变体表现出增加的对蛋白酶的抗性(图10)。 在所述测定条件下，这些变体抵抗蛋白酶消化1小时至2小时。SEQ ID NO：33，35，37，38，39，42，43，44，47，48，57，62，69和104 的多肽变体对蛋白酶消化表现出1小时的抗性。图9.14，9.15，9.16， 9.17，9.18，9.21，9.22，9.23，9.26，9.27，9.32，9.35，9.40 和9.59展示对应于84个氨基酸的不带组氨酸标签的蛋白的条带，该 条带直至蛋白酶消化1小时还能看到。

SEQ ID NO：45，49，52，55和67的多肽变体对蛋白酶消化表现 出1.5小时的抗性。图9.24，9.28，9.30，9.31和9.39展示对应于 84个氨基酸的不带组氨酸标签的蛋白的条带，该条带直至蛋白酶消化 1.5小时还能清楚看到。SEQ ID NO：59和64的多肽变体甚至对蛋白 酶消化表现出高达2小时的抗性。图9.33和9.37展示84个氨基酸的 不带组氨酸标签的蛋白的条带，该条带直至蛋白酶消化2小时还能清 楚看到。

3.在小鼠中单次皮下给药后A盒(野生型和变体)和聚乙二醇化 的A盒(野生型和变体)的药代动力学研究

3.1研究目的

本研究的目的为评估和比较在小鼠中单次皮下施用化合物后A盒 (野生型和变体)和聚乙二醇化的A盒(野生型和变体)的药代动力 学特征。

3.2材料和方法

●测试物：A盒的野生型和变体以及对应的聚乙二醇化分子。由 线性mPEG-醛(40kDa)与各个A盒分子的N末端通过还原胺化作用获 得聚乙二醇化分子。

3.3体内实验

●动物：实验时具有22.2-22.4g平均体重的小鼠(Balb/c，雄 性，7-9周龄，实验前一周由Charles River Laboratories Italia SpA， Calco提供)

●动物管理：动物饲养于通风，恒温的容器中，所述容器设置为 维持温度和相对湿度分别在22℃±2℃和55±15％，具有12 个小时的光/暗周期。在清洁的聚碳酸酯笼子中(Techniplast， Buguggiate，Italy)，一个笼子饲养多达10只的小鼠；无限制提供通 过水瓶的饮水和商业可获得的实验室啮齿动物食物(4RF21，Mucedola s.r.l.，Settimo Milanese，Italy)。

●实验组：4组(4个测试项目)，每组20只动物，随机分组。

●给药剂量：以1mg/kg皮下施用A盒野生型和变体。以5mg/kg 皮下施用聚乙二醇化的A盒野生型和变体。这些剂量确保测试化合物 等摩尔量。

●测试项目的施用：通过使用适配有0.45×12mm(26Gx1/2″) 针头的胰岛素注射器以每只小鼠0.25ml体积(每kg体重10ml)皮下 施用测试项目。

●测试物配方：磷酸盐缓冲溶液

●动物处死和采血：

处理后在以下时间点采集血液样品：

●A盒野生型和变体：施用测试化合物后5，20和40分钟，1.5 和2.5小时；

●聚乙二醇化的A盒野生型和变体：施用测试化合物后5，40分 钟，1.5，5和10小时。

基于血流中聚乙二醇化分子较长的预期的持久性确定测试化合物 之间血液样品采集的不同时间点。

在各个取样时间，用胰岛素注射器在深度醚麻醉下从各个动物的 腹主动脉采集大约0.4ml血液样品，并且将其转移到包含5μl肝素 (5000UI/mL)的聚乙烯Eppendorf管中以防止血液凝固。血液样品保 持在冰中直到在冷冻离心机(2-4℃)中以1400g离心5分钟。然后从 各个管回收血浆样品，将其置于新的Eppendorf管中并且在-80℃下冷 藏直至分析。

3.4分析测定

通过ELISA方法确定小鼠血浆中的A盒(野生型和变体)和聚乙 二醇化的A盒(野生型和变体)的血浆浓度。

简言之，通过在100mM碳酸盐-碳酸氢盐包被缓冲液中稀释抗A 盒的N末端的单克隆抗体至10ng/ml来制备包被溶液。等分100μl 到Nunc Maxisorp ELISA板的每个孔中，其在4℃温育过夜。用PBS 0.05％吐温(Tween)清洗平板六次并且往每个孔加入300μl的5％ 牛奶(在PBS 1％吐温中)以封闭平板上剩下的结合位点。在室温下， 在300rpm下温育平板1小时。样品以1∶20稀释于PBS 1％吐温中。

清洗平板6次并且将100μl标准品和经稀释的样品转到经包被的 平板的指定孔并且在室温下在300rpm下温育1小时。在加入抗A盒的 C-末端的第二抗体(1∶200)前再次清洗平板6次。温育1小时和清洗 六次后，将生物素-山羊抗兔缀合物的1∶20000溶液加入每个孔(100 μL/孔)。温育1小时(室温下，300rpm)和清洗六次后，将平板和 100μl/孔的1∶100000链霉亲和素-HRP溶液一起在300rpm下温育25 分钟。清洗平板6次并且往各个孔加入100μl预温的TMB底物。在实 验台(bench top)上在室温下显示信号，30分钟后，加入100μL/ 孔的终止溶液并且马上在450nm处读板。

3.5结果

对各个先前描述的PK样品，计算A盒(野生型和变体)和聚乙二 醇化的A盒(野生型和变体)的平均血浆浓度并且确定药代动力学特 征。结果在图11和12中表示。

作为实例，下文报道了A盒野生型和变体号64(M51I)以及聚乙 二醇化的A盒和聚乙二醇化的A盒变体号64(M51I)的PK特征。以 平均值±误差(标准误)(每个时间点4只小鼠，以一式两份分析) 报道结果。

在下表中，报道了针对A盒野生型，A盒变体号64，聚乙二醇化 的A盒野生型和聚乙二醇化的A盒变体号64曲线计算的AUClast(在最 后的实验点计算的曲线下面积)。

表2针对A盒野生型(WT)，A盒变体号64(64)，聚乙二醇化 的A盒野生型(WT)和聚乙二醇化的A盒变体号64(PEG-64)曲线计 算的AUClast数据。

  AUClast   (μM＊min)   WT   8.899   64   14.97   PEG-WT   275.5   PEG-64   332.5

3.6讨论

通过突变赋予WT的在AUClast中的相对增长为1.68X(WT比64)，这 很可能是由于在sub cute小室中较高的蛋白酶抗性。通过聚乙二醇化 赋予WT的在AUClast中的相对增长为31X(WT比PEG-WT)，这主要是由于 PEG缀合物的削弱的肾滤过，还由于抵抗蛋白酶作用的保护。突变和聚 乙二醇化一起在AUClast中产生37X的相对增长(WT比PEG-64)。出乎意 料地，两种修饰一起对暴露于蛋白的动物具有正面效应，所述正面效 应高于单个修饰的贡献的总和(即，37X＞1.68X+31X)。因此，单 个位点突变和聚乙二醇化对天然蛋白的药代动力学特征具有协同，协 作作用。这一现象的可能的解释可以为在sub cute小室中不能完全保 护聚乙二醇化的蛋白抵抗蛋白酶解。单个位点突变的导入增强了在该 小室中的抗性，允许更高数量的蛋白进入血液循环然后通过巨大的PEG 链保护其不被肾滤过。